JPH02291260A - Carrier for cell culture - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To obtain a carrier enabling high-density mass-culture of anchorage- dependent cell by coating the surface of a specific foamed polyurethane with a water-insoluble polymer containing polymerizable monomer as constituent unit and optionally chemically bonding a specific functional group to the polymer. CONSTITUTION:The objective cell culture medium is produced by coating the surface of a foamed polyurethane having average pore diameter of 1 to 3mm with a water-insoluble polymer containing polymerizable monomer as constituent unit and optionally chemically bonding a positively chargeable functional group to the water-insoluble polymer. The void ratio of the foamed polyurethane in the obtained carrier is 60 to 99%. For impregnating and coating the polymerizable monomer to the foamed polyurethane, the polymerizable monomer component and the diluent used in the process are preferably good solvents to the polyurethane. Suitable polymerizable monomer is hydrophilic monomer, especially a vinyl monomer giving a polymerized polymer causing little non- specific adsorption of protein, etc. Representative examples of the monomer are (meth)acrylic acid ester and (meth)acrylamide.

Description

【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]

（産業上の利用分野ノ 本発明は、細胞培養担体に関するもので．１、特に付着
依存性細胞の高密度培養に適した担体Ｋ関するものであ
る。 （従来の技術及び発明が解決しようとする課題）細胞を
大量かつ高密度状態で培養する方法として、マイクロカ
プセル法、ホローファイバー法、セラミックス担体法、
マイクロキャリア法、ガラスビーズ法等の培養方法が知
られている。 しかしながら近年、培養方法の進展に伴い、より高密度
状態の培養が達成できる培養担体、及びその培養方法が
求められるようになってきた。 マイクロキャリア、ガラスビーズ法のような担体表面の
みを付着面とするような担体では、単位体積当シの表面
積（以下、Ｓ／Ｖ値と略す〕が低いため高密度培養に限
界がある。・この目的を達成するためには、担体内部ま
でも付着面とするような培養担体が求められ、既に幾つ
か報告されている。しかしながら、これらの培養担体に
も以下に述べるような問題点がある。 特開昭６２−タＯＪ９３６号及びバイオ／テクノロジー
　５巻．ｐ　ｇＪ！ｒ−ｇＪ７．（ｌ９ｇ７）（ヘラノ
クス・コーポレーション）テハ，コラーゲン繊維を三次
元的に織った球状担体を用い、高密度培養が達成されて
いる。しかしながら、素材がコラーゲンであるため、オ
ートクレープ滅菌ができないという最大の問題点を有し
ている。 特開昭１２−／６９ｇ３７号及びニルンンらのパイオ／
テクノロジー．ｑ巻，　ｐ　９　ｇ　？　−　９　９　
０　．（ｌデｇ７ノでは，多孔性ゼラチン担体を用い、
高密度培養の可能性を報告している。本担体は、コラー
ゲン担体とは異なりオートクレープ滅菌が可能であるが
、強付着依存性細胞でさえも付着性が悪く、特殊な付着
方法が必要である。 Ｇ．Ａ．　Ｐｋｈａｋａｄｚｅらは、ウクレインスキ　
ノでイオキミツニ　ジャーナ／Ｌ／　（　Ｕｋｒ．　Ｂ
ｉｏｋｈｉｍ．Ｚｈ．　）．５７巻，４ｔ号，ｐＪ夕３
−．ｙｇａ．ＣＩタクタノでポリウレタンを用い、ラッ
トの繊維芽細胞が培養できることを既に報告している。 更に、特開昭６２−．２／！ｉＪｇＡ号（日本電気工業
■〕では、発泡ポリウレタンを用い、高密度培養の可能
性を報告している。しかしながら、発泡ポリウレタンを
基材とした担体では、細胞の付着性や、増殖性が悪く、
しかも増殖した細胞が剥離しやすいばかりではなく、付
着した細胞によって分泌された蛋白質やウイルスを吸着
しやす込という問題点を有している。また、渡辺らは、
ポリウレタンは、溶出物が多く生育が不良であることを
報告(In the field of industrial application, the present invention relates to cell culture carriers. 1. In particular, it relates to carriers K suitable for high-density culture of adhesion-dependent cells. Issue) Methods for culturing cells in large quantities and at high density include microcapsule method, hollow fiber method, ceramic carrier method,
Culture methods such as the microcarrier method and the glass bead method are known. However, in recent years, with the development of culture methods, there has been a demand for culture carriers and culture methods that can achieve higher density culture. With carriers such as microcarriers and glass bead methods where only the carrier surface is the attachment surface, there is a limit to high-density culture due to the low surface area per unit volume (hereinafter abbreviated as S/V value).- In order to achieve this purpose, a culture carrier that has an attachment surface even inside the carrier is required, and several reports have already been made.However, these culture carriers also have the following problems. . JP-A No. 62-ta OJ936 and Bio/Technology Vol. 5. p gJ!r-gJ7. (l9g7) (Heranox Corporation) High-density culture using a spherical carrier made of three-dimensionally woven collagen fibers. However, since the material is collagen, the biggest problem is that autoclave sterilization is not possible.
technology. Volume q, p 9 g? -9 9
0. (In l deg7, a porous gelatin carrier is used,
The possibility of high-density culture has been reported. Unlike collagen carriers, this carrier can be sterilized by autoclave; however, it has poor adhesion even to strongly adhesion-dependent cells, and requires a special adhesion method. G. A. Pkhakadze et al., Ukreinski
Node Iokimitsuni Jhana/L/ (Ukr. B
iokhim. Zh. ). Volume 57, issue 4t, pJ evening 3
−． yga. CI Takutano has already reported that rat fibroblasts can be cultured using polyurethane. Furthermore, JP-A-62-. 2/! iJgA issue (NEC Corporation ■) reported the possibility of high-density culture using foamed polyurethane. However, with foamed polyurethane-based carriers, cell adhesion and proliferation were poor.
Moreover, not only are the proliferated cells easily detached, but they also have the problem of easily adsorbing proteins and viruses secreted by the attached cells. Also, Watanabe et al.
It has been reported that polyurethane has a large amount of eluate and poor growth.

【東京医科歯科大学医用器材研究所報告．，／Ｏ巻
．ｐ６タークＳ，（ｌタクル）〕シている。 ところで、本発明者らは特開昭６３−７／／７．７号、
特開昭６３−２．２６２ｇコ号及び特開昭６グー１０９
７９号において、（メタ）アクリル酸エステルを構成単
位とする水不溶性重合体粒子に、正Ｋ荷電しうる化学的
残基または、蛋白質を表面に化学結合してなるマイクロ
キャリアを報告している。しかしながら、前述のように
、微粒子表面の付着面のみでは、高密度培養の達成には
限界があシ、Ｓ／Ｖ値の向上が、高密度培養の達成の成
否を握る鍵となっていた。 以上の状況から、細胞の付着性や増殖性が良好で、オー
トクレープ滅菌が可能な担体が求められていた。 本発明の目的は、細胞とシわけ付着依存性細胞の高密度
かつ大量培養を可能にする培養担体を提供しようとする
ものである。 （課題を解決するだめの手段） 本発明者らは、゛上記の問題点に鑑み鋭意検討を行った
結果、（メタ〕アクリル酸エステル、または（メタノア
クリルアミド等の水不溶性ポリマーを、特定の発泡ポリ
ウレタンにコーティングすることにより従来の技術の欠
点を補った担体が得られることを知得した。即ち、相応
する重合性モノマーを特定の発泡ポリウレタンに含浸し
コーティングした後、重合することによシ、Ｓ／Ｖ値が
大きく、しかも適切な平均細孔径及び比重？有し、ＭＪ
胞の付着、増殖性か良好で、生理活性物質等の蛋白質を
非特異的に吸着することの少ない細胞培養担体を得るこ
とができ、これにより細胞の高密度培養を達成できるこ
とを知得し、本発明に到達した。 すなわち、本発明の要旨は、空隙の平均細孔径がｌμｍ
−３朋である発泡ポリウレタンの表面を、重合性モノマ
ーを構成単位とする水不溶性高分子で被覆してなり、ま
たは５更に、該水不溶性高分子に正に荷電しうる官能基
を化学結合してなり、かつ発泡ポリウレタンの空隙率が
６０〜タデ係であることを特徴とする細胞培養担体に存
する。 以下、本発明を詳細に説明する。 細胞、と９わけ付着依存性細胞を効率的に培養し，該細
胞が分泌する生理活性蛋白質を、効率的に回収するだめ
の細胞培養担体が具備すべき条件として、以下の項目が
あげられる。 （ａｌ　　細胞が付着，増殖しやすいこと。 （ｂｌｓ／Ｖ値が大きいこと。 （ｃｌ　　付着面の曲率半径が大きいこと。 ｆｄｌ　　培養液が流通しうる適度な細孔を有すること
。 （ｅｌ　　細胞が受けるせん断力をできるだけ抑えられ
る構造体であること。 げ）蛋白質の非特異的吸着が少ない素材であること。 （ｇ１　　オートクレープ滅菌が可能であること。 （ｈｌ　　光学的に透明な素材であること。 （１）化学的、生物学的Ｋ安定な素材であること。 （ｊｌ　　廉価な培養担体であること。 これらの条件を満たす担体の支持体として、本発明者ら
は特定の発泡ポリウレタンを採用した。本発明に用いら
れる発泡ポリウレタンの空隙の平均細孔径は７μｍ〜３
龍であシ、空隙率は６０〜ワデチである。また該ポリウ
レタンの大きさは、一般に／　０−７ｃｔｌ〜／　０６
ｃｒｉｌである。 通常、担体の大きさは、その平均細孔径Ｋよって大きく
異なるが、流動状態で培盪するけん濁培養、還流培養、
流動床培養もしくは、回転培養等においては、一辺の長
さがｉｏｏμｍ〜７００μｍの範囲にある構造体である
ことが好ましい。この範囲を越えた場合、担体内部に培
養液が充分拡散しにくくなり、多孔性担体の内部の付着
面を有効に利用できない。この培養担体を用いた場合、
多孔性担体の平均細孔径は、通常、７μｍ−　ｓ　ｏ　
ｏμｍ１好ましくは７０μｍ〜一〇〇μｍである。しか
も培養液の内部拡散を考慮し、担体は、多孔性ポリウレ
タンであることが好ましい。また、該担体は、球状に近
い形状であることが好ましい。これは、（１）培養液を
できるだけ内部に均一に拡散させるため、（２４培養液
中の見かけの粘度を低くするため、（３）担体同士の衝
突による細胞の損傷をできる限シ抑えるためである。 一方、固定床培養担体として用いる場合、該担体の大き
さは、培養規模により大きく異なるが、！　ｃｔ＆　−
　／　Ｏ’ａｔｉの範囲であることが好ましい。 また、その平均細孔径は培養液の担体の内部での拡散性
をよくするため、前述の流動状態での培養に用いられる
担体よシ大きいことが好ましく、一般にＳＯＯμｍ　”
””　Ｊ　Ｍｌｊｉの範囲であることが好ましい。この
場合担体は、培養容器の形状に合わせて裁断することに
よシ得られる。 本発明担体は、付着依存性細胞以外にもハイブリドーマ
、プロトプラスト等の浮遊性細胞も培養することができ
る。この場合、担体の平均細孔径は、比較的小さいこと
が好ましく、その範囲はｌμ７７１　−　／　０　０μ
ｍである。 細胞培養担体の比重は、培養方法やモノマーの含浸量に
よって大きく異なるが、一般にその比重は、／．００−
／．クＯタ／　ｍｌであることが好ましい。 付着依存性細胞を対象とした場合、本発明で用いられる
発泡ポリウレタンは、三次元構造の骨格構造体であれば
連続構造体であっても、骨格間に膜が張った半連続構造
体であっても、いずれでもよい。しかしながら，Ｓ／Ｖ
値を大きくするためには、三次元構造体の骨格構造体間
に適度に膜が張った半連続構造体であることが好ましく
具体的にはそのＳ／Ｖ値として、コ。 ｃｙｉ〜／ｅ０　０　０ｃｎｌ／ｍｌ−；ｔ？　！ｊ　
’ｙ　レタン以上テアルことが好ましい。 細胞は、付着体表面の曲率半径を認識することが、既に
知られてぃる（ＷＳ．Ｈｕ　　バイオテクノロジーアン
ドバイオエンジニアリング．ＪＯ巻，　ｐ！；ｌｌｇ，
　／　９　ｇク〕。即ち、付着体表面の曲率半径が大き
い方が、付着性、増殖性が良好である。発泡ポリウレタ
ンにおいても、細胞付着面が外側に凸で、その曲率半径
ができる限り大きい、または内側に凹の構造体で膜が張
った発泡ポリウレタンであることが好ましい。 本発明において、重合性モノマーを発泡ポリウレタンに
含浸、コーティングするためには、発泡ポリウレタンは
耐薬品性であシ，且つ使用される重合性モノマー成分及
び希釈剤は、該ポリウレタンに対して、良溶媒的である
ことが好ましい。本発明において好適に使用される重合
性モノマーは、親水性モノマーであシ、かつ重合したボ
リマーに蛋白質等の非特異的な吸着が少ないビニルモノ
マーが好適であシ、代表的には（メタ〕アクリル酸エス
テル、または（メタノアクリルアミドがあげられる。具
体的には、一一ヒドロキシエチル（メタ冫アクリレート
、ジエチレングリコール（メタ〕アクリレート、トリエ
チレングリコール（メタ〕アクリレート、テトラエチレ
ングリコール（メタノアクリレート、オクタエチレング
リコール（メタ）アクリレート，ポリエチレングリコー
ル（メタ）アクリレート、メチル（メタ）アクリレート
、グリ七ロール（メタノアクリレート％　（メタ〕アク
リルアミド、メチル（メタ冫アクリルアミド，エチル（
メタ〕アクリルアミド、グリシジル（メタ）アクリレー
ト、クリセロール（メタ）アクリレ〜ト、下記表一／ｉ
たは下記表一一のモノマー等があげられる。なお．表中
においてＭｅ基はメチル基を，Ｅｔ基はエチル基を示す
。 また，ＣＬＯＧＰ値は、溶質の水一ｌ−オクタノール系
におけるモノマーの分配係数の対数値を計算によシ求め
た値でアシ、その意義については後述する。 以上の中から適宜選択された重合性モノマー成分に、必
要に応じて架橋剤成分を添加することが好ましい。ここ
で、支持体表面を被覆する高分子膜が水不溶性であれば
、架橋剤成分は必須成分ではないが、該高分子膜及び支
持体からの可溶性成分等の溶出、または、重合した高分
子膜の剥離等を考慮し、架橋剤成分を添加することが好
ましい。架橋剤成分としては、前述のモノマー成分と共
重合性を有し、できる限り親水性の高い多官能性のビニ
ルモノマーが好適である。例えば、エチレングリコール
ジ（メタ〕アクリレート、ジエチレングリコールジ（メ
タクアクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ〕
アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アク
リレート、グリセロールジ（メタラアクリレート、トリ
メチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、エチレ
ンビス（メタ〕アクリルアミド、トリエチレンピス（メ
タ）アクリルアミド等があげられる。架橋剤成分は、支
持体の構成成分の漏出を最小限に抑えるために、欧用す
ることが好ましいが、架橋剤成分の含有率が高すぎる場
合には、血清中の蛋白質及び細胞によって分泌された生
理活性蛋白質を吸着し、効率的にそれらを回収できない
という問題点が生じる場合がある。従って、架橋剤成分
の含有率は、ｏ．ｉ−ｓｏＭ量チ、特に／−ＪＯ重量係
であることが好ましい。 本発明において上記モノマーに対して、希釈剤を添加す
ることが好ましい。これにより発泡ポリウレタンの内部
にまで含浸でき、均一にコーティングすることができる
。しかも得られた高分子に適度の可とり性をもたせるこ
ともできる。 モノマー成分に添加される希釈剤としては，モノマーを
溶解し、モノマー成分の官能基即ち、メタクリロイル基
、水酸基、グリシジル基、アミド基、アミノ基等や、発
泡ポリウレタンに対し不活性であればよい。一般に好適
な希釈剤は、使用される七ノマ一種によって異なる。通
常、ベンゼン、トルエン、メチルイソプチノレケトン、
酢酸エチル、酢酸プチル、ｌ−ヘキサノーノレ、シクロ
ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、シクロヘ
キサノン、ジブチルエーテル、テトラヒドロフラン、ム
コージクロロエタン，／，Ｆ−ジオキサン、クロロホル
ム、四塩化炭素、ジメテルホルムアミド、ジメテルスル
ホキシド、アセトニトリル、エタノール、グロパノール
、メタノール、アセトン及び上記水溶性有機溶媒と水と
の混合溶液等が好適である。 一般に、被覆を行う水不溶性高分子は、細胞と高分子と
の接触点を多くするため、非多孔性の膜であることが好
ましいが、微多孔性高分子膜であっても差し支えない。 上記希釈剤としてモノマーに対し良溶媒を添加した場合
には、被覆した水不溶性高分子膜は、光学的に透明な高
分子膜となシ、一方、貧溶媒を添加した場合には、光学
的に不透明な多孔性高分子Ｍ．！：なる。 また同一溶媒を欧用した場合でも、よシ親水性のモノマ
ーや架橋剤を１吏用した場合には、生成する高分子膜は
光学的に透明な高分子膜になシやすい。 全モノマーに対する希釈剤の添加量は，Ｏ〜ＩＯ倍量で
あることが好ましく、特に好ましくは、／．０−グ．θ
倍量である。希釈剤ｔ過剰に添加した場合には、高分子
膜が剥離しやすいばかりではなく、重合収率が低下する
等の問題点が生じる。 本発明者らは、正に荷電しうる官能基量が培養液中にお
いてＯ．Ｓ〜．３．３０ミリ当量／ｇであり、かつボリ
マー中の正に荷電しうる相当するモノマーの．ＣＬＯＧ
Ｐ値が−２．０〜＋コ．０の範囲Ｋある培養担体が、細
胞の付着率が良好であシ、しかも伸展性や増殖性も良い
こと・を見いだした。 正に荷電しうる官能基量は、細胞や官能基によって異な
るが、低い場合には、一般に細胞の付着性が悪くなる。 一方、高い場合には、付着率は良好であるが、上記の範
囲を越えると再び細胞の伸展性や増殖性が悪くなる。細
胞の付着性や増殖性に影響を与えるのは、官能基量ばか
りではなく、ボリマー中の正に荷電しうる相当するモノ
マーのＣＬＯＧＰ値も重要である。本発明ＫおけるＣＬ
ＯＧＰシステムは、ポモナ大学（カリフォルニア州）　
（　Ｔ，Ｎｉｓｈｉｏｋａ　　（京都大学〕によってＦ
ＡＣＯＭ．７．．？．？版に編集されたプログラム）に
よって開発されたもので、以下のように定義される。Ｃ
ＬＯＧＰ値は、上述のとおり溶質の水一ｌ−オクタノー
ル系におけるモノマーの分配係数の対数値を計算によシ
求めた値である。これによシ中性分子の疎水性を定量的
に表現することができるようになった。本発明における
正に荷電しうるモノマー単位のＣＬＯＧＰ値も、この方
法によシ求めたものである。正に荷電しうる官能基は、
培養液において、その一部は、解離状態にあると考えら
れるが、Ｗ．　Ｓ．　Ｈ　ｕらは、ｐＨ７．．１０にお
ける増殖速度に及ぼす正味の荷電量の影響は少ない、ま
たは全く規則性がないことを報告している（バイオテク
ノロジーアンドバイオエンジニアリング，一タ巻，ｐ　
／／ｊｊ−１１６．３．　／９ｇ’）　）。従って、ボ
リマー中の正に荷電しうる相当するモノマー単位の疎水
性度は、中性分子のＣＬＯＧＰ値を考慮すればよい。本
発明では、相当するモノマー単位のＣＬＯＧＰ値が，　
−２．０より小さい値の官能基の場合、培養担体に対す
る細胞の付着性は悪くなシ、逆に、ＣＬＯＧＰ値が、＋
コ．Ｏより大きい場合も、細胞の付着性や増殖性は悪く
なる傾向にある。ＣＬＯＧＰ値が、十一．Ｏより大きい
場合に起こる現象を、本発明者らは、疎水性阻害と呼ん
でいる。この場合、細胞によって分泌された生理活性蛋
白質を、培養担体が吸着することも見い出した。更に、
該モノマー単位の含有率と相当するモノマー単位のＣＬ
ＯＧＰ値との間には、規則性が観察された。即ち、培養
担体上で細胞を良好に付着、増殖させるためには、ＣＬ
ＯＧＰ値が低い場合には、官能基量を多くし、高い場合
には、それを低くすることが好ましいことも判明した。 ＣＬＯＧＰ値が、一一．Ｏ〜＋コ．Ｏの範囲にあシ、且
つ正に荷電しうる官能基をもつモノマー単位としては，
前述の表一ｌ及び表一一に示したものをあげることがで
きる。表一７及び表一一に示していない化合物でも、本
発明の特許請求の範囲を越えない限り、表中の化合物に
限られるものではない。 発泡ポリウレタンの表面を水不溶性高分子で被覆する方
法は、以下の手順に従って行うことができる。 モノマー，架橋剤、希釈剤を混合して成るモノマー溶液
に重合開始剤を添加する。この溶液を発泡性ポリウレタ
ンに含浸し、過剰のモノマー溶液は、ポリウレタンを圧
縮し絞シ出した後、窒素雰囲気下でモノマーを重合する
。固定床用担体を製造する場合には、発泡ポリウレタン
にモノマーを含浸し、均一にコーティングするため、で
きる限Ｆ）　／　Ｏａｎ片以下に裁断し、上記の重合反
応を行う。培養器に合わせた固定床用培養担体を製造す
る場合には、裁断し上記の操作を行った後、遠心分離機
で過剰のモノマー溶液を除去する。培養担体が小さい場
合には、カラム内に充填した後、含浸及びコーティング
することも可能である。上記の製造工程において注意す
る点としては、過剰のモノマー溶液を除去する際、ウレ
タン内部に液溜りが生じないようにしなければならない
ことである。 本発明で使用される重合開始剤として、以下のものをあ
げることができる。過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイ
ル、過酸化アセチル等の過酸化系重合開始剤、コ．コー
アゾビス一一一シクロプロビルプロピオニトリル等のア
ゾ系重合開始剤または過酸化水素水一Ｆｅ２＋塩、過酸
化物塩一硫酸水素ナトリウム、トリエチルホウ素、ジエ
チル亜鉛等の極低幅用重合開始剤によシ重合を開始させ
ることができる。 ここで重合開始剤の選択は、モノマー、架橋剤、希釈剤
等によって，大きく異なる。モノマー溶液が水溶性であ
る場合には、レドンクス系重合開始剤、水溶性アゾ系重
合開始剤または過酸化アンモニウム、過酸化カリウムー
Ｎ，Ｎ．Ｎ’Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミン等が
用いられる。また、モノマー溶液が水に難溶性である場
合には、過酸化系重合開始剤またはアゾ系重合開始剤が
好ましく用いられる。 重合温度は、一般にレドックス系重合開始剤の場合には
、θ℃〜ＳＯ℃とするのが好ましく、またアゾ系重合開
始剤及び過Ｉ酸化物系重合開始剤の場合には３０℃〜／
００℃とするのが好を有する場合、得られた高分子はそ
のまま用いることができる。しかし、高分子が上記荷電
しうる官能基を全く含まない場合、または、特許請求の
範囲に記載した官能基量の範囲以下である場合には、更
に化学反応によって正に荷電しうる官能基を化学結合に
よシ導入しなければならない。例えば、高分子中のグリ
シジル基は、アミンとの反応によシ容易に化学修飾して
正荷電しうる官能基を導入できる。高分子中の水酸基、
コ，３−ジヒドロキシグロビル基等の場合には、臭化シ
アンとの反応によシイミドカルボネートを得た後、ジア
ミンとの反応によシ、化学修飾して、正荷電しうる官能
基とすることができる。また同様に水酸基、コ，３−ジ
ヒドロキシグロビル基をトリクロロトリアジンと反応さ
せ、生成したジクロロトリアシル基とジアミンとの反応
によシ，化学修飾することもできる。 担体に導入された正に荷電しうる官能基量は、支持体に
よっては、測定することが難しい場合が多い。その場合
、別にガラスシャーレ上にモノマーをコーティングした
後、ポリマーを回収し、正の荷電量を滴定によって推定
する・ことはできる。なお、実施例に示した正の荷電量
は、上記の方法によって推定により求めた値である。 本発明の細胞培養担体を用いて培養する方法として、培
養規模，培養の目的等によって異なるが、例えば、以下
の方法があげられる。シャーレ、Ｔ−フラスコを使用し
た場合４靜地培養法、スビンナーフラスコ，ローラーボ
トルの場合、けん濁培養法、固定床を用いた場合、固定
床培養法，その他エアーリフトを用いた場合、還流培養
法等があげられる。 培養方法によシ培養担体の投入量は異なシ、一般に培養
液に対して５％〜６０％の範囲であることが好ましい。 （実施例） 以下、実施例によシ本発明を詳細に説明するが、本発明
は、その要旨を越えない限シ、以下の実施例によシ限定
されるものではない。 （実施例一ｌ） ボリエテレングリコールメタクリレート（ＰＥ一コＯＯ
；日本油脂■製）！．／０９，グリシジルメタクリレー
トａ．ｓｏｙ，ポリエチレングリコールジメタクリレー
ト（４’Ｇ；新中村化学■製）コ．ｑ　ｏタ、ｌ．ダー
ジオキサンコｏ．ｏ　ｙ及び塩化メテレンｏ．ｓｍｌに
溶解したアゾ系重合開始剤＋７）Ｖ　−　７　０　（　
２．．２’−７ゾヒス（＜＜−メトキ’／一一，クーバ
レロニトリル）　；ｆＯ光純薬工業■製〕ａｏｒｎ９を
混合し、モノマー溶液を調製した。室温で窒素ガスを通
じ、モノマー溶液中の溶存酸素を除去した。 発泡ポリウレタン（平均細孔径．２ＳＯμｍ、半連続発
泡体、ＭＤ化成■製ノ（ｌＯｃＭＬｘｌＯ儂Ｘ　７　ｃ
ｎＬ；　７　０　０　ｃｒｄ　）に上記調裂したモノマ
ー浴液を含浸し、過剰のモノマー溶液を圧縮し絞シ出し
た。該ポリウレタン片をガラス容器内Ｋ入れ、窒素雰囲
気下ＳＯ℃に加湛し、一時間重合反応を行った。重合反
応終了後、残留モノマー及びジオキサンを除去するため
、ＳＯ℃に加温したアセトン水溶液で洗浄し、最後に蒸
留水で洗浄した。 更に、このポリウレタン片をジオキサンで置換した後，
この中へエタノールアミンコ．θ２のジオキサン溶液／
ｏｍｌを滴下し，？！ｒ℃でｑ時間アミン化を行った。 反応終了後、ポリウレタン片をＳＯ％アセトン水溶液で
十分洗浄した後、蒸留水で洗浄し尼。被覆されたボリマ
ーの量は／ｇ．！；チであった。 相当する正に荷電するモノマー単位は、メタクリル酸一
一一ヒドロキシエチルアミノー一一ヒドロキシグロビル
でメシ、そのＣＬＯＧＰ値は，−０．６４９である。推
定される官能基量は、約ｌ．クｌミリ当量／ｇであシ、
表面積は！；　２ｃｒｄ／ｍｌ、空隙率は約ざ７チであ
った。 （実施例一コ） ポリエチレングリコールメタクリレ−”｝（ＰＥ−３！
；０；日本油脂■製）　ｓ．ｏ　ｙ、グリシジルメタク
リレート２．４Ｏｆ，グリセロールジメタクリレートム
ダ０２、／，９−ジオキサンコ０．０？及び塩化メチレ
ンｏ．ｓｍｌに溶解したアゾ系重合開始剤の■−７０　
（　．２，．２’−アゾビス（グーメトキシ一一，クー
バレロニトリル】；和光純薬工業■製〕コｏｒｎ９を混
合し、モノマー溶液を調製した。室温で窒素ガスを通じ
、モノマー溶液中の溶存酸素を除去した。 発泡ポリウレタン（平均細孔径７θμｍ、半連続発泡体
）（　／　ＯａｎＸＩ　Ｏｃｍ×７ｃｍ：　７００ｄ）
に上記調製したモノマー溶液を含浸し、過剰のモノマー
溶液を圧縮し絞シ出した。該ポリウレタン片をガラス容
器内に入れ，窒素雰囲気下６０℃に加温し、２時間重合
反応を行った。 重合反応終了後、残留モノマー及びジオキサンを除去す
るため、！；　０　′Ｃに加湛したｓｏ％アセトン水溶
液で洗浄し，最後に蒸留水で洗浄した。 更に、このポリウレタンフォームをジオキサンで置換し
た。この中へコーアミノエタンチオール一．θノのジオ
キサン溶液／θｍｌｆ滴下し，７５℃でグ時間アミン化
を行った。反応終了後、ポリウレタン片を５０俤アセト
ン水溶液で十分洗浄した後、蒸留水で洗浄した。被覆さ
れたボリマーの量は／コ．３％であった。 相当する正に荷電するモノマー単位は、メタクリル酸一
λ−メルカブトエチノレアミノ一一一ヒドロギシグロビ
ルでアシ、そのＣＬＯＧＰ値１’ｌ：、−ｏ．ｏｔｂで
ある。推定される官能基量は、約／．７７ミリ当量／ｇ
であり、表面積はｉ　ｙ　ｔ，ｃｎＬ／１ｎｌ、空隙率
は約ククチであった。 （実施例−３） シエチレングリコールメタクリレート７．Ｏｆ、ジメチ
ルアミノエチルメタクリレー｝，ｚ．ｔ／ＩＦ（　ＣＬ
ＯＧＰ値ｉ．ｉａ３）、グリセローノレメタクリレート
ｏ．ｓ　ｏ　ｒ　，テトラヒドロ７ランコ／．０２及び
重合開始剤のＶ−１５［ｕ，！−アゾビス（コ，クージ
メチルパレロニトリル）　；和光純薬工業■製］コＯ■
を混合し、モノマー溶液を調製した。室温で窒素ガスを
通じ、モノマー溶液中の溶存酸素を除去した。 発泡ポリウレタン（平均細孔径／００μｍ、半連続発泡
体）　（　／　Ｏ　ｃｍ　Ｘ　／　Ｏ　ｃｍ　Ｘ　７　
ｃｍ　：　？　０　０ｃｄ）に上記調製したモノマー溶
液を含浸し、過剰のモノマー溶液を圧縮し絞シ出した。 該ポリウレタン片をガラス容器内に入れ、窒素雰囲気下
１．０”Ｃに加温し、ｔ時間重合反応を行った。 重合反応終了後、残留モノマー及びジオキサンを除去す
るため、５０℃に加湛したアセトン水溶液で洗浄し、最
後に蒸留水で洗浄した。 被覆されたボリマーの量は、ｑ．ｓ　ｑ６であった。 推定される官能基量は、約７．３一ミリ当量／７であり
、表面積は／　／　７　７／　ｍｌ、空隙率は約ｇｌ係
であった・ （実施例一ク） ポリエチレングリコールメタクリレー｝（ＰＥ一．２ｏ
ｏ　；日本油脂■製）　７．Ｏ　ｆ、ジエチルアミンエ
チルメタクリレートΩ．ｙ　３？　（　ＣＬＯＧＰ値：
　ｌ．／ｇｇ），グリセロールメタクリレート／．！０
９，７！；％テトラヒド口フラン水溶液／ｇ．０？及び
アゾ系重合開始剤のＶ　−　ｂ　ｓＣ２．２−アゾビス
（コ，クージメチルバレロニトリルラ；相光純薬工業■
製〕一〇　ｍ９　ｆ混合し、モノマー溶液を調製した。 室温で窒素ガスを通じ、モノマー溶液中の溶存酸素を除
去した。 発泡ポリウレタン（平均細孔径クＯμｍ５半連続発泡体
）　（　５　ｃｍ　Ｘ　３　ｃｍＸ　３　（Ｘ　；クＳ
ｄ）に上記調製したモノマー溶液を含浸し、過剰のモノ
マー溶液を圧縮し絞シ出した。該ポリウレタン片をガラ
ス容器内に入れ、窒素雰囲気下６０℃に加湛し、ｑ時間
重合反応を行った。重合反応終了後、残留モノマー及び
ジオキサンを除去するため、６５℃に加温したアセトン
水溶液で洗浄し、最後に蒸留水で洗浄した。被榎された
ポリマーの量は６．７％であった。推定される官能基量
は、約／．Ｊａ　ミＩ）当量／ｇであり、表面積は／コ
ｔ　ｃｒｌ　／　”　％空隙率は約７７％であった。 試験例ｌ　（細胞培養実験ラ 実施例−７で製造された細胞培養担体を用いて、細胞培
養実験を行った。 実施例一ノで製造された細胞培養担体を蒸留水で充分洗
浄し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で置換し、更にダルベソ
コ変性イーグル培地（高圧蒸気滅菌可能）（日水製薬■
製ノで置換し、ｌコ７℃で一〇分間、蒸気滅菌を行った
。 細胞培養は、／０％牛胎児血清（三菱化成■冫を含有す
る、ｅ−ＲＤＦ培地（極東製薬■ラ及びダルベツコ変性
イーグル培地（日水製薬■製９で培養を行った。培養に
供した細胞は、Ｖｅｒ６（アフリカミドリザル腎）細胞
，ＭＤＣＫ（コツ力スパニエル腎）細胞、Ｃ６（ラット
グリア）細胞、ＫＮ（ヒト肺ガン）細胞、ＨｅＬａ（ヒ
ト子宮頚部ガン）細胞、Ｗ　Ｉ　−　．７　ｇ　（ヒト
胎児正常二倍体〕細胞である。 試験例２　（静置培養実験〕 ＡＣＩｎシャーレを用いて、細胞培養実験を行った。各
々のシャーレ内に、実施例−７で製造した細胞培養担体
片を，約ｉ．Ｏｍｌ入れ，３７℃の炭酸インキエペータ
ー内で培養を開始した。５時間後、及び５日後の付着性
及び増殖性は、以下の通りでめった。 シャーレ内の細胞密度は、以下の通りであった・細胞種
　　　　　細胞密度Ｃｃｅｌｌ５／ｍｔ）Ｖｅｒｏ細胞
　　　？．！；　Ｘ　／　０７ＨｅＬａ細胞　　　ざ＋
ｊ　Ｘ　／　０″Ｃ６細胞　　　　　ｇ．／　Ｘ　／　
０’ＣＨＯ−Ｋ／細胞　　　　６．ｇ　Ｘ　／　０’Ｗ
ｌ−．２ｇ細胞　　　　八コＸ　／　０７試験例Ｊ　（
けん濁培養実験） 全容１／ｋ八０７３のスビンナーフラスコを用いてけん
濁培養を行った。スビンナーフラスコ内に実施例一ｌ，
一実施例一コ、実施例−３及び実施例一ｑで製造された
滅菌済みの細胞培養担体片（Ｏ．ｊｍ１角）をｓ．ｏｍ
ｌ投入し、血清２　０．θｍｌ及びｅ−ＲＤＦ培地を加
え３００ｍｌとした。 この中へトリプシンで分散したＶｅｒｏ細胞をコ．Ｏ　
ｘ　／　０７ｃｅｌｌｓ播種し、／　！；　ｒｐｍで連
続攪拌し培養を行った。各実施例における担体は、いず
れも良好な付着性及び増殖性を示し、高密度培養が達成
された。 試験例４Ｉ（蛋白質吸着量測定〕 ｏ．ｉ％牛血清アルブミン（シグマ社製クのリン．酸緩
衝溶液（ｐ８　　７．１１０）／００ｍｌを調製した。 この中へ実施例−７、実施例一コ、実施例−３及び実施
例一グで合成した培養担体、及び比較例として重合処理
を行っていないポリウレタンＣＩ−Ｏｍｍ角）ｉ０．Ｏ
ｍｌを上記溶液中に投入し、Ｊク℃で振とうした。Ｓ時
間後、上溌み液のコｇ　Ｏ　ｎｍにおける吸光度を測定
し、ポリウレタンに吸着した牛血清アルブミンの量ヲ算
出した。結果を下記表−３に示す。 表−３ （発明の効果） 本発明によれば、培養担体を構成する重合性モノマーが
、液体であるため種々の形状の発泡ポリウレタンに含浸
し、コーティングすることができる。このことによシ、
各種用途に適した担体を製造することが可能となった。 本発明の細胞培養担体は、Ｓ／Ｖ値（単位体積当シの付
着表酢積冫が大きく、培養液が流通しうる細孔を有する
ため、高密度培養を達成しやすい。付着表面の曲率半径
が大きく，また、細胞の増殖にとって適切な荷電量及び
疎水性を有している。発泡ポリクレタン表面を親水性ポ
リマー成分でコーティングしているため、蛋白質の非特
異的吸着がほとんど観祭されない。その他、光学的に透
明であるため細胞を観察しやすく、オートクレープ滅菌
が可能である等の効果があげられる。これらの効果によ
シ動物細胞の培養や、それによって分泌される生理活性
蛋白質、モノクローナル抗体、ワクチン、ウイルス等を
効率的Ｋ生産できるようになった。 出　願　人　　三菱化成株式会社 代　理　人　　長谷川 （ほかｌ名）[Report from Tokyo Medical and Dental University Medical Equipment Research Institute. , /O volume. p6 Turk S, (l Thakur)]. By the way, the present inventors have disclosed JP-A-63-7//7.7,
JP-A No. 63-2.262g and JP-A No. 6-109
No. 79 reports a microcarrier formed by chemically bonding a positively K-chargeable chemical residue or protein to the surface of water-insoluble polymer particles having (meth)acrylic acid ester as a constituent unit. However, as described above, there is a limit to the achievement of high-density culture using only the adhesion surface of the particle surface, and improvement of the S/V value has been the key to success or failure in achieving high-density culture. Under the above circumstances, there has been a need for a carrier that has good cell adhesion and growth properties and is capable of autoclave sterilization. An object of the present invention is to provide a culture carrier that enables high-density and large-scale culture of cells and wrinkle-adhesion-dependent cells. (Means for Solving the Problems) The present inventors have conducted intensive studies in view of the above problems, and have found that water-insoluble polymers such as (meth)acrylic acid esters or (methanoacrylamide) are It has been found that by coating polyurethane, it is possible to obtain a carrier that compensates for the drawbacks of the conventional technology.That is, by impregnating and coating a specific foamed polyurethane with a corresponding polymerizable monomer, and then polymerizing, It has a large S/V value, appropriate average pore diameter and specific gravity, and MJ
We have learned that it is possible to obtain a cell culture carrier that has good cell adhesion and growth properties, and that does not non-specifically adsorb proteins such as physiologically active substances, and that this enables high-density culture of cells to be achieved. We have arrived at the present invention. That is, the gist of the present invention is that the average pore diameter of the voids is 1 μm.
-3) The surface of the foamed polyurethane is coated with a water-insoluble polymer having a polymerizable monomer as a constituent unit, or (5) a positively charged functional group is chemically bonded to the water-insoluble polymer. The cell culture carrier is characterized in that the polyurethane foam has a porosity of 60 to 50%. The present invention will be explained in detail below. The following conditions must be met for a cell culture carrier to efficiently culture cells, particularly adhesion-dependent cells, and to efficiently recover physiologically active proteins secreted by the cells. (al Cells should easily attach and proliferate. (Bls/V value should be large. (cl) The attachment surface should have a large radius of curvature. fdl It should have appropriate pores through which the culture solution could flow. (el Cells should have a large radius of curvature. The structure must be able to suppress the applied shear force as much as possible. g) The material must have low non-specific adsorption of proteins. (g1 The material must be capable of autoclave sterilization. (hl The material must be optically transparent. (1) It must be a chemically and biologically stable material. (jl It must be an inexpensive culture carrier. The present inventors adopted a specific foamed polyurethane as a support for a carrier that satisfies these conditions. The average pore diameter of the voids in the polyurethane foam used in the present invention was 7 μm to 3 μm.
The porosity is 60 to 100 mm. The size of the polyurethane is generally /0-7ctl~/06
It is cril. Usually, the size of the carrier varies greatly depending on its average pore diameter K, but suspension culture, reflux culture,
In fluidized bed culture, rotary culture, etc., it is preferable that the structure has a side length in the range of ioo μm to 700 μm. If it exceeds this range, it becomes difficult for the culture solution to sufficiently diffuse inside the carrier, and the adhesion surface inside the porous carrier cannot be used effectively. When using this culture carrier,
The average pore diameter of the porous carrier is usually 7 μm-so
oμm1 is preferably 70 μm to 100 μm. Furthermore, in consideration of internal diffusion of the culture solution, the carrier is preferably porous polyurethane. Moreover, it is preferable that the carrier has a nearly spherical shape. This is done in order to (1) diffuse the culture solution as uniformly as possible inside, (24) to lower the apparent viscosity of the culture solution, and (3) to minimize cell damage caused by collisions between carriers. On the other hand, when used as a fixed bed culture carrier, the size of the carrier varies greatly depending on the culture scale;
/O'ati range is preferable. In addition, in order to improve the diffusion of the culture solution inside the carrier, the average pore diameter is preferably larger than that of the carrier used for culturing in the fluidized state described above, and is generally SOOμm.
"" J Mlji range is preferable. In this case, the carrier can be obtained by cutting it to match the shape of the culture container. In addition to adhesion-dependent cells, floating cells such as hybridomas and protoplasts can also be cultured on the carrier of the present invention. In this case, the average pore diameter of the carrier is preferably relatively small, and the range is lμ771 − / 0 0μ
It is m. The specific gravity of a cell culture carrier varies greatly depending on the culture method and the amount of monomer impregnated, but generally the specific gravity is /. 00-
/． Preferably, the amount is 100 kg/ml. When targeting adhesion-dependent cells, the foamed polyurethane used in the present invention can be a continuous structure as long as it has a three-dimensional skeletal structure, or a semi-continuous structure with a membrane stretched between the skeletal structures. Either is fine. However, S/V
In order to increase the S/V value, it is preferable that the three-dimensional structure has a semi-continuous structure with an appropriate film stretched between the skeleton structures. cyi~/e0 0 0cnl/ml-;t? ! j
'y Rethane or more is preferable. It is already known that cells recognize the radius of curvature of the surface of adherent bodies (WS. Hu Biotechnology and Bioengineering. Vol. JO, p!; llg,
/ 9g]. That is, the larger the radius of curvature of the surface of the adherent, the better the adhesion and proliferation. In the case of polyurethane foam, it is preferable that the cell adhesion surface is outwardly convex and its radius of curvature is as large as possible, or that the cell adhesion surface is concave inward and is covered with a membrane. In the present invention, in order to impregnate and coat foamed polyurethane with a polymerizable monomer, the foamed polyurethane must be chemically resistant, and the polymerizable monomer component and diluent used must be a good solvent for the polyurethane. Preferably. The polymerizable monomer suitably used in the present invention is preferably a vinyl monomer that is hydrophilic and has little non-specific adsorption of proteins, etc. to the polymerized polymer, typically (meth). Examples include acrylic esters or (methanoacrylamide.Specifically, monohydroxyethyl (methacrylate), diethylene glycol (meth)acrylate, triethylene glycol (meth)acrylate, tetraethylene glycol (methanoacrylate, octaethylene glycol) (meth)acrylate, polyethylene glycol (meth)acrylate, methyl (meth)acrylate, glycerol (methanoacrylate% (meth)acrylamide, methyl (methacrylamide), ethyl (
[meth]acrylamide, glycidyl (meth)acrylate, chrycerol (meth)acrylate, Table 1/i below
Alternatively, the monomers shown in Table 11 below may be mentioned. In addition. In the table, Me group represents a methyl group, and Et group represents an ethyl group. Further, the CLOGP value is a value calculated by calculating the logarithm of the distribution coefficient of the monomer in the water-l-octanol system of the solute, and its significance will be described later. It is preferable to add a crosslinking agent component to the polymerizable monomer component appropriately selected from the above as necessary. Here, if the polymer membrane covering the surface of the support is water-insoluble, the crosslinking agent component is not an essential component, but the elution of soluble components from the polymer membrane and support, or the polymerized polymer It is preferable to add a crosslinking agent component in consideration of peeling of the film and the like. As the crosslinking agent component, a polyfunctional vinyl monomer that is copolymerizable with the above-mentioned monomer component and has as high hydrophilicity as possible is suitable. For example, ethylene glycol di(meth)acrylate, diethylene glycol di(meth)acrylate, triethylene glycol di(meth)
Examples include acrylate, polyethylene glycol di(meth)acrylate, glycerol di(methacrylate, trimethylolpropane tri(meth)acrylate, ethylene bis(meth)acrylamide, triethylenepis(meth)acrylamide, etc.). In order to minimize the leakage of body components, it is preferable to use it in Europe, but if the content of crosslinking agent components is too high, it may adsorb proteins in serum and physiologically active proteins secreted by cells. However, there may arise a problem that they cannot be efficiently recovered.Therefore, the content of the crosslinking agent component is preferably o.i-soM weight, especially /-JO weight.The present invention It is preferable to add a diluent to the above monomer.This allows the polyurethane foam to be impregnated into the inside of the polyurethane foam and coated uniformly.Moreover, the obtained polymer should have appropriate flexibility. The diluent added to the monomer component can be a diluent that dissolves the monomer and is inert to the functional groups of the monomer component, such as methacryloyl groups, hydroxyl groups, glycidyl groups, amide groups, amino groups, etc., or to foamed polyurethane. Suitable diluents generally vary depending on the type of diluent used. Usually, benzene, toluene, methyl isoptinoleketone,
Ethyl acetate, butyl acetate, l-hexanol, cyclohexanol, heptanol, octanol, cyclohexanone, dibutyl ether, tetrahydrofuran, mucodichloroethane, /, F-dioxane, chloroform, carbon tetrachloride, dimeterformamide, dimetersulfoxide, acetonitrile, Ethanol, gropanol, methanol, acetone, a mixed solution of the above-mentioned water-soluble organic solvents and water, etc. are suitable. Generally, the water-insoluble polymer for coating is preferably a non-porous membrane in order to increase the number of contact points between the cells and the polymer, but a microporous polymer membrane may also be used. When a good solvent is added to the monomer as the diluent, the coated water-insoluble polymer film becomes an optically transparent polymer film, whereas when a poor solvent is added, the coated water-insoluble polymer film becomes an optically transparent polymer film. opaque porous polymer M. ! :Become. Furthermore, even if the same solvent is used in Europe, if only one highly hydrophilic monomer or crosslinking agent is used, the resulting polymer film tends to be optically transparent. The amount of diluent added to all monomers is preferably O to IO times, particularly preferably /. 0-g. θ
It's double the amount. If too much diluent t is added, problems such as not only easy peeling of the polymer film but also a decrease in polymerization yield occur. The present inventors have discovered that the amount of positively charged functional groups is O. S~. 3.30 meq/g and of the corresponding positively charged monomer in the polymer. CLOG
P value is -2.0 to +ko. It has been found that a culture carrier with K in the range 0 has a good cell attachment rate, and also has good spreadability and proliferation. The amount of positively charged functional groups varies depending on cells and functional groups, but when it is low, cell adhesion generally deteriorates. On the other hand, when it is high, the adhesion rate is good, but when it exceeds the above range, cell spreadability and proliferation become poor again. It is not only the amount of functional groups that influences cell attachment and proliferation, but also the CLOGP value of the corresponding positively charged monomer in the polymerer. CL in the present invention K
OGP system is Pomona College (California)
(F by T. Nishioka (Kyoto University)
ACOM. 7. ．． ? ．． ? (edited program) and is defined as: C
As described above, the LOGP value is a value obtained by calculating the logarithm of the distribution coefficient of the monomer in the water-l-octanol system of the solute. This made it possible to quantitatively express the hydrophobicity of neutral molecules. The CLOGP value of the positively charged monomer unit in the present invention was also determined by this method. Functional groups that can be positively charged are
In the culture solution, some of it is considered to be in a dissociated state, but W. S. Hu et al. ．． It has been reported that the effect of the net charge amount on the growth rate in No. 10 is small or not regular at all (Biotechnology and Bioengineering, Vol. 1, p.
//jj-116.3. /9g') ). Therefore, the degree of hydrophobicity of the corresponding positively charged monomer unit in the polymer may be determined by considering the CLOGP value of a neutral molecule. In the present invention, the CLOGP value of the corresponding monomer unit is
In the case of a functional group with a value smaller than -2.0, the adhesion of cells to the culture carrier is poor;
Ko. If it is larger than O, cell adhesion and proliferation tend to be poor. CLOGP value is 11. The phenomenon that occurs when O is greater than O is called hydrophobic inhibition by the present inventors. In this case, it was also found that the culture carrier adsorbs physiologically active proteins secreted by cells. Furthermore,
CL of the monomer unit corresponding to the content of the monomer unit
Regularity was observed between the OGP values. That is, in order for cells to adhere and proliferate well on a culture carrier, CL
It has also been found that when the OGP value is low, it is preferable to increase the amount of functional groups, and when the OGP value is high, it is preferable to decrease it. The CLOGP value is 11. O~+ko. As a monomer unit having a positively charged functional group in the O range,
Examples include those shown in Tables 11 and 11 above. Even compounds not shown in Tables 17 and 11 are not limited to the compounds in the tables, as long as they do not exceed the scope of the claims of the present invention. The surface of polyurethane foam can be coated with a water-insoluble polymer according to the following procedure. A polymerization initiator is added to a monomer solution formed by mixing a monomer, a crosslinking agent, and a diluent. This solution is impregnated into foamable polyurethane, and the excess monomer solution is squeezed out by compressing the polyurethane, and then the monomer is polymerized under a nitrogen atmosphere. When producing a fixed bed carrier, foamed polyurethane is impregnated with a monomer and, in order to uniformly coat it, it is cut into pieces as small as F) / Oan or smaller and subjected to the above polymerization reaction. When manufacturing a fixed bed culture carrier suitable for a culture vessel, after cutting the carrier and performing the above-described operations, excess monomer solution is removed using a centrifuge. When the culture carrier is small, it is also possible to impregnate and coat it after filling it into a column. A point to be noted in the above manufacturing process is that when removing the excess monomer solution, it is necessary to prevent a liquid pool from forming inside the urethane. The following can be mentioned as the polymerization initiator used in the present invention. Peroxide-based polymerization initiators such as benzoyl peroxide, lauroyl peroxide, acetyl peroxide, etc. For azo polymerization initiators such as coazobis-111-cyclopropylpropionitrile, or ultra-low width polymerization initiators such as hydrogen peroxide solution-Fe2+ salt, peroxide salt monosodium hydrogen sulfate, triethylboron, diethylzinc, etc. It is possible to initiate polymerization. Here, the selection of the polymerization initiator varies greatly depending on the monomer, crosslinking agent, diluent, etc. When the monomer solution is water-soluble, a redonx polymerization initiator, a water-soluble azo polymerization initiator, ammonium peroxide, potassium peroxide-N, N. N'N'-tetramethylethylenediamine and the like are used. Furthermore, when the monomer solution is poorly soluble in water, a peroxide polymerization initiator or an azo polymerization initiator is preferably used. The polymerization temperature is generally preferably θ°C to SO°C in the case of a redox polymerization initiator, and 30°C to SO in the case of an azo polymerization initiator and a peroxide polymerization initiator.
If it is preferable to set the temperature to 00°C, the obtained polymer can be used as is. However, if the polymer does not contain any of the functional groups that can be charged, or if the amount of functional groups is less than the range stated in the claims, it may further contain functional groups that can be positively charged by chemical reaction. It must be introduced by chemical bonding. For example, a glycidyl group in a polymer can be easily chemically modified by reaction with an amine to introduce a positively charged functional group. hydroxyl groups in polymers,
In the case of a co,3-dihydroxyglobyl group, etc., a functional group that can be positively charged is obtained by reaction with cyanogen bromide to obtain shiimide carbonate, and then chemically modified by reaction with a diamine. It can be done. Similarly, a hydroxyl group or a co,3-dihydroxyglobyl group can be reacted with trichlorotriazine, and the resulting dichlorotriacyl group can be chemically modified by reaction with a diamine. Depending on the support, it is often difficult to measure the amount of positively charged functional groups introduced into the support. In that case, it is possible to separately coat a glass petri dish with the monomer, collect the polymer, and estimate the amount of positive charge by titration. Note that the amount of positive charge shown in the examples is a value estimated by the method described above. Methods for culturing using the cell culture carrier of the present invention vary depending on the culture scale, purpose of culture, etc., but include, for example, the following methods. 4. When using a Petri dish or T-flask: 4. Mort culture method, when using a spinner flask, roller bottle, suspension culture method, when using a fixed bed, fixed bed culture method, when using an air lift, etc. Examples include culture methods. The amount of culture carrier added varies depending on the culture method, but is generally preferably in the range of 5% to 60% of the culture solution. (Examples) Hereinafter, the present invention will be explained in detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to the following Examples unless the gist thereof is exceeded. (Example 1l) Polyethylene glycol methacrylate (PE one OO
;Made by Nippon Oil & Fats ■)! ．． /09, glycidyl methacrylate a. soy, polyethylene glycol dimethacrylate (4'G; manufactured by Shin Nakamura Chemical ■) Co. qota, l. Dardioxancho o. o y and methylene chloride o. Azo polymerization initiator dissolved in sml + 7) V-70 (
2. ．． 2'-7 Zohis (<<-methoxy'/11, cuvaleronitrile) manufactured by fO Hikari Pure Chemical Industries, Ltd.] aorn9 was mixed to prepare a monomer solution. Dissolved oxygen in the monomer solution was removed by passing nitrogen gas at room temperature. Foamed polyurethane (average pore diameter: 2SOμm, semi-open foam, manufactured by MD Kasei)
nL; 700 crd) was impregnated with the monomer bath liquid prepared above, and the excess monomer solution was compressed and squeezed out. The polyurethane pieces were placed in a glass container, heated to SO 0 C under a nitrogen atmosphere, and polymerized for one hour. After the polymerization reaction was completed, in order to remove residual monomers and dioxane, the product was washed with an acetone aqueous solution heated to SO 0 C, and finally with distilled water. Furthermore, after replacing this polyurethane piece with dioxane,
Into this is ethanolamine. Dioxane solution at θ2/
Drop oml, ? ! Amination was carried out for q hours at r°C. After the reaction was completed, the polyurethane piece was thoroughly washed with an aqueous solution of SO% acetone, and then washed with distilled water. The amount of polymer coated is /g. ! ; It was Chi. The corresponding positively charged monomer unit is methacrylic acid-11-hydroxyethylamino-11-hydroxyglobyl, whose CLOGP value is -0.649. The estimated amount of functional groups is approximately l. walnut milliequivalent/g,
The surface area is! ; 2 crd/ml, and the porosity was approximately 7 cm. (Example 1) Polyethylene glycol methacrylate (PE-3!)
;0; Nippon Oil & Fats ■) s. o y, glycidyl methacrylate 2.4Of, glycerol dimethacrylate Muda 02, /,9-dioxanco 0.0? and methylene chloride o. ■-70 of azo polymerization initiator dissolved in sml
(.2,.2'-Azobis(gumethoxy-11, cuvaleronitrile) manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was mixed to prepare a monomer solution. At room temperature, nitrogen gas was passed through the monomer solution to remove dissolved oxygen in the monomer solution. Foamed polyurethane (average pore diameter 7θμm, semi-open foam) ( / OanXI Ocm x 7cm: 700d)
was impregnated with the monomer solution prepared above, and the excess monomer solution was compressed and squeezed out. The polyurethane piece was placed in a glass container, heated to 60° C. under a nitrogen atmosphere, and a polymerization reaction was carried out for 2 hours. After the polymerization reaction is complete, to remove residual monomers and dioxane! ; Washed with SO% acetone aqueous solution at 0'C, and finally with distilled water. Additionally, this polyurethane foam was substituted with dioxane. Add 1 co-aminoethanethiol into this. A dioxane solution of θ/θml was added dropwise, and amination was carried out at 75° C. for a period of time. After the reaction was completed, the polyurethane piece was thoroughly washed with 50 g of acetone aqueous solution and then with distilled water. The amount of polymer coated is /co. It was 3%. The corresponding positively charged monomer unit is methacrylic acid monolambda-mercabutoetynoleaamino-hydrogyciglovir, whose CLOGP value is 1'l:, -o. It is otb. The estimated amount of functional groups is approximately /. 77 meq/g
The surface area was i y t,cnL/1nl, and the porosity was about Kukuchi. (Example-3) Thiethylene glycol methacrylate 7. Of, dimethylaminoethyl methacrylate}, z. t/IF(CL
OGP value i. ia3), glyceronol methacrylate o. s or r, tetrahydro 7 ranko/. 02 and the polymerization initiator V-15 [u,! -Azobis(co,dimethylpaleronitrile); Manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.] KoO
were mixed to prepare a monomer solution. Dissolved oxygen in the monomer solution was removed by passing nitrogen gas at room temperature. Foamed polyurethane (average pore diameter/00 μm, semi-open foam) ( / O cm X / O cm X 7
cm:? 00cd) was impregnated with the monomer solution prepared above, and the excess monomer solution was compressed and squeezed out. The polyurethane piece was placed in a glass container, heated to 1.0"C under nitrogen atmosphere, and polymerized for t hours. After the polymerization reaction was completed, it was heated to 50°C to remove residual monomers and dioxane. and finally with distilled water. The amount of polymer coated was q.s q6. The estimated amount of functional groups was approximately 7.3 milliequivalents/7. , the surface area was / / 7 7 / ml, and the porosity was about gl.
o ; Made by Nippon Oil & Fats ■) 7. Of, diethylamine ethyl methacrylate Ω. y3? (CLOGP value:
l. /gg), glycerol methacrylate/. ! 0
9,7! ;% tetrahydrofuran aqueous solution/g. 0? and the azo polymerization initiator V-b sC2.2-azobis(co,cudimethylvaleronitrile; Soiko Pure Chemical Industries, Ltd.
10 m9f were mixed to prepare a monomer solution. Dissolved oxygen in the monomer solution was removed by passing nitrogen gas at room temperature. Foamed polyurethane (average pore size 0 μm 5 semi-open foam) (5 cm x 3 cm x 3 (X;
d) was impregnated with the monomer solution prepared above, and the excess monomer solution was compressed and squeezed out. The polyurethane piece was placed in a glass container, heated to 60° C. under a nitrogen atmosphere, and a polymerization reaction was carried out for q hours. After the polymerization reaction was completed, in order to remove residual monomers and dioxane, it was washed with an acetone aqueous solution heated to 65°C, and finally with distilled water. The amount of extracted polymer was 6.7%. The estimated amount of functional groups is approximately /. The porosity was approximately 77%. Test Example 1 (Cell Culture Experiment Using the cell culture carrier manufactured in Example-7) The cell culture carrier prepared in Example 1 was thoroughly washed with distilled water, replaced with phosphate buffered saline (PBS), and further added with Dulbesoco's modified Eagle's medium (can be autoclaved). (Nissui Pharmaceutical ■
The tube was replaced with a 100% puree resin, and steam sterilized at 7°C for 10 minutes. Cell culture was carried out in e-RDF medium (Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.) and Dulbecco's modified Eagle medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. 9) containing /0% fetal bovine serum (Mitsubishi Chemical Co., Ltd.). The cells were Ver6 (African Green Monkey Kidney) cells, MDCK (Cotton Spaniel Kidney) cells, C6 (Rat Glial) cells, KN (Human Lung Cancer) cells, HeLa (Human Cervical Cancer) cells, and WI-.7g ( Normal diploid human fetal] cells. Test Example 2 (Static culture experiment) A cell culture experiment was conducted using an ACIn Petri dish. In each Petri dish, a piece of the cell culture carrier produced in Example-7 was placed. Approximately 1.0 ml of the cellulose was added and culture was started in a carbonate ink evaporator at 37°C.The adhesion and proliferation after 5 hours and 5 days were as follows.The cell density in the petri dish was The cell types were as follows: Cell density: Ccell5/mt) Vero cells?.!; X/07HeLa cells.
j X / 0″C6 cell g. / X /
0'CHO-K/cell 6. g X / 0'W
l-. 2g Cell Hacco X/07 Test Example J (
Suspension culture experiment) Suspension culture was carried out using a Svinner flask with a total volume of 1/k8073. Example 1 l in the Svinner flask,
The sterilized cell culture carrier pieces (O.jm1 square) manufactured in Example 1, Example 1, Example 3, and Example 1q were s.c. om
1, and serum 20. θml and e-RDF medium were added to make 300ml. Place Vero cells dispersed with trypsin into this. O
x/07cells sown,/! ; Culture was performed with continuous stirring at rpm. The carriers in each example all showed good adhesion and proliferation, and high-density culture was achieved. Test Example 4I (Measurement of protein adsorption amount) 00 ml of o.i% bovine serum albumin (Sigma Co., Ltd. phosphoric acid buffer solution (p8 7.110)) was prepared. The culture carrier synthesized in Example 3 and Example 1, and the polyurethane CI-Omm square) i0.O that was not subjected to polymerization treatment as a comparative example.
ml was added to the above solution and shaken at J°C. After S hours, the absorbance of the supernatant at 0 nm was measured, and the amount of bovine serum albumin adsorbed on the polyurethane was calculated. The results are shown in Table 3 below. Table 3 (Effects of the Invention) According to the present invention, since the polymerizable monomer constituting the culture carrier is liquid, it can be impregnated into polyurethane foams of various shapes and coated thereon. Thank you for this,
It has become possible to manufacture carriers suitable for various uses. The cell culture carrier of the present invention has a large S/V value (accumulation of adhesion surface per unit volume) and has pores through which the culture solution can flow, making it easy to achieve high-density culture.The curvature of the adhesion surface It has a large radius and has an appropriate amount of charge and hydrophobicity for cell growth.Since the foamed polycrethane surface is coated with a hydrophilic polymer component, non-specific adsorption of proteins is almost never observed. Other benefits include the fact that it is optically transparent, making it easy to observe cells, and autoclave sterilization is possible. It has become possible to efficiently produce monoclonal antibodies, vaccines, viruses, etc. Applicant: Mitsubishi Kasei Corporation Agent: Hasegawa (and one other person)

Claims (3)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）空隙の平均細孔径が１μｍ〜３ｍｍである発泡ポ
リウレタンの表面を、重合性モノマーを構成単位とする
水不溶性高分子で被覆してなり、または、更に、該水不
溶性高分子に正に荷電しうる官能基を化学結合してなり
、かつ発泡ポリウレタンの空隙率が６０〜９９％である
ことを特徴とする細胞培養担体。(1) The surface of foamed polyurethane whose voids have an average pore diameter of 1 μm to 3 mm is coated with a water-insoluble polymer having a polymerizable monomer as a constituent unit, or the water-insoluble polymer is 1. A cell culture carrier comprising chemically bonded functional groups capable of being charged, and characterized in that the polyurethane foam has a porosity of 60 to 99%. （２）水不溶性の重合性モノマーが、（メタ）アクリル
酸エステル、または（メタ）アクリルアミドであること
を特徴とする請求項１記載の細胞培養担体。(2) The cell culture carrier according to claim 1, wherein the water-insoluble polymerizable monomer is a (meth)acrylic acid ester or (meth)acrylamide. （３）被覆する水不溶性高分子の正に荷電しうる官能基
量が培養液中において、０．５０〜３．５０ミリ当量／
ｇであり、かつ相当する正に荷電しうるモノマー単位の
ＣＬＯＧＰ値が、−２．０〜＋２．０の範囲にあること
を特徴とする請求項１記載の細胞培養担体。(3) The amount of positively charged functional groups of the water-insoluble polymer to be coated is 0.50 to 3.50 milliequivalent/
2. The cell culture carrier according to claim 1, wherein the CLOGP value of the corresponding positively charged monomer unit is in the range of -2.0 to +2.0.