JPH02273177A - Ａｄｐ−グルコース・ピロホスホリラーゼをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素であるＡＤＰ−グルコース・ピロホスホ
リラーゼの単離、精製及び特性決定に関し、またＡＤＰ
−グルコース・ピロホスホリラーゼをコードするｃＤＮ
Ａのクローン類の同定に使用し得る抗体の製造に関する
０本発明はまた。小麦、トウモロコシ及び大麦のような
穀物植物中に産生ずるデンプンの収量を増加させるため
のｃＤＮＡクローン類の使用に関する。

デンプンは、葉において光合成が行なわれる間の炭酸固
定の重要な最終生成物であり、且つ種子や果実中の重要
な貯蔵生成物である。経済上の見地から、３種の穀物作
物、すなわち小麦、稲及びトロモロコシの食用部分によ
って生産されるデンプンは、カロリーとして計算した時
に世界中の食糧の約２７３を占める。

デンプンは光合成性の細胞中のプラスチド区画中で、即
ち葉緑体中で又は非光合成性の細胞中のアミロプラスト
中で合成される０葉におけるデンプン生合成の生化学的
経路はすでに十分に特徴づけられている（添付図面の第
１図参照）、これに対して、植物の貯蔵器官におけるデ
ンプン生合成の経路は、はとんど知られていない。しか
しながら、小麦の胚乳細胞から生の（ｉｎｔａｃｔ）の
アミロプラストを単離する方法の最近の進展は、貯蔵器
官におけるデンプン生合成の経路の解明に寄与している
。別の研究によれば小麦の胚乳におけるデンプン生合成
の経路と、小麦の葉におけるデンプン生合成の経路とは
異なることが明らかにされている（添付図面の第１図及
び第２図参照）。

プラスチド酵素であるＡＤＰ−グルコース・ピロホスホ
リラーゼは、光合成植物の諸器官におけるデンプン生合
成の重要な調節酵素である０葉緑体ＡＤＰ−グルコース
・ピロホスホリラーゼは、アロステリックエフェクター
である３−ホスホグリセリン酸及びオルトリン酸によっ
て翻訳後（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓ−１ａｔｉｏｎａｌｌ
ｙ）に調節される。従来研究された植物の葉のＡＤＰ−
グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素の全ては試験管内
で（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）も３−ホスホグリセリン酸によ
って活性化され、しかもフルクトース−１，６−ビスリ
ン酸、フルクトース−６−リン酸及びホスホエノールビ
ルビン酸によっては、活性化される度合は小さい、これ
らの代謝中間物質は基質のに１値を下げ、しかも酵素触
媒（ｅｎｚｙｍｓ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ）反応の最大速
度Ｖ−ａｘを増大させる。

更に、植物の葉由来のＡＤＰ−グルコース・ピロホスホ
リラーゼ酵素は、試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）でオル
トリン酸によって阻害されるが、この場合１００μＮよ
りも低いオルトリン酸濃度で該酵素の活性の半値最大阻
害（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ　１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ
）が一般に達せられる。

葉のデンプン生合成は、試験管内でＡＤＰ−グルコース
・ピロホスホリラーゼ酵素のレベル（ｌｅｖｅｌ）で、
３−ホスホグリセリン酸及びオルトリン酸の葉緑体内濃
度の変動（ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ）により調節される
。この調節機構にとって極めて重要なことは、葉緑体の
内膜の選択的透過性である。葉緑体の内膜は、トリオー
ス−リン酸、ジカルボキレート、及びオルトリン酸に対
して選択的に透過性であり。

そハらは葉緑体から細胞質ゾル（ｃｙｔｏｓｏｌ）へ急
速に且つ特異的に（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）輸送さ
れ、またその逆も起ることが明らかにされている。この
能動輸送（能動透過ともいう）の機構は、リン酸／トリ
オース−リン酸輸送体（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ）を
経て細胞質ゾルからオルトリン酸の向流平衡内部移動を
伴なう。オルトリン酸／トリオース−リン酸輸送体を経
由する代謝中間物質の能動輸送は、通常の昼−夜（ｌｉ
ｇｈｔ−ｄａｒｋ）の推移の間のプラスチド内のオルト
リン酸と３−ホスホグリセリン酸の比（すなわち、　（
Ｐｉ）／（３−ＰＧＡ））の変化を伴なう、光合成の間
に、Ｃ０７−同定から生成した３−ホスホグリセリン酸
は、葉緑体中に蓄積する。葉緑体の内部から細胞質ゾル
迄の間の３−ホスホグリセリン酸について生じた濃度勾
配は、オルトリン酸を移送するのと引替えに３−ホスホ
グリセリン酸の若干を細胞質ゾル中に移送（ｅｘｐｏｒ
ｔ）することを招く、移入されたオルトリン酸は、次後
に光リン酸化を経て＾ＴＰ生成に利用され、そのために
（ＰＬ）　／　（３−ＰＧＡ）の葉緑体内の総体的な比
（ｏｖｅｒａｌｌ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｉｃ　ｒａ
ｔｉｏ）は、昼間周期の間は低いままである。このよう
にして。

ＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素は、デン
プン生合成を続けさせながら、明所中ではアロステリッ
クに活性化される。夜間周期の間は、ＣＯ□−固定の減
少及び光リン酸化の低下があり、それに伴なって、ＡＴ
Ｐの加水分解の結果として葉緑体内のオルトリン酸濃度
の増加がある。これは葉緑体内の（Ｐｉ）／　（３−Ｐ
ＧＡ）の比を大きくし、それによってＡＤＰ−グルコー
ス・ピロホスホリラーゼ活性とデンプン生成とを阻害す
る。

アロステリックエフェクターによるＡＤＰ−グルコース
・ピロホスホリラーゼ活性の調整（モジュレーション）
に加えて１葉のデンプン生合成は、葉緑体のアデニル酸
エネルギー充足によっても調節される見込みもある。

発育中の胚乳におけるデンプン生合成の最も重要な調節
因子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｆｅａｔｕｒｅ）は、デ
ンプン生合成用の酵素の合成の調節を経る粗い（ｃｏａ
ｒｓｅ）制御機構である可能性が多い、最近の研究では
、デンプン生合成経路における律速酵素（ペースメーカ
ー酵素ともいう）の同定にかなり重点をおいている。あ
いにく、穀物植物の胚乳の発育する期間全体にわたるデ
ンプン生合成用酵素について試験管内（ｉｌ　ｙｉｔｒ
ｏ）の酵素活性の測定に関する研究は、この問題を余り
解明するところがない、その理由は、試験管内（ｉｎ　
ｖｉｔｒｏ）の酵素活性と生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）の
酵素活性とを互いに相関づけることが難しく、また大部
分のデンプン生合成用酵素は同等（ｃｏ−ｏｒｄｉｎａ
ｔｅｌｙ）に発現すると思われるからである。

現在のところ、ＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラー
ゼの翻訳後調節が、穀物植物の貯蔵器官において生体内
（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で発現して働らくことを実質的に示
す証拠はない、穀粒のアミロプラストは、正常な発育中
には、葉緑体になるまで、発育せず、しかも機能上でも
関係しない、上記因子は、小麦の胚乳でのデンプン生合
成経路にトリオースリン酸が掛かり合いをもたない事実
に組合せて考えると穀物の胚乳のアミロプラストにおけ
るＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼのアロステ
リック制御は、生体内では何らの役割りがないことを示
唆する。しかしながら、トウモロコシの胚乳由来のＡＤ
Ｐ−グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素は、３−ホス
ホグリセリン酸によって、試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ
）では、植物の葉から単離した該酵素と同じ程度迄活性
化される。反対に、稲の胚乳由来のＡＤＰ−グルコース
・ピロホスホリラーゼ酵素は、５ｍＭの３−ホスホグリ
セリン酸（３−ｐｈｏｓｐｈｏ−ｇｌｙｃａｒａｔｅ）
によって試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）では僅か１．２
倍だけ活性化されるのみである。

穀物植物の胚乳の酵素の全てに関して、３−ホスホグリ
セリン酸の存在は、オルトリン酸による阻害に対する前
記酵素の感受性を低減し、このことは３−ホスホグリセ
リン酸が、オルトリン酸の結合する部位（サイト）に近
い所で、該酵素に結合することを示している。すなわち
、胚乳のＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素
中においてアロステリックエフェクターが結合する部位
が保存されであることに拘わらず、また３−ホスホグリ
セリン酸によって試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）でトウ
モロコシ胚乳の酵素が強く活性化される能力があるにも
かかわらず、上記の７０ステリツク効果が生体内で働く
意義（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）は未だよくわかって
いない。

本発明の目的は、実質的に純粋な形のＡＤＰ−グルコー
ス・ピロホスホリラーゼを提供することにある。

本発明の要旨によれば、実質的に純粋なＡＤＰ−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼが提供される。

本発明の別の要旨によれば、酵素ＡＤＰ−グルコース・
ピロホスホリラーゼを含有する粗酵素抽出液をゲルクロ
マトグラフィーによって連続精製することを特徴とする
酵素ＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼの精製方
法が提供される。

前記の粗製酵素は、小麦の胚乳から単離し得る。

また１本発明の要旨によれば、　（ｉ）　ＡＤＰ−グル
コース・ピロホスホリラーゼをコードし且つ添付図面の
第３図に示したヌクレオチド配列を有する小麦の葉のｃ
ＤＮＡ、それを含有するプラスミドｗＬ：＾ＧＡ。

１、並びに寄託番号ＮＣｌ８４００６５として、１９８
８年１０月１９日付で英国アバディーンのザ・ナショナ
ル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・
マリン・バクテリアに寄託されである前記プラスミドＷ
Ｌ：ＡＧＡ、１を含有して保留している大腸菌（Ｅ、ｃ
ｏｌｉ）ＴＧ２： （ｉ）　ＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼをコ
ードし且つ添付図面の第４図に示した配列を有する小麦
の胚乳ｃＤＮＡ、それを含有するプラスミドｌ１ｌＥ：
ＡＧＡ、３．並びに寄託番号ＮＣＩＢ４００６６として
、１９８８年１０月１９日付で英国アバディーンのザ・
ナショナル・コレクシ扇ン・オブ・インダストリアル・
アンド・マリン・バクテリアに寄託されてある、前記プ
ラスミドＷＥ：ＡＧＡ、３を含有して保留している大腸
菌ＴＧ２：及び （ｉ）　ＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼをコ
ードし且つ添付図面の第５図に示したヌクレオチド配列
を有する小麦の胚乳ｃＤＮＡ、それを含有するプラスミ
ドｗＥＳＡＧＡ、７．並びに寄託番号ＮＣｌＢ４Ｏ０６
７として、１９８８年１０月１９日付でザ・ナショナル
・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マ
リン・バクテリアに寄託されてある、前記プラスミドＩ
Ｅ：ＡＧＡ、７を含有して保留している大腸菌ＴＧ２、
が提供される。

前記のクローン類は、他の植物種、特に穀類例えば小麦
、トウモロコシ、大麦及びモロコシ（ｓｏｒｇｈｕｍ）
、並びに食用作物例えばジャガイモ、の同等の遺伝子用
のプローブとして使用し得る。

更に、本発明の要旨によれば、添付図面の第３図、第４
図及び第５図にそれぞれ示したアミノ酸配列を有する前
記（１）、（ｉ）及び（ｉ）のｃＤＮＡ類によって発現
された酵素類が提供される。

本発明の更に別の要旨によれば、前記ＡＤＰ−グルコー
ス・ピロホスホリラーゼに対する抗体が提供される。

前に定義したｃＤＮＡ類の主な用途は、デンプン生合成
を調節するための作物植物の形質転換に利用するにある
。従って、本発明の別の要旨によれば、前記（ｉ）、（
ｉ）及び（ｉ）のｃＤＮＡの１種又はそれ以上の１つ又
はそれ以上のコピーを含有する形質転換された植物が提
供される。

以下の記載では、小麦からＡＤＰ−グルコース・ピロホ
スホリラーゼを単離する方法、小麦の胚乳及び葉の前記
酵素の動力学的性質、ＡＤＰ−グルコース・ピロホスホ
リラーゼをコードしたｃＤＮＡクローン類の単離方法を
説明する。また、前記ｃＤＮＡ類の構造上の特徴も詳細
に記載する。前記クローン類は対応する遺伝子の単離に
使用し得る。また前記ｃＤＮＡ類と前記遺伝子類の両方
は、デンプンの収量の増大を生起させる諸研究に使用で
きる。１つの可能な応用の用途は、デンプン生合成にお
ける正味（ｎｅｔ）の調節にどのようにＡＤＰ−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼが寄与しているか決定するた
めに、形質転換された作物植物におけるＡＤＰ−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼの遺伝子の導入量を増加させ
、次いでその後に１例えば穀物植物において穀粒がみの
る過程中に蓄積されたデンプンの量又は濃度を変えるた
めに、前記ＤＮＡ配列を使用することであろう、小麦の
胚乳のＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼの遺伝
子の付加的なコピーの導入は、小麦の胚乳のアミロプラ
スト内の酵素の濃度をより大きくするはずである。遺伝
子の発現の増大も、ＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼ遺伝子の５′−未転写領域中にエンハンサ−（ｅ
ｎｈａｎｃｅｒ）配列の多数のコピーを導入することに
よって励起され得る。

前記酵素がデンプン生合成に対して律速酵素である場合
には、その場合にはデンプン生合成速度が、形質転換さ
れた植物において増大すると期待される１本発明を利用
すると、タンパク質工学により胚乳酵素の動力学的諸性
質を変えることもできる、例えばオルトリン酸結合部位
を巧みに加工操作することによって上記酵素をオルトリ
ン酸阻害に対する感受性が低くすることができる。多数
の別のパラメーターも改善し得ることも明らかであろう
。

本発明を、実例として以下の実施例により、添付図面を
参照して説明する。

添付図面の第１図は葉におけるデンプンとグルコースの
生合成経路に伴なう諸反応を示す（Ｐｒｅｉｓｓ　（１
９８４年）を修正した〕。使用した略語は以下のものを
表わす、すなわち、Ｇ−３−Ｐはグリセルアルデヒド−
３−リン酸を表わし；　ＤＨＡＰはジヒドロキシアセト
ンリン酸を表わし；Ｐｉはオルトリン酸を表わし；　Ｐ
Ｐｉは無機ピロリン酸を表わす。前記反応は次の酵素に
よって触媒的に促進される。

１）ホスホグリセリン酸・キナーゼ／グリセルアルデヒ
ド−３−リン酸・デヒドロゲナーゼ２）トリオース−リ
ン酸・イソメラーゼ３）アルドラーゼ ４）フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ５）ヘ
キソース−リン酸・イソメラーゼ６）ホスホグルコムタ
ーゼ ７）　ＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼ８）デ
ンプンシンターゼ ９）　ｕｏｐ−グルコース・ピロホスホリラーゼ１０）
スクロースリン酸シンターゼ １１）スクロースホスファターゼ １２）オルトリン酸／トリオースリン酸輸送体１３）無
機ピロホスファターゼ 添付図面の第２図は、小麦の胚乳におけるデンプン生合
成の提案された代謝経路（Ｋｅｅｌｉｎｇら、１９８８
年）を示す。使用した略号は第１図と同じである。この
反応は次の酵素によって触媒的に促進される。

ｌ）スクロースシンターゼ ２）　ＵＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼ３）へ
キソキナーゼ ４）ホスホグルコムターゼ ５）ヘキソース−リン酸・イソメラーゼ６）　ＡＴＰ−
依存ホスホフルクトキナーゼ７）　ＰＰ１−依存ホスホ
フルクトキナーゼ８）アルドラーゼ ９）トリオース−リン酸・イソメラーゼ１０）ヘキソー
ス−リン酸輸送体（？）１１）　ＡＤＰ−グルコース・
ピロホスホリラーゼ１２）デンプンシンターゼ １３）スクロースホスフェート・シンターゼ１４）スク
ロースホスファターゼ 第３図はクローンＷＬ　：　ＡＧＡ、１のＤＮＡ配列を
示し；第４図はりｏ　−：／ＩＩＥ　：　ＡＧＡ、３の
ＤＮＡ配列を示し；第５図１＊　’）　ｏ　−ンＷＥ　
：　ＡＧＡ、７（７）ＤＮＡ配列ヲ示ス。

Ａ叶−グルコース・ピロホスホリラーゼをフェニル−セ
ファロース上でクロマトグラフィーで部分的に精製し、
次いでイオン交換媒体ＭｏｎｏＱ　ＨＲ５１５上で２回
精製し、更にゲル濾過媒体、すなわち５ｕｐｅｒｏｓｅ
１２　ＨＲ１０／３０を通して１回精製することによっ
て、精製した６代表的な精製結果を次の第１表に示した
。

前記精製操作の各工程でためた（ｐｏｏｌｅｄ）ＡＤＰ
−グルコース・ピロホスホリラーゼ抽出液をＳＯ８／ポ
リアクリルアミドゲルで分析した。ゲル濾過の後では、
酵素標品中にはほとんどタンパク質不純物はなく、荷酵
素標品は９０％よりも高い純度であった。

分子量５１，０００のポリペプチドは、前記精製の各工
程で選択的に精製された。すなわち、小麦の胚乳のＡＤ
Ｐ−グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素はサブユニッ
ト分子量５１，０００を有する。

小麦の胚乳のＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼ
の本来の（ｎａｔｉｖｅ）分子量は、前記の部分的に精
製された酵素を５ｕｐａｒｏｓｅ　１２　ＨＲ１０／３
０上で再びクロマトグラフィー精製することにより２４
５．Ｇｏ。

±３，０００であると決定された。これは、タンパク質
を５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−３００ｓｆ上でりＯ？トゲ
ラフイー精製することにより決定された推定分子量２６
０．０００±２０，０００とほぼ一致している。各々の
場合に、　ＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼ活
性の溶出容量を、既知のタンパク質標品、フェリチン、
カタラーゼ及びウシ血清アルブミンの溶出容量と比較す
ることによって分子量を決定した。このようにして、本
発明者らは、小麦の胚乳の酵素は同一の分子量の４つの
サブユニットからなると結論を下した。

１．２　　　の動力学・性 部分的に精製した小麦の胚乳のＡＤＰ−グルコース・ピ
ロホスホリラーゼは、２０＋ａＭ　３−ホスホグリセリ
ン酸迄の濃度では活性化されなかった。これに対して、
小麦の葉の酵素は、１００μＭ３−ホスホグリセリン酸
によって１４．５倍活性化される。小麦の胚乳の酵素は
、酵素活性の半値最大阻害を得るために必要な７００μ
にのオルトリン酸を用いて、オルトリン酸で阻害される
ことが認められた。これは、小麦の葉のＡＤＰ−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼの半値最大阻害を得るのに必
要な濃度（５６μＭ）よりもかなり高い、トウモロコシ
の胚乳のＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼはア
ロステリック応答性（ｒｅｓｐｏｓｉｖａｎｅｓｓ　）
を同様に欠くことが、先に既に観察されている。トウモ
ロコシの胚乳においては、このｖ！Ａ象は、それ以来、
前記酵素に対するプロテアーゼ活性の影響のせいだとさ
れていた。

その理由は、１　、５ｍＭ　フェニルメタンスルホニル
フルオリド及び１０μｇ／ｍｕキモスタチンの存在下で
精製した場合には、トウモロコシの胚乳のＡＤＰ−グル
コース・ピロホスホリラーゼは、３−ホスホグリセリン
酸によって試験管内（ｉｎｙｉｔｒｏ）で活性化される
ことが証明されているからである。しかしながら、本発
明者らは、プロテアーゼ阻害物質であるキモスタチン、
ロイペプチン及びフェニルメタンスルホニルフルオリド
の存在下で小麦の胚乳のＡＤＰ−グルコース・ピロホス
ホリラーゼを精製した。

本発明者らは、３−ホスホグリセリン酸による、試験管
内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）での上記酵素標品のアロステリ
ック活性化を例証することができなかった。従って、上
記の結果は、小麦の胚乳の酵素は３−ホスホグリセリン
酸によってアロステリックに活性化されないことを示唆
する。

植物の葉のＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼ酵
素に対する３−ホスホグリセリン酸とオルトリン酸の組
み合わさった効果と一致して、小麦の胚乳の酵素の阻害
は３−ホスホグリセリン酸によって除去される。１鱈の
３−ホスホグリセリン酸の存在下では、オルトリン酸に
対する小麦の胚乳のＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼの１．、、は１．５ｍＭ迄増加する。これは前記
酵素は３−ホスホグリセリン酸の存在下で該酵素をより
活性な形に変えるのに必要な、必要配座変化をすること
ができないが。

該酵素が代謝中間物質には結合できることを示す。

この３−ホスホグリセリン酸とオルトリン酸との相互作
用からみて、３−ホスホグリセリン酸の結合部位は、恐
らくは前記酵素の３次元構造内のオルトリン酸結合部位
に近いであろう。

１．３酵素に対する　　の　生 多数の別々の実験から前記のようにして単離した、単離
酵素サブユニットをプール（ｐｏｏｌ）することによっ
て、ウサギを免疫化させるのに十分なタンパク貿を得た
。次いで５１ＫＯのＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼポリペプチドをポリアクリルアミドゲルの薄切り
（スライス）から電気溶出によって明白な同質性物（ｈ
ｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）に精製した。

５１ＫＤのＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼポ
リペプチドに対する抗血清を調製した。ウサギの免疫処
理は、本質的にＭａｙｅｒ及びＷａｌｋｅｒの方法（１
９７８）に従って行なった。

得られた免疫血清は、小麦の胚乳の粗抽出物がらＡＤＰ
−グルコース・ピロホスホリラーゼ活性体（Ａｃｔｉｖ
ｉｔｙ）を沈殿させた。免疫血清と共に抽出物を培養し
、酵素−Ｉｇγ−プロティンＡ−セファロース接合体を
遠心分離した後に、ＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼ活性体の１０％のみが上澄画分中に残った。洗滌
した酵素−Ｉｇγ−プロティンＡ−セファロース接合体
を、酵素活性について、直接に検定すると、ＡＤＰ−グ
ルコース・ピロホスホリラーゼ活性体をペレット画分中
に検出できた。胚乳抽出物中に存在する全酵素活性体の
約７０％が、次後にペレット画分中に免疫沈殿物として
回収された。

対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）実験では、ＡＤＰ−グルコース
・ピロホスホリラーゼを用いて動物類を初期免疫処理す
る前に該動物類から採取した前免疫（ｐｒｅ−ｉ＋ｍ＋
ｍｕｎｅ）血清は、ＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼ活性体を分配（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）　Ｌ＋なか
った。抗−小麦胚乳ＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼ血清を使用した小麦の胚乳の可溶性タンパク質全
体のウェスタン・プロット分析によれば、単一の５１ｋ
Ｄの免疫活性ポリペプチドの存在が明らかにされた。同
様の実験では、ホウレンソウの葉のＡＤＰ−グルコース
・ピロホスホリラーゼホロ酵素に対して誘導された抗体
もまた、５１ｋＤの分子量の小麦胚乳内にのみ存在する
１つのポリペプチドと認められた。

１．４胚　及び葉の酵素のサブユニット構造小麦の胚乳
及び小麦の葉の中のＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼの器官特異（ｏｒｇａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）イ
ソ酵素の存在を、酵素サブユニットを検出するための抗
−小麦胚乳ＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼ血
清を使用して、前記の器官由来のタンパク質抽出物のウ
ェスタンプロット分析によって確認した。前述のように
、小麦胚乳の酵素は４つの５１ｋＤサブユニツトからな
る。小麦の葉のイソ酵素のサブユニット構造を決定する
ためのウェスタンプロット試験では、小麦の葉の粗抽出
物中には免疫活性タンパク質のバンド（ｂａｎｄ）は検
出できなかった。小麦の葉の抽出物を、フェニル−セフ
ァロース及び５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２　ＨＲ１Ｇ／３Ｇ
上でクロマトグラフィー精製した後には、４８．５〜４
９．０ｋＤの分子量を有する単一の免疫活性ポリペプチ
ドがウェスタンプロット中に検出された。従って、小麦
の葉のＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼポリペ
プチドは、小麦の胚乳由来の対応するタンパク質よりも
約２．５ｋＤ小さい、小麦の葉の酵素と胚乳の酵素との
間の相異を示す別の証拠（ｅｖｉｄｅｎｃｅ）を以下に
示す。

オファージを選別した。最初の選別で選択した７つの陽
性クローンのうち、最も強い信号を発生する３つのクロ
ーンを再選別した。これら３つのクローンのうちの１つ
だけが次回の選別で強い陽性信号を発生した。非組換体
λＧＴＩＩに関連して、上記ｃＤＮＡクローンが出した
信号の強さは、該クローンが小麦の葉のＡＤＰ−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼをコードしたｃＤＮＡを含有
することを示唆する。

小麦の葉のＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼを
ｃＤＮＡクローンと推定されるものをｖＬ　：　ＡＧＡ
、１と命名した。　ＤＮＡはりｏ−ンＷＬ：ＡＧＡ、１
カらｍ製した。

小麦の葉のＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼを
コードしたｃＤＮＡクローンを同定するために、抗−ホ
ウレンソウの葉ＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラー
ゼ血清を用いて、増殖させたホウレンソウの葉ｃＤＮＡ
ライブラリーから３Ｘ１０”個のバクテリ上記ＤＮＡを
酵素ＥｃｏＲ１を用いて制限エンドヌクレアーゼ消化し
、アガロースゲルで電気泳動にかけた後で、りｏ−ンＷ
Ｌ：ＡＧ＾、１は９５０ｂＰ　ノ大きさノＣＤＮＡ挿入
断片を含有することが明らかにされた。上記ｃＤＮＡ挿
入断片をニックトランスレーションによってａｌｐでラ
ベルし、小麦の葉及び小麦の胚乳由来のポリ（Ａ）−含
有ＲＮＡのノーザンプロットをプローブするのに使用し
た。このプローブは、小麦の胚乳及び小麦の葉のＲＮＡ
試料中の、それぞれ約１．８ｋｂ及び１．７ｋｂのｍＲ
ＮＡバンドとハイブリダイズする。

ここで決定された小麦の葉及び小麦の胚乳のＡＤＰ−グ
ルコース・ピロホスホリラーゼｍＲＮＡの大きさは。

稲の胚乳のＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼを
コードしたｃＤＮＡでプローブした小麦ＲＮＡ類のノー
ザンプロットから、　Ｋｒ１ｓｈｎａｎらによって得ら
れた評価（ｅｓｔｉｍａｔｅ）　（１９８６年）と密接
に一致した。前記のｃＤＮＡ挿入断片の大きさと同様の
ｍＲＮＡ種の大きさの比較によって、ＷＬ：ＡＧＡ、１
ｃＤＮＡ挿入断片は、完全な小麦の葉のＡＤＰ−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼｍＲＮＡ配列の約５０％を含
有することが示された。

２．２りｌ：ｌ−ンｖｔ、　：　ＡＧＡ、ｌのクローン
礼：　ＡＧＡ、１由来のｃＤＮＡ挿入断片は９４７ｂｐ
の長さであり、且つ小麦の葉のＡＤＰ−グルコース・ピ
ロホスホリラーゼのＣ−末端に３０１個のアミノ酸をコ
ードする（第３図参照）、上記ｗＬ：ＡＧＡ、１タンパ
ク質中には、成熟した小麦の葉のＡＤＰ−グルコース・
ピロホスホリラーゼポリペプチド配列の約７０％が含ま
れる。前記ｃＤＮＡは、対応するｍＲＮ＾の３′−未翻
訳領域中に４５個のヌクレオチドまで伸び（ａｘｔｅｎ
ｄ）、且つ位９９４２〜９４７に配置された推定のポリ
アデニル化信号Ａ　Ａ　Ｔ、Ａ　Ａ　Ａで終わる。従っ
て、小麦の葉のＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラー
ゼｍＲＮＡ配列中にはポリ（Ａ）尾（ｔａｉｌ）は存在
しない、ヒトロバシー・インデックス（ｈｙｄｒｏｐａ
ｔｈｙ　Ｉｎｄｅｘ）（ＫｙｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｌａ
、１９８２年）及び第２の構造予言（ｐｒｅｄｉｃｔｉ
ｏｎ）　（ＣｈｏｕとＦａｓｓ＋ａａｎ、１９７８年）
は、Ｄａｖｅｒｅｕｘら（１９８７年）のプログラムを
使用して前記１１１Ｌ：ＡＧＡ、１タンパク質について
算出された。前記ｖＬ：ＡＧＡ、１のＫｙｔａとＤｏｏ
ｌｉｔｔｌｅ　（１９８２年）のヒトロバシー・インデ
ックスは、葉緑体の可溶性画分中の配置（ｌｏｃａｔｉ
ｏｎ）　（ＫａｉｓｅｒとＢａｇｓｈｏ＋ｍ、　１９７
９年）と一致している。　Ｃ１ｏｕとＦａｓｗ＋ａｎの
第２の構造予言は、小麦の葉と小麦の胚乳のＡＤＰ−グ
ルコース・ピロホスホリラーゼタンパク質の比較に用い
た（後記参照）。

小麦の胚乳のｃＤＮＡライブラリーを作った。−本鎖化
ｃＤＮＡの前精製（ＧｕｂｌｅｒとＨｏｆｆ＋ｍａｎ、
１９８３年）を行なわずに、２本鎖ｃＤＮＡの合成にＲ
ＮアーゼＨ（リボヌクレアーゼ（１）と大腸菌ＤＮＡポ
リメラーゼエを用いる方法で、オリゴｄＴ−セルロース
精製した小麦の胚乳ＲＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを調製し
た。未増殖小麦胚乳のｃＤＮＡライブラリーは、小麦の
葉の＾ＯＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼｃＤＮＡ
挿入断片、％ｌＬ：ＡＧＡ。

１に対して相同性の配列の存在について選別された。３
Ｘ１０’個の組換えバクテリオファージの選別において
、１０個の陽性信号が検出された。これら１０個のクロ
ーン類のうちの６個を２回の追加の選別の間にプラーク
精製し、これらをクローンｗＥ：ＡＧＡ、１、ＷＥ　：
　ＡＧＡ、３、すＲ：　ＡＧＡ、４、ＷＥ　：　ＡＧＡ
、５．ＷＥ　：ＡＧＡ、６及びＷＥ　：　ＡＧＡ、７と
命名した。これら６個の小麦の胚乳のＡＤＰ−グルコー
ス・ピロホスホリラーゼｃＤＮＡクローンと推定される
ものからＤＮＡを調製した。上記ＤＮＡ類をＥＣｏＲｌ
を用いて制限エンドヌクレアーゼ消化し、アガロースゲ
ル電気泳動を行なった後には、前記クローン類のｃＤＮ
Ａ挿入断片類の大きさは４００ｂｐ〜１８００ｂｐの範
囲にわたることが示された。

２．４　りｏ−ンＷＥ：ＡＧＡ、３の配りローンＷＥ：
ＡＧＡ、３由来のｃＤＮＡ挿入断片は１２７２ｂｐの長
さであり（第４図参照）、該ｃＤＮＡは３′−末端に６
５個のヌクレオチドの長さのポリ（Ａ）尾（ｔａｉｌ）
を含む。ＴＡＧ終止コドンからポリ（Ａ）尾の始め迄の
ＷＥ：ＡＧＡ　、　３ｃＤＮＡの３′−未翻訳領域は、
３１７ｂｐの長さである。３１７ｂｐのＷＥ：ＡＧＡ、
３ｃＤＮＡの３′−未翻訳領域には２つの重複したポリ
アデニル化信号が存在し；このうちの１つの配列ＡＡＴ
ＡＡＡはポリアデニル化部位の１０４ｂＰ上流に配置さ
れ、もう１つの配列ＡＡＴＡＡＧはポリアデニル化部位
の１００ｂｐ上流に配置される。

クローンリＥ；＾ＧＡ、３はまた、ポリアデニル化部位
から３１ｂＰ上流の位置１１７６〜１１８１に第３のポ
リアデニル化信号と推定される信号、　ＡＡＴＡＡＡを
含む。植物ｄＮＡＮ生類中リアデニル化信号の位置は、
通常ポリアデニル化部位のヌクレオチド２２〜３６個分
上流に存在する（Ｊｏｓｈｉ、　１９８７年）ので、こ
の場合クローンＷＥ：ＡＧＡ、３中の上記第３のポリア
デニル化信号は、多分対応するＡＤＰ−グルコース・ピ
ロホスホリラーゼｍＲＮＡのプロセッシング（ｐｒｏｃ
ｅｓｓｉｎｇ）の間に、ポリ（Ａ）付加部位の選択を意
味する信号であるらしい、クローンＶＢ：ＡＧＡ、３の
転写解読枠は、小麦の胚乳のＡＤＰ−グルコース・ピロ
ホスホリラーゼのアミノ酸２９６個をコードした８９０
ｂｐの長さである。

すなわち、分子量３３，２００のタンパク質が、クロー
ンＷＥ：ＡＧＡ、３によってコードされ、該クローンは
成熟生麦の胚乳のＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラ
ーゼサブユニットの６５％の大きさに相当する。

２．５りｏ−ンＷＥ：ＡＧＡ、７の配　　折数も大きな
小麦胚乳ＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼｃＤ
ＮＡ、すなわち１１８：ＡＧＡ、７は、１７９８ｂｐ（
７）長さであり（第５図参照）　、１５００ｂρの転写
解読枠を含有する。この転写解読枠は分子量５５，００
０のタンパク質をコードし、該タンパク質は成熟小麦の
胚乳のＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼポリペプ
チドの約４，５ｋＤと推定された分子量を越える。

クローンＩＩ！Ｅ：ＡＧＡ、７によってコードされた最
初の３３個の残基からなるアミノ酸配列は、葉緑体タン
パク質のシグナルペプチド（ｔｒａｎｓｉｔ　ｐｅｐｔ
ｉｄｅともいう）　（ＣｏｌｍａｎとＲσｂｉｎｓｏｎ
、　１９８６年）及びアミロプラストのシグナルペプチ
ド、すなわち顆粒結合（ｇｒａｎｕｌｅ−ｂｏｕｎｄ）
デンプンシンターゼ（Ｋｌｏｓｇｓｎら、１９８６年）
に似た性質を示す、上記配列は加水分解されてあり且つ
塩基性のアミノ酸類、特にアルギニンが多く、該アルギ
ニンは該配列中に４〜５残基毎に見出される。ＡＤＰ−
グルコース・ピロホスホリラーゼシグナルペプチドと推
定されるシグナルペプチドと顆粒結合したデンプンシン
ターゼシグナルペプチドとは、アミノ酸含有量において
類似しているのにもかかわらず、明らかな配列相同性は
存在しない。また、核をコードした葉緑体タンパク質の
シグナルペプチド配列、例えばＲｕｂｉｓｇ。

の小さいサブユニット（ＭａｚｕｒとＣｈｕｉ、　１９
８５年）及び酸素放出錯体の１６に！］のポリペプチド
（Ｊａｎｓｅｎら。

１９８７年）に相同性の（ｈｏ■ｏｌｏｇｙ）配列は存
在しない。

プレーＡＤＰ−グルコース・ホスホリラーゼポリペプチ
ドの正確なプロセッシング部位は、上記の諸研究では決
定されておらず、しかも小麦の胚乳由来の成熟タンパク
質のＮ−末端アミノ酸配列の分析を必要とする。しかし
ながら、　Ｎｅｔ（メチオニン）とＣｙｓ（システィン
）の間の前駆体ポリペプチドの切断は、成熟ＡＤＰ−グ
ルコース・ピロホスホリラーゼの概略の分子量、すなわ
ち５１，８００の、タンパク質を生成するであろう、更
にまた、Ｒｕｂｉｓｃｏの小さいサブユニットの葉緑体
特異的シグナルペプチドもまた、システィンとメチオニ
ン残基の間の境界で除かれる。これに対してアミノプラ
スト特異的デンプンシンターゼシグナルペプチドは、シ
スティンとアラニン残基との間の境界で除かれる（Ｋｌ
ｏｓｇａｎら、１９８６年）。

さらに、クローンＷＥ：ＡＧ＾、７は、ＴＡＧ終止コド
ンからポリ（Ａ）尾の始め迄の２１８ｂｐの３７−未翻
訳領域を含む、前記未翻訳領域は、２つの重複するポリ
アデニル化信号と推定される信号すなわち、位置１７２
８〜１７３３のＡＡＴＡＡＡと位置１７３２〜１７３７
の＾ＡＴＡＡＧとを含む、これらのポリアデニル化信号
は、ポリアデニル化部位からそれぞれ４５ｂｐ及び４１
ｂｐ上流に配置され、且つクローンリＥ：ＡＧＡ、３中
に存在する２つの配列と同じ配列である。＠在、上記２
つの信号のどちらが機能を営み（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ
）得るかを決定することは不可能である。　Ｋｙｔｅと
Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２年）のヒトロバシーイン
デックスとＣｈｏｕとＦａｓｍａｎ（１９７８年）の第
２の構造予言とは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８７年）
のプログラムを使用してクローンＷＥ：ＡＧＡ。

７について計算された＊　ＫｙｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｌ
ｅ　（１９８２年）のヒトロバシーのプロフィール（ｐ
ｒｏｆｉｌｅ）は、クローンＷＥ：ＡＧＡ、７タンパク
質がその長さ全体に散在する疎水性領域（ｄｏｌＩａｉ
ｎ）と親水性領域とを含有し、それが可溶性タンパク質
であることと一致していることを示す。

りｏ　−ン！１２：ＡＧＡ、３及びりｏ　−ンＷＥ：Ａ
ＧＡ、７ノ、小麦の胚乳のＡＤＰ−グルコース・ピロホ
スホリラーゼｃＤＮＡ挿入所片同士は、それらの転写解
読枠の共有領域において９６．３％の相同性である゛、
　ＴＡＧ終止コドンからポリアデニル化部位迄の、上記
クローン類の３′−未翻訳領域においては、相同性の範
囲は７２．３％迄低くなる。　１１Ｅ：ＡＧＡ、３ｃＤ
ＮＡとＷＥ：ＡＧＡ、７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列同
士の比較は、３０塩基の置換の全部が明らかになり、そ
のうちの７２％がトランジション（塩基転位ともいう）
である、転写解読枠内には１８個の塩基の置換、すなわ
ち１１個のトランジションと７個のトランスバージョン
（塩基置換ともいう）があるだけである、前記のトラン
ジションの全ては、コドンの第３番目の塩基の位置に配
置され、それらのいずれもアミノ酸の置換を生起しない
ことは注目すべきである。　ＷＥ：ＡＧＡ、７中の位置
１２９６に配置された前記トランスバージョンの１つは
、熱学（ｓｉｌｅｎｔ）である、残りの６つのトランス
バージョンは、３つの保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖ
ｅ）アミノ酸置換（スレオニン−セリン、グルタミン−
リシン、アラニン−セリン）と２つの生保存的アミノ酸
置換（アルギニン−メチオニン、イソロイシン−メチオ
ニン）を生ずる。さらに、前記転写解読枠には９個所だ
け挿入／欠落が存在し、ＷＥ！：ＡＧＡ、３ヌクレオチ
ド配列の位置５７９〜５８５及び位置５９２〜５９３に
発生している。これらの挿入／欠落は、ＷＥ：ＡＧＡ。

３タンパク質とＩＩＩＥ：ＡＧＡ、７タンパク質との間
の付加的な５個のアミノ酸の変換、３個の挿入及び２個
の置換を生ずる。すなわち、小麦の胚乳のＡひＰ−グル
コース・ピロホスホリラーゼｃＤＮＡ類の誘導されたア
ミノ酸配列は、２９６個のアミノ酸残基のうち１０個だ
けが異なり、９６．７％のアミノ酸相同性を生ずる。前
記の３′−未翻訳領域においては、ＷＥ：ＡＧＡ、３配
列とＷＥ：ＡＧＡ、７配列（７）ｆｌｌＨ：８５Ｍ（７
）挿入／欠落の全部があり、８つの可変領域に密集して
いる。

３．２りｏ　−ンＷＥ！：ＡＧＡ、７とりｏ−ンＷＬ：
ＡＧＡ、１（７）比小麦の葉のＡＤＰ−グルコース・ピ
ロホスホリラーゼｃＤＮＡ配列（ＭＬ：ＡＧＡ、１）と
小麦の胚乳のＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼ
ｃＤＮＡ配列（ＷＥ：ＡＧＡ、７）を、Ｄｅｖｅｒｅｕ
ｘら（１９８７年）のＤＩＡＧＯＮプログラムを使用し
て比較した。上記２つのヌクレオチド配列の間には、１
０個の良く保存された領域がある。クローンＷＬ：ＡＧ
Ａ、１とりｏ−ンｌＥ：ＡＧＡ、７トノｆｔ１ｉ４：ハ
、３２２個のヌクレオチド置換があり、そのうちの２９
０個は転写解読枠内にあり、これに１４８個の挿入／欠
落が加わる。従って、クローンＷＬ：ＡＧＡ、１及びク
ロ−ンＷＥ：ＡＧＡ、７のｃＤＮＡ配列が重複する転写
解読枠内では、ＤＮＡレベルでわずか５５．７％の相同
性があるだけである。前記のクローン中に示された３′
−未翻訳領域には相同性はない。

ＷＥ：ＡＧＡ、７及びＷＬ：ＡＧＡ、１をコードしたポ
リペプチド同士の間の相同性を決定するために、誘導さ
れたアミノ酸配列を一列に整列させた（ａｌｉｇｎｅｄ
）。

転写解読枠内の２９０個のヌクレオチド置換のうち、９
７個は熱学（ｓｉｌｅｎｔ）である、残りの１９３個の
ヌクレオチド置換と、１４８個の挿入／欠落のうちの９
１個とにより生成された、小麦の葉及び小麦の胚乳のＡ
ＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼポリペプチド配
列同士の間には全体で１１０個のアミノ酸変換（ａｌｔ
ｅｒａｔｉｏｎ）がある、このデータは、はとんどの場
合に、ＷＬ：ＡＧＡ、　１　ト！ｊＥ：ＡＧＡ、７（７
）ｃＤＮＡ配列同士ノ間のヌクレオチド置換は、コドン
の３つのヌクレオチド位置の全てを含むことを示す。従
って、前記２つのｃＤＮＡの誘導されたアミノ酸配列同
士の間の相同性はわずか５５．３％である。

小麦の葉及び小麦の胚乳のＡＤＰ−グルコース・ピロホ
スホリラーゼポリペプチド配列同士の間の１１０個のア
ミノ酸置換のうちの６２個は、保存的変化（ｃｏｎｓｅ
ｒｖａｔｉｖｅ　ｃｈａｎｇｅ）であり、荷電の相異あ
るいは中性アミド（すなわち、グルタミン、アスパラギ
ン）に代わる荷電残基による置換、両親媒性残基に代わ
る他の両親媒性残基への置換又は疎水性残基に代わる他
の疎水性残基への置換はいずれも伴なわない。３９個の
生保存的アミノ酸置換があり、これらは荷電の逆転ある
いは荷電されであるか又は中性もしくは疎水性の残基に
代わる両親媒性アミノ酸への置換を伴なっている。非保
存的アミノ酸置換のうちの９つは、荷電されであるか又
は中性のアミノ酸いずれかに代わる疎水性残基への置換
を伴なう。小麦の葉及び小麦の胚乳の、ＡＤＰ−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼポリペプチド同士の間の前記
の非保存的アミノ酸置換のうちの２つ（）１１８ｇ１＊
−Ｔｙｒｉｔｓ　：Ｌｙｓｓａｉ−Ｇｌｎｓｚｉ）及び
２つの生保存的置換（！Ｍｌｒｓｏｅ−Ｇｌｕｓｅａ　
：Ａｌａｉ＊ｔ−ＬｙＳｓｚｔ　）は、ホウレンソウの
葉のＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼ（Ｐｒｅ
ｉｓｓら、１９８８年）上の推定の（ρｕｔａｔｉｖｅ
）３−ホスホグリセリン酸結合部位に相同性の領域にほ
ぼ近いか又はその領域内に配置されている。しかしなが
ら、小麦の葉及び小麦の胚乳のＡＤＰ−グルコース・ピ
ロホスホリラーゼ酵素のＣ−末端２７残基内では、前記
のＣｈｏｕとＦａｓａｍ　（１９７８年）の予言はほと
んど一致している。

３．３制　酵素　　地図　　によるクローン　の比、較
− 小麦の葉と小麦の胚乳のＡＤＰ−グルコース・ピロホス
ホリラーゼｃＤＮＡそれぞれの制限酵素切断地図を作成
しそれらの関係を例証した。小麦の葉のＡＤＰ−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼｃＤＮＡの制限酵素切断地図
は、一般に分子内制限酵素部位を有せず小麦の胚乳のＡ
ＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼｃＤＮＡの制限
酵素切断地図とは極めて異なる。

この結果は、小麦の葉と小麦の胚乳のＡＤＰ−グルコー
ス・ピロホスホリラーゼ遺伝子ｃＤＮＡが、別々の遺伝
子サブファミリー（亜科）を表わすことを示した先のハ
イブリダイゼーション分析を追認する。

これに対して、小麦の胚乳のｃＤＮＡ類すなわち１１Ｅ
：ＡＧＡ、１、ＷＥ：ＡＧＡ、３、ＷＥ：ＡＧＡ、５、
ＷＥ：ＡＧＡ、６及びｗＥ：ＡＧＡ、７は、密接に関連
している。上記ｃＤＮＡ類の全ては、３′−末端に配置
された唯一のＨｉｎｄ　ｍ部位及び）ｆｉｎｄ　ｍ部位
に対して−６８０の位置に配置されたＳｓｔ　１部位を
含有する。唯一のＢａｍＨ１部位はより長イｅＤＮＡ挿
入断片類、すなわちＷＥ：ＡＧＡ、１．　ＷＥ：ＡＧＡ
、６及びＷＥ：ＡＧＡ、７の５′−領域に存在する。小
麦の胚乳のＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼｃ
ＤＮＡ類のＨｉｎｄ　ｍ部位に対して−４００の位置に
配置されたＳｓｔ　１部位の周りには多形性（ｐｏｌｙ
ｏｎｏｒｐｈｉｓｍ）が存在する。その理由は、この部
位がクローン類ｗＥ：ＡＧＡ、１、ＷＥ：ＡＧＡ、６及
びＷＥ：ＡＧＡ、７中ニノミ存在するからである。さら
に、Ｈｉｎｄ　ｍ部位に対して−３４０の位置に配置さ
れたＢｇ１１１部位は、クローン類ＷＥ：ＡＧＡ、３及
びＷＥ：ＡＧＡ、５中に存在するだけである。

これらの結果は、小麦の胚乳のＡＤＰ−グルコース・ピ
ロホスホリラーゼ遺伝子サブファミリー（亜科）は、少
なくとも２つの異なる遺伝子分類、すなわちクローン類
りＤ　−ンｗＥ：ＡＧＡ、３、ＷＥ：ＡＧＡ、５によっ
て代表される分類Ｉとクローン類ＷＥ：ＡＧＡ、１゜Ｗ
Ｅ：ＡＧＡ、６及びＷＥ：ＡＧＡ、７ニよって代表され
る分類■に区分し得る。

小麦のＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼｃＤＮ
Ａ類由来のアミノ酸配列を、稲の胚乳のＡＤＰ−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼｃＤＮＡ　（Ｐｒｅｉｓｓら
、１９８７年）及び大腸菌ｇ１ｇｃ遺伝子（Ｂａｃｈｏ
ｒら、１９８３年）由来のアミノ酸配列と共に一直線に
配列した（ａｌｉｇｎａｄ）　ｍ　Ｓ通りのタンパク質
配列の直線状化（ａｌｉｇｎｍａｎｔ）を行なった。ア
ミノ酸配列同士の相同性は、吹抜に、重複領域同士の中
の同一の残基の割合として上記直線状化（ａｌｉｇｎｍ
ｅｎｔ）を基準として計算し、従って、重複の間の間隙
の大きさは考慮に入れない、小麦の胚乳の２つのＡＤＰ
−グルコース・ピロホスホリラーゼ配列（ＷＥ：ＡＧＡ
、３とＷＥ：ＡＧＡ、７）と、稲の胚乳（７）　ＡＤＰ
−グ／Ｌ／：Ｉ−スーピロホスホリラーゼ配列との間の
相同性は４０％である。

小麦の葉の上記配列は、稲の胚乳のＡＤＰ−グルコース
・ピロホスホリラーゼ配列に対し４４％の相同性である
。上記２つの相同性は、小麦の葉と小麦の胚乳の配列同
士の間の相同性５５％よりもわずかに低いだけである。

さらにまた、小麦の葉又は小麦の胚乳のＡＤＰ−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼと大腸菌ＡＤＰ−グルコース
・ピロホスホリラーゼとの間の相同性がわずか２４％で
あるのに比べて、稲の胚乳と大腸菌のアミノ酸配列同士
の間の相同性は２９．５％である。

大腸菌及びホウレンソウの葉のＡＤＰ−グルコース・ピ
ロホスホリラーゼポリペプチド配列の領域は、先に既に
基質、活性化物質又は阻害物質の組合部位として同定さ
れている（ＰａｒｓｏｎｓとＰｒｅｉｓｓ、１９７８年
ａ、　１９７８年ｂ；　りａｒｓａｎら、　１９８６年
；　Ｌｅｅ　とＰｒａｉｓｓ　。

１９８６年；　Ｊ、　Ｐｒｅｉｓｓ、個人的書信）、小
麦の葉及び小麦の胚乳のＡＤＰ−グルコース・ピロホス
ホリラーゼの誘導されたアミノ酸配列は、他のＡＤＰ−
グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素類で同定された基
質、活性化物質又は阻害物質の結合部位と比較されてい
る。上記結合部位は５つのタンパク質領域を形成する。

■、フルクトースー１６−ピスリン　　ム大腸菌のＡＤ
Ｐ−グルコース・ピロホスホリラーゼのアロステリック
活性化剤（フルクトース−１，６−ビスリン酸）結合部
位は、ＬＹＳｓ　ｏ残基（ＰａｒｓｏｎｓとＰｒｅｉｓ
ｓ、１９７８年ｂ）に近いタンパク質のＮ−末端近くに
位置している。大腸菌酵素のフルクトース−１，６−ビ
スリン酸結合部位（ＰａｒｓｏｎとＰｒａｉｓｓ、１９
７８年ｂ）に相同性の、小麦の胚乳のＡＤＰ−グルコー
ス・ピロホスホリラーゼ中のアミノ酸配列は、固定され
ている。残基７８〜１００由来の領域は、小麦の胚乳及
び大腸菌の配列同士の間に保存された２３個のアミノ酸
の中から１４個を有する。しかしながら、小麦の胚乳の
配列中の疎水性又は両親媒性の残基例えばＡｒｇｓｏ　
−Ｔｈｒ、、、　Ｌ）’ａｍｓ　−Ｐｈｅ、ｓ、　ＡＳ
Ｐｓｓ　−Ｐｒｏｓｓ＊Ｌｙ８＠６−Ｔｈｒ、、、　Ｌ
ＹＳｓ３−Ｔｈｒ＠３ｔ　Ｈ１ｓ＠７−ＰｒＯｓｔに代
えて大腸菌配列内の荷電残による置換を伴なって、幾つ
かのアミノ酸部分で主な変換（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）
がある、ピリドキサール−５′−リン酸は、大腸菌ＡＤ
Ｐ−グルコース拳ピロホスホリラーゼ中のＬｙ８ｓａで
結合し、　フルクトース−１，６−ビスリン酸もこの領
域で結合する（ＰａｒｓｏｎとＰｒｅｉｓｓ、　１９７
８年ａ、　１９７８年ｂ）ので、この部位は、多分、小
麦の胚乳タンパク質内では機能を営まないであろう、従
って、大腸菌ＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼ
のアロスラリツク部位に相同性の中表の胚乳配列では、
フルクトース−１，６−ビスリン酸とタンパク質領域の
間でシッフベース（Ｓｃｈｉｆｆ　ｂａｓｅ）を形成す
る機会がない、この知見は、　フルクトース−１，６−
ビスリン酸による小麦の胚乳のＡＤＰ−グルコース・ピ
ロホスホリラーゼの検出可能な活性化の欠除と一致して
いる。あいにく、小麦の葉のＡＤＰ−グルコース・ピロ
ホスホリラーゼｃＤＮＡ配列は、５′−コード領域中に
十分遠く追伸びず、　フルクトース−１，６−ビスリン
酸結合部位の配列を含有しない。それ故、フルクトース
−１，６−ビスリン酸による葉のＡＤＰ−グルコース・
ピロホスホリラーゼのアロステリック活性化が、大腸菌
酵素内と同じ部位に対する活性化剤の結合によって達成
されるかどうかを本発明者らは確認できない。

Ｌ−基ｊＪＬ今１ヱＧ− 大腸菌ＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼの２個
所の基質結合部位は、小麦の葉及び小麦の胚乳の２つの
ＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼ配列において
十分に保存されている。残基１６６〜１７３の間の領域
は、この領域内の小麦の胚乳、稲の胚乳及び大腸菌タン
パク質の配列それぞれの比較から得られたコンセンサス
配列（共通塩基配列ともいう）　ＶＸＸＧＴＡＤＡを含
む、あらゆる場合において、アミノ部位ｆｉ　１６７は
、芳香族疎水性残基、すなわちチロシン又はフェニルア
ラニンのどちらかによって占有される。　ＡＤＰ−グル
コース・ピロホスホリラーゼ同士の比較によれば、残基
２５２〜２５６としてコンセンサス配列ＦＸＥＸＰが明
らかにされる。

さらにまた、大腸菌ＡＴＯＰ−グルコース・ピロホスホ
リラーゼのＬｙｓ、ｓ　ｓに対するピリドキサール−５
′−リン酸の結合は、ＡＤＰ−グルコースによって阻害
され。

基質結合部位が近くにあることを示す、ピリドキサール
−５′−リン酸は、リシンのｅ−アミノ基とシッフベー
スを形成するが、Ｌｙｓｚｓ　ｓがそれ自体基質結合中
に含まれるということはありそうもない、その理由はＬ
ｙｓ、　ｓ　ｓは、植物ＡＤＰ−グルコース・ピロホス
ホリラーゼ配列中に厳密に保存されないからでアル、例
えば、りＯ−ンＷＥ：　ＡＧＡ、７ハ位！Ｉ　２５５　
テグルタミン残基をコードする。しかしながら、Ｐｈｅ
ｚ　ｓよけ調べられたＡＤＰ−グルコース・ピロホスホ
リラーゼ配列の全ての中に厳密に保存されており、この
残基が、フェニルアラニン側鎖の平坦な芳香族環と基質
分子のアデニン環との間の疎水性相互作用によって、結
合ＡＴＰ及びＡＤＰ−グルコース内に含まれるかもしれ
ないことを示す、それにもかかわらず、　ＡＴＰ又はＡ
ＤＰ−グルコースのリン酸部分とＡｒｇ□、（又はＬｙ
ｓｚｓ　ｖ　）のアミノ基との間のイオン相互作用を伴
なう別の機構は、除外し得ない。

ＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素の推定上
の基質結合領域（ｄｏ■ａｉｎ）においては、ＡＴＰ結
合部位に対し、Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９８６年）のコン
センサス配列と相同性を有するアミノ酸は存在しない。

上記コンセンサス配列（ＧＸＸＸＸＧＫＳ）は、結晶構
造分析によってリン酸結合領域（Ｐａｉら、　１９７９
年。

Ｈｉｇｇｉｎｓらに引用された、１９８６年）を形成し
ていることが明らかにされている。この配列の変異すな
わち小麦の葉の配列中のＧＤＱＬＡＥＧＫＶと小麦内胚
乳の配列中ノＳＲＬＭＳＥＧＫＶは、位置４６０〜４６
８ニ配置される。

４．３−ホスホグリセリン酸　Ａ　　：各アミノ酸配列
を、ホウレンソウの葉のＡＤＰ−グルコース・ピロホス
ホリラーゼ上の推定上の３−ホスホグリセリン酸結合部
位のアミノ酸配列と比較した。この部位は、小麦の葉の
配列と小麦の胚乳の配列との間で高＜　（ｈｉｇｈｌｙ
）保存される。小麦の葉と小麦の胚乳の２つのＡＤＰ−
グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素の異なる活性化動
力学は、３−ホスホグリセリン酸の変換された（ａｆｔ
θｒｅｄ）結合部位の点からは説明されない、その理由
は、３−ホスホグリセリン酸結合部位の酵素活性化と保
存との間には明白な関係がないからである。更に、小麦
の胚乳と小麦の葉のＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼの主要な（Ｐｒｉｍａｒｙ）配列は、３−ホスホ
グリセリン酸結合部位の１３個の残基のうち６個が異な
るが、この配列の第２の構造予言はほとんど一致してい
る。

３−ホスホグリセリン酸は、オルトリン酸による小麦の
胚乳のＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼの阻害
を防止できるが、このことは、該酵素が機能的な３−ホ
スホグリセリン酸結合部位を有することを示唆する。残
基５１５〜５２″２の間の３−ホスホグリセリン酸が結
合するコンセンサス配列は、全ての利用可能な植物のＡ
ＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼ配列の比較によ
って得られた５ＧＩＸＸＸＸＫである。残基Ｌｙｓｓ　
ｘ　ｘは全ての配列中に厳密に保存され、且つピリドキ
サール−５′−リン酸の結合を含み、しかもホウレンソ
ウの葉のＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素
中に見出されるような３−ホスホグリセリン酸の結合も
多分含む。

従って、推定上の３−ホスホグリセリン酸結合部位以外
の領域中の小麦の葉及び小麦の胚乳のＡＤＰ−グルコー
ス・ピロホスホリラーゼアミノ酸配列それぞれの間の変
換は、上記酵素類のアロステリッり特性において観察さ
れた相異が原因である。

上記２つの酵素のアミノ酸配列同士は、わずか５５％の
相同性であるので、観察されたアミノ酸の変換のいずれ
も、その異なるアロステリック特性を説明するかもしれ
ない、このことは、小麦の胚乳の酵素が、３−ホスホグ
リセリン酸の存在下で。

より活性な形に変わるのに必要とされる必要な構造変化
を行なうことができないことを示唆する。

【図面の簡単な説明】

第１図は葉におけるデンプンとグルコースの生合成経路
に伴なう諸反応を示し、図中、Ｇ−３−Ｐはグリセルア
ルデヒド−３−リン酸を表わし；　　ＤＨＡＰはジヒド
ロキシアセトンリン酸を表わし；Ｐｉはオルトリン酸を
表わし；　　ＰＰｉは無機ピロリン酸を表わし；１はホ
スホグリセリン酸キナーゼ／グリセルアルデヒド−３−
リン酸デヒドロゲナーゼ、　２はトリオース−リン酸イ
ソメラーゼ、　３はアルドラーゼ、４はフルクトース−
１，６−ビスホスファターゼ。 ５はヘキソース−リン酸イソメラーゼ、　６はホスホグ
ルコムターゼ、７はＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼ、８はデンプンシンターゼ、９はυＤＰ−グルコ
ースピロホスホリラーゼ、１Ｇはスクロースリン酸シン
ターゼ、１１はスクロースホスファターゼ、１２はオル
トリン酸／トリオースリン酸輸送体、１３は無機ピロホ
スファターゼを表わす。 第２図は、小麦の胚乳におけるデンプン生合成の提案さ
れた代謝経路を示し、図中のＧ−３−Ｐ、ＤＨＡＰ、Ｐ
ｉ、　ＰＰｉは第１図と同じ意味を表わし。 １はスクロースシンターゼ、２はυＤＰ−グルコースピ
ロホスホリラーゼ、３はへキソキナーゼ、４はホスホグ
ルコムターゼ、　５はヘキソース−リン酸イソメラーゼ
、６はＡＴＰ−依存ホスホフルクトキナーゼ、７はＰＰ
１−依存ホスホフルクトキナーゼ、８はアルドラーゼ、
　９はトリす−スーリン酸イソメラーゼ、１０はヘキソ
ース−リン酸輸送体（？）、１１はＡＤＰ−グルコース
ピロホスホリラーゼ、１２はデンプンシンターゼ、１３
はスクロースホスフェートシンターゼ、１４はスクロー
スホスファターゼを表わす。 第３１１ハクｏ　−ンＷＬ：ＡＧＡ、１のＤＮＡ配列を
示し；第４図はりｏ−ンＷＥ：ＡＧＡ、３のＤＮＡ配列
を示し；第５図はクローンＷＥ：ＡＧＡ、フのＤＮＡ配
列を示す。 第　　２ 図 第 図 Ａ）　ＷＬ：ＡＧＡｌ 第 図 Ｂ）ＷＥ：ＡＧ入３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、実質的に純粋なＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリ
   ラーゼ。 ２、酵素であるＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラー
   ゼを含有する粗酵素抽出液をゲルクロマトグラフィーに
   よって連続精製することを特徴とする酵素ＡＤＰ−グル
   コース・ピロホスホリラーゼの精製方法。 ３、粗製酵素が小麦の胚乳から単離されたものである請
   求項２記載の方法。 ４、ＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼをコード
   し且つ添付図面の第３図に示したヌクレオチド配列を有
   する小麦の葉のｃＤＮＡ。 ５、ＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼをコード
   し且つ添付図面の第３図に示したヌクレオチド配列を有
   する小麦の葉のｃＤＮＡを含有するプラスミドＷＬ：Ａ
   ＧＡ．１、並びに寄託番号ＮＣＩＢ４００６５として、
   １９８８年１０月１９日付で英国アバディーンのザ・ナ
   ショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・ア
   ンド・マリン・バクテリアに寄託されてある、前記プラ
   スミドＷＬ：ＡＧＡ．１を含有して保留している大腸菌
   （Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ２。 ６、ＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼをコード
   し且つ添付図面の第４図に示した配列を有する小麦の胚
   乳ｃＤＮＡ。 ７、ＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼをコード
   し且つ添付図面の第４図に示した配列を有する小麦の胚
   乳ｃＤＮＡを含有するプラスミドＷＥ：ＡＧＡ。 ３、並びに寄託番号ＮＣＩＢ４００６６として、１９８
   ８年１０月１９日付で英国アバディーンのザ・ナショナ
   ル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・
   マリン・バクテリアに寄託されてある、前記プラスミド
   ＷＥ：ＡＧＡ．３を含有して保留している大腸菌ＴＧ２
   。 ８、ＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼをコード
   し且つ添付図面の第５図に示した配列を有する小麦の胚
   乳ｃＤＮＡ。 ９、ＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼをコード
   し且つ添付図面の第５図に示したヌクレオチド配列を有
   する小麦の胚乳ｃＤＮＡを含有するプラスミドＷＥ：Ａ
   ＧＡ．７、並びに寄託番号ＮＣＩＢ４００６７として、
   １９８８年１０月１９日付でザ・ナショナル・コレクシ
   ョン・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バク
   テリアに寄託されてある、前記プラスミドＷＥ：ＡＧＡ
   ．７を含有して保留している大腸菌ＴＧ２。 １０、請求項４、６及び８のいずれかに記載のｃＤＮＡ
   を含有してなる遺伝子プローブと酵素消化物とをハイブ
   リダイズすることを特徴とする、ＡＤＰ−グルコース・
   ピロホスホリラーゼをコードするＤＮＡ配列の存在の検
   出方法。 １１、添付図面の第３図又は第４図又は第５図に示した
   アミノ酸配列を有するＡＤＰ−グルコース・ピロホスホ
   リラーゼ。 １２、前記のＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼ
   に対する抗体。 １３、ＡＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼをコー
   ドする遺伝子の１個又は２個以上の付加コピーを、形質
   転換によって、デンプン合成植物の染色体中に安定的に
   組み込んであるデンプン合成植物からなることを特徴と
   する、高められたデンプン生産能を有する植物。 １４、デンプン合成植物の内在性のＡＤＰ−グルコース
   ・ピロホスホリラーゼ遺伝子によりコードされるｍＲＮ
   Ａに対してアンチセンスなｍＲＮＡをコードする遺伝子
   を、形質転換によって前記デンプン合成植物の染色体中
   に安定的に組み込んであるデンプン合成植物からなるこ
   とを特徴とする、低減されたデンプン生産能を有する植
   物。