JPH02273177A - Adp−グルコース・ピロホスホリラーゼをコードするdna - Google Patents
Adp−グルコース・ピロホスホリラーゼをコードするdnaInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、酵素であるADP−グルコース・ピロホスホ
リラーゼの単離、精製及び特性決定に関し、またADP
−グルコース・ピロホスホリラーゼをコードするcDN
Aのクローン類の同定に使用し得る抗体の製造に関する
0本発明はまた。小麦、トウモロコシ及び大麦のような
穀物植物中に産生ずるデンプンの収量を増加させるため
のcDNAクローン類の使用に関する。
リラーゼの単離、精製及び特性決定に関し、またADP
−グルコース・ピロホスホリラーゼをコードするcDN
Aのクローン類の同定に使用し得る抗体の製造に関する
0本発明はまた。小麦、トウモロコシ及び大麦のような
穀物植物中に産生ずるデンプンの収量を増加させるため
のcDNAクローン類の使用に関する。
デンプンは、葉において光合成が行なわれる間の炭酸固
定の重要な最終生成物であり、且つ種子や果実中の重要
な貯蔵生成物である。経済上の見地から、3種の穀物作
物、すなわち小麦、稲及びトロモロコシの食用部分によ
って生産されるデンプンは、カロリーとして計算した時
に世界中の食糧の約273を占める。
定の重要な最終生成物であり、且つ種子や果実中の重要
な貯蔵生成物である。経済上の見地から、3種の穀物作
物、すなわち小麦、稲及びトロモロコシの食用部分によ
って生産されるデンプンは、カロリーとして計算した時
に世界中の食糧の約273を占める。
デンプンは光合成性の細胞中のプラスチド区画中で、即
ち葉緑体中で又は非光合成性の細胞中のアミロプラスト
中で合成される0葉におけるデンプン生合成の生化学的
経路はすでに十分に特徴づけられている(添付図面の第
1図参照)、これに対して、植物の貯蔵器官におけるデ
ンプン生合成の経路は、はとんど知られていない。しか
しながら、小麦の胚乳細胞から生の(intact)の
アミロプラストを単離する方法の最近の進展は、貯蔵器
官におけるデンプン生合成の経路の解明に寄与している
。別の研究によれば小麦の胚乳におけるデンプン生合成
の経路と、小麦の葉におけるデンプン生合成の経路とは
異なることが明らかにされている(添付図面の第1図及
び第2図参照)。
ち葉緑体中で又は非光合成性の細胞中のアミロプラスト
中で合成される0葉におけるデンプン生合成の生化学的
経路はすでに十分に特徴づけられている(添付図面の第
1図参照)、これに対して、植物の貯蔵器官におけるデ
ンプン生合成の経路は、はとんど知られていない。しか
しながら、小麦の胚乳細胞から生の(intact)の
アミロプラストを単離する方法の最近の進展は、貯蔵器
官におけるデンプン生合成の経路の解明に寄与している
。別の研究によれば小麦の胚乳におけるデンプン生合成
の経路と、小麦の葉におけるデンプン生合成の経路とは
異なることが明らかにされている(添付図面の第1図及
び第2図参照)。
プラスチド酵素であるADP−グルコース・ピロホスホ
リラーゼは、光合成植物の諸器官におけるデンプン生合
成の重要な調節酵素である0葉緑体ADP−グルコース
・ピロホスホリラーゼは、アロステリックエフェクター
である3−ホスホグリセリン酸及びオルトリン酸によっ
て翻訳後(post−trans−1ationall
y)に調節される。従来研究された植物の葉のADP−
グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素の全ては試験管内
で(in vitro)も3−ホスホグリセリン酸によ
って活性化され、しかもフルクトース−1,6−ビスリ
ン酸、フルクトース−6−リン酸及びホスホエノールビ
ルビン酸によっては、活性化される度合は小さい、これ
らの代謝中間物質は基質のに1値を下げ、しかも酵素触
媒(enzyms−catalyzed)反応の最大速
度V−axを増大させる。
リラーゼは、光合成植物の諸器官におけるデンプン生合
成の重要な調節酵素である0葉緑体ADP−グルコース
・ピロホスホリラーゼは、アロステリックエフェクター
である3−ホスホグリセリン酸及びオルトリン酸によっ
て翻訳後(post−trans−1ationall
y)に調節される。従来研究された植物の葉のADP−
グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素の全ては試験管内
で(in vitro)も3−ホスホグリセリン酸によ
って活性化され、しかもフルクトース−1,6−ビスリ
ン酸、フルクトース−6−リン酸及びホスホエノールビ
ルビン酸によっては、活性化される度合は小さい、これ
らの代謝中間物質は基質のに1値を下げ、しかも酵素触
媒(enzyms−catalyzed)反応の最大速
度V−axを増大させる。
更に、植物の葉由来のADP−グルコース・ピロホスホ
リラーゼ酵素は、試験管内(in vitro)でオル
トリン酸によって阻害されるが、この場合100μNよ
りも低いオルトリン酸濃度で該酵素の活性の半値最大阻
害(half−maximal 1nhibition
)が一般に達せられる。
リラーゼ酵素は、試験管内(in vitro)でオル
トリン酸によって阻害されるが、この場合100μNよ
りも低いオルトリン酸濃度で該酵素の活性の半値最大阻
害(half−maximal 1nhibition
)が一般に達せられる。
葉のデンプン生合成は、試験管内でADP−グルコース
・ピロホスホリラーゼ酵素のレベル(level)で、
3−ホスホグリセリン酸及びオルトリン酸の葉緑体内濃
度の変動(fluctuation)により調節される
。この調節機構にとって極めて重要なことは、葉緑体の
内膜の選択的透過性である。葉緑体の内膜は、トリオー
ス−リン酸、ジカルボキレート、及びオルトリン酸に対
して選択的に透過性であり。
・ピロホスホリラーゼ酵素のレベル(level)で、
3−ホスホグリセリン酸及びオルトリン酸の葉緑体内濃
度の変動(fluctuation)により調節される
。この調節機構にとって極めて重要なことは、葉緑体の
内膜の選択的透過性である。葉緑体の内膜は、トリオー
ス−リン酸、ジカルボキレート、及びオルトリン酸に対
して選択的に透過性であり。
そハらは葉緑体から細胞質ゾル(cytosol)へ急
速に且つ特異的に(specifically)輸送さ
れ、またその逆も起ることが明らかにされている。この
能動輸送(能動透過ともいう)の機構は、リン酸/トリ
オース−リン酸輸送体(translocator)を
経て細胞質ゾルからオルトリン酸の向流平衡内部移動を
伴なう。オルトリン酸/トリオース−リン酸輸送体を経
由する代謝中間物質の能動輸送は、通常の昼−夜(li
ght−dark)の推移の間のプラスチド内のオルト
リン酸と3−ホスホグリセリン酸の比(すなわち、 (
Pi)/(3−PGA))の変化を伴なう、光合成の間
に、C07−同定から生成した3−ホスホグリセリン酸
は、葉緑体中に蓄積する。葉緑体の内部から細胞質ゾル
迄の間の3−ホスホグリセリン酸について生じた濃度勾
配は、オルトリン酸を移送するのと引替えに3−ホスホ
グリセリン酸の若干を細胞質ゾル中に移送(expor
t)することを招く、移入されたオルトリン酸は、次後
に光リン酸化を経て^TP生成に利用され、そのために
(PL) / (3−PGA)の葉緑体内の総体的な比
(overall chloroplastic ra
tio)は、昼間周期の間は低いままである。このよう
にして。
速に且つ特異的に(specifically)輸送さ
れ、またその逆も起ることが明らかにされている。この
能動輸送(能動透過ともいう)の機構は、リン酸/トリ
オース−リン酸輸送体(translocator)を
経て細胞質ゾルからオルトリン酸の向流平衡内部移動を
伴なう。オルトリン酸/トリオース−リン酸輸送体を経
由する代謝中間物質の能動輸送は、通常の昼−夜(li
ght−dark)の推移の間のプラスチド内のオルト
リン酸と3−ホスホグリセリン酸の比(すなわち、 (
Pi)/(3−PGA))の変化を伴なう、光合成の間
に、C07−同定から生成した3−ホスホグリセリン酸
は、葉緑体中に蓄積する。葉緑体の内部から細胞質ゾル
迄の間の3−ホスホグリセリン酸について生じた濃度勾
配は、オルトリン酸を移送するのと引替えに3−ホスホ
グリセリン酸の若干を細胞質ゾル中に移送(expor
t)することを招く、移入されたオルトリン酸は、次後
に光リン酸化を経て^TP生成に利用され、そのために
(PL) / (3−PGA)の葉緑体内の総体的な比
(overall chloroplastic ra
tio)は、昼間周期の間は低いままである。このよう
にして。
ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素は、デン
プン生合成を続けさせながら、明所中ではアロステリッ
クに活性化される。夜間周期の間は、CO□−固定の減
少及び光リン酸化の低下があり、それに伴なって、AT
Pの加水分解の結果として葉緑体内のオルトリン酸濃度
の増加がある。これは葉緑体内の(Pi)/ (3−P
GA)の比を大きくし、それによってADP−グルコー
ス・ピロホスホリラーゼ活性とデンプン生成とを阻害す
る。
プン生合成を続けさせながら、明所中ではアロステリッ
クに活性化される。夜間周期の間は、CO□−固定の減
少及び光リン酸化の低下があり、それに伴なって、AT
Pの加水分解の結果として葉緑体内のオルトリン酸濃度
の増加がある。これは葉緑体内の(Pi)/ (3−P
GA)の比を大きくし、それによってADP−グルコー
ス・ピロホスホリラーゼ活性とデンプン生成とを阻害す
る。
アロステリックエフェクターによるADP−グルコース
・ピロホスホリラーゼ活性の調整(モジュレーション)
に加えて1葉のデンプン生合成は、葉緑体のアデニル酸
エネルギー充足によっても調節される見込みもある。
・ピロホスホリラーゼ活性の調整(モジュレーション)
に加えて1葉のデンプン生合成は、葉緑体のアデニル酸
エネルギー充足によっても調節される見込みもある。
発育中の胚乳におけるデンプン生合成の最も重要な調節
因子(regulatory feature)は、デ
ンプン生合成用の酵素の合成の調節を経る粗い(coa
rse)制御機構である可能性が多い、最近の研究では
、デンプン生合成経路における律速酵素(ペースメーカ
ー酵素ともいう)の同定にかなり重点をおいている。あ
いにく、穀物植物の胚乳の発育する期間全体にわたるデ
ンプン生合成用酵素について試験管内(il yitr
o)の酵素活性の測定に関する研究は、この問題を余り
解明するところがない、その理由は、試験管内(in
vitro)の酵素活性と生体内(in vivo)の
酵素活性とを互いに相関づけることが難しく、また大部
分のデンプン生合成用酵素は同等(co−ordina
tely)に発現すると思われるからである。
因子(regulatory feature)は、デ
ンプン生合成用の酵素の合成の調節を経る粗い(coa
rse)制御機構である可能性が多い、最近の研究では
、デンプン生合成経路における律速酵素(ペースメーカ
ー酵素ともいう)の同定にかなり重点をおいている。あ
いにく、穀物植物の胚乳の発育する期間全体にわたるデ
ンプン生合成用酵素について試験管内(il yitr
o)の酵素活性の測定に関する研究は、この問題を余り
解明するところがない、その理由は、試験管内(in
vitro)の酵素活性と生体内(in vivo)の
酵素活性とを互いに相関づけることが難しく、また大部
分のデンプン生合成用酵素は同等(co−ordina
tely)に発現すると思われるからである。
現在のところ、ADP−グルコース・ピロホスホリラー
ゼの翻訳後調節が、穀物植物の貯蔵器官において生体内
(in vivo)で発現して働らくことを実質的に示
す証拠はない、穀粒のアミロプラストは、正常な発育中
には、葉緑体になるまで、発育せず、しかも機能上でも
関係しない、上記因子は、小麦の胚乳でのデンプン生合
成経路にトリオースリン酸が掛かり合いをもたない事実
に組合せて考えると穀物の胚乳のアミロプラストにおけ
るADP−グルコース・ピロホスホリラーゼのアロステ
リック制御は、生体内では何らの役割りがないことを示
唆する。しかしながら、トウモロコシの胚乳由来のAD
P−グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素は、3−ホス
ホグリセリン酸によって、試験管内(in vitro
)では、植物の葉から単離した該酵素と同じ程度迄活性
化される。反対に、稲の胚乳由来のADP−グルコース
・ピロホスホリラーゼ酵素は、5mMの3−ホスホグリ
セリン酸(3−phospho−glycarate)
によって試験管内(in vitro)では僅か1.2
倍だけ活性化されるのみである。
ゼの翻訳後調節が、穀物植物の貯蔵器官において生体内
(in vivo)で発現して働らくことを実質的に示
す証拠はない、穀粒のアミロプラストは、正常な発育中
には、葉緑体になるまで、発育せず、しかも機能上でも
関係しない、上記因子は、小麦の胚乳でのデンプン生合
成経路にトリオースリン酸が掛かり合いをもたない事実
に組合せて考えると穀物の胚乳のアミロプラストにおけ
るADP−グルコース・ピロホスホリラーゼのアロステ
リック制御は、生体内では何らの役割りがないことを示
唆する。しかしながら、トウモロコシの胚乳由来のAD
P−グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素は、3−ホス
ホグリセリン酸によって、試験管内(in vitro
)では、植物の葉から単離した該酵素と同じ程度迄活性
化される。反対に、稲の胚乳由来のADP−グルコース
・ピロホスホリラーゼ酵素は、5mMの3−ホスホグリ
セリン酸(3−phospho−glycarate)
によって試験管内(in vitro)では僅か1.2
倍だけ活性化されるのみである。
穀物植物の胚乳の酵素の全てに関して、3−ホスホグリ
セリン酸の存在は、オルトリン酸による阻害に対する前
記酵素の感受性を低減し、このことは3−ホスホグリセ
リン酸が、オルトリン酸の結合する部位(サイト)に近
い所で、該酵素に結合することを示している。すなわち
、胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素
中においてアロステリックエフェクターが結合する部位
が保存されであることに拘わらず、また3−ホスホグリ
セリン酸によって試験管内(in vitro)でトウ
モロコシ胚乳の酵素が強く活性化される能力があるにも
かかわらず、上記の70ステリツク効果が生体内で働く
意義(significance)は未だよくわかって
いない。
セリン酸の存在は、オルトリン酸による阻害に対する前
記酵素の感受性を低減し、このことは3−ホスホグリセ
リン酸が、オルトリン酸の結合する部位(サイト)に近
い所で、該酵素に結合することを示している。すなわち
、胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素
中においてアロステリックエフェクターが結合する部位
が保存されであることに拘わらず、また3−ホスホグリ
セリン酸によって試験管内(in vitro)でトウ
モロコシ胚乳の酵素が強く活性化される能力があるにも
かかわらず、上記の70ステリツク効果が生体内で働く
意義(significance)は未だよくわかって
いない。
本発明の目的は、実質的に純粋な形のADP−グルコー
ス・ピロホスホリラーゼを提供することにある。
ス・ピロホスホリラーゼを提供することにある。
本発明の要旨によれば、実質的に純粋なADP−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼが提供される。
ース・ピロホスホリラーゼが提供される。
本発明の別の要旨によれば、酵素ADP−グルコース・
ピロホスホリラーゼを含有する粗酵素抽出液をゲルクロ
マトグラフィーによって連続精製することを特徴とする
酵素ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼの精製方
法が提供される。
ピロホスホリラーゼを含有する粗酵素抽出液をゲルクロ
マトグラフィーによって連続精製することを特徴とする
酵素ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼの精製方
法が提供される。
前記の粗製酵素は、小麦の胚乳から単離し得る。
また1本発明の要旨によれば、 (i) ADP−グル
コース・ピロホスホリラーゼをコードし且つ添付図面の
第3図に示したヌクレオチド配列を有する小麦の葉のc
DNA、それを含有するプラスミドwL:^GA。
コース・ピロホスホリラーゼをコードし且つ添付図面の
第3図に示したヌクレオチド配列を有する小麦の葉のc
DNA、それを含有するプラスミドwL:^GA。
1、並びに寄託番号NCl840065として、198
8年10月19日付で英国アバディーンのザ・ナショナ
ル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・
マリン・バクテリアに寄託されである前記プラスミドW
L:AGA、1を含有して保留している大腸菌(E、c
oli)TG2: (i) ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼをコ
ードし且つ添付図面の第4図に示した配列を有する小麦
の胚乳cDNA、それを含有するプラスミドl1lE:
AGA、3.並びに寄託番号NCIB40066として
、1988年10月19日付で英国アバディーンのザ・
ナショナル・コレクシ扇ン・オブ・インダストリアル・
アンド・マリン・バクテリアに寄託されてある、前記プ
ラスミドWE:AGA、3を含有して保留している大腸
菌TG2:及び (i) ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼをコ
ードし且つ添付図面の第5図に示したヌクレオチド配列
を有する小麦の胚乳cDNA、それを含有するプラスミ
ドwESAGA、7.並びに寄託番号NClB4O06
7として、1988年10月19日付でザ・ナショナル
・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マ
リン・バクテリアに寄託されてある、前記プラスミドI
E:AGA、7を含有して保留している大腸菌TG2、
が提供される。
8年10月19日付で英国アバディーンのザ・ナショナ
ル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・
マリン・バクテリアに寄託されである前記プラスミドW
L:AGA、1を含有して保留している大腸菌(E、c
oli)TG2: (i) ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼをコ
ードし且つ添付図面の第4図に示した配列を有する小麦
の胚乳cDNA、それを含有するプラスミドl1lE:
AGA、3.並びに寄託番号NCIB40066として
、1988年10月19日付で英国アバディーンのザ・
ナショナル・コレクシ扇ン・オブ・インダストリアル・
アンド・マリン・バクテリアに寄託されてある、前記プ
ラスミドWE:AGA、3を含有して保留している大腸
菌TG2:及び (i) ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼをコ
ードし且つ添付図面の第5図に示したヌクレオチド配列
を有する小麦の胚乳cDNA、それを含有するプラスミ
ドwESAGA、7.並びに寄託番号NClB4O06
7として、1988年10月19日付でザ・ナショナル
・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マ
リン・バクテリアに寄託されてある、前記プラスミドI
E:AGA、7を含有して保留している大腸菌TG2、
が提供される。
前記のクローン類は、他の植物種、特に穀類例えば小麦
、トウモロコシ、大麦及びモロコシ(sorghum)
、並びに食用作物例えばジャガイモ、の同等の遺伝子用
のプローブとして使用し得る。
、トウモロコシ、大麦及びモロコシ(sorghum)
、並びに食用作物例えばジャガイモ、の同等の遺伝子用
のプローブとして使用し得る。
更に、本発明の要旨によれば、添付図面の第3図、第4
図及び第5図にそれぞれ示したアミノ酸配列を有する前
記(1)、(i)及び(i)のcDNA類によって発現
された酵素類が提供される。
図及び第5図にそれぞれ示したアミノ酸配列を有する前
記(1)、(i)及び(i)のcDNA類によって発現
された酵素類が提供される。
本発明の更に別の要旨によれば、前記ADP−グルコー
ス・ピロホスホリラーゼに対する抗体が提供される。
ス・ピロホスホリラーゼに対する抗体が提供される。
前に定義したcDNA類の主な用途は、デンプン生合成
を調節するための作物植物の形質転換に利用するにある
。従って、本発明の別の要旨によれば、前記(i)、(
i)及び(i)のcDNAの1種又はそれ以上の1つ又
はそれ以上のコピーを含有する形質転換された植物が提
供される。
を調節するための作物植物の形質転換に利用するにある
。従って、本発明の別の要旨によれば、前記(i)、(
i)及び(i)のcDNAの1種又はそれ以上の1つ又
はそれ以上のコピーを含有する形質転換された植物が提
供される。
以下の記載では、小麦からADP−グルコース・ピロホ
スホリラーゼを単離する方法、小麦の胚乳及び葉の前記
酵素の動力学的性質、ADP−グルコース・ピロホスホ
リラーゼをコードしたcDNAクローン類の単離方法を
説明する。また、前記cDNA類の構造上の特徴も詳細
に記載する。前記クローン類は対応する遺伝子の単離に
使用し得る。また前記cDNA類と前記遺伝子類の両方
は、デンプンの収量の増大を生起させる諸研究に使用で
きる。1つの可能な応用の用途は、デンプン生合成にお
ける正味(net)の調節にどのようにADP−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼが寄与しているか決定するた
めに、形質転換された作物植物におけるADP−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼの遺伝子の導入量を増加させ
、次いでその後に1例えば穀物植物において穀粒がみの
る過程中に蓄積されたデンプンの量又は濃度を変えるた
めに、前記DNA配列を使用することであろう、小麦の
胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼの遺伝
子の付加的なコピーの導入は、小麦の胚乳のアミロプラ
スト内の酵素の濃度をより大きくするはずである。遺伝
子の発現の増大も、ADP−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼ遺伝子の5′−未転写領域中にエンハンサ−(e
nhancer)配列の多数のコピーを導入することに
よって励起され得る。
スホリラーゼを単離する方法、小麦の胚乳及び葉の前記
酵素の動力学的性質、ADP−グルコース・ピロホスホ
リラーゼをコードしたcDNAクローン類の単離方法を
説明する。また、前記cDNA類の構造上の特徴も詳細
に記載する。前記クローン類は対応する遺伝子の単離に
使用し得る。また前記cDNA類と前記遺伝子類の両方
は、デンプンの収量の増大を生起させる諸研究に使用で
きる。1つの可能な応用の用途は、デンプン生合成にお
ける正味(net)の調節にどのようにADP−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼが寄与しているか決定するた
めに、形質転換された作物植物におけるADP−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼの遺伝子の導入量を増加させ
、次いでその後に1例えば穀物植物において穀粒がみの
る過程中に蓄積されたデンプンの量又は濃度を変えるた
めに、前記DNA配列を使用することであろう、小麦の
胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼの遺伝
子の付加的なコピーの導入は、小麦の胚乳のアミロプラ
スト内の酵素の濃度をより大きくするはずである。遺伝
子の発現の増大も、ADP−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼ遺伝子の5′−未転写領域中にエンハンサ−(e
nhancer)配列の多数のコピーを導入することに
よって励起され得る。
前記酵素がデンプン生合成に対して律速酵素である場合
には、その場合にはデンプン生合成速度が、形質転換さ
れた植物において増大すると期待される1本発明を利用
すると、タンパク質工学により胚乳酵素の動力学的諸性
質を変えることもできる、例えばオルトリン酸結合部位
を巧みに加工操作することによって上記酵素をオルトリ
ン酸阻害に対する感受性が低くすることができる。多数
の別のパラメーターも改善し得ることも明らかであろう
。
には、その場合にはデンプン生合成速度が、形質転換さ
れた植物において増大すると期待される1本発明を利用
すると、タンパク質工学により胚乳酵素の動力学的諸性
質を変えることもできる、例えばオルトリン酸結合部位
を巧みに加工操作することによって上記酵素をオルトリ
ン酸阻害に対する感受性が低くすることができる。多数
の別のパラメーターも改善し得ることも明らかであろう
。
本発明を、実例として以下の実施例により、添付図面を
参照して説明する。
参照して説明する。
添付図面の第1図は葉におけるデンプンとグルコースの
生合成経路に伴なう諸反応を示す(Preiss (1
984年)を修正した〕。使用した略語は以下のものを
表わす、すなわち、G−3−Pはグリセルアルデヒド−
3−リン酸を表わし; DHAPはジヒドロキシアセト
ンリン酸を表わし;Piはオルトリン酸を表わし; P
Piは無機ピロリン酸を表わす。前記反応は次の酵素に
よって触媒的に促進される。
生合成経路に伴なう諸反応を示す(Preiss (1
984年)を修正した〕。使用した略語は以下のものを
表わす、すなわち、G−3−Pはグリセルアルデヒド−
3−リン酸を表わし; DHAPはジヒドロキシアセト
ンリン酸を表わし;Piはオルトリン酸を表わし; P
Piは無機ピロリン酸を表わす。前記反応は次の酵素に
よって触媒的に促進される。
1)ホスホグリセリン酸・キナーゼ/グリセルアルデヒ
ド−3−リン酸・デヒドロゲナーゼ2)トリオース−リ
ン酸・イソメラーゼ3)アルドラーゼ 4)フルクトース−1,6−ビスホスファターゼ5)ヘ
キソース−リン酸・イソメラーゼ6)ホスホグルコムタ
ーゼ 7) ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ8)デ
ンプンシンターゼ 9) uop−グルコース・ピロホスホリラーゼ10)
スクロースリン酸シンターゼ 11)スクロースホスファターゼ 12)オルトリン酸/トリオースリン酸輸送体13)無
機ピロホスファターゼ 添付図面の第2図は、小麦の胚乳におけるデンプン生合
成の提案された代謝経路(Keelingら、1988
年)を示す。使用した略号は第1図と同じである。この
反応は次の酵素によって触媒的に促進される。
ド−3−リン酸・デヒドロゲナーゼ2)トリオース−リ
ン酸・イソメラーゼ3)アルドラーゼ 4)フルクトース−1,6−ビスホスファターゼ5)ヘ
キソース−リン酸・イソメラーゼ6)ホスホグルコムタ
ーゼ 7) ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ8)デ
ンプンシンターゼ 9) uop−グルコース・ピロホスホリラーゼ10)
スクロースリン酸シンターゼ 11)スクロースホスファターゼ 12)オルトリン酸/トリオースリン酸輸送体13)無
機ピロホスファターゼ 添付図面の第2図は、小麦の胚乳におけるデンプン生合
成の提案された代謝経路(Keelingら、1988
年)を示す。使用した略号は第1図と同じである。この
反応は次の酵素によって触媒的に促進される。
l)スクロースシンターゼ
2) UDP−グルコース・ピロホスホリラーゼ3)へ
キソキナーゼ 4)ホスホグルコムターゼ 5)ヘキソース−リン酸・イソメラーゼ6) ATP−
依存ホスホフルクトキナーゼ7) PP1−依存ホスホ
フルクトキナーゼ8)アルドラーゼ 9)トリオース−リン酸・イソメラーゼ10)ヘキソー
ス−リン酸輸送体(?)11) ADP−グルコース・
ピロホスホリラーゼ12)デンプンシンターゼ 13)スクロースホスフェート・シンターゼ14)スク
ロースホスファターゼ 第3図はクローンWL : AGA、1のDNA配列を
示し;第4図はりo −:/IIE : AGA、3の
DNA配列を示し;第5図1* ’) o −ンWE
: AGA、7(7)DNA配列ヲ示ス。
キソキナーゼ 4)ホスホグルコムターゼ 5)ヘキソース−リン酸・イソメラーゼ6) ATP−
依存ホスホフルクトキナーゼ7) PP1−依存ホスホ
フルクトキナーゼ8)アルドラーゼ 9)トリオース−リン酸・イソメラーゼ10)ヘキソー
ス−リン酸輸送体(?)11) ADP−グルコース・
ピロホスホリラーゼ12)デンプンシンターゼ 13)スクロースホスフェート・シンターゼ14)スク
ロースホスファターゼ 第3図はクローンWL : AGA、1のDNA配列を
示し;第4図はりo −:/IIE : AGA、3の
DNA配列を示し;第5図1* ’) o −ンWE
: AGA、7(7)DNA配列ヲ示ス。
A叶−グルコース・ピロホスホリラーゼをフェニル−セ
ファロース上でクロマトグラフィーで部分的に精製し、
次いでイオン交換媒体MonoQ HR515上で2回
精製し、更にゲル濾過媒体、すなわち5uperose
12 HR10/30を通して1回精製することによっ
て、精製した6代表的な精製結果を次の第1表に示した
。
ファロース上でクロマトグラフィーで部分的に精製し、
次いでイオン交換媒体MonoQ HR515上で2回
精製し、更にゲル濾過媒体、すなわち5uperose
12 HR10/30を通して1回精製することによっ
て、精製した6代表的な精製結果を次の第1表に示した
。
前記精製操作の各工程でためた(pooled)ADP
−グルコース・ピロホスホリラーゼ抽出液をSO8/ポ
リアクリルアミドゲルで分析した。ゲル濾過の後では、
酵素標品中にはほとんどタンパク質不純物はなく、荷酵
素標品は90%よりも高い純度であった。
−グルコース・ピロホスホリラーゼ抽出液をSO8/ポ
リアクリルアミドゲルで分析した。ゲル濾過の後では、
酵素標品中にはほとんどタンパク質不純物はなく、荷酵
素標品は90%よりも高い純度であった。
分子量51,000のポリペプチドは、前記精製の各工
程で選択的に精製された。すなわち、小麦の胚乳のAD
P−グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素はサブユニッ
ト分子量51,000を有する。
程で選択的に精製された。すなわち、小麦の胚乳のAD
P−グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素はサブユニッ
ト分子量51,000を有する。
小麦の胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ
の本来の(native)分子量は、前記の部分的に精
製された酵素を5uparose 12 HR10/3
0上で再びクロマトグラフィー精製することにより24
5.Go。
の本来の(native)分子量は、前記の部分的に精
製された酵素を5uparose 12 HR10/3
0上で再びクロマトグラフィー精製することにより24
5.Go。
±3,000であると決定された。これは、タンパク質
を5ephacryl S−300sf上でりO?トゲ
ラフイー精製することにより決定された推定分子量26
0.000±20,000とほぼ一致している。各々の
場合に、 ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ活
性の溶出容量を、既知のタンパク質標品、フェリチン、
カタラーゼ及びウシ血清アルブミンの溶出容量と比較す
ることによって分子量を決定した。このようにして、本
発明者らは、小麦の胚乳の酵素は同一の分子量の4つの
サブユニットからなると結論を下した。
を5ephacryl S−300sf上でりO?トゲ
ラフイー精製することにより決定された推定分子量26
0.000±20,000とほぼ一致している。各々の
場合に、 ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ活
性の溶出容量を、既知のタンパク質標品、フェリチン、
カタラーゼ及びウシ血清アルブミンの溶出容量と比較す
ることによって分子量を決定した。このようにして、本
発明者らは、小麦の胚乳の酵素は同一の分子量の4つの
サブユニットからなると結論を下した。
1.2 の動力学・性
部分的に精製した小麦の胚乳のADP−グルコース・ピ
ロホスホリラーゼは、20+aM 3−ホスホグリセリ
ン酸迄の濃度では活性化されなかった。これに対して、
小麦の葉の酵素は、100μM3−ホスホグリセリン酸
によって14.5倍活性化される。小麦の胚乳の酵素は
、酵素活性の半値最大阻害を得るために必要な700μ
にのオルトリン酸を用いて、オルトリン酸で阻害される
ことが認められた。これは、小麦の葉のADP−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼの半値最大阻害を得るのに必
要な濃度(56μM)よりもかなり高い、トウモロコシ
の胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼはア
ロステリック応答性(resposivaness )
を同様に欠くことが、先に既に観察されている。トウモ
ロコシの胚乳においては、このv!A象は、それ以来、
前記酵素に対するプロテアーゼ活性の影響のせいだとさ
れていた。
ロホスホリラーゼは、20+aM 3−ホスホグリセリ
ン酸迄の濃度では活性化されなかった。これに対して、
小麦の葉の酵素は、100μM3−ホスホグリセリン酸
によって14.5倍活性化される。小麦の胚乳の酵素は
、酵素活性の半値最大阻害を得るために必要な700μ
にのオルトリン酸を用いて、オルトリン酸で阻害される
ことが認められた。これは、小麦の葉のADP−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼの半値最大阻害を得るのに必
要な濃度(56μM)よりもかなり高い、トウモロコシ
の胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼはア
ロステリック応答性(resposivaness )
を同様に欠くことが、先に既に観察されている。トウモ
ロコシの胚乳においては、このv!A象は、それ以来、
前記酵素に対するプロテアーゼ活性の影響のせいだとさ
れていた。
その理由は、1 、5mM フェニルメタンスルホニル
フルオリド及び10μg/muキモスタチンの存在下で
精製した場合には、トウモロコシの胚乳のADP−グル
コース・ピロホスホリラーゼは、3−ホスホグリセリン
酸によって試験管内(inyitro)で活性化される
ことが証明されているからである。しかしながら、本発
明者らは、プロテアーゼ阻害物質であるキモスタチン、
ロイペプチン及びフェニルメタンスルホニルフルオリド
の存在下で小麦の胚乳のADP−グルコース・ピロホス
ホリラーゼを精製した。
フルオリド及び10μg/muキモスタチンの存在下で
精製した場合には、トウモロコシの胚乳のADP−グル
コース・ピロホスホリラーゼは、3−ホスホグリセリン
酸によって試験管内(inyitro)で活性化される
ことが証明されているからである。しかしながら、本発
明者らは、プロテアーゼ阻害物質であるキモスタチン、
ロイペプチン及びフェニルメタンスルホニルフルオリド
の存在下で小麦の胚乳のADP−グルコース・ピロホス
ホリラーゼを精製した。
本発明者らは、3−ホスホグリセリン酸による、試験管
内(in vitro)での上記酵素標品のアロステリ
ック活性化を例証することができなかった。従って、上
記の結果は、小麦の胚乳の酵素は3−ホスホグリセリン
酸によってアロステリックに活性化されないことを示唆
する。
内(in vitro)での上記酵素標品のアロステリ
ック活性化を例証することができなかった。従って、上
記の結果は、小麦の胚乳の酵素は3−ホスホグリセリン
酸によってアロステリックに活性化されないことを示唆
する。
植物の葉のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ酵
素に対する3−ホスホグリセリン酸とオルトリン酸の組
み合わさった効果と一致して、小麦の胚乳の酵素の阻害
は3−ホスホグリセリン酸によって除去される。1鱈の
3−ホスホグリセリン酸の存在下では、オルトリン酸に
対する小麦の胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼの1.、、は1.5mM迄増加する。これは前記
酵素は3−ホスホグリセリン酸の存在下で該酵素をより
活性な形に変えるのに必要な、必要配座変化をすること
ができないが。
素に対する3−ホスホグリセリン酸とオルトリン酸の組
み合わさった効果と一致して、小麦の胚乳の酵素の阻害
は3−ホスホグリセリン酸によって除去される。1鱈の
3−ホスホグリセリン酸の存在下では、オルトリン酸に
対する小麦の胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼの1.、、は1.5mM迄増加する。これは前記
酵素は3−ホスホグリセリン酸の存在下で該酵素をより
活性な形に変えるのに必要な、必要配座変化をすること
ができないが。
該酵素が代謝中間物質には結合できることを示す。
この3−ホスホグリセリン酸とオルトリン酸との相互作
用からみて、3−ホスホグリセリン酸の結合部位は、恐
らくは前記酵素の3次元構造内のオルトリン酸結合部位
に近いであろう。
用からみて、3−ホスホグリセリン酸の結合部位は、恐
らくは前記酵素の3次元構造内のオルトリン酸結合部位
に近いであろう。
1.3酵素に対する の 生
多数の別々の実験から前記のようにして単離した、単離
酵素サブユニットをプール(pool)することによっ
て、ウサギを免疫化させるのに十分なタンパク貿を得た
。次いで51KOのADP−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼポリペプチドをポリアクリルアミドゲルの薄切り
(スライス)から電気溶出によって明白な同質性物(h
omogeneity)に精製した。
酵素サブユニットをプール(pool)することによっ
て、ウサギを免疫化させるのに十分なタンパク貿を得た
。次いで51KOのADP−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼポリペプチドをポリアクリルアミドゲルの薄切り
(スライス)から電気溶出によって明白な同質性物(h
omogeneity)に精製した。
51KDのADP−グルコース・ピロホスホリラーゼポ
リペプチドに対する抗血清を調製した。ウサギの免疫処
理は、本質的にMayer及びWalkerの方法(1
978)に従って行なった。
リペプチドに対する抗血清を調製した。ウサギの免疫処
理は、本質的にMayer及びWalkerの方法(1
978)に従って行なった。
得られた免疫血清は、小麦の胚乳の粗抽出物がらADP
−グルコース・ピロホスホリラーゼ活性体(Activ
ity)を沈殿させた。免疫血清と共に抽出物を培養し
、酵素−Igγ−プロティンA−セファロース接合体を
遠心分離した後に、ADP−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼ活性体の10%のみが上澄画分中に残った。洗滌
した酵素−Igγ−プロティンA−セファロース接合体
を、酵素活性について、直接に検定すると、ADP−グ
ルコース・ピロホスホリラーゼ活性体をペレット画分中
に検出できた。胚乳抽出物中に存在する全酵素活性体の
約70%が、次後にペレット画分中に免疫沈殿物として
回収された。
−グルコース・ピロホスホリラーゼ活性体(Activ
ity)を沈殿させた。免疫血清と共に抽出物を培養し
、酵素−Igγ−プロティンA−セファロース接合体を
遠心分離した後に、ADP−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼ活性体の10%のみが上澄画分中に残った。洗滌
した酵素−Igγ−プロティンA−セファロース接合体
を、酵素活性について、直接に検定すると、ADP−グ
ルコース・ピロホスホリラーゼ活性体をペレット画分中
に検出できた。胚乳抽出物中に存在する全酵素活性体の
約70%が、次後にペレット画分中に免疫沈殿物として
回収された。
対照(control)実験では、ADP−グルコース
・ピロホスホリラーゼを用いて動物類を初期免疫処理す
る前に該動物類から採取した前免疫(pre−i+m+
mune)血清は、ADP−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼ活性体を分配(partition) L+なか
った。抗−小麦胚乳ADP−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼ血清を使用した小麦の胚乳の可溶性タンパク質全
体のウェスタン・プロット分析によれば、単一の51k
Dの免疫活性ポリペプチドの存在が明らかにされた。同
様の実験では、ホウレンソウの葉のADP−グルコース
・ピロホスホリラーゼホロ酵素に対して誘導された抗体
もまた、51kDの分子量の小麦胚乳内にのみ存在する
1つのポリペプチドと認められた。
・ピロホスホリラーゼを用いて動物類を初期免疫処理す
る前に該動物類から採取した前免疫(pre−i+m+
mune)血清は、ADP−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼ活性体を分配(partition) L+なか
った。抗−小麦胚乳ADP−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼ血清を使用した小麦の胚乳の可溶性タンパク質全
体のウェスタン・プロット分析によれば、単一の51k
Dの免疫活性ポリペプチドの存在が明らかにされた。同
様の実験では、ホウレンソウの葉のADP−グルコース
・ピロホスホリラーゼホロ酵素に対して誘導された抗体
もまた、51kDの分子量の小麦胚乳内にのみ存在する
1つのポリペプチドと認められた。
1.4胚 及び葉の酵素のサブユニット構造小麦の胚乳
及び小麦の葉の中のADP−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼの器官特異(organ−specific)イ
ソ酵素の存在を、酵素サブユニットを検出するための抗
−小麦胚乳ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ血
清を使用して、前記の器官由来のタンパク質抽出物のウ
ェスタンプロット分析によって確認した。前述のように
、小麦胚乳の酵素は4つの51kDサブユニツトからな
る。小麦の葉のイソ酵素のサブユニット構造を決定する
ためのウェスタンプロット試験では、小麦の葉の粗抽出
物中には免疫活性タンパク質のバンド(band)は検
出できなかった。小麦の葉の抽出物を、フェニル−セフ
ァロース及び5uperose 12 HR1G/3G
上でクロマトグラフィー精製した後には、48.5〜4
9.0kDの分子量を有する単一の免疫活性ポリペプチ
ドがウェスタンプロット中に検出された。従って、小麦
の葉のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼポリペ
プチドは、小麦の胚乳由来の対応するタンパク質よりも
約2.5kD小さい、小麦の葉の酵素と胚乳の酵素との
間の相異を示す別の証拠(evidence)を以下に
示す。
及び小麦の葉の中のADP−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼの器官特異(organ−specific)イ
ソ酵素の存在を、酵素サブユニットを検出するための抗
−小麦胚乳ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ血
清を使用して、前記の器官由来のタンパク質抽出物のウ
ェスタンプロット分析によって確認した。前述のように
、小麦胚乳の酵素は4つの51kDサブユニツトからな
る。小麦の葉のイソ酵素のサブユニット構造を決定する
ためのウェスタンプロット試験では、小麦の葉の粗抽出
物中には免疫活性タンパク質のバンド(band)は検
出できなかった。小麦の葉の抽出物を、フェニル−セフ
ァロース及び5uperose 12 HR1G/3G
上でクロマトグラフィー精製した後には、48.5〜4
9.0kDの分子量を有する単一の免疫活性ポリペプチ
ドがウェスタンプロット中に検出された。従って、小麦
の葉のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼポリペ
プチドは、小麦の胚乳由来の対応するタンパク質よりも
約2.5kD小さい、小麦の葉の酵素と胚乳の酵素との
間の相異を示す別の証拠(evidence)を以下に
示す。
オファージを選別した。最初の選別で選択した7つの陽
性クローンのうち、最も強い信号を発生する3つのクロ
ーンを再選別した。これら3つのクローンのうちの1つ
だけが次回の選別で強い陽性信号を発生した。非組換体
λGTIIに関連して、上記cDNAクローンが出した
信号の強さは、該クローンが小麦の葉のADP−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼをコードしたcDNAを含有
することを示唆する。
性クローンのうち、最も強い信号を発生する3つのクロ
ーンを再選別した。これら3つのクローンのうちの1つ
だけが次回の選別で強い陽性信号を発生した。非組換体
λGTIIに関連して、上記cDNAクローンが出した
信号の強さは、該クローンが小麦の葉のADP−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼをコードしたcDNAを含有
することを示唆する。
小麦の葉のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼを
cDNAクローンと推定されるものをvL : AGA
、1と命名した。 DNAはりo−ンWL:AGA、1
カらm製した。
cDNAクローンと推定されるものをvL : AGA
、1と命名した。 DNAはりo−ンWL:AGA、1
カらm製した。
小麦の葉のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼを
コードしたcDNAクローンを同定するために、抗−ホ
ウレンソウの葉ADP−グルコース・ピロホスホリラー
ゼ血清を用いて、増殖させたホウレンソウの葉cDNA
ライブラリーから3X10”個のバクテリ上記DNAを
酵素EcoR1を用いて制限エンドヌクレアーゼ消化し
、アガロースゲルで電気泳動にかけた後で、りo−ンW
L:AG^、1は950bP ノ大きさノCDNA挿入
断片を含有することが明らかにされた。上記cDNA挿
入断片をニックトランスレーションによってalpでラ
ベルし、小麦の葉及び小麦の胚乳由来のポリ(A)−含
有RNAのノーザンプロットをプローブするのに使用し
た。このプローブは、小麦の胚乳及び小麦の葉のRNA
試料中の、それぞれ約1.8kb及び1.7kbのmR
NAバンドとハイブリダイズする。
コードしたcDNAクローンを同定するために、抗−ホ
ウレンソウの葉ADP−グルコース・ピロホスホリラー
ゼ血清を用いて、増殖させたホウレンソウの葉cDNA
ライブラリーから3X10”個のバクテリ上記DNAを
酵素EcoR1を用いて制限エンドヌクレアーゼ消化し
、アガロースゲルで電気泳動にかけた後で、りo−ンW
L:AG^、1は950bP ノ大きさノCDNA挿入
断片を含有することが明らかにされた。上記cDNA挿
入断片をニックトランスレーションによってalpでラ
ベルし、小麦の葉及び小麦の胚乳由来のポリ(A)−含
有RNAのノーザンプロットをプローブするのに使用し
た。このプローブは、小麦の胚乳及び小麦の葉のRNA
試料中の、それぞれ約1.8kb及び1.7kbのmR
NAバンドとハイブリダイズする。
ここで決定された小麦の葉及び小麦の胚乳のADP−グ
ルコース・ピロホスホリラーゼmRNAの大きさは。
ルコース・ピロホスホリラーゼmRNAの大きさは。
稲の胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼを
コードしたcDNAでプローブした小麦RNA類のノー
ザンプロットから、 Kr1shnanらによって得ら
れた評価(estimate) (1986年)と密接
に一致した。前記のcDNA挿入断片の大きさと同様の
mRNA種の大きさの比較によって、WL:AGA、1
cDNA挿入断片は、完全な小麦の葉のADP−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼmRNA配列の約50%を含
有することが示された。
コードしたcDNAでプローブした小麦RNA類のノー
ザンプロットから、 Kr1shnanらによって得ら
れた評価(estimate) (1986年)と密接
に一致した。前記のcDNA挿入断片の大きさと同様の
mRNA種の大きさの比較によって、WL:AGA、1
cDNA挿入断片は、完全な小麦の葉のADP−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼmRNA配列の約50%を含
有することが示された。
2.2りl:l−ンvt、 : AGA、lのクローン
礼: AGA、1由来のcDNA挿入断片は947bp
の長さであり、且つ小麦の葉のADP−グルコース・ピ
ロホスホリラーゼのC−末端に301個のアミノ酸をコ
ードする(第3図参照)、上記wL:AGA、1タンパ
ク質中には、成熟した小麦の葉のADP−グルコース・
ピロホスホリラーゼポリペプチド配列の約70%が含ま
れる。前記cDNAは、対応するmRN^の3′−未翻
訳領域中に45個のヌクレオチドまで伸び(axten
d)、且つ位9942〜947に配置された推定のポリ
アデニル化信号A A T、A A Aで終わる。従っ
て、小麦の葉のADP−グルコース・ピロホスホリラー
ゼmRNA配列中にはポリ(A)尾(tail)は存在
しない、ヒトロバシー・インデックス(hydropa
thy Index)(KyteとDoolittla
、1982年)及び第2の構造予言(predicti
on) (ChouとFass+aan、1978年)
は、Davereuxら(1987年)のプログラムを
使用して前記111L:AGA、1タンパク質について
算出された。前記vL:AGA、1のKytaとDoo
little (1982年)のヒトロバシー・インデ
ックスは、葉緑体の可溶性画分中の配置(locati
on) (KaiserとBagsho+m、 197
9年)と一致している。 C1ouとFasw+anの
第2の構造予言は、小麦の葉と小麦の胚乳のADP−グ
ルコース・ピロホスホリラーゼタンパク質の比較に用い
た(後記参照)。
礼: AGA、1由来のcDNA挿入断片は947bp
の長さであり、且つ小麦の葉のADP−グルコース・ピ
ロホスホリラーゼのC−末端に301個のアミノ酸をコ
ードする(第3図参照)、上記wL:AGA、1タンパ
ク質中には、成熟した小麦の葉のADP−グルコース・
ピロホスホリラーゼポリペプチド配列の約70%が含ま
れる。前記cDNAは、対応するmRN^の3′−未翻
訳領域中に45個のヌクレオチドまで伸び(axten
d)、且つ位9942〜947に配置された推定のポリ
アデニル化信号A A T、A A Aで終わる。従っ
て、小麦の葉のADP−グルコース・ピロホスホリラー
ゼmRNA配列中にはポリ(A)尾(tail)は存在
しない、ヒトロバシー・インデックス(hydropa
thy Index)(KyteとDoolittla
、1982年)及び第2の構造予言(predicti
on) (ChouとFass+aan、1978年)
は、Davereuxら(1987年)のプログラムを
使用して前記111L:AGA、1タンパク質について
算出された。前記vL:AGA、1のKytaとDoo
little (1982年)のヒトロバシー・インデ
ックスは、葉緑体の可溶性画分中の配置(locati
on) (KaiserとBagsho+m、 197
9年)と一致している。 C1ouとFasw+anの
第2の構造予言は、小麦の葉と小麦の胚乳のADP−グ
ルコース・ピロホスホリラーゼタンパク質の比較に用い
た(後記参照)。
小麦の胚乳のcDNAライブラリーを作った。−本鎖化
cDNAの前精製(GublerとHoff+man、
1983年)を行なわずに、2本鎖cDNAの合成にR
NアーゼH(リボヌクレアーゼ(1)と大腸菌DNAポ
リメラーゼエを用いる方法で、オリゴdT−セルロース
精製した小麦の胚乳RNAから2本鎖cDNAを調製し
た。未増殖小麦胚乳のcDNAライブラリーは、小麦の
葉の^OP−グルコース・ピロホスホリラーゼcDNA
挿入断片、%lL:AGA。
cDNAの前精製(GublerとHoff+man、
1983年)を行なわずに、2本鎖cDNAの合成にR
NアーゼH(リボヌクレアーゼ(1)と大腸菌DNAポ
リメラーゼエを用いる方法で、オリゴdT−セルロース
精製した小麦の胚乳RNAから2本鎖cDNAを調製し
た。未増殖小麦胚乳のcDNAライブラリーは、小麦の
葉の^OP−グルコース・ピロホスホリラーゼcDNA
挿入断片、%lL:AGA。
1に対して相同性の配列の存在について選別された。3
X10’個の組換えバクテリオファージの選別において
、10個の陽性信号が検出された。これら10個のクロ
ーン類のうちの6個を2回の追加の選別の間にプラーク
精製し、これらをクローンwE:AGA、1、WE :
AGA、3、すR: AGA、4、WE : AGA
、5.WE :AGA、6及びWE : AGA、7と
命名した。これら6個の小麦の胚乳のADP−グルコー
ス・ピロホスホリラーゼcDNAクローンと推定される
ものからDNAを調製した。上記DNA類をECoRl
を用いて制限エンドヌクレアーゼ消化し、アガロースゲ
ル電気泳動を行なった後には、前記クローン類のcDN
A挿入断片類の大きさは400bp〜1800bpの範
囲にわたることが示された。
X10’個の組換えバクテリオファージの選別において
、10個の陽性信号が検出された。これら10個のクロ
ーン類のうちの6個を2回の追加の選別の間にプラーク
精製し、これらをクローンwE:AGA、1、WE :
AGA、3、すR: AGA、4、WE : AGA
、5.WE :AGA、6及びWE : AGA、7と
命名した。これら6個の小麦の胚乳のADP−グルコー
ス・ピロホスホリラーゼcDNAクローンと推定される
ものからDNAを調製した。上記DNA類をECoRl
を用いて制限エンドヌクレアーゼ消化し、アガロースゲ
ル電気泳動を行なった後には、前記クローン類のcDN
A挿入断片類の大きさは400bp〜1800bpの範
囲にわたることが示された。
2.4 りo−ンWE:AGA、3の配りローンWE:
AGA、3由来のcDNA挿入断片は1272bpの長
さであり(第4図参照)、該cDNAは3′−末端に6
5個のヌクレオチドの長さのポリ(A)尾(tail)
を含む。TAG終止コドンからポリ(A)尾の始め迄の
WE:AGA 、 3cDNAの3′−未翻訳領域は、
317bpの長さである。317bpのWE:AGA、
3cDNAの3′−未翻訳領域には2つの重複したポリ
アデニル化信号が存在し;このうちの1つの配列AAT
AAAはポリアデニル化部位の104bP上流に配置さ
れ、もう1つの配列AATAAGはポリアデニル化部位
の100bp上流に配置される。
AGA、3由来のcDNA挿入断片は1272bpの長
さであり(第4図参照)、該cDNAは3′−末端に6
5個のヌクレオチドの長さのポリ(A)尾(tail)
を含む。TAG終止コドンからポリ(A)尾の始め迄の
WE:AGA 、 3cDNAの3′−未翻訳領域は、
317bpの長さである。317bpのWE:AGA、
3cDNAの3′−未翻訳領域には2つの重複したポリ
アデニル化信号が存在し;このうちの1つの配列AAT
AAAはポリアデニル化部位の104bP上流に配置さ
れ、もう1つの配列AATAAGはポリアデニル化部位
の100bp上流に配置される。
クローンリE;^GA、3はまた、ポリアデニル化部位
から31bP上流の位置1176〜1181に第3のポ
リアデニル化信号と推定される信号、 AATAAAを
含む。植物dNAN生類中リアデニル化信号の位置は、
通常ポリアデニル化部位のヌクレオチド22〜36個分
上流に存在する(Joshi、 1987年)ので、こ
の場合クローンWE:AGA、3中の上記第3のポリア
デニル化信号は、多分対応するADP−グルコース・ピ
ロホスホリラーゼmRNAのプロセッシング(proc
essing)の間に、ポリ(A)付加部位の選択を意
味する信号であるらしい、クローンVB:AGA、3の
転写解読枠は、小麦の胚乳のADP−グルコース・ピロ
ホスホリラーゼのアミノ酸296個をコードした890
bpの長さである。
から31bP上流の位置1176〜1181に第3のポ
リアデニル化信号と推定される信号、 AATAAAを
含む。植物dNAN生類中リアデニル化信号の位置は、
通常ポリアデニル化部位のヌクレオチド22〜36個分
上流に存在する(Joshi、 1987年)ので、こ
の場合クローンWE:AGA、3中の上記第3のポリア
デニル化信号は、多分対応するADP−グルコース・ピ
ロホスホリラーゼmRNAのプロセッシング(proc
essing)の間に、ポリ(A)付加部位の選択を意
味する信号であるらしい、クローンVB:AGA、3の
転写解読枠は、小麦の胚乳のADP−グルコース・ピロ
ホスホリラーゼのアミノ酸296個をコードした890
bpの長さである。
すなわち、分子量33,200のタンパク質が、クロー
ンWE:AGA、3によってコードされ、該クローンは
成熟生麦の胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリラ
ーゼサブユニットの65%の大きさに相当する。
ンWE:AGA、3によってコードされ、該クローンは
成熟生麦の胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリラ
ーゼサブユニットの65%の大きさに相当する。
2.5りo−ンWE:AGA、7の配 折数も大きな
小麦胚乳ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼcD
NA、すなわち118:AGA、7は、1798bp(
7)長さであり(第5図参照) 、1500bρの転写
解読枠を含有する。この転写解読枠は分子量55,00
0のタンパク質をコードし、該タンパク質は成熟小麦の
胚乳のADP−グルコースピロホスホリラーゼポリペプ
チドの約4,5kDと推定された分子量を越える。
小麦胚乳ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼcD
NA、すなわち118:AGA、7は、1798bp(
7)長さであり(第5図参照) 、1500bρの転写
解読枠を含有する。この転写解読枠は分子量55,00
0のタンパク質をコードし、該タンパク質は成熟小麦の
胚乳のADP−グルコースピロホスホリラーゼポリペプ
チドの約4,5kDと推定された分子量を越える。
クローンII!E:AGA、7によってコードされた最
初の33個の残基からなるアミノ酸配列は、葉緑体タン
パク質のシグナルペプチド(transit pept
ideともいう) (ColmanとRσbinson
、 1986年)及びアミロプラストのシグナルペプチ
ド、すなわち顆粒結合(granule−bound)
デンプンシンターゼ(Klosgsnら、1986年)
に似た性質を示す、上記配列は加水分解されてあり且つ
塩基性のアミノ酸類、特にアルギニンが多く、該アルギ
ニンは該配列中に4〜5残基毎に見出される。ADP−
グルコース・ピロホスホリラーゼシグナルペプチドと推
定されるシグナルペプチドと顆粒結合したデンプンシン
ターゼシグナルペプチドとは、アミノ酸含有量において
類似しているのにもかかわらず、明らかな配列相同性は
存在しない。また、核をコードした葉緑体タンパク質の
シグナルペプチド配列、例えばRubisg。
初の33個の残基からなるアミノ酸配列は、葉緑体タン
パク質のシグナルペプチド(transit pept
ideともいう) (ColmanとRσbinson
、 1986年)及びアミロプラストのシグナルペプチ
ド、すなわち顆粒結合(granule−bound)
デンプンシンターゼ(Klosgsnら、1986年)
に似た性質を示す、上記配列は加水分解されてあり且つ
塩基性のアミノ酸類、特にアルギニンが多く、該アルギ
ニンは該配列中に4〜5残基毎に見出される。ADP−
グルコース・ピロホスホリラーゼシグナルペプチドと推
定されるシグナルペプチドと顆粒結合したデンプンシン
ターゼシグナルペプチドとは、アミノ酸含有量において
類似しているのにもかかわらず、明らかな配列相同性は
存在しない。また、核をコードした葉緑体タンパク質の
シグナルペプチド配列、例えばRubisg。
の小さいサブユニット(MazurとChui、 19
85年)及び酸素放出錯体の16に!]のポリペプチド
(Jansenら。
85年)及び酸素放出錯体の16に!]のポリペプチド
(Jansenら。
1987年)に相同性の(ho■ology)配列は存
在しない。
在しない。
プレーADP−グルコース・ホスホリラーゼポリペプチ
ドの正確なプロセッシング部位は、上記の諸研究では決
定されておらず、しかも小麦の胚乳由来の成熟タンパク
質のN−末端アミノ酸配列の分析を必要とする。しかし
ながら、 Net(メチオニン)とCys(システィン
)の間の前駆体ポリペプチドの切断は、成熟ADP−グ
ルコース・ピロホスホリラーゼの概略の分子量、すなわ
ち51,800の、タンパク質を生成するであろう、更
にまた、Rubiscoの小さいサブユニットの葉緑体
特異的シグナルペプチドもまた、システィンとメチオニ
ン残基の間の境界で除かれる。これに対してアミノプラ
スト特異的デンプンシンターゼシグナルペプチドは、シ
スティンとアラニン残基との間の境界で除かれる(Kl
osganら、1986年)。
ドの正確なプロセッシング部位は、上記の諸研究では決
定されておらず、しかも小麦の胚乳由来の成熟タンパク
質のN−末端アミノ酸配列の分析を必要とする。しかし
ながら、 Net(メチオニン)とCys(システィン
)の間の前駆体ポリペプチドの切断は、成熟ADP−グ
ルコース・ピロホスホリラーゼの概略の分子量、すなわ
ち51,800の、タンパク質を生成するであろう、更
にまた、Rubiscoの小さいサブユニットの葉緑体
特異的シグナルペプチドもまた、システィンとメチオニ
ン残基の間の境界で除かれる。これに対してアミノプラ
スト特異的デンプンシンターゼシグナルペプチドは、シ
スティンとアラニン残基との間の境界で除かれる(Kl
osganら、1986年)。
さらに、クローンWE:AG^、7は、TAG終止コド
ンからポリ(A)尾の始め迄の218bpの37−未翻
訳領域を含む、前記未翻訳領域は、2つの重複するポリ
アデニル化信号と推定される信号すなわち、位置172
8〜1733のAATAAAと位置1732〜1737
の^ATAAGとを含む、これらのポリアデニル化信号
は、ポリアデニル化部位からそれぞれ45bp及び41
bp上流に配置され、且つクローンリE:AGA、3中
に存在する2つの配列と同じ配列である。@在、上記2
つの信号のどちらが機能を営み(functional
)得るかを決定することは不可能である。 Kyteと
Doolittle(1982年)のヒトロバシーイン
デックスとChouとFasman(1978年)の第
2の構造予言とは、Devereuxら(1987年)
のプログラムを使用してクローンWE:AGA。
ンからポリ(A)尾の始め迄の218bpの37−未翻
訳領域を含む、前記未翻訳領域は、2つの重複するポリ
アデニル化信号と推定される信号すなわち、位置172
8〜1733のAATAAAと位置1732〜1737
の^ATAAGとを含む、これらのポリアデニル化信号
は、ポリアデニル化部位からそれぞれ45bp及び41
bp上流に配置され、且つクローンリE:AGA、3中
に存在する2つの配列と同じ配列である。@在、上記2
つの信号のどちらが機能を営み(functional
)得るかを決定することは不可能である。 Kyteと
Doolittle(1982年)のヒトロバシーイン
デックスとChouとFasman(1978年)の第
2の構造予言とは、Devereuxら(1987年)
のプログラムを使用してクローンWE:AGA。
7について計算された* KyteとDoolittl
e (1982年)のヒトロバシーのプロフィール(p
rofile)は、クローンWE:AGA、7タンパク
質がその長さ全体に散在する疎水性領域(dolIai
n)と親水性領域とを含有し、それが可溶性タンパク質
であることと一致していることを示す。
e (1982年)のヒトロバシーのプロフィール(p
rofile)は、クローンWE:AGA、7タンパク
質がその長さ全体に散在する疎水性領域(dolIai
n)と親水性領域とを含有し、それが可溶性タンパク質
であることと一致していることを示す。
りo −ン!12:AGA、3及びりo −ンWE:A
GA、7ノ、小麦の胚乳のADP−グルコース・ピロホ
スホリラーゼcDNA挿入所片同士は、それらの転写解
読枠の共有領域において96.3%の相同性である゛、
TAG終止コドンからポリアデニル化部位迄の、上記
クローン類の3′−未翻訳領域においては、相同性の範
囲は72.3%迄低くなる。 11E:AGA、3cD
NAとWE:AGA、7cDNAのヌクレオチド配列同
士の比較は、30塩基の置換の全部が明らかになり、そ
のうちの72%がトランジション(塩基転位ともいう)
である、転写解読枠内には18個の塩基の置換、すなわ
ち11個のトランジションと7個のトランスバージョン
(塩基置換ともいう)があるだけである、前記のトラン
ジションの全ては、コドンの第3番目の塩基の位置に配
置され、それらのいずれもアミノ酸の置換を生起しない
ことは注目すべきである。 WE:AGA、7中の位置
1296に配置された前記トランスバージョンの1つは
、熱学(silent)である、残りの6つのトランス
バージョンは、3つの保存的(conservativ
e)アミノ酸置換(スレオニン−セリン、グルタミン−
リシン、アラニン−セリン)と2つの生保存的アミノ酸
置換(アルギニン−メチオニン、イソロイシン−メチオ
ニン)を生ずる。さらに、前記転写解読枠には9個所だ
け挿入/欠落が存在し、WE!:AGA、3ヌクレオチ
ド配列の位置579〜585及び位置592〜593に
発生している。これらの挿入/欠落は、WE:AGA。
GA、7ノ、小麦の胚乳のADP−グルコース・ピロホ
スホリラーゼcDNA挿入所片同士は、それらの転写解
読枠の共有領域において96.3%の相同性である゛、
TAG終止コドンからポリアデニル化部位迄の、上記
クローン類の3′−未翻訳領域においては、相同性の範
囲は72.3%迄低くなる。 11E:AGA、3cD
NAとWE:AGA、7cDNAのヌクレオチド配列同
士の比較は、30塩基の置換の全部が明らかになり、そ
のうちの72%がトランジション(塩基転位ともいう)
である、転写解読枠内には18個の塩基の置換、すなわ
ち11個のトランジションと7個のトランスバージョン
(塩基置換ともいう)があるだけである、前記のトラン
ジションの全ては、コドンの第3番目の塩基の位置に配
置され、それらのいずれもアミノ酸の置換を生起しない
ことは注目すべきである。 WE:AGA、7中の位置
1296に配置された前記トランスバージョンの1つは
、熱学(silent)である、残りの6つのトランス
バージョンは、3つの保存的(conservativ
e)アミノ酸置換(スレオニン−セリン、グルタミン−
リシン、アラニン−セリン)と2つの生保存的アミノ酸
置換(アルギニン−メチオニン、イソロイシン−メチオ
ニン)を生ずる。さらに、前記転写解読枠には9個所だ
け挿入/欠落が存在し、WE!:AGA、3ヌクレオチ
ド配列の位置579〜585及び位置592〜593に
発生している。これらの挿入/欠落は、WE:AGA。
3タンパク質とIIIE:AGA、7タンパク質との間
の付加的な5個のアミノ酸の変換、3個の挿入及び2個
の置換を生ずる。すなわち、小麦の胚乳のAひP−グル
コース・ピロホスホリラーゼcDNA類の誘導されたア
ミノ酸配列は、296個のアミノ酸残基のうち10個だ
けが異なり、96.7%のアミノ酸相同性を生ずる。前
記の3′−未翻訳領域においては、WE:AGA、3配
列とWE:AGA、7配列(7)fllH:85M(7
)挿入/欠落の全部があり、8つの可変領域に密集して
いる。
の付加的な5個のアミノ酸の変換、3個の挿入及び2個
の置換を生ずる。すなわち、小麦の胚乳のAひP−グル
コース・ピロホスホリラーゼcDNA類の誘導されたア
ミノ酸配列は、296個のアミノ酸残基のうち10個だ
けが異なり、96.7%のアミノ酸相同性を生ずる。前
記の3′−未翻訳領域においては、WE:AGA、3配
列とWE:AGA、7配列(7)fllH:85M(7
)挿入/欠落の全部があり、8つの可変領域に密集して
いる。
3.2りo −ンWE!:AGA、7とりo−ンWL:
AGA、1(7)比小麦の葉のADP−グルコース・ピ
ロホスホリラーゼcDNA配列(ML:AGA、1)と
小麦の胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ
cDNA配列(WE:AGA、7)を、Devereu
xら(1987年)のDIAGONプログラムを使用し
て比較した。上記2つのヌクレオチド配列の間には、1
0個の良く保存された領域がある。クローンWL:AG
A、1とりo−ンlE:AGA、7トノft1i4:ハ
、322個のヌクレオチド置換があり、そのうちの29
0個は転写解読枠内にあり、これに148個の挿入/欠
落が加わる。従って、クローンWL:AGA、1及びク
ロ−ンWE:AGA、7のcDNA配列が重複する転写
解読枠内では、DNAレベルでわずか55.7%の相同
性があるだけである。前記のクローン中に示された3′
−未翻訳領域には相同性はない。
AGA、1(7)比小麦の葉のADP−グルコース・ピ
ロホスホリラーゼcDNA配列(ML:AGA、1)と
小麦の胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ
cDNA配列(WE:AGA、7)を、Devereu
xら(1987年)のDIAGONプログラムを使用し
て比較した。上記2つのヌクレオチド配列の間には、1
0個の良く保存された領域がある。クローンWL:AG
A、1とりo−ンlE:AGA、7トノft1i4:ハ
、322個のヌクレオチド置換があり、そのうちの29
0個は転写解読枠内にあり、これに148個の挿入/欠
落が加わる。従って、クローンWL:AGA、1及びク
ロ−ンWE:AGA、7のcDNA配列が重複する転写
解読枠内では、DNAレベルでわずか55.7%の相同
性があるだけである。前記のクローン中に示された3′
−未翻訳領域には相同性はない。
WE:AGA、7及びWL:AGA、1をコードしたポ
リペプチド同士の間の相同性を決定するために、誘導さ
れたアミノ酸配列を一列に整列させた(aligned
)。
リペプチド同士の間の相同性を決定するために、誘導さ
れたアミノ酸配列を一列に整列させた(aligned
)。
転写解読枠内の290個のヌクレオチド置換のうち、9
7個は熱学(silent)である、残りの193個の
ヌクレオチド置換と、148個の挿入/欠落のうちの9
1個とにより生成された、小麦の葉及び小麦の胚乳のA
DP−グルコース・ピロホスホリラーゼポリペプチド配
列同士の間には全体で110個のアミノ酸変換(alt
eration)がある、このデータは、はとんどの場
合に、WL:AGA、 1 ト!jE:AGA、7(7
)cDNA配列同士ノ間のヌクレオチド置換は、コドン
の3つのヌクレオチド位置の全てを含むことを示す。従
って、前記2つのcDNAの誘導されたアミノ酸配列同
士の間の相同性はわずか55.3%である。
7個は熱学(silent)である、残りの193個の
ヌクレオチド置換と、148個の挿入/欠落のうちの9
1個とにより生成された、小麦の葉及び小麦の胚乳のA
DP−グルコース・ピロホスホリラーゼポリペプチド配
列同士の間には全体で110個のアミノ酸変換(alt
eration)がある、このデータは、はとんどの場
合に、WL:AGA、 1 ト!jE:AGA、7(7
)cDNA配列同士ノ間のヌクレオチド置換は、コドン
の3つのヌクレオチド位置の全てを含むことを示す。従
って、前記2つのcDNAの誘導されたアミノ酸配列同
士の間の相同性はわずか55.3%である。
小麦の葉及び小麦の胚乳のADP−グルコース・ピロホ
スホリラーゼポリペプチド配列同士の間の110個のア
ミノ酸置換のうちの62個は、保存的変化(conse
rvative change)であり、荷電の相異あ
るいは中性アミド(すなわち、グルタミン、アスパラギ
ン)に代わる荷電残基による置換、両親媒性残基に代わ
る他の両親媒性残基への置換又は疎水性残基に代わる他
の疎水性残基への置換はいずれも伴なわない。39個の
生保存的アミノ酸置換があり、これらは荷電の逆転ある
いは荷電されであるか又は中性もしくは疎水性の残基に
代わる両親媒性アミノ酸への置換を伴なっている。非保
存的アミノ酸置換のうちの9つは、荷電されであるか又
は中性のアミノ酸いずれかに代わる疎水性残基への置換
を伴なう。小麦の葉及び小麦の胚乳の、ADP−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼポリペプチド同士の間の前記
の非保存的アミノ酸置換のうちの2つ()118g1*
−Tyrits :Lyssai−Glnszi)及び
2つの生保存的置換(!Mlrsoe−Glusea
:Alai*t−LySszt )は、ホウレンソウの
葉のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ(Pre
issら、1988年)上の推定の(ρutative
)3−ホスホグリセリン酸結合部位に相同性の領域にほ
ぼ近いか又はその領域内に配置されている。しかしなが
ら、小麦の葉及び小麦の胚乳のADP−グルコース・ピ
ロホスホリラーゼ酵素のC−末端27残基内では、前記
のChouとFasam (1978年)の予言はほと
んど一致している。
スホリラーゼポリペプチド配列同士の間の110個のア
ミノ酸置換のうちの62個は、保存的変化(conse
rvative change)であり、荷電の相異あ
るいは中性アミド(すなわち、グルタミン、アスパラギ
ン)に代わる荷電残基による置換、両親媒性残基に代わ
る他の両親媒性残基への置換又は疎水性残基に代わる他
の疎水性残基への置換はいずれも伴なわない。39個の
生保存的アミノ酸置換があり、これらは荷電の逆転ある
いは荷電されであるか又は中性もしくは疎水性の残基に
代わる両親媒性アミノ酸への置換を伴なっている。非保
存的アミノ酸置換のうちの9つは、荷電されであるか又
は中性のアミノ酸いずれかに代わる疎水性残基への置換
を伴なう。小麦の葉及び小麦の胚乳の、ADP−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼポリペプチド同士の間の前記
の非保存的アミノ酸置換のうちの2つ()118g1*
−Tyrits :Lyssai−Glnszi)及び
2つの生保存的置換(!Mlrsoe−Glusea
:Alai*t−LySszt )は、ホウレンソウの
葉のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ(Pre
issら、1988年)上の推定の(ρutative
)3−ホスホグリセリン酸結合部位に相同性の領域にほ
ぼ近いか又はその領域内に配置されている。しかしなが
ら、小麦の葉及び小麦の胚乳のADP−グルコース・ピ
ロホスホリラーゼ酵素のC−末端27残基内では、前記
のChouとFasam (1978年)の予言はほと
んど一致している。
3.3制 酵素 地図 によるクローン の比、較
− 小麦の葉と小麦の胚乳のADP−グルコース・ピロホス
ホリラーゼcDNAそれぞれの制限酵素切断地図を作成
しそれらの関係を例証した。小麦の葉のADP−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼcDNAの制限酵素切断地図
は、一般に分子内制限酵素部位を有せず小麦の胚乳のA
DP−グルコース・ピロホスホリラーゼcDNAの制限
酵素切断地図とは極めて異なる。
− 小麦の葉と小麦の胚乳のADP−グルコース・ピロホス
ホリラーゼcDNAそれぞれの制限酵素切断地図を作成
しそれらの関係を例証した。小麦の葉のADP−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼcDNAの制限酵素切断地図
は、一般に分子内制限酵素部位を有せず小麦の胚乳のA
DP−グルコース・ピロホスホリラーゼcDNAの制限
酵素切断地図とは極めて異なる。
この結果は、小麦の葉と小麦の胚乳のADP−グルコー
ス・ピロホスホリラーゼ遺伝子cDNAが、別々の遺伝
子サブファミリー(亜科)を表わすことを示した先のハ
イブリダイゼーション分析を追認する。
ス・ピロホスホリラーゼ遺伝子cDNAが、別々の遺伝
子サブファミリー(亜科)を表わすことを示した先のハ
イブリダイゼーション分析を追認する。
これに対して、小麦の胚乳のcDNA類すなわち11E
:AGA、1、WE:AGA、3、WE:AGA、5、
WE:AGA、6及びwE:AGA、7は、密接に関連
している。上記cDNA類の全ては、3′−末端に配置
された唯一のHind m部位及び)find m部位
に対して−680の位置に配置されたSst 1部位を
含有する。唯一のBamH1部位はより長イeDNA挿
入断片類、すなわちWE:AGA、1. WE:AGA
、6及びWE:AGA、7の5′−領域に存在する。小
麦の胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼc
DNA類のHind m部位に対して−400の位置に
配置されたSst 1部位の周りには多形性(poly
onorphism)が存在する。その理由は、この部
位がクローン類wE:AGA、1、WE:AGA、6及
びWE:AGA、7中ニノミ存在するからである。さら
に、Hind m部位に対して−340の位置に配置さ
れたBg111部位は、クローン類WE:AGA、3及
びWE:AGA、5中に存在するだけである。
:AGA、1、WE:AGA、3、WE:AGA、5、
WE:AGA、6及びwE:AGA、7は、密接に関連
している。上記cDNA類の全ては、3′−末端に配置
された唯一のHind m部位及び)find m部位
に対して−680の位置に配置されたSst 1部位を
含有する。唯一のBamH1部位はより長イeDNA挿
入断片類、すなわちWE:AGA、1. WE:AGA
、6及びWE:AGA、7の5′−領域に存在する。小
麦の胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼc
DNA類のHind m部位に対して−400の位置に
配置されたSst 1部位の周りには多形性(poly
onorphism)が存在する。その理由は、この部
位がクローン類wE:AGA、1、WE:AGA、6及
びWE:AGA、7中ニノミ存在するからである。さら
に、Hind m部位に対して−340の位置に配置さ
れたBg111部位は、クローン類WE:AGA、3及
びWE:AGA、5中に存在するだけである。
これらの結果は、小麦の胚乳のADP−グルコース・ピ
ロホスホリラーゼ遺伝子サブファミリー(亜科)は、少
なくとも2つの異なる遺伝子分類、すなわちクローン類
りD −ンwE:AGA、3、WE:AGA、5によっ
て代表される分類Iとクローン類WE:AGA、1゜W
E:AGA、6及びWE:AGA、7ニよって代表され
る分類■に区分し得る。
ロホスホリラーゼ遺伝子サブファミリー(亜科)は、少
なくとも2つの異なる遺伝子分類、すなわちクローン類
りD −ンwE:AGA、3、WE:AGA、5によっ
て代表される分類Iとクローン類WE:AGA、1゜W
E:AGA、6及びWE:AGA、7ニよって代表され
る分類■に区分し得る。
小麦のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼcDN
A類由来のアミノ酸配列を、稲の胚乳のADP−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼcDNA (Preissら
、1987年)及び大腸菌g1gc遺伝子(Bacho
rら、1983年)由来のアミノ酸配列と共に一直線に
配列した(alignad) m S通りのタンパク質
配列の直線状化(alignmant)を行なった。ア
ミノ酸配列同士の相同性は、吹抜に、重複領域同士の中
の同一の残基の割合として上記直線状化(alignm
ent)を基準として計算し、従って、重複の間の間隙
の大きさは考慮に入れない、小麦の胚乳の2つのADP
−グルコース・ピロホスホリラーゼ配列(WE:AGA
、3とWE:AGA、7)と、稲の胚乳(7) ADP
−グ/L/:I−スーピロホスホリラーゼ配列との間の
相同性は40%である。
A類由来のアミノ酸配列を、稲の胚乳のADP−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼcDNA (Preissら
、1987年)及び大腸菌g1gc遺伝子(Bacho
rら、1983年)由来のアミノ酸配列と共に一直線に
配列した(alignad) m S通りのタンパク質
配列の直線状化(alignmant)を行なった。ア
ミノ酸配列同士の相同性は、吹抜に、重複領域同士の中
の同一の残基の割合として上記直線状化(alignm
ent)を基準として計算し、従って、重複の間の間隙
の大きさは考慮に入れない、小麦の胚乳の2つのADP
−グルコース・ピロホスホリラーゼ配列(WE:AGA
、3とWE:AGA、7)と、稲の胚乳(7) ADP
−グ/L/:I−スーピロホスホリラーゼ配列との間の
相同性は40%である。
小麦の葉の上記配列は、稲の胚乳のADP−グルコース
・ピロホスホリラーゼ配列に対し44%の相同性である
。上記2つの相同性は、小麦の葉と小麦の胚乳の配列同
士の間の相同性55%よりもわずかに低いだけである。
・ピロホスホリラーゼ配列に対し44%の相同性である
。上記2つの相同性は、小麦の葉と小麦の胚乳の配列同
士の間の相同性55%よりもわずかに低いだけである。
さらにまた、小麦の葉又は小麦の胚乳のADP−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼと大腸菌ADP−グルコース
・ピロホスホリラーゼとの間の相同性がわずか24%で
あるのに比べて、稲の胚乳と大腸菌のアミノ酸配列同士
の間の相同性は29.5%である。
ース・ピロホスホリラーゼと大腸菌ADP−グルコース
・ピロホスホリラーゼとの間の相同性がわずか24%で
あるのに比べて、稲の胚乳と大腸菌のアミノ酸配列同士
の間の相同性は29.5%である。
大腸菌及びホウレンソウの葉のADP−グルコース・ピ
ロホスホリラーゼポリペプチド配列の領域は、先に既に
基質、活性化物質又は阻害物質の組合部位として同定さ
れている(ParsonsとPreiss、1978年
a、 1978年b; りarsanら、 1986年
; Lee とPraiss 。
ロホスホリラーゼポリペプチド配列の領域は、先に既に
基質、活性化物質又は阻害物質の組合部位として同定さ
れている(ParsonsとPreiss、1978年
a、 1978年b; りarsanら、 1986年
; Lee とPraiss 。
1986年; J、 Preiss、個人的書信)、小
麦の葉及び小麦の胚乳のADP−グルコース・ピロホス
ホリラーゼの誘導されたアミノ酸配列は、他のADP−
グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素類で同定された基
質、活性化物質又は阻害物質の結合部位と比較されてい
る。上記結合部位は5つのタンパク質領域を形成する。
麦の葉及び小麦の胚乳のADP−グルコース・ピロホス
ホリラーゼの誘導されたアミノ酸配列は、他のADP−
グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素類で同定された基
質、活性化物質又は阻害物質の結合部位と比較されてい
る。上記結合部位は5つのタンパク質領域を形成する。
■、フルクトースー16−ピスリン ム大腸菌のAD
P−グルコース・ピロホスホリラーゼのアロステリック
活性化剤(フルクトース−1,6−ビスリン酸)結合部
位は、LYSs o残基(ParsonsとPreis
s、1978年b)に近いタンパク質のN−末端近くに
位置している。大腸菌酵素のフルクトース−1,6−ビ
スリン酸結合部位(ParsonとPraiss、19
78年b)に相同性の、小麦の胚乳のADP−グルコー
ス・ピロホスホリラーゼ中のアミノ酸配列は、固定され
ている。残基78〜100由来の領域は、小麦の胚乳及
び大腸菌の配列同士の間に保存された23個のアミノ酸
の中から14個を有する。しかしながら、小麦の胚乳の
配列中の疎水性又は両親媒性の残基例えばArgso
−Thr、、、 L)’ams −Phe、s、 AS
Pss −Pross*Ly8@6−Thr、、、 L
YSs3−Thr@3t H1s@7−PrOstに代
えて大腸菌配列内の荷電残による置換を伴なって、幾つ
かのアミノ酸部分で主な変換(alteration)
がある、ピリドキサール−5′−リン酸は、大腸菌AD
P−グルコース拳ピロホスホリラーゼ中のLy8saで
結合し、 フルクトース−1,6−ビスリン酸もこの領
域で結合する(ParsonとPreiss、 197
8年a、 1978年b)ので、この部位は、多分、小
麦の胚乳タンパク質内では機能を営まないであろう、従
って、大腸菌ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ
のアロスラリツク部位に相同性の中表の胚乳配列では、
フルクトース−1,6−ビスリン酸とタンパク質領域の
間でシッフベース(Schiff base)を形成す
る機会がない、この知見は、 フルクトース−1,6−
ビスリン酸による小麦の胚乳のADP−グルコース・ピ
ロホスホリラーゼの検出可能な活性化の欠除と一致して
いる。あいにく、小麦の葉のADP−グルコース・ピロ
ホスホリラーゼcDNA配列は、5′−コード領域中に
十分遠く追伸びず、 フルクトース−1,6−ビスリン
酸結合部位の配列を含有しない。それ故、フルクトース
−1,6−ビスリン酸による葉のADP−グルコース・
ピロホスホリラーゼのアロステリック活性化が、大腸菌
酵素内と同じ部位に対する活性化剤の結合によって達成
されるかどうかを本発明者らは確認できない。
P−グルコース・ピロホスホリラーゼのアロステリック
活性化剤(フルクトース−1,6−ビスリン酸)結合部
位は、LYSs o残基(ParsonsとPreis
s、1978年b)に近いタンパク質のN−末端近くに
位置している。大腸菌酵素のフルクトース−1,6−ビ
スリン酸結合部位(ParsonとPraiss、19
78年b)に相同性の、小麦の胚乳のADP−グルコー
ス・ピロホスホリラーゼ中のアミノ酸配列は、固定され
ている。残基78〜100由来の領域は、小麦の胚乳及
び大腸菌の配列同士の間に保存された23個のアミノ酸
の中から14個を有する。しかしながら、小麦の胚乳の
配列中の疎水性又は両親媒性の残基例えばArgso
−Thr、、、 L)’ams −Phe、s、 AS
Pss −Pross*Ly8@6−Thr、、、 L
YSs3−Thr@3t H1s@7−PrOstに代
えて大腸菌配列内の荷電残による置換を伴なって、幾つ
かのアミノ酸部分で主な変換(alteration)
がある、ピリドキサール−5′−リン酸は、大腸菌AD
P−グルコース拳ピロホスホリラーゼ中のLy8saで
結合し、 フルクトース−1,6−ビスリン酸もこの領
域で結合する(ParsonとPreiss、 197
8年a、 1978年b)ので、この部位は、多分、小
麦の胚乳タンパク質内では機能を営まないであろう、従
って、大腸菌ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ
のアロスラリツク部位に相同性の中表の胚乳配列では、
フルクトース−1,6−ビスリン酸とタンパク質領域の
間でシッフベース(Schiff base)を形成す
る機会がない、この知見は、 フルクトース−1,6−
ビスリン酸による小麦の胚乳のADP−グルコース・ピ
ロホスホリラーゼの検出可能な活性化の欠除と一致して
いる。あいにく、小麦の葉のADP−グルコース・ピロ
ホスホリラーゼcDNA配列は、5′−コード領域中に
十分遠く追伸びず、 フルクトース−1,6−ビスリン
酸結合部位の配列を含有しない。それ故、フルクトース
−1,6−ビスリン酸による葉のADP−グルコース・
ピロホスホリラーゼのアロステリック活性化が、大腸菌
酵素内と同じ部位に対する活性化剤の結合によって達成
されるかどうかを本発明者らは確認できない。
L−基jJL今1ヱG−
大腸菌ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼの2個
所の基質結合部位は、小麦の葉及び小麦の胚乳の2つの
ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ配列において
十分に保存されている。残基166〜173の間の領域
は、この領域内の小麦の胚乳、稲の胚乳及び大腸菌タン
パク質の配列それぞれの比較から得られたコンセンサス
配列(共通塩基配列ともいう) VXXGTADAを含
む、あらゆる場合において、アミノ部位fi 167は
、芳香族疎水性残基、すなわちチロシン又はフェニルア
ラニンのどちらかによって占有される。 ADP−グル
コース・ピロホスホリラーゼ同士の比較によれば、残基
252〜256としてコンセンサス配列FXEXPが明
らかにされる。
所の基質結合部位は、小麦の葉及び小麦の胚乳の2つの
ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ配列において
十分に保存されている。残基166〜173の間の領域
は、この領域内の小麦の胚乳、稲の胚乳及び大腸菌タン
パク質の配列それぞれの比較から得られたコンセンサス
配列(共通塩基配列ともいう) VXXGTADAを含
む、あらゆる場合において、アミノ部位fi 167は
、芳香族疎水性残基、すなわちチロシン又はフェニルア
ラニンのどちらかによって占有される。 ADP−グル
コース・ピロホスホリラーゼ同士の比較によれば、残基
252〜256としてコンセンサス配列FXEXPが明
らかにされる。
さらにまた、大腸菌ATOP−グルコース・ピロホスホ
リラーゼのLys、s sに対するピリドキサール−5
′−リン酸の結合は、ADP−グルコースによって阻害
され。
リラーゼのLys、s sに対するピリドキサール−5
′−リン酸の結合は、ADP−グルコースによって阻害
され。
基質結合部位が近くにあることを示す、ピリドキサール
−5′−リン酸は、リシンのe−アミノ基とシッフベー
スを形成するが、Lyszs sがそれ自体基質結合中
に含まれるということはありそうもない、その理由はL
ys、 s sは、植物ADP−グルコース・ピロホス
ホリラーゼ配列中に厳密に保存されないからでアル、例
えば、りO−ンWE: AGA、7ハ位!I 255
テグルタミン残基をコードする。しかしながら、Phe
z sよけ調べられたADP−グルコース・ピロホスホ
リラーゼ配列の全ての中に厳密に保存されており、この
残基が、フェニルアラニン側鎖の平坦な芳香族環と基質
分子のアデニン環との間の疎水性相互作用によって、結
合ATP及びADP−グルコース内に含まれるかもしれ
ないことを示す、それにもかかわらず、 ATP又はA
DP−グルコースのリン酸部分とArg□、(又はLy
szs v )のアミノ基との間のイオン相互作用を伴
なう別の機構は、除外し得ない。
−5′−リン酸は、リシンのe−アミノ基とシッフベー
スを形成するが、Lyszs sがそれ自体基質結合中
に含まれるということはありそうもない、その理由はL
ys、 s sは、植物ADP−グルコース・ピロホス
ホリラーゼ配列中に厳密に保存されないからでアル、例
えば、りO−ンWE: AGA、7ハ位!I 255
テグルタミン残基をコードする。しかしながら、Phe
z sよけ調べられたADP−グルコース・ピロホスホ
リラーゼ配列の全ての中に厳密に保存されており、この
残基が、フェニルアラニン側鎖の平坦な芳香族環と基質
分子のアデニン環との間の疎水性相互作用によって、結
合ATP及びADP−グルコース内に含まれるかもしれ
ないことを示す、それにもかかわらず、 ATP又はA
DP−グルコースのリン酸部分とArg□、(又はLy
szs v )のアミノ基との間のイオン相互作用を伴
なう別の機構は、除外し得ない。
ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素の推定上
の基質結合領域(do■ain)においては、ATP結
合部位に対し、Higginsら(1986年)のコン
センサス配列と相同性を有するアミノ酸は存在しない。
の基質結合領域(do■ain)においては、ATP結
合部位に対し、Higginsら(1986年)のコン
センサス配列と相同性を有するアミノ酸は存在しない。
上記コンセンサス配列(GXXXXGKS)は、結晶構
造分析によってリン酸結合領域(Paiら、 1979
年。
造分析によってリン酸結合領域(Paiら、 1979
年。
Higginsらに引用された、1986年)を形成し
ていることが明らかにされている。この配列の変異すな
わち小麦の葉の配列中のGDQLAEGKVと小麦内胚
乳の配列中ノSRLMSEGKVは、位置460〜46
8ニ配置される。
ていることが明らかにされている。この配列の変異すな
わち小麦の葉の配列中のGDQLAEGKVと小麦内胚
乳の配列中ノSRLMSEGKVは、位置460〜46
8ニ配置される。
4.3−ホスホグリセリン酸 A :各アミノ酸配列
を、ホウレンソウの葉のADP−グルコース・ピロホス
ホリラーゼ上の推定上の3−ホスホグリセリン酸結合部
位のアミノ酸配列と比較した。この部位は、小麦の葉の
配列と小麦の胚乳の配列との間で高< (highly
)保存される。小麦の葉と小麦の胚乳の2つのADP−
グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素の異なる活性化動
力学は、3−ホスホグリセリン酸の変換された(aft
θred)結合部位の点からは説明されない、その理由
は、3−ホスホグリセリン酸結合部位の酵素活性化と保
存との間には明白な関係がないからである。更に、小麦
の胚乳と小麦の葉のADP−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼの主要な(Primary)配列は、3−ホスホ
グリセリン酸結合部位の13個の残基のうち6個が異な
るが、この配列の第2の構造予言はほとんど一致してい
る。
を、ホウレンソウの葉のADP−グルコース・ピロホス
ホリラーゼ上の推定上の3−ホスホグリセリン酸結合部
位のアミノ酸配列と比較した。この部位は、小麦の葉の
配列と小麦の胚乳の配列との間で高< (highly
)保存される。小麦の葉と小麦の胚乳の2つのADP−
グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素の異なる活性化動
力学は、3−ホスホグリセリン酸の変換された(aft
θred)結合部位の点からは説明されない、その理由
は、3−ホスホグリセリン酸結合部位の酵素活性化と保
存との間には明白な関係がないからである。更に、小麦
の胚乳と小麦の葉のADP−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼの主要な(Primary)配列は、3−ホスホ
グリセリン酸結合部位の13個の残基のうち6個が異な
るが、この配列の第2の構造予言はほとんど一致してい
る。
3−ホスホグリセリン酸は、オルトリン酸による小麦の
胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼの阻害
を防止できるが、このことは、該酵素が機能的な3−ホ
スホグリセリン酸結合部位を有することを示唆する。残
基515〜52″2の間の3−ホスホグリセリン酸が結
合するコンセンサス配列は、全ての利用可能な植物のA
DP−グルコース・ピロホスホリラーゼ配列の比較によ
って得られた5GIXXXXKである。残基Lyss
x xは全ての配列中に厳密に保存され、且つピリドキ
サール−5′−リン酸の結合を含み、しかもホウレンソ
ウの葉のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素
中に見出されるような3−ホスホグリセリン酸の結合も
多分含む。
胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼの阻害
を防止できるが、このことは、該酵素が機能的な3−ホ
スホグリセリン酸結合部位を有することを示唆する。残
基515〜52″2の間の3−ホスホグリセリン酸が結
合するコンセンサス配列は、全ての利用可能な植物のA
DP−グルコース・ピロホスホリラーゼ配列の比較によ
って得られた5GIXXXXKである。残基Lyss
x xは全ての配列中に厳密に保存され、且つピリドキ
サール−5′−リン酸の結合を含み、しかもホウレンソ
ウの葉のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素
中に見出されるような3−ホスホグリセリン酸の結合も
多分含む。
従って、推定上の3−ホスホグリセリン酸結合部位以外
の領域中の小麦の葉及び小麦の胚乳のADP−グルコー
ス・ピロホスホリラーゼアミノ酸配列それぞれの間の変
換は、上記酵素類のアロステリッり特性において観察さ
れた相異が原因である。
の領域中の小麦の葉及び小麦の胚乳のADP−グルコー
ス・ピロホスホリラーゼアミノ酸配列それぞれの間の変
換は、上記酵素類のアロステリッり特性において観察さ
れた相異が原因である。
上記2つの酵素のアミノ酸配列同士は、わずか55%の
相同性であるので、観察されたアミノ酸の変換のいずれ
も、その異なるアロステリック特性を説明するかもしれ
ない、このことは、小麦の胚乳の酵素が、3−ホスホグ
リセリン酸の存在下で。
相同性であるので、観察されたアミノ酸の変換のいずれ
も、その異なるアロステリック特性を説明するかもしれ
ない、このことは、小麦の胚乳の酵素が、3−ホスホグ
リセリン酸の存在下で。
より活性な形に変わるのに必要とされる必要な構造変化
を行なうことができないことを示唆する。
を行なうことができないことを示唆する。
第1図は葉におけるデンプンとグルコースの生合成経路
に伴なう諸反応を示し、図中、G−3−Pはグリセルア
ルデヒド−3−リン酸を表わし; DHAPはジヒド
ロキシアセトンリン酸を表わし;Piはオルトリン酸を
表わし; PPiは無機ピロリン酸を表わし;1はホ
スホグリセリン酸キナーゼ/グリセルアルデヒド−3−
リン酸デヒドロゲナーゼ、 2はトリオース−リン酸イ
ソメラーゼ、 3はアルドラーゼ、4はフルクトース−
1,6−ビスホスファターゼ。 5はヘキソース−リン酸イソメラーゼ、 6はホスホグ
ルコムターゼ、7はADP−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼ、8はデンプンシンターゼ、9はυDP−グルコ
ースピロホスホリラーゼ、1Gはスクロースリン酸シン
ターゼ、11はスクロースホスファターゼ、12はオル
トリン酸/トリオースリン酸輸送体、13は無機ピロホ
スファターゼを表わす。 第2図は、小麦の胚乳におけるデンプン生合成の提案さ
れた代謝経路を示し、図中のG−3−P、DHAP、P
i、 PPiは第1図と同じ意味を表わし。 1はスクロースシンターゼ、2はυDP−グルコースピ
ロホスホリラーゼ、3はへキソキナーゼ、4はホスホグ
ルコムターゼ、 5はヘキソース−リン酸イソメラーゼ
、6はATP−依存ホスホフルクトキナーゼ、7はPP
1−依存ホスホフルクトキナーゼ、8はアルドラーゼ、
9はトリす−スーリン酸イソメラーゼ、10はヘキソ
ース−リン酸輸送体(?)、11はADP−グルコース
ピロホスホリラーゼ、12はデンプンシンターゼ、13
はスクロースホスフェートシンターゼ、14はスクロー
スホスファターゼを表わす。 第311ハクo −ンWL:AGA、1のDNA配列を
示し;第4図はりo−ンWE:AGA、3のDNA配列
を示し;第5図はクローンWE:AGA、フのDNA配
列を示す。 第 2 図 第 図 A) WL:AGAl 第 図 B)WE:AG入3
に伴なう諸反応を示し、図中、G−3−Pはグリセルア
ルデヒド−3−リン酸を表わし; DHAPはジヒド
ロキシアセトンリン酸を表わし;Piはオルトリン酸を
表わし; PPiは無機ピロリン酸を表わし;1はホ
スホグリセリン酸キナーゼ/グリセルアルデヒド−3−
リン酸デヒドロゲナーゼ、 2はトリオース−リン酸イ
ソメラーゼ、 3はアルドラーゼ、4はフルクトース−
1,6−ビスホスファターゼ。 5はヘキソース−リン酸イソメラーゼ、 6はホスホグ
ルコムターゼ、7はADP−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼ、8はデンプンシンターゼ、9はυDP−グルコ
ースピロホスホリラーゼ、1Gはスクロースリン酸シン
ターゼ、11はスクロースホスファターゼ、12はオル
トリン酸/トリオースリン酸輸送体、13は無機ピロホ
スファターゼを表わす。 第2図は、小麦の胚乳におけるデンプン生合成の提案さ
れた代謝経路を示し、図中のG−3−P、DHAP、P
i、 PPiは第1図と同じ意味を表わし。 1はスクロースシンターゼ、2はυDP−グルコースピ
ロホスホリラーゼ、3はへキソキナーゼ、4はホスホグ
ルコムターゼ、 5はヘキソース−リン酸イソメラーゼ
、6はATP−依存ホスホフルクトキナーゼ、7はPP
1−依存ホスホフルクトキナーゼ、8はアルドラーゼ、
9はトリす−スーリン酸イソメラーゼ、10はヘキソ
ース−リン酸輸送体(?)、11はADP−グルコース
ピロホスホリラーゼ、12はデンプンシンターゼ、13
はスクロースホスフェートシンターゼ、14はスクロー
スホスファターゼを表わす。 第311ハクo −ンWL:AGA、1のDNA配列を
示し;第4図はりo−ンWE:AGA、3のDNA配列
を示し;第5図はクローンWE:AGA、フのDNA配
列を示す。 第 2 図 第 図 A) WL:AGAl 第 図 B)WE:AG入3
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、実質的に純粋なADP−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼ。 2、酵素であるADP−グルコース・ピロホスホリラー
ゼを含有する粗酵素抽出液をゲルクロマトグラフィーに
よって連続精製することを特徴とする酵素ADP−グル
コース・ピロホスホリラーゼの精製方法。 3、粗製酵素が小麦の胚乳から単離されたものである請
求項2記載の方法。 4、ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼをコード
し且つ添付図面の第3図に示したヌクレオチド配列を有
する小麦の葉のcDNA。 5、ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼをコード
し且つ添付図面の第3図に示したヌクレオチド配列を有
する小麦の葉のcDNAを含有するプラスミドWL:A
GA.1、並びに寄託番号NCIB40065として、
1988年10月19日付で英国アバディーンのザ・ナ
ショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・ア
ンド・マリン・バクテリアに寄託されてある、前記プラ
スミドWL:AGA.1を含有して保留している大腸菌
(E.coli)TG2。 6、ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼをコード
し且つ添付図面の第4図に示した配列を有する小麦の胚
乳cDNA。 7、ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼをコード
し且つ添付図面の第4図に示した配列を有する小麦の胚
乳cDNAを含有するプラスミドWE:AGA。 3、並びに寄託番号NCIB40066として、198
8年10月19日付で英国アバディーンのザ・ナショナ
ル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・
マリン・バクテリアに寄託されてある、前記プラスミド
WE:AGA.3を含有して保留している大腸菌TG2
。 8、ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼをコード
し且つ添付図面の第5図に示した配列を有する小麦の胚
乳cDNA。 9、ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼをコード
し且つ添付図面の第5図に示したヌクレオチド配列を有
する小麦の胚乳cDNAを含有するプラスミドWE:A
GA.7、並びに寄託番号NCIB40067として、
1988年10月19日付でザ・ナショナル・コレクシ
ョン・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バク
テリアに寄託されてある、前記プラスミドWE:AGA
.7を含有して保留している大腸菌TG2。 10、請求項4、6及び8のいずれかに記載のcDNA
を含有してなる遺伝子プローブと酵素消化物とをハイブ
リダイズすることを特徴とする、ADP−グルコース・
ピロホスホリラーゼをコードするDNA配列の存在の検
出方法。 11、添付図面の第3図又は第4図又は第5図に示した
アミノ酸配列を有するADP−グルコース・ピロホスホ
リラーゼ。 12、前記のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ
に対する抗体。 13、ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼをコー
ドする遺伝子の1個又は2個以上の付加コピーを、形質
転換によって、デンプン合成植物の染色体中に安定的に
組み込んであるデンプン合成植物からなることを特徴と
する、高められたデンプン生産能を有する植物。 14、デンプン合成植物の内在性のADP−グルコース
・ピロホスホリラーゼ遺伝子によりコードされるmRN
Aに対してアンチセンスなmRNAをコードする遺伝子
を、形質転換によって前記デンプン合成植物の染色体中
に安定的に組み込んであるデンプン合成植物からなるこ
とを特徴とする、低減されたデンプン生産能を有する植
物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB8826356.1 | 1988-11-10 | ||
GB888826356A GB8826356D0 (en) | 1988-11-10 | 1988-11-10 | Adp glucose-pyrophosphorylase |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02273177A true JPH02273177A (ja) | 1990-11-07 |
JP3070059B2 JP3070059B2 (ja) | 2000-07-24 |
Family
ID=10646662
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1291401A Expired - Fee Related JP3070059B2 (ja) | 1988-11-10 | 1989-11-10 | Adp−グルコース・ピロホスホリラーゼをコードするdna |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP0368506A3 (ja) |
JP (1) | JP3070059B2 (ja) |
AU (1) | AU635904B2 (ja) |
CA (1) | CA2002788C (ja) |
GB (1) | GB8826356D0 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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SE467358B (sv) * | 1990-12-21 | 1992-07-06 | Amylogene Hb | Genteknisk foeraendring av potatis foer bildning av staerkelse av amylopektintyp |
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GB9307408D0 (en) * | 1993-04-08 | 1993-06-02 | Danisco | Transgenic plants |
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GB9805939D0 (en) * | 1998-03-20 | 1998-05-13 | Univ Manchester | Starch biosynthesis |
DE19836098A1 (de) | 1998-07-31 | 2000-02-03 | Hoechst Schering Agrevo Gmbh | Pflanzen, die eine modifizierte Stärke synthetisieren, Verfahren zur Herstellung der Pflanzen, ihre Verwendung sowie die modifizierte Stärke |
CN114813877B (zh) * | 2022-05-31 | 2023-03-14 | 华中科技大学 | 一种用于检测葡萄糖的传感器、其制备方法和应用 |
-
1988
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Cited By (1)
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WO2008117886A1 (ja) * | 2007-03-28 | 2008-10-02 | Japan Tobacco Inc. | 燃焼煙中のカルボニル類含量が低減されたタバコ属植物およびその作製法 |
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