JPH02256700A - 細胞毒性薬物コンジュゲート - Google Patents
細胞毒性薬物コンジュゲートInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野]
本発明は、有機化学、免疫学、および薬化学の分野に属
すものであり、患者に細胞毒性薬物をターゲット投与(
標的指向性投与)するのに有用な細胞毒性薬物コンジュ
ゲートを提供するものである。薬物コンジュゲートのタ
ーゲット化は、細胞毒性薬物で処置すべき細胞に関連す
る抗原を認識する抗体を使用することによって行われ、
この抗体により、細胞毒性薬物が細胞にまで運搬される
。
すものであり、患者に細胞毒性薬物をターゲット投与(
標的指向性投与)するのに有用な細胞毒性薬物コンジュ
ゲートを提供するものである。薬物コンジュゲートのタ
ーゲット化は、細胞毒性薬物で処置すべき細胞に関連す
る抗原を認識する抗体を使用することによって行われ、
この抗体により、細胞毒性薬物が細胞にまで運搬される
。
本発明はさらに、該コンジュゲートを合成するのに使用
される中間体をも提供するものである。
される中間体をも提供するものである。
[従来技術と本発明が解決しようとする課題]癌患者の
化学療法治療は、医学実務として十分に確立されている
。しかし、使用される薬物は、細胞毒性であり、患者に
とって重大な副作用を示すので、最大の配慮を払って投
与されるべきものである。メトトレキセート属の薬物は
有効であり、使用されることが多い薬物であるが、著し
く有害である。本発明は、特別の細胞指向性抗体を使用
して薬物をその薬物によって死滅させるべき細胞に向か
わせることによって、患者の危険性を減少させるもので
ある。薬物は特定の細胞に指向せしめられるので、患者
の体内を循環する薬物は減少し、従って、副作用および
毒性全般が減じられる。
化学療法治療は、医学実務として十分に確立されている
。しかし、使用される薬物は、細胞毒性であり、患者に
とって重大な副作用を示すので、最大の配慮を払って投
与されるべきものである。メトトレキセート属の薬物は
有効であり、使用されることが多い薬物であるが、著し
く有害である。本発明は、特別の細胞指向性抗体を使用
して薬物をその薬物によって死滅させるべき細胞に向か
わせることによって、患者の危険性を減少させるもので
ある。薬物は特定の細胞に指向せしめられるので、患者
の体内を循環する薬物は減少し、従って、副作用および
毒性全般が減じられる。
[課題解決のための手段]
本発明は、式(■):
Ab[CO−X=N−HN−Mコm (1
)[式中、mは1から約10までの整数であり、Abは
、望ましくない細胞に関連する抗原を認識する生理学的
に許容され得る抗体、または抗原を認識するそのフラグ
メントであり、 Xは、以下の式: %式%([) で示されるリンカ−であり、 Rは、水素、フェニル、または1つもしくは2つのニト
ロ基、ハロゲン基、シアノ基もしくはトリフルオロメチ
ル基で置換されているフェニルであり、 ■ 1’(+は、水素、アミノ、アミ/−C,−C,アルキ
ル、ヒドロキシ−C,−C4アルキル、またはグアニジ
/−C,−C,アルキルであり、nは、0から5までの
整数であり、 Mは、式(■): (V) R’l2、Co、So−、Co (CHR)s、また
はCo−NHであり、 R5は、水素、またはC,−C,アルキルであり、Sは
、■または2であり、 COR” SOx (CH−)s CHNH (■)または COR’ Co−(CHR)u−CH−NHCIK)であり、上記
式中、tは、■がら6までの整数、Uは1から22まで
の整数、 R8は、水素、または生理学的に許容され得る塩を完成
させる部分) で示されるメトトレキセート薬物であるコで示される細
胞毒性薬物コンジュゲートを提供するものである。
)[式中、mは1から約10までの整数であり、Abは
、望ましくない細胞に関連する抗原を認識する生理学的
に許容され得る抗体、または抗原を認識するそのフラグ
メントであり、 Xは、以下の式: %式%([) で示されるリンカ−であり、 Rは、水素、フェニル、または1つもしくは2つのニト
ロ基、ハロゲン基、シアノ基もしくはトリフルオロメチ
ル基で置換されているフェニルであり、 ■ 1’(+は、水素、アミノ、アミ/−C,−C,アルキ
ル、ヒドロキシ−C,−C4アルキル、またはグアニジ
/−C,−C,アルキルであり、nは、0から5までの
整数であり、 Mは、式(■): (V) R’l2、Co、So−、Co (CHR)s、また
はCo−NHであり、 R5は、水素、またはC,−C,アルキルであり、Sは
、■または2であり、 COR” SOx (CH−)s CHNH (■)または COR’ Co−(CHR)u−CH−NHCIK)であり、上記
式中、tは、■がら6までの整数、Uは1から22まで
の整数、 R8は、水素、または生理学的に許容され得る塩を完成
させる部分) で示されるメトトレキセート薬物であるコで示される細
胞毒性薬物コンジュゲートを提供するものである。
さらに、本発明は、式:
%式%]
[式中、R8はO、(OCH,)、、または(OCH,
CH3)!であり、AbSXおよびmは、前記の定義と
同意義であるコ で示される一連の誘導化抗体をも提供するものである。
CH3)!であり、AbSXおよびmは、前記の定義と
同意義であるコ で示される一連の誘導化抗体をも提供するものである。
また、本発明は、望ましくない細胞の増殖を制御する方
法であって、本発明のコンジュゲートを患者に非経口的
に投与することを特徴とする方法、および本発明のコン
ジュゲートを非経口投与用媒質中に分散させてなる医薬
製剤をも提供するものである。
法であって、本発明のコンジュゲートを患者に非経口的
に投与することを特徴とする方法、および本発明のコン
ジュゲートを非経口投与用媒質中に分散させてなる医薬
製剤をも提供するものである。
さらに、本発明は、上記の誘導化抗体を式:%式%
で示される薬物ヒドラジドと反応させることを特徴とす
る、式(1)で示されるコンジュゲートの製造方法をも
提供するものである。
る、式(1)で示されるコンジュゲートの製造方法をも
提供するものである。
本発明の薬物コンジュゲートは、抗体、リンカ−1およ
びヒドラジド形態のメトトレキセート薬物から構成され
る。本発明のコンジュゲートの望ましい治療活性は、主
として、抗体のおかげで標的細胞付近に薬物が到達した
後に抗体からメトトレキセート薬物が放出されるよう設
計されたリンカ−から得られる。以下に、本発明コンジ
ュゲートの前記3つの主成分について個々に説明し、次
に本コンジュゲートの合成について説明し、最後に、本
コンジュゲートの合成例およびその生物学的試験を示す
。
びヒドラジド形態のメトトレキセート薬物から構成され
る。本発明のコンジュゲートの望ましい治療活性は、主
として、抗体のおかげで標的細胞付近に薬物が到達した
後に抗体からメトトレキセート薬物が放出されるよう設
計されたリンカ−から得られる。以下に、本発明コンジ
ュゲートの前記3つの主成分について個々に説明し、次
に本コンジュゲートの合成について説明し、最後に、本
コンジュゲートの合成例およびその生物学的試験を示す
。
広径
本発明コンジュゲートの抗体部分における必須の特性は
、望ましくない細胞に関連する抗原を認識できることで
ある。メトトレキセート薬物は多種多様の細胞に対して
細胞毒性が高く、また標的細胞内に内在化(inter
nalized) した場合にその十分な活性を示すこ
とが理解されている。したがって、抗体の選択に当たっ
ては、メトトレキセート薬物によって死滅するかまたは
そうでなくても制御される細胞を認識し、これと結合し
、かつ内在化される能力の点に関して選択するのが好ま
しい。
、望ましくない細胞に関連する抗原を認識できることで
ある。メトトレキセート薬物は多種多様の細胞に対して
細胞毒性が高く、また標的細胞内に内在化(inter
nalized) した場合にその十分な活性を示すこ
とが理解されている。したがって、抗体の選択に当たっ
ては、メトトレキセート薬物によって死滅するかまたは
そうでなくても制御される細胞を認識し、これと結合し
、かつ内在化される能力の点に関して選択するのが好ま
しい。
抗体の供給源は、本発明にとって重要ではない。
それは、rgG、IgAS IgM、IgEおよびrg
Dなどの免疫グロブリンのあらゆるクラスまたはサブク
ラスから選択することができる。同様に、メトトレキセ
ート薬物の作用が有用である細胞を抗体が標的とする限
り、起源の種は限定されない。
Dなどの免疫グロブリンのあらゆるクラスまたはサブク
ラスから選択することができる。同様に、メトトレキセ
ート薬物の作用が有用である細胞を抗体が標的とする限
り、起源の種は限定されない。
現在、当分野では、薬物コンジュゲートとしてモノクロ
ーナル抗体が最もよく使用されており、本発明において
もこれを用いるのが好ましい。しかし、ポリクローナル
抗体が排除されるわけではない。比較的新しい型の抗体
はキメラ抗体であるが、これは、所望の抗体の抗原結合
領域をコードし、かつ他の所望のアミノ酸配列をもコー
ドしている修飾DNAを発現せしめる組換え技術によっ
て実験室内で調製される。すなわち、ある種由来のある
部分と別の種由来の他の部分からなるキメラ抗体を得る
ことができ、これを本発明に用いることができる。
ーナル抗体が最もよく使用されており、本発明において
もこれを用いるのが好ましい。しかし、ポリクローナル
抗体が排除されるわけではない。比較的新しい型の抗体
はキメラ抗体であるが、これは、所望の抗体の抗原結合
領域をコードし、かつ他の所望のアミノ酸配列をもコー
ドしている修飾DNAを発現せしめる組換え技術によっ
て実験室内で調製される。すなわち、ある種由来のある
部分と別の種由来の他の部分からなるキメラ抗体を得る
ことができ、これを本発明に用いることができる。
処置すべき細胞を標的とし、かつ患者にとってそれ自身
毒性でない限り、抗体の起源と性質は重要でない。当業
者であれば、候補の抗体を用いたコンジュゲートの調製
は容易であり、またそれらを評価することができる。便
宜のため、抗体およびコンジュゲートを評価する方法を
若干説明する。
毒性でない限り、抗体の起源と性質は重要でない。当業
者であれば、候補の抗体を用いたコンジュゲートの調製
は容易であり、またそれらを評価することができる。便
宜のため、抗体およびコンジュゲートを評価する方法を
若干説明する。
まず、抗体は、相当量の抗体を調製するのに充分な安定
性を有するハイブリドーマから生産するべきである。抗
体自体は、精製が容易なものであるべきであり、特に、
相当な濃度で化学的操作をするのに充分な水溶性を有し
ているべきである。
性を有するハイブリドーマから生産するべきである。抗
体自体は、精製が容易なものであるべきであり、特に、
相当な濃度で化学的操作をするのに充分な水溶性を有し
ているべきである。
初めに、候補の抗体を用いて調製したコンジュゲートを
抗原結合能について評価する。遊離抗体の結合能からは
若干減少することが予想されるが、これは許容される。
抗原結合能について評価する。遊離抗体の結合能からは
若干減少することが予想されるが、これは許容される。
次いで、このコンジュゲートを試験し、抗原ポジティブ
な(陽性の)細胞に対するそのインビトロ細胞毒性を測
定する。有効なコンジュゲートは、同じ検定において、
遊離薬物よりも若干低い細胞毒性を有するかもしれない
。次いで、この最初の2つの試験によって認められたコ
ンジユゲートを、ジョンソン等[Johnson an
d Laguzza、 Cancer Res、 47
.3118−22 (1987)]が教示しているヌー
ドマウスヒト腫瘍異種移植モデルにおいて評価する。候
補のコンジュゲートは、遊離薬物、遊離薬物と遊離抗体
との混合物、および非−標的性免疫グロブリンとのコン
ジュゲートに対し、ヌードマウスにて試験されるべきで
あり、これらのすべてよりも改善された活性または安全
性を示すべきである。投与量範囲の試験は、この異種移
植モデルにおいて行なうべきである。
な(陽性の)細胞に対するそのインビトロ細胞毒性を測
定する。有効なコンジュゲートは、同じ検定において、
遊離薬物よりも若干低い細胞毒性を有するかもしれない
。次いで、この最初の2つの試験によって認められたコ
ンジユゲートを、ジョンソン等[Johnson an
d Laguzza、 Cancer Res、 47
.3118−22 (1987)]が教示しているヌー
ドマウスヒト腫瘍異種移植モデルにおいて評価する。候
補のコンジュゲートは、遊離薬物、遊離薬物と遊離抗体
との混合物、および非−標的性免疫グロブリンとのコン
ジュゲートに対し、ヌードマウスにて試験されるべきで
あり、これらのすべてよりも改善された活性または安全
性を示すべきである。投与量範囲の試験は、この異種移
植モデルにおいて行なうべきである。
異種移植モデルにおいて効果があったコンジュゲートを
、ヒトで観察されるパターンと同様のパターンで目的の
抗原を発現することが知られている動物によって試験す
る。このような試験においてコンジュゲートが抗原に対
して有意な結合度を生じ、かつ異種移植モデルから予想
される治療的用量において毒性がそれほどでない場合に
は、その候補のコンジュゲートは治療上の可能性を有す
ると考えることができる。
、ヒトで観察されるパターンと同様のパターンで目的の
抗原を発現することが知られている動物によって試験す
る。このような試験においてコンジュゲートが抗原に対
して有意な結合度を生じ、かつ異種移植モデルから予想
される治療的用量において毒性がそれほどでない場合に
は、その候補のコンジュゲートは治療上の可能性を有す
ると考えることができる。
現在知られている多数の抗体が本発明に使用することが
できる。好ましい特異的な抗体は、L/IC2であり、
この抗体はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン[ロックビル、メリーランド]にHB9682とし
て寄託されているノ\イブリドーマから産生される。
できる。好ましい特異的な抗体は、L/IC2であり、
この抗体はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン[ロックビル、メリーランド]にHB9682とし
て寄託されているノ\イブリドーマから産生される。
ATCCハイブリドーマであるHB21から産生される
抗体5E9C11は、多数の腫瘍から発現されるトラン
スフェリンレセプターを認識する。
抗体5E9C11は、多数の腫瘍から発現されるトラン
スフェリンレセプターを認識する。
ナショナル・キャンサー・インステイチュート(Nat
ional Cancer In5titute)から
入手可能な、B72.3と称される抗体は、乳癌および
結腸癌の両者から発現される抗原を認識する。
ional Cancer In5titute)から
入手可能な、B72.3と称される抗体は、乳癌および
結腸癌の両者から発現される抗原を認識する。
非腫瘍抗原に対して反応性を有する2つの重要な抗体は
0KT3と0KT4であり、それぞれ末梢T−細胞とヒ
トT−ヘルパー細胞に結合する。
0KT3と0KT4であり、それぞれ末梢T−細胞とヒ
トT−ヘルパー細胞に結合する。
これらは、それぞれCRL8001およびCR,La2
O2としてATCCに寄託されているハイブリドーマか
ら産生される。
O2としてATCCに寄託されているハイブリドーマか
ら産生される。
様々な治療目的に有用な抗体の供給源を以下のとおり追
加する。免疫変調(iImIoune l1lodul
ation)および腫瘍治療に有用な抗−ヒトリンパ球
および単核細胞抗体は、ATCC培養物HB2、HB2
2、HB44、HB78およびHB136から産生され
る。腫瘍治療に有用な抗−トランスフェリンレセプター
抗体は、ATCC培養物HB84から産生される。AT
CC培養物HB 8059は、結腸直腸癌モノシアロガ
ングリオシドに対する抗体を産生じ、培養物HB813
6は、免疫変調およびT−細胞白血病の治療に有用な、
成熟ヒI−T−細胞表面抗原に対する抗体を産生ずる。
加する。免疫変調(iImIoune l1lodul
ation)および腫瘍治療に有用な抗−ヒトリンパ球
および単核細胞抗体は、ATCC培養物HB2、HB2
2、HB44、HB78およびHB136から産生され
る。腫瘍治療に有用な抗−トランスフェリンレセプター
抗体は、ATCC培養物HB84から産生される。AT
CC培養物HB 8059は、結腸直腸癌モノシアロガ
ングリオシドに対する抗体を産生じ、培養物HB813
6は、免疫変調およびT−細胞白血病の治療に有用な、
成熟ヒI−T−細胞表面抗原に対する抗体を産生ずる。
当業者なら、さらに別の候補抗体の入手先を容易に調べ
ることができる。容易に入手可能な抗体についての特に
有用な情報源は、リンスコッツ・ディレクトリ−・オブ
・イムノロジカル・アンド・バイオロジカル・リージェ
ンツ(Linscott’ s Directory
or Imiunological and Biol
ogocal Reagents) [リンスコッツ・
ディレクトリ−(94941カリフオルニア、ミル・バ
リー、グレンφドライブ40番)から発行]である。1
984年版には、60種以上の腫瘍関連モノクローナル
抗体が挙げられており、それぞれの市販光が少なくとも
1つ挙げられている。
ることができる。容易に入手可能な抗体についての特に
有用な情報源は、リンスコッツ・ディレクトリ−・オブ
・イムノロジカル・アンド・バイオロジカル・リージェ
ンツ(Linscott’ s Directory
or Imiunological and Biol
ogocal Reagents) [リンスコッツ・
ディレクトリ−(94941カリフオルニア、ミル・バ
リー、グレンφドライブ40番)から発行]である。1
984年版には、60種以上の腫瘍関連モノクローナル
抗体が挙げられており、それぞれの市販光が少なくとも
1つ挙げられている。
種々の望ましくない細胞が本発明のコンジュゲートによ
って処置できることは理解されるであろう。メトトレキ
セート(methotrexate)薬物は、様々なタ
イプの癌細胞に対して効果的であることがよく知られて
おり、したがって癌細胞は、本発明のコンジュゲートに
よって標的とされるべき好ましい細胞の1つであると考
えられる。
って処置できることは理解されるであろう。メトトレキ
セート(methotrexate)薬物は、様々なタ
イプの癌細胞に対して効果的であることがよく知られて
おり、したがって癌細胞は、本発明のコンジュゲートに
よって標的とされるべき好ましい細胞の1つであると考
えられる。
具体的には、悪性腫瘍を持続成長させる細胞、および抗
−腫瘍免疫の進行を制御する免疫系の細胞がさらに考え
られる。標的とされるべき特異的なタイプの癌関連細胞
としては、扁平上皮癌細胞、腺癌細胞、小細胞癌細胞、
神経膠腫細胞、黒色腫細胞、腎細胞癌細胞、移行性細胞
癌細胞、肉腫細胞、腫瘍脈管系を支持する細胞、ならび
に白血病およびリンパ腫などのリンパ球腫瘍の細胞が挙
げられる。
−腫瘍免疫の進行を制御する免疫系の細胞がさらに考え
られる。標的とされるべき特異的なタイプの癌関連細胞
としては、扁平上皮癌細胞、腺癌細胞、小細胞癌細胞、
神経膠腫細胞、黒色腫細胞、腎細胞癌細胞、移行性細胞
癌細胞、肉腫細胞、腫瘍脈管系を支持する細胞、ならび
に白血病およびリンパ腫などのリンパ球腫瘍の細胞が挙
げられる。
しかし、メトトレキセード薬物は、多くの別のタイプの
細胞に対しても細胞毒性を示す。したがって、抗体を適
切に選択して本発明のコンジュゲートを使用すれば、例
えばウィルス粒子に感染した細胞、種々の有害物質に感
染したT細胞、および自己免疫疾患の進行を促進するか
もしくは制御する免疫系の細胞などの望ましくない細胞
を殺すかまたは改変することができる。
細胞に対しても細胞毒性を示す。したがって、抗体を適
切に選択して本発明のコンジュゲートを使用すれば、例
えばウィルス粒子に感染した細胞、種々の有害物質に感
染したT細胞、および自己免疫疾患の進行を促進するか
もしくは制御する免疫系の細胞などの望ましくない細胞
を殺すかまたは改変することができる。
抗体のフラグメントを適切に選択しても、それが無傷の
抗体と同一の効果を有することは理解されるであろう。
抗体と同一の効果を有することは理解されるであろう。
したがって、本発明の実施において、処置すべき細胞に
関連する抗原を認識する抗体フラグメント、好ましくは
F(ab5)xフラグメントは無傷の抗体と同様に有用
であり得る。
関連する抗原を認識する抗体フラグメント、好ましくは
F(ab5)xフラグメントは無傷の抗体と同様に有用
であり得る。
リンカ−基が抗体と反応して結合する正確な機序は式(
I)においては示されておらず、完全にはわかっていな
い。この反応は、以下で説明するように、おそらくアシ
ル化であり、抗体分子上の多数の部位がアシル化を受け
る。最も普通には、抗体のアシル化は、リジン部分の遊
離アミノ基上で進行するものと考えられる。しかし、こ
のアシル化は、ヒドロキシ基、フェノール基、イミダゾ
ール環およびおそらくは他の部分をも攻撃するであろう
。
I)においては示されておらず、完全にはわかっていな
い。この反応は、以下で説明するように、おそらくアシ
ル化であり、抗体分子上の多数の部位がアシル化を受け
る。最も普通には、抗体のアシル化は、リジン部分の遊
離アミノ基上で進行するものと考えられる。しかし、こ
のアシル化は、ヒドロキシ基、フェノール基、イミダゾ
ール環およびおそらくは他の部分をも攻撃するであろう
。
式(1)は、lから約10個のリンカー−薬物部分を抗
体各分子に結合させることを示している。
体各分子に結合させることを示している。
当然ながら、コンジュゲートのある一群は、抗体に対す
る薬物−リンカ−の割合に範囲を有した分子を本質的に
含有するものであり、したがって抗体分子1個当たりの
上記の部分の数は、平均の数である。多(の薬物分子を
各抗体分子に結合させれば、高価である抗体を最も有効
に使用することができることは容易に知れる。しかしな
がら、薬物−リンカ一部分における非常に多くの分子の
結合は、しばしば抗体の抗原認識能および結合能に悪影
響を及ぼすものであり、したがってmに関して妥当な値
を見いださなければならない。一般には、mの好ましい
値は、約4から約10であり、他の好ましい値は約3か
ら約8である。
る薬物−リンカ−の割合に範囲を有した分子を本質的に
含有するものであり、したがって抗体分子1個当たりの
上記の部分の数は、平均の数である。多(の薬物分子を
各抗体分子に結合させれば、高価である抗体を最も有効
に使用することができることは容易に知れる。しかしな
がら、薬物−リンカ一部分における非常に多くの分子の
結合は、しばしば抗体の抗原認識能および結合能に悪影
響を及ぼすものであり、したがってmに関して妥当な値
を見いださなければならない。一般には、mの好ましい
値は、約4から約10であり、他の好ましい値は約3か
ら約8である。
4」二重に虹竺二五薬惣
本発明のコンジュゲートに使用される細胞毒性薬物はメ
トトレキセート、アミノプテリン、または式(VI)で
示されるそれらの誘導体であるが、本明細書では、それ
らの化合物は集合的にメトトレキセート薬物と呼ぶ。メ
トトレキセート薬物は、ヒドラジド形態で使用される。
トトレキセート、アミノプテリン、または式(VI)で
示されるそれらの誘導体であるが、本明細書では、それ
らの化合物は集合的にメトトレキセート薬物と呼ぶ。メ
トトレキセート薬物は、ヒドラジド形態で使用される。
それら薬物における各種の不斉中心の立体特異的形態は
示していない。当業者であれば、その薬物の立体化学は
、当該技術分野で明確に説明されているように、その活
性に影響を及ぼすものであることは理解できるであろう
。メトトレキセート薬物の通常の立体化学構造が、本発
明のコンジュゲートに係る中間体の製造時に使用される
のが好ましいが、式(Vr)の化合物には、すべての立
体化学的形態が包含される。
示していない。当業者であれば、その薬物の立体化学は
、当該技術分野で明確に説明されているように、その活
性に影響を及ぼすものであることは理解できるであろう
。メトトレキセート薬物の通常の立体化学構造が、本発
明のコンジュゲートに係る中間体の製造時に使用される
のが好ましいが、式(Vr)の化合物には、すべての立
体化学的形態が包含される。
メトトレキセート薬物ヒドラジドとリンカ−との間の結
合は、アルキリデンヒドラジド結合である。しかし、そ
の結合は、溶液、特に生理学的溶液中では他の形態で存
在し得ることは理解されるであろう。その二重結合を開
裂させ、官能基またはプロトンをその窒素または炭素原
子に結合させることが可能である。その結果、ヒドロキ
シ基または他の酸素連結種が先の二重結合の一方に結合
し、アミノ連結部分が同様に結合し得る。水は、これら
原子の1つと弱く結合し得る。さらに、抗体部分もそれ
ら原子の1つと弱い結合を形成し得、1つよりも多くの
このような反応が起こって混合物が形成される場合があ
る。しかし、このような生成物は、一過性のものである
ので、本明細書では、本発明のコンジュゲートを、一般
的でありかつ安定な形態であるアルキリデンヒドラジド
形態として記載する。
合は、アルキリデンヒドラジド結合である。しかし、そ
の結合は、溶液、特に生理学的溶液中では他の形態で存
在し得ることは理解されるであろう。その二重結合を開
裂させ、官能基またはプロトンをその窒素または炭素原
子に結合させることが可能である。その結果、ヒドロキ
シ基または他の酸素連結種が先の二重結合の一方に結合
し、アミノ連結部分が同様に結合し得る。水は、これら
原子の1つと弱く結合し得る。さらに、抗体部分もそれ
ら原子の1つと弱い結合を形成し得、1つよりも多くの
このような反応が起こって混合物が形成される場合があ
る。しかし、このような生成物は、一過性のものである
ので、本明細書では、本発明のコンジュゲートを、一般
的でありかつ安定な形態であるアルキリデンヒドラジド
形態として記載する。
式(Vl)において、rC,C3アルキル」なる用語に
はメチル、エチル、プロピルおよびイソプロピルが包含
され、好ましくはメチルまたは水素を挙げることができ
る。
はメチル、エチル、プロピルおよびイソプロピルが包含
され、好ましくはメチルまたは水素を挙げることができ
る。
式(■)の薬物内で変動し得る種々の基を個々に説明し
、この中で好ましい定義を述べる。好ましいメトトレキ
セート薬物ヒドラジドが好ましい構成基から形成されて
いることは理解されるであろうし、また適当な文献知識
を有する薬化学者であれば、このような薬物ヒドラジド
を調製できる。
、この中で好ましい定義を述べる。好ましいメトトレキ
セート薬物ヒドラジドが好ましい構成基から形成されて
いることは理解されるであろうし、また適当な文献知識
を有する薬化学者であれば、このような薬物ヒドラジド
を調製できる。
基、R3は、硫黄、酸素、アミンまたはメチレンなどの
架橋基であり、後2つはC,−C,アルキルで任意に置
換されることもある。このような基の代表は、アミノ、
メチレン、メチルアミノ、プロピルアミノ、1.1−プ
ロピレン、および1,1−インブチレンである。好まし
いR3基は、アミノおよびメチルアミノである。
架橋基であり、後2つはC,−C,アルキルで任意に置
換されることもある。このような基の代表は、アミノ、
メチレン、メチルアミノ、プロピルアミノ、1.1−プ
ロピレン、および1,1−インブチレンである。好まし
いR3基は、アミノおよびメチルアミノである。
基:R’は、カルボニル、スルホニル、アセチル、プロ
ピオニル、またはカルボキサミドなどの架橋基である。
ピオニル、またはカルボキサミドなどの架橋基である。
後3つの場合には、カルボニル基が基:2と結合する。
最も好ましいR′基は、カルボニル、およびアセチルで
あるが、プロピオニルも好ましい。
あるが、プロピオニルも好ましい。
基:Zは、R4基と結合するアミ7基をその一端に有し
ており、また他端に、基: =N−HNと結合するカル
ボニル基またはスルホニル基を有している。式(■)で
示されるZ基はグルタミン酸から誘導され、tが1でな
いならば、ポリグルタミン酸残基を構成する。しかし、
式(■)で示される好ましいZ基は、tが1の基である
。
ており、また他端に、基: =N−HNと結合するカル
ボニル基またはスルホニル基を有している。式(■)で
示されるZ基はグルタミン酸から誘導され、tが1でな
いならば、ポリグルタミン酸残基を構成する。しかし、
式(■)で示される好ましいZ基は、tが1の基である
。
式(■)で示される2基は、スルホニルで終止し、した
がって相当するスルホン酸の残基である。式(■)の基
は、1または2個のメチレン基を有し、好ましくは2個
有す。
がって相当するスルホン酸の残基である。式(■)の基
は、1または2個のメチレン基を有し、好ましくは2個
有す。
式(IX)で示されるZ基は、メチレン基を1から22
個有することがある、様々な長さのアミノ酸である。式
(IX)で示される基の好ましいクラスは、メチレン基
lから10個を含有するものであり、より好ましくはメ
チレン基3から8個を有するものである。
個有することがある、様々な長さのアミノ酸である。式
(IX)で示される基の好ましいクラスは、メチレン基
lから10個を含有するものであり、より好ましくはメ
チレン基3から8個を有するものである。
最も好ましい2基は、tが1である式(■)で示される
基、およびUが3から8である式(IX)で示される基
である。
基、およびUが3から8である式(IX)で示される基
である。
式(■)、(■)および([)で示される基では、遊離
形の、または塩形態のカルボキシ基、R11が存在して
いる。それらの塩類は、カルボン酸の生理学的に許容さ
れ得る塩を形成し得るあらゆる部分から形成される。ア
ルカリ金属およびハロゲン化塩が特に適当である。した
がって、本発明を実施するには、ナトリウム、カリウム
、およびリチウム塩、ならびに塩酸、臭化水素、および
フッ化水素塩が特に有用である。しかし、他の薬化学的
に許容され得る塩も有用である。例えば、トリエチルア
ミン、トリエタノールアミン、エチルジメチルアミンな
どが、テトラアルキルアンモニウム塩、(ベンジルまた
はフェニル)トリアルキルアンモニウム塩などの第4級
アンモニウム塩と同様に有用である。アンモニウム塩の
中でも、テトラブチルアンモニウム、ベンジルトリメチ
ルアンモニウム、およびテトラメチルアンモニウムが代
表であり、好ましい塩である。しかし、薬化学者は頻繁
にカルボン酸塩を使用するが、R@が塩形成部分である
それらの塩類は、生理学的に許容され得る塩を形成する
あらゆる塩基から調製することができる。
形の、または塩形態のカルボキシ基、R11が存在して
いる。それらの塩類は、カルボン酸の生理学的に許容さ
れ得る塩を形成し得るあらゆる部分から形成される。ア
ルカリ金属およびハロゲン化塩が特に適当である。した
がって、本発明を実施するには、ナトリウム、カリウム
、およびリチウム塩、ならびに塩酸、臭化水素、および
フッ化水素塩が特に有用である。しかし、他の薬化学的
に許容され得る塩も有用である。例えば、トリエチルア
ミン、トリエタノールアミン、エチルジメチルアミンな
どが、テトラアルキルアンモニウム塩、(ベンジルまた
はフェニル)トリアルキルアンモニウム塩などの第4級
アンモニウム塩と同様に有用である。アンモニウム塩の
中でも、テトラブチルアンモニウム、ベンジルトリメチ
ルアンモニウム、およびテトラメチルアンモニウムが代
表であり、好ましい塩である。しかし、薬化学者は頻繁
にカルボン酸塩を使用するが、R@が塩形成部分である
それらの塩類は、生理学的に許容され得る塩を形成する
あらゆる塩基から調製することができる。
式(Vl)で示される基を誘導するために必須の中間体
は、薬化学の分野に属し、当業者であれば、それらのい
ずれをも入手することができる。メトトレ牛セード薬物
の合成に関する有用な参照文献には、ローマンら(Ra
hman and Chhabra)のMedicin
al RetRev、 8.第1巻、95−155(1
988) rメトトレキセートおよびその類縁体の化学
」がある。
は、薬化学の分野に属し、当業者であれば、それらのい
ずれをも入手することができる。メトトレ牛セード薬物
の合成に関する有用な参照文献には、ローマンら(Ra
hman and Chhabra)のMedicin
al RetRev、 8.第1巻、95−155(1
988) rメトトレキセートおよびその類縁体の化学
」がある。
リンカ−
リンカ−基であるXは、一端がカルボニルに、他端がヒ
ドラジドに結合される有機基である。
ドラジドに結合される有機基である。
式(ff)で示されるリンカ−基は、(CH−)n部分
カ例又はメチレン、エチレン、プロピレン、ベンチレン
などのアルキレン基である。
カ例又はメチレン、エチレン、プロピレン、ベンチレン
などのアルキレン基である。
基;Rは、水素、または1つもしくは2つの電子求引基
で置換されていることもあるフェニルである。したがっ
て、R基には、フェニル、3−ニトロフェニル、2,4
−ジクロロフェニル、3−ブロモ−5−フルオロフェニ
ル、4−シアノフェニル、3−トリフルオロメチルフェ
ニル、2−クロロ−4−トリフルオロメチルフェニル、
3−ニトロ−4−トリフルオロメチルフェニルなどがあ
り得る。本明細書中で使用しているハロゲンなる用語は
、クロロ、ブロモおよびフルオロを意味する。水素は好
ましいR基であり、非置換フェニルはその他の好ましい
R基であり、3番目に好ましいR基はモノ置換フェニル
である。
で置換されていることもあるフェニルである。したがっ
て、R基には、フェニル、3−ニトロフェニル、2,4
−ジクロロフェニル、3−ブロモ−5−フルオロフェニ
ル、4−シアノフェニル、3−トリフルオロメチルフェ
ニル、2−クロロ−4−トリフルオロメチルフェニル、
3−ニトロ−4−トリフルオロメチルフェニルなどがあ
り得る。本明細書中で使用しているハロゲンなる用語は
、クロロ、ブロモおよびフルオロを意味する。水素は好
ましいR基であり、非置換フェニルはその他の好ましい
R基であり、3番目に好ましいR基はモノ置換フェニル
である。
式(III)で示される基は、架橋性アリール基:Ar
がフェニル、またはピロリルであるアルキルアリール部
分である。フェニルAr基は、メタまたはパラ位で連結
され、パラ位が好ましい。式(III)で示される基の
(CHJn部分は、式(旧の対応する基と同一である。
がフェニル、またはピロリルであるアルキルアリール部
分である。フェニルAr基は、メタまたはパラ位で連結
され、パラ位が好ましい。式(III)で示される基の
(CHJn部分は、式(旧の対応する基と同一である。
すなわち、nがOの場合には、その基は単結合以上のも
のではないが、この基は既述のアルキレン基となり得る
。nが0であるのが好ましく、さらにnが2−4である
ものも好ましい。
のではないが、この基は既述のアルキレン基となり得る
。nが0であるのが好ましく、さらにnが2−4である
ものも好ましい。
式(■)で示される基は、1つまたは2つのアルキレン
架橋を含むこともあるアミド結合リンカ−である。式(
IV)の基におけるアルキレン基;(CHt)nは、式
(II)の基において既述したものと同一である。式(
IV)の基の設計に当たって、2つの任意のアルキレン
架橋は独立して考えることができる。即ち、nが両者と
もにOである場合、または一方がOであり、他方が1か
ら5までの整数である場合、または両者ともに1から5
までの整数である場合である。好ましくは、両者ともに
nが1から4までの基: (CHt)nのアルキレン基
であり、より好ましくはnが2または3のアルキレン基
である。
架橋を含むこともあるアミド結合リンカ−である。式(
IV)の基におけるアルキレン基;(CHt)nは、式
(II)の基において既述したものと同一である。式(
IV)の基の設計に当たって、2つの任意のアルキレン
架橋は独立して考えることができる。即ち、nが両者と
もにOである場合、または一方がOであり、他方が1か
ら5までの整数である場合、または両者ともに1から5
までの整数である場合である。好ましくは、両者ともに
nが1から4までの基: (CHt)nのアルキレン基
であり、より好ましくはnが2または3のアルキレン基
である。
式(V)で示される基は、比較的複雑なアミド連結基で
あり、アミノ酸部分を含んでいることが多い。その(C
Ht)n基は、既述の式(It)の場合と同じである。
あり、アミノ酸部分を含んでいることが多い。その(C
Ht)n基は、既述の式(It)の場合と同じである。
そのペンダント基は、アミノ、ヒドロキシまたはグアニ
ジ/ [NH−C(=NH)−NH,]で置換されたC
、−C,アルキル基であり得る。したがって、それには
、例えばアミノメチル、2−アミノエチル、4−アミノ
ブチル、2−ヒドロキシメチル、3−ヒドロ牛ジプロピ
ル、4−ヒドロキシブチル、グアニジノメチル、2−グ
アニジ/エチル、および4−グアニジノブチルなどの基
が挙げられる。Riはさらに、水素またはアミンであっ
てもよい。好ましいR1基は、アミノ、ヒドロキシメチ
ル、アミノアルキル、特に4−アミノブチル、およびグ
アニジ/アルキル、特に4グアニジノブチルである。
ジ/ [NH−C(=NH)−NH,]で置換されたC
、−C,アルキル基であり得る。したがって、それには
、例えばアミノメチル、2−アミノエチル、4−アミノ
ブチル、2−ヒドロキシメチル、3−ヒドロ牛ジプロピ
ル、4−ヒドロキシブチル、グアニジノメチル、2−グ
アニジ/エチル、および4−グアニジノブチルなどの基
が挙げられる。Riはさらに、水素またはアミンであっ
てもよい。好ましいR1基は、アミノ、ヒドロキシメチ
ル、アミノアルキル、特に4−アミノブチル、およびグ
アニジ/アルキル、特に4グアニジノブチルである。
基:R″は、nがOの場合は単結合であるか、または1
から5個の炭素原子のアルキレン基、フェニルまたはピ
ロリルであり得る。フェニルR1基はメタまたはパラ位
で連結されている。基:(CI(z)nは既述の式(I
I)の基の場合の対応するアルキレン基と同じであり、
同じ価を有する場合がある。
から5個の炭素原子のアルキレン基、フェニルまたはピ
ロリルであり得る。フェニルR1基はメタまたはパラ位
で連結されている。基:(CI(z)nは既述の式(I
I)の基の場合の対応するアルキレン基と同じであり、
同じ価を有する場合がある。
式(II)、(I[I)、(■)および(V)で示され
る最も好ましいリンカ−基は、4−ベンジリデン、4−
メチルベンジリデン、および2−エチルアミ/カルボニ
ル−4−ベンジリデンである。
る最も好ましいリンカ−基は、4−ベンジリデン、4−
メチルベンジリデン、および2−エチルアミ/カルボニ
ル−4−ベンジリデンである。
誘導化抗体
誘導化抗体は、リンカ−中間体との反応によって改変さ
れた抗体から構成される、コンジュゲートを合成するた
めの中間体である。そのリンカ−基は、メトトレキセー
ト薬物ヒドラジドと最終工程で反応するカルボニルまた
はそのジ(メチルまたはエチル)アセタールを末端に有
している。したがって、このリンカ−のX基は、誘導化
抗体中、−〇または(OCH3)、または(OCHt
CHs ) tを末端に有する。カルボニル形態が好ま
しいが、アセタールは満足のいく反応剤であるので、そ
れを使用するのが好都合用ある場合には、それを使用す
るとよい。
れた抗体から構成される、コンジュゲートを合成するた
めの中間体である。そのリンカ−基は、メトトレキセー
ト薬物ヒドラジドと最終工程で反応するカルボニルまた
はそのジ(メチルまたはエチル)アセタールを末端に有
している。したがって、このリンカ−のX基は、誘導化
抗体中、−〇または(OCH3)、または(OCHt
CHs ) tを末端に有する。カルボニル形態が好ま
しいが、アセタールは満足のいく反応剤であるので、そ
れを使用するのが好都合用ある場合には、それを使用す
るとよい。
変動因子、Xおよびmが、既に説明した誘導化抗体にお
いて同じ価値を有している。好ましい誘導化抗体は、好
ましいX基から形成された、好ましい数mのリンカ−基
と結合している好ましい抗体から構成されているという
点で、好ましいコンジュゲートに相当するものである。
いて同じ価値を有している。好ましい誘導化抗体は、好
ましいX基から形成された、好ましい数mのリンカ−基
と結合している好ましい抗体から構成されているという
点で、好ましいコンジュゲートに相当するものである。
合成
本発明のコンジュゲートは、一般に当業界で現在使用さ
れている方法と同様の方法によって調製される。好まし
くは、最初にリンカ−を抗体と反応させ、次いで最終工
程としてそのリンカ−をメトトレキセート薬物のヒドラ
ジドと反応させる。
れている方法と同様の方法によって調製される。好まし
くは、最初にリンカ−を抗体と反応させ、次いで最終工
程としてそのリンカ−をメトトレキセート薬物のヒドラ
ジドと反応させる。
この合成方法の利点は、メトトレキセート薬物の立体化
学的な形態が最も容易に保存される点てあしたがって、
本合成の最初の工程(群)は、一端を抗体と、さらに他
端をメトトレキセート薬物と反応させるべき適当な形態
のリンカ−を調製することである。次いで、得られたリ
ンカ−を抗体に結合させて誘導化抗体を調製し、最後に
、メトトレキセート薬物をそのリンカ−のカルボニルま
たはアセタール末端に結合する。抗体が反応混合物中に
存在している限りは、本方法は、抗体の損傷を防ぐのに
適当な温和な条件下で実施しなければならないことは理
解されるであろう。
学的な形態が最も容易に保存される点てあしたがって、
本合成の最初の工程(群)は、一端を抗体と、さらに他
端をメトトレキセート薬物と反応させるべき適当な形態
のリンカ−を調製することである。次いで、得られたリ
ンカ−を抗体に結合させて誘導化抗体を調製し、最後に
、メトトレキセート薬物をそのリンカ−のカルボニルま
たはアセタール末端に結合する。抗体が反応混合物中に
存在している限りは、本方法は、抗体の損傷を防ぐのに
適当な温和な条件下で実施しなければならないことは理
解されるであろう。
本合成は、以下の反応式で表すことができる:Ab +
m[R7−Co−X=R”] ]置Ab[CO−X=
R@l+Ab[CO−X4”]]置 + m[HtN
HN−M] → Ab[CC0−X4−IN−コ謂[
式中、R?はカルボン酸活性基であり、Ab、X。
m[R7−Co−X=R”] ]置Ab[CO−X=
R@l+Ab[CO−X4”]]置 + m[HtN
HN−M] → Ab[CC0−X4−IN−コ謂[
式中、R?はカルボン酸活性基であり、Ab、X。
R1およびmは既述の定義と同意義であるコ。
この式中、基R7は、アシル化剤として使用すルタメに
カルボン酸を活性化するのに通常使用されている周知の
基の中から選択される。例えば、スクシンイミドオキシ
、フタルイミドオキシ、メタンスルホニルオキシ、トル
エンスルホニルオキシ、ベンゼンスルホニルオキシ、ベ
ンゾトリアゾリルオキシ、クロロ、ブロモ、アジド、な
どが、通常上記の活性基として使用される。好ましい活
性基は、スクシンイミドオキシ、フタルイミドオキシ、
およびベンゾトリアゾリルオキシである。
カルボン酸を活性化するのに通常使用されている周知の
基の中から選択される。例えば、スクシンイミドオキシ
、フタルイミドオキシ、メタンスルホニルオキシ、トル
エンスルホニルオキシ、ベンゼンスルホニルオキシ、ベ
ンゾトリアゾリルオキシ、クロロ、ブロモ、アジド、な
どが、通常上記の活性基として使用される。好ましい活
性基は、スクシンイミドオキシ、フタルイミドオキシ、
およびベンゾトリアゾリルオキシである。
この反応を行っている間は、ペンダントR′置換分の一
部である遊離アミ7基を、簡便かつ容易に除去できる保
護基でブロックする。このような基は、Green、
Protective Groups in Orga
nic 5ynthesis、 John 1lile
y & 5ons+ニユーヨーク、 1981に包括的
に論じられている。ここで使用される基は、抗体への損
傷を回避できる程に温和な条件下で取り外しができなけ
ればならない。そのような保護基は化学者には周知であ
るが、特に有用な保護基を例示すれば、アセト酢酸エチ
ル、シトラコン酸エチル、およびジメチルマレイン酸エ
チルがある。
部である遊離アミ7基を、簡便かつ容易に除去できる保
護基でブロックする。このような基は、Green、
Protective Groups in Orga
nic 5ynthesis、 John 1lile
y & 5ons+ニユーヨーク、 1981に包括的
に論じられている。ここで使用される基は、抗体への損
傷を回避できる程に温和な条件下で取り外しができなけ
ればならない。そのような保護基は化学者には周知であ
るが、特に有用な保護基を例示すれば、アセト酢酸エチ
ル、シトラコン酸エチル、およびジメチルマレイン酸エ
チルがある。
リンカ−中間体、R’−Co−X=R”は比較的単純な
化合物であり、これは購入することができ、または常法
によって容易に製造することができる。カルボキサミド
連結(リンケージ)を有するこれらのリンカ−中間体は
、リンカ−中間体の一端を形成するところの第1級アミ
ンを、その中間体の他端を形成するところの活性化カル
ボン酸と反応させることによって最も簡便に製造される
。
化合物であり、これは購入することができ、または常法
によって容易に製造することができる。カルボキサミド
連結(リンケージ)を有するこれらのリンカ−中間体は
、リンカ−中間体の一端を形成するところの第1級アミ
ンを、その中間体の他端を形成するところの活性化カル
ボン酸と反応させることによって最も簡便に製造される
。
このような反応は、温和な水性塩基中において、環境温
度またはそれよりも若干温度を上げて行うことができ、
数時間のうちに良好な収量で反応が進行する。
度またはそれよりも若干温度を上げて行うことができ、
数時間のうちに良好な収量で反応が進行する。
本発明のコンジュゲートの合成に係る各種の工程を行う
ことで、本方法を行う装置の処理能力を、または収率を
最大にすることができる。すべての場合ではないが、大
刀は抗体自体が反応中で最も高価なものであり、したが
って方法の最善化には、抗体に基づいて収量を最大にす
ることが要求される。したがって、実際の最善の実施条
件は、個々の使用抗体の最大の安定性条件に依存するこ
とになる。このように、最善の実施条件には、抗体を最
大に利用し、抗体を反応混合物に暴露する時間を最小に
するために、メトトレキセート薬物を大過剰に使用する
ことが必要であろう。
ことで、本方法を行う装置の処理能力を、または収率を
最大にすることができる。すべての場合ではないが、大
刀は抗体自体が反応中で最も高価なものであり、したが
って方法の最善化には、抗体に基づいて収量を最大にす
ることが要求される。したがって、実際の最善の実施条
件は、個々の使用抗体の最大の安定性条件に依存するこ
とになる。このように、最善の実施条件には、抗体を最
大に利用し、抗体を反応混合物に暴露する時間を最小に
するために、メトトレキセート薬物を大過剰に使用する
ことが必要であろう。
カルボン酸活性基は、リンカ−中間体のカルボン酸上に
、例えばジシクロへキシルカルボジイミドまたは他のエ
ステル化試剤を使用することによって容易に設置される
。このような反応は、不活性有機溶媒、例えばジオキサ
ン、テトラヒドロフラン、塩素化炭化水素などの溶媒中
で行われ、約0−50℃の範囲の緩和な温度で実施する
ことができる。リンカ−中間体の製造は、以下の製造例
でさらに説明する。
、例えばジシクロへキシルカルボジイミドまたは他のエ
ステル化試剤を使用することによって容易に設置される
。このような反応は、不活性有機溶媒、例えばジオキサ
ン、テトラヒドロフラン、塩素化炭化水素などの溶媒中
で行われ、約0−50℃の範囲の緩和な温度で実施する
ことができる。リンカ−中間体の製造は、以下の製造例
でさらに説明する。
リンカ−中間体を抗体と反応させるための条件の選択に
当たって第1の注意事項は、抗体の安定性の維持である
。その反応は、抗体を傷付けない組成の水性媒質中で実
施しなければならない。具体的には、適当な水性媒質は
、ホウ酸イオンの濃度が約0.1−0.5モル濃度のホ
ウ酸緩衝液である。本反応を実施できる他の適当な水性
媒質は、生理緩衝化食塩水である。その反応媒質のpH
域は約7−9の若干塩基性であるべきである。その反応
媒質を水性にする一方で、少量の有機溶媒を存在させて
も悪くなく、都合の良い場合もある。
当たって第1の注意事項は、抗体の安定性の維持である
。その反応は、抗体を傷付けない組成の水性媒質中で実
施しなければならない。具体的には、適当な水性媒質は
、ホウ酸イオンの濃度が約0.1−0.5モル濃度のホ
ウ酸緩衝液である。本反応を実施できる他の適当な水性
媒質は、生理緩衝化食塩水である。その反応媒質のpH
域は約7−9の若干塩基性であるべきである。その反応
媒質を水性にする一方で、少量の有機溶媒を存在させて
も悪くなく、都合の良い場合もある。
例えば、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、テト
ラヒドロフラン、ジオキサン、またはグリコールエーテ
ルなどの有機溶媒の少量にリンカ−中間体を溶解し、そ
の有機溶媒溶液を抗体の水性媒雪中溶液に加える。
ラヒドロフラン、ジオキサン、またはグリコールエーテ
ルなどの有機溶媒の少量にリンカ−中間体を溶解し、そ
の有機溶媒溶液を抗体の水性媒雪中溶液に加える。
一般に、その反応は、抗体の溶解性が概して高くないの
で、比較的低濃度で行う必要がある。例えば、抗体の濃
度は通常、水性媒質IRe当たり約5−25wgの範囲
である。
で、比較的低濃度で行う必要がある。例えば、抗体の濃
度は通常、水性媒質IRe当たり約5−25wgの範囲
である。
既述したように、リンカ−と薬物の1から約10モルを
抗体1モルに結合させる。そのコンジュゲート比率を得
るためには、通常、過剰量のリンカ−中間体を使用する
ことが必要である。アシル化条件下での抗体と活性エス
テルとの反応性は若干変動し得るが、一般に本反応では
、抗体1モル当たり約5から約15モルのリンカ−中間
体を使用する。
抗体1モルに結合させる。そのコンジュゲート比率を得
るためには、通常、過剰量のリンカ−中間体を使用する
ことが必要である。アシル化条件下での抗体と活性エス
テルとの反応性は若干変動し得るが、一般に本反応では
、抗体1モル当たり約5から約15モルのリンカ−中間
体を使用する。
このアシル化反応は、温度約O℃から約40’Cの範囲
で数分から数時間進行させる。温度を上昇させれば、抗
体にとって有害である場合があることは明白であり、と
りわけ本反応は本質的に速いので、低温で実施すること
を特に推奨する。
で数分から数時間進行させる。温度を上昇させれば、抗
体にとって有害である場合があることは明白であり、と
りわけ本反応は本質的に速いので、低温で実施すること
を特に推奨する。
リンカ−中間体基を適切に含有した誘導化抗体を調製し
た場合、以下の実施例で説明するように、得られた反応
混合物を常法によってクロマトグラフィーに供し、誘導
化抗体を非反応のリンカ−中間体と分離する。精製をこ
の時点で行わない場合には、メトトレキセート薬物は最
初の反応混合物中にある過剰のリンカ−中間体と反応し
て消費される。
た場合、以下の実施例で説明するように、得られた反応
混合物を常法によってクロマトグラフィーに供し、誘導
化抗体を非反応のリンカ−中間体と分離する。精製をこ
の時点で行わない場合には、メトトレキセート薬物は最
初の反応混合物中にある過剰のリンカ−中間体と反応し
て消費される。
最後に、メトトレキセート薬物のγ−ヒドラジドを誘導
化抗体と反応させて薬物コンジュゲートを完成させる。
化抗体と反応させて薬物コンジュゲートを完成させる。
この反応は、リンカ−中間体の終止基であるケトンまた
はアルデヒド、またはそれらのアセタールを薬物ヒドラ
ジドと反応させる単純な反応である。それは、水性媒質
中、適当な環境温度で十分に進行する迅速な反応である
。理想的には、得られたアシル化抗体は、メトトレキセ
ート薬物の反応にとって十分な反応媒質を形成し、かつ
クロマトグラフィーでの良好な分離を可能にさせる溶液
で溶出するクロマトグラフィーで精製する。この2つの
目的にとっては希釈水性緩衝液が適当である。
はアルデヒド、またはそれらのアセタールを薬物ヒドラ
ジドと反応させる単純な反応である。それは、水性媒質
中、適当な環境温度で十分に進行する迅速な反応である
。理想的には、得られたアシル化抗体は、メトトレキセ
ート薬物の反応にとって十分な反応媒質を形成し、かつ
クロマトグラフィーでの良好な分離を可能にさせる溶液
で溶出するクロマトグラフィーで精製する。この2つの
目的にとっては希釈水性緩衝液が適当である。
例えば、特に有用な反応媒質は希釈アセテート緩衝液で
あり、より具体的にはpH約5から約7の若干酸性pH
のO,1M酢酸ナトリウムである。
あり、より具体的にはpH約5から約7の若干酸性pH
のO,1M酢酸ナトリウムである。
しかし、この反応は、pHが若干酸性である限りは、ホ
ウ酸緩衝液、生理緩衝化食塩水などの中でも行うことが
できる。既述したように、溶媒が抗体を損傷する傾向を
示さない限りは、この反応媒質中に少量の有機溶媒が存
在していても有害ではない。
ウ酸緩衝液、生理緩衝化食塩水などの中でも行うことが
できる。既述したように、溶媒が抗体を損傷する傾向を
示さない限りは、この反応媒質中に少量の有機溶媒が存
在していても有害ではない。
メトトレ牛セードヒドラジドとの反応は、約1時間から
約1日の反応時間行う。反応混合物中の抗体量に基づい
て収量が最大になるような温度を選択して約0−40℃
の範囲の反応温度を使用する。
約1日の反応時間行う。反応混合物中の抗体量に基づい
て収量が最大になるような温度を選択して約0−40℃
の範囲の反応温度を使用する。
最後に、常法によるクロマトグラフィーによって、本発
明の薬物コンジュゲートを精製、単離する。生理緩衝化
食塩水を使用して薬物コンジュゲートを溶出するのが、
特に便利である。患者に投与するのに適した濃度で本発
明薬物コンジュゲートを溶出することができるであろう
が、通常は、減圧 透析などによって本フンジ−ゲート
を濃縮することが必要である。
明の薬物コンジュゲートを精製、単離する。生理緩衝化
食塩水を使用して薬物コンジュゲートを溶出するのが、
特に便利である。患者に投与するのに適した濃度で本発
明薬物コンジュゲートを溶出することができるであろう
が、通常は、減圧 透析などによって本フンジ−ゲート
を濃縮することが必要である。
本発明の薬物コンジュゲートの合成を、以下に記載した
製造例および実施例によってさらに説明する。
製造例および実施例によってさらに説明する。
製造例I
メトトレキセート−γ−ヒドラジド
100jIQ容量のフラスコに、L−グルタミン酸・5
−メチルエステル1.61g(10ミリモル)を加えた
。それに、t−ブチルアセテート60x(lを加え、得
られた混合物を手短に撹拌した。
−メチルエステル1.61g(10ミリモル)を加えた
。それに、t−ブチルアセテート60x(lを加え、得
られた混合物を手短に撹拌した。
次いで、それに70%過塩素酸1.58g (11ミリ
モル)を十分に撹拌しながら滴加した。このl物を窒素
雰囲気下に2日間撹拌し、次いで015N塩酸100m
+2で3回抽出した。水層をまとめ、重炭酸ナトリウム
30gで中和した。この中性溶液をジエチルエーテルで
3回(総量150 xQ)抽出し、有機層をまとめ、塩
水(ブライン)で洗浄した。次いで、洗浄した有機溶液
を硫酸ナトリウムで乾燥し、環境温度で減圧下に蒸発さ
せ、きれいな油1.18g (5,4ミリモル)を得た
。これはL−グルタミン酸・5−メチル−1−t−ブチ
ルジエステルであることを同定した。
モル)を十分に撹拌しながら滴加した。このl物を窒素
雰囲気下に2日間撹拌し、次いで015N塩酸100m
+2で3回抽出した。水層をまとめ、重炭酸ナトリウム
30gで中和した。この中性溶液をジエチルエーテルで
3回(総量150 xQ)抽出し、有機層をまとめ、塩
水(ブライン)で洗浄した。次いで、洗浄した有機溶液
を硫酸ナトリウムで乾燥し、環境温度で減圧下に蒸発さ
せ、きれいな油1.18g (5,4ミリモル)を得た
。これはL−グルタミン酸・5−メチル−1−t−ブチ
ルジエステルであることを同定した。
オーブン乾燥した10011(l容量フラスコにトリエ
チルアミン0.99z(1(6,6ミリモル)、ジエチ
ル・シア/ホスホネートIx&(6,6ミリモル)、お
よび酸化バリウムから減圧下に蒸留したばかりのジメチ
ルホルムアミド4Mを加えた。
チルアミン0.99z(1(6,6ミリモル)、ジエチ
ル・シア/ホスホネートIx&(6,6ミリモル)、お
よび酸化バリウムから減圧下に蒸留したばかりのジメチ
ルホルムアミド4Mを加えた。
撹拌下に、この溶液に、2,4−ジアミノ−6−[N−
メチル−N−(4−カルボキシフェニル)アミノコプテ
リジン・三水和物506xg (1,3ミリモル)を加
えた。撹拌して中間生成物が溶解したなら、その混合物
を80℃に加熱し、次いでトリエチルアミン0.20i
I2(1,4ミリモル)および上記のようにして製造し
たし一グルタミン酸ジエステル342xgをジメチルホ
ルムアミド11Qに加えた。得られた混合物を80℃で
2時間撹拌し、次いで冷却し、減圧下に溶媒を除去した
。
メチル−N−(4−カルボキシフェニル)アミノコプテ
リジン・三水和物506xg (1,3ミリモル)を加
えた。撹拌して中間生成物が溶解したなら、その混合物
を80℃に加熱し、次いでトリエチルアミン0.20i
I2(1,4ミリモル)および上記のようにして製造し
たし一グルタミン酸ジエステル342xgをジメチルホ
ルムアミド11Qに加えた。得られた混合物を80℃で
2時間撹拌し、次いで冷却し、減圧下に溶媒を除去した
。
得られた残渣をクロロホルム300zR中に取り、重炭
酸ナトリウム5%溶液で洗浄した。水層をクロロホルム
で抽出し、有機層をまとめ、硫酸ナトリウムで乾燥I7
、減圧下に濃縮してオレンジ色のtl、35gを得、次
いでこれをクロロホルム中10%メタ/−ルで溶出する
シリカゲル150gのクロマトグラフィーにかけた。生
成物を含有するフラクションをまとめて濃縮し、γ−カ
ルボキシがメチルエステル形態であり、α−カルボキシ
が(−ブチルエステル形態であるメトトレキセートジエ
ステル体6451gを得た。
酸ナトリウム5%溶液で洗浄した。水層をクロロホルム
で抽出し、有機層をまとめ、硫酸ナトリウムで乾燥I7
、減圧下に濃縮してオレンジ色のtl、35gを得、次
いでこれをクロロホルム中10%メタ/−ルで溶出する
シリカゲル150gのクロマトグラフィーにかけた。生
成物を含有するフラクションをまとめて濃縮し、γ−カ
ルボキシがメチルエステル形態であり、α−カルボキシ
が(−ブチルエステル形態であるメトトレキセートジエ
ステル体6451gを得た。
上記中間生成物を別のロフトであるが同じ化合物(全量
697スg(1,3ミリモル))と−緒にし、メタノー
ル12jlffに溶解した。それに無水ヒドラジン17
01g (5,3ミリモル)を加え、得られた混合物を
窒素雰囲気下に環境温度で6日間撹拌した。次いで、溶
媒を減圧下に除去し、得られた残渣をシリカゲル150
gのクロマトグラフィーに付し、クロロホルム中15%
メタノールで溶出し、メトトレキセート−α−t−ブチ
ルエステル−γ−ヒドラジド47C)yg(0,9ミリ
モル)を得た。
697スg(1,3ミリモル))と−緒にし、メタノー
ル12jlffに溶解した。それに無水ヒドラジン17
01g (5,3ミリモル)を加え、得られた混合物を
窒素雰囲気下に環境温度で6日間撹拌した。次いで、溶
媒を減圧下に除去し、得られた残渣をシリカゲル150
gのクロマトグラフィーに付し、クロロホルム中15%
メタノールで溶出し、メトトレキセート−α−t−ブチ
ルエステル−γ−ヒドラジド47C)yg(0,9ミリ
モル)を得た。
この中間生成物をIN塩酸120旺に溶解し、55℃に
50分間加熱した。次いで、減圧下に濃縮して固形物と
し、得られた残渣を0.01M酢酸アンモニウム(1)
H8)80x12に取った。この溶液を4℃で3日間保
存し、次いでこの直前に使用したものと同一の緩衝液(
緩衝液A)と1゜0M酢酸アンモニウム(pH8)(緩
衝液B)との勾配法によって溶出するセファロースファ
ーストフローQ [5epharose Fast F
low Q、ファルマシ乙Inc、 、ビスカッタウェ
イ、NJ]300次Qのクロマトグラフィーにかけた。
50分間加熱した。次いで、減圧下に濃縮して固形物と
し、得られた残渣を0.01M酢酸アンモニウム(1)
H8)80x12に取った。この溶液を4℃で3日間保
存し、次いでこの直前に使用したものと同一の緩衝液(
緩衝液A)と1゜0M酢酸アンモニウム(pH8)(緩
衝液B)との勾配法によって溶出するセファロースファ
ーストフローQ [5epharose Fast F
low Q、ファルマシ乙Inc、 、ビスカッタウェ
イ、NJ]300次Qのクロマトグラフィーにかけた。
100%の緩衝液Bで溶出する生成物を含有するフラク
ションをまとめ、凍結乾燥を繰り返し、痕跡量の酢酸ア
ンモニウムを除去した。得られた収量は、メトトレキセ
ート−γ−ヒドラジド326J+g (0,7ミリモル
)であった。
ションをまとめ、凍結乾燥を繰り返し、痕跡量の酢酸ア
ンモニウムを除去した。得られた収量は、メトトレキセ
ート−γ−ヒドラジド326J+g (0,7ミリモル
)であった。
製造例2
L/IC2抗体の生産
凍結したL/IC2ハイブリドーマのバイアルは、アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクシコンから受託番
号HB 9682の下で入手することができる。37
℃水浴中でバイアルを渦巻かせながらバイアル内容物を
解凍し、生細胞を回収する。次いで、その細胞懸濁物を
平衡塩類溶液[グランド・アイスランド・バイオロジカ
ル・カンパニー(Grand l5land Biol
ogical Company)(G I BCO、ギ
ブコ)、ニューヨーク14072、グランド・アイスラ
ンド、スタレー・ロード3175番コで1:2に希釈し
、その懸濁液を、血清を通過させて下層まで2009で
遠心し、極低温用培地から細胞を分別する。上清を吸引
し、得られた細胞ペレット中の細胞を、37℃、5%二
酸化炭素雰囲気下、775組織培養フラスコ中、10%
0%ラン血清、2I+1ML−グルタミン(ギブコ)お
よび50Mg/z(l硫酸ゲンタマイシン(ギブコ)を
加えた培養培地[ベントレックスHL−1(Ventr
ex HL−1)、ベントレックス・ラボラトリーズ、
ME、ボートラントコ中に懸濁する。殆ど全面成長の培
養物から上清を採取し、残った細胞を遠心して除去する
。細胞不含の上清をプロティンAセファロースカラム(
ファルマシア)に通過させ、その上清から抗体を精製す
る。抗体はこのカラムに結合し、培養培地は、0.01
M リン酸ナトリウム(pH8,0)中に洗浄排出され
る。次いで、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(p H
3゜5)を用いてそのカラムから抗体を溶出する。溶出
した抗体を1M トリツマ緩衝液[Trizma bu
rfer、シグマ、MO,セントルイス](pH7,4
)で素早く中和し、0.01M リン酸ナトリウム(p
H7,4)および0.15M塩化ナトリウムを含有した
減圧透析機[B io−Molecular Dyna
mics、 ORビーベルトンコを用いて透析し、濃縮
する。抗体調製物を0.2μl孔(ボア)に通して滅菌
濾過し、使用時まで4°Cで保存する。
リカン・タイプ・カルチャー・コレクシコンから受託番
号HB 9682の下で入手することができる。37
℃水浴中でバイアルを渦巻かせながらバイアル内容物を
解凍し、生細胞を回収する。次いで、その細胞懸濁物を
平衡塩類溶液[グランド・アイスランド・バイオロジカ
ル・カンパニー(Grand l5land Biol
ogical Company)(G I BCO、ギ
ブコ)、ニューヨーク14072、グランド・アイスラ
ンド、スタレー・ロード3175番コで1:2に希釈し
、その懸濁液を、血清を通過させて下層まで2009で
遠心し、極低温用培地から細胞を分別する。上清を吸引
し、得られた細胞ペレット中の細胞を、37℃、5%二
酸化炭素雰囲気下、775組織培養フラスコ中、10%
0%ラン血清、2I+1ML−グルタミン(ギブコ)お
よび50Mg/z(l硫酸ゲンタマイシン(ギブコ)を
加えた培養培地[ベントレックスHL−1(Ventr
ex HL−1)、ベントレックス・ラボラトリーズ、
ME、ボートラントコ中に懸濁する。殆ど全面成長の培
養物から上清を採取し、残った細胞を遠心して除去する
。細胞不含の上清をプロティンAセファロースカラム(
ファルマシア)に通過させ、その上清から抗体を精製す
る。抗体はこのカラムに結合し、培養培地は、0.01
M リン酸ナトリウム(pH8,0)中に洗浄排出され
る。次いで、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(p H
3゜5)を用いてそのカラムから抗体を溶出する。溶出
した抗体を1M トリツマ緩衝液[Trizma bu
rfer、シグマ、MO,セントルイス](pH7,4
)で素早く中和し、0.01M リン酸ナトリウム(p
H7,4)および0.15M塩化ナトリウムを含有した
減圧透析機[B io−Molecular Dyna
mics、 ORビーベルトンコを用いて透析し、濃縮
する。抗体調製物を0.2μl孔(ボア)に通して滅菌
濾過し、使用時まで4°Cで保存する。
製造例3
2503112容量フラスコに、ジオキサン100xa
中、4−カルボキシベンズアルデヒド3g(20ミリモ
ル)およびN−ヒドロキシスクシンイミド2.3g (
20ミリモル)を加えた。この混合物を5−10分間撹
拌し、次いでジシクロへキシルカルボジイミド4.1g
(20ミリモル)を加えた。環境温度で1時間この混合
物を撹拌した後、濾過した。得られた濾液を減圧下に蒸
発させ、白色固体9.4gを得、これを温インプロパツ
ール25112から再結晶した。この中間生成物をイン
プロパツールでトリチュレートし、4−カルボキシベン
ズアルデヒドの所望のN−スクシンイミドエステル体2
.1 g (8,5ミリモル)を得た。
中、4−カルボキシベンズアルデヒド3g(20ミリモ
ル)およびN−ヒドロキシスクシンイミド2.3g (
20ミリモル)を加えた。この混合物を5−10分間撹
拌し、次いでジシクロへキシルカルボジイミド4.1g
(20ミリモル)を加えた。環境温度で1時間この混合
物を撹拌した後、濾過した。得られた濾液を減圧下に蒸
発させ、白色固体9.4gを得、これを温インプロパツ
ール25112から再結晶した。この中間生成物をイン
プロパツールでトリチュレートし、4−カルボキシベン
ズアルデヒドの所望のN−スクシンイミドエステル体2
.1 g (8,5ミリモル)を得た。
さらに中間生成物のバッチを製造し、全量10g(40
ミリモル)のN−スクシンイミドエステルを、β−アラ
ニン3.6g(40ミリモル)のIN水酸化ナトリウム
40xQおよび水約1005112中溶液に加えた。そ
のpHを8以上に維持しながら、その混合物を1.5時
間撹拌した。次いで、混合物を濾過し、得られた濾液の
palを、2N塩酸を用いてpH1,9にまで酸性にし
た。全量150j112の酢酸エチルで3回抽出し、得
られた有機層をまとめ、塩水で洗浄した。次いで、有機
層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下に留去して白色固
体の3−(4−ホルミルフェニルカルボニルアミノ)プ
ロピオン酸4.6g(21ミリモル)を得た。
ミリモル)のN−スクシンイミドエステルを、β−アラ
ニン3.6g(40ミリモル)のIN水酸化ナトリウム
40xQおよび水約1005112中溶液に加えた。そ
のpHを8以上に維持しながら、その混合物を1.5時
間撹拌した。次いで、混合物を濾過し、得られた濾液の
palを、2N塩酸を用いてpH1,9にまで酸性にし
た。全量150j112の酢酸エチルで3回抽出し、得
られた有機層をまとめ、塩水で洗浄した。次いで、有機
層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下に留去して白色固
体の3−(4−ホルミルフェニルカルボニルアミノ)プ
ロピオン酸4.6g(21ミリモル)を得た。
この中間生成物100mg (0,45ミリモル)、ジ
シクロへキシルカルボジイミド103103i。
シクロへキシルカルボジイミド103103i。
5ミリモル)、N−ヒドロキシスクシンイミド57.5
xg (0,5ミリモル)およびジオキサン1011Q
を小フラスコに入れ、得られた混合物を窒素雰囲気下に
環境温度で撹拌した。薄層クロマトグラフィーによって
、この反応の進行を観察し、ジシクロへキシルカルボジ
イミド75xg (0,36ミリモル)およびN−ヒド
ロキシスクシンイミド45mg (0,4ミリモル)を
それぞれ追加した。
xg (0,5ミリモル)およびジオキサン1011Q
を小フラスコに入れ、得られた混合物を窒素雰囲気下に
環境温度で撹拌した。薄層クロマトグラフィーによって
、この反応の進行を観察し、ジシクロへキシルカルボジ
イミド75xg (0,36ミリモル)およびN−ヒド
ロキシスクシンイミド45mg (0,4ミリモル)を
それぞれ追加した。
4時間後、この反応混合物を濾過し、得られた濾液を減
圧下に留去して固形物を得た。不純物を含む生成物的2
00xgを得、これをジクロロメタ295%イソプロパ
ツールで溶出するシリカゲル30gのクロマトグラフィ
ーにかけた。生成物を含有するフラクションをまとめ、
若干の不純物を含む所望の中間生成物81mg (0,
25ミ!Jモル)を得た。
圧下に留去して固形物を得た。不純物を含む生成物的2
00xgを得、これをジクロロメタ295%イソプロパ
ツールで溶出するシリカゲル30gのクロマトグラフィ
ーにかけた。生成物を含有するフラクションをまとめ、
若干の不純物を含む所望の中間生成物81mg (0,
25ミ!Jモル)を得た。
製造例4
258nmおよび280nmのUV分析によッテ、得ら
れたフラクションを評価し、生成物を含有するフラクシ
ョンをまとめ、濃度8.5mg/xρの溶液状(111
,5xQ)の所望の生成物948mg (6,3μ1d
ol)を得た。この誘導化抗体におけるコンジュゲート
比率は、抗体1モル当たりリンカ−4,8モルであった
。
れたフラクションを評価し、生成物を含有するフラクシ
ョンをまとめ、濃度8.5mg/xρの溶液状(111
,5xQ)の所望の生成物948mg (6,3μ1d
ol)を得た。この誘導化抗体におけるコンジュゲート
比率は、抗体1モル当たりリンカ−4,8モルであった
。
実施例1
100mQ容量フラスコに環境温度で、0.34Mホウ
酸塩緩衝液(pH8,6)76、 lxQ中の抗体L/
lc2 (1026i+g、6.8μl1ol)溶液を
加え、次いでアセトニトリル3.3x(l中、製造例3
で得た活性エステル14.1mg (44μm。
酸塩緩衝液(pH8,6)76、 lxQ中の抗体L/
lc2 (1026i+g、6.8μl1ol)溶液を
加え、次いでアセトニトリル3.3x(l中、製造例3
で得た活性エステル14.1mg (44μm。
1)を加えた。この混合物を環境温度で1時間撹拌した
。次いで、0.1M酢酸ナトリウム(pH5,6)で溶
出するセファデックスG25(ファルマシア)90gの
クロマトグラフィーにかけた。
。次いで、0.1M酢酸ナトリウム(pH5,6)で溶
出するセファデックスG25(ファルマシア)90gの
クロマトグラフィーにかけた。
誘導化抗体472mg (3,1μmoりを含有する、
製造例4の生成物の55.61Q部分量を、0゜1M酢
酸ナトリウム(pH5,6)87zCを追加して希釈し
た。
製造例4の生成物の55.61Q部分量を、0゜1M酢
酸ナトリウム(pH5,6)87zCを追加して希釈し
た。
メトトレキセート−γ−ヒドラジドの部分量101ig
101iμa+ol)をアセトニトリル7.2R11お
よび1Mモノ塩基性カリウムリン酸緩衝液21.6ff
(2中に取った。5N水酸化ナトリウムを少量この溶液
に加え、次いで得られた溶液に抗体溶液を加えた。氷酢
酸を用いてこの反応混合物のpHを5.8にまで酸性に
調節し、環境温度で16時間撹拌した。次いで、遠心し
、上清を、生理緩衝化食塩水で溶出するセファデックス
G25クロマトグラフイーカラム(90g)2個を用い
たクロマトグラフィーに供した。
101iμa+ol)をアセトニトリル7.2R11お
よび1Mモノ塩基性カリウムリン酸緩衝液21.6ff
(2中に取った。5N水酸化ナトリウムを少量この溶液
に加え、次いで得られた溶液に抗体溶液を加えた。氷酢
酸を用いてこの反応混合物のpHを5.8にまで酸性に
調節し、環境温度で16時間撹拌した。次いで、遠心し
、上清を、生理緩衝化食塩水で溶出するセファデックス
G25クロマトグラフイーカラム(90g)2個を用い
たクロマトグラフィーに供した。
全fft202.8xI2の溶液をこのクロマトグラフ
ィーから採取し、280および370nmのスペクトル
を観察する紫外線分光測定によって分析した。
ィーから採取し、280および370nmのスペクトル
を観察する紫外線分光測定によって分析した。
この分析により、溶液には0.018xg/xQのメト
トレキセートおよび1.87gg/xcの抗体が含有さ
れていることが判明した。したがって、コンジュゲート
比率はモル濃度からみると3.0であった。
トレキセートおよび1.87gg/xcの抗体が含有さ
れていることが判明した。したがって、コンジュゲート
比率はモル濃度からみると3.0であった。
この生成物溶液を冷所で生理緩衝化食塩水に対して減圧
透析し、本実施例の生成物溶液を、同様に操作して得た
生成物溶液2121Qと一緒にした。透析によってその
容量をtoszgまで減じた。
透析し、本実施例の生成物溶液を、同様に操作して得た
生成物溶液2121Qと一緒にした。透析によってその
容量をtoszgまで減じた。
得られた生成物を、雌性ヌードマウスの異種移植片とし
て確立しているヒト腫瘍T222 [マスイ(Masu
i)らのカンサー(Cancer)、 44.1002
−07(1984)]に対して評価した。マウスに腫瘍
を移植した後、3.6および9日後に、本コンジュゲー
トを以下の表に示すような投与11(メトトレキセート
ヒドラジド含量に基づく)でマウスに静脈内投与(注射
)した。腫瘍移植後2.3および4週に、腫瘍を測定し
たので、得られた結果を、非処置対照マウスの腫瘍増殖
と比較した処置マウスにおける腫瘍増殖の阻害率として
以下の表に示す。ポジティブ対照動物は非結合型のメト
トレキセート−γ−ヒドラジドで処置し、コンジコゲー
ト処置動物と比較した。この処置の毒性を、毒性の兆候
を示した各々5匹のマウス処置群における動物の数とし
て報告する。得られた結果は以下のようであった。
て確立しているヒト腫瘍T222 [マスイ(Masu
i)らのカンサー(Cancer)、 44.1002
−07(1984)]に対して評価した。マウスに腫瘍
を移植した後、3.6および9日後に、本コンジュゲー
トを以下の表に示すような投与11(メトトレキセート
ヒドラジド含量に基づく)でマウスに静脈内投与(注射
)した。腫瘍移植後2.3および4週に、腫瘍を測定し
たので、得られた結果を、非処置対照マウスの腫瘍増殖
と比較した処置マウスにおける腫瘍増殖の阻害率として
以下の表に示す。ポジティブ対照動物は非結合型のメト
トレキセート−γ−ヒドラジドで処置し、コンジコゲー
ト処置動物と比較した。この処置の毒性を、毒性の兆候
を示した各々5匹のマウス処置群における動物の数とし
て報告する。得られた結果は以下のようであった。
(以下余白)
鼻1に
実施例1 4ytg/kg
0.5
MTX 20
ヒドラジド 4
実施例2
実施例1に記載の方法を、以下に記載のような異なる条
件下で4回繰り返した。
件下で4回繰り返した。
A、O,1M酢酸すトリウム(pH5,6)67μQお
よびアセトニトリル33μaに溶解したメトトレ牛セー
ドーγ−ヒドラジド0.67mg部分量を、製造例4に
記載した中間生成物2.2mgを含有するO、1M酢酸
ナトリウム溶液13112と一緒にし、得られた混合物
を11時間放置した。
よびアセトニトリル33μaに溶解したメトトレ牛セー
ドーγ−ヒドラジド0.67mg部分量を、製造例4に
記載した中間生成物2.2mgを含有するO、1M酢酸
ナトリウム溶液13112と一緒にし、得られた混合物
を11時間放置した。
次いで、バイオゲルP 6 (Biogel P6、バ
イオラド・ラボラトリーズ(Bio−Rad Labo
ratories)、リッチモンド、C^94804)
5 、9 gのクロマトグラフィーにかけ、コンジュ
ゲート溶液5112を得た。これは、抗体1モル当たり
メトトレキセート3.2モルのコンジュゲート比率であ
る所望のコンジュゲート0.6mgを含有しでいること
を見いだした。
イオラド・ラボラトリーズ(Bio−Rad Labo
ratories)、リッチモンド、C^94804)
5 、9 gのクロマトグラフィーにかけ、コンジュ
ゲート溶液5112を得た。これは、抗体1モル当たり
メトトレキセート3.2モルのコンジュゲート比率であ
る所望のコンジュゲート0.6mgを含有しでいること
を見いだした。
B、上記Aで使用したメトトレキセート−γ−ヒドラジ
ド溶液を同量、製造例4の中間生成物0゜42mgを含
有する中間生成物溶液0.95i&と一緒にし、この混
合物を11時間放置した。これを上記Aに記載したよう
にクロマトグラフィーにかけ、コンジュゲート比率がL
/lc2抗体1モ抗体1リル当トレキセート5.4モル
のコンジュゲート0.11ggを含有するコンジュゲー
ト溶液4.75zI2を得た。
ド溶液を同量、製造例4の中間生成物0゜42mgを含
有する中間生成物溶液0.95i&と一緒にし、この混
合物を11時間放置した。これを上記Aに記載したよう
にクロマトグラフィーにかけ、コンジュゲート比率がL
/lc2抗体1モ抗体1リル当トレキセート5.4モル
のコンジュゲート0.11ggを含有するコンジュゲー
ト溶液4.75zI2を得た。
C,アセトニトリル50μQおよびIM リン酸緩衝液
(pH5,8)100μQに溶解したメトトレ牛セード
ーγ−ヒドラジド0.7xgを、0゜1M酢酸t)、I
J’yム(pH5,6) 1x(l に溶解した製造
例4の中間生成物2.2mgと一緒にした。
(pH5,8)100μQに溶解したメトトレ牛セード
ーγ−ヒドラジド0.7xgを、0゜1M酢酸t)、I
J’yム(pH5,6) 1x(l に溶解した製造
例4の中間生成物2.2mgと一緒にした。
この混合物を11時間放置し、上記Aに記載したように
クロマトグラフィーにかけ、抗体1モル当たりメトトレ
キセート3.3モルのコンジュゲート比率であるコンジ
ュゲーN、3mgを含有するコンジュゲート溶液5.3
jl12を得た。
クロマトグラフィーにかけ、抗体1モル当たりメトトレ
キセート3.3モルのコンジュゲート比率であるコンジ
ュゲーN、3mgを含有するコンジュゲート溶液5.3
jl12を得た。
D、アセトニトリル50μσおよび1Mリン酸緩衝液(
pH5,8)15011ρに溶解したメトトレキセート
−γ〜ヒドラジド0.7igを、0゜IM酢酸ナトトリ
ムIiR中、実施例4の中間生成物2.2mgと一緒に
した。この混合物を14時間放置した後、上記Aに記載
したようにクロマトグラフィーにかけ、コンジュゲート
比率3.3のコンジュゲート体1.7xgを含有するコ
ンジュゲート溶液5.3村を得た。
pH5,8)15011ρに溶解したメトトレキセート
−γ〜ヒドラジド0.7igを、0゜IM酢酸ナトトリ
ムIiR中、実施例4の中間生成物2.2mgと一緒に
した。この混合物を14時間放置した後、上記Aに記載
したようにクロマトグラフィーにかけ、コンジュゲート
比率3.3のコンジュゲート体1.7xgを含有するコ
ンジュゲート溶液5.3村を得た。
コンジュゲートの制御した濃縮物を培養培地に加えるこ
とによって、上記CおよびDの反応生成物を、組織培養
中の腫瘍T222細胞の増殖の阻害能に関して評価した
。対照として使用した遊離抗体L/ I C2は16
IIIag/xQで細胞増殖を37%阻害し、160
mcghQでは98%阻害した。
とによって、上記CおよびDの反応生成物を、組織培養
中の腫瘍T222細胞の増殖の阻害能に関して評価した
。対照として使用した遊離抗体L/ I C2は16
IIIag/xQで細胞増殖を37%阻害し、160
mcghQでは98%阻害した。
上記実施例Cのコンジュゲートは、メトトレキセート−
γ−ヒドラジド含量に基づいて0.0013 mcg/
z(lで13%、0 、013 mcg/llRで87
%増殖を阻害した。
γ−ヒドラジド含量に基づいて0.0013 mcg/
z(lで13%、0 、013 mcg/llRで87
%増殖を阻害した。
上記実施例りのコンジュゲートは、メトトレキセート−
γ−ヒドラジド含量に基づいて0.0016 rmcg
/x(lで21%、0 、016 mcg/x(lで9
2%細胞の増殖を阻害した。
γ−ヒドラジド含量に基づいて0.0016 rmcg
/x(lで21%、0 、016 mcg/x(lで9
2%細胞の増殖を阻害した。
製造例5
抗KL/ I C2カルボニル−4−ベンズアルデヒド
4−カルボキシベンズアルデヒド・N−スクシンイミド
エステル0.31xgを上記製造例3に記載したように
製造した。それをジメチルホルムアミド100μaに溶
解し、0.34Mホウ酸塩緩衝液(pH8,6)2.1
xrl中、抗体L/1c2(18,9mg)に加えた。
エステル0.31xgを上記製造例3に記載したように
製造した。それをジメチルホルムアミド100μaに溶
解し、0.34Mホウ酸塩緩衝液(pH8,6)2.1
xrl中、抗体L/1c2(18,9mg)に加えた。
この混合物を環境温度で1.5時間撹拌し、次いでO,
1M酢酸ナトリウム(pH5,6)で溶出するバイオゲ
ルP6(6g)のクロマトグラフィーにかけた。溶液6
.2厘a部分量を得、これを256および280nmの
スペクトルを観察するUV分析によって分析した。
1M酢酸ナトリウム(pH5,6)で溶出するバイオゲ
ルP6(6g)のクロマトグラフィーにかけた。溶液6
.2厘a部分量を得、これを256および280nmの
スペクトルを観察するUV分析によって分析した。
この分析により、抗体1モル当たりリンカ−5゜2モル
のリンカ−のコンジュゲート比率であり、濃度2.6g
gl峠の誘導化抗体16.lJIgが得られたことを確
認した。
のリンカ−のコンジュゲート比率であり、濃度2.6g
gl峠の誘導化抗体16.lJIgが得られたことを確
認した。
実施例3
コンジュゲート
誘導化抗体10.4j1g (0,069μmol)を
含有する、製造例5に記載の溶液4RI2を、ジメチル
ホルムアミド250μe中、メトトレキセート−γ−ヒ
ドラジド3.2j+g (6,8μmol)と−緒にし
た。この混合物を環境温度に6時間放置し、次いで冷蔵
庫に入れた。2日後、この混合物を遠心し、得られた上
清をバイオゲルP6(生理緩衝化食塩水で溶出)にかけ
、溶液8.51ρを得、これを、280および370n
mのスペクトルを観察するUV分析によって分析した。
含有する、製造例5に記載の溶液4RI2を、ジメチル
ホルムアミド250μe中、メトトレキセート−γ−ヒ
ドラジド3.2j+g (6,8μmol)と−緒にし
た。この混合物を環境温度に6時間放置し、次いで冷蔵
庫に入れた。2日後、この混合物を遠心し、得られた上
清をバイオゲルP6(生理緩衝化食塩水で溶出)にかけ
、溶液8.51ρを得、これを、280および370n
mのスペクトルを観察するUV分析によって分析した。
この分析により、生成物が、抗体1モル当たり6.4モ
ル薬物のコンジュゲート比率を有しており、この溶液が
0.64xg/y、Qのコンジュゲートを含有している
ことを確認した。
ル薬物のコンジュゲート比率を有しており、この溶液が
0.64xg/y、Qのコンジュゲートを含有している
ことを確認した。
組織培養中のT222腫瘍細胞の増殖の阻害能について
、得゛られた生成物を評価した。このコンジュゲ−1・
は、メトトレキセート含量に基づいて、0、035μg
/x(lの濃度で細胞増殖の70%を阻害を示すことが
見いだされた。
、得゛られた生成物を評価した。このコンジュゲ−1・
は、メトトレキセート含量に基づいて、0、035μg
/x(lの濃度で細胞増殖の70%を阻害を示すことが
見いだされた。
製造例6
抗体L / I C2F (ab’ ) t 7ラグメ
ントペブ’/712.6Rg/M(lのペプシン溶液2
,4xQを生理緩衝化食塩水270籾中、L/IC2抗
体1.5gに加えることによって、抗体L/IC2のF
(ab’ )yフラグメントを調製した。この混合物
を37°Cに2時間20分間保存した後、トリエタノー
ルアミンを添加して反応を停止させた。
ントペブ’/712.6Rg/M(lのペプシン溶液2
,4xQを生理緩衝化食塩水270籾中、L/IC2抗
体1.5gに加えることによって、抗体L/IC2のF
(ab’ )yフラグメントを調製した。この混合物
を37°Cに2時間20分間保存した後、トリエタノー
ルアミンを添加して反応を停止させた。
次いで、0.15M酢酸ナトリウムで溶出するセファロ
ース・ファスト・フロー・カラムのクロマトゲラフイー
によって生成物を濃縮した。得られたF (ab’ )
yを含有するフラクションをまとめ、透析によって濃縮
し、抗体L/IC2のF (ab’ )*フラグメント
992xgを含有する生成物溶液100xQを得た。
ース・ファスト・フロー・カラムのクロマトゲラフイー
によって生成物を濃縮した。得られたF (ab’ )
yを含有するフラクションをまとめ、透析によって濃縮
し、抗体L/IC2のF (ab’ )*フラグメント
992xgを含有する生成物溶液100xQを得た。
製造例7
トゲラフイーにかけた。生成物を含有するフラクション
をまとめ、溶H9,6xQ中に、抗体1モル当たす2.
8モルのコンジュゲート比率の誘導化抗体フラグメント
19mg (0,19μmol)を得た。
をまとめ、溶H9,6xQ中に、抗体1モル当たす2.
8モルのコンジュゲート比率の誘導化抗体フラグメント
19mg (0,19μmol)を得た。
実施例4
デヒド
製造例6で調製したL/ I C2F (ab’ )!
フラグメントを、0.34Mホウ酸塩緩衝液(p H8
゜6)中で透析し、F(ab5)yフラグメント23y
tg(0,23μll1ol)を溶液3.8村として得
た。この溶液を、アセトニトリル102μff中、3−
(4−ホルミルフェニルカルボニルアミノ)プロピオン
酸・N−スクシンイミドエステル0.44mg(1,4
μmol)と−緒にした。この混合物を環境温度で1時
間撹拌し、次いで得られた溶液を、0.1M酢酸ナトリ
ウム(pH5,6)で溶出するセファデックスG25
(11g)のカラムによるクロマンシュゲート 製造例7で調製した、誘導化抗体フラグメント8JIg
(0,08μmol)を含有する誘導化抗体フラクメ
:y ト溶1(12,7x(l ニ、IM!/ン#!衝
液(pH5,6)0.47婦を加えた。この溶液に、最
小量の0.1M酢酸ナトリウムに溶解したメトトレキセ
ート−γ−ヒドラジド3.7ig (7,9μmol)
を加えた。希塩酸によってこの混合物のpHを5.6に
戻しに環境温度で17時間撹拌した。次いで、遠心し、
得られた上清を、生理緩衝化食塩水で溶出するセファデ
ックスG25(11g)のカラムのクロマトグラフィー
にかけた。UV分析ニヨッテ、0.95mg/x9 で
含有する溶液状のコンジュゲート5.8ggが得られ、
そのコンジュゲート比率は1モル当たり2.1モルであ
ることが判明した。
フラグメントを、0.34Mホウ酸塩緩衝液(p H8
゜6)中で透析し、F(ab5)yフラグメント23y
tg(0,23μll1ol)を溶液3.8村として得
た。この溶液を、アセトニトリル102μff中、3−
(4−ホルミルフェニルカルボニルアミノ)プロピオン
酸・N−スクシンイミドエステル0.44mg(1,4
μmol)と−緒にした。この混合物を環境温度で1時
間撹拌し、次いで得られた溶液を、0.1M酢酸ナトリ
ウム(pH5,6)で溶出するセファデックスG25
(11g)のカラムによるクロマンシュゲート 製造例7で調製した、誘導化抗体フラグメント8JIg
(0,08μmol)を含有する誘導化抗体フラクメ
:y ト溶1(12,7x(l ニ、IM!/ン#!衝
液(pH5,6)0.47婦を加えた。この溶液に、最
小量の0.1M酢酸ナトリウムに溶解したメトトレキセ
ート−γ−ヒドラジド3.7ig (7,9μmol)
を加えた。希塩酸によってこの混合物のpHを5.6に
戻しに環境温度で17時間撹拌した。次いで、遠心し、
得られた上清を、生理緩衝化食塩水で溶出するセファデ
ックスG25(11g)のカラムのクロマトグラフィー
にかけた。UV分析ニヨッテ、0.95mg/x9 で
含有する溶液状のコンジュゲート5.8ggが得られ、
そのコンジュゲート比率は1モル当たり2.1モルであ
ることが判明した。
このコンジユゲートを、組織培養中で、T222腫瘍細
胞に対して試験し、メトトレキセート−γ−ヒドラジド
含量に基づいて濃度0.0046mc g / z(l
で22%程度、細胞増殖を阻害し、また濃度0.046
mcg/xQで83%細胞増殖を阻害することが判明し
た。
胞に対して試験し、メトトレキセート−γ−ヒドラジド
含量に基づいて濃度0.0046mc g / z(l
で22%程度、細胞増殖を阻害し、また濃度0.046
mcg/xQで83%細胞増殖を阻害することが判明し
た。
製造例8
エステル
フラスコに、5−ホルミルピロール−2−イルカルボン
酸139xg、ジシクロへキシルカルボジイミド247
mg、N−ヒドロキシスクシンイミド138xg、およ
びジメチルホルムアミドIO峠を加えた。この混合物を
窒素雰囲気下、環境温度で2時間撹拌し、減圧下に溶媒
を除去して粗製の活性エステル391gを得た。
酸139xg、ジシクロへキシルカルボジイミド247
mg、N−ヒドロキシスクシンイミド138xg、およ
びジメチルホルムアミドIO峠を加えた。この混合物を
窒素雰囲気下、環境温度で2時間撹拌し、減圧下に溶媒
を除去して粗製の活性エステル391gを得た。
この残渣をアセトニトリルLx(l中に取った。
すべての残渣が溶液を形成したわけではなかった。
この不均一な混合物を、β−アラニン89xgの0.5
N水酸化ナトリウム2z(l溶液にゆっくりと加えた。
N水酸化ナトリウム2z(l溶液にゆっくりと加えた。
同時に、IN水酸化ナトリウムを加え、そのpHを7.
5から8の間に維持した。次いで、その混合物を環境温
度で1時間撹拌し、濾過した。得られた濾液を希塩酸で
酸性にし、塩化ナトリウムを飽和させて酢酸エチルで抽
出した。
5から8の間に維持した。次いで、その混合物を環境温
度で1時間撹拌し、濾過した。得られた濾液を希塩酸で
酸性にし、塩化ナトリウムを飽和させて酢酸エチルで抽
出した。
次いで、それを乾燥し、濃縮してオレンジ色の油を得、
それをジクロロメタ2910%メタノールで溶出するシ
リカゲルカラムのクロマトグラフィーにかけた。生成物
を含有するフラクションを減圧下に濃縮し、3− (5
−ホルミルビロール−2−イルカルボニルアミノ)プロ
ピオン酸49mgを得た。
それをジクロロメタ2910%メタノールで溶出するシ
リカゲルカラムのクロマトグラフィーにかけた。生成物
を含有するフラクションを減圧下に濃縮し、3− (5
−ホルミルビロール−2−イルカルボニルアミノ)プロ
ピオン酸49mgを得た。
この中間生成物31ygをジオキサン3zff中に取り
、それにジシクロへキシルカルボジイミド35+g、お
よびN−ヒドロキシスクシンイミド19*gを加えた。
、それにジシクロへキシルカルボジイミド35+g、お
よびN−ヒドロキシスクシンイミド19*gを加えた。
得られた混合物を窒素雰囲気下に環境温度で2時間撹拌
し、次いて濾過して減圧下に濃縮した。得られた残渣を
、ジクロロメタ795%メタノールで溶出するシリカゲ
ルクロマトグラフィーにかけ、所望の中間体活性エステ
ル約6Rgを得た。
し、次いて濾過して減圧下に濃縮した。得られた残渣を
、ジクロロメタ795%メタノールで溶出するシリカゲ
ルクロマトグラフィーにかけ、所望の中間体活性エステ
ル約6Rgを得た。
製造例9
ド
抗体007Bは、抗体KSI/4を産生するハイブリド
ーマから誘導されたサブクローンであるハイブリドーマ
から産生される[バルキ(Varki)らの、 Can
cer Re5each 44.681−86(198
4)に記載されている]。0.34Mホウ酸塩緩衝液に
1531g/酎で含有させた抗体007B 1105
xの溶液を、製造例8の中間体活性エステル1.293
Igを含有する中間体のアセトニトリル溶液300μQ
と一緒にした。この混合物を環境温度で1時間撹拌し、
次いでO,1,M酢酸ナトリウム(pH56)で溶出す
るセファデックスG25カラム(10g)のクロマトグ
ラフィーにかけた。生成物を含有するフラクションをま
とめ、280nmおよび300nmのカーブを測定する
Uv分析によって分析した。生成物は、標題中間生成物
を総量83.2xg含有する、濃度5.7xg’/mQ
の溶液14.6x(に含有されていた。コンジュゲート
比率は、3.6であった。
ーマから誘導されたサブクローンであるハイブリドーマ
から産生される[バルキ(Varki)らの、 Can
cer Re5each 44.681−86(198
4)に記載されている]。0.34Mホウ酸塩緩衝液に
1531g/酎で含有させた抗体007B 1105
xの溶液を、製造例8の中間体活性エステル1.293
Igを含有する中間体のアセトニトリル溶液300μQ
と一緒にした。この混合物を環境温度で1時間撹拌し、
次いでO,1,M酢酸ナトリウム(pH56)で溶出す
るセファデックスG25カラム(10g)のクロマトグ
ラフィーにかけた。生成物を含有するフラクションをま
とめ、280nmおよび300nmのカーブを測定する
Uv分析によって分析した。生成物は、標題中間生成物
を総量83.2xg含有する、濃度5.7xg’/mQ
の溶液14.6x(に含有されていた。コンジュゲート
比率は、3.6であった。
実施例5
シュゲート
0.1M酢酸ナトリウムおよび0.15M リン酸イオ
ンを含有する緩衝液(pH5,6)中、48gg/z&
で存在する、製造例9の中間生成物15xgの溶液3.
IJIQを、酢酸ナトリウム緩衝液0.2村中、メトト
レキセート−γ−ヒドラジド4.7Rgと一緒にした。
ンを含有する緩衝液(pH5,6)中、48gg/z&
で存在する、製造例9の中間生成物15xgの溶液3.
IJIQを、酢酸ナトリウム緩衝液0.2村中、メトト
レキセート−γ−ヒドラジド4.7Rgと一緒にした。
その添加後、pHを5゜6に調節し、得られた混合物を
環境温度で約24時間撹拌した。次いで、遠心し、得ら
れた上清を、生理緩衝化食塩水で溶出するセファデック
ス625カラム(10g)のクロマトグラフィーに供し
た。生成物を含有するフラクションをまとめ、0゜22
ミクロンフィルターで濾過し、所望のコンジュゲート9
.9mgを含有する生成物溶液6.05+σを得、それ
を、250および280nmのスペクトルを観察する紫
外線分光測定によって分析すると、コンジュゲート比率
は2.3であった。このコンジュゲートの結合能をラジ
オイムノアッセイによって、非コンジュゲート化007
B抗体と比較して評価した。このコンジュゲートと抗体
の力価カーブは、実質的に同様であり、このことはリン
カ−および薬物とのコンジュゲートによっては抗体の結
合能は実質的に変化しないことを示している。
環境温度で約24時間撹拌した。次いで、遠心し、得ら
れた上清を、生理緩衝化食塩水で溶出するセファデック
ス625カラム(10g)のクロマトグラフィーに供し
た。生成物を含有するフラクションをまとめ、0゜22
ミクロンフィルターで濾過し、所望のコンジュゲート9
.9mgを含有する生成物溶液6.05+σを得、それ
を、250および280nmのスペクトルを観察する紫
外線分光測定によって分析すると、コンジュゲート比率
は2.3であった。このコンジュゲートの結合能をラジ
オイムノアッセイによって、非コンジュゲート化007
B抗体と比較して評価した。このコンジュゲートと抗体
の力価カーブは、実質的に同様であり、このことはリン
カ−および薬物とのコンジュゲートによっては抗体の結
合能は実質的に変化しないことを示している。
製造例10
抗体KSI/4を濃度20zg/mνで、0.34Mホ
ウ酸塩緩衝液(pH8,6)中で透析した。
ウ酸塩緩衝液(pH8,6)中で透析した。
その抗体溶液1j112を、ジメチルホルムアミドに2
0肩g/x(l溶液として加えた3−(4,4−ジェト
キシブチルアミ7カルボニル)プロピオン酸・N−スク
シンイミドエステルと反応させた。1つのケースでは活
性エステルの量は0.24Bであり、他のケースでは0
.48ggであった。これら2つの反応混合物を2時間
撹拌し、次いで生理緩衝化食塩水で溶出するバイオゲル
P6のクロマトグラフィーにかけた。
0肩g/x(l溶液として加えた3−(4,4−ジェト
キシブチルアミ7カルボニル)プロピオン酸・N−スク
シンイミドエステルと反応させた。1つのケースでは活
性エステルの量は0.24Bであり、他のケースでは0
.48ggであった。これら2つの反応混合物を2時間
撹拌し、次いで生理緩衝化食塩水で溶出するバイオゲル
P6のクロマトグラフィーにかけた。
最初の反応で得られた生成物は、所望の中間生成物17
.8mgであり、次の反応で得られた生成物は、所望の
中間生成物15.6xgであった。
.8mgであり、次の反応で得られた生成物は、所望の
中間生成物15.6xgであった。
実施例6
ト
上記の製造例10で調製した誘導化抗体1xct全、0
.34Mホウ酸塩緩衝液(pH8,6)中、メトトレキ
セート−γ−ヒドラジドと反応させた。
.34Mホウ酸塩緩衝液(pH8,6)中、メトトレキ
セート−γ−ヒドラジドと反応させた。
製造例10の最初の生成物の場合は、その3.5肩gを
、ジメチルホルムアミド溶液としてのメトトレキセート
−γ−ヒドラジド2.3mgと反応させた。第2の生成
物の場合、その量は2.9mgであり、メトトレキセー
ト〜γ−ヒドラジドの量は2゜Oxgであった。次いで
、各場合とも、得られた反応混合物のpHを4.9に調
節した。次ぎに、37°Cで18時間反応させ、得られ
た生成物を、生理緩衝化食塩水で溶出するバイオゲルP
6のクロマトグラフィーにかけた。
、ジメチルホルムアミド溶液としてのメトトレキセート
−γ−ヒドラジド2.3mgと反応させた。第2の生成
物の場合、その量は2.9mgであり、メトトレキセー
ト〜γ−ヒドラジドの量は2゜Oxgであった。次いで
、各場合とも、得られた反応混合物のpHを4.9に調
節した。次ぎに、37°Cで18時間反応させ、得られ
た生成物を、生理緩衝化食塩水で溶出するバイオゲルP
6のクロマトグラフィーにかけた。
各反応における生成物を含有するフラクションをまとめ
、279および370nmのカーブを観察する紫外線分
光測定によって分析した。最初の反応の生成物は、コン
ジュゲート比率2.0の所望のコンジュゲート2.”7
mgであった。第2の反応の生成物は、コンジ−ゲート
比率3.9の生成物2.6mgであった。
、279および370nmのカーブを観察する紫外線分
光測定によって分析した。最初の反応の生成物は、コン
ジュゲート比率2.0の所望のコンジュゲート2.”7
mgであった。第2の反応の生成物は、コンジ−ゲート
比率3.9の生成物2.6mgであった。
本発明のコンジュゲートは、本発明の重要な構成要素で
ある、望ましくない細胞の増殖を阻害するための方法に
有用である。したがって、本発明はさらに、医薬製剤、
最も好ましくは患者の体内への注射に適した非経口用製
剤をも包含する。このような製剤は、普通に薬化学の分
野で使用されている方法によって調製される。本発明の
コンジュゲートは、生理食塩水、および非経口投与して
安全であり得る他の水溶液などの生理学的に許容され得
る液に良好に溶解する。
ある、望ましくない細胞の増殖を阻害するための方法に
有用である。したがって、本発明はさらに、医薬製剤、
最も好ましくは患者の体内への注射に適した非経口用製
剤をも包含する。このような製剤は、普通に薬化学の分
野で使用されている方法によって調製される。本発明の
コンジュゲートは、生理食塩水、および非経口投与して
安全であり得る他の水溶液などの生理学的に許容され得
る液に良好に溶解する。
非経口投与用生成物は、使用前に素早く再製できるよう
に、製剤化され、固体、好ましくは凍結乾燥形態に分散
されることが多い。このような製剤は、本発明にとって
有用な製剤である。それらの調製法は、薬化学者には十
分知られるところであり、一般に、等強性を与えるため
に無機塩の混合物を含有させ、また乾燥調製物が再構成
時に素早く溶解できるようにラクトンなどの分散化剤を
含有させる。このような製剤は、高度に精製した水を用
いてメトトレキセート薬物に基づいて既知の濃度にまで
再構成する。
に、製剤化され、固体、好ましくは凍結乾燥形態に分散
されることが多い。このような製剤は、本発明にとって
有用な製剤である。それらの調製法は、薬化学者には十
分知られるところであり、一般に、等強性を与えるため
に無機塩の混合物を含有させ、また乾燥調製物が再構成
時に素早く溶解できるようにラクトンなどの分散化剤を
含有させる。このような製剤は、高度に精製した水を用
いてメトトレキセート薬物に基づいて既知の濃度にまで
再構成する。
本発明のコンジュゲートの最適な投与量、および投与計
画は、患者の状態を勘案して、治療する医師によって決
定されなければならない。
画は、患者の状態を勘案して、治療する医師によって決
定されなければならない。
当然ながら、一連の各投与毎に数日または数週間の間隔
をあけた分割した投与形態で投与するのが普通である。
をあけた分割した投与形態で投与するのが普通である。
本発明のコンジュゲートは、様々な用量範囲で有効であ
るが、通常、1週間当たりの投与量は、メトトレキセー
ト薬物的50から約1000xg/x”以内に抑え、よ
り好ましくは約200から約400肩g/lである。
るが、通常、1週間当たりの投与量は、メトトレキセー
ト薬物的50から約1000xg/x”以内に抑え、よ
り好ましくは約200から約400肩g/lである。
本発明のコンジュゲートを投与するのに使用される製剤
例を以下に示し、理解の一助とする。
例を以下に示し、理解の一助とする。
製剤例1
実施例のコンジュゲート 1001g生理食塩水
10g(1低温で保存し、静脈
内投与する。
10g(1低温で保存し、静脈
内投与する。
製剤例2
実施例3のコンジュゲート 1gラクトース
011g
生理食塩水 100肩e低温で凍結乾
燥し、室温またはそれ以下の温度で保存し、投与するた
めに精製水を用いて再構成する。
燥し、室温またはそれ以下の温度で保存し、投与するた
めに精製水を用いて再構成する。
製剤例3
実施例4のコンジュゲート 1g分散化剤
25gg生理食塩水
100酎低温で凍結乾燥し、室温またはそれ以下の
温度で保存し、投与するために精製水を用いて再構成す
る。
25gg生理食塩水
100酎低温で凍結乾燥し、室温またはそれ以下の
温度で保存し、投与するために精製水を用いて再構成す
る。
製剤例4
実施例5のコンジュゲート 1001g生理食塩水
10村低温度で保存し、静脈内に投
与する。
10村低温度で保存し、静脈内に投
与する。
製剤例5
実施例6のコンジュゲート 5g分散化剤
80mg
生理食塩水
500村
低温で凍結乾燥し、室温またはそれ以下の温度で保存し
、投与するために精製水を用いて再構成する。
、投与するために精製水を用いて再構成する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、式( I ): Ab[CO−X=N−HN−M]_m( I )[式中、
mは1から約10までの整数であり、Abは、望ましく
ない細胞に関連する抗原を認識する、生理学的に許容さ
れ得る抗体または抗原を認識するそのフラグメントであ
り、 Xは、以下の式: ▲数式、化学式、表等があります▼(II) (CH_2)n−Ar−CH=(III) (CH_2)n−CO−NH−(CH_2)n−CH=
(IV)または、 ▲数式、化学式、表等があります▼(V) で示されるリンカーであり、 Rは、水素、フェニル、または1つもしくは2つのニト
ロ基、ハロゲン基、シアノ基もしくはトリフルオロメチ
ル基で置換されているフェニルであり、 Arは、▲数式、化学式、表等があります▼または▲数
式、化学式、表等があります▼であり、 R^1は、水素、アミノ、アミノ−C_1−C_4アル
キル、ヒドロキシ−C_1−C_4アルキル、またはグ
アニジノ−C_1−C_4アルキルであり、R^2は、
▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学
式、表等があります▼ であり、 nは、0から5までの整数であり、 Mは、式(VI): ▲数式、化学式、表等があります▼(VI) (ここに、R^3は▲数式、化学式、表等があります▼
、▲数式、化学式、表等があります▼、S、またはOで
あり、R^4は、CO、SO_2、Co−(CH_2)
s、またはCO−NHであり、 R^5は、水素、またはC_1−C_3アルキルであり
、sは、1または2であり、 Zは、▲数式、化学式、表等があります▼(VII) ▲数式、化学式、表等があります▼(VIII)または ▲数式、化学式、表等があります▼(IX) であり、上記式中、tは、1から6までの整数、uは1
から22までの整数、 R^6は、水素、または生理学的に許容され得る塩を完
成させる部分) で示されるメトトレキセート薬物である] で示される細胞毒性薬物コンジュゲート。 2、抗体がモノクローナルまたはキメラ抗体、または抗
原を認識するそのフラグメントである請求項1に記載の
コンジュゲート。 3、Xが、(CH_2)n−Ar−CH=、または▲数
式、化学式、表等があります▼ である請求項1または請求項2に記載のコンジュゲート
。 4、Zが、▲数式、化学式、表等があります▼で あり、tが1である請求項3に記載のコンジュゲート。 5、R^3が、N(R^5)であり、R^4がCOであ
る請求項1から請求項4までのいずれかに記載のコンジ
ュゲート。 6、請求項1から請求項5までのいずれかに記載のコン
ジュゲートを活性成分として含有し、1つまたはそれ以
上の非経口投与用担体または希釈剤を共に含有してなる
医薬製剤。 7、式:Ab[CO−X=R^8]m [式中、R^8はO、(OCH_3)_2、または(O
CH_2CH_3)_2であり、Ab、Xおよびmは、
請求項1から請求項3までのいずれかに記載の定義と同
意義である] で示される誘導化抗体。 8、抗体がモノクローナルまたはキメラ抗体、または抗
原を認識するそのフラグメントである請求項7に記載の
誘導化抗体。 9、請求項1から請求項5までのいずれかに記載のコン
ジュゲートを製造するための方法であって、 式:Ab[CO−X=R^8]m [式中、Ab、Xおよびmは請求項1から請求項3まで
のいずれかに記載の定義と同意義であり、R^8は請求
項7における定義と同意義である]で示される誘導化抗
体を式: H_2NHN−M [式中、Mは請求項1における定義と同意義である] で示される薬物ヒドラジドと反応させることを特徴とす
る方法。
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