JPH02255898A - エンド型アルカリ性セルラーゼを含有する洗浄剤組成物 - Google Patents
エンド型アルカリ性セルラーゼを含有する洗浄剤組成物Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
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Description
(産業上の利用分野)
本発明は、エンド型アルカリ性セルラーゼを含有する洗
浄剤組成物に関する。 (従来の技術) 近年、衣料の洗浄に関して、著しい発達がみられた。即
ち、洗剤に適した原料の開発、水質の改善、洗浄機械の
改良と普及、繊維の改良等によって衣料の洗浄は著しく
容易になってきた。なかでも、洗剤用原料の改良はめざ
ましく、界面活性剤、ビルダー、分散剤、蛍光染料、漂
白剤等の改質によって、衣料用洗剤の組成は、はぼ完成
の域に達したかの感がある。しかし乍ら衣料用洗剤開発
の背景にある思想は、(1)汚れ成るいは/及び繊維表
面に界面活性剤やビルダーが吸着することにより、汚れ
成るいは/及び繊維と水との間の界面張力を低下させ、
汚れと繊維を物理化学的に引き雌す、(2)汚れを界面
活性剤、無機ビルダーで分散、可溶化する。(3)汚れ
をプロテアーゼ等の酵素で化学的に分解する、(4)着
色汚れを漂白剤等で漂白する、(5)繊維表面に蛍光染
料等を吸着させで、増白する、(6)洗浄に有効な成分
の二価金属イオンによる沈澱をキレート剤で防止する等
に要約される。 即ち、従来の衣料洗浄の基本は汚れを直接に攻撃する成
分若しくは該成分の功撃力を補助する成分を如何に洗浄
剤組成物の一成分どして有効に取り入れるかということ
にあった、 (発明が解決しようとする問題点) しかしながら、現在、該基本に基づいた洗浄剤組成物で
は、ある意味においてその洗浄性能はほぼ飽和点に達し
ており、更に高い洗浄力を有する洗浄剤組成物の開発が
望まれていた。 斯様な観点にたち本発明者らは、新規な洗浄機序を与え
る物質としてアルカリ性セルラーゼを見い出し、該酵素
を産生ずる微生物としてストレプトマイセス・エスピー
(StreptolIyces sp、)にSM−2(
微工研菌寄第7621号)、ストレプトマイセス・エス
ピー(Streptorayces sp、)にS?f
−9(微工研菌寄第7622号)を見い出した。 しかしながら、これら微生物の産生するアルカリ性セル
ラーゼは、エキソ(exo)型およびエンド(endo
)型セルラーゼの混合物であって、しかも、その生産性
は低いものであった。 (問題点を解決するための手段) 本発明者らは、ストレプトマイセス属に属するアルカリ
性セルラーゼ生産菌のアルカリ性セルラーゼを生産する
染色体遺伝子部位を、遺伝子工学の遺伝子クローニング
法でクローニングし、エンド型アルカリ性セルラーゼの
みを生成させることに成功し本発明を完成した。 すなわち、本発明はストレプトマイセス属に属するエン
ド型アルカリ性セルラーゼ生産菌が生産するエンド型ア
ルカリ性セルラーゼを含有する洗浄剤組成物に関するも
のである。 本発明に用いるエンド型アルカリ性セルラーゼは、スト
レプトマイセス属に属するアルカリ性セルラーゼ生産菌
のエンド型アルカリ性セルラーゼ生産性染色体DNAを
含有せしめてなる絹換えベクターによって形質転換され
たス1−レプ1へマイセス属に属するエンド型アルカリ
性セルラーゼ生産菌を培養した培地から回収採取するこ
とにより生産される。 ストレプトマイセス属に属するアルカリ性セルラーゼ生
産菌からのエンド型アルカリセルラーゼの生産に関与す
る染色体DNAの調製は、特に限定されない0例えば、
リゾチーム等で細胞壁を溶解後、界面活性剤を用いてお
だやかに溶菌し、無細胞抽出液を得る。ついで遠心によ
って菌体人糞とDNA画分を分離し、さらに塩化セシウ
ム平衡密度勾配遠心法でDNA画分を得る。 もしくは、SDS等の界面活性剤によって溶菌後、フェ
ノール処理、クロロホルム処理を行い、DNA画分を精
製分離したのち、エタノール沈澱によってDNAを得る
。 調製された供与染色体DNAは、次いでベクターと連結
されるために切断される。供与染色体の切断は、通常制
限エンドヌクレアーゼを用いる方法によって実施される
が、特にこの方法に限定されるものではなく、例えば、
物理的に剪断力を加えて切断する方法でもよい。制限酵
素を使用し供与DNAを切断する場合、完全切断をおこ
す反応条件を用いるのであればアルカリ性セルラーゼ遺
伝子に切断部位を持たない制限エンドヌクレアーゼであ
れば如何なるものでも使用可能である。また、部分的に
しか切断を起さない反応条件を用いるのであれば、全て
の制限エンドヌクレアーゼが使用可能である。斯様に制
限酵素は用いる条件に応じて種々のものが選択可能では
あるが、ベクターとの連結の容易さからは使用するベク
ターに唯一の切断部位を有する制限酵素を使用するのが
よい。例えばI’st I、 Dam旧、 Sac I
、Kpn I、BgQ n等が使用可能である。 一方、ベクターとしては、宿主として使用するストレプ
トマイセス属微生物中で複製可能なものであれば、プラ
スミド若しくはファージの区別なく使用することができ
る。 ベクターとしてプラスミドを使用する場合、宿主中にお
いて複製可能なものであれば如何なるものでもよいが、
特定の制限酵素による唯一の切断部位を有し、抗生物質
耐性等のマーカーを有するものが、供与染色体との結合
および形質転換株の選択容易性から望ましい。プラスミ
ドの例示としては、すでに公知となっているストーブ1
−ミセス属微生物から得られたpJcPlll、pIJ
41. pIJ61、pIJ361、pIJ702.
pIJ365、p I J 385などがあげられる。 切断された供与染色体DNAを、ベクターに挿入し結合
させる為には、供与染色体DNAとベクターとを同一の
制限酵素で切断し、然る後に、DNAリガーゼを使用し
両者を結合するのが一般的に使用される方法である。し
かし、斯様な方法に限定されることな〈従来知られてい
る如何なる方法でも実施は可能である。 DNAリガーゼの例示としては、大腸菌のDNAリガー
ゼ及びT4ファージのDNAリガーゼがあげられる。 斯様にして調製された供与染色体DNA断片とベクター
との結合体である組換えベクターは、次いで、宿主であ
るストレプトマイセス属微生物に導入される。 宿主として使用されるストレプトマイセス属微生物は、
本発明の実施目的に応じて種々のものが適宜選択して使
用可能であ、る。 選らばれた宿主微生物であるス1−レブトマイセス属微
生物への組換λベクターの導入、すなわち形質転換法は
、特に限定されないが、プロトプラスト形質転換法が最
適である。 形質転換株から目的とするエンド型アルカリ性セルラー
ゼ遺伝子若しくはエンド型アルカリ性セルラーゼ遺伝子
を含む供与染色体DNA断片が導入された微生物を選択
・分離する方法は特に限定されないが、ベクターが有す
る抗生物質耐性等のマーカー発現を利用し第一次的に選
択し次いで宿主のエンド型アルカリ性セルラーゼ活性を
指標とする第2次的選択をする方法が好適である。 かくして最終的に選択された形質転換株を使用したエン
ド型アルカリ性セルラーゼの培養液中での蓄積、回収、
精製法については特に制限はない。 培養で使用する培地の組成は、使用する菌株が良好に生
育し、エンド型アルカリ性セルラーゼの生産を順調に行
なわしめるために適当な炭素源、窒素源あるいは有機栄
養源、無機塩等からなっている。炭素源としては、例え
ばカルボキシメチルセルロース(CMC)等の可溶性繊
維素誘導体、バルブ粉末、口紙粉末、アビセル等の固型
繊維素等のセルロース等;グルコ・−ス、フラクト・−
ス、シュクロース若しくはソルビl−−ル等の炭水化物
;クエン酸、コハク酸等の有機酸;n−ドデカン、n−
ヘキサデカン等の炭化水素等々の資化されるものであれ
ばいずれも使用できる。これら炭素源のうちではセルロ
ース等、就中、可溶性繊維素誘導体を使用した培地はエ
ンド型アルカリ性セルラーゼの生産量も多く好適である
。 本発明の製造例において、遺伝子操作によって得た例示
のプラスミドpCAS1 を用いて得た形質転換体、ス
トレプトマイセス・リビダンスIIH21Na1(pC
ASI)、FHRM P−8276の生産するエンド型
アルカリ性セルラーゼの理化学的性質を示すと、次の通
りである。 1゜作用:カルボキシメチルセルロース(CMC)等の
セルロースを、エンド(endo)型の機作で分解し粘
度低下をきたす、これに対し還元糖の生成はほとんど認
められない。 2、 基’11異性: CMC等のセルロースに対し
て特異的に作用する。 3、至適pH: pH8付近でCMCに対する作用が至
適である。第2図に示す通りである。 4、安定pH範囲:30℃で48時間処理した場合、p
116〜11において、CMCに対し90%以上の残存
活性を示す、第3図に示す通りである。 5、至適温度:pH8において、CMCを基質とした場
合、45℃付近である。第4図に示す通りである。 6゜熱安定性:pH8において40℃1時間処理におい
て90%以上活性が残存する。第5図に示す通りである
。 本発明のエンド型アルカリ性セルラーゼの酵素活性は、
カルボキシメチルセルロース(CMC)を基質とした時
、はとんど還元糖を生成しないため以下に述べるエンド
型CMCase活性測定方法に従い決定した。 すなわち、和光純薬製CMC1,0%溶液3mfl。 グリシンバッファー 0.5M溶液(pH8) 2mQ
、イオン交換水3mMを混合し、ウベローデ型粘度計中
にて40℃に保つ、これに酵素溶液11を加え、すばや
く撹拌後粘度を測定しこの時の値をV、とする740℃
で5分間静置後再び粘度を測定しこの時の値をV2とす
る。 V、 −Vl の値が1 est/winを示した時をエンド型CMC
ase1ユニットとした。 本発明の洗浄剤組成物は、エンド型アルカリ性セルラー
ゼを組成物1kgに対して50ユニット以−ヒ、25
、000ユニッ1−以下で配合することが好ましく、別
の表現をすれば洗浄剤組成物を水に溶かした後は、洗た
く液1リットル中に0.067ユニツト以し、33ユニ
ツトへ下となるように、エンド型アルカリ性セルラーゼ
を洗浄剤組成物に配合することが好ましい。 本発明の洗浄剤組成物にはエンド型アルカリ性セルラー
ゼ以外の成分は特に限定されない。 例えば、公知の次の諸成分なら本来のその効果の必要に
応じて任意に配合される。 (1)界面活性剤 アルキルベンゼンスルホン酸塩、ポリオキシアルキレン
(C−2若しくは3)アルキル又はアルケニルエーテル
硫酸エステル塩、アルキル又はアルケニル硫酸エステル
塩、オレフィンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩、
高級脂肪酸塩、アルキル又はアルケニルエーテルカルボ
ン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩又はそのエステル化物等々
の平均炭素数8〜20のアルキル又はアルケニル鎖を有
する陰イオン性界面活性剤。 、二二で、陰イオン性界面活性剤の対イオンとしてはナ
トリウム、カリウム等のアルカリ金属イオン、カルシウ
ム、マグネシウム等のアルカリ土類金属イオン、アンモ
ニウムイオン炭素数2又は;3のアルカノール基を1〜
3個有するアルカノールアミン(例えばモノエタノール
アミン、ジェタノールアミン、トリエタノールアミン、
1−リイソプロパノールアミンなど)を挙げることがで
きる。 更に、スルホン酸型、ベタイン型等の両性界面活性剤、
ポリオキシエチレンアルキル又はアルケニルエーテル、
ポリオキシエチレンアルキル又はアルケニルフェニルエ
ーテル、ポリオキシプロピレン・ポリオキシエチレン共
重合物のアルキル又はアルケニルエーテル、高級脂肪酸
アルカノールアミド、蔗糖脂肪酸エステル、アルキルア
ミンオキサイド等の非イオン性界面活性剤も配分出来る
、また、アルキルトリメチル第4級アンモニウム塩、ジ
アルキルジメチル第4級アンモニウム塩等々の陽イオン
性界面活性剤も必要により配合してもよい。 これら界面活性剤は、一種若しくは二種以上混合して使
用出来2好ましくは洗浄剤組成物中に10重量%(以下
%で示す)以上含有するのがよい。 (2)二価金属イオン捕捉剤 下記の各種アルカリ金属塩、アルカノール7ミン塩の一
種又は二種以上のビルダー成分を0〜50%含有するこ
ともできる。 オルソリン酸塩、ビロリン酸塩、1−リボリリン酸塩、
メタリン酸塩、ヘキサメタリン酸塩、フィチン酸塩等の
リン酸塩。 ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩等のアミ
ノポリ酢酸塩、ポリアクリル酸、ポリマレイン酸ポリア
セタールカルボキシレートなどの高分子電解質、クエン
酸、コハク酸、スルホコハク酸等の有機カルボン酸塩、
?ルミ、ノケイ酸塩、アスパラギン酸、グルタミン酸等
のアミノ酸塩な乙 (3)アルカリ削成るいは無4!&電M質更にアルカリ
剤あるいは無機電解質として次に示すものの各種のアル
カリ金属塩の一種又は二挿具」二を組成物中1・〜・5
0%、好ましくは5−30%含有することができる。ゲ
イV塩、JA酢酸塩硫酸塩。 又、有機アルカリ剤として、トリ′f−タノールアミン
、ジエタノ・−ルアミン、モノエタノールアミン、トリ
イソプロパツールアミンなど。 (4)再汚染防止剤 更に再汚染防止剤として次に示す化合物の一=種又は二
種以上を組成物中に0.1.−=−5%含有することが
できる6ポリエチ1ノングリコール、ポリビニルアルコ
ール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロ
ースなど。 なかでも、カルボキシメチルセルロースあるいは及びポ
リエチレングリコ・−ルと本発明に係るエンド型アルカ
リ性セルラーゼどの併用は、どろんこ汚れ除去に相乗的
効果を奏する。 (5)漂白剤 過炭酸ソーダ、過炭酸ソーダ、硫酸すトリウム過酸化水
素付加体、塩化す1−リウム過酸化水素付加体などの漂
白剤あるいは/及び、スルホン化フタロシアニン亜鉛塩
、あるいはアルミニウム塩等の光感応性の漂白性色素等
と本発明に係るエンド型アルカリ性セルラーゼとの併用
は、洗浄効果を一段と向上させる。 (6)酵素(本来的酵素作用を洗浄工程中になす酵素で
ある) 酵素の反応性から分類すると、ヒドロラーゼ類、リアー
ゼ類、オキシドレダクターゼ類、リガーゼ類、1−ラン
スフェラーゼ類及びイソメラーゼ類が挙げられるが、本
発明には何れも適用できる。特に好ましいのはヒドロラ
ーゼ類であり、プロテアーゼ、エステラーゼ、カルボヒ
ドラーゼ及びヌクレアーゼが含まれる。 (7)青味付剤及び蛍光染料 各種の青味付剤及び蛍光染料なども必要に応じて配合で
きる。 (8)ケーキング防止剤 粉末洗剤の場合には、次のようなケーキング防止剤も配
合できる。パラトルエンスルホン酸塩。 キシレンスルホン酸塩、酢酸塩、スルホコハク順塩、タ
ルク、微粉末シリカ、粘土、カルシウム−シリケート(
例えばTohns−Manvil1社のマイクロでルな
と)、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム等々。 (9)酸化防止剤 第3ブチルヒドロキシトルエン、4,4′−ブチリデン
ビス−・(6−第3ブチル−3−メチルフェノール)、
2.2′−ブチリデンビス−(6−第3ブチル−4−メ
チルフェノール)、モノスチレン化り1ノゾール、ジス
チレン化クレゾール、モノスチレン化フェノール、ジス
チレン化フェノール、1.1′〜ビス−(4−ヒドロキ
シフェニル)シクロヘキザン等の酸化防11−剤。 (10)可溶化剤 エタノールのような低級アルコール、ベンゼンスルホン
酸塩、p−トルエンスルホン酸塩のような低級アルキル
ベンゼンスルホン酸塩、プロピレングリコールのような
グリコール類、アセチルベンぜンスルホン酸塩、アセト
アミド類、ピリジンジカルボン酸アミド類、安息香酸塩
又は尿素などの可溶化剤。 本発明の大きな利点は、従来の洗浄剤では十分に落とす
ことができなかった無機固体汚れ、例えば微細な泥汚れ
に特に洗浄効果があるのを初めどじて襟、袖口の汚れ、
演じみ等々の汚れに対しても有効であり、更に無燐或い
は低燐洗剤の洗浄力向上に非常に役立つことにある。繊
維と繊維の間にもぐりこんだ微細などろんこ汚れの除去
は燐酸塩で有効であった。ところが、富栄養化問題で燐
酸塩配合量が逓減化の傾向にあ(]、一部は!I!、燐
化を余儀なくされた結果、どろんこ汚れの除去は至難と
なってきた。特に、木綿布にもぐりこんだどろ汚九は全
く除去しにくいことは周知の通りである。また、木綿混
紡布から成るズックにこびりついたどる汚れも主婦の悩
みの種である。 本発明の洗浄剤はこのような課題の解決に光明をもたら
すものである。即ぢ、セルロース繊維及びそれと他の種
類の繊維との混紡布のどろんこ汚れを洗浄する際に、例
えば(1)アルカリ性の無燐或いは低燐洗剤に本発明を
適用する。′:とにより。 (2)弱アルカリ液体無燐、洗剤に本発明を適用するこ
とにより、燐酸塩を充分含有する弱アルカリ性粉末洗剤
と同等以」−の優れた洗浄力が得られる7本発明の別の
大きな利点は、如何なる形態の洗浄剤にも適用できるこ
とにある。噴S乾燥粉末粉末ブレンド粉末、錠剤、液体
等の色々な形態にアルカリセルラーゼを添加
浄剤組成物に関する。 (従来の技術) 近年、衣料の洗浄に関して、著しい発達がみられた。即
ち、洗剤に適した原料の開発、水質の改善、洗浄機械の
改良と普及、繊維の改良等によって衣料の洗浄は著しく
容易になってきた。なかでも、洗剤用原料の改良はめざ
ましく、界面活性剤、ビルダー、分散剤、蛍光染料、漂
白剤等の改質によって、衣料用洗剤の組成は、はぼ完成
の域に達したかの感がある。しかし乍ら衣料用洗剤開発
の背景にある思想は、(1)汚れ成るいは/及び繊維表
面に界面活性剤やビルダーが吸着することにより、汚れ
成るいは/及び繊維と水との間の界面張力を低下させ、
汚れと繊維を物理化学的に引き雌す、(2)汚れを界面
活性剤、無機ビルダーで分散、可溶化する。(3)汚れ
をプロテアーゼ等の酵素で化学的に分解する、(4)着
色汚れを漂白剤等で漂白する、(5)繊維表面に蛍光染
料等を吸着させで、増白する、(6)洗浄に有効な成分
の二価金属イオンによる沈澱をキレート剤で防止する等
に要約される。 即ち、従来の衣料洗浄の基本は汚れを直接に攻撃する成
分若しくは該成分の功撃力を補助する成分を如何に洗浄
剤組成物の一成分どして有効に取り入れるかということ
にあった、 (発明が解決しようとする問題点) しかしながら、現在、該基本に基づいた洗浄剤組成物で
は、ある意味においてその洗浄性能はほぼ飽和点に達し
ており、更に高い洗浄力を有する洗浄剤組成物の開発が
望まれていた。 斯様な観点にたち本発明者らは、新規な洗浄機序を与え
る物質としてアルカリ性セルラーゼを見い出し、該酵素
を産生ずる微生物としてストレプトマイセス・エスピー
(StreptolIyces sp、)にSM−2(
微工研菌寄第7621号)、ストレプトマイセス・エス
ピー(Streptorayces sp、)にS?f
−9(微工研菌寄第7622号)を見い出した。 しかしながら、これら微生物の産生するアルカリ性セル
ラーゼは、エキソ(exo)型およびエンド(endo
)型セルラーゼの混合物であって、しかも、その生産性
は低いものであった。 (問題点を解決するための手段) 本発明者らは、ストレプトマイセス属に属するアルカリ
性セルラーゼ生産菌のアルカリ性セルラーゼを生産する
染色体遺伝子部位を、遺伝子工学の遺伝子クローニング
法でクローニングし、エンド型アルカリ性セルラーゼの
みを生成させることに成功し本発明を完成した。 すなわち、本発明はストレプトマイセス属に属するエン
ド型アルカリ性セルラーゼ生産菌が生産するエンド型ア
ルカリ性セルラーゼを含有する洗浄剤組成物に関するも
のである。 本発明に用いるエンド型アルカリ性セルラーゼは、スト
レプトマイセス属に属するアルカリ性セルラーゼ生産菌
のエンド型アルカリ性セルラーゼ生産性染色体DNAを
含有せしめてなる絹換えベクターによって形質転換され
たス1−レプ1へマイセス属に属するエンド型アルカリ
性セルラーゼ生産菌を培養した培地から回収採取するこ
とにより生産される。 ストレプトマイセス属に属するアルカリ性セルラーゼ生
産菌からのエンド型アルカリセルラーゼの生産に関与す
る染色体DNAの調製は、特に限定されない0例えば、
リゾチーム等で細胞壁を溶解後、界面活性剤を用いてお
だやかに溶菌し、無細胞抽出液を得る。ついで遠心によ
って菌体人糞とDNA画分を分離し、さらに塩化セシウ
ム平衡密度勾配遠心法でDNA画分を得る。 もしくは、SDS等の界面活性剤によって溶菌後、フェ
ノール処理、クロロホルム処理を行い、DNA画分を精
製分離したのち、エタノール沈澱によってDNAを得る
。 調製された供与染色体DNAは、次いでベクターと連結
されるために切断される。供与染色体の切断は、通常制
限エンドヌクレアーゼを用いる方法によって実施される
が、特にこの方法に限定されるものではなく、例えば、
物理的に剪断力を加えて切断する方法でもよい。制限酵
素を使用し供与DNAを切断する場合、完全切断をおこ
す反応条件を用いるのであればアルカリ性セルラーゼ遺
伝子に切断部位を持たない制限エンドヌクレアーゼであ
れば如何なるものでも使用可能である。また、部分的に
しか切断を起さない反応条件を用いるのであれば、全て
の制限エンドヌクレアーゼが使用可能である。斯様に制
限酵素は用いる条件に応じて種々のものが選択可能では
あるが、ベクターとの連結の容易さからは使用するベク
ターに唯一の切断部位を有する制限酵素を使用するのが
よい。例えばI’st I、 Dam旧、 Sac I
、Kpn I、BgQ n等が使用可能である。 一方、ベクターとしては、宿主として使用するストレプ
トマイセス属微生物中で複製可能なものであれば、プラ
スミド若しくはファージの区別なく使用することができ
る。 ベクターとしてプラスミドを使用する場合、宿主中にお
いて複製可能なものであれば如何なるものでもよいが、
特定の制限酵素による唯一の切断部位を有し、抗生物質
耐性等のマーカーを有するものが、供与染色体との結合
および形質転換株の選択容易性から望ましい。プラスミ
ドの例示としては、すでに公知となっているストーブ1
−ミセス属微生物から得られたpJcPlll、pIJ
41. pIJ61、pIJ361、pIJ702.
pIJ365、p I J 385などがあげられる。 切断された供与染色体DNAを、ベクターに挿入し結合
させる為には、供与染色体DNAとベクターとを同一の
制限酵素で切断し、然る後に、DNAリガーゼを使用し
両者を結合するのが一般的に使用される方法である。し
かし、斯様な方法に限定されることな〈従来知られてい
る如何なる方法でも実施は可能である。 DNAリガーゼの例示としては、大腸菌のDNAリガー
ゼ及びT4ファージのDNAリガーゼがあげられる。 斯様にして調製された供与染色体DNA断片とベクター
との結合体である組換えベクターは、次いで、宿主であ
るストレプトマイセス属微生物に導入される。 宿主として使用されるストレプトマイセス属微生物は、
本発明の実施目的に応じて種々のものが適宜選択して使
用可能であ、る。 選らばれた宿主微生物であるス1−レブトマイセス属微
生物への組換λベクターの導入、すなわち形質転換法は
、特に限定されないが、プロトプラスト形質転換法が最
適である。 形質転換株から目的とするエンド型アルカリ性セルラー
ゼ遺伝子若しくはエンド型アルカリ性セルラーゼ遺伝子
を含む供与染色体DNA断片が導入された微生物を選択
・分離する方法は特に限定されないが、ベクターが有す
る抗生物質耐性等のマーカー発現を利用し第一次的に選
択し次いで宿主のエンド型アルカリ性セルラーゼ活性を
指標とする第2次的選択をする方法が好適である。 かくして最終的に選択された形質転換株を使用したエン
ド型アルカリ性セルラーゼの培養液中での蓄積、回収、
精製法については特に制限はない。 培養で使用する培地の組成は、使用する菌株が良好に生
育し、エンド型アルカリ性セルラーゼの生産を順調に行
なわしめるために適当な炭素源、窒素源あるいは有機栄
養源、無機塩等からなっている。炭素源としては、例え
ばカルボキシメチルセルロース(CMC)等の可溶性繊
維素誘導体、バルブ粉末、口紙粉末、アビセル等の固型
繊維素等のセルロース等;グルコ・−ス、フラクト・−
ス、シュクロース若しくはソルビl−−ル等の炭水化物
;クエン酸、コハク酸等の有機酸;n−ドデカン、n−
ヘキサデカン等の炭化水素等々の資化されるものであれ
ばいずれも使用できる。これら炭素源のうちではセルロ
ース等、就中、可溶性繊維素誘導体を使用した培地はエ
ンド型アルカリ性セルラーゼの生産量も多く好適である
。 本発明の製造例において、遺伝子操作によって得た例示
のプラスミドpCAS1 を用いて得た形質転換体、ス
トレプトマイセス・リビダンスIIH21Na1(pC
ASI)、FHRM P−8276の生産するエンド型
アルカリ性セルラーゼの理化学的性質を示すと、次の通
りである。 1゜作用:カルボキシメチルセルロース(CMC)等の
セルロースを、エンド(endo)型の機作で分解し粘
度低下をきたす、これに対し還元糖の生成はほとんど認
められない。 2、 基’11異性: CMC等のセルロースに対し
て特異的に作用する。 3、至適pH: pH8付近でCMCに対する作用が至
適である。第2図に示す通りである。 4、安定pH範囲:30℃で48時間処理した場合、p
116〜11において、CMCに対し90%以上の残存
活性を示す、第3図に示す通りである。 5、至適温度:pH8において、CMCを基質とした場
合、45℃付近である。第4図に示す通りである。 6゜熱安定性:pH8において40℃1時間処理におい
て90%以上活性が残存する。第5図に示す通りである
。 本発明のエンド型アルカリ性セルラーゼの酵素活性は、
カルボキシメチルセルロース(CMC)を基質とした時
、はとんど還元糖を生成しないため以下に述べるエンド
型CMCase活性測定方法に従い決定した。 すなわち、和光純薬製CMC1,0%溶液3mfl。 グリシンバッファー 0.5M溶液(pH8) 2mQ
、イオン交換水3mMを混合し、ウベローデ型粘度計中
にて40℃に保つ、これに酵素溶液11を加え、すばや
く撹拌後粘度を測定しこの時の値をV、とする740℃
で5分間静置後再び粘度を測定しこの時の値をV2とす
る。 V、 −Vl の値が1 est/winを示した時をエンド型CMC
ase1ユニットとした。 本発明の洗浄剤組成物は、エンド型アルカリ性セルラー
ゼを組成物1kgに対して50ユニット以−ヒ、25
、000ユニッ1−以下で配合することが好ましく、別
の表現をすれば洗浄剤組成物を水に溶かした後は、洗た
く液1リットル中に0.067ユニツト以し、33ユニ
ツトへ下となるように、エンド型アルカリ性セルラーゼ
を洗浄剤組成物に配合することが好ましい。 本発明の洗浄剤組成物にはエンド型アルカリ性セルラー
ゼ以外の成分は特に限定されない。 例えば、公知の次の諸成分なら本来のその効果の必要に
応じて任意に配合される。 (1)界面活性剤 アルキルベンゼンスルホン酸塩、ポリオキシアルキレン
(C−2若しくは3)アルキル又はアルケニルエーテル
硫酸エステル塩、アルキル又はアルケニル硫酸エステル
塩、オレフィンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩、
高級脂肪酸塩、アルキル又はアルケニルエーテルカルボ
ン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩又はそのエステル化物等々
の平均炭素数8〜20のアルキル又はアルケニル鎖を有
する陰イオン性界面活性剤。 、二二で、陰イオン性界面活性剤の対イオンとしてはナ
トリウム、カリウム等のアルカリ金属イオン、カルシウ
ム、マグネシウム等のアルカリ土類金属イオン、アンモ
ニウムイオン炭素数2又は;3のアルカノール基を1〜
3個有するアルカノールアミン(例えばモノエタノール
アミン、ジェタノールアミン、トリエタノールアミン、
1−リイソプロパノールアミンなど)を挙げることがで
きる。 更に、スルホン酸型、ベタイン型等の両性界面活性剤、
ポリオキシエチレンアルキル又はアルケニルエーテル、
ポリオキシエチレンアルキル又はアルケニルフェニルエ
ーテル、ポリオキシプロピレン・ポリオキシエチレン共
重合物のアルキル又はアルケニルエーテル、高級脂肪酸
アルカノールアミド、蔗糖脂肪酸エステル、アルキルア
ミンオキサイド等の非イオン性界面活性剤も配分出来る
、また、アルキルトリメチル第4級アンモニウム塩、ジ
アルキルジメチル第4級アンモニウム塩等々の陽イオン
性界面活性剤も必要により配合してもよい。 これら界面活性剤は、一種若しくは二種以上混合して使
用出来2好ましくは洗浄剤組成物中に10重量%(以下
%で示す)以上含有するのがよい。 (2)二価金属イオン捕捉剤 下記の各種アルカリ金属塩、アルカノール7ミン塩の一
種又は二種以上のビルダー成分を0〜50%含有するこ
ともできる。 オルソリン酸塩、ビロリン酸塩、1−リボリリン酸塩、
メタリン酸塩、ヘキサメタリン酸塩、フィチン酸塩等の
リン酸塩。 ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩等のアミ
ノポリ酢酸塩、ポリアクリル酸、ポリマレイン酸ポリア
セタールカルボキシレートなどの高分子電解質、クエン
酸、コハク酸、スルホコハク酸等の有機カルボン酸塩、
?ルミ、ノケイ酸塩、アスパラギン酸、グルタミン酸等
のアミノ酸塩な乙 (3)アルカリ削成るいは無4!&電M質更にアルカリ
剤あるいは無機電解質として次に示すものの各種のアル
カリ金属塩の一種又は二挿具」二を組成物中1・〜・5
0%、好ましくは5−30%含有することができる。ゲ
イV塩、JA酢酸塩硫酸塩。 又、有機アルカリ剤として、トリ′f−タノールアミン
、ジエタノ・−ルアミン、モノエタノールアミン、トリ
イソプロパツールアミンなど。 (4)再汚染防止剤 更に再汚染防止剤として次に示す化合物の一=種又は二
種以上を組成物中に0.1.−=−5%含有することが
できる6ポリエチ1ノングリコール、ポリビニルアルコ
ール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロ
ースなど。 なかでも、カルボキシメチルセルロースあるいは及びポ
リエチレングリコ・−ルと本発明に係るエンド型アルカ
リ性セルラーゼどの併用は、どろんこ汚れ除去に相乗的
効果を奏する。 (5)漂白剤 過炭酸ソーダ、過炭酸ソーダ、硫酸すトリウム過酸化水
素付加体、塩化す1−リウム過酸化水素付加体などの漂
白剤あるいは/及び、スルホン化フタロシアニン亜鉛塩
、あるいはアルミニウム塩等の光感応性の漂白性色素等
と本発明に係るエンド型アルカリ性セルラーゼとの併用
は、洗浄効果を一段と向上させる。 (6)酵素(本来的酵素作用を洗浄工程中になす酵素で
ある) 酵素の反応性から分類すると、ヒドロラーゼ類、リアー
ゼ類、オキシドレダクターゼ類、リガーゼ類、1−ラン
スフェラーゼ類及びイソメラーゼ類が挙げられるが、本
発明には何れも適用できる。特に好ましいのはヒドロラ
ーゼ類であり、プロテアーゼ、エステラーゼ、カルボヒ
ドラーゼ及びヌクレアーゼが含まれる。 (7)青味付剤及び蛍光染料 各種の青味付剤及び蛍光染料なども必要に応じて配合で
きる。 (8)ケーキング防止剤 粉末洗剤の場合には、次のようなケーキング防止剤も配
合できる。パラトルエンスルホン酸塩。 キシレンスルホン酸塩、酢酸塩、スルホコハク順塩、タ
ルク、微粉末シリカ、粘土、カルシウム−シリケート(
例えばTohns−Manvil1社のマイクロでルな
と)、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム等々。 (9)酸化防止剤 第3ブチルヒドロキシトルエン、4,4′−ブチリデン
ビス−・(6−第3ブチル−3−メチルフェノール)、
2.2′−ブチリデンビス−(6−第3ブチル−4−メ
チルフェノール)、モノスチレン化り1ノゾール、ジス
チレン化クレゾール、モノスチレン化フェノール、ジス
チレン化フェノール、1.1′〜ビス−(4−ヒドロキ
シフェニル)シクロヘキザン等の酸化防11−剤。 (10)可溶化剤 エタノールのような低級アルコール、ベンゼンスルホン
酸塩、p−トルエンスルホン酸塩のような低級アルキル
ベンゼンスルホン酸塩、プロピレングリコールのような
グリコール類、アセチルベンぜンスルホン酸塩、アセト
アミド類、ピリジンジカルボン酸アミド類、安息香酸塩
又は尿素などの可溶化剤。 本発明の大きな利点は、従来の洗浄剤では十分に落とす
ことができなかった無機固体汚れ、例えば微細な泥汚れ
に特に洗浄効果があるのを初めどじて襟、袖口の汚れ、
演じみ等々の汚れに対しても有効であり、更に無燐或い
は低燐洗剤の洗浄力向上に非常に役立つことにある。繊
維と繊維の間にもぐりこんだ微細などろんこ汚れの除去
は燐酸塩で有効であった。ところが、富栄養化問題で燐
酸塩配合量が逓減化の傾向にあ(]、一部は!I!、燐
化を余儀なくされた結果、どろんこ汚れの除去は至難と
なってきた。特に、木綿布にもぐりこんだどろ汚九は全
く除去しにくいことは周知の通りである。また、木綿混
紡布から成るズックにこびりついたどる汚れも主婦の悩
みの種である。 本発明の洗浄剤はこのような課題の解決に光明をもたら
すものである。即ぢ、セルロース繊維及びそれと他の種
類の繊維との混紡布のどろんこ汚れを洗浄する際に、例
えば(1)アルカリ性の無燐或いは低燐洗剤に本発明を
適用する。′:とにより。 (2)弱アルカリ液体無燐、洗剤に本発明を適用するこ
とにより、燐酸塩を充分含有する弱アルカリ性粉末洗剤
と同等以」−の優れた洗浄力が得られる7本発明の別の
大きな利点は、如何なる形態の洗浄剤にも適用できるこ
とにある。噴S乾燥粉末粉末ブレンド粉末、錠剤、液体
等の色々な形態にアルカリセルラーゼを添加
【、2て本
発明品を得ることができる。 (作 用) 洗浄剤の技術分野においで酵素を使用することは公知で
あるが、その酵素は特に汚れに対して有効に作用するも
ののみが知られているにすぎない。 即ち、蛋白汚れに対してはプロテアーゼが、澱粉汚れに
対し、ではアミラーゼが更には油脂汚れに対してはリパ
ーゼが知られており何れも汚れに直接に功撃する酵素で
ある。本発明におけるエンド型アルカリ性セルラーゼの
洗浄[作は如何なるものか未だ完全には解明されていな
いが、界面活性剤にその本質をみることのできる繊維の
単なる膨潤作用に基づくものではない。 (発明の効果) ストレプトマイセス属に14するアルカリ性セルラーゼ
生産菌より誘導された形質転換体の生産するエンド型ア
ルカリ性セルラーゼは、洗浄剤就中衣料用洗浄剤に配合
された場合、衣料汚れ特に衿布、袖口汚れ、更にはズッ
ク靴等の汚れに対して顕著な洗浄効果を発揮する。 次に本発明の創製例及び実施例を示す。 創製例1.(染色体DNAの!J!J製法)ストシブ1
−マイセス・エスピーKSM−9(FERM P762
0)より染色体DNAを調製する際には100mflの
M Y / N a 2 C03培地(肉エキス1.5
%、酵母エキス0.5%、 K112PO40,1%、
Na2Co、 0.2%)、で生育させた菌体を集菌、
洗浄後、8n+Qの25%シュークロース5(hM ト
リス−塩酸、2011M EDTA(pH8,0)のバ
ッファーに懸濁し3゜21のEDTA (p、 H8,
O)と5111gのりゾチームを加え、37℃で1−時
間静置した後、2tQの10%S D Sを加え溶菌さ
せた。これに5MNaCffを41加え、0℃で3時間
静置した後、48,000gで1時間遠心しクリアート
ライゼートを得、PEG 6000を終濃度10%にな
るように加えてDNAを沈殿させ、これをTEバッファ
ーに溶解し、塩化セシウム密慶勾配遠心により染色体D
NAとプラスミドI〕NAを単離した。 創製例2.(組換えプラスミドの構築と調製)創製例1
で得られた染色体DNAをPst Iにて、37℃、2
時間の完全分解を行う。別にプラスミドplJ385も
Psj、1にて同様に完全分解を行う。 ついで、両者を混合し、フェノール抽出後、エタノール
沈殿を行なった後、リゲーションを行う。 ノゲ・−ジョンはT4リガーゼを用いて12℃で12時
間反応を行なった。 リゲーションが完全に行なわれたことは、アガロースゲ
ル電気泳動によって確認した。 創製例3.(受容菌の分離) 形質転換の受容菌としてはスト1ノプトマイセス・リビ
ダンスHH21株を用いるが、本菌はCMCaseの生
産性を有する為、そのままでは受容菌として用いること
が出来ない、そこでCMCase欠損変異株の誘導を行
なった。 ストレプトマイセス・リビダンス+()121の胞子を
0゜05阿リン酸バツフアー・(pH7,0)に良く分
散させた後、 NTG(N−メチル−N′−二l−ロー
N−ニトロソグアニジン)を500gになるように加え
、30℃で1時間振盪する。これを生理食塩水で希釈し
、CMCを含有する8M寒天培地にブレーティングする
。 コロニー形成させた後、コンゴーレッド染色法でハロー
形成能が低下した菌を選択した。 完全なCMCase欠損株は得られなかったが、野性株
の175以下にハロ・−径が低下した株を分離し、スト
レプトマイセス・リビダンスH)121 N(11株と
命名した。 創製例4、(プロトプラスト調製と形質転換)プロトプ
ラスト調製及び形質転換はビブ(Bibb)らの方法(
ビブ、エム・ジェイ;ジエイ・エム・ワードとデイ・ニ
ー・ホープウッド(Bibb、 M、 J、 ;J、
M、 Ward& D、 A、 Hopwond) ・
ネイチャー(Nature) 274.398〜400
1978)に従った。 すなわちS培地で生育させた菌体を集菌し、0.3Mシ
ュークローズで洗浄した後、2mg/mQリゾチーム(
次に示すP培地に溶解)に@濁し30℃で1−時間静置
してプロトプラスト化する。 (P培地) シュークロース 103gK、5o40
.25g Mg(J26H,02,03g K)12PO,IO、05g CaCQ、 ・21!20 3.6
8gT E S (0,25M pH7,2)
]、000mff水
IQこれを綿濾過により残存菌糸体と分
難し、遠心によりプロトプラストを得た。さらにP培地
で良く洗浄後、少量のP培地に懸濁し2、そこで実施例
2で調製したDNAを加え、終濃度20%になるように
ポリエチレングリコール#1000 を加え、DNAを
取り込まぜた。これをP培地で希釈、遠心後、次に示す
R2YIE寒天培地にまいて再生させた。 (R2YE寒天培地) シュークローズ 103 gKzS0
40−25g HgCQ、・61!20 10.1
2gCaCQ2・2H202,95g KH2PO40,05g グルコース 10gカザミノ酸
0.1 g酵母エキス
5g l、−アスパラギン 3gT E S
100n+Q寒天
22 g水
IQ形質転換株はR2YE寒
天培地」二で充分に胞子が着生した後、これをチオスト
レプトン30g含む、次に示すBに寒天培地にレプリカ
することにより選択した。 (8M寒天培地) 酵母エキス 1g肉エキス
1gNZアミン(type A
) 2gマルトース
LogCM C10g 寒天 20g水
lQ目的の
CMCase遺伝子を有する株は、コンゴーレッド染色
法によりCMC含有寒天平板上で透明なハローをコロニ
ー周辺に形成する。生成したハローのうち、最大のハロ
ーを生成した該当菌株を分離し、これをストレプトマイ
セス・リビダンスHH21Nttl(pcAsl)と命
名した。本菌株はFERM P−8276として微工研
に寄託された。 創製例5.(プラスミドpCAS1の確認)ストレプ[
・マイセス・リビダンス4団21N(11(PCASI
)、FERM P−8276をMY培地で30℃で、3
日間培養し、培養菌体を溶菌し、超遠心分難後、クリア
ートライゼートを塩化セシウム密度勾配遠心にかけるこ
とにより、プラスミドpCAS 1の存在が確認された
。プラスミドpcAs1の開裂地図は第1図に示す。制
限酵素を用いた解析によりプラスミドpcAs1にはス
トレプトマイセス・エスピーKSM−9に由来する3、
4にbの挿入断片を有することが確認された。 製造例(エンド型アルカリ性セルラーゼの生産)肉エキ
ス、1.5%(u/V)、酵母エキX O,5% (W
/V)、リン酸二水素カリウム0.1%(W/V)、炭
酸ナトリウム0.2%(lit/V) (別滅歯)を5
00mff容坂ロフラスコに入れ滅菌後、PCASIを
有するストシブ1−コツカス・リビダンスHH21N[
11(PCASI)、 FERN P−8276を接種
し、30℃、4日間振盪培養した後、培養液から遠心分
離によって菌体を除去した上清液のエンド型CMCas
e活性を粘度低下法によって測定したところ、0.10
6 cst/mj、nのエンド型CMCase活性どし
てエンド型アルカリ性セルラーゼが得られた。 実施例1゜ 本実施例をもって天然エリ垢汚染布に対して、エンド型
アルカリ性セルラーゼが特に有効であることを示す。 1)洗剤配合 直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ソーダ(C1,〜、い
1l=1.0モル) アルキル硫酸ソーダ(014〜1− 石ケン(牛脂肪酸ソーダ) 結晶性アルミノケイ酸ソーダ ケイ酸ソーダ 炭酸ソーダ カルボキシメチルセルロース ポリエチレングリコール(MW6000)蛍光染料 香 料 芒 硝 水 分 12(鱈4%) 2)天然えり布汚染布: 木綿金型Jt2023布をワイシャツの襟に縫い付け、
成年男子に2日間着用させる。着用後中心点に対し汚れ
が対称な布を選び出し、この汚れの対称点で布を半裁し
実験に供した。 3)洗浄条件及び方法 天然汚染布を洗浄する場合、90m X 30cmの天
然汚染布を対称の位置で半裁し、9 cm X 15c
mの一対の汚染布の一方を基準洗浄し、片方を比較洗剤
である本発明の洗剤でそれぞれ洗浄した。まず天然汚染
布片15枚を50em X 50cmの綿布に縫い付け
、粉末洗剤の場合には8Qの0.665%の洗剤溶液に
入れ30℃で1時間浸漬後東芝製洗濯機「銀河」に移し
綿製肌着800gr、ポリエステル綿混(65%/35
%)IlYシャツ500grを加えた後、全量を40Q
とした後備反転で10分間洗浄し、脱水、すすぎを充分
にした後、乾燥後判定に供した。 基準洗剤で洗った半裁布と本発明の洗剤で洗った半裁布
とを肉眼判定による1対比較で評価した。 汚れの程度を表わす10段階にランクづけした標準汚れ
を基準にし、洗浄布をランクづけした。洗浄性は基準洗
剤の洗浄力を100としたときの本発明の洗剤の洗浄力
の点数で表わした。洗浄力指数の差は0.5以上で有意
の差とみなせる。 4)結果 表 実施例2゜ 更に本発明のエンド型アルカリ性セルラーゼを。 液体洗浄剤組成物及び漂白剤含有洗浄剤組成物に配合し
、天然エリ垢汚染布の洗浄効果を確認した。 1)洗剤配合 アルキル硫酸ソーダ 2ア
ルキルエトキシ硫酸ソーダ 20ノニオン
155石 鹸
】03トリポリリン酸ソーダ ケイ酸ソーダ 炭酸ソーダ 芒 硝 クエン酸ソーダ 3アルカノールア
ミン ポリエチjソングリコール 21エタノール
7過炭酸ソーダ
20蛍光染F40.2 0
.4 青味付剤 o.oos香 料
0。20.3水
バランス 5プロテアーゼ
0.5 0.5にエンド
型アルカリ性セルラーゼを配合した場合、いずれも無配
合だった場合に比較して優れた洗浄効果を示した。
発明品を得ることができる。 (作 用) 洗浄剤の技術分野においで酵素を使用することは公知で
あるが、その酵素は特に汚れに対して有効に作用するも
ののみが知られているにすぎない。 即ち、蛋白汚れに対してはプロテアーゼが、澱粉汚れに
対し、ではアミラーゼが更には油脂汚れに対してはリパ
ーゼが知られており何れも汚れに直接に功撃する酵素で
ある。本発明におけるエンド型アルカリ性セルラーゼの
洗浄[作は如何なるものか未だ完全には解明されていな
いが、界面活性剤にその本質をみることのできる繊維の
単なる膨潤作用に基づくものではない。 (発明の効果) ストレプトマイセス属に14するアルカリ性セルラーゼ
生産菌より誘導された形質転換体の生産するエンド型ア
ルカリ性セルラーゼは、洗浄剤就中衣料用洗浄剤に配合
された場合、衣料汚れ特に衿布、袖口汚れ、更にはズッ
ク靴等の汚れに対して顕著な洗浄効果を発揮する。 次に本発明の創製例及び実施例を示す。 創製例1.(染色体DNAの!J!J製法)ストシブ1
−マイセス・エスピーKSM−9(FERM P762
0)より染色体DNAを調製する際には100mflの
M Y / N a 2 C03培地(肉エキス1.5
%、酵母エキス0.5%、 K112PO40,1%、
Na2Co、 0.2%)、で生育させた菌体を集菌、
洗浄後、8n+Qの25%シュークロース5(hM ト
リス−塩酸、2011M EDTA(pH8,0)のバ
ッファーに懸濁し3゜21のEDTA (p、 H8,
O)と5111gのりゾチームを加え、37℃で1−時
間静置した後、2tQの10%S D Sを加え溶菌さ
せた。これに5MNaCffを41加え、0℃で3時間
静置した後、48,000gで1時間遠心しクリアート
ライゼートを得、PEG 6000を終濃度10%にな
るように加えてDNAを沈殿させ、これをTEバッファ
ーに溶解し、塩化セシウム密慶勾配遠心により染色体D
NAとプラスミドI〕NAを単離した。 創製例2.(組換えプラスミドの構築と調製)創製例1
で得られた染色体DNAをPst Iにて、37℃、2
時間の完全分解を行う。別にプラスミドplJ385も
Psj、1にて同様に完全分解を行う。 ついで、両者を混合し、フェノール抽出後、エタノール
沈殿を行なった後、リゲーションを行う。 ノゲ・−ジョンはT4リガーゼを用いて12℃で12時
間反応を行なった。 リゲーションが完全に行なわれたことは、アガロースゲ
ル電気泳動によって確認した。 創製例3.(受容菌の分離) 形質転換の受容菌としてはスト1ノプトマイセス・リビ
ダンスHH21株を用いるが、本菌はCMCaseの生
産性を有する為、そのままでは受容菌として用いること
が出来ない、そこでCMCase欠損変異株の誘導を行
なった。 ストレプトマイセス・リビダンス+()121の胞子を
0゜05阿リン酸バツフアー・(pH7,0)に良く分
散させた後、 NTG(N−メチル−N′−二l−ロー
N−ニトロソグアニジン)を500gになるように加え
、30℃で1時間振盪する。これを生理食塩水で希釈し
、CMCを含有する8M寒天培地にブレーティングする
。 コロニー形成させた後、コンゴーレッド染色法でハロー
形成能が低下した菌を選択した。 完全なCMCase欠損株は得られなかったが、野性株
の175以下にハロ・−径が低下した株を分離し、スト
レプトマイセス・リビダンスH)121 N(11株と
命名した。 創製例4、(プロトプラスト調製と形質転換)プロトプ
ラスト調製及び形質転換はビブ(Bibb)らの方法(
ビブ、エム・ジェイ;ジエイ・エム・ワードとデイ・ニ
ー・ホープウッド(Bibb、 M、 J、 ;J、
M、 Ward& D、 A、 Hopwond) ・
ネイチャー(Nature) 274.398〜400
1978)に従った。 すなわちS培地で生育させた菌体を集菌し、0.3Mシ
ュークローズで洗浄した後、2mg/mQリゾチーム(
次に示すP培地に溶解)に@濁し30℃で1−時間静置
してプロトプラスト化する。 (P培地) シュークロース 103gK、5o40
.25g Mg(J26H,02,03g K)12PO,IO、05g CaCQ、 ・21!20 3.6
8gT E S (0,25M pH7,2)
]、000mff水
IQこれを綿濾過により残存菌糸体と分
難し、遠心によりプロトプラストを得た。さらにP培地
で良く洗浄後、少量のP培地に懸濁し2、そこで実施例
2で調製したDNAを加え、終濃度20%になるように
ポリエチレングリコール#1000 を加え、DNAを
取り込まぜた。これをP培地で希釈、遠心後、次に示す
R2YIE寒天培地にまいて再生させた。 (R2YE寒天培地) シュークローズ 103 gKzS0
40−25g HgCQ、・61!20 10.1
2gCaCQ2・2H202,95g KH2PO40,05g グルコース 10gカザミノ酸
0.1 g酵母エキス
5g l、−アスパラギン 3gT E S
100n+Q寒天
22 g水
IQ形質転換株はR2YE寒
天培地」二で充分に胞子が着生した後、これをチオスト
レプトン30g含む、次に示すBに寒天培地にレプリカ
することにより選択した。 (8M寒天培地) 酵母エキス 1g肉エキス
1gNZアミン(type A
) 2gマルトース
LogCM C10g 寒天 20g水
lQ目的の
CMCase遺伝子を有する株は、コンゴーレッド染色
法によりCMC含有寒天平板上で透明なハローをコロニ
ー周辺に形成する。生成したハローのうち、最大のハロ
ーを生成した該当菌株を分離し、これをストレプトマイ
セス・リビダンスHH21Nttl(pcAsl)と命
名した。本菌株はFERM P−8276として微工研
に寄託された。 創製例5.(プラスミドpCAS1の確認)ストレプ[
・マイセス・リビダンス4団21N(11(PCASI
)、FERM P−8276をMY培地で30℃で、3
日間培養し、培養菌体を溶菌し、超遠心分難後、クリア
ートライゼートを塩化セシウム密度勾配遠心にかけるこ
とにより、プラスミドpCAS 1の存在が確認された
。プラスミドpcAs1の開裂地図は第1図に示す。制
限酵素を用いた解析によりプラスミドpcAs1にはス
トレプトマイセス・エスピーKSM−9に由来する3、
4にbの挿入断片を有することが確認された。 製造例(エンド型アルカリ性セルラーゼの生産)肉エキ
ス、1.5%(u/V)、酵母エキX O,5% (W
/V)、リン酸二水素カリウム0.1%(W/V)、炭
酸ナトリウム0.2%(lit/V) (別滅歯)を5
00mff容坂ロフラスコに入れ滅菌後、PCASIを
有するストシブ1−コツカス・リビダンスHH21N[
11(PCASI)、 FERN P−8276を接種
し、30℃、4日間振盪培養した後、培養液から遠心分
離によって菌体を除去した上清液のエンド型CMCas
e活性を粘度低下法によって測定したところ、0.10
6 cst/mj、nのエンド型CMCase活性どし
てエンド型アルカリ性セルラーゼが得られた。 実施例1゜ 本実施例をもって天然エリ垢汚染布に対して、エンド型
アルカリ性セルラーゼが特に有効であることを示す。 1)洗剤配合 直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ソーダ(C1,〜、い
1l=1.0モル) アルキル硫酸ソーダ(014〜1− 石ケン(牛脂肪酸ソーダ) 結晶性アルミノケイ酸ソーダ ケイ酸ソーダ 炭酸ソーダ カルボキシメチルセルロース ポリエチレングリコール(MW6000)蛍光染料 香 料 芒 硝 水 分 12(鱈4%) 2)天然えり布汚染布: 木綿金型Jt2023布をワイシャツの襟に縫い付け、
成年男子に2日間着用させる。着用後中心点に対し汚れ
が対称な布を選び出し、この汚れの対称点で布を半裁し
実験に供した。 3)洗浄条件及び方法 天然汚染布を洗浄する場合、90m X 30cmの天
然汚染布を対称の位置で半裁し、9 cm X 15c
mの一対の汚染布の一方を基準洗浄し、片方を比較洗剤
である本発明の洗剤でそれぞれ洗浄した。まず天然汚染
布片15枚を50em X 50cmの綿布に縫い付け
、粉末洗剤の場合には8Qの0.665%の洗剤溶液に
入れ30℃で1時間浸漬後東芝製洗濯機「銀河」に移し
綿製肌着800gr、ポリエステル綿混(65%/35
%)IlYシャツ500grを加えた後、全量を40Q
とした後備反転で10分間洗浄し、脱水、すすぎを充分
にした後、乾燥後判定に供した。 基準洗剤で洗った半裁布と本発明の洗剤で洗った半裁布
とを肉眼判定による1対比較で評価した。 汚れの程度を表わす10段階にランクづけした標準汚れ
を基準にし、洗浄布をランクづけした。洗浄性は基準洗
剤の洗浄力を100としたときの本発明の洗剤の洗浄力
の点数で表わした。洗浄力指数の差は0.5以上で有意
の差とみなせる。 4)結果 表 実施例2゜ 更に本発明のエンド型アルカリ性セルラーゼを。 液体洗浄剤組成物及び漂白剤含有洗浄剤組成物に配合し
、天然エリ垢汚染布の洗浄効果を確認した。 1)洗剤配合 アルキル硫酸ソーダ 2ア
ルキルエトキシ硫酸ソーダ 20ノニオン
155石 鹸
】03トリポリリン酸ソーダ ケイ酸ソーダ 炭酸ソーダ 芒 硝 クエン酸ソーダ 3アルカノールア
ミン ポリエチjソングリコール 21エタノール
7過炭酸ソーダ
20蛍光染F40.2 0
.4 青味付剤 o.oos香 料
0。20.3水
バランス 5プロテアーゼ
0.5 0.5にエンド
型アルカリ性セルラーゼを配合した場合、いずれも無配
合だった場合に比較して優れた洗浄効果を示した。
第1図はプラスミドpcAs1の開裂地図を示す図であ
る。カッコ内はKbを表している。 第2図は、エンド型フルカリ性セルラーゼの作用,至適
pHを示す図で、第3図は、そのpH安定性を示す図で
、第4図は、その作用至適温度を示す図で、第5図は、
その温度安定性を示す図である。 代理人 弁理士 戸 1)親 男 2)天然エリ布汚染布及び洗浄条件、方法天然エリ布汚
染布の調整及び洗浄条件、方法は実施例1に順じた。 3)結果 液体洗浄剤組成物及び漂白剤含有洗浄剤組成物第 図 col、71 の 第 図 第 図 H 第 図 温 戻 (℃)
る。カッコ内はKbを表している。 第2図は、エンド型フルカリ性セルラーゼの作用,至適
pHを示す図で、第3図は、そのpH安定性を示す図で
、第4図は、その作用至適温度を示す図で、第5図は、
その温度安定性を示す図である。 代理人 弁理士 戸 1)親 男 2)天然エリ布汚染布及び洗浄条件、方法天然エリ布汚
染布の調整及び洗浄条件、方法は実施例1に順じた。 3)結果 液体洗浄剤組成物及び漂白剤含有洗浄剤組成物第 図 col、71 の 第 図 第 図 H 第 図 温 戻 (℃)
Claims (1)
- 1、ストレプトマイセス属に属するアルカリ性セルラー
ゼ生産菌のエンド型アルカリ性セルラーゼ生産性染色体
DNAを放線菌由来のベクターに含有せしめてなる組換
えベクターによって形質転換されたストレプトマイセス
属に属するエンド型アルカリ性セルラーゼ生産菌の産生
するエンド型アルカリ性セルラーゼを含有する洗浄剤組
成物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2506990A JPH02255898A (ja) | 1985-06-05 | 1990-02-06 | エンド型アルカリ性セルラーゼを含有する洗浄剤組成物 |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP12052185A JPS61280276A (ja) | 1985-06-05 | 1985-06-05 | エンド型アルカリ性セルラーゼ |
JP2506990A JPH02255898A (ja) | 1985-06-05 | 1990-02-06 | エンド型アルカリ性セルラーゼを含有する洗浄剤組成物 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP12052185A Division JPS61280276A (ja) | 1985-06-05 | 1985-06-05 | エンド型アルカリ性セルラーゼ |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02255898A true JPH02255898A (ja) | 1990-10-16 |
JPH059480B2 JPH059480B2 (ja) | 1993-02-05 |
Family
ID=26362665
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2506990A Granted JPH02255898A (ja) | 1985-06-05 | 1990-02-06 | エンド型アルカリ性セルラーゼを含有する洗浄剤組成物 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH02255898A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH11152494A (ja) * | 1997-11-21 | 1999-06-08 | Shin Etsu Chem Co Ltd | 衣類用洗剤組成物 |
US6403289B1 (en) | 1997-10-31 | 2002-06-11 | Nippon Zeon Co., Ltd. | Developer for photosensitive polyimide resin composition |
-
1990
- 1990-02-06 JP JP2506990A patent/JPH02255898A/ja active Granted
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6403289B1 (en) | 1997-10-31 | 2002-06-11 | Nippon Zeon Co., Ltd. | Developer for photosensitive polyimide resin composition |
JPH11152494A (ja) * | 1997-11-21 | 1999-06-08 | Shin Etsu Chem Co Ltd | 衣類用洗剤組成物 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH059480B2 (ja) | 1993-02-05 |
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