JPH0217200A - デス―17―ヒスチジンカルシトニン - Google Patents
デス―17―ヒスチジンカルシトニンInfo
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は生物学的活性をもつカルシトニンおよび生物学
に活性なカルシトニンに転化しうるペプチドに関し、ま
たこのようなペプチド及びカルシトニン類似体を製造す
る方法に関する。
に活性なカルシトニンに転化しうるペプチドに関し、ま
たこのようなペプチド及びカルシトニン類似体を製造す
る方法に関する。
周知の天然カルシトニン・ペプチドのすべては32個の
アミノ酸から成るアミノ酸系列を含む。天然のカルシ+
−二ンはサーモン、イール(うなぎ)、牛、豚、羊、ラ
ットおよびヒトに含まれるカルシトニンを包含する。た
とえばす−モン(さけ)のカルシトニンは次の構造式を
もつ。
アミノ酸から成るアミノ酸系列を含む。天然のカルシ+
−二ンはサーモン、イール(うなぎ)、牛、豚、羊、ラ
ットおよびヒトに含まれるカルシトニンを包含する。た
とえばす−モン(さけ)のカルシトニンは次の構造式を
もつ。
E−Cys−5et−Ass−Law−5ay−Thデ
ーC1a−Val−Las−Gly−Lye−Lms−
5et−Gin−Glu−Las−Hia−Lym−L
e111−Gin−The−Tyr−Pro−Arg−
Thr−Ass−Thr−Gly−5at−GLy−T
hr−Pra−NET本国特許43,926,938.
4,062,815.3.92へ758.4,033,
940.4,336,187.4,401゜593.4
,528.132には上記のサーモン・カルシトニンを
包含するカルシトニン類の改良合成法が記載されている
。
ーC1a−Val−Las−Gly−Lye−Lms−
5et−Gin−Glu−Las−Hia−Lym−L
e111−Gin−The−Tyr−Pro−Arg−
Thr−Ass−Thr−Gly−5at−GLy−T
hr−Pra−NET本国特許43,926,938.
4,062,815.3.92へ758.4,033,
940.4,336,187.4,401゜593.4
,528.132には上記のサーモン・カルシトニンを
包含するカルシトニン類の改良合成法が記載されている
。
〔発明が解決しようとする昧題とそのための手段〕我々
は周知のカルシトニン類と同じ生物学的活性をもつ31
個のアミノ酸系列の上記天然カルシトニン・ペプチドの
類縁体を発見した。この類縁体の構造上の主要な相違点
は、我々の新規なペプチドにおいて、17位のヒスチジ
ンがそのシーケンスから省略されていることにある。こ
れらの新規なペプチドはペプチド類の合成変性体のI
U P A C−IUP砧名法(Biochmm、 J
、、 (1984) 219.345.377〕?:使
用して、デス−17−ヒスチシンーカルシトニンと称さ
れる。
は周知のカルシトニン類と同じ生物学的活性をもつ31
個のアミノ酸系列の上記天然カルシトニン・ペプチドの
類縁体を発見した。この類縁体の構造上の主要な相違点
は、我々の新規なペプチドにおいて、17位のヒスチジ
ンがそのシーケンスから省略されていることにある。こ
れらの新規なペプチドはペプチド類の合成変性体のI
U P A C−IUP砧名法(Biochmm、 J
、、 (1984) 219.345.377〕?:使
用して、デス−17−ヒスチシンーカルシトニンと称さ
れる。
この新規なペプチドは公知のカルシトニンに比しより高
い力価と品質を有する。この新規なペプチドはカルシト
ニンの形成に通常要求される順序でアミンrItを加え
、17位からヒスチジンを省略することによってデス−
17−ヒスチシンーカルシトニンをつ(ることにより製
造される。
い力価と品質を有する。この新規なペプチドはカルシト
ニンの形成に通常要求される順序でアミンrItを加え
、17位からヒスチジンを省略することによってデス−
17−ヒスチシンーカルシトニンをつ(ることにより製
造される。
公知のサーモン力ルシトニンと同じタイプの茫性なもつ
本発明の新規デス−17−ヒスチシンーサーモンカルシ
トニンは次式で示されうる: Gin−Thr−Tyr−Pro−Arg−Thr−A
s9S−Thr−Gly−5at−Gly−Tkr−P
ro−NH。
本発明の新規デス−17−ヒスチシンーサーモンカルシ
トニンは次式で示されうる: Gin−Thr−Tyr−Pro−Arg−Thr−A
s9S−Thr−Gly−5at−Gly−Tkr−P
ro−NH。
本発明の新規なデス−17−ヒスチシンーイール(うな
ぎ)カルシトニンは次式で示されうる:モニカワ等はE
zparimsLiα、32(9)、1104−110
6(1976)で合成イールカルシトニンは約4300
1U/■の低カルシウム力価をもつが合成類縁体の(l
、7−アルファーム−アミノ−スペリン酸)イールカル
シトニンは約300IU/■の低カルシウム力価しかも
たないことを示している。
ぎ)カルシトニンは次式で示されうる:モニカワ等はE
zparimsLiα、32(9)、1104−110
6(1976)で合成イールカルシトニンは約4300
1U/■の低カルシウム力価をもつが合成類縁体の(l
、7−アルファーム−アミノ−スペリン酸)イールカル
シトニンは約300IU/■の低カルシウム力価しかも
たないことを示している。
それ故、本発明はまたサーモン、イール及びチキンカル
シトニンの30−アミノ酸類縁体(第1及び第47のシ
スティ/がα−L−アミノースペリン酸で置換され、ヒ
スチジン−16がシーケンスから省略されている)を包
含する。
シトニンの30−アミノ酸類縁体(第1及び第47のシ
スティ/がα−L−アミノースペリン酸で置換され、ヒ
スチジン−16がシーケンスから省略されている)を包
含する。
上式から明らかなように、31−アミノ酸がこの式に包
含され、これらのアミノ酸の位置は前述の命名法により
鎖の一端にあるCya の位置1で始まり鎖の他端のp
roの位M31で終るように番号が付けられている。記
述を簡明にするために、この番号付けを合成サイクルの
8ピ述の際に使用−jろ。アミノ酸の組立はスレオニン
のカップリングを含むサイクル31で始まる。
含され、これらのアミノ酸の位置は前述の命名法により
鎖の一端にあるCya の位置1で始まり鎖の他端のp
roの位M31で終るように番号が付けられている。記
述を簡明にするために、この番号付けを合成サイクルの
8ピ述の際に使用−jろ。アミノ酸の組立はスレオニン
のカップリングを含むサイクル31で始まる。
一般1ζ、我々は合成の固相方法論を使用し、ベンズヒ
ドリルアミン樹脂(BliA樹脂)と呼ばれる樹脂を使
用して出発する。この種の樹脂は周知であり、その製造
はPiattaら[Piatta、 P、S、 and
Marahall 、 G、R,。
ドリルアミン樹脂(BliA樹脂)と呼ばれる樹脂を使
用して出発する。この種の樹脂は周知であり、その製造
はPiattaら[Piatta、 P、S、 and
Marahall 、 G、R,。
Ckam、(、ommuss、、650(1970))
、およびオルロウスキーら(/、Org、(:’Agm
、、41.3701(1976))。Kよって記述され
ている。交差結合ポリスチレンBBA樹脂は化学薬品店
から入手しうる。我々はこのBli Aa1脂を表現す
るために次の表示を使用する。
、およびオルロウスキーら(/、Org、(:’Agm
、、41.3701(1976))。Kよって記述され
ている。交差結合ポリスチレンBBA樹脂は化学薬品店
から入手しうる。我々はこのBli Aa1脂を表現す
るために次の表示を使用する。
〔式中ののはこの樹脂のポリスプレン部分である。〕〔
樹脂ペプチド合成〕 この合成において、アミノ酸類は全ペプチド系列が樹脂
上く形成されるまで不溶性樹脂に1度に1個づつ加える
。
樹脂ペプチド合成〕 この合成において、アミノ酸類は全ペプチド系列が樹脂
上く形成されるまで不溶性樹脂に1度に1個づつ加える
。
アミノ酸の官能基はブロッキング基によって保護する。
アミノ酸のα−アミノ基は第3級ブチロキシカーボニル
基またはその均等物によって保護する。このα−第3級
ブチロキシカーボニル基をB (J C’と呼ぶ。セリ
ンおよびスレオニンのヒドロキシ官能基はベンジル基ま
たはベンジル誘導体基(たとえば4−メトキシベンジル
、4−メチルベンジル、3.4−ジifルヘ/シル、4
−クロロベンジル、2.6−ジクロロベンジル、4−ニ
トロベンジル、ベンズヒドリルまたはそれらの均等物)
によって保護する。このベンジル基またはベンジル誘導
体基を表わすためにBtなる語を用いる。
基またはその均等物によって保護する。このα−第3級
ブチロキシカーボニル基をB (J C’と呼ぶ。セリ
ンおよびスレオニンのヒドロキシ官能基はベンジル基ま
たはベンジル誘導体基(たとえば4−メトキシベンジル
、4−メチルベンジル、3.4−ジifルヘ/シル、4
−クロロベンジル、2.6−ジクロロベンジル、4−ニ
トロベンジル、ベンズヒドリルまたはそれらの均等物)
によって保護する。このベンジル基またはベンジル誘導
体基を表わすためにBtなる語を用いる。
チロシンのヒドロキシル官能基は非保護であってもよく
、あるいは上述のBf4のようなベンジル基またはベン
ジル誘導体基で保護してもよ(、あるいはベンジロキシ
カーボニルまたはベンジロキシカーボニル誘導体(たと
えば2−クロロベンジロキシカーボニルマタは2−ブロ
モベンジロキシカーボニル、あるいはそれらの均等物)
で保護してもよい。非保護基、B1基、ベンジロキシカ
ーボニル基、マたはベンジロキシカーボニル誘導体基の
いづれがを表すためにIFなる飴を用いる。
、あるいは上述のBf4のようなベンジル基またはベン
ジル誘導体基で保護してもよ(、あるいはベンジロキシ
カーボニルまたはベンジロキシカーボニル誘導体(たと
えば2−クロロベンジロキシカーボニルマタは2−ブロ
モベンジロキシカーボニル、あるいはそれらの均等物)
で保護してもよい。非保護基、B1基、ベンジロキシカ
ーボニル基、マたはベンジロキシカーボニル誘導体基の
いづれがを表すためにIFなる飴を用いる。
システィンのチオール官能基は上記のベンジル基または
ベンジル誘褥体保鏝基Bzによって又は爲−アルキルチ
オ基(たとえはメチルチオ、エチルチオ、外−プロピル
チオ、邦−ブチルチオまたはそれらの均等物)によって
保護することができる。我々は3−アルキルチオMi、
またはBfを表わすために文字R8を使用し、R2力i
−フルキルチオであるときのBtを表わすために及びR
1がBtであるときの外−アルキルチオを表わすために
文字R1を使用する。
ベンジル誘褥体保鏝基Bzによって又は爲−アルキルチ
オ基(たとえはメチルチオ、エチルチオ、外−プロピル
チオ、邦−ブチルチオまたはそれらの均等物)によって
保護することができる。我々は3−アルキルチオMi、
またはBfを表わすために文字R8を使用し、R2力i
−フルキルチオであるときのBtを表わすために及びR
1がBtであるときの外−アルキルチオを表わすために
文字R1を使用する。
アルギニンのグアニジン負託基はニトロ基、トシル基−
またを工それらの均等物によって保護することができる
。我々はニトロ基オたはトシル基のいづれかを表わすた
めに文字Tを使用する。リジンのイプシロン−アミノ官
能基はベンジロキシカーボニル基またはベンジロキシカ
ーボニル誘導体4体基(たとえば2−クロロベンジロキ
シカーボニル、3,4−ジメチルベンジロキシカーボニ
ル筐たはそれらの均等物)によって保護することができ
る。我々はベンジロキシカーボニル基またはベンジロキ
シカーボニル誘導体基を表わすために文字Vを使用する
。ヒスチジ/のイミダゾール141f。
またを工それらの均等物によって保護することができる
。我々はニトロ基オたはトシル基のいづれかを表わすた
めに文字Tを使用する。リジンのイプシロン−アミノ官
能基はベンジロキシカーボニル基またはベンジロキシカ
ーボニル誘導体4体基(たとえば2−クロロベンジロキ
シカーボニル、3,4−ジメチルベンジロキシカーボニ
ル筐たはそれらの均等物)によって保護することができ
る。我々はベンジロキシカーボニル基またはベンジロキ
シカーボニル誘導体基を表わすために文字Vを使用する
。ヒスチジ/のイミダゾール141f。
に使用する保護基はヒスチジンについて上述したような
ベンジロキシカーボニル基およびベンジロキシカーボニ
ル誘導体基であつ、同様に〆と呼ぶ。グルタミン酸のガ
ンマ−カルボン酸基はセリンおよびスレオニンのヒドロ
キシ官能基の保護について前述したようなベンジルまた
はペンジル基またはベンジル調導体基によって保護され
、これらの保護基は文字Bzによって表わされる。
ベンジロキシカーボニル基およびベンジロキシカーボニ
ル誘導体基であつ、同様に〆と呼ぶ。グルタミン酸のガ
ンマ−カルボン酸基はセリンおよびスレオニンのヒドロ
キシ官能基の保護について前述したようなベンジルまた
はペンジル基またはベンジル調導体基によって保護され
、これらの保護基は文字Bzによって表わされる。
サーモン・カルシトニン(例示のためにのみ使用)の合
成の31サイクルのそれぞれに使用するための好ましい
アミノ酸反応試剤を次の表■に示す。
成の31サイクルのそれぞれに使用するための好ましい
アミノ酸反応試剤を次の表■に示す。
衣 !
BOC−オメガ−ニトロ−L−アルギニン又はBUC−
オメガ−トシル−L−アルギニンBOC−L−プロリン B OC−(1) −ブロモベンジロキシカーボニル−
L−チロシン B OC−0−ベンジル−L−スレオニンBOC−L−
グルタミン p−ニトロフェニルエステル BUC−L−ロイシン BU(、’−L−プロリン Boc−o−ベンジル−L−スレオニンBOC−グリシ
ン BUC−(J−ベンジル−L−セリン HUC−グリシン BUC−0−ベンジル−L−スレオニンBOC−L−ア
スパラギン p−ニトロフェニルエステル HU C−U−ベンジル−L−スレオニンロキシカーボ
ニルーL−リジン BOC−L−ロイシン BOC−L−グルタミン酸−カンマ−ベンジルエステル BOC−L−fルタミン p−二トロベンジルエステル BOC−0−ベンジル−L−セリン BOC−L−ロイシン ロキシカーボニルーLーリジン BOC−グリシン H O C− L−ロイシン IJOC−L−バリン BOC−グリシン システィン BUC−0−ベンジル−L−スレオニンBυC−O−ベ
ンジル−L−セリン BUC−L−ロイシン BO(、’−L−アスパラギン p−ニトロフェニルエ
ステル BUC−0−ベンジル−L−セリン ンジルーLーシスティンyはBib−BUC−L−シス
ティン サイクル31 BEA樹脂へのプロリンの結合 樹脂ペプチド合成のすべての工程に使用する反応槽は頂
部に物質添加用の入口を備え、底部に可溶性反応混合物
と洗浄M媒を濾過によって除去するだめのガラス円板7
備えたガラス槽であり5る。濾過はA空または窒素圧の
使用によって行なうことができる。反応槽内容物は格全
体を伽盪することによって又は機械的攪拌によってかき
まぜることができろ。
オメガ−トシル−L−アルギニンBOC−L−プロリン B OC−(1) −ブロモベンジロキシカーボニル−
L−チロシン B OC−0−ベンジル−L−スレオニンBOC−L−
グルタミン p−ニトロフェニルエステル BUC−L−ロイシン BU(、’−L−プロリン Boc−o−ベンジル−L−スレオニンBOC−グリシ
ン BUC−(J−ベンジル−L−セリン HUC−グリシン BUC−0−ベンジル−L−スレオニンBOC−L−ア
スパラギン p−ニトロフェニルエステル HU C−U−ベンジル−L−スレオニンロキシカーボ
ニルーL−リジン BOC−L−ロイシン BOC−L−グルタミン酸−カンマ−ベンジルエステル BOC−L−fルタミン p−二トロベンジルエステル BOC−0−ベンジル−L−セリン BOC−L−ロイシン ロキシカーボニルーLーリジン BOC−グリシン H O C− L−ロイシン IJOC−L−バリン BOC−グリシン システィン BUC−0−ベンジル−L−スレオニンBυC−O−ベ
ンジル−L−セリン BUC−L−ロイシン BO(、’−L−アスパラギン p−ニトロフェニルエ
ステル BUC−0−ベンジル−L−セリン ンジルーLーシスティンyはBib−BUC−L−シス
ティン サイクル31 BEA樹脂へのプロリンの結合 樹脂ペプチド合成のすべての工程に使用する反応槽は頂
部に物質添加用の入口を備え、底部に可溶性反応混合物
と洗浄M媒を濾過によって除去するだめのガラス円板7
備えたガラス槽であり5る。濾過はA空または窒素圧の
使用によって行なうことができる。反応槽内容物は格全
体を伽盪することによって又は機械的攪拌によってかき
まぜることができろ。
サイクル31において、1311A樹脂を反応槽に入れ
、溶媒(たとえばメチレンクロライド、クロロホルム、
ジ,メチルホルムアミド、ベンゼン、またはそれらの均
等物)中に樹脂1当り溶媒3〜12ゴの割合で恐陶させ
る。これにB O C− L−プロリンを使用するBI
IA倒脂の遊離アミン当轍当り約1〜6当世の蛍で加え
る。5〜10分間混合した後、カップリング剤たとえば
ジシクロへキシル力ルポジイミド(DCC)を加える。
、溶媒(たとえばメチレンクロライド、クロロホルム、
ジ,メチルホルムアミド、ベンゼン、またはそれらの均
等物)中に樹脂1当り溶媒3〜12ゴの割合で恐陶させ
る。これにB O C− L−プロリンを使用するBI
IA倒脂の遊離アミン当轍当り約1〜6当世の蛍で加え
る。5〜10分間混合した後、カップリング剤たとえば
ジシクロへキシル力ルポジイミド(DCC)を加える。
他のジイミド・カップリング剤を使用することもできる
。ジイミド・カップリング剤は使用するBUC−L−プ
ロリン当量当り0.5〜2.0等量で使用することがで
きる。
。ジイミド・カップリング剤は使用するBUC−L−プ
ロリン当量当り0.5〜2.0等量で使用することがで
きる。
HUC−L−プロリンはその活性エステル誘導体、その
アジド誘導体、その対称無水物誘導体、または適当にえ
らばれた混合無水物誘導体を使用する場合にはカップリ
ング剤の不存在下で結合させることができる。使用しう
る活性エステル誘4体に−12−ニトロフェニル・エス
テル、4−二トロフェニル・エステル、ペンタフルオロ
フェニル修エステル、N−ヒドロキシサクシニミド・エ
ステルまたはその均等物である。活性エステルはB11
A倒脂の遊離アミン当鴛当り1〜10当蓋の童で使用さ
れる。
アジド誘導体、その対称無水物誘導体、または適当にえ
らばれた混合無水物誘導体を使用する場合にはカップリ
ング剤の不存在下で結合させることができる。使用しう
る活性エステル誘4体に−12−ニトロフェニル・エス
テル、4−二トロフェニル・エステル、ペンタフルオロ
フェニル修エステル、N−ヒドロキシサクシニミド・エ
ステルまたはその均等物である。活性エステルはB11
A倒脂の遊離アミン当鴛当り1〜10当蓋の童で使用さ
れる。
BIIA樹脂、溶媒、BOC−L−リジン、およびカッ
プリング剤せたはBC)C−L−プaリン活性エステル
から成る反応混合物を、試験試料についてのニンヒドリ
ン試験(E、Kaiser、at al 、、Ana
(、Esoc五a倶*H34p595−8(1970)
)によって示されるように反応が完了するまで、伎械的
に撹拌もしくは振盪する。カップリング反応の完了後、
BOC−L−プロリン樹脂を溶媒(たとえばメチレンク
ロライド、クロロホルム、メチルアルコール、ベンゼン
、ジメチルホルムアミド、fた)ま酢酸ンで洗浄するこ
とができる。洗浄溶媒は最初に使用した13HA樹脂2
当p5〜20Int溶媒が好適である。完了前にカップ
リング反応を終結させろことを望むならば、洗浄法を使
用することができ、セしてIJOC−L−プロリン樹脂
上の残存遊離アミノ基(工過剰のアセチル化剤を用いる
アセチル化によって更に反応が進むのを阻止すること力
Sできる。このアセチル化法はBOC−L−プロリン樹
脂をアセチル化剤済液と共に0.5〜12時間かきまぜ
ることによって行なうことができる。メチレンクロライ
ド溶液中のN−アセチルイミダゾール、またはクロロホ
ルム中の無水酢酸とトリエチルアミ/との混合物、のよ
5なアセチル化剤を使用することができる。アセチル化
剤は出発1111A<@脂の遊離アミン当量当り0.5
〜5.0当量の量で使用することができる。
プリング剤せたはBC)C−L−プaリン活性エステル
から成る反応混合物を、試験試料についてのニンヒドリ
ン試験(E、Kaiser、at al 、、Ana
(、Esoc五a倶*H34p595−8(1970)
)によって示されるように反応が完了するまで、伎械的
に撹拌もしくは振盪する。カップリング反応の完了後、
BOC−L−プロリン樹脂を溶媒(たとえばメチレンク
ロライド、クロロホルム、メチルアルコール、ベンゼン
、ジメチルホルムアミド、fた)ま酢酸ンで洗浄するこ
とができる。洗浄溶媒は最初に使用した13HA樹脂2
当p5〜20Int溶媒が好適である。完了前にカップ
リング反応を終結させろことを望むならば、洗浄法を使
用することができ、セしてIJOC−L−プロリン樹脂
上の残存遊離アミノ基(工過剰のアセチル化剤を用いる
アセチル化によって更に反応が進むのを阻止すること力
Sできる。このアセチル化法はBOC−L−プロリン樹
脂をアセチル化剤済液と共に0.5〜12時間かきまぜ
ることによって行なうことができる。メチレンクロライ
ド溶液中のN−アセチルイミダゾール、またはクロロホ
ルム中の無水酢酸とトリエチルアミ/との混合物、のよ
5なアセチル化剤を使用することができる。アセチル化
剤は出発1111A<@脂の遊離アミン当量当り0.5
〜5.0当量の量で使用することができる。
BOC−L−プロリン樹脂を製造するためのカップリン
グ反応は次の反応式によって表わすことができる。
グ反応は次の反応式によって表わすことができる。
上記のようにして製造したBOC−L−プロリン樹脂は
上述のような溶媒で洗浄し、そしてこれを溶媒(たとえ
ばメチレンクロライド、クロロホルム、ベンゼンまたは
その均等物)中のトリフルオロ酢酸(TFA)の混合物
のような試剤と共にかきまぜることによって保護基を除
去することができる。溶媒中のTFAの蛍は始めに使用
したBHA樹脂2当り3〜20Intの範囲で変えるこ
とができる。反応時間は約lO分〜4時間の範囲であシ
うる。保護基除去工程はい過し″ITFA溶媒を除去す
ることによって終了する。
上述のような溶媒で洗浄し、そしてこれを溶媒(たとえ
ばメチレンクロライド、クロロホルム、ベンゼンまたは
その均等物)中のトリフルオロ酢酸(TFA)の混合物
のような試剤と共にかきまぜることによって保護基を除
去することができる。溶媒中のTFAの蛍は始めに使用
したBHA樹脂2当り3〜20Intの範囲で変えるこ
とができる。反応時間は約lO分〜4時間の範囲であシ
うる。保護基除去工程はい過し″ITFA溶媒を除去す
ることによって終了する。
残存TFAはBHA樹脂?当り3〜20Rtの5〜30
チドリエテルアミン溶液(メチレンクロライド、クロロ
ホルム、ベンゼン、またはそれらの均等物のよ5な溶媒
中)で洗浄することによってL−プロリン樹脂から除去
することができる。トリエチルアミンの代りに他の第3
級または第2級有機アミン(たとえばトリメチルアミン
、N−エチルピペリジン、ジイソプロピルアミン、また
はそれらの均等物〕を使用することもできろ。L−プロ
リン樹脂の遊離アミン墓はDOrmCLn 滴定法に
よって測定することができるよって示される反応の完了
後に[E、Kaiaer*gt al、。
チドリエテルアミン溶液(メチレンクロライド、クロロ
ホルム、ベンゼン、またはそれらの均等物のよ5な溶媒
中)で洗浄することによってL−プロリン樹脂から除去
することができる。トリエチルアミンの代りに他の第3
級または第2級有機アミン(たとえばトリメチルアミン
、N−エチルピペリジン、ジイソプロピルアミン、また
はそれらの均等物〕を使用することもできろ。L−プロ
リン樹脂の遊離アミン墓はDOrmCLn 滴定法に
よって測定することができるよって示される反応の完了
後に[E、Kaiaer*gt al、。
[DortncL@、L−C,、Tetrahadro
n Lmtterm、1969゜2319−21:]
。上記の保護基除去反応は次の反応式によって表わすこ
とができる。
n Lmtterm、1969゜2319−21:]
。上記の保護基除去反応は次の反応式によって表わすこ
とができる。
サイクル30
サイクル31の結果として見られたプロリル−BHA樹
脂はカップリング溶媒に懸濁させ、BOC−0−Bt−
L−スレオニンを加え、そして混合物を同様に平衡させ
ることができる。カップリング剤DCCを加え、イサチ
ン試験に反応温合物をE過によってBOC−0−Bz−
スレオニルプロリルBHA樹脂から除去することができ
ろ。ペプチド樹脂を溶媒で洗浄する。反応試剤の量、溶
媒の量、および反応時間はサイクル31において述べた
のと同じでちってよい。BOC基はサイクル31におい
て述べた保護基除去法によってペプチド樹脂から除去す
ることができる。生成する0−Bg−スレオニルプロリ
ル−BIIA樹脂は次いでサイクル29に供せられる。
脂はカップリング溶媒に懸濁させ、BOC−0−Bt−
L−スレオニンを加え、そして混合物を同様に平衡させ
ることができる。カップリング剤DCCを加え、イサチ
ン試験に反応温合物をE過によってBOC−0−Bz−
スレオニルプロリルBHA樹脂から除去することができ
ろ。ペプチド樹脂を溶媒で洗浄する。反応試剤の量、溶
媒の量、および反応時間はサイクル31において述べた
のと同じでちってよい。BOC基はサイクル31におい
て述べた保護基除去法によってペプチド樹脂から除去す
ることができる。生成する0−Bg−スレオニルプロリ
ル−BIIA樹脂は次いでサイクル29に供せられる。
サイクル30の反応は矢の反応式によって表わすことが
できる。
できる。
Ez
サイクル29
サイクル29において、カップリング反応も保護基除去
反応もサイクル30と同様に行なわれるが、BOC−0
−Ih−L−スレオニンの代りにBOC−グリシンが使
用される。カップリングおよび保護基除去の反応は次の
ように表わされる。
反応もサイクル30と同様に行なわれるが、BOC−0
−Ih−L−スレオニンの代りにBOC−グリシンが使
用される。カップリングおよび保護基除去の反応は次の
ように表わされる。
0B雰
重
便宜上、この生成樹脂ペプチドを略号を使用して次のよ
うに記述する。
うに記述する。
TAr −Pro−NBCH−の
サイクル28
サイクル28において、カップリングと保護基除去の反
応はサイクル30と同様に行なわれるが、アミノ酸誘導
体と1.てBOC−0”Bz−L−セリンが使用される
。これに次のように表わされる。
応はサイクル30と同様に行なわれるが、アミノ酸誘導
体と1.てBOC−0”Bz−L−セリンが使用される
。これに次のように表わされる。
このサイクルにおいて、同じアミノ酸試剤を使用してサ
イクル30と同様にカップリングおよび保j基除去の反
応が行なわれ、次の化合物かえられる。
イクル30と同様にカップリングおよび保j基除去の反
応が行なわれ、次の化合物かえられる。
サイクル27
サイクル27において、カップリングと保護基除去の反
応はサイクル30と同様に行なわれるが、アミノ酸試剤
としてBOC−グリシンが使用されろ。これらのカップ
リングと保、iや基除去の反応は次のように表わされる
。
応はサイクル30と同様に行なわれるが、アミノ酸試剤
としてBOC−グリシンが使用されろ。これらのカップ
リングと保、iや基除去の反応は次のように表わされる
。
サイクル26
サイクル25
サイクル25において、カップリング反応はBOC−L
−アスパラギンの活性エステル誘導体を使用して行なう
。
−アスパラギンの活性エステル誘導体を使用して行なう
。
DDCカップリング剤の代りにBOC−L−アスパラギ
ンまたはBOC−L−グルタミンを用いる活性エステル
法を使用する。BOC−L−アスパラギ/の活性エステ
ルを使用する反応はBHA@脂の遊離アミン当量当92
〜10当鍵の針で、始めに使用したBlfA樹脂V当v
2〜201ntの童の溶媒(ジメチルホルムアミド;ジ
メチルホルムアミドとベンゼン、メチレンクロライド、
クロロホルムまたはそれらの均等物との混合物)中で行
な5ことができる。
ンまたはBOC−L−グルタミンを用いる活性エステル
法を使用する。BOC−L−アスパラギ/の活性エステ
ルを使用する反応はBHA@脂の遊離アミン当量当92
〜10当鍵の針で、始めに使用したBlfA樹脂V当v
2〜201ntの童の溶媒(ジメチルホルムアミド;ジ
メチルホルムアミドとベンゼン、メチレンクロライド、
クロロホルムまたはそれらの均等物との混合物)中で行
な5ことができる。
反応時間は1〜72時間の範囲にある。反応混合物はニ
ンヒドリン試験によって示される反応完了後K濾過によ
ってBOCペプチド(耐層から除去することができる。
ンヒドリン試験によって示される反応完了後K濾過によ
ってBOCペプチド(耐層から除去することができる。
使用1−るrlエステル誘導体は2−ニトロフェニルエ
ステル、4−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロ
フェニルエステル、またはそれらの均等物でありうる。
ステル、4−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロ
フェニルエステル、またはそれらの均等物でありうる。
我々は誘導体の活性エステル部分を示すためにAEを使
用する。カップリング反応は次のように記述することが
できる。
用する。カップリング反応は次のように記述することが
できる。
サイクル24〜21
サイク/l/24〜26のそれぞれにおいて、カップリ
ング反応および保護基除去反応はBOC−0−B、−L
−スレオニン(サイクル24)、BOC−オメガ−T−
L−アルギニン(サイクル23)、BOC−L−プロリ
ン(サイクル23)、BOC−IV−L−fa’/7(
”jイクに21 )おJ。
ング反応および保護基除去反応はBOC−0−B、−L
−スレオニン(サイクル24)、BOC−オメガ−T−
L−アルギニン(サイクル23)、BOC−L−プロリ
ン(サイクル23)、BOC−IV−L−fa’/7(
”jイクに21 )おJ。
びBOC−0−1h−L−スレオニン(サイクル21)
を使用して、サイクル30に述べたような方法と反応試
剤割合を用いて行なうことができる。サイクル21の完
了かうえられる化合物は次のように表わされる。
を使用して、サイクル30に述べたような方法と反応試
剤割合を用いて行なうことができる。サイクル21の完
了かうえられる化合物は次のように表わされる。
BOC基を除去するための保護基除去反応はサイクル3
1のようにして行なう。
1のようにして行なう。
サイクル20
サイクル20におい℃、カップリング反応および保護基
除去反応はB OC−0−1h−L−スレオニンをアミ
ノ酸誘導体として使用し、サイクル25に述べた方法と
反応試剤割合を使用して行なうことができ、次の化合物
がえられる。
除去反応はB OC−0−1h−L−スレオニンをアミ
ノ酸誘導体として使用し、サイクル25に述べた方法と
反応試剤割合を使用して行なうことができ、次の化合物
がえられる。
サイクル19
サイクル19において、BOC−L−グルタミン活性エ
ステルをアミノ酸誘導体として使用し、サイクル25に
述べ1こようにして反応を行なう。サイクル19かもえ
られる化合物を1次のとおりである。
ステルをアミノ酸誘導体として使用し、サイクル25に
述べ1こようにして反応を行なう。サイクル19かもえ
られる化合物を1次のとおりである。
サイク/I/18
サイクル18において、BOC’−L−ロイシンをアミ
ノ酸誘導体として使用して、サイクル30で述べたよ5
1’1て行なうことができろ。次の化合物かえられる。
ノ酸誘導体として使用して、サイクル30で述べたよ5
1’1て行なうことができろ。次の化合物かえられる。
サイクル17
サイクル17ではBOC−イプシロン−V−L−1,1
シンをアミノ叡誘導体として用いる。またサイクル17
はサイクル30と同様に行なうことができ、次の化合物
がえられる。
シンをアミノ叡誘導体として用いる。またサイクル17
はサイクル30と同様に行なうことができ、次の化合物
がえられる。
サイクル15かも16への反応は、サイクル16におけ
全反応剤としてBOC−L−ロイシンを使用し、サイク
ルエ5の反応剤としてBO(、’−L−グルタミン酸B
tエステル(Btはセリン、スレオニンにおけると同じ
基を示す)を使用する以外はサイクル30と同様にして
行なわれ、サイクル15かも次の化合物かえられる:サ
イクル14〜8 −9−イクル14はBOC−L−グルタミン酸をアミノ
酸誘導体として使用し、サイクル19と同様にして行な
5ことができる。サイクル13〜8はBOC−0−Bt
−L−セリン(サイクルx3)、BOC−L−ロイシン
(サイクル12)、BOC−イプシロン−V−L−リジ
ン(サイクル11)、110 C−グリシン(サイクル
10)、HOC−L−ロイシン(サイクル9)、および
B (J C−L−バリン(サイクル8)を使用し、サ
イクル30で述べたようにして行なうことができる。次
の化合物がえられる。
全反応剤としてBOC−L−ロイシンを使用し、サイク
ルエ5の反応剤としてBO(、’−L−グルタミン酸B
tエステル(Btはセリン、スレオニンにおけると同じ
基を示す)を使用する以外はサイクル30と同様にして
行なわれ、サイクル15かも次の化合物かえられる:サ
イクル14〜8 −9−イクル14はBOC−L−グルタミン酸をアミノ
酸誘導体として使用し、サイクル19と同様にして行な
5ことができる。サイクル13〜8はBOC−0−Bt
−L−セリン(サイクルx3)、BOC−L−ロイシン
(サイクル12)、BOC−イプシロン−V−L−リジ
ン(サイクル11)、110 C−グリシン(サイクル
10)、HOC−L−ロイシン(サイクル9)、および
B (J C−L−バリン(サイクル8)を使用し、サ
イクル30で述べたようにして行なうことができる。次
の化合物がえられる。
サイクル7
サイクル7はBOC−5−エチルチオ−L−システィン
fたはその均等物をアミノ酸誘導体として使用する以外
はサイクル30で述べたようにして行なうことができる
。サイクル7かうえられる化合物は次式によって表わさ
れる。
fたはその均等物をアミノ酸誘導体として使用する以外
はサイクル30で述べたようにして行なうことができる
。サイクル7かうえられる化合物は次式によって表わさ
れる。
2)、およびEOC−L−oイ7ン(?イクrv4)
を7 ミノ酸誘導体として使用し、サイクル30のよう
にして行なうことができる。サイクル3はBOC−L−
アスパラギン活性エステルを使用してサイクル25と同
保に行なプことができる。サイクル2かもえられる化合
物は次のとおりである。
を7 ミノ酸誘導体として使用し、サイクル30のよう
にして行なうことができる。サイクル3はBOC−L−
アスパラギン活性エステルを使用してサイクル25と同
保に行なプことができる。サイクル2かもえられる化合
物は次のとおりである。
CRtはアルキルチオまたをよりz基である。〕サイク
ル6〜2 サイクル6かも12はBOC−0−1に一スレオニン(
サイクル6)、B OC−0−1h−L−セリン(サイ
クル5とサイクルl このサイクルはEOC−5−R,−L−システィン誘導
体を使用してサイクル7と同様に行なわれる。このシス
ティンのためにえらばれるR1基はサイクル7で使用し
たものと同じであってもよ(、あるいは異なっていても
よい。たとえば、サイクル7についてえらばれた誘導体
がBOC−。
ル6〜2 サイクル6かも12はBOC−0−1に一スレオニン(
サイクル6)、B OC−0−1h−L−セリン(サイ
クル5とサイクルl このサイクルはEOC−5−R,−L−システィン誘導
体を使用してサイクル7と同様に行なわれる。このシス
ティンのためにえらばれるR1基はサイクル7で使用し
たものと同じであってもよ(、あるいは異なっていても
よい。たとえば、サイクル7についてえらばれた誘導体
がBOC−。
S−エチルチオ−L−7ステインでおるならば、サイク
ル1の誘導体をより0C−5−4−メトキシベンジル−
L−システィンであってもよく、あるいはBOC−5−
4−メトキシベンジルがサイクル7にえもばれたならば
、この誘導体またはBOC−5−エチルチオ−L−シス
ティンをサイクルlに使用してもよい。サイクル1かう
えられろ化合物は次式によって表わされる。
ル1の誘導体をより0C−5−4−メトキシベンジル−
L−システィンであってもよく、あるいはBOC−5−
4−メトキシベンジルがサイクル7にえもばれたならば
、この誘導体またはBOC−5−エチルチオ−L−シス
ティンをサイクルlに使用してもよい。サイクル1かう
えられろ化合物は次式によって表わされる。
(R,はS−n−アルキル、cy、またはBgであり;
R2は5−n−アルキルまたはBzであるが、R2がB
gであるときR2をま5−n−アルキルまたはCy a
であり;R2が5−n−アルキルであるとぎR,はBg
である。〕サイクルlは樹脂ペプチドの完成を表わす。
R2は5−n−アルキルまたはBzであるが、R2がB
gであるときR2をま5−n−アルキルまたはCy a
であり;R2が5−n−アルキルであるとぎR,はBg
である。〕サイクルlは樹脂ペプチドの完成を表わす。
このす(脂ペプチドは反応槽から取出して真空中で乾燥
することができる。樹脂ペプチドの重量は合成の始めに
使用したBEAa1脂の2.0〜3.5倍であると予期
される。
することができる。樹脂ペプチドの重量は合成の始めに
使用したBEAa1脂の2.0〜3.5倍であると予期
される。
樹脂ペプチドの開裂
ペプチドは液体弗化水素(HF)による処理によって、
アシル化サイクルからえらばれる樹脂ペプチドから開裂
される。このHF開裂反応は樹脂ペプチドとアニソール
(樹脂ペプチド2当90.5〜5y+z)との混合物を
((l(脂ペブチドノ当り2〜20Wltの液体11F
で)0.5〜20時間−20℃〜+15℃のhyで処理
することによって行なわれる。
アシル化サイクルからえらばれる樹脂ペプチドから開裂
される。このHF開裂反応は樹脂ペプチドとアニソール
(樹脂ペプチド2当90.5〜5y+z)との混合物を
((l(脂ペブチドノ当り2〜20Wltの液体11F
で)0.5〜20時間−20℃〜+15℃のhyで処理
することによって行なわれる。
反応期間の後に、過剰のRFを蒸発によつ℃除き、生成
するペプチドと樹脂ビーズとの混合物を有機溶媒(たと
えばエチルアセテート、ジエチルエーテル、ぺ/ゼンな
と)で抽出してアニソールと残TjMFを除くことがで
きる。ペプチドは抽出によって樹脂ビーズから水性酢酸
中に分離することができる。このj21.Sでのペプチ
ドはhl状ではな(、分子中の位elのシスティンと位
置7のシスティンとの間にジサルファイド結合のない非
環状生成物の状態にある。
するペプチドと樹脂ビーズとの混合物を有機溶媒(たと
えばエチルアセテート、ジエチルエーテル、ぺ/ゼンな
と)で抽出してアニソールと残TjMFを除くことがで
きる。ペプチドは抽出によって樹脂ビーズから水性酢酸
中に分離することができる。このj21.Sでのペプチ
ドはhl状ではな(、分子中の位elのシスティンと位
置7のシスティンとの間にジサルファイド結合のない非
環状生成物の状態にある。
BP処理を工、位tlまたは位置7のシスティン残基の
チオール官能基上の5−アルキルチオ保a基を除いて、
すべての保a基をペプチドから除去する。5−n−アル
キルチオ−L−システィン残基はIIF開裂法に対して
安定であり、開裂および抽出の操作を通してそのまま残
る。5−Bt−L−7ステイン残基はIIFによって開
裂して遊離チオール官能基をもつシスティン残基な生ず
る。我々の合成過程において、位置1および位1117
において両種の保護基を相互に組合せ℃使用した。
チオール官能基上の5−アルキルチオ保a基を除いて、
すべての保a基をペプチドから除去する。5−n−アル
キルチオ−L−システィン残基はIIF開裂法に対して
安定であり、開裂および抽出の操作を通してそのまま残
る。5−Bt−L−7ステイン残基はIIFによって開
裂して遊離チオール官能基をもつシスティン残基な生ず
る。我々の合成過程において、位置1および位1117
において両種の保護基を相互に組合せ℃使用した。
このようにして、HF開裂後にえもれるペプチドは樹脂
ペプチド合成中に使用したシスティン誘導体のチオール
官能基としてえらんだ保護基に応じて4種のうちのIn
でありうる。
ペプチド合成中に使用したシスティン誘導体のチオール
官能基としてえらんだ保護基に応じて4種のうちのIn
でありうる。
BOC−5−1h−L−システィン誘導体を樹脂ペプチ
ド合成のサイクル1に使用し、BOC−5−n−アルキ
ルチオ−L−システィンをサイクル7に使用する場合、
HF開裂後に足られるペプチドは型rであり、位置Iに
おいて遊離のチオール官能基をもち、位R7においてシ
スティン残基上に5−n−アルキルチオ基をもつ。我々
はこの種のペプチドな型1のペプチドと呼ぶ。このもの
は次式によって表わされる。
ド合成のサイクル1に使用し、BOC−5−n−アルキ
ルチオ−L−システィンをサイクル7に使用する場合、
HF開裂後に足られるペプチドは型rであり、位置Iに
おいて遊離のチオール官能基をもち、位R7においてシ
スティン残基上に5−n−アルキルチオ基をもつ。我々
はこの種のペプチドな型1のペプチドと呼ぶ。このもの
は次式によって表わされる。
5−n−アルキル
Cys−5ar−Aan−Lms−5ay−Tんr−C
ya−Val−Las−GEy−Lye−Las−5H
−Gin−Gls−Lms−Lye−Las −Gin
−Thr−Tyr−Pro−Arg−Thr−Aan−
Thr−Gly−5ar−Gly−Thr−Pro−N
il。
ya−Val−Las−GEy−Lye−Las−5H
−Gin−Gls−Lms−Lye−Las −Gin
−Thr−Tyr−Pro−Arg−Thr−Aan−
Thr−Gly−5ar−Gly−Thr−Pro−N
il。
逆に、BOC−5−n−アルキルチオ−L−システィン
誘導体がサイクル1に使用され、HOC−5−13t−
L−システィンが位置7に使用されると、開裂から生じ
るペプチドは型…であって次式によって表わされる。
誘導体がサイクル1に使用され、HOC−5−13t−
L−システィンが位置7に使用されると、開裂から生じ
るペプチドは型…であって次式によって表わされる。
Gin−Thr−Tyr−Pro−Arg−Thr−A
an−The−Gly−5ar−Gly−Thr−Pr
o−Nll。
an−The−Gly−5ar−Gly−Thr−Pr
o−Nll。
位置1において保護基5−n−アルキルの代りにS−シ
ステイニル基を使用することができる(この場合、この
位置のシスティンをニジスティン基を形成する)。これ
を行なうとき我々を工位置7のシスティンを保訛するた
めにBt基を使用する。Big−BOC−L−システィ
ンをサイクル1の試剤として使用し、BOC−5−Bz
−L−システィンをサイクル7の試剤として使用するな
らば、開裂から生ずるペプチドは型■のものであり、次
式によって表わされる。
ステイニル基を使用することができる(この場合、この
位置のシスティンをニジスティン基を形成する)。これ
を行なうとき我々を工位置7のシスティンを保訛するた
めにBt基を使用する。Big−BOC−L−システィ
ンをサイクル1の試剤として使用し、BOC−5−Bz
−L−システィンをサイクル7の試剤として使用するな
らば、開裂から生ずるペプチドは型■のものであり、次
式によって表わされる。
Cya
Cya−5ay−Aan−Lms−5ay−The−C
ya−Val−Lgs−GLy−Lye−Las−さ−
r−Gin−Glu−Law−Lye−Lg%−Gin
−Thr−Tyr−Pro−Arg−Thr−Asn−
The−Gly−Gl y−Lye−Lms−Sar−
Gin−GEs−Lms−Lye−Les −5ar−
Gly−Thr−Pro−HE。
ya−Val−Lgs−GLy−Lye−Las−さ−
r−Gin−Glu−Law−Lye−Lg%−Gin
−Thr−Tyr−Pro−Arg−Thr−Asn−
The−Gly−Gl y−Lye−Lms−Sar−
Gin−GEs−Lms−Lye−Les −5ar−
Gly−Thr−Pro−HE。
BOC−5−1h−L−システィンを位flと位置7の
双方の試剤として使用すると、開裂から生じるペプチド
は型■のものであり、次式によって表わされる。
双方の試剤として使用すると、開裂から生じるペプチド
は型■のものであり、次式によって表わされる。
Cyz−5ur−Aan−Las−5°gr−Thr−
Cya−Val−Las−GLy−Lya−Lmm−5
ar−Gln−Gls−Lms−Lya−Les−Gl
n−Thr−Tyr−Pro−Arg−Thr−Axn
−Thr−Gly−5er−Gly−Thr−Pro
−NH2型!、nおよび■のペプチドから環状ジサルフ
ァイド・ペプチドへの変換は、HF開裂からの粗ペプチ
ドの酢酸水溶液を蒸留水で、開裂した樹脂ペプチド1当
950〜200m1の最終容置にまで希釈することによ
って行なわれろ。この溶成のpBは水酸化アンモニウム
溶液の添加1cより5〜lOに調節することができ、そ
して混合物は不活性ガス(たとえば窒素)の流れのもと
て約2〜48時間密閉容器中で撹拌することができる。
Cya−Val−Las−GLy−Lya−Lmm−5
ar−Gln−Gls−Lms−Lya−Les−Gl
n−Thr−Tyr−Pro−Arg−Thr−Axn
−Thr−Gly−5er−Gly−Thr−Pro
−NH2型!、nおよび■のペプチドから環状ジサルフ
ァイド・ペプチドへの変換は、HF開裂からの粗ペプチ
ドの酢酸水溶液を蒸留水で、開裂した樹脂ペプチド1当
950〜200m1の最終容置にまで希釈することによ
って行なわれろ。この溶成のpBは水酸化アンモニウム
溶液の添加1cより5〜lOに調節することができ、そ
して混合物は不活性ガス(たとえば窒素)の流れのもと
て約2〜48時間密閉容器中で撹拌することができる。
流出ガス流がもはやn−アルキルメルカプタンを含まな
くなったとき反応を停止させることができる。反応混合
物のμs′は氷酢酸の添加によって約3.5〜5.5に
低下させることができる。
くなったとき反応を停止させることができる。反応混合
物のμs′は氷酢酸の添加によって約3.5〜5.5に
低下させることができる。
型IVのペプチドから環状ジサルファイド・ペプチドへ
の変換は、当業技術にとって周知の古典的方法によって
行なわれ、そこではペプチドが酸化されて位[1および
位置7においてシスナインを含むように環化される。
の変換は、当業技術にとって周知の古典的方法によって
行なわれ、そこではペプチドが酸化されて位[1および
位置7においてシスナインを含むように環化される。
中間体ペプチドが型【、バ、1[[または■のいづれで
あっても、周知の任慧のカルシトニンに対応するアミノ
酸の鎖をもつペプチドを合成することができる。ここに
述べたようにして合成されたこのようなペプチドは精製
することができ、そして周知のカルシトニンと同じ種類
の生物学的活性をもつことがわかった。このように合成
されたカルシトニンはデス−17−ヒスチシンーカルシ
トニント呼ばれる。
あっても、周知の任慧のカルシトニンに対応するアミノ
酸の鎖をもつペプチドを合成することができる。ここに
述べたようにして合成されたこのようなペプチドは精製
することができ、そして周知のカルシトニンと同じ種類
の生物学的活性をもつことがわかった。このように合成
されたカルシトニンはデス−17−ヒスチシンーカルシ
トニント呼ばれる。
これはIUPAC−IUB命名法に準拠している。
粗デスー17−ヒステジンーサーモンΦカルシトニンの
精製 上記の合成からのpH5の粗ペプチド溶液はイオン交換
法を使用して濃縮することができる。濃縮物はゲル濾過
法、イオン交換クロマトグラフ法、および分配クロマト
グラフ法の組合せによってf#製することができる。最
終の精製物は溶液からの凍結乾燥によって「ふわふわし
た」白色固体として見られる。生成物は所望のペプチド
の正しいアミノ酸分析値を与える。
精製 上記の合成からのpH5の粗ペプチド溶液はイオン交換
法を使用して濃縮することができる。濃縮物はゲル濾過
法、イオン交換クロマトグラフ法、および分配クロマト
グラフ法の組合せによってf#製することができる。最
終の精製物は溶液からの凍結乾燥によって「ふわふわし
た」白色固体として見られる。生成物は所望のペプチド
の正しいアミノ酸分析値を与える。
下記の実施例によって本発明を更に具体的に説明する。
実施例1゜
樹脂活性化
0.61溝−q/?のアミン滴定量?もりBHAMB脂
(5y)をペプチド合成器〔米国アリシナ州タクソンの
ベガ・バイオケミカルスかも市販〕に入れた。樹脂を次
の溶媒(各251)で処理し、それぞれの処理後に濾過
した。
(5y)をペプチド合成器〔米国アリシナ州タクソンの
ベガ・バイオケミカルスかも市販〕に入れた。樹脂を次
の溶媒(各251)で処理し、それぞれの処理後に濾過
した。
メチレンクロライド 2分間クロロホル
ム 2分間ツつ2回りロロホルム
中10チドリエチル 5分間づつ2回アミン クロロホルム 2分間 メチレンクロライド 2分間づつ3回サ
イクル31 カップリング二 上記のERA@脂、25Nのメチレン
クロライド、および1.3xP(o、oo6tモル)の
BOC−L−−fロリンを10分間かぎまぜた。ジシク
ロへキシルカルボジイミドのメチレンクロライド溶液6
.1 tnt (H液1jlt当りDCC1ミリ当りを
反応器に加え、混合物を6時間かきまぜた。反応混合物
を濾過によって反応器から除き、BOC−プロリルBH
A樹脂を濾過によって反応器から除き、次の溶gX(各
25紅)で次々に2分間づつ処理した。
ム 2分間ツつ2回りロロホルム
中10チドリエチル 5分間づつ2回アミン クロロホルム 2分間 メチレンクロライド 2分間づつ3回サ
イクル31 カップリング二 上記のERA@脂、25Nのメチレン
クロライド、および1.3xP(o、oo6tモル)の
BOC−L−−fロリンを10分間かぎまぜた。ジシク
ロへキシルカルボジイミドのメチレンクロライド溶液6
.1 tnt (H液1jlt当りDCC1ミリ当りを
反応器に加え、混合物を6時間かきまぜた。反応混合物
を濾過によって反応器から除き、BOC−プロリルBH
A樹脂を濾過によって反応器から除き、次の溶gX(各
25紅)で次々に2分間づつ処理した。
メチレンクロライド 2回メチルアルコー
ル 2回メチレンクロライド
3回アセチル化: 次いでこの樹脂を1,5mlの
トリエチルアミン(TEA)、IRIの無水酢酸、およ
び25Rtのクロロホルムから成る混合物と2時間かき
まぜた。この反応混合物を濾過により除き、樹脂を次の
溶媒(各25′l1t)で2分間づつ洗った。
ル 2回メチレンクロライド
3回アセチル化: 次いでこの樹脂を1,5mlの
トリエチルアミン(TEA)、IRIの無水酢酸、およ
び25Rtのクロロホルムから成る混合物と2時間かき
まぜた。この反応混合物を濾過により除き、樹脂を次の
溶媒(各25′l1t)で2分間づつ洗った。
クロロホルム 2回メチルアルコー
ル 2回メチレンクロライド
3回保護基除去: EOC保護樹脂を151Lt
のトリフルオロ酸9(TFA)と15m1のメチレンク
ロライドとの混合物と5分間かきまぜた。この混合物’
f濾過によって除き、樹脂を15紅のTFAと151n
lのメチレンクロライドとの第2混合物と30分間かき
まぜた。反応混合物を05過によつ℃除き、樹脂を次の
溶媒(各25a)で洗浄した。
ル 2回メチレンクロライド
3回保護基除去: EOC保護樹脂を151Lt
のトリフルオロ酸9(TFA)と15m1のメチレンク
ロライドとの混合物と5分間かきまぜた。この混合物’
f濾過によって除き、樹脂を15紅のTFAと151n
lのメチレンクロライドとの第2混合物と30分間かき
まぜた。反応混合物を05過によつ℃除き、樹脂を次の
溶媒(各25a)で洗浄した。
メチレンクロライド 2分間づつ2回メ
チルアルコール 2分間づつ2回クロ
ロホルム 2分間づつ2回りロロ
ホルム中lO%TEA 10分間づつ2回クロロ
ホルム 2分間つつ2回メチレン
クロライド 2分子lJjづつ2回この
L−プロリンBIiA便脂を滴定してアミン又はプロリ
ンの滴定iを求めた。この値は樹脂f当90.55ミリ
当愈のアミン又はプロリンであった。
チルアルコール 2分間づつ2回クロ
ロホルム 2分間づつ2回りロロ
ホルム中lO%TEA 10分間づつ2回クロロ
ホルム 2分間つつ2回メチレン
クロライド 2分子lJjづつ2回この
L−プロリンBIiA便脂を滴定してアミン又はプロリ
ンの滴定iを求めた。この値は樹脂f当90.55ミリ
当愈のアミン又はプロリンであった。
サイクル30
カップリング二 上記の樹脂、25jltのメチレンク
ロライド、および1.64F(0,0053モル)のE
OC−0−ベンジル−L−スレオニンを10分間かきま
ぜた。次いでジシクロへキシルカルボジイミドのメチレ
ンクロライド溶液5,5紅(1ミリ当量)を反応器に加
え、混合物を2時間かきまぜた。反応混合物を反応器か
ら除き、樹脂を次の溶媒(各251)で久々に2分間つ
つ洗浄し、洗浄液を濾過により除いた。
ロライド、および1.64F(0,0053モル)のE
OC−0−ベンジル−L−スレオニンを10分間かきま
ぜた。次いでジシクロへキシルカルボジイミドのメチレ
ンクロライド溶液5,5紅(1ミリ当量)を反応器に加
え、混合物を2時間かきまぜた。反応混合物を反応器か
ら除き、樹脂を次の溶媒(各251)で久々に2分間つ
つ洗浄し、洗浄液を濾過により除いた。
メチレンクロライド 2回メチルアルコー
ル 2回メチレンクロライド
3回イサチン試験は陰性であった。
ル 2回メチレンクロライド
3回イサチン試験は陰性であった。
保護基除去: サイクル31に述べた保護基除去操作を
このサイクルについてくりかえした。
このサイクルについてくりかえした。
これらのサイクルに使用したカップリングおよび保護基
除去の操作はスレオニン誘導体の代りに次のアミノrR
誘導体を使用した以外はサイクル30と同じであった。
除去の操作はスレオニン誘導体の代りに次のアミノrR
誘導体を使用した以外はサイクル30と同じであった。
サイクル29・・・o、93y(o、oos3モル)の
BQC−グリシン サイクル2”8・・・1.55F(0,0053モル)
のBOC−0−ベンジル−L−セリン サイクル27・・・サイクル30で使用した試剤と同じ
サイクル26・・・サイクル31で使用した試剤と同じ
サイクル25 カップリング: サイクル26でえたペプチド樹脂を各
25紅のジメチルホルムアミド(DMF)で2回代った
。
BQC−グリシン サイクル2”8・・・1.55F(0,0053モル)
のBOC−0−ベンジル−L−セリン サイクル27・・・サイクル30で使用した試剤と同じ
サイクル26・・・サイクル31で使用した試剤と同じ
サイクル25 カップリング: サイクル26でえたペプチド樹脂を各
25紅のジメチルホルムアミド(DMF)で2回代った
。
次いでこの樹脂をDMF 35ffllj中のBOC−
L−アスパラギン−p−ニトロフェニルエステル2.8
2F(0,008モル)の溶液と24時間かきまぜた。
L−アスパラギン−p−ニトロフェニルエステル2.8
2F(0,008モル)の溶液と24時間かきまぜた。
反応混合物を濾過し、樹脂ペプチドを次の溶媒各25r
tで各2回次々に洗浄した:DMF、メチレンクロライ
ド、メタノール、メチレンクロライド。それぞれの個々
の溶媒を濾過によって除いた。ニンヒドリン試験は陰性
であった。
tで各2回次々に洗浄した:DMF、メチレンクロライ
ド、メタノール、メチレンクロライド。それぞれの個々
の溶媒を濾過によって除いた。ニンヒドリン試験は陰性
であった。
保護基除去: サイクル31に使用した保護基除去操作
をくりかえした。
をくりかえした。
サイクル24
カップリングと保護基除去の操作はサイクル30で使用
のと同じであり、同じ試剤を同じ量使用した。
のと同じであり、同じ試剤を同じ量使用した。
サイクル23
カップリング: サイクル24でえた樹脂ペプチドを1
)MP各251ntで2回洗った。欠いで賀脂ペプチド
を3.42y(o、oosモル)のBOC−N−オメガ
−トシル−L−アルギニンと251LtのDMFとの混
合物と10分間かきまぜた。次いでメチレンクロライド
中のDCCs*(o、oosモルのDCCに相当)を加
え、混合物を6時間かきまぜた。
)MP各251ntで2回洗った。欠いで賀脂ペプチド
を3.42y(o、oosモル)のBOC−N−オメガ
−トシル−L−アルギニンと251LtのDMFとの混
合物と10分間かきまぜた。次いでメチレンクロライド
中のDCCs*(o、oosモルのDCCに相当)を加
え、混合物を6時間かきまぜた。
反応混合物を濾過によって除いた。使脂ペプチドを次の
溶媒(各25酊)で2回づつ次々に洗った: DMF、
メチレンクロライド、メチルアルコール、メチレンクロ
ライド。
溶媒(各25酊)で2回づつ次々に洗った: DMF、
メチレンクロライド、メチルアルコール、メチレンクロ
ライド。
ニンヒドリン試験は陰性でめった。
保護基除去: サイクル31で使用した保護基除去操作
なくりかえした。
なくりかえした。
サイクル22
カップリング: サイクル23でえたペプチド樹脂を1
.72P(o、o o sモル)のBOC−L−プロリ
ンと25紅のメチレンクロライドとの混合物と10分間
かきまぜた。
.72P(o、o o sモル)のBOC−L−プロリ
ンと25紅のメチレンクロライドとの混合物と10分間
かきまぜた。
メチレンクロライド中のD(、’C3rnl(0,00
8モルのI)CCに相当)を加え、混合物を6時間かき
まぜた。反工6混合物を濾過によって除き、樹脂ペプチ
ドを次の溶媒(各251)で2回づつ次々に洗った:メ
チレンクロライド、メチルアルコール、メチレンクロラ
イド。それぞれの個々の洗浄液を濾過によって除いた。
8モルのI)CCに相当)を加え、混合物を6時間かき
まぜた。反工6混合物を濾過によって除き、樹脂ペプチ
ドを次の溶媒(各251)で2回づつ次々に洗った:メ
チレンクロライド、メチルアルコール、メチレンクロラ
イド。それぞれの個々の洗浄液を濾過によって除いた。
ニンヒドリン試験は陰性であった。
保護基除去: サイクル31で使用した保護基除去操作
を(りかえした。
を(りかえした。
サイクル21および20
このサイクルで使用したカップリングと保遭基除去の操
作はカンプリング反応においてBOC−L−プロリンの
代りに次のアミノrR誘導体を使用した以外はサイクル
22と同じであった。
作はカンプリング反応においてBOC−L−プロリンの
代りに次のアミノrR誘導体を使用した以外はサイクル
22と同じであった。
サイクル21・・・4.07F(0,008モル)のB
OC−0−2−ブロモベンジル−オキ7カー ボニルーL−チロシン サイクル20・・・2.479 (0,008モル)の
BOC−O−ベンジル−L−スレオニ/ サイクル19 このサイクルの操作はアスパラギン誘導体の代りに2.
94F(0,008モル)のBOC−L−グルタミン−
p−二トロフェニルエステルを使用した以外はサイクル
25と同じである。
OC−0−2−ブロモベンジル−オキ7カー ボニルーL−チロシン サイクル20・・・2.479 (0,008モル)の
BOC−O−ベンジル−L−スレオニ/ サイクル19 このサイクルの操作はアスパラギン誘導体の代りに2.
94F(0,008モル)のBOC−L−グルタミン−
p−二トロフェニルエステルを使用した以外はサイクル
25と同じである。
サイクル18〜工5
これらのサイクルの操作をエスレオニン訪導体の代りに
次のアミノ酸34体を使用した以外はサイクル3oと同
じである。
次のアミノ酸34体を使用した以外はサイクル3oと同
じである。
サイク、v1B−1,3211(0,0053モル)f
)BOC−L−ロイシン サイクルエアー2.20F (0,0053モル)a)
BOC−イプシロン−2−カルボベンジロキ シ−L−リジン サイクルi 6−1.323E (0,0053モル)
cQBOc−L−ロイシ/ サイクル15・・・1.79F(0,0053モル)の
BOC−L−fルタミン酸−ガンマ−ベンジ ルエステル サイクル14 サイクル19と同じ。
)BOC−L−ロイシン サイクルエアー2.20F (0,0053モル)a)
BOC−イプシロン−2−カルボベンジロキ シ−L−リジン サイクルi 6−1.323E (0,0053モル)
cQBOc−L−ロイシ/ サイクル15・・・1.79F(0,0053モル)の
BOC−L−fルタミン酸−ガンマ−ベンジ ルエステル サイクル14 サイクル19と同じ。
サイクル13
このサイクルの操作はカップリング反応においてプロリ
ン誘導体の代りに2.36ノ(0,008モル)のBO
C−0−ベンジル−L−セリンを使用した以外はサイク
ル22と同じである。
ン誘導体の代りに2.36ノ(0,008モル)のBO
C−0−ベンジル−L−セリンを使用した以外はサイク
ル22と同じである。
サイクル12〜9
このサイクルの操作はカップリング反応においてスレオ
ニン誘導体の代りに次のアミノ酸誘導体を使用した以外
はサイクル30と同じである。
ニン誘導体の代りに次のアミノ酸誘導体を使用した以外
はサイクル30と同じである。
サイクル12・・・サイクル19で使用した試剤と同じ
サイクル11・・・サイクル17で使用した試剤と同じ
サイクル10・・・サイクル29で使用した試剤と同じ
サイクル9・・・サイクル16で使用した試剤と同じサ
イクル8 カップリング: サイクル9かもの樹脂ペプチドを1.
74ノ(o、oosモル)のEOC−L−バリンおよび
25ばのメチレンクロライドと10分間かきまぜた。次
いでメチレンクロライド中のDCC8ml(0,008
モyのDCCVC相当)を加え、混合物を16時間かき
まぜた。反応混合物を濾過によって除いた。樹脂ペプチ
ドを次のmIs<各25Rt)で2回づつ洗った:メチ
ノンクロライド、メチルアルコール、メチレンクロライ
ド。それぞれの個々の洸#gを濾過によって除いた。
サイクル11・・・サイクル17で使用した試剤と同じ
サイクル10・・・サイクル29で使用した試剤と同じ
サイクル9・・・サイクル16で使用した試剤と同じサ
イクル8 カップリング: サイクル9かもの樹脂ペプチドを1.
74ノ(o、oosモル)のEOC−L−バリンおよび
25ばのメチレンクロライドと10分間かきまぜた。次
いでメチレンクロライド中のDCC8ml(0,008
モyのDCCVC相当)を加え、混合物を16時間かき
まぜた。反応混合物を濾過によって除いた。樹脂ペプチ
ドを次のmIs<各25Rt)で2回づつ洗った:メチ
ノンクロライド、メチルアルコール、メチレンクロライ
ド。それぞれの個々の洸#gを濾過によって除いた。
保護基除去: ナイン/I/30と同じ。
サイクル7
サイクル7の操作はカップリング反応においてスレオニ
ン誘導体の代りにx、59p(o、oos3モル)のB
OC−5−xfルfyF−L−システィンを使用した以
外はサイクル30と同じであった。
ン誘導体の代りにx、59p(o、oos3モル)のB
OC−5−xfルfyF−L−システィンを使用した以
外はサイクル30と同じであった。
サイクル6
使用した試剤と操作ヲエサイクル30と同じであった。
サイクル5
使用した試剤と操作はサイクル28と同じであった。
サイクル4
使用した試剤と操作はサイクル16と同じでめった。
サイクル3
使用した試剤と操作はサイクル25と同じであった。
サイクル2
使用した試剤と操作はサイクル28と同じであった。
サイクルl
スレオニン誘導体の代りに1.5xP(o、oos3モ
ル)のBOC−5−p−メトキシベンジル−L−シスナ
インを使用した以外は使用した試剤と操作をエサイクル
30と同じであった。
ル)のBOC−5−p−メトキシベンジル−L−シスナ
インを使用した以外は使用した試剤と操作をエサイクル
30と同じであった。
サイクルlの完了後、樹脂ペプチドを最後に各2511
14のn−へキサンで2回洗った。ヘプテド物質を反応
器から除き、真空オーブン中で0. l rnHgの圧
力、40℃の一度で24時間乾燥した。
14のn−へキサンで2回洗った。ヘプテド物質を反応
器から除き、真空オーブン中で0. l rnHgの圧
力、40℃の一度で24時間乾燥した。
弗化水素による開裂
乾燥樹脂ペプチド(2))およびアニソール(211t
)をテア0ン反応槽に入れた。テフロン被oi磁石カベ
G工ん機付きの反応槽をドライアイス・アセト/浴に入
れ、15mJの弗化水素ガスを反応槽中で縦組させた。
)をテア0ン反応槽に入れた。テフロン被oi磁石カベ
G工ん機付きの反応槽をドライアイス・アセト/浴に入
れ、15mJの弗化水素ガスを反応槽中で縦組させた。
この混合物を水浴中で0℃に1時間かくはんした。弗化
水素を減圧で蒸発させて除いた。残渣な25m1つつ6
回のエチルアセテートですりつぶした。0.1モル濃度
酢酸水溶液120Rtによりペプチドを樹脂ビーズから
抽出した。
水素を減圧で蒸発させて除いた。残渣な25m1つつ6
回のエチルアセテートですりつぶした。0.1モル濃度
酢酸水溶液120Rtによりペプチドを樹脂ビーズから
抽出した。
ペプチドの環化
弗化水素開裂から見られた水性酢酸抽出物を蒸留水80
Vの添加により200νに1で希釈した。濃水酸化アン
モニウムの添加によジgiのpHを7.5に調節した。
Vの添加により200νに1で希釈した。濃水酸化アン
モニウムの添加によジgiのpHを7.5に調節した。
この溶液を窒素気流下に密閉容器中でカベを工んした。
この時点で流出窒素気流中にエテルメルカプタンは検出
されなかった。
されなかった。
窒素気流中のエテルメルカプタンは該気流をエルマン試
薬溶液(El 1max、G、L、、Arch 、Bi
ochgm、Biophyx、。
薬溶液(El 1max、G、L、、Arch 、Bi
ochgm、Biophyx、。
82.7O−7(1969))に通すことによって測定
した。反応混合物のpiIは氷酢酸の添加により5.0
に調節した。
した。反応混合物のpiIは氷酢酸の添加により5.0
に調節した。
粗デス−Eia”−5CTの精製
上記合成からのpZ/ 5.0の浴液200ゴを5P−
25イオン交換カラムを使用し″′C濃縮した。0.7
5モル濃度の塩化ナトリウム溶液を用いてカラムから除
いた25r!Ltの濃縮物をセファテックスG−25(
微細)ゲル濾過カラムを通すことrこよって脱塩および
精製し、0.03モル濃度の酢酸水溶液で溶離させた。
25イオン交換カラムを使用し″′C濃縮した。0.7
5モル濃度の塩化ナトリウム溶液を用いてカラムから除
いた25r!Ltの濃縮物をセファテックスG−25(
微細)ゲル濾過カラムを通すことrこよって脱塩および
精製し、0.03モル濃度の酢酸水溶液で溶離させた。
このカラムからのテスーHsl”−5CT留分を水酸化
アンモニウム溶液の添加によりpB 6に調節した。こ
の溶液をl〆hatrrLαncM−52カラムを用い
酢酸アンモニウムバッファで溶出するイオン交換クロマ
トグラフィーでさらに精製した。このカラムからのデス
−11ii丁−5CTを氷酢酸を加えて餠5,0に調節
した。この溶液をSP−セファデックスC−25イオン
交換カラムを用いて濃縮した。
アンモニウム溶液の添加によりpB 6に調節した。こ
の溶液をl〆hatrrLαncM−52カラムを用い
酢酸アンモニウムバッファで溶出するイオン交換クロマ
トグラフィーでさらに精製した。このカラムからのデス
−11ii丁−5CTを氷酢酸を加えて餠5,0に調節
した。この溶液をSP−セファデックスC−25イオン
交換カラムを用いて濃縮した。
0.7モル濃度の塩化ナトリウム溶液によりカラムから
除いた30IILtの濃縮物をセファデックスに−25
(微Mfi)ゲル濾過カラムを用いて脱塩した。ペプチ
ド留分を集め工凍結乾燥した。生成物をWaters
Microbondapak CH@を充填したl0c
mカラムを用いる逆相高能率液体クロマトグラフィーを
用いてさらにvJ製した。既に平衡にしだカラム(10
%アセトニトリル、0.1%(マ/マ)トリフルオロ酸
l!2)を平衡バッファからなる蔵勾配でデベロップし
、制限バッファ(60チアセトニトリル、0.1%(マ
/V))リフルオロ酢酸)を40分デベロップし、2a
の留分なえた。
除いた30IILtの濃縮物をセファデックスに−25
(微Mfi)ゲル濾過カラムを用いて脱塩した。ペプチ
ド留分を集め工凍結乾燥した。生成物をWaters
Microbondapak CH@を充填したl0c
mカラムを用いる逆相高能率液体クロマトグラフィーを
用いてさらにvJ製した。既に平衡にしだカラム(10
%アセトニトリル、0.1%(マ/マ)トリフルオロ酸
l!2)を平衡バッファからなる蔵勾配でデベロップし
、制限バッファ(60チアセトニトリル、0.1%(マ
/V))リフルオロ酢酸)を40分デベロップし、2a
の留分なえた。
主ビーク留分を果め2回凍結乾燥した。回収した生成物
をCM−52カラム上でのイオン交換クロマドグ2フイ
ーによってHCl塩にかえ、セファデックスG−25(
微細)カラム上でゲル濾過した。精製したペプチド留分
な集め凍結乾燥した。
をCM−52カラム上でのイオン交換クロマドグ2フイ
ーによってHCl塩にかえ、セファデックスG−25(
微細)カラム上でゲル濾過した。精製したペプチド留分
な集め凍結乾燥した。
生成物を「ふわふわした」白色固体として得た。生成物
のアミノ酸分析はカッコ内に示す埋鍮値に対して次の比
を与えた:Aap2゜0 (20)、rhデ 5.2
(53、S#デ 3.8(4)、Gl* 2.8(3
3、Pro 2.0(2)、 Gly 3.0
(4J、 VaL O,9(1)、 Law
5.0(5)% Lyj 1.9(2入 Arg
O,94(1入 C,al、91(2)、Tyr
O,91(υ。
のアミノ酸分析はカッコ内に示す埋鍮値に対して次の比
を与えた:Aap2゜0 (20)、rhデ 5.2
(53、S#デ 3.8(4)、Gl* 2.8(3
3、Pro 2.0(2)、 Gly 3.0
(4J、 VaL O,9(1)、 Law
5.0(5)% Lyj 1.9(2入 Arg
O,94(1入 C,al、91(2)、Tyr
O,91(υ。
生体内でのカルシトニン類似体の生物学的分析デス−1
7−ヒステジンーサーモン0カルシトニンの生物学的能
力をデス−Ei#I?−5CTおよび合成サーモン・カ
ルシトニン標準物の等吸付は調剤量の投与後の血清カル
シウム濃度の減少を比較することによって測定した。ラ
ットを7匹づつの4つのグループに分け、それぞれのグ
ループに標準溶液また(工試験溶液の調剤量をランダム
に与えた。
7−ヒステジンーサーモン0カルシトニンの生物学的能
力をデス−Ei#I?−5CTおよび合成サーモン・カ
ルシトニン標準物の等吸付は調剤量の投与後の血清カル
シウム濃度の減少を比較することによって測定した。ラ
ットを7匹づつの4つのグループに分け、それぞれのグ
ループに標準溶液また(工試験溶液の調剤量をランダム
に与えた。
調剤量応答曲線の線状部分から低調剤量および晶調剤量
をえらんだ。サーモンφカルシトニン標準物についテ、
コレらの値はそれぞれ0.7および2.In?ペプチド
/1ooyjFBテl>−’)り。コtLk’5jlt
l 3オjヒ9 MU / 1001 BWである。ペ
プチドを皮下注射(0,2111t/100jl B
W)によって与え、1時間後に採血し℃血清カルシウム
を測定した。採血後2時間以内に血清を処理し分析した
。結果を2X2平行線分析[: Ga d d %n
+)、li、、J、Phanm。
をえらんだ。サーモンφカルシトニン標準物についテ、
コレらの値はそれぞれ0.7および2.In?ペプチド
/1ooyjFBテl>−’)り。コtLk’5jlt
l 3オjヒ9 MU / 1001 BWである。ペ
プチドを皮下注射(0,2111t/100jl B
W)によって与え、1時間後に採血し℃血清カルシウム
を測定した。採血後2時間以内に血清を処理し分析した
。結果を2X2平行線分析[: Ga d d %n
+)、li、、J、Phanm。
Pharnhacol−p 6 p 345 (19
53) )によって分析した。使用した標準サーモン・
カルシトニンは独立に4.0001 U/■より多(を
含むと測定された。デス−1jia” −S CTは4
,2501U/〜で分析された。
53) )によって分析した。使用した標準サーモン・
カルシトニンは独立に4.0001 U/■より多(を
含むと測定された。デス−1jia” −S CTは4
,2501U/〜で分析された。
本発明のおる釉の具体例を詳細に記述したけれども、多
くの他の特定の具体例が実施し5ること、多(の変化が
行ないうろこと、およびこれらのすべてが本発明の精神
および特許請求の範囲内にあることが当業者にとって明
らかであろう。
くの他の特定の具体例が実施し5ること、多(の変化が
行ないうろこと、およびこれらのすべてが本発明の精神
および特許請求の範囲内にあることが当業者にとって明
らかであろう。
平成1年τ月3
特許庁長官 吉 1)文 毅 殿
1、事件の表示
平成1年特許願第128014号
2、発明の名称
デス−17−ヒスチジン−カルシトニン3、@正をする
者 事件との関係
者 事件との関係
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、デス−17−ヒスチジン−カルシトニンからなる変
性カルシトニン。 2、該カルシトニンがサーモンカルシトニン欠失(de
le−tion)類縁体、イールカルシトニン欠失類縁
体又はチキンカルシトニン欠失類縁体である請求項1記
載のカルシトニン。 3、式 【遺伝子配列があります】 式 【遺伝子配列があります】(イール)又は 式 【遺伝子配列があります】(チキン)なる構造を有する
請求項1記載のカルシトニン。 4、式 【遺伝子配列があります】 (サーモン) 式 【遺伝子配列があります】 (イール)又は 式 【遺伝子配列があります】 (チキン) 但しR_1はS−n−アルキル、Cys又はHであり、
R_2はS−n−アルキル又はHであり、R_2がHの
ときはR_1はS−n−アルキル、Cys又はHであり
R_1がHのときはR_2はS−n−アルキル又はHで
ある、 なる構造を有する請求項1記載のカルシトニン。 5、該カルシトニンが式 【遺伝子配列があります】 (サーモン)なる 構造をもつ〔1,7−アルフア−L−アミノスベリン酸
デス−16−ヒスチジン−サーモンカルシトニンである
請求項1記載のカルシトニン。 6、該カルシトニンが式 【遺伝子配列があります】 (イール構造をも つ〔1,7−アルファ−L−アミノスベリン酸デス−1
6−ヒスチジン−イールカルシトニンである請求項1記
載のカルシトニン。 7、該カルシトニンが式 【遺伝子配列があります】 (チキン)なる構造を もつ〔1,7−アルフア−L−アミノスベリン酸デス−
16−ヒスチジン−チキンカルシトニンである請求項1
記載のカルシトニン。 8、請求項1記載の変性カルシトニンを有効成分として
含む血中カルシウム濃度調節剤。9、カルシトニンの単
位ドースが体重100g当り約0.7〜21mgである
請求項8記載の血中カルシウム濃度調節剤。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US07/197,538 US5001222A (en) | 1988-05-23 | 1988-05-23 | Des-17-histidine-calcitonin |
US197538 | 1988-05-23 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0217200A true JPH0217200A (ja) | 1990-01-22 |
Family
ID=22729808
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1128014A Pending JPH0217200A (ja) | 1988-05-23 | 1989-05-23 | デス―17―ヒスチジンカルシトニン |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5001222A (ja) |
EP (1) | EP0343577A3 (ja) |
JP (1) | JPH0217200A (ja) |
AU (1) | AU3508989A (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9657967B2 (en) | 2012-05-16 | 2017-05-23 | Alion Energy, Inc. | Rotatable support system for mounting one or more photovoltaic modules |
US9937846B2 (en) | 2013-09-11 | 2018-04-10 | Alion Energy, Inc. | Vehicles and methods for magnetically managing legs of rail-based photovoltaic modules during installation |
US9988776B2 (en) | 2015-09-11 | 2018-06-05 | Alion Energy, Inc. | Wind screens for photovoltaic arrays and methods thereof |
US10122319B2 (en) | 2013-09-05 | 2018-11-06 | Alion Energy, Inc. | Systems, vehicles, and methods for maintaining rail-based arrays of photovoltaic modules |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5710244A (en) * | 1992-12-31 | 1998-01-20 | Labroo; Virender M. | Derivatized calcitonins |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4604236A (en) * | 1985-03-18 | 1986-08-05 | Orlowski Ronald C | Calcitonin analogs |
US4639509A (en) * | 1985-03-28 | 1987-01-27 | Armour Pharmaceutical Company | [16,19-Di-alanine] calcitonin |
US4746728A (en) * | 1986-05-05 | 1988-05-24 | Armour Pharmaceutical Company | 8-glycine, des-19-leucine-calcitonin |
US4732969A (en) * | 1986-05-05 | 1988-03-22 | Armour Pharmaceutical Corporation | Des-19-leucine, 20-glutamine-calcitonin |
US4764590A (en) * | 1987-04-21 | 1988-08-16 | Rorer Pharmaceutical Corporation | Des-19-leucine, 20-glutamine, 21-threonine-calcitonin |
US4764591A (en) * | 1987-04-21 | 1988-08-16 | Rorer Pharmaceutical Corporation | Des-19-leucine, 20-glutamine, 21-threonine, 22-tyrosine-calcitonin |
JPH07117093B2 (ja) * | 1987-05-11 | 1995-12-18 | 株式会社ニフコ | ボルト締付け用プラスチッククリップ |
US4764589A (en) * | 1987-05-26 | 1988-08-16 | Rorer Pharmaceutical Corporation | [N-alpha-acyl,8-glycine, des-19-leucine]-calcitonin |
-
1988
- 1988-05-23 US US07/197,538 patent/US5001222A/en not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-05-23 AU AU35089/89A patent/AU3508989A/en not_active Abandoned
- 1989-05-23 JP JP1128014A patent/JPH0217200A/ja active Pending
- 1989-05-23 EP EP19890109217 patent/EP0343577A3/en not_active Withdrawn
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9657967B2 (en) | 2012-05-16 | 2017-05-23 | Alion Energy, Inc. | Rotatable support system for mounting one or more photovoltaic modules |
US10122319B2 (en) | 2013-09-05 | 2018-11-06 | Alion Energy, Inc. | Systems, vehicles, and methods for maintaining rail-based arrays of photovoltaic modules |
US9937846B2 (en) | 2013-09-11 | 2018-04-10 | Alion Energy, Inc. | Vehicles and methods for magnetically managing legs of rail-based photovoltaic modules during installation |
US9988776B2 (en) | 2015-09-11 | 2018-06-05 | Alion Energy, Inc. | Wind screens for photovoltaic arrays and methods thereof |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0343577A3 (en) | 1990-10-03 |
AU3508989A (en) | 1989-11-23 |
US5001222A (en) | 1991-03-19 |
EP0343577A2 (en) | 1989-11-29 |
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