JPH0216984A - Ｂａｒ１分泌シグナル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、一般に、蛋白質の発現に関し、さらに詳しく
は、酵母および哺乳動物細胞中の蛋白質の発現における
特定の分泌シグナルの使用に関Ｊる。

〔従来の技術〕

最近において、遺伝子工学の技術における進歩は、より
高等生物体に由来し、そして特定の蛋白質をコーＦする
ＤＮＡ配列が酵母細胞中で発現できることを示した。組
み換えＤＮＡ技術は、また、導いた。

酵母中での真核生物（例えば、哺乳動物）の遺伝子生成
物の生産は、哺乳類動物またはバクテリアの細胞の培養
を用いる生産に卓越する利点を有する。異種蛋白質の生
産のための宿主としてバクテリアを使用することにおけ
る主な欠点の１つは、生成物を製剤として使用できる前
に、エンドキシン生成物を完全に除去しなくてはならい
ということである。バクテリア中で生産された異種蛋白
質は、低い溶解性をもち、この問題は、克服されなりれ
ば、製剤としてのそれらの使用をきびしく制御１Ｊする
。ざらに、商業的レベルで蛋白質生成物を発現するため
の哺乳動物細胞の使用はひじょうに経費を必要とする。

対照的に、酵母の商業的規模の発酵は、よく確立されて
おり、異種蛋白質生成物の人足の生産を可能とする。酵
母は、バクテリアよりもｌ１ｄｉ　！７Ｌ動物細胞との
類似性を有する真核生物体である。酵母生成蛋白質は、
また、細胞によって培地中に分泌されることができ、こ
こで量の汚染蛋白質の鼠が減少していることは生成物の
精製を促進する。分泌は、また、ある種の蛋白質の適当
なフメルディング（ｆｏｌｄｉｎｇ）および／または生
物学的活性のために要求されうる、グリコジル化および
ジザルファイド結合の形成を可能としうる。酵母および
哺乳動物細胞の分泌系は類似する。両者の細胞のタイプ
は、分泌オルガネラ、例えば、小胞体（ｅｎｄｏｐｌａ
ｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）　、ゴルジ装置、およ
び細胞表面への小包移送（ｖｅｓｉｃｌｅ　ｔｒａｎｓ
ｉｔ）系を有する。さらに、生産される蛋白質上に見い
だされる分泌シグナルのペプチドは２つ細胞タイプにお
いて非常に類イ以しくＷａｔｓｏｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｃｈ１２：５１５４．１９８４
）、重要な面は疎水性アミノ酸のコアである。これらの
シグナルペプチドは、新しく合成されたシグナル蛋白質
を小包胞体膜へ供給しそしてそれらをそれらのルーメン
中に挿入するＩＭｌの蛋白質によって認識される。分泌
ペプチドは、酵母および削孔動物細胞の両者において、
シグナルプＩ：Ｉテアーゼによって分泌蛋白質から実質
的に除去される。真核生物分泌通路については、Ｋｅｌ
ｌｙＳｃｉｔ！ｎｃｑ　２３０：１９８５参照。

酵母からの異種蛋白質の分泌は、自然酵母分泌ペプチド
の使用によって達成されて来た。酵母から分泌されるこ
とが知られているポリペプチドは、ペプチドを分泌経路
に入らせる疎水性アミノ末端部分を含有する。疎水性領
域は「シグナルペプチド」として知られている。シグナ
ルペプチドは、一般に、他の配列との組み合わせにおい
て、成熟ポリペプチドまたは蛋白質の分泌を制御する。

これらの配列は、典型的には、分泌の間に成熟ポリペプ
チドから切り放され、そして集合的に分泌ペプチドを構
成する。α−因子分泌ペプチド（ｐｒｅ−ｐ　ｒ　Ｏ配
列）　（ＫｕｒｊａｎおよびＩｌｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、
　Ｃｅ１ｌ創：　９３３−９４３．１９８２）は、種々
の研究者らによって、酵母から異種蛋白質を分泌するた
めに使用されてきている（Ｂｒａｋｅ、欧州特許１１６
，２０１号、＋９８３；Ｂ１１ｔｅｒ、欧州特許１２３
，２９４号、　１９８４　；　Ｓｉｎｇｈ、欧州特許１
２３，５４４号；Ｏ５旧川ら、欧州特許１７１．．００
０゜１９８５）。Ｂｒａｋｅ　（欧州特許１１．６，２
０１号、　１９８３）ば、ＭＦα１プロモーターおよび
分泌ペプチドを利用して、ヒト表皮成長因子を分泌せし
めた。Ｂｉｔｔｅｒ（前掲）は、ＭＦα１プロモーター
および分泌ペプチドを利用して、ヒ１−（Ｌｅｕ５）β
−エンドルフィンを分泌せしめた。Ｓｉｎｇｎ（前掲）
は、２つの遺伝子ＭＦα１およびＭＦα２をクローニン
グし、それらの蛋白質はＭＡＴａ細胞中におけるＧ１の
阻止を誘発できる。Ｓｉｎｇｈによってクローニングさ
れたＭＦαｌ遺伝子は、ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋ
ｏｗｉｔｚ　（前掲）が記載するＭＦα１ｉｆｔ伝子に
相当することが示された。ＭＦα２遺伝子は、ＭＦα１
遺伝子に本来類似するが、同一でないことが示された。

ＳｉｎｇｈはＭＦα１プロモーターおよび分泌ペプチド
を使用して、種々の異種蛋白質を分泌−ｕしめた。ごれ
らは、有意な量で分泌される蛋白質、例えば、ヒトイン
ターフェロンＤ、ヒト血清アルブミン、ウシインターフ
ェロンαｌ、ウシインターフェロンα２、組織プラスミ
ノゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）およびヒトインスリ
ン様成長因子；および微量で分泌されるタンパク質、例
えば、レンニンおよびヒトインターフェロンγを包含す
る。Ｏｈｓｉｍａら（前掲）は、ＭＦα１プロモーター
および分泌ペプチドを使用して、αネオエンドルフィン
およびインターロイキン２を分泌せしめることを報告し
た。それらは、他の蛋白質およびペプチド、例えば、イ
ンスリン、ソマトスタチン、成長ホルモン、成長ホルモ
ン刺激因子、利尿ホルモン、インターフェロン、腫瘍壊
死因子およびリンフォトキシンの分泌におけるＭＦα１
の利用を示唆している。

ＬｅｍｏｎｔＬら（ＷＯ８６１００６３８）は、ＰＨ０
５分泌ペプチドを使用して、酵母から異種蛋白質を分泌
せしめた。ｌ１ｒａｋｅ（欧州特許１２３．２８９．１
９８４）　は、α因子分泌ペプチドを使用して異種蛋白
質を分泌せしめることを報告した。

Ｓ、セレビシアエ（Ｓ、ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）　（以後
、Ｓ、セレビシェ−）ＢＡＲＩ遺伝子は、メイテイング
（ｍａｔｉｎｇ）タイプａ細胞から分泌される「バリヤ
ー」（Ｂａｒｒｉｅｒ）として知られている蛋白質をコ
ードする。このバリヤー蛋白質は、細胞がα−因子の■
害作用を克服できるようにする。ＢＡＲ−上の分泌経路
は、α−因子の分泌経路とは異る経路を代表する。

米国特許第４，６１３，５７２号（Ｍａｃｋａｙら、１
９８Ｇ）は、ＢＡＲ１遺伝子を使用して、異種蛋白質を
分泌することができることを開示しているが、これに関
して有用であるであろう遺伝子の特定の領域を同定して
いない。

ＷＯ３７１０２６７０（Ｍａｃｋａｙ）は、ＢＡ−Ｒ１
シグナルペプチドコード領域を使用して、形質転換され
た酵母細胞からの異種遺伝子生成物の低いレヘルの分泌
を指令することを開示している。Ｍａｃｋａｙ　（前出
）が記載するＢＡＲ１分泌系は、α−因子分泌ペプチド
より低い効率の分泌シグナルを提供することがわかった
。

酵母からの組織プラスミノゲンアクチベーターの分泌の
研究は、α−因子分泌ペプチドがｔＰＡまたはウロキナ
ーゼを培地中に効率よく移送しないことを示している。

これは、また、他の異種蛋白質について真実である事を
証明される。

〔発明が解決しようとする課題〕

結局、この分野において、異種蛋白質を酵母からより効
率よい方法で分泌させる他の分泌ペプチドを同定するこ
とが要求されている。本発明は、この要求を満足し、そ
して、さらに、他の関連する利点を提供する。

Ｃ課題を解決するための手段〕 要約すれば、本発明は、ＤＮＡ造成物を開示し、この造
成物は、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と、
これに続くリーディングフレーム内にＢＡＲ１遺伝子生
成物の部分であって少なくともＣ−末端ドメインの一部
分を含むもの及び異種蛋白質又はポリペプチドをコード
する第二のＤＮＡ配列に作用可能に連結された転写プロ
モーターを含んで成る。好ましいシグナルペプチドはバ
リヤーシグナルペプチドである。１つの態様において、
第二のＤＮＡ配列は、異種蛋白質又はポリペプチドをコ
ードするセグメント、及びその下流に続く、ＢＡＲ１遺
伝子生成物のＣ−末端ドメインの少なくとも−１をコー
ドするセグメントを含んで成ることができる。あるいは
、第二のＤＮＡ配列は、ＢＡＲｌ遺伝子生成物のＣ−末
端ドメインの少なくとも一部をコードするセグメント、
および引き続く下流に、異種蛋白質またはポリペプチド
をエンコードするセグメーントを含んで成ることができ
る。

本発明の１つの面において、前記Ｃ−末端ドメインの部
分は、番号３９１のセリンから始まりそして番号５２６
のセリンで終わる第１図のアミノ酸配列を含んでる。本
発明の関連する面の範囲内で、前記Ｃ−末端ドメインの
部分は、番号４２３のアラニンから始まりそして番号５
２６のセリンで終わる第１図のアミノ酸配列を含んで成
る。

他の面において、第二のＤＮＡ配列は、さらに、異種蛋
白質またはポリペプチドをコードするセグメントに隣接
して位置する切断部位をコードするセグメントを含んで
成る。好ましい態様に範囲内で、前記切断部位は２塩基
部位またはトロンビン切断部位である。

本発明のなお他の面において、第二のＤＮＡ配列は突然
変異誘発され、ＢＡＲ１遺伝子生成物のアミノ酸４６８
および５０３の一方または双方における炭水化物の付加
を防止する。好ましくは、第二のＤＮＡ配列は位置４６
８および／または位置５０３におけるグルタミンをコー
ドする。

本発明は、種々の蛋白質、例えば、ウロキナーゼ、イン
スリン、血小板誘導因子およびその類似体を発現するた
めに使用できる。好ましい態様の範囲内で、転写プロモ
ーターはトリオースホスフェートイソメラーゼ（ＴＰｒ
）酵素またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）酵
素をコードする遺伝子のそれである。このようなりＮＡ
造成物で形質転換された酵母細胞および哺乳動物細胞も
また開示される。

本発明の他の面において、問題の蛋白質を製造する方法
を開示する。この方法は、一般に、（ａ）シグナルペプ
チドをコードするＤＮＡ配列に作用可能に結合された転
写プロモーター並びに引き続いてリーディングフレーム
内に、異種蛋白質又はポリペプチドおよびＢＡＲｌ遺伝
子生成物のＣ末端ドメインの少なくとも部分をコードす
る第二のＤＮＡ配列を含んで成る造成物を含有する宿主
細胞を、適当な培地中で増殖せしめ、そして（ｂ）該宿
主細胞から蛋白質またはポリペプチドを単離することを
含んでなる。好ましい宿主細胞は、酵母細胞および哺乳
動物細胞を包含する。この方法は、また、分離工程後、
蛋白質生成物を精製することを包含できる。

本発明のこれらの目的および他の面は、以下の詳細な説
明および添付図面を参照とすことにより明らかになるで
あろう。

（Ｉ４） 〔具体的な説明〕 前述のように、本発明は、宿主細胞中で生産される異種
蛋白質の分泌を指令するシグナルペプチドをコードする
配列（シグナル配列）と関連して、Ｓ、セレビシェ−Ｂ
ＡＲ１遺伝子生成物のＣ−末端領域［第３ドメイン（ｄ
ｏｍａｉｎ）　］の一部をコードする配列を利用する。

シグナル配列およびバリヤーＣ−−末端領域の一部をコ
ードする配列は、−緒になってハイブリッド分泌ペプチ
ドをコードする。

次いで、このハイブリッド分泌性ペプチドを使用して、
宿主細胞からの異種蛋白質またはポリペプチドの分泌を
指令する。シグナルペプチドおよび第３ドメインは隣接
することができ、異種蛋白質またはポリペプチドはハイ
ブリッド分泌性ペプチドにその下流（Ｃ−末端）におい
て融合しているか、あるいは異種蛋白質またはポリペプ
チドはハイプリント分泌性ペプチドの部分の間に位置す
ることができる。いずれの配置においても、プロセシン
グシグナル（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｓｉｇｎａｌ）　
、好ましくはアミノ酸Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ａｒｇ
。

Ｌｙｓ−ＬｙｓまたはＡｒｇ−Ｌｙｓから成る二塩基切
断部位を使用して、分泌性ペプチドと異種蛋白質の間の
切断を実施する。好ましい二塩基切断部位はＫＥＸ２切
断部位Ｌｙｓ−Ａｒｇである。

あるいは、トロンビン部位を、分泌ペプチドと異種蛋白
質との間のプロセシング部位として使用できる。

好ましい態様において、ハイブリッド分泌性ペプチドは
、シグナルペプチドおよびバリヤーのＣ−末端ドメイン
またはＣ−末端ドメインの一部から本質的に成る。バリ
ヤーの第１および第２ドメインに由来する配列は、実質
的に存在しないであろう。前述のように、蛋白質分解プ
ロセシングシグナルもまた、含めることができる。

また、前述のように、好ましいシグナル配列はＢＡＲ１
シグナル配列であることができるが、Ｓ。

セレビシェ−ＰＨ０５遺伝子のそれもまた使用できる。

ＢＡＲ１遺伝子によってコードされるバリヤー蛋白質の
前駆体は、そのアミノ末端に推定上のシグナルペプチド
を含有する。この推定上のシグナルペプチドは、疎水性
アミノ酸のコアによって特徴つけられ、そしてアミノ酸
ｌからアミノ酸２４へ延びると思われる（第１図）。−
ＢＡＲ１−次翻訳生成物のこの部分は、分泌経路を通っ
てのバリヤーのプロセシングの間に除去されると思われ
、そしてこの明細書においてｒＢＡＲ１シグナルペプチ
ド」と呼ぶ。ＢＡＲ１遺伝子の対応する部分は、この明
細書において「シグナル配列」と呼ぶ。

例示的発現単位は、少なくともＢＡＲ１シグナル配列お
よび第３ドメインコード配列を含み、そしてまた、他の
ＢＡＲ１配列を含むことができる。

例えば、１つの適当な発現側単位はＴＰｌ、１プロモー
ター（Ｋａｗａｓａｋｉ、米国特許第４，５９９，３１
１号、１９８Ｇ）　、−Ｂ　Ａ　Ｒ１シグナル配列、ア
ミノ酸３９１−５２６をコードするＢＡＲＩ　Ｃ−末端
ドメインのための配列の部分、２塩基切断部位をコード
する配列、および異種蛋白質のためのコード配列、例え
ば、インスリン前駆体ＭＩ−３をコードずするＤＮＡ配
列［Ｍａｒｋｕｓｓｅｎら、欧州特許１６３．５２９号
に記載されてしするようにｒＢ（１−２９）八Ｉａ　Ａ
ｌａ　Ｌｙｓ　Ａ（１−１２）Ｊとしても知られる〕、
を含んで成る。

他の例示的発現単位は、ＴＰＩＩプロモーター開始ＡＴ
Ｇから＋１５７２ｂｐにおけるＥｃｏ旧部位までのＢＡ
Ｒ１遺伝子、２塩基切断部位をコードする配列、および
異種蛋白質のためのコード配列、例えば、インスリン前
駆体Ｍｌ−３をコードするＤＮＡ配列を含んで成る。

さらに他の発現単位は、ＴＰＩＩプロモーター酵母ＰＨ
０５（伸性性（ｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ）ホスファクー
ゼ〕シグナル配列、ブタ・ウロキナーゼｃＤＮＡ、アミ
ノ酸４２３−５２６をコードする運ＡＲ１第３ドメイン
配列の一部、およびＴＰＴＩターミネータ−を含んで成
る。

分泌性ペプチドと異種蛋白質との間のプロセシング部位
としてのトロンビン切断部位の別の使用は、他の例示的
発現単位を生ずる。１つのこのような発現単位は、ＴＰ
ＩＩプロモーター、且−へ３−１シグナル配列、ＢＡＲ
Ｉ　Ｃ−末端ドメインのためのコード配列、トロンビン
切断部位（アミノ酸プ１１リンおよびアルギニン）をコ
ードする配列、異種蛋白質のためのコード配列、例えば
、インスリン前駆体Ｍｌ−３をコードするＤＮＡ配列を
含んで成る。

ＢＡＲＪｉｆｆ伝子配列の分折子配列リヤーおよびいく
つかのペプシン様プロテアーゼの間の相同性を示した。

さらに、バリヤーは、これらのプロテアーゼとの相同性
を示さない、第３ドメインをそのＣ−末端に含有する。

本発明者らによるそれ以上の研究は、このドメイン内の
配列が細胞からのバリヤーの輸送に必要であることを示
した。

−ＷムＲ，１准定ジグづ”ル配列を第３（Ｃ−末端）ド
メインの１３６アミノ酸のためのコード領域と組み合わ
せることによって、本発明者らはＭＦα１ｐ　ｒ　ｅ　
−ｐ　ｒ　Ｏ配列を含んで成るｌ造成物を使用して得ら
れたものよりも高い異種蛋白質についての分泌レベルを
得た。

Ｃ−末端ドメインの１３６アミノ酸部分を使用するこ七
に加えて、このドメインのより小さいセグメントを使用
することができる。制限酵素による切断およびエキソヌ
クレアーゼによる消化を使用することによって、第３ド
メインのより小さい断片を発生させ、そして形質転換さ
れた細胞からの蛋白質の分泌を指令するそれらの能力に
ついて試験した。例えば、１系列の実験において、串Ａ
Ｒ上遺伝子をいくつかの便利な制限部位において切断し
て、Ｃ−末端の欠失を発生させた。次いで、遺伝子断片
を物質ＰのＣ−末端部分をコードする断片に融合せしめ
た（Ｍｕｎｒｏ：およびＰｅｌｈａＨｌｆｉ−ＭＢＯノ
エー３　：　３０８７−３０９３．１９８４）。得られ
た融合蛋白質を、物質Ｐに体する抗体を使用して、検出
しかつ定量した。これらの研究により、位１ｆｆ１２６
７　（第１図）から位置１５７２におけるＥｃｏＲＴ部
位までの領域を適当なシグナルペプチドコード配列と組
み合わせて、強力なハイプリン）・分泌性ペプチドを得
ることができる。

また、ＢＡＲ］第３ドメインの突然変異を含有する発現
単位を発生さゼ、こうしてアミノ酸４６８４７０（グリ
コジル化部位＃７）、またはアミノ酸５０３．５０５（
グリコジル化部位＃８）、または両部位におりるＮ−結
合グリコシル化部位を突然変異誘発させて、それぞれ、
アミノ酸４６８または５０３における炭水化物の付加を
防止することも有利であろう。Ｎ−結合グリコシル化は
Ａｓｎ’−Ｘ−３ｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ　　（
ここでＸは任意のアミノ酸であることができる）のアク
セプター・ｌ・リベプチド配列において起こるが、これ
らのトリペプチド配列のすべてはＮ−結合グリコシル化
に対するポストではない。Ｎ−結合グリコシル化アクセ
プタ一部位を、トリペプチドアクセプター配列の部位の
いずれかにおける他のアミノ酸コドンで置換することに
よって炭水化物部分の付加を防止するために、突然変異
誘発することができる。

例えば、アクセプター配列Ａｓｎ−Ｘ−３ｅｒま、？、
＝ハ八ｓへｎ−Ｘ−Ｔｈ　ｒのいずれかの第２位置にお
りるプロリン残基は酵母におけるグリコジル化を阻止す
ることができる（Ｍａｒｓｈａｌｌ　、ＢＬ匹豆明ユＳ
Ｑ以づ７ｍＢ、　４０　：　１７−２６．１９７４）　
、アクセプター・トリペプチド配列の第３アミノ酸もま
た変化させるごとができる。とくに好ましい態様におい
て、トリペプチドアクセプター配列の第１位：１°’；
ｌこおりるアスパラギンを他のアミノ酸装置８換える。

最も好ましくは、グルタミン残基（ＧＩｎ）をＡｓｎ残
基の代りに用いる。しかしながら、他のアミノ酸の置換
もまたトリペプチドアクセプター配列の３つの位置にお
いて実施して炭水化物の付加を防止することができる。

部位＃７もしくは＃８、または両者の部位における炭水
化物のＮ−結合イ１加を阻止する突然変異は、好ましく
は部位特異的生体外突然変異誘発によって生成される。

特に好ましい突然変異は、トリペプチド・アクセプター
配列の第１位におけるＡｓｎ残基に対するＧｉｎ置換を
発生さ−Ｕる。位置＃７または＃８においてＢ１３上第
３ドメイン・グリコジル化部位の突然変異を発生させる
ことによって、野生型グリコジルを伴う昇カ１シ１．第
３ドメイン及び竺旦α１　　ｐｒｅ−ｐｒｏ配列または
−ＷΔ３−しシグナルペプチドを含んで成る類似の構成
体を使用して得られるものよりも高い、異種蛋白質につ
いて分泌レベルを本発明者らは得た。位置＃７まノこは
ｆｆ　８におけるグリコジル化部位の突然変異を含りす
るｒ３　Ａ升−し造成物で形質転換した細胞と、完全に
グリコジル化される刀ＡＲＩ造成物で形質転換した細胞
の間の増殖曲線の比較において、完全にグリコジル化さ
れるＢＡＰ　Ｉ造成物の形質転換体において明らかな増
殖ラグは、突然変異誘発した造成物の形質転換体におい
て欠けている。

２塩基切断部位を含有する本発明の発現単位は、好まし
くは適当なプロモーター、二人に士遺伝子の適当な部分
、２塩基切断部位をコードするアダプター、異質種伝子
またはｃＤＮＡ、および転写ターミネータ、例えば、Ｔ
Ｐｒｌターミネータを連結することによって生成される
。トロンビン切断部位を含有する本発明の発現単位は、
好ましくは、前述の発現単位中に含有される２塩基プロ
セス部位の生体外突然変異誘発によって、例えば、Ｌｙ
ｓ−ＡｒｇをＰｒｏ−Ａｒｇに変化させることによって
、あるいはトロンビン切断部位をコードするアダプター
を有する発現単位を組み立てるごとによって生成される
。

次いで、生ずる発現単位を適当なベクター中に連結する
。適当な酵母ベクターは次のものを包含する：　Ｙ　Ｒ
Ｊ）　７　　（Ｓｔｒｕｈｌら、（Ｐｒｏｃ＝ｊＪａ−
Ｌｏ−Ｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　、ヱ６　　：　　１０３５−１０３
９　　、１９７８）　　、　Ｙ　Ｆ、ｐ　１３（Ｂｒｏ
ａｃｈら、ｐｅｎｅ、　　８．　８　：　１２１−１３
３．　７９７８）、ｐＪＤ８２４Ｂおよびｐ　Ｊ　Ｄ　
Ｂ　（Ｂｃ４ｇｓ、勘ｔｕｒ−ｑ、２７Ｅ＞：１０４−
１０８．１７８）およびそれらの誘導体。このようなベ
クターは、一般に、選択マーカー、例えば、栄養マーカ
ー、山ＥＵ２　（これはＩｃｕ２を有する宿主菌株にお
ける選択を可能とする）、またはシゾサツカロミセス・
ボムベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ肛叩
勤）からの解糖系遺伝子ヱーｐ−工１　（Ｋａｗａｓａ
ｋｉおよびＢｅ１ｌ、欧州特許１７１　、１４２号）（
これはｌ、ｐ−ｉ　１突然変異を有する宿主菌株におけ
る選択を可能とする）を包含する。好ましいプロモータ
ーは、酵母解糖系遺伝子からのものＣＩｌＣｌｌｉｔｚ
ｅら、！」ｊ煩−Ｃｈｅｍ、　２５５　：　１２０７３
−１２０８０．１９８０　；　　八ＩｂｅｒおよびＫａ
ｗａｓａｋｉ、　　Ｊ、Ｍｏ＋、八　　ｌ、　　Ｇｅｎ
ｅｔ、　　　」−：旧”ｌ−４３４，１９Ｂ２）または
アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子からノモの（Ｙｏｕ
ｎｇら、釦Ｍ月上上吐肋朋１１ｇ　ｏｒ旧ｃｒｏｏｒ　
ａｎｉｓｍｓ　ｆｏｒ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　ｌ１ｏ
ｌａｅｎｄｅｒら編ｐ、３５５．　　ｌ’ｌｅｎｕｍ、
Ｎ’、Ｙ、＋　　１９８２　；　　八ｍ１ｎｅｒｅｒ、
　　Ｍｅｎｍｏｌ、　　ｊＱ↓：１９２−２０１．１９
８３）である。これに関しで、とくに好ましいプロモー
ターはＴＰＩＩプロモーター（Ｋａｗａｓａｋｉ、米国
特許第４，５９９，３１１号、　１９８６）である。好
ましい転写停止シグナルはＴＰＩＩターミネータ−であ
る。

酵母ベクター中の発現単位を含んで成る造成物を、酵母
、例えば、サツカロミセス・セレビシア工（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）（以後、Ｓ、
セレビシェ−）の菌株中に形質転換する。酵母を形質転
換するだめの技術は、例えば、Ｂｅｇｇｓ　（前掲）お
よび旧ｎｎａｎら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｏｌ、八ｃａｄ、
　　Ｓｃｉ、［ＩＳＡ　　、どし５：１９２９１．９３
３．１９７８）において知られている。形質転換体を、
炭素および窒素源、ならびに特定の宿主菌株が要求する
他の栄養物質を含有する適当な培地中で’？ｔ”Ｄする
。ＰＯＴ１選択マーカーを含有するプラスミドで形質転
換した宿主細胞を、炭素源としてグルコースを含有する
複合培地中で培養することができる。

本発明における使用に通ずる酵母菌株は、プラスミドが
含有する選択マーカーによって補完され得る遺伝的欠陥
を有するであろう。選択マーカは一般に、宿主細胞にお
ける栄養要求変異を補完する遺伝子である。このような
遺伝子欠陥を有する酵母菌株は、例えば、＾ＴＣＣ（米
国マリイランド州ロックビル）または酵母遺伝子原料セ
ンター（Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃ
ｅｎｔｅｒ）　（米国カリフォルニア州バークレイ）か
ら商業的に入手可能であるか、あるいは突然変異および
選択の標準技術を使用して調製できる。特定の宿主およ
び選択マーカーの選択は、当業者の技量の範囲内である
。異種蛋白質の生産を最適化するために、宿主菌株は突
然変異、例えば、タンパク質分解活性を減少させるり阜
ｌ↓突然変異（Ｊｏｎｅｓ＋　ＧｅｎＬｉｃｓ、　８５
　：　２３＋１９７７）を有することが好ましい。

哺乳動物細胞の発現ベクターもまた、この分野において
よく知られている。種々のプロモーター例えば、ウィル
ス（例えば、ＳＶ４０およびアデノウィルス）プロモー
ターおよび細胞性プロモータ−（例えば、メタロヂオネ
イン遺伝子；　Ｋａｒｉｎ、米国特許第４，６０１，９
７８号；およびＰａ１ｍ１Ｌｅｒら、米国特許第４，５
７９，８２１号）が人手可能である。他の要素、例えば
、転写停止シグナル、ポリアデニル化シグナルおよび転
写増強配列は、特定の宿主細胞系にお＆）るそれらの機
能のためム二選択される。哺乳動物細胞を形質転換し、
そしてクローニングしたＤＮＡ配列を発現する方法は、
Ｋａｕｆｍａｎおよび５ｈａｒｐ（夫、Ｍｏ１．Ｂ１１
ｏ、　１５９：６０１−６２１．１９８２）、Ｓｏｕ　
ｔｈｅｒｎおよびＢｅｒｇ−σ１匣に蝕弦旦　上：３２
７３４１．１９８２）　、Ｌｏｙｔｅｒら、　　（Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｏｌ、Ａｃａ、Ｓｃｉ。

ｕｓ４　７！ｊ：４２２−４２６．１９８２）およびＮ
ｅｕｍａｎｎら。

（財則Ｑユニ１　：　８４１−８４５．１９８２）に記
載されている。細胞を血清含有培地または適当な補充物
質を含有する血清不合培地中で培養する。このような適
当な培地は、商業的に入手可能であるか、あるいは公表
された処方に従って調製できる（例えば、ＡＴＣＣのカ
タログ）。特定の精製のプロトコルは、精製すべき特定
のタンパク質の性質によって決定されるであろう。この
ような決定は当業者の技量の範囲内である。一般に、細
胞培地を細胞から分離し、そして蛋白質を培地から単離
する。有用な精製の技術は、沈澱、免疫吸着および種々
のクロマトグラフィー法、例えば、イオン交換りｌコマ
トゲラフイー、アフイニテイーク「７７トグラフイーお
よびゲルろ過による分画を包含する。

ＢＡＲ１遺伝子をＭａｃｋａｙら（米国特許第１１，６
１３，５７２号、　１９８６）に記載されているように
クローニングした。簡単に述べると、Ｓ、セレビシェ−
に由来する酵母ゲノムＤＮＡ断片のランダム混合物ベク
ターＹＥｐ１３中にを含有するプラスミドのプールを、
遺伝子型ＭＡＴａ、Ｉｅｕ２　　ｂａｒｌをもつ酵母菌
株中に形質転換した。形質転換体を、ロイシンを欠く合
成培地上で増殖するそれらの能力について選択した。形
質転換した細胞を、さらに、宿主細胞におけるｂａｒｌ
欠陥を補完するそれらの能力についてスクリーニングし
た。機能的Ｂ　Ａ　ｊ”；−１遺伝子を欠く酵母菌株Ｍ
ＡＴａ細胞は、α−因子による阻害に対して異常に感受
性である。次いで、α〜因子の阻害に対して抵抗性であ
ることがわかった形質転換体を、バリアー活性を分泌す
る能力についてスクリーニングした。ベクターＹＥＰ］
３および９．２ｋｂの酵母ゲノムインサートを含んで成
るプラスミドｐ　Ｂ　Ａ　Ｒ２（ＡＴＣＣＩ３６４１０
）は、ｂａｒｌ欠陥を完全に補完することがわかった。

ＢＡＲｌ遺伝子およびその関連するフランキング（ｆｌ
ａｎｋｉｎｇ）配列を、Ｈｉｎｄｎｌ−Ｘｈｏｌ断片と
して、ベクターｐ　Ｕ　Ｃ１３（ＶｉｅｉｒａおよびＭ
ｅｓｓｉｎｇ。

Ｇｅｎｅ、　３９　：　２５９．１９８２）中にサブク
ローニングした。

プラスミドｐＢＡＲ２をＨｉｎｌｌおよびＸｈｏｌで消
化して、ＢＡＲ１遺伝子を含有するほぼ３ｋｂの断片を
単離した。プラスミドｐＵｃ１３を、Ｈ４ｎ１ｌおよび
５ａｉｌで消化によって線状化した。

線状化したベクターをｐＢＡＲ２からの３ｋｂと連結し
た。生ずるプラスミドをｐＺＶ９と表示した（１！、Ｃ
ｏ１１菌株ＲＲＩ中の形質転換体として寄託された。　
ＡＴＣＣ１５３２８３）。

クローニングした一ＢＡＲＩ遺伝子の配列および一次翻
訳生成物の配列を第１図に示す。

第２図を参照すると、プラスミドｐＭ２２０（またｐ　
Ｍ２１０として知られている）を、エエ士土プロモータ
ーおよびターミネータの両者の人手源として使用した（
ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ＋　Ｊ、１ｉｐｐ１
．Ｇｅｎｅｔ。

上：　４１９−４３４．１９８２）。ｐＭ２２０で形質
転換した［。

コリ　ＲＲＩは、ＡＴＣＣに受託番号３９８５３で寄託
された。ＴＰＩＩプロモーターおよびターミネータ−を
含んで成るプラスミドｐＤ１１０７を造成するため、ま
ず、ｐＭ２２０の９ｏｏｂｐのＢｇｌＩｒ−Ｅｃ。

ＲＩ　　ＴＰＩＩプロモーター断片をｐＴ　Ｃ７（Ｍａ
ｒｓｈら、釦匹、共、　：４８１−４８５．１９８４）
中にサブクローニングして、プラスミドｆ１０１１０１
を発生させた。次いで、プラスミドｐＤ１１０１をＨｉ
　ｎ　ＩＩＩおよび５ｐｈｌで消化して、７００ｐｂの
部分的Ｔｒ’ＴＩプロモーター断片を単離した。ｐＵＣ
１８中にサブクローニングされたｐ　Ｍ２２０の８００
ｂｐのＸｂａ　Ｉ−Ｂａｍｌｌ′Ｆ　ＴＰｌｌ−プロモ
ーター断片を含んで成るプラスミドｐＤＲ１１００を、
Ｔ（ｉ　ｎ　Ｉ［ＩおよびＳｐｈ■て切断した。７００
ｂｐの部分的ＴＰＴＩプロモーターを線状化したｐＤＲ
１１００中に連結してｐＤ１１０７を生成した。プロモ
ーター配列の３゛末端にＸｂａ１部位を挿入するために
修飾されたｐＭ２２０からのニーＩ’１１プロモーター
を使用して、ｐＤ１１０７中に存在するＴＰｒｌプロモ
ーターを置換した。

プラスミドｐＭ２２０をＥｃｏＲＴで消化し、そして７
Ｐｆｉ−プロモーターを含んで成る０、９断片をアガロ
ースゲルの重水泳動によって分離し、そして末端をＤＮ
Ａポリメラーゼ■　（クレノー断片）で平滑末端とした
。キナーゼＸｂａＩリンカ−をこの断片に付加し、次い
でＢｇｌＵおよびＸｂａＴで消化した。次いで、この修
飾されたＴＰＴＩプロモーター断片をｒｌＤ１１０７の
３．４　ｋｂのＢｇｌｌＩ−ＸｂａＩベクター断片中に
連結してｐＺＶ１１８を生成せしめた。

次いで、ｐＺＶ１１８中のＴＰＩＩプロモーターの３゛
末端において再生したＥｃｏＲＩ部位を破壊した。この
プラスミ１゛をＩＩｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩおよびＥ（。

ｏＲＩで消化し、そして０．９ｋｂの断片を分離し、そ
してオリゴヌクレオチドＺＣ７０８（５’−へへＴＴＧ
ＣＴＣＧＡＧＴ−３’　）およびＺ　Ｃ７０９（３’　
−ＣＧＡＧＣＴＣＩＩＧＡＴＣ−５’）をアニーリング
するごとによって構成した合成リンカ−に連結した。［
オリゴヌクレオチドはアプライド・バイオシステムス（
Δｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３８０Ａ型合
成装置で合成し、そしてポリアクリルアミドゲルの電気
泳動によって精製した］。ＺＣ７０ＢおよびＺＣ７０９
をマニアチス（ＭａｎｉａＬｉｓ）ら■１とｃｕｌａｒ
　　Ｃ１ｏｎｉｎ　　＋　　八　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　
　　Ｍｅｔｈｏｄ、　　ｐ、１２２Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇ　１ｌａｒｂｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ
１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｅｒ、　Ｎ、Ｙ、、　１
９８２］に記載されている方法に従ってキナーゼ処理し
、そしてアニールした。アダプターの付加は、ＴＰＩＩ
プロモーター断片の３′末端におけるＥｃｏＲ１部位を
排除し、そしてＸｈｏＩおよびＸｂａ　１部位を付加す
る。次いで、この断片をＨ’＋ｎｍ−ＸｂａＴ切断ｐＵ
ｃ＋３に連結した。生ずるプラスミドをＰＺＶ１３４　
と表示する（第２図）。

実−極側」ニブラスミド　ＧＬＹ２．３の″１′プラス
ミドｐＭＴ６１０　（Ｍａｒｋｕｓｓｅｎら、欧州特許
ＩＧ３．５２９号；第３図参照）に由来する、ＭＦα１
リーダーおよびインスリン前駆体Ｍｌ−３（また、＋３
（１−２９）−ΔＩａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ　（１−２１）
としても知られている〕をコードする酵母コドン最適化
配列からなる０、５ｋｈの断片を突然変異誘発して、Ｍ
ＦαＩリーダー中に存在する２つの潜在的グリコジル化
部位を除去した。ＭＦα１１Ｊ−グーのアミノ酸５７（
グリコジル化部位＃２）およびアミノ酸６７（グリコジ
ル化部位＃３）で開始する部位を、各場合において、Ａ
ｓｎコドンをＧｉｎコドンに変化させることによって除
去した。突然変異誘発のため、ＰＭＴ（ｉｌｏに由来す
る。、ｓｋｂのＥｃ　ｏＲＴ−ＸｂａＴ　　ＭＦｃｙｌ
断片をＭ１３ｍｐＨ（これはＸｂａ　ＴおよびＥｃ　ｏ
ＲＩを使用する消化によって線状化されている）中に連
結した。生ずる組み換えファージをｍＣα６８と表示し
た。オリゴヌクレオチドＺ　Ｃ４５７（５’−ＴＧＴ　
ＴＣＣＡＡＡ　ＣＴＡ　ＣＴＡ　ＴＴＧＣＣ−３’）お
よびＺ　Ｃ４５８（５’−ＧＣＣＡＴＴ　ＴＣＣＣＣＡ
　ＡＴＣＣＡＣＣＡＡ　Ｔ−３’　）　ヲアブライド・
バイオシステムス３８０Ａ型ＤＮＡ合成装置で合成し、
そしてポリアクリルアミドゲルの電気泳動によって精製
した。次いで、ＭＦα１　＋Ｊ−ダーグリコシル化部位
＃３のＡｓｎコドンを、生体外突然変異誘発（Ｚｏｌｌ
ｅｒおよびＳｍ１ｔｈ、　Ｄ　Ｎ　Ａ　　３　：　４７
９−４８８．１９８４　；およびＺｏｌｌｅｒおよびＳ
ｍ　ｉ　ｔｈ　＋　Ｍｅ現Ｕ渾αｍｏ如［１００，１９
８３）によって、オリゴヌクレオチドＺＣ４５７および
ｍＣα６８鋳型を使用して変更した。陽性のクローンの
配列を決定し、そして正しいクローンをｍＣα６８と表
示した。Ｍｌ”αｌグリコジル化部位か２を変更したオ
リゴヌクレオチドＺＣ４５７を使用して、Ｚｏｌｌｅｒ
およびＳｍ１ｔｈ（前掲）に記載される突然変異誘発法
に従い、ｍＣα７５鋳型を突然変異誘発した。陽性のク
ローンの配列を決定し、そして正しいクローンをｍＣα
８８と表示した。突然変異誘発したＰＩＦα１リーダー
およびＭｌ−３をコードする遺伝子を含んで成る０、５
１５ｋｂのＰ、ｃｏｌ’？ＩＸｂａ　Ｉ断片を１ｙｌｃ
α８８から取り、そし７ｐＵＣ１９（ＥｃｏＲＩおよび
Ｘｂａ　Ｔで消化するごとによって線状化したもの）中
にサブクローニングした。ｉ：Ｉられたプラスミドをｐ
Ｃ，ＬＹ２．３と表示した（第３図） ４：ヘク　−　５Ｗ１６７の゛！Ｉ３ 発現ベクターｐｓＷ１６７は、酵母ベクターＹ　Ｆ、　
ｐ　１３ｔ１１Ｍ　Ｉ−３コ一ド配列に融合したバリヤ
ーの最初の５２６アミノ酸をコードする配列を含んで成
る。ＴＰ１１プロモーターおよび１５７８ｂｐの１込−
Ｂ」−断片とＭｌ−３のだめのコード配列との間の融合
を使用して、２塩基切断部位をコードするアダプターを
用いて、フレーム内に該２つの配列を連結して、発現単
位を構成した。融合を構成するとき、１込」」−コード
配列はｐ　ＳＷ８およびその誘導体ｐｓＷ８１から生成
し、それらは次のようにして造成した。

完全なＴ３ＡＲ１コード領域およびそれに連なるフラン
キング領域を含んで成るプラスミドｐＺＶ９をＳ　ａ　
ｌ　ＩおよびＢ　ａ　ｍ　Ｈｌで切断して、１．３ｋｂ
の−Ｗ人３ユ断片を単離した。この断片をｐＵＣ１３（
これは５ａｉｌおよびＢａｍＨｌで切断した）中にサブ
クローニングして、ｐＺＶＩ７と表示するプラスミドを
発生させた（第４図）。プラスミドｐＺＶ１７をＥｃｏ
ＲＩで消化して、ＢＡＲ１コード頭域の最も３′側の０
．５ｋｂを除去した。ヘクターーＢＡＲＩ断片を再連結
してｐ　、Ｊ　ｒ−Ｉ　Ｇ６と表示するプラスミドを発
生させた。プラスミドｐ　Ｊ　ＪＩＧ（ｉをＥｃｏＲＩ
で線状化し、そしてＤＮＡポリメラーゼｌ（クレノー断
片）で平滑末端とした。キナーゼ処理したＢ　ａ　ｍ　
ＨＩリンカ−（５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ３゛）を付
加し、そして再連結の前に過剰のリンカ−をＢａｍＨｌ
で消化して除去した。得られたプラスミドをｐ　Ｓ　Ｗ
　８と表示した（第８図）。

ＴＰＩＩプロモーター、物質Ｐ　（ＭｕｎｒｏおよびＰ
ｅｌｈａｍ、前掲）のＣ−末端部分のコード領域に融合
したＢＡＲｊコード領域およびＴＰＴＩクーミネーター
を含んで成るｐｓＷ８１を、第４図および第５図に示す
ようにして、ｐＳＷ８から誘導した。

プラスミドｐＳＷ８を５ａｉｌおよびＢ　ａ　ｍ　Ｈ１
で切断して、バリヤーのアミノ酸２５２−５２６をコー
ドする８２４ｂｐの断片を単離した。Ｍ１３ｍｐＢ中に
物質［）のＣ−末端部分を２量体の形態でコードする合
成オリゴヌクレオチド配列を含有するプラスミｌ”　ｐ
　Ｐ　Ｍ　２を、ＭｕｎｒｏおよびＰｅｌｈａｍから得
た。

プラスミドｐＰＭ２をＢａｍＨｌおよび５ａｌＩによる
消化によって線状化し、そしてｐＳＷ８からの８２４ｂ
ｐの且人且土断片と連結した。得られるプラスミドｐｓ
Ｗ１４を５ａｌＩおよびＳｍａ　Ｉで消化して、８７１
ｂｐのＢＡＲ１−物質Ｐ断片を単離した。アミノ酸１−
２５０をコードするＢＡＲ１の断片を含んで成るプラス
ミドｐＺＶ１６をＸｂａ　Ｉおよび５ａｉｌで切断して
、７６７ｂｐのＢＡＲ１断片を得た。この断片を、Ｘｂ
ａ　ＴおよびＳｍａＩで切断したｐＵｃ１８との３部分
の連結において、８７１ｂｐの升へ尺上−物質Ｐ断片と
連結した。得られるプラスミド（ｐｓＷ１５と表示する
）をＸｂａ１および３ｍａ　Ｉで消化して、１．６４ｋ
ｂのＢＡＲ１物質Ｐ断片を単離した。Ａ　Ｄ　Ｈ１プロ
モーターをｐＲ＋、０２９から得た。ｐＲＬＯ２９はｐ
Ｕｃ１８中の人旦用上プロモーターおよび１１６ｂｐの
ＢＡＲ１の５“コード領域を含んで成る（Ｍａｃｋａｙ
、　ＷＯ３７１０２６７０）。プラスミドｐ　ＲＬＯ２
９をＳｐｌ＋ｌおよびＸｂａ　Ｉで消化して、０．４２
ｋｂのＡＤＨＩプロモーター断片を単離した。ＴＰＩＩ
ターミネータ−（ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、
前掲）を、ｐＵｃ１８（Ｅｃ　ｏＲｌ−５ｐ　ｈ　Ｉ）
に連結台された０、７ｋｂのＴＰＩＩターミネータ−（
平滑末端Ｘｂａ　ＩＥｃｏＲＩ）を含んで成る平滑末端
のＸｂａｒ−３ｐｈｌ断片として準備した。この断片を
０．４２ｋｂのＡＤＨｌ−プロモーター断片および１．
６４ｋｂのＢＡＲ１物質Ｐ断片と、３部分連結において
連結してプラスミドｐＳＷ２２を生成した（第４図）。

ｐＳＷ２２中に存在するＡＤＨＩプロモーターをＴＰＩ
Ｉプロモーターと置換して、プラスミドｐｓＷ８１を造
成した（第５図）。ニーＰ−１−３プロモーターを９ｏ
ｏｂｐのＨ４ｎｄＩＩＩ−Ｘｂａ　Ｉ断片として準備し
た。ＢＡＲ１−物質Ｐ融合およびＴＰＴ上ターミネータ
−を含有する２、３ｋｂの断片を、Ｘｂａ■−３ｓｔＩ
断片としてプラスミドｐＳＷ２２から単離した。ＴＰＩ
Ｉプロモーター断片およびＢＡＲ１−物質Ｐ−工ｔ±上
ターミネーター断片を、３部分連結合で、Ｈｉｎｄｌ［
Ｉおよび５ｓｔＩで線状化されたｐＵｃ１８と連結した
。得られるプラスミドをｐｓｗｓ＋と表示した。

１−ｙｓ−Ａｒｇ切断部位をコードする合成オリゴヌク
レオヂドアダプターを使用して、ＢＡＲ］およびＭ＋−
３の間の融合を実施した。オリゴヌクレオチドＺ　Ｃ７
９４（５’−ＣＡＴ　ＣＣＴ　ＴＧＧ　ＡＴＡ　Ａへ＾
Ｇ３゛）およびＺ　Ｃ７９５（５’−ＡＡＴ　ＣＴＴ　
ＴＴＡ　ＴＣＣ八八へへ３’）をキナーゼ処理し、そし
てアニーリングして、Ｂ　ａ　ｍ　Ｉ−１１およびＩ−
１ｉ　ｎ　ｆ　Ｉ粘着末端およびＬｙＳ−△ｒｇ切断部
位をコードする配列を含んで成るアダプターを生成した
。プラスミドｐＣ，ＬＹ２３（実施例３）をＥｃｏＲＩ
およびＸｂａ　Ｉで切断して、修飾されたＭＦα１ｐｒ
ｅ−ｐｒｏおよびＭ　Ｉ　−３配列を含有する０、５１
５ｋｂの断片を生成した。次いで、この断片をＨｉｎｆ
ｌで消化して、１８０１＋ｐのＭｌ−３断片を遊離せし
めた。前述のプラスミドｐｓＷ２２をＥｃ　ｏ　ＲＩお
よびＢｇｌＩＩで切断して２４０ｂｐのＢＡＲ１断片を
分離した。この断片を、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａ　Ｉで
線状化したＰＵＣ１８との４部分連結において、１８０
ｂｐのＭ１３断片およびＺ　Ｃ７９４／　Ｚ　Ｃ７９５
アダプターと連結した。得られるプラスミｌ’　（ｐ　
Ｓ　Ｗ１２３　と表示する）（第５図）、をＥｃｏＲＩ
およびＸｂａ　Ｔで切断して、３．２ｋｂのＢＡＲＩ−
Ｍｌ−３断片を単−離した。プラスミドＰＳＷ８１をＩ
−Ｔ　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断して
、１．１　ｋｂのエヱ」−１プロモータＪ−引Ｂ」−断
片を単離した。エヂ」１−クーミネーターを０．７６ｋ
ｂのＸｂａＩ−ＢａｍＨ１断片として準備した。１．１
ｋｂのＴＰ　Ｉ　１−ＢＡＲ１断片、３．２ｋｂのＢＡ
ＰＩ−Ｍｌ−３断片およびＴＰＩＩターミネータ−を、
ＩＩ　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩおよびＢ　ａ　ｍ　Ｈ１で線
状化したｐｕｃ１８との４部分連結において連結した。

得られるプラスミド（ｐｓＷ１２７と表示する）は工上
上上プロモーター、アミノ酸１−１１５をコードするＢ
ＡＲ１配列、Ｌｙｓ−Ａｒｇ切断部位をコードする配列
、Ｍｌ−３コ一ド配列およびＴＰＩＩターミネータ−を
含有する。

ｐｓＷ１２７中に存在するＢＡＲ１コード領域を、ＢＡ
Ｒ１遺伝子からのアミノ酸２５１−５２６のためのコー
ド領域と置換することによって、プラスミドｐｓＷ１５
１を造成した。プラスミドｐｓＷ１２７をＸｈｏｒＴお
よびＥｃｏＲＩで消化して、ＴＰＩＩターミネータ−と
連結されたＭｌ−３に融合したＺ　Ｃ７９４／　Ｚ　Ｃ
７９５合成アダプターを含んで成る９６５ｂｐの断片を
単離した。ｐｓＷ８１を５ａｉｌおよびＢａｍＨｌで消
化して、ＢＡＲＩのＣ−末端２７５アミノ酸をコードす
る８２１ｂｐ断片を単離した。

ＳｍａｌおよびＥｃｏＲＩで線状化したプラスミドｐ　
Ｉ　Ｃｌ８Ｈ（Ｍａｒｓｈら、前掲）を、９６５ｂｐお
よび８２１ｂｐの断片と３部分連結において連結した。

酵母ベクターＹ　Ｅ　Ｐ　１３中ＭＩ−３配列に融合し
たｊＪｐ　１のコドン１−５２６を含んで成るプラスミ
ドｐｓＷ１６７を次のようにして造成した。プラスミド
ｐｓＷ８１は、ｐＳＷ１５１中に存在するＢＡＲ１配列
に結合したときにＢＡＲ１のためのコード配列を完成す
るために必要なＴＰＩＩプロモーターおよび＋３Ａ−Ｒ
１配列を提供した。ｐｓＷ８１をＨｉ　ｎ　ｄ　ｍおよ
び５ａｉｌで消化して、１．６７ｋｂのＴＰｊｊ−プロ
モーター−ＢＡＲ１断片を単離した。

ｐｓＷ１５１をＳｍａ　ＩおよびＢｇｌｌｌで切断して
、ＢＡＲ１−Ｍ　Ｉ−３融合物およびＴｒ’ｌ土ターミ
ネータ−を含んで成る１、６１ｋｂの断片を単離した。

この断片を、１．６７ｋｂのＴＰＴＩプロモーターおよ
びＹ　Ｅ　ｐ　１３　（Ｂｒｏａｃｈら、　Ｇｅｎｅ　
　８電１２］−１３３，１９７９）（これはＨｉ　ｎ　
Ｉ［ＩおよびＢａｍＨｌで線状化されている）と連結し
た。得られるプラスミドをｐｓＷ１６７と表示する（第
６図）。プラスミドｐＳＷ１６７はＡＴＣＣにＥ、コリ
　ＨＢＩＯＩの形質転換体として受託番号６７５２３号
として寄託されている。

５：　　ヘク　−　５Ｗ２００の″′ ＢＡＲ１シグナル配列、旦人ユ上第三ドメイン配列及び
Ｍｌ−３コ一ド配列を含有する造成物を、まずベクター
ｐ　Ｔ　Ｃ１９Ｈ（マージ：ｒ−（Ｍａｒｓｈ　）等、
前掲〕中に組み立て、その後、酵ＩＩ］ベクターＹＥｐ
１３（第６図）中にクローニングした。プラスミドｐｓ
Ｗ８１（実施例４）をＥｃｏＲＩで線状化した。Ｅｃｏ
ＲＴ粘着末端をＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）
で処理してフィルインした。次に、得られた平滑末端断
片をＢｇＬＩＩで切断して、工」ｊ−」−プロモーター
及びＢＡＲ１シグナル配列を含有する１、１ｋｂ断片を
単離した。プラスミドｐｓＷＩ５１（実施例３）をＥｃ
ｏＲＶ及びＣ１ａｌで切断して、４０３ｂｐ　Ｂ　Ａ　
Ｒ１の第三ドメイン配列、Ｍ　Ｉ−３コ一ド配列及びＴ
Ｐ■１ターミネータ−を含有する１、３７ｋｂ断片を単
離した。この断片を、ＢｇｌｌｌおよびＣ１ａで消化し
て線状化したｐｌＣ１９ＩＩとの３部分連結においてＰ
ＳＷ８１由来の１．１ｋｂ断片に連結した。得られたプ
ラスミド（］）ＳＷ１９５と命名）をＢｇｌＩＩ及びＳ
ｍａ　Ｉで消化して２．４ｋｂの発現単位を単離後、Ｂ
ａｍＨＴ及びＰｖｕＵで消化して線状化したＹ　Ｅ　Ｐ
　１３に連結した。得られたプラスミドをｐ　Ｓ　Ｗ２
Ｏ０と命名した。このプラスミドｐ　Ｓ　Ｗ２Ｏ０を、
アメリカンタイプ　力Ｊレチ−１−−コレクション（八
ｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１Ｌｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅ
ｃｔｉｏｎ）に大腸菌ＨＢＩＯＩ形質転換株（寄託第６
７５２４号）として寄託した。

６：ベクター　Ｓ　Ｗ２Ｏ７の ｐｓＷ１６７に含有される発現単位も、選択マカーとし
てＳ、ボンベ（Ｓ、ｐｏｍｂｅ）　Ｐ　ＯＴ　１遺伝子
を用いるベクターに挿入し、宿主細胞におりるエエ上上
欠損を補足した。ＰＯＴＩ遺伝子は酵母宿主細胞株にお
ける↓■土工欠損の補ｍレベルが低い。

この低レベル補償により、発現ベクターのコピー数の増
加を補償する。このベクターは、ベクターｐｃＰＯＴ（
アメリカン　タイプ　力ルヂャーコレクションに大腸菌
株ＨＢＩＯＩ形質転換体（寄託第３９６８５号）として
寄託）〕由来のものであった。第７図に示したように、
ベクターｐｃｐｏＴを、２ミクロン及びｐＢＲ３２２配
列を含有する７５０ｂｐ　Ｓｐ　ｈ　Ｔ−ＢａｍＨＩ断
片をｐＢＲ３２２テトラサイクリン耐性遺伝子由来の１
８６ｂｐ　Ｓ　ｐ　ｈ　Ｔ−ＢａｍＨＩ断片で置換する
ことにより変異させてプラスミドｐＤＰＯＴを造成した
。プラスミドｐＤＰＯＴを変性して５ｐｈｌ部位を破壊
し、Ｎｏｔ１部位への５゛にＢａｍＨ１部位を配置した
。オリゴヌクレオチドＺＣ９９４（５”−ＧＡＴ　ＣＣ
Ｇ　ＣＧＧＣＣＧ　ＣＡＣＡＴＧ−３’）及びＺＣ９９
５（５’−ＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣ３゛）をキナーゼ処理
及びアニーリングして５゛５ｐｈｌコンパチブル末端、
Ｎｏｔ１部位及び３゜ＢａｍＨＴ粘着末端を有するアダ
プターを形成した。プラスミドｐＤＰＯＴを、５ｐｈｒ
及びＢａｍＨＩで消化することにより線状化した。線状
化したｐ　Ｄ　Ｐ　ＯＴを、Ｚ　Ｃ９９４／Ｚ　Ｃ９９
５アダプターに連結してプラスミドｐｓＷ１９７（第７
図）を形成した。

ＴＰ１１プロモーターをプラスミドｐｓＷ１９７に挿入
してｐｓＷ２０７を造成した。プラスミドｐＺＶ１３４
（実施例２）をＢｇｌｌＩ及びＥｃｏＲＩで消化して０
．９ｋｂプロモ一ター断片を単離した。

ＴＰｊｊ−プロモーター断片及び上記したＺＣ９９４／
ＺＣ９９５アダプターを、５ｐｈｌ及びＥｃｏＲＩで消
化して線状化したｐＵｃｌＢに３部分連結により連結し
た。得られたプラスミドｐｓＷ１９８をＮｏｔｌ及びＢ
ａｍＨＩで消化して０．９ｋｂＴＰＩ−しプロモーター
断片を単離した。この断片を、ＮｏＬＩ及びＢａｍＨＩ
で消化して線状化したｐｓＷＩ９７に連結した。得られ
たプラスミドをプラスミドｐｓＷ２０７（第７図）と命
名した。

７：　　ベクター　Ｓ　Ｗ２１０の ＭＴ−３１−ド配列に融合したバリア（Ｉｌａｒｒｉｅ
ｒ）の最初の５２６個のアミノ酸をコードしている配列
を含有している発現ベクターを第８図及び第９図に示す
ようにして造成した。

操作を容易にするために、Ｚ　Ｃ７９４／　Ｚ　Ｃ７９
５アダプター、Ｍｌ−３コ一ド配列及びエエ」」−ター
ミネータ−を含有している断片をＰＴＣ１９Ｈ中でサブ
クローニングした。プラスミドｐｓＷ１２７（実施例４
）をＥｃｏＲＴで消化して、Ｒ人λ上の３゛部分、Ｚ　
Ｃ７９４／Ｚ　Ｃ７９５７ダブター、ＭＴ−３＝ｒ−ド
配列及びＴＰｒｌターミネータ−を含有している１、　
２　ｋｂ断片を単離した。この１．２ｋｂｌｔｙｒ片を
ｘｈｏＵで消化して、Ｚ　Ｃ７９４／　Ｚ　Ｃ７９５ア
ダプタ、ＭＩ−３コ一ド配列及びＴＰＩＩターミネータ
−を含有している０、９６ｋｂ断片を単離した。この断
片を、ＢａｍＨＩ及びＥｃ　ｏＲＩで消化して線状化し
たＰＩＣ１９Ｈに連結した。得られたプラスミドをｐｓ
Ｗ１５０（第９図に図示）と命名した。

ＴＰＩＩプロモーター断片をプラスミドｐＳＷ８４から
得た。プラスミドｐＳＷ８４はＴＰＴＩプロモーター、
物質Ｐの配列に融合した突然変異させたＪ−へＰＩ遺伝
子及び工Ｊ５し１ターミネータ−を含有おり、ごのプラ
スミドｐＳＷ８４を第８図に示すようにして造成した。

ＡＤＨ１プロモーター及びプラスミドｐＳＷ２２（実施
例４）由来のＢＡＲ上の最初の１１９ｂｐを含有してい
る０、５４ｋｂ　　Ｓ　ｐ　ｈｌ−Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ断
片を、５ｐｈｌ及びＥｃｏＲＩで消化して線状化したＭ
１３ｍ　ｐ　１Ｂに連結した。得られたファージ（ｐＳ
Ｗ５４と命名）を、突然変異誘発用のオリゴヌクレオチ
ドＺ　Ｃ６３４（５’−ＡＴＴ　ＡＣＴＧＣＴ　ＣＣＴ
　ＡＣＡ　ＡＡＣＧＡＴ−３’）を用いて試験管内突然
変異誘発（シラー及びスミス、前掲）させた。この突然
変異により、位置２５のロイシンのコドンをプロリンの
コドンに変更して、シグナルペプチト開裂部位突然変異
体を生成した。陽性クローンの配列決定を行い突然変異
を確認し、そのうちの一つの陽性クローンをｍ　Ｚ　Ｃ
６３４−７と命名した。

ｍ　Ｚ　ＣＧ３４−１の複製型ＤＮＡを５ｐｈｌ及びＥ
ｃｏＲＩで消化して０．５４ｋｂ断片を単離した。この
断片を、５ｐｈｌ及びＥｃｏＲＩで消化して線状化した
ｐＵｃ１８に連結した。得られたプラスミドｐＳＷ６６
をＨｉｎｄｌｌＩ及びｘｂａｌで消化して、ＡＤＨ１プ
ロモ一ター断片を除去した。突然変賃させたＢＡＲ１断
片を含有している２、８ｋｂ断片及びｐＵｃ１８を、−
工」こ↓」−プロモーターを含有しているプラスミドｐ
ＺＶ１３４（実施例２）からのＩ（１ｎｄｌｌｒ−ｘｂ
ａｌ断片に連結した。得られたプラスミドをＰＳＷ８２
と命名した。プラスミドｐｓＷ８２をＨｉｎｄＩ［ｌ及
びＥｃｏＲＩで消化して、ＴＰ上土プロモーター及び突
然変異させたＢＡＲ１断片を含有している１、０２ｋｂ
断片を単離した。プラスミドＰＳＷ２２をＥｃｏＲＩで
部分消化し、そして５ｓｔＩで完全に消化して、物質Ｐ
の配列に融合したＢＡＲＩ遺伝子のＣ−末端部分及び工
り土工ターミネータ−を含有している２、１６ｋｂ断片
を単離した。これらの２つの断片を、ＩＩ　ｉ　ｎ　ｄ
　ｍ及び５ｓｔＩで消化して線状化したｐＵＣ１８に３
部分連結で連結した。得られたプラスミドｐＳＷ８４は
、ＴＰＩＩプロモーター、突然変異させたＢＡＲｉ−遺
伝子及びＴＰＩＩターミネータ−を含有している。

操作を容易にするために、ｐＳＷ８４からのＴＰ」Ｊ−
プロモーター−ＢＡＲ１断片を、ベクターｐ　Ｉ　Ｃ１
９Ｒ（マーシュ等、前掲）中でｐｓＷ１５０のＭｌ−３
−ＴＰＩＩターミネータ−断片に連結した。第９図に示
すように、プロモーターｐＳＷ１５０を、Ａｃｃｌで消
化して線状化し、粘着末端をＤＮＡポリメラーゼＩ　（
クレノー断片）で平滑化した。平滑化した断片を、次に
、ＢｇｌＩ［で切断して、Ｚ　Ｃ９９４／Ｚ　Ｃ９９５
アダプター、Ｍｒ−３コ一ド配列及びＴＰＩｌターミネ
ータ−を含有している０、９７ｋｂ断片を単乱し。プラ
スミドｐＳＷ８４をＥ　ｒ、　ｏ　ＲＩで消化し、粘着
末端をＤＮＡポリメラーゼＩ　（クレノー断片）で平滑
化した。次に、平滑化した断片をＨｉｎｄｌ［［で切断
して、１．０２ｋｂＴＰＩＩプロモーター−ＢＡＲ１断
片を単離した。

ｐｓＷ１５０からの０．９７ｋｂ断片及びｐｓＷ８４か
らの１．０２ｋｂ断片を、Ｉ−１ｊｎ　ｄ　ＤＩ及びＢ
ｇｌＩ［で消化して線状化したｐ　Ｉ　Ｃ１９Ｈに、３
部分連結で連結した。得られたプラスミドをｐ　Ｓ　Ｗ
２Ｏ４と命名した。

ｐｓＷ２０４中の発現単位をｐ　Ｓ　Ｗ２Ｏ７（実施例
６）に挿入してプラスミドｐｓＷ２１２を調製した。プ
ラスミドｐ　Ｓ　Ｗ２Ｏ４を５ｐｈｒ及びＢｇｌＩＩで
切断して、１．３ｋｂ発現単位を単離した。プラスミド
ｐ　Ｓ　Ｗ２Ｏ７を５ｐｈｌ及びＢ　ａ　ｍ　ＨＩで切
断して、部分的ＴＰＩＩプロモーター・ベクター断片を
単離した。これらの２つの断片をいっしょに連結して、
プラスミドｐｓＷ２１２（第９図）を調製した。

ｐｓＷ２１２中に存在するＢＡＲ１断片をｐＳＷ１６７
（実施例４）からのＢＡＲＩ断片で置換して、全長ＢＡ
ＲＩ−Ｍｌ−３融合物を造成した。プラスミドｐｓＷ２
１２を５ｐｈｒ及びＢａｍＨＩで消化して、部分的ＴＰ
ＴＩプロモーター、ＺＣ７９４／ＺＣ７９５アダプター
、Ｍｌ−３コ一ド配列及びＴＰＩＩターミネータ−を含
有しているベクター断片を単離した。プラスミドｐｓＷ
Ｉ６７を５ｐｈＩ及びＢａｍＨＩで消化して、１．８１
ｋｂの部分的ＴＰＩＩプロモーター及びＢＡＲ１配列を
単離した。この断片をｐｓＷ２１２に連結して、発現ベ
クターｐｓＷ２１０（第９図）を生成した。。

久井例−Ｕ発　ベクターｐｓＷ２１９の造ｐｓＷ２００
（実施例５）中に存在している発現単位及び−Ｔ’Ｑ−
工」−選択マーカーを含有しているプラスミドｐｓＷ２
１９を以下のようにして造成した（第１０図）。プラス
ミドｐｓＷＩ９５（実施例５）を１３ｇＩＵ及びＣ１ａ
で消化して、ＴＰＩＩプロモーター、ＢＡＲ１シグナル
配列、ＢＡＲ１第三ドメインコ一ド配列及びＴＰＴＩタ
ーミネークーを含有している２、　４　ｋｂ断片を単離
した。この断片を、’ＢａｍＨＴ　−ＣＩ　ａ　Ｉ７−
線状化したｐＴｃ１９１−１に連結した。得られたプラ
スミドｐｓＷ２１７は、工凡±ｔクーミネーターの３“
端にＢ　ａ　ｍ　Ｈ１部位を有するｐｓＷ１９５からの
発現単位を含有していた。プラスミドｐ　Ｓ　Ｗ２１７
を５ｐｈＴ及び８ｇ１■で消化して、部分的ＴＰＴＩプ
ロモーター升込」」−シグナル及び第三ドメイン配列、
Ｍ１３コード配列並びに１−既↓−しターミネータ−を
含有している１、７ｋｂ断片を単離した。プラスミドｐ
ｓＷ２０７（実施例６）を５ｐｈｌ及びＢ　ａ　ｍ　Ｈ
Ｔで消化して、部分−ＴＰＴ　］−プロモーター・ベク
ター断片を小謡した。この断片をｐｓＷ２１７からの１
．７ｋｂ断片に連結して、発現ベクターｐ　Ｓ　Ｗ２１
９を調製した。

９：　　ベクター　ＺＶＩ８７の　成 二塩基性開裂部位に代るプロセッシング部位はトロンビ
ン開裂部位である。代替発現単位を造成するために、プ
ラスミドｐｓＷＩ９５を、試験管内突然変異誘発により
変異してＬｙｓ−Ａｒｇ開裂部位をトロンビン開裂部位
で置換した。この変形により、二塩基性プロセッシング
部位に関連したコドンの代わりに、アミノ酸プロリン及
びアルギニンをコードしているコドンが生じた。ＢＡＲ
１シグナル配列及び第三ドメインコード配列を含有して
いる得られたＭｌ−３発現ベクターを、ｐＺ■１８７と
命名した。

第１１図に、ｐＺＶ１８７の造成を示す。プラスミドｐ
ｓＷ１９５を５ｐｈＴ及び５ａｌｒで消化して、ＢＡＲ
Ｉ−ＭＴ−３畿合物及びニーＰｊ−上ターミネーターを
含有している１、７ｋｂ断片を単離した。

この１υｉ片を、予め５ｐｈｌ及び５ａｌＴで完全に消
化したＭ１３ｍ　ｐ　１８に連結した。得られたファー
ジクローンをｍ　ｐ　１８−　Ｚ　Ｖ２Ｖ５と命名した
。オリゴヌクレオチドｌ　Ｃ１０８３（５’−ＴＣＣＴ
ＴＧ　ＧＡＴ　ＣＣＡ　ＡＧ八へＴＣＧＴＴ−３’　）
を用いて、ウラシル法〔クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）、ブ
ロク　ナトル　アカドサ・イ　（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　、米国、第８２巻、
４８８〜４９２（１９８５）　）により、ｍ　ｐ’　１
Ｂ　−Ｚ　Ｖ　１７２を突然変異誘発させた。得られた
突然変異体の配列決定を行い突然変異誘発を確認し、陽
性クローンをＺＶ１７２／１０８３と命名した。便宜上
、Ｚ　Ｖ　１７２／１０８３に存在する挿入物をｐＵ０
１Ｂ中でサブクローニングした。

Ｚ　Ｖ　１７２／１０８３からの１．７ｋｂＳｐ　ｈ　
ｌ−５ａ　Ｉ　Ｉ挿入物を単離し、予め５ｐｈｌ及び５
ａｌｌで完全に消化したｐｔＪｃ１８に連結した。得ら
れたプラスミド、ｚＶ１８０を５ａｌｌで完全に消化し
た。線状化したｐＺＶＩ８０をＤＮＡポリメラーゼＩ（
クレノー断片）を用いて平滑化し、キナーゼ処理したＢ
ｇｌｒｌリンカ−に連結した。過剰のリンカ−を、Ｂ　
Ｂ　Ｉ　ＩＩで消化することにより除去した。次に、リ
ンカ−をイ」加したＤＮＡを５ａｌｌで完全に切断して
、１．７ｋｂ挿入物を単離した。部分子Ｐ１１プロモー
ター、且へ几上−ＭＩ−３融合物及びＴＰ　Ｔ　Ｉター
ミネータ−を含有する１、７ｋｂ挿入物をプラスミドｐ
ｓＷ２０７のＳｐｈｌ−ＢａｍＨ１部分子ＰＩＩプロモ
ーター−ベクター断片に連結して、ｐＺＶ１８７を造成
した。

ベクターＹ　Ｅ　Ｐ　１３中に発現単位を含有する発現
べ’）ターｐｓＷ１６７及びｐｓＷ２００、並びニヘク
ター　ｐ　Ｓ　ＷＩ９７中に発現単位を含有する発現ベ
クター　ｐ　Ｓ　Ｗ２１０　、Ｔ）　Ｓ　Ｗ２１９及び
ｐＺＶ１８７により、標準法に準じて適当な酵母を形質
転換した。ナ弓丈アカロミセス・セレビシェ−（Ｓ、ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）宿主株は、プラスミド上に存在す
る選択マーカーにより補完された突然変異を含有してい
た。

Ｙ　Ｅ　ｐ　１３中でＭｌ−３のコード配列に融合した
ＢＡＲ１のコード領域の最初の５２６個のアミノ酸をコ
ードしている配列を含有しているプラスミドｐｓＷ１６
７、並びにＹ　Ｅ　ｐ　１３中でＢＡＲＩシグナルペプ
チド及びＭｌ−３のコード配列に融合したＢ／ｌ　１第
三ドメインをコードしている配列を包含しているプラス
ミドｐ　Ｓ　Ｗ２Ｏ０により、Ｓ、セレ転換した。ロイ
シンを含まない合成増殖培地で増殖できる形質転換体を
選択した。

形質転換体を、５　ｍｌの−ＬｅｕＤ（ライツカ−ハム
（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍ）　、エル　ジェイ、ジェイ　ハ
クト（Ｊ、Ｂａｃｔ、　Ｌ、第５２巻、２９３〜３０１
（１９４６）　ｉ窒素源としてデイフコ　イースト　ナ
イトロジェンヘース（Ｄｆｃｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒ
ｏｇｅｎ　Ｂａ５ｅ”）を含有〕中で一晩３０゛Ｃで増
殖さゼた。形質転換を、２０又は５０ｍ２のＬ　ｅ　ｕ
　Ｄで１．　：　１００に希釈して、２４又は４８時間
、３０゛Ｃで増殖させた。細胞をペレット化して洗浄後
、−７０°Ｃで凍結した。スペント培地を２回回転させ
、細胞物から傾斜して除去後、７０°Ｃで凍結した。放
射線免疫検定法０？Ｉ＾；実施例１４参照）により測定
したＭＩ−３レベルにより、５４時間で、ｐｓＷ１Ｇ？
形質転換体が３８ｐｇ／ｍｌのＭｌ−３免疫反応性物質
を生成し、ｐｓＷ２００形質転換体が１１３ｐｇ／ｍｆ
ｆ１のＭＩ−３免疫反応性物質を生成したことが分かっ
た。

ｐｓＷ１９７巾でＭＩ−３のコード配列に融合したＢＡ
ＲＩの最初の５２６個のアミノ酸をコート′シている配
列を含有しているプラスミドｐ　Ｓ　Ｗ２１０、並びに
ｐｓＷ１９７中でＢＡＲ１シグナルペプチド及びＭＩ−
３のコード配列に融合したーＢＡＰ　Ｉ第三ドメインを
コードしている配列を含有しているプラスミドｐｓＷ２
１９により、Ｓ、セレビシェ−（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）株ＧＡ１８　１　Ｃ（ＭＡＴａ　　Ｉ　ｅｕ　２
−３　１　ｅ　ｕ　２−１１２　　ｌＬ引Ｊ−１上」ｊ
　：：　ＬＥＵ２）及び２Ｍ１１４（ＭＡＴａ　　Ｉｅ
ｕ２−旦）を形質転換した。グルコースの存在下での増
殖能力について形質転換を選択した。

プラスミドｐｓＷ２１０及びｐｓＷ２１９で形質転換し
たＧＡｌＢ−Ｉ　Ｃ株からのＭｌ−３の発現及び分泌シ
Ｊ゛、まず形質転換体を一晩３０℃で、５　ｍｌのＭＥ
ＤＩ　　（バク１−イースト　エクストラクト（Ｂａｃ
Ｌｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ）　２％、硫酸アン
モニウム０．５％、グルコース６％〕中で増殖させるこ
とにより行われた。形質転換体を２０ｍ１又は５０ｍ！
のＭＥＤ　ｌで１：１００に希釈して、２４時間又は４
８時間、３０°Ｃで増殖させた。細胞をペレット化して
洗浄後、−７０”Ｃで凍結した。スペント培地を２回回
転させ、細胞材料から傾斜して除去後、７０°Ｃで凍結
した。Ｒ，ＩＡにより測定したＭ１３レベルにより、２
４時間で、ｐ　Ｓ　Ｗ２１０形質転換体が０．３μｇ　
／　ｍｌｌのＭ、Ｉ−３免疫反応性物質を生成し、ｐ　
Ｓ　Ｗ２１９形質転換体が０．１５ｘｒ／ｍｌのＭｌ−
３免疫反応性物質を生成したことが分かった。

２Ｍ１１４株のｐｓＷ２１９形質転換体からのＭｌ−３
の発現及び分泌レベルも、高圧液体クロマトグラフィー
（＋＋ＰＬｃ）アッセイにより測定した。形質転換体を
、−晩３０゛Ｃで５　ｍｌの補足ＹＥＰＤ　（ＹＥＰＤ
＋４０ｍｇ／４　　　　Ａｄｅ　　−ト８０ｍｇ／　　
Ｐ、　　　　Ｌ　　Ｃｕ　　−ｔ−１０ｍＭｃａｃ１ｇ
（グルコース濃度を６％に調整）〕中で増殖させた。−
晩培養した培養物を、補足ＹＩＥｒ’Ｄ５０Ｉｎ１でｉ
：ｔｏｏに希釈し、３０℃で成長させた。試料４　ｍｌ
を２つづつ、３０時間、４８時間及び７５時間に採取し
た。試料を遠心分離して上澄みを保存した。上澄みの０
．５　ｍｌｌのアリコントを、醗酵液（５５２ｇの９６
％ＥｔＯＩ＋　＋　３４９　ｇのＩＩｚＯ＋　５　ｍｌ
の濃＋１２ｓ０４）０、５　ｒｔｒｌ、と混合し、室温
で３０分間インキユヘートした。次に、混合物を０．２
　ｔｓｎアクロディスクス（Ａｃｒｏｄｉｓｃｓ）　（
ミシガン州アン　アーバーにあるゲルマンサイエンス社
）を通して濾過後、−２０℃で凍結した。ＨＰＬＣアッ
セイ（実施例１４Ｂ）で測定したＭＩ−３レベルにより
、ｐＳＷ２］９形質転換体が７５時間で１４ｎ／ｍｌ−
のＭｌ−３を生成したことが分かった。

ＢＡＲ１第三ドメインとＭ　Ｉ−３コ一ド配列の間にト
ロンビン開裂部位を含有するプラスミドｐＺ、Ｖ１８７
で、Ｓ、セレビシェ−株ＧＡ１Ｂ−ＩＣ及び２Ｍ１１４
を形質転換した。グルコースの存在下の増殖能力につい
て形質転換体を選択した。形質転換体を一晩５ｍＱのＹ
　Ｅ　Ｐ　＋６％グルコース（１％バク１　イースト　
エクストラフＩ〜、２％バクト　イースト　ペプトン、
及びオートクレーピング後に６％デキストロース添加）
中で成長させた。

−晩培養した培養物を、ＹＥＰ＋６％グルコース１０ｍ
１で１：１００に希釈し、３０°Ｃで増殖させた。

試料を、２６時間及び４８時間に採取した。試料を遠心
分離して細胞をペレット化し、上澄み液を傾しゃ後−７
０°Ｃで凍結した。ＭＩ−３レベルを放射線免疫検定法
により測定した。その結果、４８時間で、ＧＡＩ８−Ｉ
　Ｃ形質転換体が０．９ｎｇ／ｍｌのＭ　＋−３免疫反
応物質を生成し、一方、ＺＭ１１４形質転換体が、０．
５２ｎｇ／ｍｌのＭｌ−３免疫反応性物質を生成したこ
とが分かった。

実」５１列−！〜」」υター　Ｓ　Ｗ２９０　　　び　
ＳＷ邪り久童國 一■」」−プロモーター、ＢＡＲ］−シグナル配列、位
置＃７にグリコジル化部位突然変異を有する旦ＡＪ？］
第ニドメイン配列、Ｍｌ−３コ一ド配列、ＴＰＩＩター
ミネータ−及びｐｒｌＰＯＴベクター配列を含有する造
成物をｐ　７．　Ｃ８９１から次のようにして造成した
。ＴＰＴＩプロモーターの一部分、ＢＡＲ１シグナル配
列及びＢ　Ａ　Ｒ上第三ドメインを含有するｐｓＷ］９
５（実施例５）のＳ　ｐ　ｈ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ断片を
、ｓｐｈ＋及びＢ　ａ　ｍ　ＨＩで消化して線状化した
ＭＩ３ｍ　ｐ　１８中でクローニングした。得られた造
成物から製造した一木鎖鋳型ＤＮＡを、シラー及びスミ
ス（前掲、１９８３年）により記載されている方法と実
質的に同様にして、ＺＣ８９１（５’−ＡＧＴ　ＣＧＡ
　ＴＧＣＴＣＴ　ＡＣＧ−３’）を用いで、試験管内突
然変異誘発さ・已た。ＺＣＢ９Ｊを用いた突然変異誘発
により、旦込ＴＪ−第三トツインの位置＃７にＡｓｎ−
＋ＧＩｎ突然変異を生成した。プラークハイブリダイゼ
ーションで同定し、ジデオキシシーフェンシング番こよ
り確認した陽性り１，１−ンを、ｐＺＣ８９１と命名し
た。

複製型ｐＺＣ８９１ＤＮＡを調製し、５ｐｈｒ及びＢａ
ｍＨＩで消化して、ＴＰＴＩ−プロモーターの一部分、
ＢＡＩ？１シグナル配列、及びグリコシル化部位＃７に
ＺＣ８９１突然変異を含有する凡人Ｒ１第ニドメインを
含んで成る０、７３ｋｂ断片を単離した。プラスミドｐ
ｓＷ２１０（実施例７）を５ｐｈＩ及びＢ　；］　ｍ　
ＨＴで消化して、エヱ士上プロモーターの５゛側０．７
ｋｂ、ＭＴ＝３コード配列、工ｔ１１ターミネータ−及
びＰＤＰＯＴベクター配列を含有する１２．３ｋｂ断片
を単離した。ｐｓＷ２１０断片を、リガーゼ処理により
ｐ　Ｚ　Ｃ８９１に連結してシラスミｌ′ｐ　Ｓ　Ｗ２
９０を生成した。

ＴＰＴＩプロモーター、ＢＡＲ１シグナル配列、位置＃
８にグリコジル化部位突然変異を有する１△−雁上第三
ドメイン配列、Ｍｌ−３コ一ド配列、Ｔｒ’１１ターミ
ネータ−及びｐＤＰＯＴベクター配列を含有する造成物
を、ｐ　Ｓ　Ｗ２９０の造成に類似の方法により造成し
た。Ｚ　Ｃ１３３０（５’−ＡＡＡ　ＣＣＴＣＴＣ八八
Ｇ八八へへＣへへへ３゛へへびソ゛ラー及びスミス（前
ｆＬｆ、１９８３年）により記載された方法を用いて、
ｐｓＷ２５３の−・重鎖鋳型ＤＮＡについての位置特異
的試験管内突然変異誘発により、グリコジル化部位＃８
にＡｓｎ−＋ＧＩｎ置換を生じる突然変異を生じさせた
。陽性クローンを同定し、Ｓ　ｐ　ｈ　１及びＢ　ａ　
ｍ　ＨＩで消化して、７．Ｃ１３３０突然変異を含有す
る０、７３ｋｂ断片を単離した。次に、０．７３ｋｂ断
片を、プラスミドｐｓＷ２１０の１２．３ｋｂＳ　ｐ　
ｈ　ＩＢａｍＨＩ断片に連結した。得られたプラスミド
をｐｓＷ２８１　と命名した。

■ プラスミドｐｓＷ２９０からのインシュリン前駆体ＭＬ
−３の発現を、ＴＰＩＩプロモーターＭＦα１シグナル
配列、Ｍｒ−３コ一ド配列、ＴＰＩＩターミネータ−及
びｐＤＰＯＴベクター配列を含んで成るベクターｐＤＰ
ＯＴ及び頚伯の造成物ｐ　ｌＮ４Ａ、並びにＴＰｒｌ−
プロモーターＢＡＲ１シグナル配列、野性型Ｂ／ｌ　ｊ
第三ドメイン配列、Ｍｌ−３コ一ド配列、ＴＰＩＩター
ミネータ−配列及びｐＤＰＯＴベクター配列を含んで成
るｐｓＷ２１９（実施例８）と比較した。発現を増殖曲
線実験において解析した。プラスミドｐＳＷ２９０　、
ρＤＰＯＴ、ｐ　ＴＮ４Ａ及びｐｓＷ２１９により、Ｓ
、セレビシェ−株ＺＭ１１４（実施例１０）を標【１１
１法に準じて形質転換した。ＹＥＰＤ＋　ａ　ｄ　ｅ　
＋Ｉｃｕ（１％イース１−　エクストラクト、２％ベプ
１−ン、２％グルコース、４０ｍｇ／ｎアデニン、８０
ｍ１／Ｉ！ロイシン）５ｄ中の一晩培養した前培養物を
、各形質転換体について増殖させた。前培養物をＹＩＥ
ＰＤ＋ａ　ｄ　ｅ＋　Ｉ　ｅ　ｕでＯＤ６．．０．１に
希釈し、通気しなから３０°Ｃで増殖させた。試料を、
接種後２２時間、３４．５時間、３６．５時間及び５７
．２時間に採取した。

各時間に、ＯＤ６゜。を測定し、各培養物から５ｍ２の
試料を採取した。２Ｍ１１４　　［５Ｗ２９０　）培養
物は、ｌ３ＡＲ１第三ドメインにおいて野性型グリコジ
ル化をコードしている類似造成物ｐｓＷ２１９で見出さ
れたような増殖ラグを示さなかった（第１表）。細胞を
４°Ｃで遠心分離により除去し、上澄の液を保存した。

各上澄み液の０．５　ｒｔｄｌアリコン（−２つを２個
のミクロフユージ管に分配した。

０．５ｍρの醗酵液で希釈後室塩で３０分間インキュへ
一トし、エソペンドルフミクロフユージ〔ニューコーク
、ウェストバリーにあるブリンクマン社（Ｂｒｉｎｋｍ
ａｎｎ）　）で５分間４°Ｃで遠心分離し、０．４５陣
フイルターを通して濾過して別のミクロフユジ管に入れ
て、ＩＩＰＬＣ用０．５　ｒｔｒＲアリコントを調製し
た。アッセイの前に試料を一７０°Ｃで保存した。

実施例１６Ｂに記載したようにして、培養物の上澄み液
の高圧液体クロマトグラフィーを行った。アッセイの結
果（第２表）　、２Ｍ１１４　（ｐ　５Ｗ２９０）が、
２Ｍ１１４を形質転換した類似造成物ｐ　ＴＮ４Ａより
多くのＭＩ−３の分泌を示すことが判明した。

人−一一一λ Ｐ　Ｉ−１０５シグナルペプチド、ＢＡＲ１第三ドメイ
ン配列及びブタウロキナーゼ（ｕＰＡ）ｃＤＮＡを含ん
で成る発現単位を造成し、ベクターＹＥｐ１３に挿入し
た。ｕＰＡ　　ｃＤＮＡは、ベクターｐ　＋３　Ｒ３２
２中の２．３ｋｂ挿入物としてｕＰＡ　　ｃＤＮＡを含
有するプラスミドｐＹＮ１５［ナガミネ等、ヌク　アシ
・ンズ　レス（Ｎｕｃ、八ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、）、第１
２巻、９５２５〜９５４１　（１９８４）　）に由来す
るものであった（第１２図）。ｃＤＮＡ配列をまず変異
して、ｕＰＡストップコドンの３′側にｘｂａＩ部位を
配置した。プラスミドｐＹＮ１５をｘｂａｌで切断して
、ｕＰＡコード配列を含有する１、　９　ｋｂ断片を単
離した。この断片を、ｘｂａＴで完全に消化したｐＵｃ
１３に連結した。連結混合物で大腸菌株ＪＭ８３を形質
転換した。形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、
正しく配向した挿入物を有するプラスミドをｐ　Ｄ　Ｒ
２０１０と命名した。プラスミドｐ　Ｄ　Ｒ２０１０を
ＡｐａＩで消化して線状化し、粘着末端をＴ、ＤＮＡポ
リメラーゼで平滑化した。

平滑化した断片をＳｍａｒで切断して５８５ｔｉｐの３
“非コード領域を除去し後、再連結してプラスミドｐＤ
Ｒ２０１１を得た。

次に、プラスミドｐ　Ｄ　Ｒ２０１１に存在するｃＤＮ
Ａを変異させて、ｕＰＡの第一アミノ酸コドンの５′側
にＢｇｌＴ１部位を配置した。その後、プラスミドｐＤ
Ｒ２０１１をｘｂａｌ及びＥ　ｃ　ｏ　ＲＩで切断して
、１．３５ｋｂ　ｕ　Ｐ　Ａ断片を単離し、次に、ｘｂ
ａｌ及びＥｃｏＲＩで完全に消化したＭ１３ｒｎｐ１９
に連結した。得られたファージクローンをＭＩ３ｍｐ１
９−２０１１と命名した。オリゴヌクレオチドＺＣ５５
８（５’−＾ＧＴ　　ＴＣＡ　　ＴＧ／ｌ　　ＧＡＴ　
　ＣＴＴ　　ＴＴＧ　　ＧＡＧＴ−３’　）　　を、ｕ
ＰＡの最初のアミノ酸にＢｇ１１１部位を生じるように
設計した。プラスミドＭ　１３ｍ　ｐ　１９−２０１１
を、シラー及びスミス（１９８４年、前掲）の２−プラ
イマー法により、第一プライマーとしてＺＣ５５８を用
い、第ニブライマーとしてＺ　Ｃ８７（５’−ＴＣＣＣ
ＡＧＴＣＡ　Ｃ［；Ａ　ＣＧＴ−３’）を用いて試験管
内突然変異誘発させた。キナーゼ処理したＺＣ５５８へ
のハイブリダイゼーションにより同定した陽性クローン
をＢｇｌｌｌ及びＥｃ　ｏＲＴで切断して、ＢｇｌｌＴ
部位の導入を確認した。得られたファージｍｐ１９−２
０１１−５５８をｘｂａ　Ｉ及び５ｓｔｌで消化して、
突然変異誘発したｕＰＡ配列を含有する１、３５ｋｂ断
片を単離した。この断片をｘｂａＩ及び５ｓｔｌで消化
して線状化したｐ［Ｊｃ１８に連結した。得られたプラ
スミドをｐ　Ｄ　Ｒ２０１２（第１２図）と命名した。

プラスミドｐ　Ｄ　Ｒ２０１２に存在するｕＰＡ　　ｃ
ＤＮＡを変異して、ストップコドンにの３′側にＸｂａ
　ｌを付加した。プラスミドｐ　Ｄ　Ｒ２０１２をＥｃ
ｏＲＩで消化して綿状化し、粘着末端をＤＮＡポリメラ
ーゼＩ　（クレノー断片）で処理して平滑化した。末端
を平滑化した断片を、キナーゼ処理したＸｂａ　Ｉリン
カ−（ＣＴＣＴＡＧＡＧ）に連結し、ＥｃｏＲＩａＪＭ
８３を形質転換した。形質転換体から単離したプラスミ
ドＤＮＡを、Ｂｆｉｌｌｌ及びＸｂａ　Ｉで消化して解
析した。陽性クローンをｐＺＶ１１２（第１３図）と命
名した。

部分的ＴＰＩＩプロモーター、ＭＦαｌプレプロ配列及
びｔＰＡ　　ｃＤＮＡ（第１３図）を含有するプラスミ
ドｐＤＲ１２９８中の組織プラスミノーゲン活性因子（
ｔＰＡ）ｃＤＮＡ配列を、プラスミドｐＺＶ１１２に存
在するｕＰＡ　　ｃＤＮＡで置換した。プラスミドｐ　
Ｄ　Ｒ１２９８をＢｇｌＨ及びｘｂａＩで消化して、Ｔ
ＰＩＩブロモ−クー、ＭＦα１シグナル配列及びｐＵｃ
１８ヘクターを含有する３、２５ｋｂ断片を単離した。

プラスミドｐＺＶ１１２をＢｇｌｌｌ及びｘｂａｌで消
化して、ｕＰＡｃＤＮＡを単離した。この断片を３．２
５ｋｂ　　ｐ　Ｄ　Ｒ１２９８断片と連結した。得られ
たプラスミドｐＺＶ１１７を５ｐｈｒ及びｘｂａＴで消
化して、部分的ＴＰＩＩ−プロモーター、肛α１シグナ
ル配列及びｕＰＡ　ｃＤＮＡを単離した。プラスミドｐ
ＤＲ１１０７（実施例２）を５ｐｈｒ及びｘｂａｌで消
化して、部分的ＴＰＩＩプロモーター、ＴＰＩＩクーミ
ネーター及びｐＵｃ１３ベクターを含有している３、６
ｋｂ断片を単離した。次に、この断片を３．２５ｋｂ　
　ｐ　Ｚ　Ｖ１１７断片に連結して、プラスミドｐＺＶ
１２０を得た。シラスミ）’　Ｐ　Ｚ　Ｖ１２０をＨｉ
ｎｄｌ［ｌ及びＳｍａ　Ｉで消化して、発現単位を単離
した。プラスミドＹ　Ｅ　ｐ　１３を、ＢａｍＨＩで消
化後、ＤＮＡポリメラーゼＩ　（クレノー断片）で末端
を平滑化した。次に、末端平滑化断片をＨｉ　ｎｄｎｌ
で切断して、ベクタ一部分を単離し、その後、ｐＺＶ］
２０の発現単位に連結してプラスミドｐＺ■１２５を得
た。

プラスミドｐＺＶＩ２５におけるｕＰＡ　　ｃＤＮＡを
合成アダプターを用いて変異させて、ｕＰＡｃ　Ｄ　Ｎ
　Ａストンプコドンの３′側に５ａｌＩ部位を配置した
。プラスミドＰＺＶ１２５をＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ及び
Ｂ　；ｉ　ｍ　ＨＴで消化して、ＴＰｒｌＰｒｌプロモ
ーフ１プレプロ配列及び部分的ｕｌ）ＡｃＤＮＡを含有
している２、５ｋｂ断片を単離した。

オリゴヌクレオチドＺ　Ｃ８３０（５’−ＴＣＧ　／Ｉ
ｃＧ　ＴＧＡ　ＧＣＴＡＧＣＣＣＧ　　ＴＴＴ　　ＴＣ
Ａ　　ＣＣＡ　　　ＣＣＡ　　ＡＣＧ　　ＴＧＡ　　Ｇ
ＴＧ　　ＴＧ−３’）及びＺ　　Ｃ８３１（５’−ＧＡ
Ｔ　　ＣＣＡ　ＣＡＣＴＣＡ　　ＣＧＴ　　ＴＧＧ　　
ＴＧＧ　　ＴＧＡ八Ａへ　ＣＧＧ　ＧＣＴ　ＡＧＣＴＣ
Ａ　ＣＧ−３’）をキナーゼ処理後、アリ−リングして
、ＢａｍＨＩ及び５ａ１１粘着末端を有するｕＰＡの末
端の１３個のアミノ酸をコードしている酵母コドン最適
化アダプターを生成した。Ｚ　Ｃ８３０／Ｚ　Ｃ８３１
７ダブタートｐＺＶ１２５からの２．５ｋｂ断片とを、
Ｉイｉｎｄｍ及びＳ　ａ　Ｉ　Ｔで消化して線状化した
ｐＵｃＩ３に、３部分連結で連結した。ｐＺＶ１５７と
命名した得られたプラスミドは、ｕＰＡの第一コドンの
５°側にＢ　ｇＩ　１１部位を有し、そしてｕＰＡスト
ップコドンの３″側に５ａｉ１部位を有するｕＰＡ　　
ｃＤＮＡを含有している。

ｐＺＶ１５７からのｕＰＡ　　ｃＤＮＡを一エエ」」−
プロモーター及びＰＨ０５シグナルペプチド配列に連結
してＰ　Ｓ　Ｗ１４８を造成した。プラスミドｐＺＶＩ
５７をＢｇｌＩＩ及び５ａｉ１で消化して、１．３ｋｌ
＋　　ｕＰＡ　　ｃＤＮＡを単離した。プラスミドｐ　
Ｄ　Ｒ１３９４Ｃ酵母ＰＨ０５（アリマ等、ヌクアシ・
ンズ　レス　（Ｎｕｃ、八ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、）　、第
１１巻、１６５７〜１６７２．１９８３年）シグナルペ
プチドをコードしている合成配列に連結されたＴＰＩＩ
ブロモターを含有しているｐＵｃ１８系ブラスミＦ〕由
来のＴ’　Ｐ　ｒ　］］プロモーターーＰＨ０５シグナ
ルペプチド配列を含有する０、９６ｋｂＢ　ｇ　１　ｍ
断片及びｕＰＡｃＤＮＡ断片を、ＢｇｌＨ−３ａｉｌ切
断ｐｒＣＩ９１−１に、３部分連結により連結した。得
られたプラスミドをｐｓＷ１４８と命名した。

物質Ｉ）の配列に融合したＢＡＲ１第三ドメイン配列及
びエヱユ止ターミネータ−を含有するプラスミｔ’　ｐ
　ｓ　Ｗ　１５２を、下記のようにして造成した。

プラスミドｐＳＷ２２（実施例４）をＰｖｕｌｌで消化
して、］、１６ｋｂ　　Ｂ　Ａ　Ｒ１−物質Ｐ断片を単
離した。−１−ナーゼ処理しそしてアニーリングした５
ａＩＩリンカ−（５°−ＣＧＴ　ＣＧＡ　ＣＧ−３’）
を１．１６ｋｂ断片に連結した。過剰のリンカ−を、５
ａｌＩ及び５ｓｔｌで消化して除去した。１．０ｋｂ断
片を単離後、Ｓａ　Ｉ　Ｔ及びＳｓ　ｔ　Ｉ″？：線状
化したｐｌｃ１９Ｒに連結した。得られたプラスミドを
ｐｓＷ１５２と命名した。

プラスミドｐｓＷ１４８をＨｉｎｄｌｒｌ及びＳａｌ■
で消化して、ＴＰＩＩプロモーター、Ｐ　ｔｌ　０５シ
グナル配列及びｕＰＡ　　ｃＤＮＡを含有する２、２ｋ
ｂ断片を単離した。プラスミドｐｓＷ１５２を５ａｌｌ
及びＢｇｌＴＩで消化して、ＢＡＲ］］第三ドメインー
物質Ｐ融合物びＴＰＩ上ターミネータ−を含有する１、
１ｋｂ断片を単離した。この２，２ｋｂ　　ｐｓＷ１４
８断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍｌＴＩ切断Ｙ　Ｅ　
Ｐ　１３に、３部分連結で連結した。得られたプラスミ
ドをｐｓＷ１６３と命名した（第１５図）。

酵母ベクターＹ　Ｅ　ｐ　１３中に土工ユ１−プロモー
タ、ＰＨ０５シグナル配列、ｕＰＡ　　ｃＤＮＡ。

ＢＡＲ１第三ドメイン及び−ＴＰＩＩターミネータ−を
含有しているプラスミドｐｓＷ］６３により、酵Ｉυ株
ＺＹ１００（ＭＡＴａ　　ａｄｅ２−１０１　１ｅｕ２
−３＋１１２　　ｕｒａ３−５２　５ｕｃ２−Δ９工」
」ス　上胆Ｊ４：ＣＡ丁）及びＺＹ２００　　（ＭＡた
ｕＰＡのレヘルは、細胞抽出物中で７．２　ｔｔｇ／　
ｌ−及びＺＹ２００のＰＳＷ１６３形質転換体からの上
澄み液中で３８ｚ／Ｉ！であった。

ＣＡＴ　　Ｍエエｌ）を形質転換した。ロイシン不存在
の合成増殖培地で増殖することのできる能力について形
質転換体を選択した。

ｐｓＷ１６３形質転換体からのブタウロキナーゼの発現
及び分泌を、まず形質転換体を３０°Ｃで一晩一−Ｌｅ
ｕ６％Ｄ＋０．１ＭスクシネートｐＨ５，５〔６％グル
コースを含有するーＬｅｕ及び０．１Ｍスクシネート（
オートクレーピング前にＮａＯＨでｐＨ５，５に調整）
）５ｍｆｉ中で増殖させることにより行った。−晩培養
した培養物を、５藏の−Ｌｅｕ６％Ｄ＋０．１Ｍスクシ
ネーｔ−ｐＨ５，５で１＝１０００に希釈し、３０゛Ｃ
で３７時間増殖させた。細胞をペレット化し、上澄み液
を傾しゃして保存した。

ｕＰＡ活性を、フィブリン溶解アッセイ（実施例１６Ｃ
）により測定した。この方法を用いて測定しＡ、　ＰＤ
ＧＦ配列のクローニング ＰＤＧＦのＢ鎮をコードしている配列の造成については
、ムレイ（Ｍｕｒｒａｙ）等により開示されている〔米
国特許箱４．７６６．０７３号及び第４，７（ｉ９，３
２８号：これらの開示内容は本発明に用いることができ
る〕。

ムレイ等（米国特許箱４，７６６．０７３号）により記
載されているように、発現ベクターｐＢＩ２（第１５図
）は、Ｓ、セレビシェ−ＴＰ１１プロモーターに作用可
能に結合させたヒトＰＤＧＦ　Ｂ鎖をコードしているＤ
ＮＡ配列、Ｍ　Ｆ　α］フップロ配列及び１兄上１ター
ミネータ−を含有している。又、米国特許箱４，７６６
．０７３号に記載されているように、ベクターｐｓＢ１
　　（第１５図）は、エヱ」」−プロモーター、Ｍ且α
１プレプロ配列、ｖ−ｓｉｓコード配列及びＴＰ１１タ
ーミネータ−からなる発現型位を含イラしている。

ｐｓＢ１ベクター中のＭＦαｌ／ｖ−ｓｉｓ配列を−Ｑ
Ｆα１／Ｂ鎖配列に代って用いた。ｐＳ８１発現単位を
、Ｅｃ　ｏＲ１部位を欠く変異ｐＢＲ３２２プラスミド
に挿入した。ｐＫＰｌｏ（第１０図）と命名した得られ
たベクターをＥｃｏＲＩ及びＸ　ｂ　ａ　Ｔで消化して
、ＭＦαｌ／ｖ−ｓｉｓ断片を除去した。次に、ＰＢ１
２　　ＭＦα１／Ｂ鎖断片をｐＫＰ１０発現単位に挿入
して、ｐＫＰ２６（第１５図）を造成した。

その後、コドン最適化α因子配列をこの発現単位に導入
した。α因子プレプロ配列及びインシュリン配列（実施
例３）を含有しているＥｃｏＲＩ−ｘｂａｌ断片を、Ｉ
Ｅｃ　ｏＲＴ及びｘｂａｌで消化したｐＵｃ１８（ヴエ
イラ及びメッシング（Ｖｉｅｉｌａａｎｄ　Ｍｅｓｓｉ
ｎｇ）、メス・エンザイモロジー（Ｍｅｔ九。

Ｒｎ、ｚｙｍｏｌｏ６ｚ）　、第１５３巻、３〜１１（
１９８７）　：ｌ中でクローニング後、−末鎖鋳型ＤＮ
Ａを調製した。次に、この鋳型を２−プライマー法〔シ
ラー及びスミス、ｌ）　Ｎ　Ａ、第３巻、４７９〜４８
８（１９８４）　］に準じて、突然変異誘発性オリゴヌ
クレオヂＩＪ’　Ｚ　Ｃ８６２（５″−ＧＧＡ　八ＴＣ
ＴＴＴ　　ＴＧ八　ＧＣＴ　　ＣＡＧ　　４八Ａ　　Ｃ
／Ｉｃ　　ｃ−３’　）　　を用いて、突然変異誘発し
た。この突然変異誘発により、α因子リーダーの３“末
端に５ｓＬＴ部位が生成した。正しく変異したプラスミ
ドを選択し、ｐＫＰ２３と命名した。リーダー配列を、
ＥｃｏＲＩ及び５ｓｔＩで消化してｐＫＰ２３から除去
し、このリーダー断片をＥｃｏＲＩ＋５ａｃｌ切断ｐ　
Ｉ　Ｃ１９Ｈ（７−シユ（Ｍａｒｓｈ）等、ジーン−Ω
μ川と、第３２巻、４８１〜４８６（１９８４）　Ｅ中
でザブクローニングした。得られたプラスミドをＰＫＰ
２イ（第１５図）と命名した。プラスミドｐＫＰ２Ｇを
ＪＥｃｏＲＩ及び５ｓＬＴで切断して、α因子配列を除
去した。次に、コドン最適化α因子配列を、Ｅｃ。

ｏＲＩ　−３ｓＬＴ断片としてｐＫＰ２４から取り出し
、線状化したｐＫＰ２６に接合した。得られたベクター
をｐＫＰ２８（第１６図）と命名した。

ベクターの造成を容易にするために、次にα因子リーダ
ーに導入した５ｓＬＴ部位を除去して野性型コード配列
を回復した。プラスミドｐＫＰ２８ＥｃｏｌンＩ及びｘ
ｂａＩで消化し、α因子−Ｂｇ融合配列を回収した。こ
の断片をｐｕｃｌｓ中でりｌ：１−ニングし、−末鎖Ｄ
ＮＡを単離した。鋳型を、２−プライマー法にベムして
、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドＺ　Ｃ１０１９（
５’−ＡＣＣＣＡＡ　ＧＧＡ　ＴＣＴ　ＣＴＴＧＴＣＣ
八八　へＧへ　＾へＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣ−３“）　を
用いて突然変異誘発した。正しく突然変異誘発したプラ
スミドをρＫＰ３２と命名した。

次に、発現単位全体を第１６図に示すようにして再造成
した。プラスミドｐＫＰ３２をＥｃｏＲｒ及びｘｂａｌ
で消化し、α因子−Ｂ−断片を回収した。この断片を、
ＥｃｏＲｒ及びＸｂａ　Ｔで切断したｐＫＰｌｏに挿入
してｐＫＰ３４を造成した。

プラスミドｐＫＰ３４をＣ］ａＩ及びＢａｍＨＩで消化
し、発現単位を回収した。この断片を、Ｃ１ａｌ及びＢ
　、、Ｉｍ　ＩＩ　＋で消化したｐＭＰＯＴ２　（酵母
及び細菌複製起点、アンピシリン耐性遺伝子並びにＰＯ
Ｔ　１選択マーカーを含有する、酵母２ミクｌ：１ンを
ヘースにしたプラスミド）に挿入してｐＫｌ）３（ｉを
造成した。

プラスミドｐＡ７　（ムレイ等、米国特許第４．７６６
．０７３号）からのコドン最適化Ｐｒ１ＧＦ　Ａ鎖配列
を、Ｂ鎖（第２図）に関して」二連した一連の造成工程
に対応する工程番こより、コドン屋適化α因子リーダー
と連結した。　Ｊ）Ａ７　Ａ鎖配列を５ｓＬＴｘｂａＩ
断片として単則し、５ｓｔｌ及びＸｂａｌで切断したｐ
ＫＰ２８に挿入してｐＫＰ２７を造成した。プラスミド
ｐＫＰ２７をＥｃｏＲＩ及びＸｂａｌで消化し、α因子
−Ａ鎖断片をｐＵｃ１１Ｂ中でクローニングした。

上記と同様にして、オリゴヌクレオチドＺｃ１０１８（
５’−ＴＴＣＧＡＴ　　ＡＧＡ　　ＴＣＴ　　ＣＴＴ　
　ＧＴＣＣＡＡ　　ＡＧＡ　　ＡＡＣＡＣＣＴＴＣＴＴ
Ｃ−３’）を用いて突然変異誘発を行い、５ｓｔＩ部位
を除去して野性型α因子配列を回復した。正しく突然変
異誘発したプラスミドをｐＫＰ３１と命名した。

次に、コドン最適化発現ベクターを造成した。

プラスミドｐＫＰ３１をＥｃｏＲＴ及びＸｂａ　Ｉで消
化し、α因子−へ鎖断片をＥｃｏＲＩ及びｘｂａＴで切
断したｐＫＰｌｏに連結した。ｐＫ＋’３３（第１７図
）と命名した得られたベクターは発現単位全体を含有し
ていた。プラスミドｐＫＰ３３をＣＩ　ａ　Ｉ及びＢａ
ｍＨＩで消化し、発現単位断片を回収した。この断片を
Ｃ１ａｌ及びＢａｍＨＩで切断したｐＭＰＯＴ２に挿入
して、発現ベクタ−ｐｒ＜ｐ３ｓを造成した。

ＰＤＧＦ　ＩＶ１３’ｉをコードする配列は、第１７図
に示すように造成したプラスミドｐＫＰ５１に由来する
ものであった。プラスミドｐＫＰ３２により、Ｅ、コリ
Ｍ　Ｖ　１１９３を形質転換した。−重鎖鋳型ＤＮＡを
調製し、鋳型を突然変異誘発性オリゴヌクレオチドＺＣ
１０７８（表３）を用いて突然変異誘発した。

ＺＣ１０７８による鋳型の突然変異誘発により、ＰＤＧ
ＦＢ　ｔｊ′ｉコート配列の５゛末端にＢ　ａ　ｍ　Ｉ
（Ｉ制限部位の挿入が生した。陽性クローンをプラーク
ハイブリダイゼーション、制限解析及びジデオキシシー
フェンシングにより同定した。陽性クローンをｐＫＰ４
７と命名した。

ＰＫＩ”４７に存在するＭＦα１シグナル配列を合成シ
グナル配列で置換した。プラスミドｐＫＰ４７をＥｃｏ
ＲＩ及びＢａｍＨＩで消化して、ヒｌ−Ｂ鎖配列及びｐ
Ｕｃ１１８を含有する断片を単離した。

オリゴヌクレオチドＺＣ１１５７、ＺＣ１１５Ｂ、ＺＣ
１０７６及びＺＣ１０７７（表３）を、アリ−リングし
たときに、合成シグナル配列をコードするＦ、ｃｏＲｌ
−ＢａｍＨＩアダプターをコードするように設計した。

オリゴヌクレオチドＺＣＩＩ５８及びＺｃ１０７６をキ
ナーゼ処理した。オリゴヌクレオチドＺＣ１１５８及び
ＺＣ１１５７をアリ−リングし、そしてＺＣ１０７６及
びＺＣＩ０７７をそれとは別個に反応さセてアニーリン
グした。ｐＫＰ４７がらのＥ　ｃ、　ｏ　ＲｒＢ　ａ　
ｍ　Ｈｒ断片を、３部分連結で、ＺＣ１１５Ｂ／ＺＣ１
１５７及ヒＺ　Ｃ１０７６／　Ｚ　Ｃｌ０７７ニ連結し
た。

ｐＫＰ４９と命名した得られたプラスミドは、合成シフ
ナル配列、ＰＩ）ＧＦ８　ｋＭ配列及びｐＵｃＩＩ８ベ
クター配列を含有していた。

ＴＰＩＩプロモーター、合成シグナル配列、ＰＤＧＦ　
Ｂ鎖配列及びＴＰＩＩターミネータ−をプラスミドｐＫ
Ｐ４９から造成後、酵母配列ベクターでサブクローニン
グした。プラスミドｐＫＰ３４を（８０〕 Ｃ１ａｌ及びＢ、　ａ　ｍ　ＨＴで消化して、ＴＰＩＩ
プロモーター、ＭＦαｌシグナル配列、ＰＤＧＦ　Ｂ鎖
配列及び工を士上ターミネーター発現単位を含有する２
、３ｋｂ断片を単離した。プラスミドＪ）ＵＣｌ３をＨ
ｉ　ｎ　ｄ　［７及びＥｃｏＲＩで消化して線状化した
。

オリゴヌクレオチドＺＣ１０１Ｇ及びＺ　Ｃ１０１７（
表３）をキナーゼ処理後アリ−リングして、ＣＩａｌ、
。

Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｍ、ｘｈｏ　１．、Ａｃｃ　Ｉ、ｘｂａ
　Ｉ及びＢ　ａ　ｍ　ＨＴ制限部位を含有するポリリン
カーアダプターを生成した。線状ベクターを、リガーゼ
処理により、：１−ナーゼ処理及びアニーリングしたＺ
　Ｃ１０１（ｉ／　Ｚ　Ｃ１０１７７ダプターに連結し
て、ｐＵＣ１２Ｔｌ１ｎｄＩ［Ｉ及びＥｃｏＲＩ部位を
喪失せしめた。得られたベクターｐＵｃ１２＊をＡｃｃ
ｌ及びＢａｍＨＩにより線状化した。２．３ｋｂ発現単
位断片を、ｐＵｃ１２＊にリガーゼ処理により連結した
。得られたプラスミドをｐＫＰ３８と命名した。

プラスミドｐＫＰ３８をＥｃｏＲＩ及びｘｂａＩで消化
して、ＴＰＴＩプロモーター、ＴＰＩＩターミネークー
及びｐｔＪｃＩ２＊ベクター配列を含有する４、　３　
ｋｂ断片を単離した。プラスミドｐＫＰ４９をＥｃｏＲ
Ｉ及びｘｂａＩで消化して、合成シグナル配列及びＰＤ
ＧＦ　Ｂ鎖配列を含有する０、８ｋｂ断片を単離した。

この０．８ｋｂｌｔＩｒ片をｐＫＰ３７からの４．３ｋ
ｂ断片にリガーゼにより連結した。得られたプラスミド
をｐＫＰ５１と命名した。

Ｂ０発現ベクターの造成 ＰＤＧＦ　Ｂ鎖発現を、次に、リーダー及びＳ、セレビ
シｘ　−Ｂ　Ａ　Ｒ１遺伝子の第三ドメインコード配列
を含有している分泌シグナルに連結した。その後、ＢＡ
Ｒ１分泌シグナルをＢｔ！コード配列と連結して、発現
ベクター　ｐ　Ｓ　Ｗ２Ｏ３及びｐＺＹ７６を造成した
。　　　　　　　　　　　　　以下余白オリゴヌ 去　　３ 配列（５゛→３”） 一’ｒ”　ｌｌ　Ｔ↓プロモーター及びＢＡＲＩ分泌シ
グナルを含有するプラスミドｐＳＷ２５５をまず造成し
た。プラスミドｐｓＷ１９５（実施例５）に存在するｒ
＋、４−ｒｔ土の第三１Ｓメインコ一ド配列を、α因子
のアミノ酸８］−８５、Ｌｙｓ、−Ａｒｇ開裂部位、５
’ＥｃｏＲＩ粘着末端、３’Ｂｇｌｌｌ粘着末端及びＩ
’ＤＣＰ　Ｒ鎖の最初のアミノ酸をコードする合成アダ
プターに融合した。オリゴヌクレオチドＺＣ１１３５及
びＺ　Ｃ１１３６（表３）を、マニアチス（Ｍａｎｉａ
Ｌｉｓ）等（前掲）により記載されているのと実質的に
同様にして、キナーゼ処理及びアニーリングした。

プラスミドｐｓＷ１９５をＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ及びＥ
ｃｏＲＩで消化して、ＴＰｒｌプロモーター及びＢ　Ａ
　Ｒ上コード配列を含有する１、　４　ｋｂ断片を単離
した。

この１．４ｋｂ断片を、３部分連結により、ＺＣ１１３
５／ＺＣ１１３６アダプター並びにＨｉ　ｎ　ｄ　ｍ及
び８ｇ１■で消化して線状化したｐｒｃＩ９Ｒに接合し
た。

得られたプラスミドをｐ　Ｓ　Ｗ２５５（第１８図）と
命名した。

プラスミドｐＫＰ５１に存在するＰＤＧＦ　ｌｌ鎖配列
をＴＰＩＩプロモーター、且ＡＲ」−シグナル配列、Ｂ
ＡＲＩ第三ドメイン及びＺ　Ｃ１１３５／Ｚ　Ｃ’１１
３６アダプター（Ｌｙｓ−Ａｒｇ開裂部位をコードして
いる）に連結して、ｐ　Ｓ　Ｗ２Ｏ３（第１８図）を造
成した。プラスミドｐＫＰ５１をＢ　ａ　ｍ　ＨＴで消
化して、ＰＤＧＰ　Ｂ鎖コード配列及び丁Ｔ’ＴＩター
ミネータ−を含有する１、０９ｋｂ断片を単離した。プ
ラスミドｐＳＷ２５５を５ｐｈｒ及びＢｇｌｌ’Ｉで消
化して、部分的ＴＰＴＩプロモーター、ＢＡＲ１シグナ
ル配列、几Ｎ北上第三ドメイン及びＺ　Ｃ１１３５／Ｚ
　Ｃ１１３Ｇアダプターを含有する０、７５ｋｂ断片を
単離した。

これらの２つの断片を、５ｐｈＴ及びＢａｍＨＴで消化
して線状化したｐＵｃｌＢに、３部分連結により連結し
た。正しい配向で成分断片を含有するプラスミドを同定
し、ｐＳＷ２６２と命名した。

次に、ベクターｐＭＰＯＴ２中にＴＰＩＩ−プロモータ
ー、ｉ人尺上シグナル配列、ＢＡＲ１第三ドメイン、Ｐ
ＤＧＦ　Ｉｎ鎖及びＴｉ１ｌターミネータ−を含有する
酵母発現ベクターｐｓＷ３０４を、第１８し１に示すよ
うにして造成した。プラスミドｐＫＰ３６をＣＩａＩ及
び５ｐｈＴで消化して、工１：１１．．プロモーターの
０．７６ｋｂ５”部分を単離した。プラスミドｐＫＰ３
６（第１６図）もＣＩａＩ及びＢ［Ｉｎで消化して、Ｐ
ＤＧＦ　Ｂ鎖配列、ＴＰ１１クーミネークー及びｐＭＰ
Ｏ７２ヘクター配列を含有する１ｌｋｂヘクク一含有断
片を単離した。

プラスミドｐＳＷ２６２を５ｐｈｒ及びＢｇｌｌＩで消
化して、０．７５ｋｈ部分的ＴＰＩＩプロモーターＢＡ
Ｒ１シグナル配列、ＢＡＲ１第三ドメイン及びＺ　Ｃ１
１３５／　Ｚ　Ｃ１１３６を単離した。３つの断片を、
３部分連結により連結し、得られたプラスミドをｐｓＷ
３０４と命名した。

Ｂ鎖発現単位をベクターｐＲＰＯＴに挿入することによ
り発現ベクターｐ　Ｚ　Ｙ７６　（第１９図）を造成し
た。ｐＲＰＯＴベクターは、まずｐｃＰ。

Ｔの７５０ｂｐ　Ｓ’ｐ　ｈ　ｒ−ＢａｍＨｒ断片をｐ
ＢＲ３２２の１８６ｂｐ　Ｓｐｈ　Ｉ−Ｂａｍ’ＨＴ断
片で置換することにより得られるｐ　ＣＰ　ＯＴ　（Ａ
ＴＣＣ３９６８５）に由来するものである。得られたプ
ラスミドｐＤＰＯＴを、５ｐｈｒ及びＢ　ａ　ｍ　ＨＴ
で消化して、１０．８ｋｂ断片を単離した。オリゴヌク
レオチドＺＣ１５５１及びＺ　Ｃ１５５２（表１）をキ
ナーゼ処理及びアニーリングして、Ｓｍａ　ｉ　Ｓｓ　
ｔ　Ｔ及びｘｌｒｏＴ制限部位の側面に位置するＢ　ａ
　ｒｎ　ＨＴ粘着末端及び５ｐｈＴ粘着末端を有するア
ダプターを形成した。

１０．８ｋｂ　　ｐ　Ｄ　Ｐ　ＯＴ断片をＺ　Ｃ１５５
１／　Ｚ　Ｃ１５５２アダプターに、連結により再環状
化した。４Ｈ７られたプラスミドをｐＲ，ＰＯＴと命名
した。

ＴＩ”’ＴＩターミネーターを次のようにしてサブクロ
ーニングした。プラスミドｐ　Ｓ　Ｗ１９５（第１１図
）をＢｇｌｌｌ及びＳｍａ　Ｉで消化して、ＴＰ１１プ
ロモーター、ＢＡＲ１アミノ末端及び第三ドメイン、Ｍ
Ｉ−３コ一ド配列及びＴＰＩＩターミネータ−を含有し
ている２、３８ｋｂ断片を単離した。

この２．３８ｋｂ断片を、Ｓｍ’ａＩ及びＢｇｌｌｌで
消化して線状化したプラスミドｐＲＰＯＴに連結した。

ｐ　Ｓ　Ｗ３１３と命名した得られたプラスミドをｘｂ
ａｔ及び５ｐｈＩで消化して、０．７６ｋｂＴ　Ｐ　Ｔ
　１ク一ミネーター断片を単離した。この０．７６ｋｂ
断片を、５ｐｈＩ及びｘｂａ　Ｉで消化して線状化した
ｐＵＣ１８に連結した。得られたプラスミドをｐＺＹ７
５と命名した。

次に、プラスミドｐＺＹ７６を造成した。プラスミドｐ
ｓＷ１９５をＢｇｌｌｌ及びＥｃｏＲＩで消化して、Ｔ
Ｉ’ｌｌプロモーター並びにＢＡＲ１アミノ末６Ｑ及び
第三ドメインを含有する１、　４　ｋｂ断片をｔＰ、離
した。プラスミドｐＳＷ２６２（第１８図）をＥｃｏＲ
Ｉ及びｘｂａ　Ｉで消化して、Ｚ　Ｃ１１３５／ＺＣ１
１３６アダプター及びＰＤＧＰ　ＩＩ鎖コード配列を包
含する０、３５ｋｂ断片を単離した。プラスミドｐＺＹ
７５をＸｂａ　Ｔ及び５ｐｈｒで消化して、１Ｌし１タ
ーミネータ−を含有する０、７５ｋｂ断片を単離した。

これらの３つの断片を、Ｂ　ａ　ｍ　Ｔ−（Ｔ及びｓｐ
ｈ＋で消化して線状化したｐＲＰＯＴに、３部分連結に
より連結した。ＴＰＩＩプラスミド、ＢＡＲ１アミノ末
端及び第三ドメイン、ＰＤＧＦコード配列、ＴＰＩＩタ
ーミネータ−並びにｐＲＰＯＴヘクター配列を含有する
得られたプラスミドをｐＺＹ７６と命名した。

Ｃ，ＢＢホモダイマーの発現 ｐ　Ｓ　Ｗ２Ｏ３及びｐＺＹ７６で形質転換した酵母株
からのＰＤＧＰ　ＢＢの発現を、対照プラスミドＴ’Ｂ
１７０ｍ（ムレイ等、米国特許出願筒８９６．４８５号
）及びｐＫＰ５７（ｐＲＰＯＴ中にｐＫＰ３４発現単位
を含有する）からのＰＤＧＦの発現と比較した。プラス
ミドｐ　Ｓ　Ｗ２Ｏ３、Ｐ　Ｚ　Ｙ７６、ＰＢｌ、７Ｏ
ｎ＋及びｐＫＰ５７により、酵母株Ｅ１８＃９　（ＭＡ
Ｔａ　　Ｉ　ｃ　ｕ　２３．１１２　　ｈ　ｉ　ｓ　４
−５８０　　ｇ３　」」シ二ｌ　　↓１１」−３−４３
　　（ＭＡＴａ　　］　　ｅｕ２−３　．１１２　　　
ｕｒａ３　　ｂａｒｌ　　ｉｌ肥　ｔ　　ｉｌ：：ＬＥ
Ｕ２）及び２Ｍ１１４（ＭＡＴａ　　ａｄｅ２−１０１
　１ｅｕ２ｔｐｉ：：ＣＡＴ）を、ベッグズ（Ｂｅｇｇ
ｓ）　（ネーチャー、第２７５巻、１０４〜１０Ｂ（１
９７８）に記載の方法と実質的に同様にして形質転換し
た。

単一コロニーからの形質転換体を醗酵培地（表４）に接
種し、３０°Ｃで２４時間増殖させた。

２４時間後、グルコースを最終濃度２％となるように培
養物に添加し、培養物を３０°Ｃで２４時間増殖させた
。

以下余白 天−一一先 醗酵培地： ＮＺ　　アミンタイプＡ２０ｇ ＫＩＩｚＰＯａ　　　　　　　　　　　７　ｇＮＨ，Ｓ
ｏ、　　　　　　　　　　　６　ｇＭｇＳＯａ　　　　
　　　　　　　２　ｇ固体を水に溶解し容積を１リツト
ルとする。

２５分間オートクレーブ滅菌する。オートクレーブ滅菌
後、２　ｍｌ　／　Ｉ！、の微量元素液（下記の処方に
よる）、ビタミン液（下記の処方による）３ｍｌ、２Ｍ
コハク酸ナトリウム（ｐＨ５，５；最終モル濃度０．１
Ｍまで）及び５０％グルコース（最終濃度２％まで）を
添加する。

微量元素液： ＺｎＳＯ４９，４５ｍｇ Ｆｅ２（Ｓｏ４）＋　　　　　　２８４．８ｍｇＣｕ５
Ｏａ　　・５１１ｚＯ４８ｍｇ 固体を希釈水に溶解し、最終容積］００ｍｆｆ１とする
。

次に濾過滅菌する。

ビタミン液： リボフラビン　　　　４２０　ｍｇ パントテン酸　　　　　５．４ｇ ナイアシン　　　　　　６．１ｇ ピロトキシン　　　　　１．４ｇ ビオチン　　　　　　　６０■ 葉酸　　　　　　　　４０ｍｇ イノシトール　　　　　６．６ｇ チアミン　　　　　　　１．３ｇ 蒸留水に熔解し、最終容積１００ｍｆｆ１とする。次に
濾過滅菌する。

細胞を遠心分離により培地から除去した。次に、上澄み
液を０．４５ｔｎｈの濾過器を通して濾過し、細胞又は
細胞片を除去した。ライネス及びロス（１？ａｉｎｅｓ
ａｎｄ　Ｒｏｓｓ）　　Ｃメス・エンザイモロジー（Ｍ
ｅｔｈ■ｒＩ互リ−ｐＨ２＞す、第１０９巻、７４９〜
７７３（１９８５）　）により記載されたようにして、
濾過した培養上澄み液について有糸***誘発アッセイを
行った。結果（ｌａ地１　ｒｒｄｌ当たりのＰＤＧＦ活
性をｎｇで表したもの）を表５に示す。

プラスミド ２１８＃９ ＸＢ１３−５Ｂ Ｍ１１４ 形質転換した酵母細胞によって産生されるＰＤＧＦ類似
体は、一連のクロマトグラフィおよび濃縮工程によって
濃縮された培地上澄液から精製される。

培地上澄液はミリボア・ペリカン・カセツタ（旧１１ｉ
ｐｏｒｅ　Ｐｅ１ｌｉｃａｎ　Ｃａ５ｓｅｔｔｅｓ）　
（ミリボア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）　、ベツドフォード
、マサヂューセッツ）を用いて濃縮され、濃縮液はベッ
クマン（Ｂｅｋｃｍａｎ）　Ｊ　−６Ｂ遠心分離装置（
ベックマン・インスツルメンツ・インコーポレーテド（
ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ＋　Ｉｎｃ、）
、ブレア、カリフォルニア）で４２００ｒｐｍで３０分
間遠心分離することによってペレット化して濁りを除去
する。最終濃縮物に１０ｍＭになるようにＥＤＴＡを加
えて、混合物のｐｌ＋を５Ｍ水酸化ナトリウムで５．５
に調整する。次いで、濃縮液を水で希釈して、導電率を
約１０ミリモーとする。

生成する濃縮液をＳ−セファロース・ファスト・フロー
（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ）（ファル
マシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　、ビス力タウエイ、ニ
ュー・シャーシー）カラム上でクロマ１−グラフィにか
ける。カラムを２０ＩＩＭリン酸すトリウム、０．１　
Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７，３）で洗浄する。次に、カ
ラムを２０＋ｗＭリン酸ナトリウム、１Ｍ塩化ナトリウ
ム（ｐＨ７，３）で溶出する。溶出液の２８０ｎｍでの
吸収を測定して、ピーク分画をまとめて保存する。

溶出液を一２０°Ｃで凍結した後、融解する。溶出液か
ら粒状物質を遠心分離によって取り除く。

」二泣液を集めて、０．８７Ｍ酢酸を用いてｐｌ＋を３
．０に調整する。次に、溶出液をアミコン（Ａｍｉｃｏ
ｎ）　Ｙ　Ｍ１０フィルター（アミコン（４ｍ１ｃｏｎ
）、デンバース、マサデユー七ツッ）を用いて濃縮する
。濃縮溶出液を１Ｍ酢酸５倍容を用いて希釈し、塩化ナ
トリウム濃度を約０．２　Ｍに低下させる。

次に、溶出液を第二のＳ−セファロース・カラム上でク
ロマトグラフィにかける。カラムを１Ｍ酢酸で洗浄し、
溶出液の２８０ｎｍでの吸収を測定して、この吸収がベ
ースラインに戻るまで洗浄を続ける。カラムを１Ｍ酢酸
、１，５Ｍ塩化アンモニウム（ｐＨ４，８〜５．０　）
で溶出する。溶出液の２８０ｒ＋＋ｎでの吸収を測定し
、ＰＤＧＦを最後の２８０ｎｍにおける吸収ピークとし
て集める。このピーク分画をプールして、アミコンＹＭ
ＩＯフィルターを用いてＷ　Ｋｎする。

次いで、濃縮した溶出液をカラム容積の約１％の試料容
積を用いてセファデックスＧ−５０スーパーフアイン（
Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０５ｕｐｅｒｆｉｎｅ）（フ
ァルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　、ビス力タウエイ
、ニュー・シャーシー）カラムにかける。カラムにＭ酢
酸アンモニウム（ｐ）１９．０）を５ａａ／時の流速で
流す。

５ＤＳ−ゲル電気泳動で測定して、最も純粋な分画をプ
ールして、ｐｎを酢酸で４．０に調整する。

ル範例Ｊ−６＝分析法９提具 Ａ、ＭＴ−３免疫反応性物質についてのラジオイムノア
ッセイ。

（実施例９に記載した方法で調製した）培養液」上澄液
についてラジオイムノアッセイを行った。

試料（５０μｍ／ウェル）を９６ウエルのＶ型底マイク
ロクイタープレート（フロー・ラプス（ＦｌｏｗＬａｂ
ｓ）、マクレーン、バージニア）に加えた。

Ｎａ　ＦＡＭ　（０，０４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ７、４）１００ｍｆｆｉに０．６ｇ塩化ナトリウム
および５．９ｇウシ血清アルブミンを溶解し、０．１％
ウシ血清アルブミンを含有せしめ、最終ｐＨを水酸化ナ
トリウムで７．３に調整したもの〕中ブターインシュリ
ンの希釈液からなる標準試料をそれぞれのプレートに加
えた。それぞれのウェルに５０１１１のモルモットの抗
インシュリン抗血清を加えた。ウェル当たり２．５　Ｘ
　１０’ｃｐｍ／　５０ｐｌの”５ＴＦａｂ’マウス抗
インシユリンを加えた。この混合物を室温で２時間イ刈
１−ユヘーションした。５ｔａｐｈ　　Ａｌ４胞〔パン
ソルビン（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ）　、シグマ・ケミカル
・カンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、
）、セントルイス、ミズーリー〕をＮａＦＡＭで１＝１
０に希釈し、５０ｔｔｌをそれぞれのウェルに加え、室
温で４５分間インキュベーションした。プレートをヘッ
クマンＴＪ−６遠心機で４℃で３．００Ｏｒｐｍで５分
間遠心分離した。上澄液を捨てて、ウェルをＴＮＥＮ　
（５０ｍＭ）リス塩基、１０　ｍＭＮａｃＩ、１ｍＭε
ＤＴ／ｌ、０．５％ＮＰ４０、　ｐＨ８，０に調整）中
１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１５０μｌで２回洗
浄した。細胞をＴＮＥＮ中１％ＢＳＡに再懸濁して、ガ
ンマ−カウンターで計数した。

以下余白 Ｂ、Ｍｌ−３の裔圧液体クロマトグラフィ（ＩＩＰＬＣ
）分析法 犬二」− ＨＰ　Ｌ　Ｃ緩衝液処方 緩衝液Ａ： ５６．８　ｇ　　　ＮａｚｓＯｎ １８００ｄ　　　１ＩＰＩ、Ｃ級Ｈ２０（オムニソルブ
（Ｏｍｎｉｓｏｌｖ）、イー・エム・サイエンス（ＥＭ
　５ｃｉｅｎｃｅ）、チェリー・ヒルズ、ニュー°シャ
ー シー） ５．４ｍ１ｌ　　　ＩＩｘＰＯ４（最低８５％）エタノ
ールアミンでｐｌ＋を２．３に調整。４Ｎ水酸化ナトリ
ウムでｐｌ＋を３．６に調整。１（ＰＬＣ級アモアセト
ニトリルメリカン・プルデイ・マク・アンド・ジャ・ン
クソン・ラボラトリ−（八ｍ、Ｂｕｒｄｉｃｋ　＆　Ｊ
ａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）　、ムスケゴンミ
シガン）１５６ｇを加える。ＩＩＰＬｃ級１１□０で容
積を２リツトル調整。０．４５フイルターで濾過。

緩衝液Ｂニ ア８０　ｇ　　　ＨＰＬＣ級アセドアセトニトリル１０
４４　　ＨＰＬＣｌｆｇＬＨｚＯ）ＩＰＬｃ分析はビス
ツ（ＶＩＳＴ八）　５５００１１ＰＬＣ（パリアン（Ｖ
ａｒｉａｎ）　）を用いて培地上澄液に就いて行った。

（実施例１０に記載の方法で調製した）上澄液試料を融
解し、ミクロ遠心機中で室温で１分間遠心分離して、試
料から沈澱物を除去した。Ｍｌ−３標準試料〔ノボ・イ
ンダストリー・エイ／ニス（Ｎｏｖｏ　Ｉｎｄｕｓｔｒ
ｉ　Ａ／Ｓ）　、バグスベルト（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ）
、デンマークから入手〕２．０．１．０および０．５　
ｎを０．０２５Ｍギ酸に加えた。それぞれの試料及び標
準試料１００１１１を、Ｃ１８逆相カラム〔リクロプレ
プ（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ）　ＲＰ　−１０（５ｔｒｔ
ａ　）　、イー・メルク（Ｅ、Ｍｅｒｃｋ）　、ダルム
シュタット、西ドイツ）上に置いた。

カラムに６０％緩衝液衝合４０％緩衝液衝合表４に示し
た処方）からなる等グラデイエンド（ｉｓｏｃｒａｔｉ
ｃ　ｇｒａｄｉｅｎｔ）を５０°Ｃで１ｍ１Ｚ分の流速
で流し、２１４ｎｍの検出水準０．０５八〇ＦＳ　（＾
ｂｓｏｒｂａｎｃｅＵｎｉｔｓ　Ｆｕｌｌ　５ｃａｌｅ
）を用いた。それぞれの試料を３０分間流したところ、
ＭＩ−３ピークは１８分後に現れた。Ｍ［−３物質の定
量は試料物質と既知のＭＴ−３標準試料との比較に基づ
く。

Ｃ，ｕＰＡ活性についての定量的フィブリン熔解測定 前記実施例に記載されたのと同様に適当に増殖した培養
物を遠心分離して細胞をベレット化した。

上澄液を傾瀉して取り除いた。細胞ペレットを水で１回
洗浄し、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ、シグマ・ケミカ
ル・カンパニー）と５ｍＭ　ＥＤＴＡとの混合物に再懸
濁した。ガラスピーズ（４５０〜５００庫）を総容積の
半分になるように加えた。混合物の全速力での１分間撹
拌を３回行い、撹拌の間に試料を氷冷した。液体をパス
ツールピペットで試験管から取り出してミクロ遠心機に
移した。次いで、溶解産物をエッベンドルフ・ミクロ遠
心機（ブリンクマン（Ｒｒｉｎｋｍａｎｎ）　、ウェス
トバリー、ニューヨーク）中で最高速度で１５分間４　
”Ｃで遠心分離した。上澄液を注意深く採取して分析し
た。

フィプリンリ溶解測定はバインダー（Ｂｉｎｄｅｒ）ら
の方法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５４，１９９８
．１９７９）に基づいている。アガロースＢ（ファルマ
シア）１５０ｎ＋ｇを１５ｍ１のフィブリンプレート緩
衝液（１リットル中４．３６ｇ）リス−塩基、８．４８
ｇ塩化すトリウム、１５　Ｋ　ＣａＣ１ｚ、２００ｍｇ
　ＮａＮ：＋　、　ｐｌ＋８．４に調整）に加えた。ア
ガロース混合物を５５°Ｃで融解して保持した。この溶
液に、ウシ−トロンビン（５００Ｕ　／ｍ）を加えた。

フィブリノーゲン（シグマ・ケミカル・カンパニー）を
フィブリンプレート緩衝液に溶解し、濾過陥凹して、次
にフィブリンプレート緩衝液で希釈して０Ｄ２８０を５
にした。フィブリノーゲン溶液５　ｍｌをアガロース−
トロンビン溶液に加えた。混合物をゲルボンド・アガロ
ース・サポート・シート〔エフ・エム・シー・コーポレ
ーション（ＦＭＣＣｏｒｐ、）　、ロアクランド、メイ
ン〕に注入して、放冷した。ウェルをツガ１コース中で
切断し、これらのウェルに処理される試料１０ｐ１また
は　２０ＩＪ１を加えた。結果をヒトウロキナーゼ標準
曲線と比較し、ブタウロキナーゼの換算比活性に調整し
た。ウェルの周りの透明なハローの出現は生物学的に活
性なブタウロキナーゼの存在を示す。　上記の説明から
、本発明の特定の態様を例示の目的で記載してきたが、
各種の改変が本発明の精神および範囲から離反すること
なく可能であることが理解されるであろう。したがって
、本発明は特許請求の範囲による以外は制限されるもの
ではない。

【図面の簡単な説明】

第１−１図〜１−３図は、ＢＡＲＩ遺伝子のヌクレオチ
ド配列および一次翻訳生成物の誘導されたアミノ酸配列
を示す。線より上の数字はヌクレオチド配列に関し；マ
イナスの数字は５”非コード配列を示す。線よりしたの
数字は、アミノ酸配列に関する。推定のシグナルペプチ
ドの切断部位を矢印で示す。星印は潜在的なグリコジル
化部位を意味する。 第２図は、プラスミドｐ　Ｚ　■１３５の造成を示す。 第３図は、プラスミドｐＧＬＹ２．３の造成を示す。 第４図は、プラスミドｐＳＷ２２の造成を示す。 第５図は、プラスミドｐ　Ｓ　ＷＩ５１の造成を示す。 第６図は、発現ベクターｐｓＷ１５２およびｐＳＷ２０
０の造成を示す。 第７図は、プラスミドｐｓＷ２０７の造成を示す。 第８図は、プラスミドｐＳＷ８４の造成を示す。 第９図は、発現ベクターｐｓＷ２１０の造成を示す。 第１０図は、発現ベクターｐｓＷ２１９の造成を示す。 第１１図は、発現ベクターｐ　Ｚ　Ｖ１８７の造成を示
す。 第１２図は、プラスミドｐ　Ｄ　Ｒ２０１２の造成を示
す。 第１３図は、プラスミドｐＺＶ１２５の造成を示す。 第１４図は、プラスミドｐｓＷ１Ｇ’３の造成を示す。 第１５図は、プラスミドｐＫＰ２４およびｐＫＰ２６の
造成を示す。 第１６図は、プラスミドｐＫＰ３６の造成を示す。 第１７図は、プラスミドｐＫＰ５１の造成を示す。 第１８図は、発現ベクターｐｓＷ３０４の造成を示す。 第１９図は、発現ベクターｐＺＹ７６の造成を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と、これ
   に続くリーディングフレーム内に￥ＢＡＲ１￥遺伝子生
   成物の部分であって少なくともＣ−末端ドメインの部分
   を含むもの及び異種蛋白質又はポリペプチドをコードす
   る第二のＤＮＡ配列に作用可能に連結された転写プロモ
   ーターを含んで成るＤＮＡ造成物。 ２、前記Ｃ−末端ドメインの部分が、３９１番のセリン
   から始まり５２６番のセリンで終わる第１図のアミノ酸
   配列を有する、請求項１記載のＤＮＡ造成物。 ３、前記Ｃ−末端ドメインの部分が、４２３番のアラニ
   ンから始まり５２６番のセリンで終わる第１図のアミノ
   酸配列を有する、請求項１記載のＤＮＡ造成物。 ４、前記異種性蛋白質またはポリペプチドがウロキナー
   ゼ、インシュリン、血小板由来の成長因子およびそれら
   の類似体からなる群から選択される蛋白質である、請求
   項１記載のＤＮＡ造成物。 ５、前記転写プロモーターがＴＰＩ酵素またはＡＤＨ酵
   素をコードする遺伝子の転写プロモーターである、請求
   項１のＤＮＡ造成物。 ６、前記シグナルペプチドがバリヤーシグナルペプチド
   または酵母抑制酸性ホスファターゼシグナルペプチドで
   ある、請求項１記載のＤＮＡ造成物。 ７、前記第二のＤＮＡ配列がＢＡＲ１遺伝子生成物のＣ
   −末端ドメインの少なくとも一部をコードするセグメン
   ト及びその下流にある異種性蛋白質またはポリペプチド
   をコードするセグメントとを含んで成る、請求項１記載
   のＤＮＡ造成物。 ８、前記第二のＤＮＡ配列が異種性蛋白質またはポリペ
   プチドをコードするセグメント及びその下流にあるＢＡ
   Ｒ１遺伝子生成物のＣ−末端ドメインの少なくとも一部
   をコードするセグメントを含んで成る、請求項１記載の
   ＤＮＡ造成物。 ９、前記第二のＤＮＡ配列が異種性蛋白質またはポリペ
   プチドをコードするセグメントに隣接して配置された開
   裂部位をコードするセグメントを含んで成る、請求項７
   または８記載のＤＮＡ造成物。 １０、前記開裂部位が二塩基性開裂部位またはトロンビ
   ン開裂部位である、請求項９記載のＤＮＡ造成物。 １１、前記第二のＤＮＡ配列がＢＡＲ１遺伝子生成物の
   アミノ酸４６８および５０３の一方若しくは両方におい
   て炭水化物の付加を妨げるために変異誘発されている請
   求項１記載のＤＮＡ造成物。 １２、前記第二のＤＮＡ配列がアミノ酸４６８のグルタ
   ミン残基をコードする、請求項１１記載のＤＮＡ造成物
   。 １３、前記第二のＤＮＡ配列がアミノ酸５０３のグルタ
   ミン残基をコードする、請求項１１記載のＤＮＡ造成物
   。 １４、請求項１〜１３のいずれか１項記載のＤＮＡ造成
   物で形質転換された酵母細胞。 １５、請求項１〜１３のいずれか１項記載のＤＮＡ造成
   物で形質転換された哺乳類細胞。１６、適当な媒質中で
   請求項１〜１３のいずれか１項記載のＤＮＡ造成物を含
   有する宿主細胞を増殖させ、 該宿主細胞から蛋白質またはポリペプチド生成物を単離
   することを含んで成る、蛋白質の産生方法。 １７、単離工程の後、前記蛋白質生成物を精製する、請
   求項１６に記載の方法。 １８、上記宿主細胞が酵母細胞または哺乳類細胞である
   、請求項１６に記載の方法。 １９、請求項１６の方法によって産生される蛋白質生成
   物。