JPH0216984A - Bar1分泌シグナル - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、一般に、蛋白質の発現に関し、さらに詳しく
は、酵母および哺乳動物細胞中の蛋白質の発現における
特定の分泌シグナルの使用に関Jる。
は、酵母および哺乳動物細胞中の蛋白質の発現における
特定の分泌シグナルの使用に関Jる。
最近において、遺伝子工学の技術における進歩は、より
高等生物体に由来し、そして特定の蛋白質をコーFする
DNA配列が酵母細胞中で発現できることを示した。組
み換えDNA技術は、また、導いた。
高等生物体に由来し、そして特定の蛋白質をコーFする
DNA配列が酵母細胞中で発現できることを示した。組
み換えDNA技術は、また、導いた。
酵母中での真核生物(例えば、哺乳動物)の遺伝子生成
物の生産は、哺乳類動物またはバクテリアの細胞の培養
を用いる生産に卓越する利点を有する。異種蛋白質の生
産のための宿主としてバクテリアを使用することにおけ
る主な欠点の1つは、生成物を製剤として使用できる前
に、エンドキシン生成物を完全に除去しなくてはならい
ということである。バクテリア中で生産された異種蛋白
質は、低い溶解性をもち、この問題は、克服されなりれ
ば、製剤としてのそれらの使用をきびしく制御1Jする
。ざらに、商業的レベルで蛋白質生成物を発現するため
の哺乳動物細胞の使用はひじょうに経費を必要とする。
物の生産は、哺乳類動物またはバクテリアの細胞の培養
を用いる生産に卓越する利点を有する。異種蛋白質の生
産のための宿主としてバクテリアを使用することにおけ
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に、エンドキシン生成物を完全に除去しなくてはならい
ということである。バクテリア中で生産された異種蛋白
質は、低い溶解性をもち、この問題は、克服されなりれ
ば、製剤としてのそれらの使用をきびしく制御1Jする
。ざらに、商業的レベルで蛋白質生成物を発現するため
の哺乳動物細胞の使用はひじょうに経費を必要とする。
対照的に、酵母の商業的規模の発酵は、よく確立されて
おり、異種蛋白質生成物の人足の生産を可能とする。酵
母は、バクテリアよりもl1di !7L動物細胞との
類似性を有する真核生物体である。酵母生成蛋白質は、
また、細胞によって培地中に分泌されることができ、こ
こで量の汚染蛋白質の鼠が減少していることは生成物の
精製を促進する。分泌は、また、ある種の蛋白質の適当
なフメルディング(folding)および/または生
物学的活性のために要求されうる、グリコジル化および
ジザルファイド結合の形成を可能としうる。酵母および
哺乳動物細胞の分泌系は類似する。両者の細胞のタイプ
は、分泌オルガネラ、例えば、小胞体(endopla
smic reticulum) 、ゴルジ装置、およ
び細胞表面への小包移送(vesicle trans
it)系を有する。さらに、生産される蛋白質上に見い
だされる分泌シグナルのペプチドは2つ細胞タイプにお
いて非常に類イ以しくWatson、Nucleic
Ac1ds Re5each12:5154.1984
)、重要な面は疎水性アミノ酸のコアである。これらの
シグナルペプチドは、新しく合成されたシグナル蛋白質
を小包胞体膜へ供給しそしてそれらをそれらのルーメン
中に挿入するIMlの蛋白質によって認識される。分泌
ペプチドは、酵母および削孔動物細胞の両者において、
シグナルプI:Iテアーゼによって分泌蛋白質から実質
的に除去される。真核生物分泌通路については、Kel
lyScit!ncq 230:1985参照。
おり、異種蛋白質生成物の人足の生産を可能とする。酵
母は、バクテリアよりもl1di !7L動物細胞との
類似性を有する真核生物体である。酵母生成蛋白質は、
また、細胞によって培地中に分泌されることができ、こ
こで量の汚染蛋白質の鼠が減少していることは生成物の
精製を促進する。分泌は、また、ある種の蛋白質の適当
なフメルディング(folding)および/または生
物学的活性のために要求されうる、グリコジル化および
ジザルファイド結合の形成を可能としうる。酵母および
哺乳動物細胞の分泌系は類似する。両者の細胞のタイプ
は、分泌オルガネラ、例えば、小胞体(endopla
smic reticulum) 、ゴルジ装置、およ
び細胞表面への小包移送(vesicle trans
it)系を有する。さらに、生産される蛋白質上に見い
だされる分泌シグナルのペプチドは2つ細胞タイプにお
いて非常に類イ以しくWatson、Nucleic
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)、重要な面は疎水性アミノ酸のコアである。これらの
シグナルペプチドは、新しく合成されたシグナル蛋白質
を小包胞体膜へ供給しそしてそれらをそれらのルーメン
中に挿入するIMlの蛋白質によって認識される。分泌
ペプチドは、酵母および削孔動物細胞の両者において、
シグナルプI:Iテアーゼによって分泌蛋白質から実質
的に除去される。真核生物分泌通路については、Kel
lyScit!ncq 230:1985参照。
酵母からの異種蛋白質の分泌は、自然酵母分泌ペプチド
の使用によって達成されて来た。酵母から分泌されるこ
とが知られているポリペプチドは、ペプチドを分泌経路
に入らせる疎水性アミノ末端部分を含有する。疎水性領
域は「シグナルペプチド」として知られている。シグナ
ルペプチドは、一般に、他の配列との組み合わせにおい
て、成熟ポリペプチドまたは蛋白質の分泌を制御する。
の使用によって達成されて来た。酵母から分泌されるこ
とが知られているポリペプチドは、ペプチドを分泌経路
に入らせる疎水性アミノ末端部分を含有する。疎水性領
域は「シグナルペプチド」として知られている。シグナ
ルペプチドは、一般に、他の配列との組み合わせにおい
て、成熟ポリペプチドまたは蛋白質の分泌を制御する。
これらの配列は、典型的には、分泌の間に成熟ポリペプ
チドから切り放され、そして集合的に分泌ペプチドを構
成する。α−因子分泌ペプチド(pre−p r O配
列) (KurjanおよびIlerskowitz、
Ce1l創: 933−943.1982)は、種々
の研究者らによって、酵母から異種蛋白質を分泌するた
めに使用されてきている(Brake、欧州特許116
,201号、+983;B11ter、欧州特許123
,294号、 1984 ; Singh、欧州特許1
23,544号;O5旧川ら、欧州特許171..00
0゜1985)。Brake (欧州特許11.6,2
01号、 1983)ば、MFα1プロモーターおよび
分泌ペプチドを利用して、ヒト表皮成長因子を分泌せし
めた。Bitter(前掲)は、MFα1プロモーター
および分泌ペプチドを利用して、ヒ1−(Leu5)β
−エンドルフィンを分泌せしめた。Singn(前掲)
は、2つの遺伝子MFα1およびMFα2をクローニン
グし、それらの蛋白質はMATa細胞中におけるG1の
阻止を誘発できる。Singhによってクローニングさ
れたMFαl遺伝子は、KurjanおよびHersk
owitz (前掲)が記載するMFα1ift伝子に
相当することが示された。MFα2遺伝子は、MFα1
遺伝子に本来類似するが、同一でないことが示された。
チドから切り放され、そして集合的に分泌ペプチドを構
成する。α−因子分泌ペプチド(pre−p r O配
列) (KurjanおよびIlerskowitz、
Ce1l創: 933−943.1982)は、種々
の研究者らによって、酵母から異種蛋白質を分泌するた
めに使用されてきている(Brake、欧州特許116
,201号、+983;B11ter、欧州特許123
,294号、 1984 ; Singh、欧州特許1
23,544号;O5旧川ら、欧州特許171..00
0゜1985)。Brake (欧州特許11.6,2
01号、 1983)ば、MFα1プロモーターおよび
分泌ペプチドを利用して、ヒト表皮成長因子を分泌せし
めた。Bitter(前掲)は、MFα1プロモーター
および分泌ペプチドを利用して、ヒ1−(Leu5)β
−エンドルフィンを分泌せしめた。Singn(前掲)
は、2つの遺伝子MFα1およびMFα2をクローニン
グし、それらの蛋白質はMATa細胞中におけるG1の
阻止を誘発できる。Singhによってクローニングさ
れたMFαl遺伝子は、KurjanおよびHersk
owitz (前掲)が記載するMFα1ift伝子に
相当することが示された。MFα2遺伝子は、MFα1
遺伝子に本来類似するが、同一でないことが示された。
SinghはMFα1プロモーターおよび分泌ペプチド
を使用して、種々の異種蛋白質を分泌−uしめた。ごれ
らは、有意な量で分泌される蛋白質、例えば、ヒトイン
ターフェロンD、ヒト血清アルブミン、ウシインターフ
ェロンαl、ウシインターフェロンα2、組織プラスミ
ノゲンアクチベーター(t−PA)およびヒトインスリ
ン様成長因子;および微量で分泌されるタンパク質、例
えば、レンニンおよびヒトインターフェロンγを包含す
る。Ohsimaら(前掲)は、MFα1プロモーター
および分泌ペプチドを使用して、αネオエンドルフィン
およびインターロイキン2を分泌せしめることを報告し
た。それらは、他の蛋白質およびペプチド、例えば、イ
ンスリン、ソマトスタチン、成長ホルモン、成長ホルモ
ン刺激因子、利尿ホルモン、インターフェロン、腫瘍壊
死因子およびリンフォトキシンの分泌におけるMFα1
の利用を示唆している。
を使用して、種々の異種蛋白質を分泌−uしめた。ごれ
らは、有意な量で分泌される蛋白質、例えば、ヒトイン
ターフェロンD、ヒト血清アルブミン、ウシインターフ
ェロンαl、ウシインターフェロンα2、組織プラスミ
ノゲンアクチベーター(t−PA)およびヒトインスリ
ン様成長因子;および微量で分泌されるタンパク質、例
えば、レンニンおよびヒトインターフェロンγを包含す
る。Ohsimaら(前掲)は、MFα1プロモーター
および分泌ペプチドを使用して、αネオエンドルフィン
およびインターロイキン2を分泌せしめることを報告し
た。それらは、他の蛋白質およびペプチド、例えば、イ
ンスリン、ソマトスタチン、成長ホルモン、成長ホルモ
ン刺激因子、利尿ホルモン、インターフェロン、腫瘍壊
死因子およびリンフォトキシンの分泌におけるMFα1
の利用を示唆している。
LemontLら(WO86100638)は、PH0
5分泌ペプチドを使用して、酵母から異種蛋白質を分泌
せしめた。l1rake(欧州特許123.289.1
984) は、α因子分泌ペプチドを使用して異種蛋白
質を分泌せしめることを報告した。
5分泌ペプチドを使用して、酵母から異種蛋白質を分泌
せしめた。l1rake(欧州特許123.289.1
984) は、α因子分泌ペプチドを使用して異種蛋白
質を分泌せしめることを報告した。
S、セレビシアエ(S、cervisiae) (以後
、S、セレビシェ−)BARI遺伝子は、メイテイング
(mating)タイプa細胞から分泌される「バリヤ
ー」(Barrier)として知られている蛋白質をコ
ードする。このバリヤー蛋白質は、細胞がα−因子の■
害作用を克服できるようにする。BAR−上の分泌経路
は、α−因子の分泌経路とは異る経路を代表する。
、S、セレビシェ−)BARI遺伝子は、メイテイング
(mating)タイプa細胞から分泌される「バリヤ
ー」(Barrier)として知られている蛋白質をコ
ードする。このバリヤー蛋白質は、細胞がα−因子の■
害作用を克服できるようにする。BAR−上の分泌経路
は、α−因子の分泌経路とは異る経路を代表する。
米国特許第4,613,572号(Mackayら、1
98G)は、BAR1遺伝子を使用して、異種蛋白質を
分泌することができることを開示しているが、これに関
して有用であるであろう遺伝子の特定の領域を同定して
いない。
98G)は、BAR1遺伝子を使用して、異種蛋白質を
分泌することができることを開示しているが、これに関
して有用であるであろう遺伝子の特定の領域を同定して
いない。
WO37102670(Mackay)は、BA−R1
シグナルペプチドコード領域を使用して、形質転換され
た酵母細胞からの異種遺伝子生成物の低いレヘルの分泌
を指令することを開示している。Mackay (前出
)が記載するBAR1分泌系は、α−因子分泌ペプチド
より低い効率の分泌シグナルを提供することがわかった
。
シグナルペプチドコード領域を使用して、形質転換され
た酵母細胞からの異種遺伝子生成物の低いレヘルの分泌
を指令することを開示している。Mackay (前出
)が記載するBAR1分泌系は、α−因子分泌ペプチド
より低い効率の分泌シグナルを提供することがわかった
。
酵母からの組織プラスミノゲンアクチベーターの分泌の
研究は、α−因子分泌ペプチドがtPAまたはウロキナ
ーゼを培地中に効率よく移送しないことを示している。
研究は、α−因子分泌ペプチドがtPAまたはウロキナ
ーゼを培地中に効率よく移送しないことを示している。
これは、また、他の異種蛋白質について真実である事を
証明される。
証明される。
結局、この分野において、異種蛋白質を酵母からより効
率よい方法で分泌させる他の分泌ペプチドを同定するこ
とが要求されている。本発明は、この要求を満足し、そ
して、さらに、他の関連する利点を提供する。
率よい方法で分泌させる他の分泌ペプチドを同定するこ
とが要求されている。本発明は、この要求を満足し、そ
して、さらに、他の関連する利点を提供する。
C課題を解決するための手段〕
要約すれば、本発明は、DNA造成物を開示し、この造
成物は、シグナルペプチドをコードするDNA配列と、
これに続くリーディングフレーム内にBAR1遺伝子生
成物の部分であって少なくともC−末端ドメインの一部
分を含むもの及び異種蛋白質又はポリペプチドをコード
する第二のDNA配列に作用可能に連結された転写プロ
モーターを含んで成る。好ましいシグナルペプチドはバ
リヤーシグナルペプチドである。1つの態様において、
第二のDNA配列は、異種蛋白質又はポリペプチドをコ
ードするセグメント、及びその下流に続く、BAR1遺
伝子生成物のC−末端ドメインの少なくとも−1をコー
ドするセグメントを含んで成ることができる。あるいは
、第二のDNA配列は、BARl遺伝子生成物のC−末
端ドメインの少なくとも一部をコードするセグメント、
および引き続く下流に、異種蛋白質またはポリペプチド
をエンコードするセグメーントを含んで成ることができ
る。
成物は、シグナルペプチドをコードするDNA配列と、
これに続くリーディングフレーム内にBAR1遺伝子生
成物の部分であって少なくともC−末端ドメインの一部
分を含むもの及び異種蛋白質又はポリペプチドをコード
する第二のDNA配列に作用可能に連結された転写プロ
モーターを含んで成る。好ましいシグナルペプチドはバ
リヤーシグナルペプチドである。1つの態様において、
第二のDNA配列は、異種蛋白質又はポリペプチドをコ
ードするセグメント、及びその下流に続く、BAR1遺
伝子生成物のC−末端ドメインの少なくとも−1をコー
ドするセグメントを含んで成ることができる。あるいは
、第二のDNA配列は、BARl遺伝子生成物のC−末
端ドメインの少なくとも一部をコードするセグメント、
および引き続く下流に、異種蛋白質またはポリペプチド
をエンコードするセグメーントを含んで成ることができ
る。
本発明の1つの面において、前記C−末端ドメインの部
分は、番号391のセリンから始まりそして番号526
のセリンで終わる第1図のアミノ酸配列を含んでる。本
発明の関連する面の範囲内で、前記C−末端ドメインの
部分は、番号423のアラニンから始まりそして番号5
26のセリンで終わる第1図のアミノ酸配列を含んで成
る。
分は、番号391のセリンから始まりそして番号526
のセリンで終わる第1図のアミノ酸配列を含んでる。本
発明の関連する面の範囲内で、前記C−末端ドメインの
部分は、番号423のアラニンから始まりそして番号5
26のセリンで終わる第1図のアミノ酸配列を含んで成
る。
他の面において、第二のDNA配列は、さらに、異種蛋
白質またはポリペプチドをコードするセグメントに隣接
して位置する切断部位をコードするセグメントを含んで
成る。好ましい態様に範囲内で、前記切断部位は2塩基
部位またはトロンビン切断部位である。
白質またはポリペプチドをコードするセグメントに隣接
して位置する切断部位をコードするセグメントを含んで
成る。好ましい態様に範囲内で、前記切断部位は2塩基
部位またはトロンビン切断部位である。
本発明のなお他の面において、第二のDNA配列は突然
変異誘発され、BAR1遺伝子生成物のアミノ酸468
および503の一方または双方における炭水化物の付加
を防止する。好ましくは、第二のDNA配列は位置46
8および/または位置503におけるグルタミンをコー
ドする。
変異誘発され、BAR1遺伝子生成物のアミノ酸468
および503の一方または双方における炭水化物の付加
を防止する。好ましくは、第二のDNA配列は位置46
8および/または位置503におけるグルタミンをコー
ドする。
本発明は、種々の蛋白質、例えば、ウロキナーゼ、イン
スリン、血小板誘導因子およびその類似体を発現するた
めに使用できる。好ましい態様の範囲内で、転写プロモ
ーターはトリオースホスフェートイソメラーゼ(TPr
)酵素またはアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)酵
素をコードする遺伝子のそれである。このようなりNA
造成物で形質転換された酵母細胞および哺乳動物細胞も
また開示される。
スリン、血小板誘導因子およびその類似体を発現するた
めに使用できる。好ましい態様の範囲内で、転写プロモ
ーターはトリオースホスフェートイソメラーゼ(TPr
)酵素またはアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)酵
素をコードする遺伝子のそれである。このようなりNA
造成物で形質転換された酵母細胞および哺乳動物細胞も
また開示される。
本発明の他の面において、問題の蛋白質を製造する方法
を開示する。この方法は、一般に、(a)シグナルペプ
チドをコードするDNA配列に作用可能に結合された転
写プロモーター並びに引き続いてリーディングフレーム
内に、異種蛋白質又はポリペプチドおよびBARl遺伝
子生成物のC末端ドメインの少なくとも部分をコードす
る第二のDNA配列を含んで成る造成物を含有する宿主
細胞を、適当な培地中で増殖せしめ、そして(b)該宿
主細胞から蛋白質またはポリペプチドを単離することを
含んでなる。好ましい宿主細胞は、酵母細胞および哺乳
動物細胞を包含する。この方法は、また、分離工程後、
蛋白質生成物を精製することを包含できる。
を開示する。この方法は、一般に、(a)シグナルペプ
チドをコードするDNA配列に作用可能に結合された転
写プロモーター並びに引き続いてリーディングフレーム
内に、異種蛋白質又はポリペプチドおよびBARl遺伝
子生成物のC末端ドメインの少なくとも部分をコードす
る第二のDNA配列を含んで成る造成物を含有する宿主
細胞を、適当な培地中で増殖せしめ、そして(b)該宿
主細胞から蛋白質またはポリペプチドを単離することを
含んでなる。好ましい宿主細胞は、酵母細胞および哺乳
動物細胞を包含する。この方法は、また、分離工程後、
蛋白質生成物を精製することを包含できる。
本発明のこれらの目的および他の面は、以下の詳細な説
明および添付図面を参照とすことにより明らかになるで
あろう。
明および添付図面を参照とすことにより明らかになるで
あろう。
(I4)
〔具体的な説明〕
前述のように、本発明は、宿主細胞中で生産される異種
蛋白質の分泌を指令するシグナルペプチドをコードする
配列(シグナル配列)と関連して、S、セレビシェ−B
AR1遺伝子生成物のC−末端領域[第3ドメイン(d
omain) ]の一部をコードする配列を利用する。
蛋白質の分泌を指令するシグナルペプチドをコードする
配列(シグナル配列)と関連して、S、セレビシェ−B
AR1遺伝子生成物のC−末端領域[第3ドメイン(d
omain) ]の一部をコードする配列を利用する。
シグナル配列およびバリヤーC−−末端領域の一部をコ
ードする配列は、−緒になってハイブリッド分泌ペプチ
ドをコードする。
ードする配列は、−緒になってハイブリッド分泌ペプチ
ドをコードする。
次いで、このハイブリッド分泌性ペプチドを使用して、
宿主細胞からの異種蛋白質またはポリペプチドの分泌を
指令する。シグナルペプチドおよび第3ドメインは隣接
することができ、異種蛋白質またはポリペプチドはハイ
ブリッド分泌性ペプチドにその下流(C−末端)におい
て融合しているか、あるいは異種蛋白質またはポリペプ
チドはハイプリント分泌性ペプチドの部分の間に位置す
ることができる。いずれの配置においても、プロセシン
グシグナル(processing signal)
、好ましくはアミノ酸Lys−Arg、Arg−Arg
。
宿主細胞からの異種蛋白質またはポリペプチドの分泌を
指令する。シグナルペプチドおよび第3ドメインは隣接
することができ、異種蛋白質またはポリペプチドはハイ
ブリッド分泌性ペプチドにその下流(C−末端)におい
て融合しているか、あるいは異種蛋白質またはポリペプ
チドはハイプリント分泌性ペプチドの部分の間に位置す
ることができる。いずれの配置においても、プロセシン
グシグナル(processing signal)
、好ましくはアミノ酸Lys−Arg、Arg−Arg
。
Lys−LysまたはArg−Lysから成る二塩基切
断部位を使用して、分泌性ペプチドと異種蛋白質の間の
切断を実施する。好ましい二塩基切断部位はKEX2切
断部位Lys−Argである。
断部位を使用して、分泌性ペプチドと異種蛋白質の間の
切断を実施する。好ましい二塩基切断部位はKEX2切
断部位Lys−Argである。
あるいは、トロンビン部位を、分泌ペプチドと異種蛋白
質との間のプロセシング部位として使用できる。
質との間のプロセシング部位として使用できる。
好ましい態様において、ハイブリッド分泌性ペプチドは
、シグナルペプチドおよびバリヤーのC−末端ドメイン
またはC−末端ドメインの一部から本質的に成る。バリ
ヤーの第1および第2ドメインに由来する配列は、実質
的に存在しないであろう。前述のように、蛋白質分解プ
ロセシングシグナルもまた、含めることができる。
、シグナルペプチドおよびバリヤーのC−末端ドメイン
またはC−末端ドメインの一部から本質的に成る。バリ
ヤーの第1および第2ドメインに由来する配列は、実質
的に存在しないであろう。前述のように、蛋白質分解プ
ロセシングシグナルもまた、含めることができる。
また、前述のように、好ましいシグナル配列はBAR1
シグナル配列であることができるが、S。
シグナル配列であることができるが、S。
セレビシェ−PH05遺伝子のそれもまた使用できる。
BAR1遺伝子によってコードされるバリヤー蛋白質の
前駆体は、そのアミノ末端に推定上のシグナルペプチド
を含有する。この推定上のシグナルペプチドは、疎水性
アミノ酸のコアによって特徴つけられ、そしてアミノ酸
lからアミノ酸24へ延びると思われる(第1図)。−
BAR1−次翻訳生成物のこの部分は、分泌経路を通っ
てのバリヤーのプロセシングの間に除去されると思われ
、そしてこの明細書においてrBAR1シグナルペプチ
ド」と呼ぶ。BAR1遺伝子の対応する部分は、この明
細書において「シグナル配列」と呼ぶ。
前駆体は、そのアミノ末端に推定上のシグナルペプチド
を含有する。この推定上のシグナルペプチドは、疎水性
アミノ酸のコアによって特徴つけられ、そしてアミノ酸
lからアミノ酸24へ延びると思われる(第1図)。−
BAR1−次翻訳生成物のこの部分は、分泌経路を通っ
てのバリヤーのプロセシングの間に除去されると思われ
、そしてこの明細書においてrBAR1シグナルペプチ
ド」と呼ぶ。BAR1遺伝子の対応する部分は、この明
細書において「シグナル配列」と呼ぶ。
例示的発現単位は、少なくともBAR1シグナル配列お
よび第3ドメインコード配列を含み、そしてまた、他の
BAR1配列を含むことができる。
よび第3ドメインコード配列を含み、そしてまた、他の
BAR1配列を含むことができる。
例えば、1つの適当な発現側単位はTPl、1プロモー
ター(Kawasaki、米国特許第4,599,31
1号、198G) 、−B A R1シグナル配列、ア
ミノ酸391−526をコードするBARI C−末端
ドメインのための配列の部分、2塩基切断部位をコード
する配列、および異種蛋白質のためのコード配列、例え
ば、インスリン前駆体MI−3をコードずするDNA配
列[Markussenら、欧州特許163.529号
に記載されてしするようにrB(1−29)八Ia A
la Lys A(1−12)Jとしても知られる〕、
を含んで成る。
ター(Kawasaki、米国特許第4,599,31
1号、198G) 、−B A R1シグナル配列、ア
ミノ酸391−526をコードするBARI C−末端
ドメインのための配列の部分、2塩基切断部位をコード
する配列、および異種蛋白質のためのコード配列、例え
ば、インスリン前駆体MI−3をコードずするDNA配
列[Markussenら、欧州特許163.529号
に記載されてしするようにrB(1−29)八Ia A
la Lys A(1−12)Jとしても知られる〕、
を含んで成る。
他の例示的発現単位は、TPIIプロモーター開始AT
Gから+1572bpにおけるEco旧部位までのBA
R1遺伝子、2塩基切断部位をコードする配列、および
異種蛋白質のためのコード配列、例えば、インスリン前
駆体Ml−3をコードするDNA配列を含んで成る。
Gから+1572bpにおけるEco旧部位までのBA
R1遺伝子、2塩基切断部位をコードする配列、および
異種蛋白質のためのコード配列、例えば、インスリン前
駆体Ml−3をコードするDNA配列を含んで成る。
さらに他の発現単位は、TPIIプロモーター酵母PH
05(伸性性(repressible)ホスファクー
ゼ〕シグナル配列、ブタ・ウロキナーゼcDNA、アミ
ノ酸423−526をコードする運AR1第3ドメイン
配列の一部、およびTPTIターミネータ−を含んで成
る。
05(伸性性(repressible)ホスファクー
ゼ〕シグナル配列、ブタ・ウロキナーゼcDNA、アミ
ノ酸423−526をコードする運AR1第3ドメイン
配列の一部、およびTPTIターミネータ−を含んで成
る。
分泌性ペプチドと異種蛋白質との間のプロセシング部位
としてのトロンビン切断部位の別の使用は、他の例示的
発現単位を生ずる。1つのこのような発現単位は、TP
IIプロモーター、且−へ3−1シグナル配列、BAR
I C−末端ドメインのためのコード配列、トロンビン
切断部位(アミノ酸プ11リンおよびアルギニン)をコ
ードする配列、異種蛋白質のためのコード配列、例えば
、インスリン前駆体Ml−3をコードするDNA配列を
含んで成る。
としてのトロンビン切断部位の別の使用は、他の例示的
発現単位を生ずる。1つのこのような発現単位は、TP
IIプロモーター、且−へ3−1シグナル配列、BAR
I C−末端ドメインのためのコード配列、トロンビン
切断部位(アミノ酸プ11リンおよびアルギニン)をコ
ードする配列、異種蛋白質のためのコード配列、例えば
、インスリン前駆体Ml−3をコードするDNA配列を
含んで成る。
BARJiff伝子配列の分折子配列リヤーおよびいく
つかのペプシン様プロテアーゼの間の相同性を示した。
つかのペプシン様プロテアーゼの間の相同性を示した。
さらに、バリヤーは、これらのプロテアーゼとの相同性
を示さない、第3ドメインをそのC−末端に含有する。
を示さない、第3ドメインをそのC−末端に含有する。
本発明者らによるそれ以上の研究は、このドメイン内の
配列が細胞からのバリヤーの輸送に必要であることを示
した。
配列が細胞からのバリヤーの輸送に必要であることを示
した。
−WムR,1准定ジグづ”ル配列を第3(C−末端)ド
メインの136アミノ酸のためのコード領域と組み合わ
せることによって、本発明者らはMFα1p r e
−p r O配列を含んで成るl造成物を使用して得ら
れたものよりも高い異種蛋白質についての分泌レベルを
得た。
メインの136アミノ酸のためのコード領域と組み合わ
せることによって、本発明者らはMFα1p r e
−p r O配列を含んで成るl造成物を使用して得ら
れたものよりも高い異種蛋白質についての分泌レベルを
得た。
C−末端ドメインの136アミノ酸部分を使用するこ七
に加えて、このドメインのより小さいセグメントを使用
することができる。制限酵素による切断およびエキソヌ
クレアーゼによる消化を使用することによって、第3ド
メインのより小さい断片を発生させ、そして形質転換さ
れた細胞からの蛋白質の分泌を指令するそれらの能力に
ついて試験した。例えば、1系列の実験において、串A
R上遺伝子をいくつかの便利な制限部位において切断し
て、C−末端の欠失を発生させた。次いで、遺伝子断片
を物質PのC−末端部分をコードする断片に融合せしめ
た(Munro:およびPelhaHlfi−MBOノ
エー3 : 3087−3093.1984)。得られ
た融合蛋白質を、物質Pに体する抗体を使用して、検出
しかつ定量した。これらの研究により、位1ff126
7 (第1図)から位置1572におけるEcoRT部
位までの領域を適当なシグナルペプチドコード配列と組
み合わせて、強力なハイプリン)・分泌性ペプチドを得
ることができる。
に加えて、このドメインのより小さいセグメントを使用
することができる。制限酵素による切断およびエキソヌ
クレアーゼによる消化を使用することによって、第3ド
メインのより小さい断片を発生させ、そして形質転換さ
れた細胞からの蛋白質の分泌を指令するそれらの能力に
ついて試験した。例えば、1系列の実験において、串A
R上遺伝子をいくつかの便利な制限部位において切断し
て、C−末端の欠失を発生させた。次いで、遺伝子断片
を物質PのC−末端部分をコードする断片に融合せしめ
た(Munro:およびPelhaHlfi−MBOノ
エー3 : 3087−3093.1984)。得られ
た融合蛋白質を、物質Pに体する抗体を使用して、検出
しかつ定量した。これらの研究により、位1ff126
7 (第1図)から位置1572におけるEcoRT部
位までの領域を適当なシグナルペプチドコード配列と組
み合わせて、強力なハイプリン)・分泌性ペプチドを得
ることができる。
また、BAR]第3ドメインの突然変異を含有する発現
単位を発生さゼ、こうしてアミノ酸468470(グリ
コジル化部位#7)、またはアミノ酸503.505(
グリコジル化部位#8)、または両部位におりるN−結
合グリコシル化部位を突然変異誘発させて、それぞれ、
アミノ酸468または503における炭水化物の付加を
防止することも有利であろう。N−結合グリコシル化は
Asn’−X−3erまたはAsn−X−Thr (
ここでXは任意のアミノ酸であることができる)のアク
セプター・l・リベプチド配列において起こるが、これ
らのトリペプチド配列のすべてはN−結合グリコシル化
に対するポストではない。N−結合グリコシル化アクセ
プタ一部位を、トリペプチドアクセプター配列の部位の
いずれかにおける他のアミノ酸コドンで置換することに
よって炭水化物部分の付加を防止するために、突然変異
誘発することができる。
単位を発生さゼ、こうしてアミノ酸468470(グリ
コジル化部位#7)、またはアミノ酸503.505(
グリコジル化部位#8)、または両部位におりるN−結
合グリコシル化部位を突然変異誘発させて、それぞれ、
アミノ酸468または503における炭水化物の付加を
防止することも有利であろう。N−結合グリコシル化は
Asn’−X−3erまたはAsn−X−Thr (
ここでXは任意のアミノ酸であることができる)のアク
セプター・l・リベプチド配列において起こるが、これ
らのトリペプチド配列のすべてはN−結合グリコシル化
に対するポストではない。N−結合グリコシル化アクセ
プタ一部位を、トリペプチドアクセプター配列の部位の
いずれかにおける他のアミノ酸コドンで置換することに
よって炭水化物部分の付加を防止するために、突然変異
誘発することができる。
例えば、アクセプター配列Asn−X−3erま、?、
=ハ八sへn−X−Th rのいずれかの第2位置にお
りるプロリン残基は酵母におけるグリコジル化を阻止す
ることができる(Marshall 、BL匹豆明ユS
Q以づ7mB、 40 : 17−26.1974)
、アクセプター・トリペプチド配列の第3アミノ酸もま
た変化させるごとができる。とくに好ましい態様におい
て、トリペプチドアクセプター配列の第1位:1°’;
lこおりるアスパラギンを他のアミノ酸装置8換える。
=ハ八sへn−X−Th rのいずれかの第2位置にお
りるプロリン残基は酵母におけるグリコジル化を阻止す
ることができる(Marshall 、BL匹豆明ユS
Q以づ7mB、 40 : 17−26.1974)
、アクセプター・トリペプチド配列の第3アミノ酸もま
た変化させるごとができる。とくに好ましい態様におい
て、トリペプチドアクセプター配列の第1位:1°’;
lこおりるアスパラギンを他のアミノ酸装置8換える。
最も好ましくは、グルタミン残基(GIn)をAsn残
基の代りに用いる。しかしながら、他のアミノ酸の置換
もまたトリペプチドアクセプター配列の3つの位置にお
いて実施して炭水化物の付加を防止することができる。
基の代りに用いる。しかしながら、他のアミノ酸の置換
もまたトリペプチドアクセプター配列の3つの位置にお
いて実施して炭水化物の付加を防止することができる。
部位#7もしくは#8、または両者の部位における炭水
化物のN−結合イ1加を阻止する突然変異は、好ましく
は部位特異的生体外突然変異誘発によって生成される。
化物のN−結合イ1加を阻止する突然変異は、好ましく
は部位特異的生体外突然変異誘発によって生成される。
特に好ましい突然変異は、トリペプチド・アクセプター
配列の第1位におけるAsn残基に対するGin置換を
発生さ−Uる。位置#7または#8においてB13上第
3ドメイン・グリコジル化部位の突然変異を発生させる
ことによって、野生型グリコジルを伴う昇カ1シ1.第
3ドメイン及び竺旦α1 pre−pro配列または
−WΔ3−しシグナルペプチドを含んで成る類似の構成
体を使用して得られるものよりも高い、異種蛋白質につ
いて分泌レベルを本発明者らは得た。位置#7まノこは
ff 8におけるグリコジル化部位の突然変異を含りす
るr3 A升−し造成物で形質転換した細胞と、完全に
グリコジル化される刀ARI造成物で形質転換した細胞
の間の増殖曲線の比較において、完全にグリコジル化さ
れるBAP I造成物の形質転換体において明らかな増
殖ラグは、突然変異誘発した造成物の形質転換体におい
て欠けている。
配列の第1位におけるAsn残基に対するGin置換を
発生さ−Uる。位置#7または#8においてB13上第
3ドメイン・グリコジル化部位の突然変異を発生させる
ことによって、野生型グリコジルを伴う昇カ1シ1.第
3ドメイン及び竺旦α1 pre−pro配列または
−WΔ3−しシグナルペプチドを含んで成る類似の構成
体を使用して得られるものよりも高い、異種蛋白質につ
いて分泌レベルを本発明者らは得た。位置#7まノこは
ff 8におけるグリコジル化部位の突然変異を含りす
るr3 A升−し造成物で形質転換した細胞と、完全に
グリコジル化される刀ARI造成物で形質転換した細胞
の間の増殖曲線の比較において、完全にグリコジル化さ
れるBAP I造成物の形質転換体において明らかな増
殖ラグは、突然変異誘発した造成物の形質転換体におい
て欠けている。
2塩基切断部位を含有する本発明の発現単位は、好まし
くは適当なプロモーター、二人に士遺伝子の適当な部分
、2塩基切断部位をコードするアダプター、異質種伝子
またはcDNA、および転写ターミネータ、例えば、T
Prlターミネータを連結することによって生成される
。トロンビン切断部位を含有する本発明の発現単位は、
好ましくは、前述の発現単位中に含有される2塩基プロ
セス部位の生体外突然変異誘発によって、例えば、Ly
s−ArgをPro−Argに変化させることによって
、あるいはトロンビン切断部位をコードするアダプター
を有する発現単位を組み立てるごとによって生成される
。
くは適当なプロモーター、二人に士遺伝子の適当な部分
、2塩基切断部位をコードするアダプター、異質種伝子
またはcDNA、および転写ターミネータ、例えば、T
Prlターミネータを連結することによって生成される
。トロンビン切断部位を含有する本発明の発現単位は、
好ましくは、前述の発現単位中に含有される2塩基プロ
セス部位の生体外突然変異誘発によって、例えば、Ly
s−ArgをPro−Argに変化させることによって
、あるいはトロンビン切断部位をコードするアダプター
を有する発現単位を組み立てるごとによって生成される
。
次いで、生ずる発現単位を適当なベクター中に連結する
。適当な酵母ベクターは次のものを包含する: Y R
J) 7 (Struhlら、(Proc=jJa−
Lo−L、 Acad。
。適当な酵母ベクターは次のものを包含する: Y R
J) 7 (Struhlら、(Proc=jJa−
Lo−L、 Acad。
Sci、USA 、ヱ6 : 1035−103
9 、1978) 、 Y F、p 13(Bro
achら、pene、 8. 8 : 121−13
3. 7978)、pJD824Bおよびp J D
B (Bc4gs、勘tur−q、27E>:104−
108.178)およびそれらの誘導体。このようなベ
クターは、一般に、選択マーカー、例えば、栄養マーカ
ー、山EU2 (これはIcu2を有する宿主菌株にお
ける選択を可能とする)、またはシゾサツカロミセス・
ボムベ(Schizosaccharom ces肛叩
勤)からの解糖系遺伝子ヱーp−工1 (Kawasa
kiおよびBe1l、欧州特許171 、142号)(
これはl、p−i 1突然変異を有する宿主菌株におけ
る選択を可能とする)を包含する。好ましいプロモータ
ーは、酵母解糖系遺伝子からのものCIlCllitz
eら、!」j煩−Chem、 255 : 12073
−12080.1980 ; 八IberおよびKa
wasaki、 J、Mo+、八 l、 Gen
et、 」−:旧”l−434,19B2)または
アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子からノモの(You
ngら、釦M月上上吐肋朋11g or旧croor
anisms for Chemicals、 l1o
laenderら編p、355. l’lenum、
N’、Y、+ 1982 ; 八m1nerer、
Menmol、 jQ↓:192−201.19
83)である。これに関しで、とくに好ましいプロモー
ターはTPIIプロモーター(Kawasaki、米国
特許第4,599,311号、 1986)である。好
ましい転写停止シグナルはTPIIターミネータ−であ
る。
9 、1978) 、 Y F、p 13(Bro
achら、pene、 8. 8 : 121−13
3. 7978)、pJD824Bおよびp J D
B (Bc4gs、勘tur−q、27E>:104−
108.178)およびそれらの誘導体。このようなベ
クターは、一般に、選択マーカー、例えば、栄養マーカ
ー、山EU2 (これはIcu2を有する宿主菌株にお
ける選択を可能とする)、またはシゾサツカロミセス・
ボムベ(Schizosaccharom ces肛叩
勤)からの解糖系遺伝子ヱーp−工1 (Kawasa
kiおよびBe1l、欧州特許171 、142号)(
これはl、p−i 1突然変異を有する宿主菌株におけ
る選択を可能とする)を包含する。好ましいプロモータ
ーは、酵母解糖系遺伝子からのものCIlCllitz
eら、!」j煩−Chem、 255 : 12073
−12080.1980 ; 八IberおよびKa
wasaki、 J、Mo+、八 l、 Gen
et、 」−:旧”l−434,19B2)または
アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子からノモの(You
ngら、釦M月上上吐肋朋11g or旧croor
anisms for Chemicals、 l1o
laenderら編p、355. l’lenum、
N’、Y、+ 1982 ; 八m1nerer、
Menmol、 jQ↓:192−201.19
83)である。これに関しで、とくに好ましいプロモー
ターはTPIIプロモーター(Kawasaki、米国
特許第4,599,311号、 1986)である。好
ましい転写停止シグナルはTPIIターミネータ−であ
る。
酵母ベクター中の発現単位を含んで成る造成物を、酵母
、例えば、サツカロミセス・セレビシア工(Sacch
arom ces cervisiae)(以後、S、
セレビシェ−)の菌株中に形質転換する。酵母を形質転
換するだめの技術は、例えば、Beggs (前掲)お
よび旧nnanら(Proc、Natol、八cad、
Sci、[ISA 、どし5:19291.93
3.1978)において知られている。形質転換体を、
炭素および窒素源、ならびに特定の宿主菌株が要求する
他の栄養物質を含有する適当な培地中で’?t”Dする
。POT1選択マーカーを含有するプラスミドで形質転
換した宿主細胞を、炭素源としてグルコースを含有する
複合培地中で培養することができる。
、例えば、サツカロミセス・セレビシア工(Sacch
arom ces cervisiae)(以後、S、
セレビシェ−)の菌株中に形質転換する。酵母を形質転
換するだめの技術は、例えば、Beggs (前掲)お
よび旧nnanら(Proc、Natol、八cad、
Sci、[ISA 、どし5:19291.93
3.1978)において知られている。形質転換体を、
炭素および窒素源、ならびに特定の宿主菌株が要求する
他の栄養物質を含有する適当な培地中で’?t”Dする
。POT1選択マーカーを含有するプラスミドで形質転
換した宿主細胞を、炭素源としてグルコースを含有する
複合培地中で培養することができる。
本発明における使用に通ずる酵母菌株は、プラスミドが
含有する選択マーカーによって補完され得る遺伝的欠陥
を有するであろう。選択マーカは一般に、宿主細胞にお
ける栄養要求変異を補完する遺伝子である。このような
遺伝子欠陥を有する酵母菌株は、例えば、^TCC(米
国マリイランド州ロックビル)または酵母遺伝子原料セ
ンター(Yeast Genetic 5tock C
enter) (米国カリフォルニア州バークレイ)か
ら商業的に入手可能であるか、あるいは突然変異および
選択の標準技術を使用して調製できる。特定の宿主およ
び選択マーカーの選択は、当業者の技量の範囲内である
。異種蛋白質の生産を最適化するために、宿主菌株は突
然変異、例えば、タンパク質分解活性を減少させるり阜
l↓突然変異(Jones+ GenLics、 85
: 23+1977)を有することが好ましい。
含有する選択マーカーによって補完され得る遺伝的欠陥
を有するであろう。選択マーカは一般に、宿主細胞にお
ける栄養要求変異を補完する遺伝子である。このような
遺伝子欠陥を有する酵母菌株は、例えば、^TCC(米
国マリイランド州ロックビル)または酵母遺伝子原料セ
ンター(Yeast Genetic 5tock C
enter) (米国カリフォルニア州バークレイ)か
ら商業的に入手可能であるか、あるいは突然変異および
選択の標準技術を使用して調製できる。特定の宿主およ
び選択マーカーの選択は、当業者の技量の範囲内である
。異種蛋白質の生産を最適化するために、宿主菌株は突
然変異、例えば、タンパク質分解活性を減少させるり阜
l↓突然変異(Jones+ GenLics、 85
: 23+1977)を有することが好ましい。
哺乳動物細胞の発現ベクターもまた、この分野において
よく知られている。種々のプロモーター例えば、ウィル
ス(例えば、SV40およびアデノウィルス)プロモー
ターおよび細胞性プロモータ−(例えば、メタロヂオネ
イン遺伝子; Karin、米国特許第4,601,9
78号;およびPa1m1Lerら、米国特許第4,5
79,821号)が人手可能である。他の要素、例えば
、転写停止シグナル、ポリアデニル化シグナルおよび転
写増強配列は、特定の宿主細胞系にお&)るそれらの機
能のためム二選択される。哺乳動物細胞を形質転換し、
そしてクローニングしたDNA配列を発現する方法は、
Kaufmanおよび5harp(夫、Mo1.B11
o、 159:601−621.1982)、Sou
thernおよびBerg−σ1匣に蝕弦旦 上:32
7341.1982) 、Loyterら、 (Pr
oc、Natol、Aca、Sci。
よく知られている。種々のプロモーター例えば、ウィル
ス(例えば、SV40およびアデノウィルス)プロモー
ターおよび細胞性プロモータ−(例えば、メタロヂオネ
イン遺伝子; Karin、米国特許第4,601,9
78号;およびPa1m1Lerら、米国特許第4,5
79,821号)が人手可能である。他の要素、例えば
、転写停止シグナル、ポリアデニル化シグナルおよび転
写増強配列は、特定の宿主細胞系にお&)るそれらの機
能のためム二選択される。哺乳動物細胞を形質転換し、
そしてクローニングしたDNA配列を発現する方法は、
Kaufmanおよび5harp(夫、Mo1.B11
o、 159:601−621.1982)、Sou
thernおよびBerg−σ1匣に蝕弦旦 上:32
7341.1982) 、Loyterら、 (Pr
oc、Natol、Aca、Sci。
us4 7!j:422−426.1982)およびN
eumannら。
eumannら。
(財則Qユニ1 : 841−845.1982)に記
載されている。細胞を血清含有培地または適当な補充物
質を含有する血清不合培地中で培養する。このような適
当な培地は、商業的に入手可能であるか、あるいは公表
された処方に従って調製できる(例えば、ATCCのカ
タログ)。特定の精製のプロトコルは、精製すべき特定
のタンパク質の性質によって決定されるであろう。この
ような決定は当業者の技量の範囲内である。一般に、細
胞培地を細胞から分離し、そして蛋白質を培地から単離
する。有用な精製の技術は、沈澱、免疫吸着および種々
のクロマトグラフィー法、例えば、イオン交換りlコマ
トゲラフイー、アフイニテイーク「77トグラフイーお
よびゲルろ過による分画を包含する。
載されている。細胞を血清含有培地または適当な補充物
質を含有する血清不合培地中で培養する。このような適
当な培地は、商業的に入手可能であるか、あるいは公表
された処方に従って調製できる(例えば、ATCCのカ
タログ)。特定の精製のプロトコルは、精製すべき特定
のタンパク質の性質によって決定されるであろう。この
ような決定は当業者の技量の範囲内である。一般に、細
胞培地を細胞から分離し、そして蛋白質を培地から単離
する。有用な精製の技術は、沈澱、免疫吸着および種々
のクロマトグラフィー法、例えば、イオン交換りlコマ
トゲラフイー、アフイニテイーク「77トグラフイーお
よびゲルろ過による分画を包含する。
BAR1遺伝子をMackayら(米国特許第11,6
13,572号、 1986)に記載されているように
クローニングした。簡単に述べると、S、セレビシェ−
に由来する酵母ゲノムDNA断片のランダム混合物ベク
ターYEp13中にを含有するプラスミドのプールを、
遺伝子型MATa、Ieu2 barlをもつ酵母菌
株中に形質転換した。形質転換体を、ロイシンを欠く合
成培地上で増殖するそれらの能力について選択した。形
質転換した細胞を、さらに、宿主細胞におけるbarl
欠陥を補完するそれらの能力についてスクリーニングし
た。機能的B A j”;−1遺伝子を欠く酵母菌株M
ATa細胞は、α−因子による阻害に対して異常に感受
性である。次いで、α〜因子の阻害に対して抵抗性であ
ることがわかった形質転換体を、バリアー活性を分泌す
る能力についてスクリーニングした。ベクターYEP]
3および9.2kbの酵母ゲノムインサートを含んで成
るプラスミドp B A R2(ATCCI36410
)は、barl欠陥を完全に補完することがわかった。
13,572号、 1986)に記載されているように
クローニングした。簡単に述べると、S、セレビシェ−
に由来する酵母ゲノムDNA断片のランダム混合物ベク
ターYEp13中にを含有するプラスミドのプールを、
遺伝子型MATa、Ieu2 barlをもつ酵母菌
株中に形質転換した。形質転換体を、ロイシンを欠く合
成培地上で増殖するそれらの能力について選択した。形
質転換した細胞を、さらに、宿主細胞におけるbarl
欠陥を補完するそれらの能力についてスクリーニングし
た。機能的B A j”;−1遺伝子を欠く酵母菌株M
ATa細胞は、α−因子による阻害に対して異常に感受
性である。次いで、α〜因子の阻害に対して抵抗性であ
ることがわかった形質転換体を、バリアー活性を分泌す
る能力についてスクリーニングした。ベクターYEP]
3および9.2kbの酵母ゲノムインサートを含んで成
るプラスミドp B A R2(ATCCI36410
)は、barl欠陥を完全に補完することがわかった。
BARl遺伝子およびその関連するフランキング(fl
anking)配列を、Hindnl−Xhol断片と
して、ベクターp U C13(VieiraおよびM
essing。
anking)配列を、Hindnl−Xhol断片と
して、ベクターp U C13(VieiraおよびM
essing。
Gene、 39 : 259.1982)中にサブク
ローニングした。
ローニングした。
プラスミドpBAR2をHinllおよびXholで消
化して、BAR1遺伝子を含有するほぼ3kbの断片を
単離した。プラスミドpUc13を、H4n1lおよび
5ailで消化によって線状化した。
化して、BAR1遺伝子を含有するほぼ3kbの断片を
単離した。プラスミドpUc13を、H4n1lおよび
5ailで消化によって線状化した。
線状化したベクターをpBAR2からの3kbと連結し
た。生ずるプラスミドをpZV9と表示した(1!、C
o11菌株RRI中の形質転換体として寄託された。
ATCC153283)。
た。生ずるプラスミドをpZV9と表示した(1!、C
o11菌株RRI中の形質転換体として寄託された。
ATCC153283)。
クローニングした一BARI遺伝子の配列および一次翻
訳生成物の配列を第1図に示す。
訳生成物の配列を第1図に示す。
第2図を参照すると、プラスミドpM220(またp
M210として知られている)を、エエ士土プロモータ
ーおよびターミネータの両者の人手源として使用した(
AlberおよびKawasaki+ J、1ipp1
.Genet。
M210として知られている)を、エエ士土プロモータ
ーおよびターミネータの両者の人手源として使用した(
AlberおよびKawasaki+ J、1ipp1
.Genet。
上: 419−434.1982)。pM220で形質
転換した[。
転換した[。
コリ RRIは、ATCCに受託番号39853で寄託
された。TPIIプロモーターおよびターミネータ−を
含んで成るプラスミドpD1107を造成するため、ま
ず、pM220の9oobpのBglIr−Ec。
された。TPIIプロモーターおよびターミネータ−を
含んで成るプラスミドpD1107を造成するため、ま
ず、pM220の9oobpのBglIr−Ec。
RI TPIIプロモーター断片をpT C7(Ma
rshら、釦匹、共、 :481−485.1984)
中にサブクローニングして、プラスミドf101101
を発生させた。次いで、プラスミドpD1101をHi
n IIIおよび5phlで消化して、700pbの
部分的Tr’TIプロモーター断片を単離した。pUC
18中にサブクローニングされたp M220の800
bpのXba I−Bamll′F TPll−プロモ
ーター断片を含んで成るプラスミドpDR1100を、
T(i n I[IおよびSph■て切断した。700
bpの部分的TPTIプロモーターを線状化したpDR
1100中に連結してpD1107を生成した。プロモ
ーター配列の3゛末端にXba1部位を挿入するために
修飾されたpM220からのニーI’11プロモーター
を使用して、pD1107中に存在するTPrlプロモ
ーターを置換した。
rshら、釦匹、共、 :481−485.1984)
中にサブクローニングして、プラスミドf101101
を発生させた。次いで、プラスミドpD1101をHi
n IIIおよび5phlで消化して、700pbの
部分的Tr’TIプロモーター断片を単離した。pUC
18中にサブクローニングされたp M220の800
bpのXba I−Bamll′F TPll−プロモ
ーター断片を含んで成るプラスミドpDR1100を、
T(i n I[IおよびSph■て切断した。700
bpの部分的TPTIプロモーターを線状化したpDR
1100中に連結してpD1107を生成した。プロモ
ーター配列の3゛末端にXba1部位を挿入するために
修飾されたpM220からのニーI’11プロモーター
を使用して、pD1107中に存在するTPrlプロモ
ーターを置換した。
プラスミドpM220をEcoRTで消化し、そして7
Pfi−プロモーターを含んで成る0、9断片をアガロ
ースゲルの重水泳動によって分離し、そして末端をDN
Aポリメラーゼ■ (クレノー断片)で平滑末端とした
。キナーゼXbaIリンカ−をこの断片に付加し、次い
でBglUおよびXbaTで消化した。次いで、この修
飾されたTPTIプロモーター断片をrlD1107の
3.4 kbのBgllI−XbaIベクター断片中に
連結してpZV118を生成せしめた。
Pfi−プロモーターを含んで成る0、9断片をアガロ
ースゲルの重水泳動によって分離し、そして末端をDN
Aポリメラーゼ■ (クレノー断片)で平滑末端とした
。キナーゼXbaIリンカ−をこの断片に付加し、次い
でBglUおよびXbaTで消化した。次いで、この修
飾されたTPTIプロモーター断片をrlD1107の
3.4 kbのBgllI−XbaIベクター断片中に
連結してpZV118を生成せしめた。
次いで、pZV118中のTPIIプロモーターの3゛
末端において再生したEcoRI部位を破壊した。この
プラスミ1゛をIIi n d IIIおよびE(。
末端において再生したEcoRI部位を破壊した。この
プラスミ1゛をIIi n d IIIおよびE(。
oRIで消化し、そして0.9kbの断片を分離し、そ
してオリゴヌクレオチドZC708(5’−へへTTG
CTCGAGT−3’ )およびZ C709(3’
−CGAGCTCIIGATC−5’)をアニーリング
するごとによって構成した合成リンカ−に連結した。[
オリゴヌクレオチドはアプライド・バイオシステムス(
Δpplied Biosystems)380A型合
成装置で合成し、そしてポリアクリルアミドゲルの電気
泳動によって精製した]。ZC70BおよびZC709
をマニアチス(ManiaLis)ら■1とcular
C1onin + 八 Laborator
Method、 p、122Cold Spri
ng 1larber Laboratory、 Co
1d Springllarber、 N、Y、、 1
982]に記載されている方法に従ってキナーゼ処理し
、そしてアニールした。アダプターの付加は、TPII
プロモーター断片の3′末端におけるEcoR1部位を
排除し、そしてXhoIおよびXba 1部位を付加す
る。次いで、この断片をH’+nm−XbaT切断pU
c+3に連結した。生ずるプラスミドをPZV134
と表示する(第2図)。
してオリゴヌクレオチドZC708(5’−へへTTG
CTCGAGT−3’ )およびZ C709(3’
−CGAGCTCIIGATC−5’)をアニーリング
するごとによって構成した合成リンカ−に連結した。[
オリゴヌクレオチドはアプライド・バイオシステムス(
Δpplied Biosystems)380A型合
成装置で合成し、そしてポリアクリルアミドゲルの電気
泳動によって精製した]。ZC70BおよびZC709
をマニアチス(ManiaLis)ら■1とcular
C1onin + 八 Laborator
Method、 p、122Cold Spri
ng 1larber Laboratory、 Co
1d Springllarber、 N、Y、、 1
982]に記載されている方法に従ってキナーゼ処理し
、そしてアニールした。アダプターの付加は、TPII
プロモーター断片の3′末端におけるEcoR1部位を
排除し、そしてXhoIおよびXba 1部位を付加す
る。次いで、この断片をH’+nm−XbaT切断pU
c+3に連結した。生ずるプラスミドをPZV134
と表示する(第2図)。
実−極側」ニブラスミド GLY2.3の″1′プラス
ミドpMT610 (Markussenら、欧州特許
IG3.529号;第3図参照)に由来する、MFα1
リーダーおよびインスリン前駆体Ml−3(また、+3
(1−29)−ΔIa−Ala−Lys (1−21)
としても知られている〕をコードする酵母コドン最適化
配列からなる0、5khの断片を突然変異誘発して、M
FαIリーダー中に存在する2つの潜在的グリコジル化
部位を除去した。MFα11J−グーのアミノ酸57(
グリコジル化部位#2)およびアミノ酸67(グリコジ
ル化部位#3)で開始する部位を、各場合において、A
snコドンをGinコドンに変化させることによって除
去した。突然変異誘発のため、PMT(iloに由来す
る。、skbのEc oRT−XbaT MFcyl
断片をM13mpH(これはXba TおよびEc o
RIを使用する消化によって線状化されている)中に連
結した。生ずる組み換えファージをmCα68と表示し
た。オリゴヌクレオチドZ C457(5’−TGT
TCCAAA CTA CTA TTGCC−3’)お
よびZ C458(5’−GCCATT TCCCCA
ATCCACCAA T−3’ ) ヲアブライド・
バイオシステムス380A型DNA合成装置で合成し、
そしてポリアクリルアミドゲルの電気泳動によって精製
した。次いで、MFα1 +J−ダーグリコシル化部位
#3のAsnコドンを、生体外突然変異誘発(Zoll
erおよびSm1th、 D N A 3 : 47
9−488.1984 ;およびZollerおよびS
m i th + Me現U渾αmo如[100,19
83)によって、オリゴヌクレオチドZC457および
mCα68鋳型を使用して変更した。陽性のクローンの
配列を決定し、そして正しいクローンをmCα68と表
示した。Ml”αlグリコジル化部位か2を変更したオ
リゴヌクレオチドZC457を使用して、Zoller
およびSm1th(前掲)に記載される突然変異誘発法
に従い、mCα75鋳型を突然変異誘発した。陽性のク
ローンの配列を決定し、そして正しいクローンをmCα
88と表示した。突然変異誘発したPIFα1リーダー
およびMl−3をコードする遺伝子を含んで成る0、5
15kbのP、col’?IXba I断片を1ylc
α88から取り、そし7pUC19(EcoRIおよび
Xba Tで消化するごとによって線状化したもの)中
にサブクローニングした。i:Iられたプラスミドをp
C,LY2.3と表示した(第3図) 4:ヘク − 5W167の゛!I3 発現ベクターpsW167は、酵母ベクターY F、
p 13t11M I−3コ一ド配列に融合したバリヤ
ーの最初の526アミノ酸をコードする配列を含んで成
る。TP11プロモーターおよび1578bpの1込−
B」−断片とMl−3のだめのコード配列との間の融合
を使用して、2塩基切断部位をコードするアダプターを
用いて、フレーム内に該2つの配列を連結して、発現単
位を構成した。融合を構成するとき、1込」」−コード
配列はp SW8およびその誘導体psW81から生成
し、それらは次のようにして造成した。
ミドpMT610 (Markussenら、欧州特許
IG3.529号;第3図参照)に由来する、MFα1
リーダーおよびインスリン前駆体Ml−3(また、+3
(1−29)−ΔIa−Ala−Lys (1−21)
としても知られている〕をコードする酵母コドン最適化
配列からなる0、5khの断片を突然変異誘発して、M
FαIリーダー中に存在する2つの潜在的グリコジル化
部位を除去した。MFα11J−グーのアミノ酸57(
グリコジル化部位#2)およびアミノ酸67(グリコジ
ル化部位#3)で開始する部位を、各場合において、A
snコドンをGinコドンに変化させることによって除
去した。突然変異誘発のため、PMT(iloに由来す
る。、skbのEc oRT−XbaT MFcyl
断片をM13mpH(これはXba TおよびEc o
RIを使用する消化によって線状化されている)中に連
結した。生ずる組み換えファージをmCα68と表示し
た。オリゴヌクレオチドZ C457(5’−TGT
TCCAAA CTA CTA TTGCC−3’)お
よびZ C458(5’−GCCATT TCCCCA
ATCCACCAA T−3’ ) ヲアブライド・
バイオシステムス380A型DNA合成装置で合成し、
そしてポリアクリルアミドゲルの電気泳動によって精製
した。次いで、MFα1 +J−ダーグリコシル化部位
#3のAsnコドンを、生体外突然変異誘発(Zoll
erおよびSm1th、 D N A 3 : 47
9−488.1984 ;およびZollerおよびS
m i th + Me現U渾αmo如[100,19
83)によって、オリゴヌクレオチドZC457および
mCα68鋳型を使用して変更した。陽性のクローンの
配列を決定し、そして正しいクローンをmCα68と表
示した。Ml”αlグリコジル化部位か2を変更したオ
リゴヌクレオチドZC457を使用して、Zoller
およびSm1th(前掲)に記載される突然変異誘発法
に従い、mCα75鋳型を突然変異誘発した。陽性のク
ローンの配列を決定し、そして正しいクローンをmCα
88と表示した。突然変異誘発したPIFα1リーダー
およびMl−3をコードする遺伝子を含んで成る0、5
15kbのP、col’?IXba I断片を1ylc
α88から取り、そし7pUC19(EcoRIおよび
Xba Tで消化するごとによって線状化したもの)中
にサブクローニングした。i:Iられたプラスミドをp
C,LY2.3と表示した(第3図) 4:ヘク − 5W167の゛!I3 発現ベクターpsW167は、酵母ベクターY F、
p 13t11M I−3コ一ド配列に融合したバリヤ
ーの最初の526アミノ酸をコードする配列を含んで成
る。TP11プロモーターおよび1578bpの1込−
B」−断片とMl−3のだめのコード配列との間の融合
を使用して、2塩基切断部位をコードするアダプターを
用いて、フレーム内に該2つの配列を連結して、発現単
位を構成した。融合を構成するとき、1込」」−コード
配列はp SW8およびその誘導体psW81から生成
し、それらは次のようにして造成した。
完全なT3AR1コード領域およびそれに連なるフラン
キング領域を含んで成るプラスミドpZV9をS a
l IおよびB a m Hlで切断して、1.3kb
の−W人3ユ断片を単離した。この断片をpUC13(
これは5ailおよびBamHlで切断した)中にサブ
クローニングして、pZVI7と表示するプラスミドを
発生させた(第4図)。プラスミドpZV17をEco
RIで消化して、BAR1コード頭域の最も3′側の0
.5kbを除去した。ヘクターーBARI断片を再連結
してp 、J r−I G6と表示するプラスミドを発
生させた。プラスミドp J JIG(iをEcoRI
で線状化し、そしてDNAポリメラーゼl(クレノー断
片)で平滑末端とした。キナーゼ処理したB a m
HIリンカ−(5’−CCGGATCCGG3゛)を付
加し、そして再連結の前に過剰のリンカ−をBamHl
で消化して除去した。得られたプラスミドをp S W
8と表示した(第8図)。
キング領域を含んで成るプラスミドpZV9をS a
l IおよびB a m Hlで切断して、1.3kb
の−W人3ユ断片を単離した。この断片をpUC13(
これは5ailおよびBamHlで切断した)中にサブ
クローニングして、pZVI7と表示するプラスミドを
発生させた(第4図)。プラスミドpZV17をEco
RIで消化して、BAR1コード頭域の最も3′側の0
.5kbを除去した。ヘクターーBARI断片を再連結
してp 、J r−I G6と表示するプラスミドを発
生させた。プラスミドp J JIG(iをEcoRI
で線状化し、そしてDNAポリメラーゼl(クレノー断
片)で平滑末端とした。キナーゼ処理したB a m
HIリンカ−(5’−CCGGATCCGG3゛)を付
加し、そして再連結の前に過剰のリンカ−をBamHl
で消化して除去した。得られたプラスミドをp S W
8と表示した(第8図)。
TPIIプロモーター、物質P (MunroおよびP
elham、前掲)のC−末端部分のコード領域に融合
したBARjコード領域およびTPTIクーミネーター
を含んで成るpsW81を、第4図および第5図に示す
ようにして、pSW8から誘導した。
elham、前掲)のC−末端部分のコード領域に融合
したBARjコード領域およびTPTIクーミネーター
を含んで成るpsW81を、第4図および第5図に示す
ようにして、pSW8から誘導した。
プラスミドpSW8を5ailおよびB a m H1
で切断して、バリヤーのアミノ酸252−526をコー
ドする824bpの断片を単離した。M13mpB中に
物質[)のC−末端部分を2量体の形態でコードする合
成オリゴヌクレオチド配列を含有するプラスミl” p
P M 2を、MunroおよびPelhamから得
た。
で切断して、バリヤーのアミノ酸252−526をコー
ドする824bpの断片を単離した。M13mpB中に
物質[)のC−末端部分を2量体の形態でコードする合
成オリゴヌクレオチド配列を含有するプラスミl” p
P M 2を、MunroおよびPelhamから得
た。
プラスミドpPM2をBamHlおよび5alIによる
消化によって線状化し、そしてpSW8からの824b
pの且人且土断片と連結した。得られるプラスミドps
W14を5alIおよびSma Iで消化して、871
bpのBAR1−物質P断片を単離した。アミノ酸1−
250をコードするBAR1の断片を含んで成るプラス
ミドpZV16をXba Iおよび5ailで切断して
、767bpのBAR1断片を得た。この断片を、Xb
a TおよびSmaIで切断したpUc18との3部分
の連結において、871bpの升へ尺上−物質P断片と
連結した。得られるプラスミド(psW15と表示する
)をXba1および3ma Iで消化して、1.64k
bのBAR1物質P断片を単離した。A D H1プロ
モーターをpR+、029から得た。pRLO29はp
Uc18中の人旦用上プロモーターおよび116bpの
BAR1の5“コード領域を含んで成る(Mackay
、 WO37102670)。プラスミドp RLO2
9をSpl+lおよびXba Iで消化して、0.42
kbのADHIプロモーター断片を単離した。TPII
ターミネータ−(AlberおよびKawasaki、
前掲)を、pUc18(Ec oRl−5p h I)
に連結台された0、7kbのTPIIターミネータ−(
平滑末端Xba IEcoRI)を含んで成る平滑末端
のXbar−3phl断片として準備した。この断片を
0.42kbのADHl−プロモーター断片および1.
64kbのBAR1物質P断片と、3部分連結において
連結してプラスミドpSW22を生成した(第4図)。
消化によって線状化し、そしてpSW8からの824b
pの且人且土断片と連結した。得られるプラスミドps
W14を5alIおよびSma Iで消化して、871
bpのBAR1−物質P断片を単離した。アミノ酸1−
250をコードするBAR1の断片を含んで成るプラス
ミドpZV16をXba Iおよび5ailで切断して
、767bpのBAR1断片を得た。この断片を、Xb
a TおよびSmaIで切断したpUc18との3部分
の連結において、871bpの升へ尺上−物質P断片と
連結した。得られるプラスミド(psW15と表示する
)をXba1および3ma Iで消化して、1.64k
bのBAR1物質P断片を単離した。A D H1プロ
モーターをpR+、029から得た。pRLO29はp
Uc18中の人旦用上プロモーターおよび116bpの
BAR1の5“コード領域を含んで成る(Mackay
、 WO37102670)。プラスミドp RLO2
9をSpl+lおよびXba Iで消化して、0.42
kbのADHIプロモーター断片を単離した。TPII
ターミネータ−(AlberおよびKawasaki、
前掲)を、pUc18(Ec oRl−5p h I)
に連結台された0、7kbのTPIIターミネータ−(
平滑末端Xba IEcoRI)を含んで成る平滑末端
のXbar−3phl断片として準備した。この断片を
0.42kbのADHl−プロモーター断片および1.
64kbのBAR1物質P断片と、3部分連結において
連結してプラスミドpSW22を生成した(第4図)。
pSW22中に存在するADHIプロモーターをTPI
Iプロモーターと置換して、プラスミドpsW81を造
成した(第5図)。ニーP−1−3プロモーターを9o
obpのH4ndIII−Xba I断片として準備し
た。BAR1−物質P融合およびTPT上ターミネータ
−を含有する2、3kbの断片を、Xba■−3stI
断片としてプラスミドpSW22から単離した。TPI
Iプロモーター断片およびBAR1−物質P−工t±上
ターミネーター断片を、3部分連結合で、Hindl[
Iおよび5stIで線状化されたpUc18と連結した
。得られるプラスミドをpsws+と表示した。
Iプロモーターと置換して、プラスミドpsW81を造
成した(第5図)。ニーP−1−3プロモーターを9o
obpのH4ndIII−Xba I断片として準備し
た。BAR1−物質P融合およびTPT上ターミネータ
−を含有する2、3kbの断片を、Xba■−3stI
断片としてプラスミドpSW22から単離した。TPI
Iプロモーター断片およびBAR1−物質P−工t±上
ターミネーター断片を、3部分連結合で、Hindl[
Iおよび5stIで線状化されたpUc18と連結した
。得られるプラスミドをpsws+と表示した。
1−ys−Arg切断部位をコードする合成オリゴヌク
レオヂドアダプターを使用して、BAR]およびM+−
3の間の融合を実施した。オリゴヌクレオチドZ C7
94(5’−CAT CCT TGG ATA Aへ^
G3゛)およびZ C795(5’−AAT CTT
TTA TCC八八へへ3’)をキナーゼ処理し、そし
てアニーリングして、B a m I−11およびI−
1i n f I粘着末端およびLyS−△rg切断部
位をコードする配列を含んで成るアダプターを生成した
。プラスミドpC,LY23(実施例3)をEcoRI
およびXba Iで切断して、修飾されたMFα1pr
e−proおよびM I −3配列を含有する0、51
5kbの断片を生成した。次いで、この断片をHinf
lで消化して、1801+pのMl−3断片を遊離せし
めた。前述のプラスミドpsW22をEc o RIお
よびBglIIで切断して240bpのBAR1断片を
分離した。この断片を、EcoRIおよびXba Iで
線状化したPUC18との4部分連結において、180
bpのM13断片およびZ C794/ Z C795
アダプターと連結した。得られるプラスミl’ (p
S W123 と表示する)(第5図)、をEcoRI
およびXba Tで切断して、3.2kbのBARI−
Ml−3断片を単−離した。プラスミドPSW81をI
−T i n d IIIおよびEcoRIで切断して
、1.1 kbのエヱ」−1プロモータJ−引B」−断
片を単離した。エヂ」1−クーミネーターを0.76k
bのXbaI−BamH1断片として準備した。1.1
kbのTP I 1−BAR1断片、3.2kbのBA
PI−Ml−3断片およびTPIIターミネータ−を、
II i n d IIIおよびB a m H1で線
状化したpuc18との4部分連結において連結した。
レオヂドアダプターを使用して、BAR]およびM+−
3の間の融合を実施した。オリゴヌクレオチドZ C7
94(5’−CAT CCT TGG ATA Aへ^
G3゛)およびZ C795(5’−AAT CTT
TTA TCC八八へへ3’)をキナーゼ処理し、そし
てアニーリングして、B a m I−11およびI−
1i n f I粘着末端およびLyS−△rg切断部
位をコードする配列を含んで成るアダプターを生成した
。プラスミドpC,LY23(実施例3)をEcoRI
およびXba Iで切断して、修飾されたMFα1pr
e−proおよびM I −3配列を含有する0、51
5kbの断片を生成した。次いで、この断片をHinf
lで消化して、1801+pのMl−3断片を遊離せし
めた。前述のプラスミドpsW22をEc o RIお
よびBglIIで切断して240bpのBAR1断片を
分離した。この断片を、EcoRIおよびXba Iで
線状化したPUC18との4部分連結において、180
bpのM13断片およびZ C794/ Z C795
アダプターと連結した。得られるプラスミl’ (p
S W123 と表示する)(第5図)、をEcoRI
およびXba Tで切断して、3.2kbのBARI−
Ml−3断片を単−離した。プラスミドPSW81をI
−T i n d IIIおよびEcoRIで切断して
、1.1 kbのエヱ」−1プロモータJ−引B」−断
片を単離した。エヂ」1−クーミネーターを0.76k
bのXbaI−BamH1断片として準備した。1.1
kbのTP I 1−BAR1断片、3.2kbのBA
PI−Ml−3断片およびTPIIターミネータ−を、
II i n d IIIおよびB a m H1で線
状化したpuc18との4部分連結において連結した。
得られるプラスミド(psW127と表示する)は工上
上上プロモーター、アミノ酸1−115をコードするB
AR1配列、Lys−Arg切断部位をコードする配列
、Ml−3コ一ド配列およびTPIIターミネータ−を
含有する。
上上プロモーター、アミノ酸1−115をコードするB
AR1配列、Lys−Arg切断部位をコードする配列
、Ml−3コ一ド配列およびTPIIターミネータ−を
含有する。
psW127中に存在するBAR1コード領域を、BA
R1遺伝子からのアミノ酸251−526のためのコー
ド領域と置換することによって、プラスミドpsW15
1を造成した。プラスミドpsW127をXhorTお
よびEcoRIで消化して、TPIIターミネータ−と
連結されたMl−3に融合したZ C794/ Z C
795合成アダプターを含んで成る965bpの断片を
単離した。psW81を5ailおよびBamHlで消
化して、BARIのC−末端275アミノ酸をコードす
る821bp断片を単離した。
R1遺伝子からのアミノ酸251−526のためのコー
ド領域と置換することによって、プラスミドpsW15
1を造成した。プラスミドpsW127をXhorTお
よびEcoRIで消化して、TPIIターミネータ−と
連結されたMl−3に融合したZ C794/ Z C
795合成アダプターを含んで成る965bpの断片を
単離した。psW81を5ailおよびBamHlで消
化して、BARIのC−末端275アミノ酸をコードす
る821bp断片を単離した。
SmalおよびEcoRIで線状化したプラスミドp
I Cl8H(Marshら、前掲)を、965bpお
よび821bpの断片と3部分連結において連結した。
I Cl8H(Marshら、前掲)を、965bpお
よび821bpの断片と3部分連結において連結した。
酵母ベクターY E P 13中MI−3配列に融合し
たjJp 1のコドン1−526を含んで成るプラスミ
ドpsW167を次のようにして造成した。プラスミド
psW81は、pSW151中に存在するBAR1配列
に結合したときにBAR1のためのコード配列を完成す
るために必要なTPIIプロモーターおよび+3A−R
1配列を提供した。psW81をHi n d mおよ
び5ailで消化して、1.67kbのTPjj−プロ
モーター−BAR1断片を単離した。
たjJp 1のコドン1−526を含んで成るプラスミ
ドpsW167を次のようにして造成した。プラスミド
psW81は、pSW151中に存在するBAR1配列
に結合したときにBAR1のためのコード配列を完成す
るために必要なTPIIプロモーターおよび+3A−R
1配列を提供した。psW81をHi n d mおよ
び5ailで消化して、1.67kbのTPjj−プロ
モーター−BAR1断片を単離した。
psW151をSma IおよびBglllで切断して
、BAR1−M I−3融合物およびTr’l土ターミ
ネータ−を含んで成る1、61kbの断片を単離した。
、BAR1−M I−3融合物およびTr’l土ターミ
ネータ−を含んで成る1、61kbの断片を単離した。
この断片を、1.67kbのTPTIプロモーターおよ
びY E p 13 (Broachら、 Gene
8電12]−133,1979)(これはHi n
I[IおよびBamHlで線状化されている)と連結し
た。得られるプラスミドをpsW167と表示する(第
6図)。プラスミドpSW167はATCCにE、コリ
HBIOIの形質転換体として受託番号67523号
として寄託されている。
びY E p 13 (Broachら、 Gene
8電12]−133,1979)(これはHi n
I[IおよびBamHlで線状化されている)と連結し
た。得られるプラスミドをpsW167と表示する(第
6図)。プラスミドpSW167はATCCにE、コリ
HBIOIの形質転換体として受託番号67523号
として寄託されている。
5: ヘク − 5W200の″′
BAR1シグナル配列、旦人ユ上第三ドメイン配列及び
Ml−3コ一ド配列を含有する造成物を、まずベクター
p T C19H(マージ:r−(Marsh )等、
前掲〕中に組み立て、その後、酵II]ベクターYEp
13(第6図)中にクローニングした。プラスミドps
W81(実施例4)をEcoRIで線状化した。Eco
RT粘着末端をDNAポリメラーゼI(クレノー断片)
で処理してフィルインした。次に、得られた平滑末端断
片をBgLIIで切断して、工」j−」−プロモーター
及びBAR1シグナル配列を含有する1、1kb断片を
単離した。プラスミドpsWI51(実施例3)をEc
oRV及びC1alで切断して、403bp B A
R1の第三ドメイン配列、M I−3コ一ド配列及びT
P■1ターミネータ−を含有する1、37kb断片を単
離した。この断片を、BglllおよびC1aで消化し
て線状化したplC19IIとの3部分連結においてP
SW81由来の1.1kb断片に連結した。得られたプ
ラスミド(])SW195と命名)をBglII及びS
ma Iで消化して2.4kbの発現単位を単離後、B
amHT及びPvuUで消化して線状化したY E P
13に連結した。得られたプラスミドをp S W2
O0と命名した。このプラスミドp S W2O0を、
アメリカンタイプ 力Jレチ−1−−コレクション(八
mericanType Cu1Lure Co11e
ction)に大腸菌HBIOI形質転換株(寄託第6
7524号)として寄託した。
Ml−3コ一ド配列を含有する造成物を、まずベクター
p T C19H(マージ:r−(Marsh )等、
前掲〕中に組み立て、その後、酵II]ベクターYEp
13(第6図)中にクローニングした。プラスミドps
W81(実施例4)をEcoRIで線状化した。Eco
RT粘着末端をDNAポリメラーゼI(クレノー断片)
で処理してフィルインした。次に、得られた平滑末端断
片をBgLIIで切断して、工」j−」−プロモーター
及びBAR1シグナル配列を含有する1、1kb断片を
単離した。プラスミドpsWI51(実施例3)をEc
oRV及びC1alで切断して、403bp B A
R1の第三ドメイン配列、M I−3コ一ド配列及びT
P■1ターミネータ−を含有する1、37kb断片を単
離した。この断片を、BglllおよびC1aで消化し
て線状化したplC19IIとの3部分連結においてP
SW81由来の1.1kb断片に連結した。得られたプ
ラスミド(])SW195と命名)をBglII及びS
ma Iで消化して2.4kbの発現単位を単離後、B
amHT及びPvuUで消化して線状化したY E P
13に連結した。得られたプラスミドをp S W2
O0と命名した。このプラスミドp S W2O0を、
アメリカンタイプ 力Jレチ−1−−コレクション(八
mericanType Cu1Lure Co11e
ction)に大腸菌HBIOI形質転換株(寄託第6
7524号)として寄託した。
6:ベクター S W2O7の
psW167に含有される発現単位も、選択マカーとし
てS、ボンベ(S、pombe) P OT 1遺伝子
を用いるベクターに挿入し、宿主細胞におりるエエ上上
欠損を補足した。POTI遺伝子は酵母宿主細胞株にお
ける↓■土工欠損の補mレベルが低い。
てS、ボンベ(S、pombe) P OT 1遺伝子
を用いるベクターに挿入し、宿主細胞におりるエエ上上
欠損を補足した。POTI遺伝子は酵母宿主細胞株にお
ける↓■土工欠損の補mレベルが低い。
この低レベル補償により、発現ベクターのコピー数の増
加を補償する。このベクターは、ベクターpcPOT(
アメリカン タイプ 力ルヂャーコレクションに大腸菌
株HBIOI形質転換体(寄託第39685号)として
寄託)〕由来のものであった。第7図に示したように、
ベクターpcpoTを、2ミクロン及びpBR322配
列を含有する750bp Sp h T−BamHI断
片をpBR322テトラサイクリン耐性遺伝子由来の1
86bp S p h T−BamHI断片で置換する
ことにより変異させてプラスミドpDPOTを造成した
。プラスミドpDPOTを変性して5phl部位を破壊
し、Not1部位への5゛にBamH1部位を配置した
。オリゴヌクレオチドZC994(5”−GAT CC
G CGGCCG CACATG−3’)及びZC99
5(5’−TGCGGCCGCC3゛)をキナーゼ処理
及びアニーリングして5゛5phlコンパチブル末端、
Not1部位及び3゜BamHT粘着末端を有するアダ
プターを形成した。プラスミドpDPOTを、5phr
及びBamHIで消化することにより線状化した。線状
化したp D P OTを、Z C994/Z C99
5アダプターに連結してプラスミドpsW197(第7
図)を形成した。
加を補償する。このベクターは、ベクターpcPOT(
アメリカン タイプ 力ルヂャーコレクションに大腸菌
株HBIOI形質転換体(寄託第39685号)として
寄託)〕由来のものであった。第7図に示したように、
ベクターpcpoTを、2ミクロン及びpBR322配
列を含有する750bp Sp h T−BamHI断
片をpBR322テトラサイクリン耐性遺伝子由来の1
86bp S p h T−BamHI断片で置換する
ことにより変異させてプラスミドpDPOTを造成した
。プラスミドpDPOTを変性して5phl部位を破壊
し、Not1部位への5゛にBamH1部位を配置した
。オリゴヌクレオチドZC994(5”−GAT CC
G CGGCCG CACATG−3’)及びZC99
5(5’−TGCGGCCGCC3゛)をキナーゼ処理
及びアニーリングして5゛5phlコンパチブル末端、
Not1部位及び3゜BamHT粘着末端を有するアダ
プターを形成した。プラスミドpDPOTを、5phr
及びBamHIで消化することにより線状化した。線状
化したp D P OTを、Z C994/Z C99
5アダプターに連結してプラスミドpsW197(第7
図)を形成した。
TP11プロモーターをプラスミドpsW197に挿入
してpsW207を造成した。プラスミドpZV134
(実施例2)をBgllI及びEcoRIで消化して0
.9kbプロモ一ター断片を単離した。
してpsW207を造成した。プラスミドpZV134
(実施例2)をBgllI及びEcoRIで消化して0
.9kbプロモ一ター断片を単離した。
TPjj−プロモーター断片及び上記したZC994/
ZC995アダプターを、5phl及びEcoRIで消
化して線状化したpUclBに3部分連結により連結し
た。得られたプラスミドpsW198をNotl及びB
amHIで消化して0.9kbTPI−しプロモーター
断片を単離した。この断片を、NoLI及びBamHI
で消化して線状化したpsWI97に連結した。得られ
たプラスミドをプラスミドpsW207(第7図)と命
名した。
ZC995アダプターを、5phl及びEcoRIで消
化して線状化したpUclBに3部分連結により連結し
た。得られたプラスミドpsW198をNotl及びB
amHIで消化して0.9kbTPI−しプロモーター
断片を単離した。この断片を、NoLI及びBamHI
で消化して線状化したpsWI97に連結した。得られ
たプラスミドをプラスミドpsW207(第7図)と命
名した。
7: ベクター S W210の
MT−31−ド配列に融合したバリア(Ilarrie
r)の最初の526個のアミノ酸をコードしている配列
を含有している発現ベクターを第8図及び第9図に示す
ようにして造成した。
r)の最初の526個のアミノ酸をコードしている配列
を含有している発現ベクターを第8図及び第9図に示す
ようにして造成した。
操作を容易にするために、Z C794/ Z C79
5アダプター、Ml−3コ一ド配列及びエエ」」−ター
ミネータ−を含有している断片をPTC19H中でサブ
クローニングした。プラスミドpsW127(実施例4
)をEcoRTで消化して、R人λ上の3゛部分、Z
C794/Z C7957ダブター、MT−3=r−ド
配列及びTPrlターミネータ−を含有している1、
2 kb断片を単離した。この1.2kbltyr片を
xhoUで消化して、Z C794/ Z C795ア
ダプタ、MI−3コ一ド配列及びTPIIターミネータ
−を含有している0、96kb断片を単離した。この断
片を、BamHI及びEc oRIで消化して線状化し
たPIC19Hに連結した。得られたプラスミドをps
W150(第9図に図示)と命名した。
5アダプター、Ml−3コ一ド配列及びエエ」」−ター
ミネータ−を含有している断片をPTC19H中でサブ
クローニングした。プラスミドpsW127(実施例4
)をEcoRTで消化して、R人λ上の3゛部分、Z
C794/Z C7957ダブター、MT−3=r−ド
配列及びTPrlターミネータ−を含有している1、
2 kb断片を単離した。この1.2kbltyr片を
xhoUで消化して、Z C794/ Z C795ア
ダプタ、MI−3コ一ド配列及びTPIIターミネータ
−を含有している0、96kb断片を単離した。この断
片を、BamHI及びEc oRIで消化して線状化し
たPIC19Hに連結した。得られたプラスミドをps
W150(第9図に図示)と命名した。
TPIIプロモーター断片をプラスミドpSW84から
得た。プラスミドpSW84はTPTIプロモーター、
物質Pの配列に融合した突然変異させたJ−へPI遺伝
子及び工J5し1ターミネータ−を含有おり、ごのプラ
スミドpSW84を第8図に示すようにして造成した。
得た。プラスミドpSW84はTPTIプロモーター、
物質Pの配列に融合した突然変異させたJ−へPI遺伝
子及び工J5し1ターミネータ−を含有おり、ごのプラ
スミドpSW84を第8図に示すようにして造成した。
ADH1プロモーター及びプラスミドpSW22(実施
例4)由来のBAR上の最初の119bpを含有してい
る0、54kb S p hl−E c o RI断
片を、5phl及びEcoRIで消化して線状化したM
13m p 1Bに連結した。得られたファージ(pS
W54と命名)を、突然変異誘発用のオリゴヌクレオチ
ドZ C634(5’−ATT ACTGCT CCT
ACA AACGAT−3’)を用いて試験管内突然
変異誘発(シラー及びスミス、前掲)させた。この突然
変異により、位置25のロイシンのコドンをプロリンの
コドンに変更して、シグナルペプチト開裂部位突然変異
体を生成した。陽性クローンの配列決定を行い突然変異
を確認し、そのうちの一つの陽性クローンをm Z C
634−7と命名した。
例4)由来のBAR上の最初の119bpを含有してい
る0、54kb S p hl−E c o RI断
片を、5phl及びEcoRIで消化して線状化したM
13m p 1Bに連結した。得られたファージ(pS
W54と命名)を、突然変異誘発用のオリゴヌクレオチ
ドZ C634(5’−ATT ACTGCT CCT
ACA AACGAT−3’)を用いて試験管内突然
変異誘発(シラー及びスミス、前掲)させた。この突然
変異により、位置25のロイシンのコドンをプロリンの
コドンに変更して、シグナルペプチト開裂部位突然変異
体を生成した。陽性クローンの配列決定を行い突然変異
を確認し、そのうちの一つの陽性クローンをm Z C
634−7と命名した。
m Z CG34−1の複製型DNAを5phl及びE
coRIで消化して0.54kb断片を単離した。この
断片を、5phl及びEcoRIで消化して線状化した
pUc18に連結した。得られたプラスミドpSW66
をHindllI及びxbalで消化して、ADH1プ
ロモ一ター断片を除去した。突然変賃させたBAR1断
片を含有している2、8kb断片及びpUc18を、−
工」こ↓」−プロモーターを含有しているプラスミドp
ZV134(実施例2)からのI(1ndllr−xb
al断片に連結した。得られたプラスミドをPSW82
と命名した。プラスミドpsW82をHindI[l及
びEcoRIで消化して、TP上土プロモーター及び突
然変異させたBAR1断片を含有している1、02kb
断片を単離した。プラスミドPSW22をEcoRIで
部分消化し、そして5stIで完全に消化して、物質P
の配列に融合したBARI遺伝子のC−末端部分及び工
り土工ターミネータ−を含有している2、16kb断片
を単離した。これらの2つの断片を、II i n d
m及び5stIで消化して線状化したpUC18に3
部分連結で連結した。得られたプラスミドpSW84は
、TPIIプロモーター、突然変異させたBARi−遺
伝子及びTPIIターミネータ−を含有している。
coRIで消化して0.54kb断片を単離した。この
断片を、5phl及びEcoRIで消化して線状化した
pUc18に連結した。得られたプラスミドpSW66
をHindllI及びxbalで消化して、ADH1プ
ロモ一ター断片を除去した。突然変賃させたBAR1断
片を含有している2、8kb断片及びpUc18を、−
工」こ↓」−プロモーターを含有しているプラスミドp
ZV134(実施例2)からのI(1ndllr−xb
al断片に連結した。得られたプラスミドをPSW82
と命名した。プラスミドpsW82をHindI[l及
びEcoRIで消化して、TP上土プロモーター及び突
然変異させたBAR1断片を含有している1、02kb
断片を単離した。プラスミドPSW22をEcoRIで
部分消化し、そして5stIで完全に消化して、物質P
の配列に融合したBARI遺伝子のC−末端部分及び工
り土工ターミネータ−を含有している2、16kb断片
を単離した。これらの2つの断片を、II i n d
m及び5stIで消化して線状化したpUC18に3
部分連結で連結した。得られたプラスミドpSW84は
、TPIIプロモーター、突然変異させたBARi−遺
伝子及びTPIIターミネータ−を含有している。
操作を容易にするために、pSW84からのTP」J−
プロモーター−BAR1断片を、ベクターp I C1
9R(マーシュ等、前掲)中でpsW150のMl−3
−TPIIターミネータ−断片に連結した。第9図に示
すように、プロモーターpSW150を、Acclで消
化して線状化し、粘着末端をDNAポリメラーゼI (
クレノー断片)で平滑化した。平滑化した断片を、次に
、BglI[で切断して、Z C994/Z C995
アダプター、Mr−3コ一ド配列及びTPIlターミネ
ータ−を含有している0、97kb断片を単乱し。プラ
スミドpSW84をE r、 o RIで消化し、粘着
末端をDNAポリメラーゼI (クレノー断片)で平滑
化した。次に、平滑化した断片をHindl[[で切断
して、1.02kbTPIIプロモーター−BAR1断
片を単離した。
プロモーター−BAR1断片を、ベクターp I C1
9R(マーシュ等、前掲)中でpsW150のMl−3
−TPIIターミネータ−断片に連結した。第9図に示
すように、プロモーターpSW150を、Acclで消
化して線状化し、粘着末端をDNAポリメラーゼI (
クレノー断片)で平滑化した。平滑化した断片を、次に
、BglI[で切断して、Z C994/Z C995
アダプター、Mr−3コ一ド配列及びTPIlターミネ
ータ−を含有している0、97kb断片を単乱し。プラ
スミドpSW84をE r、 o RIで消化し、粘着
末端をDNAポリメラーゼI (クレノー断片)で平滑
化した。次に、平滑化した断片をHindl[[で切断
して、1.02kbTPIIプロモーター−BAR1断
片を単離した。
psW150からの0.97kb断片及びpsW84か
らの1.02kb断片を、I−1jn d DI及びB
glI[で消化して線状化したp I C19Hに、3
部分連結で連結した。得られたプラスミドをp S W
2O4と命名した。
らの1.02kb断片を、I−1jn d DI及びB
glI[で消化して線状化したp I C19Hに、3
部分連結で連結した。得られたプラスミドをp S W
2O4と命名した。
psW204中の発現単位をp S W2O7(実施例
6)に挿入してプラスミドpsW212を調製した。プ
ラスミドp S W2O4を5phr及びBglIIで
切断して、1.3kb発現単位を単離した。プラスミド
p S W2O7を5phl及びB a m HIで切
断して、部分的TPIIプロモーター・ベクター断片を
単離した。これらの2つの断片をいっしょに連結して、
プラスミドpsW212(第9図)を調製した。
6)に挿入してプラスミドpsW212を調製した。プ
ラスミドp S W2O4を5phr及びBglIIで
切断して、1.3kb発現単位を単離した。プラスミド
p S W2O7を5phl及びB a m HIで切
断して、部分的TPIIプロモーター・ベクター断片を
単離した。これらの2つの断片をいっしょに連結して、
プラスミドpsW212(第9図)を調製した。
psW212中に存在するBAR1断片をpSW167
(実施例4)からのBARI断片で置換して、全長BA
RI−Ml−3融合物を造成した。プラスミドpsW2
12を5phr及びBamHIで消化して、部分的TP
TIプロモーター、ZC794/ZC795アダプター
、Ml−3コ一ド配列及びTPIIターミネータ−を含
有しているベクター断片を単離した。プラスミドpsW
I67を5phI及びBamHIで消化して、1.81
kbの部分的TPIIプロモーター及びBAR1配列を
単離した。この断片をpsW212に連結して、発現ベ
クターpsW210(第9図)を生成した。。
(実施例4)からのBARI断片で置換して、全長BA
RI−Ml−3融合物を造成した。プラスミドpsW2
12を5phr及びBamHIで消化して、部分的TP
TIプロモーター、ZC794/ZC795アダプター
、Ml−3コ一ド配列及びTPIIターミネータ−を含
有しているベクター断片を単離した。プラスミドpsW
I67を5phI及びBamHIで消化して、1.81
kbの部分的TPIIプロモーター及びBAR1配列を
単離した。この断片をpsW212に連結して、発現ベ
クターpsW210(第9図)を生成した。。
久井例−U発 ベクターpsW219の造psW200
(実施例5)中に存在している発現単位及び−T’Q−
工」−選択マーカーを含有しているプラスミドpsW2
19を以下のようにして造成した(第10図)。プラス
ミドpsWI95(実施例5)を13gIU及びC1a
で消化して、TPIIプロモーター、BAR1シグナル
配列、BAR1第三ドメインコ一ド配列及びTPTIタ
ーミネークーを含有している2、 4 kb断片を単離
した。この断片を、’BamHT −CI a I7−
線状化したpTc191−1に連結した。得られたプラ
スミドpsW217は、工凡±tクーミネーターの3“
端にB a m H1部位を有するpsW195からの
発現単位を含有していた。プラスミドp S W217
を5phT及び8g1■で消化して、部分的TPTIプ
ロモーター升込」」−シグナル及び第三ドメイン配列、
M13コード配列並びに1−既↓−しターミネータ−を
含有している1、7kb断片を単離した。プラスミドp
sW207(実施例6)を5phl及びB a m H
Tで消化して、部分−TPT ]−プロモーター・ベク
ター断片を小謡した。この断片をpsW217からの1
.7kb断片に連結して、発現ベクターp S W21
9を調製した。
(実施例5)中に存在している発現単位及び−T’Q−
工」−選択マーカーを含有しているプラスミドpsW2
19を以下のようにして造成した(第10図)。プラス
ミドpsWI95(実施例5)を13gIU及びC1a
で消化して、TPIIプロモーター、BAR1シグナル
配列、BAR1第三ドメインコ一ド配列及びTPTIタ
ーミネークーを含有している2、 4 kb断片を単離
した。この断片を、’BamHT −CI a I7−
線状化したpTc191−1に連結した。得られたプラ
スミドpsW217は、工凡±tクーミネーターの3“
端にB a m H1部位を有するpsW195からの
発現単位を含有していた。プラスミドp S W217
を5phT及び8g1■で消化して、部分的TPTIプ
ロモーター升込」」−シグナル及び第三ドメイン配列、
M13コード配列並びに1−既↓−しターミネータ−を
含有している1、7kb断片を単離した。プラスミドp
sW207(実施例6)を5phl及びB a m H
Tで消化して、部分−TPT ]−プロモーター・ベク
ター断片を小謡した。この断片をpsW217からの1
.7kb断片に連結して、発現ベクターp S W21
9を調製した。
9: ベクター ZVI87の 成
二塩基性開裂部位に代るプロセッシング部位はトロンビ
ン開裂部位である。代替発現単位を造成するために、プ
ラスミドpsWI95を、試験管内突然変異誘発により
変異してLys−Arg開裂部位をトロンビン開裂部位
で置換した。この変形により、二塩基性プロセッシング
部位に関連したコドンの代わりに、アミノ酸プロリン及
びアルギニンをコードしているコドンが生じた。BAR
1シグナル配列及び第三ドメインコード配列を含有して
いる得られたMl−3発現ベクターを、pZ■187と
命名した。
ン開裂部位である。代替発現単位を造成するために、プ
ラスミドpsWI95を、試験管内突然変異誘発により
変異してLys−Arg開裂部位をトロンビン開裂部位
で置換した。この変形により、二塩基性プロセッシング
部位に関連したコドンの代わりに、アミノ酸プロリン及
びアルギニンをコードしているコドンが生じた。BAR
1シグナル配列及び第三ドメインコード配列を含有して
いる得られたMl−3発現ベクターを、pZ■187と
命名した。
第11図に、pZV187の造成を示す。プラスミドp
sW195を5phT及び5alrで消化して、BAR
I−MT−3畿合物及びニーPj−上ターミネーターを
含有している1、7kb断片を単離した。
sW195を5phT及び5alrで消化して、BAR
I−MT−3畿合物及びニーPj−上ターミネーターを
含有している1、7kb断片を単離した。
この1υi片を、予め5phl及び5alTで完全に消
化したM13m p 18に連結した。得られたファー
ジクローンをm p 18− Z V2V5と命名した
。オリゴヌクレオチドl C1083(5’−TCCT
TG GAT CCA AG八へTCGTT−3’ )
を用いて、ウラシル法〔クンケル(Kunkel)、ブ
ロク ナトル アカドサ・イ (Proc。
化したM13m p 18に連結した。得られたファー
ジクローンをm p 18− Z V2V5と命名した
。オリゴヌクレオチドl C1083(5’−TCCT
TG GAT CCA AG八へTCGTT−3’ )
を用いて、ウラシル法〔クンケル(Kunkel)、ブ
ロク ナトル アカドサ・イ (Proc。
Natl、Acad、Sci、) 、米国、第82巻、
488〜492(1985) )により、m p’ 1
B −Z V 172を突然変異誘発させた。得られた
突然変異体の配列決定を行い突然変異誘発を確認し、陽
性クローンをZV172/1083と命名した。便宜上
、Z V 172/1083に存在する挿入物をpU0
1B中でサブクローニングした。
488〜492(1985) )により、m p’ 1
B −Z V 172を突然変異誘発させた。得られた
突然変異体の配列決定を行い突然変異誘発を確認し、陽
性クローンをZV172/1083と命名した。便宜上
、Z V 172/1083に存在する挿入物をpU0
1B中でサブクローニングした。
Z V 172/1083からの1.7kbSp h
l−5a I I挿入物を単離し、予め5phl及び5
allで完全に消化したptJc18に連結した。得ら
れたプラスミド、zV180を5allで完全に消化し
た。線状化したpZVI80をDNAポリメラーゼI(
クレノー断片)を用いて平滑化し、キナーゼ処理したB
glrlリンカ−に連結した。過剰のリンカ−を、B
B I IIで消化することにより除去した。次に、リ
ンカ−をイ」加したDNAを5allで完全に切断して
、1.7kb挿入物を単離した。部分子P11プロモー
ター、且へ几上−MI−3融合物及びTP T Iター
ミネータ−を含有する1、7kb挿入物をプラスミドp
sW207のSphl−BamH1部分子PIIプロモ
ーター−ベクター断片に連結して、pZV187を造成
した。
l−5a I I挿入物を単離し、予め5phl及び5
allで完全に消化したptJc18に連結した。得ら
れたプラスミド、zV180を5allで完全に消化し
た。線状化したpZVI80をDNAポリメラーゼI(
クレノー断片)を用いて平滑化し、キナーゼ処理したB
glrlリンカ−に連結した。過剰のリンカ−を、B
B I IIで消化することにより除去した。次に、リ
ンカ−をイ」加したDNAを5allで完全に切断して
、1.7kb挿入物を単離した。部分子P11プロモー
ター、且へ几上−MI−3融合物及びTP T Iター
ミネータ−を含有する1、7kb挿入物をプラスミドp
sW207のSphl−BamH1部分子PIIプロモ
ーター−ベクター断片に連結して、pZV187を造成
した。
ベクターY E P 13中に発現単位を含有する発現
べ’)ターpsW167及びpsW200、並びニヘク
ター p S WI97中に発現単位を含有する発現ベ
クター p S W210 、T) S W219及び
pZV187により、標準法に準じて適当な酵母を形質
転換した。ナ弓丈アカロミセス・セレビシェ−(S、c
erevisiae)宿主株は、プラスミド上に存在す
る選択マーカーにより補完された突然変異を含有してい
た。
べ’)ターpsW167及びpsW200、並びニヘク
ター p S WI97中に発現単位を含有する発現ベ
クター p S W210 、T) S W219及び
pZV187により、標準法に準じて適当な酵母を形質
転換した。ナ弓丈アカロミセス・セレビシェ−(S、c
erevisiae)宿主株は、プラスミド上に存在す
る選択マーカーにより補完された突然変異を含有してい
た。
Y E p 13中でMl−3のコード配列に融合した
BAR1のコード領域の最初の526個のアミノ酸をコ
ードしている配列を含有しているプラスミドpsW16
7、並びにY E p 13中でBARIシグナルペプ
チド及びMl−3のコード配列に融合したB/l 1第
三ドメインをコードしている配列を包含しているプラス
ミドp S W2O0により、S、セレ転換した。ロイ
シンを含まない合成増殖培地で増殖できる形質転換体を
選択した。
BAR1のコード領域の最初の526個のアミノ酸をコ
ードしている配列を含有しているプラスミドpsW16
7、並びにY E p 13中でBARIシグナルペプ
チド及びMl−3のコード配列に融合したB/l 1第
三ドメインをコードしている配列を包含しているプラス
ミドp S W2O0により、S、セレ転換した。ロイ
シンを含まない合成増殖培地で増殖できる形質転換体を
選択した。
形質転換体を、5 mlの−LeuD(ライツカ−ハム
(Wickerham) 、エル ジェイ、ジェイ ハ
クト(J、Bact、 L、第52巻、293〜301
(1946) i窒素源としてデイフコ イースト ナ
イトロジェンヘース(Dfco Yeast Nitr
ogen Ba5e”)を含有〕中で一晩30゛Cで増
殖さゼた。形質転換を、20又は50m2のL e u
Dで1. : 100に希釈して、24又は48時間
、30゛Cで増殖させた。細胞をペレット化して洗浄後
、−70°Cで凍結した。スペント培地を2回回転させ
、細胞物から傾斜して除去後、70°Cで凍結した。放
射線免疫検定法0?I^;実施例14参照)により測定
したMI−3レベルにより、54時間で、psW1G?
形質転換体が38pg/mlのMl−3免疫反応性物質
を生成し、psW200形質転換体が113pg/mf
f1のMI−3免疫反応性物質を生成したことが分かっ
た。
(Wickerham) 、エル ジェイ、ジェイ ハ
クト(J、Bact、 L、第52巻、293〜301
(1946) i窒素源としてデイフコ イースト ナ
イトロジェンヘース(Dfco Yeast Nitr
ogen Ba5e”)を含有〕中で一晩30゛Cで増
殖さゼた。形質転換を、20又は50m2のL e u
Dで1. : 100に希釈して、24又は48時間
、30゛Cで増殖させた。細胞をペレット化して洗浄後
、−70°Cで凍結した。スペント培地を2回回転させ
、細胞物から傾斜して除去後、70°Cで凍結した。放
射線免疫検定法0?I^;実施例14参照)により測定
したMI−3レベルにより、54時間で、psW1G?
形質転換体が38pg/mlのMl−3免疫反応性物質
を生成し、psW200形質転換体が113pg/mf
f1のMI−3免疫反応性物質を生成したことが分かっ
た。
psW197巾でMI−3のコード配列に融合したBA
RIの最初の526個のアミノ酸をコート′シている配
列を含有しているプラスミドp S W210、並びに
psW197中でBAR1シグナルペプチド及びMI−
3のコード配列に融合したーBAP I第三ドメインを
コードしている配列を含有しているプラスミドpsW2
19により、S、セレビシェ−(S、cerevisi
ae)株GA18 1 C(MATa I eu 2
−3 1 e u 2−112 lL引J−1上」j
:: LEU2)及び2M114(MATa Ie
u2−旦)を形質転換した。グルコースの存在下での増
殖能力について形質転換を選択した。
RIの最初の526個のアミノ酸をコート′シている配
列を含有しているプラスミドp S W210、並びに
psW197中でBAR1シグナルペプチド及びMI−
3のコード配列に融合したーBAP I第三ドメインを
コードしている配列を含有しているプラスミドpsW2
19により、S、セレビシェ−(S、cerevisi
ae)株GA18 1 C(MATa I eu 2
−3 1 e u 2−112 lL引J−1上」j
:: LEU2)及び2M114(MATa Ie
u2−旦)を形質転換した。グルコースの存在下での増
殖能力について形質転換を選択した。
プラスミドpsW210及びpsW219で形質転換し
たGAlB−I C株からのMl−3の発現及び分泌シ
J゛、まず形質転換体を一晩30℃で、5 mlのME
DI (バク1−イースト エクストラクト(Bac
Lo Yeast Extract) 2%、硫酸アン
モニウム0.5%、グルコース6%〕中で増殖させるこ
とにより行われた。形質転換体を20m1又は50m!
のMED lで1:100に希釈して、24時間又は4
8時間、30°Cで増殖させた。細胞をペレット化して
洗浄後、−70”Cで凍結した。スペント培地を2回回
転させ、細胞材料から傾斜して除去後、70°Cで凍結
した。R,IAにより測定したM13レベルにより、2
4時間で、p S W210形質転換体が0.3μg
/ mllのM、I−3免疫反応性物質を生成し、p
S W219形質転換体が0.15xr/mlのMl−
3免疫反応性物質を生成したことが分かった。
たGAlB−I C株からのMl−3の発現及び分泌シ
J゛、まず形質転換体を一晩30℃で、5 mlのME
DI (バク1−イースト エクストラクト(Bac
Lo Yeast Extract) 2%、硫酸アン
モニウム0.5%、グルコース6%〕中で増殖させるこ
とにより行われた。形質転換体を20m1又は50m!
のMED lで1:100に希釈して、24時間又は4
8時間、30°Cで増殖させた。細胞をペレット化して
洗浄後、−70”Cで凍結した。スペント培地を2回回
転させ、細胞材料から傾斜して除去後、70°Cで凍結
した。R,IAにより測定したM13レベルにより、2
4時間で、p S W210形質転換体が0.3μg
/ mllのM、I−3免疫反応性物質を生成し、p
S W219形質転換体が0.15xr/mlのMl−
3免疫反応性物質を生成したことが分かった。
2M114株のpsW219形質転換体からのMl−3
の発現及び分泌レベルも、高圧液体クロマトグラフィー
(++PLc)アッセイにより測定した。形質転換体を
、−晩30゛Cで5 mlの補足YEPD (YEPD
+40mg/4 Ade −ト80mg/
P、 L Cu −t−10mMcac1g
(グルコース濃度を6%に調整)〕中で増殖させた。−
晩培養した培養物を、補足YIEr’D50In1でi
:tooに希釈し、30℃で成長させた。試料4 ml
を2つづつ、30時間、48時間及び75時間に採取し
た。試料を遠心分離して上澄みを保存した。上澄みの0
.5 mllのアリコントを、醗酵液(552gの96
%EtOI+ + 349 gのIIzO+ 5 ml
の濃+12s04)0、5 rtrl、と混合し、室温
で30分間インキユヘートした。次に、混合物を0.2
tsnアクロディスクス(Acrodiscs) (
ミシガン州アン アーバーにあるゲルマンサイエンス社
)を通して濾過後、−20℃で凍結した。HPLCアッ
セイ(実施例14B)で測定したMI−3レベルにより
、pSW2]9形質転換体が75時間で14n/ml−
のMl−3を生成したことが分かった。
の発現及び分泌レベルも、高圧液体クロマトグラフィー
(++PLc)アッセイにより測定した。形質転換体を
、−晩30゛Cで5 mlの補足YEPD (YEPD
+40mg/4 Ade −ト80mg/
P、 L Cu −t−10mMcac1g
(グルコース濃度を6%に調整)〕中で増殖させた。−
晩培養した培養物を、補足YIEr’D50In1でi
:tooに希釈し、30℃で成長させた。試料4 ml
を2つづつ、30時間、48時間及び75時間に採取し
た。試料を遠心分離して上澄みを保存した。上澄みの0
.5 mllのアリコントを、醗酵液(552gの96
%EtOI+ + 349 gのIIzO+ 5 ml
の濃+12s04)0、5 rtrl、と混合し、室温
で30分間インキユヘートした。次に、混合物を0.2
tsnアクロディスクス(Acrodiscs) (
ミシガン州アン アーバーにあるゲルマンサイエンス社
)を通して濾過後、−20℃で凍結した。HPLCアッ
セイ(実施例14B)で測定したMI−3レベルにより
、pSW2]9形質転換体が75時間で14n/ml−
のMl−3を生成したことが分かった。
BAR1第三ドメインとM I−3コ一ド配列の間にト
ロンビン開裂部位を含有するプラスミドpZ、V187
で、S、セレビシェ−株GA1B−IC及び2M114
を形質転換した。グルコースの存在下の増殖能力につい
て形質転換体を選択した。形質転換体を一晩5mQのY
E P +6%グルコース(1%バク1 イースト
エクストラフI〜、2%バクト イースト ペプトン、
及びオートクレーピング後に6%デキストロース添加)
中で成長させた。
ロンビン開裂部位を含有するプラスミドpZ、V187
で、S、セレビシェ−株GA1B−IC及び2M114
を形質転換した。グルコースの存在下の増殖能力につい
て形質転換体を選択した。形質転換体を一晩5mQのY
E P +6%グルコース(1%バク1 イースト
エクストラフI〜、2%バクト イースト ペプトン、
及びオートクレーピング後に6%デキストロース添加)
中で成長させた。
−晩培養した培養物を、YEP+6%グルコース10m
1で1:100に希釈し、30°Cで増殖させた。
1で1:100に希釈し、30°Cで増殖させた。
試料を、26時間及び48時間に採取した。試料を遠心
分離して細胞をペレット化し、上澄み液を傾しゃ後−7
0°Cで凍結した。MI−3レベルを放射線免疫検定法
により測定した。その結果、48時間で、GAI8−I
C形質転換体が0.9ng/mlのM +−3免疫反
応物質を生成し、一方、ZM114形質転換体が、0.
52ng/mlのMl−3免疫反応性物質を生成したこ
とが分かった。
分離して細胞をペレット化し、上澄み液を傾しゃ後−7
0°Cで凍結した。MI−3レベルを放射線免疫検定法
により測定した。その結果、48時間で、GAI8−I
C形質転換体が0.9ng/mlのM +−3免疫反
応物質を生成し、一方、ZM114形質転換体が、0.
52ng/mlのMl−3免疫反応性物質を生成したこ
とが分かった。
実」51列−!〜」」υター S W290 び
SW邪り久童國 一■」」−プロモーター、BAR]−シグナル配列、位
置#7にグリコジル化部位突然変異を有する旦AJ?]
第ニドメイン配列、Ml−3コ一ド配列、TPIIター
ミネータ−及びprlPOTベクター配列を含有する造
成物をp 7. C891から次のようにして造成した
。TPTIプロモーターの一部分、BAR1シグナル配
列及びB A R上第三ドメインを含有するpsW]9
5(実施例5)のS p h I −BamHI断片を
、sph+及びB a m HIで消化して線状化した
MI3m p 18中でクローニングした。得られた造
成物から製造した一木鎖鋳型DNAを、シラー及びスミ
ス(前掲、1983年)により記載されている方法と実
質的に同様にして、ZC891(5’−AGT CGA
TGCTCT ACG−3’)を用いで、試験管内突
然変異誘発さ・已た。ZCB9Jを用いた突然変異誘発
により、旦込TJ−第三トツインの位置#7にAsn−
+GIn突然変異を生成した。プラークハイブリダイゼ
ーションで同定し、ジデオキシシーフェンシング番こよ
り確認した陽性り1,1−ンを、pZC891と命名し
た。
SW邪り久童國 一■」」−プロモーター、BAR]−シグナル配列、位
置#7にグリコジル化部位突然変異を有する旦AJ?]
第ニドメイン配列、Ml−3コ一ド配列、TPIIター
ミネータ−及びprlPOTベクター配列を含有する造
成物をp 7. C891から次のようにして造成した
。TPTIプロモーターの一部分、BAR1シグナル配
列及びB A R上第三ドメインを含有するpsW]9
5(実施例5)のS p h I −BamHI断片を
、sph+及びB a m HIで消化して線状化した
MI3m p 18中でクローニングした。得られた造
成物から製造した一木鎖鋳型DNAを、シラー及びスミ
ス(前掲、1983年)により記載されている方法と実
質的に同様にして、ZC891(5’−AGT CGA
TGCTCT ACG−3’)を用いで、試験管内突
然変異誘発さ・已た。ZCB9Jを用いた突然変異誘発
により、旦込TJ−第三トツインの位置#7にAsn−
+GIn突然変異を生成した。プラークハイブリダイゼ
ーションで同定し、ジデオキシシーフェンシング番こよ
り確認した陽性り1,1−ンを、pZC891と命名し
た。
複製型pZC891DNAを調製し、5phr及びBa
mHIで消化して、TPTI−プロモーターの一部分、
BAI?1シグナル配列、及びグリコシル化部位#7に
ZC891突然変異を含有する凡人R1第ニドメインを
含んで成る0、73kb断片を単離した。プラスミドp
sW210(実施例7)を5phI及びB ;] m
HTで消化して、エヱ士上プロモーターの5゛側0.7
kb、MT=3コード配列、工t11ターミネータ−及
びPDPOTベクター配列を含有する12.3kb断片
を単離した。psW210断片を、リガーゼ処理により
p Z C891に連結してシラスミl′p S W2
90を生成した。
mHIで消化して、TPTI−プロモーターの一部分、
BAI?1シグナル配列、及びグリコシル化部位#7に
ZC891突然変異を含有する凡人R1第ニドメインを
含んで成る0、73kb断片を単離した。プラスミドp
sW210(実施例7)を5phI及びB ;] m
HTで消化して、エヱ士上プロモーターの5゛側0.7
kb、MT=3コード配列、工t11ターミネータ−及
びPDPOTベクター配列を含有する12.3kb断片
を単離した。psW210断片を、リガーゼ処理により
p Z C891に連結してシラスミl′p S W2
90を生成した。
TPTIプロモーター、BAR1シグナル配列、位置#
8にグリコジル化部位突然変異を有する1△−雁上第三
ドメイン配列、Ml−3コ一ド配列、Tr’11ターミ
ネータ−及びpDPOTベクター配列を含有する造成物
を、p S W290の造成に類似の方法により造成し
た。Z C1330(5’−AAA CCTCTC八八
G八八へへCへへへ3゛へへびソ゛ラー及びスミス(前
fLf、1983年)により記載された方法を用いて、
psW253の−・重鎖鋳型DNAについての位置特異
的試験管内突然変異誘発により、グリコジル化部位#8
にAsn−+GIn置換を生じる突然変異を生じさせた
。陽性クローンを同定し、S p h 1及びB a
m HIで消化して、7.C1330突然変異を含有す
る0、73kb断片を単離した。次に、0.73kb断
片を、プラスミドpsW210の12.3kbS p
h IBamHI断片に連結した。得られたプラスミド
をpsW281 と命名した。
8にグリコジル化部位突然変異を有する1△−雁上第三
ドメイン配列、Ml−3コ一ド配列、Tr’11ターミ
ネータ−及びpDPOTベクター配列を含有する造成物
を、p S W290の造成に類似の方法により造成し
た。Z C1330(5’−AAA CCTCTC八八
G八八へへCへへへ3゛へへびソ゛ラー及びスミス(前
fLf、1983年)により記載された方法を用いて、
psW253の−・重鎖鋳型DNAについての位置特異
的試験管内突然変異誘発により、グリコジル化部位#8
にAsn−+GIn置換を生じる突然変異を生じさせた
。陽性クローンを同定し、S p h 1及びB a
m HIで消化して、7.C1330突然変異を含有す
る0、73kb断片を単離した。次に、0.73kb断
片を、プラスミドpsW210の12.3kbS p
h IBamHI断片に連結した。得られたプラスミド
をpsW281 と命名した。
■
プラスミドpsW290からのインシュリン前駆体ML
−3の発現を、TPIIプロモーターMFα1シグナル
配列、Mr−3コ一ド配列、TPIIターミネータ−及
びpDPOTベクター配列を含んで成るベクターpDP
OT及び頚伯の造成物p lN4A、並びにTPrl−
プロモーターBAR1シグナル配列、野性型B/l j
第三ドメイン配列、Ml−3コ一ド配列、TPIIター
ミネータ−配列及びpDPOTベクター配列を含んで成
るpsW219(実施例8)と比較した。発現を増殖曲
線実験において解析した。プラスミドpSW290 、
ρDPOT、p TN4A及びpsW219により、S
、セレビシェ−株ZM114(実施例10)を標【11
1法に準じて形質転換した。YEPD+ a d e
+Icu(1%イース1− エクストラクト、2%ベプ
1−ン、2%グルコース、40mg/nアデニン、80
m1/I!ロイシン)5d中の一晩培養した前培養物を
、各形質転換体について増殖させた。前培養物をYIE
PD+a d e+ I e uでOD6..0.1に
希釈し、通気しなから30°Cで増殖させた。試料を、
接種後22時間、34.5時間、36.5時間及び57
.2時間に採取した。
−3の発現を、TPIIプロモーターMFα1シグナル
配列、Mr−3コ一ド配列、TPIIターミネータ−及
びpDPOTベクター配列を含んで成るベクターpDP
OT及び頚伯の造成物p lN4A、並びにTPrl−
プロモーターBAR1シグナル配列、野性型B/l j
第三ドメイン配列、Ml−3コ一ド配列、TPIIター
ミネータ−配列及びpDPOTベクター配列を含んで成
るpsW219(実施例8)と比較した。発現を増殖曲
線実験において解析した。プラスミドpSW290 、
ρDPOT、p TN4A及びpsW219により、S
、セレビシェ−株ZM114(実施例10)を標【11
1法に準じて形質転換した。YEPD+ a d e
+Icu(1%イース1− エクストラクト、2%ベプ
1−ン、2%グルコース、40mg/nアデニン、80
m1/I!ロイシン)5d中の一晩培養した前培養物を
、各形質転換体について増殖させた。前培養物をYIE
PD+a d e+ I e uでOD6..0.1に
希釈し、通気しなから30°Cで増殖させた。試料を、
接種後22時間、34.5時間、36.5時間及び57
.2時間に採取した。
各時間に、OD6゜。を測定し、各培養物から5m2の
試料を採取した。2M114 [5W290 )培養
物は、l3AR1第三ドメインにおいて野性型グリコジ
ル化をコードしている類似造成物psW219で見出さ
れたような増殖ラグを示さなかった(第1表)。細胞を
4°Cで遠心分離により除去し、上澄の液を保存した。
試料を採取した。2M114 [5W290 )培養
物は、l3AR1第三ドメインにおいて野性型グリコジ
ル化をコードしている類似造成物psW219で見出さ
れたような増殖ラグを示さなかった(第1表)。細胞を
4°Cで遠心分離により除去し、上澄の液を保存した。
各上澄み液の0.5 rtdlアリコン(−2つを2個
のミクロフユージ管に分配した。
のミクロフユージ管に分配した。
0.5mρの醗酵液で希釈後室塩で30分間インキュへ
一トし、エソペンドルフミクロフユージ〔ニューコーク
、ウェストバリーにあるブリンクマン社(Brinkm
ann) )で5分間4°Cで遠心分離し、0.45陣
フイルターを通して濾過して別のミクロフユジ管に入れ
て、IIPLC用0.5 rtrRアリコントを調製し
た。アッセイの前に試料を一70°Cで保存した。
一トし、エソペンドルフミクロフユージ〔ニューコーク
、ウェストバリーにあるブリンクマン社(Brinkm
ann) )で5分間4°Cで遠心分離し、0.45陣
フイルターを通して濾過して別のミクロフユジ管に入れ
て、IIPLC用0.5 rtrRアリコントを調製し
た。アッセイの前に試料を一70°Cで保存した。
実施例16Bに記載したようにして、培養物の上澄み液
の高圧液体クロマトグラフィーを行った。アッセイの結
果(第2表) 、2M114 (p 5W290)が、
2M114を形質転換した類似造成物p TN4Aより
多くのMI−3の分泌を示すことが判明した。
の高圧液体クロマトグラフィーを行った。アッセイの結
果(第2表) 、2M114 (p 5W290)が、
2M114を形質転換した類似造成物p TN4Aより
多くのMI−3の分泌を示すことが判明した。
人−一一一λ
P I−105シグナルペプチド、BAR1第三ドメイ
ン配列及びブタウロキナーゼ(uPA)cDNAを含ん
で成る発現単位を造成し、ベクターYEp13に挿入し
た。uPA cDNAは、ベクターp +3 R32
2中の2.3kb挿入物としてuPA cDNAを含
有するプラスミドpYN15[ナガミネ等、ヌク アシ
・ンズ レス(Nuc、八cids Res、)、第1
2巻、9525〜9541 (1984) )に由来す
るものであった(第12図)。cDNA配列をまず変異
して、uPAストップコドンの3′側にxbaI部位を
配置した。プラスミドpYN15をxbalで切断して
、uPAコード配列を含有する1、 9 kb断片を単
離した。この断片を、xbaTで完全に消化したpUc
13に連結した。連結混合物で大腸菌株JM83を形質
転換した。形質転換体からプラスミドDNAを調製し、
正しく配向した挿入物を有するプラスミドをp D R
2010と命名した。プラスミドp D R2010を
ApaIで消化して線状化し、粘着末端をT、DNAポ
リメラーゼで平滑化した。
ン配列及びブタウロキナーゼ(uPA)cDNAを含ん
で成る発現単位を造成し、ベクターYEp13に挿入し
た。uPA cDNAは、ベクターp +3 R32
2中の2.3kb挿入物としてuPA cDNAを含
有するプラスミドpYN15[ナガミネ等、ヌク アシ
・ンズ レス(Nuc、八cids Res、)、第1
2巻、9525〜9541 (1984) )に由来す
るものであった(第12図)。cDNA配列をまず変異
して、uPAストップコドンの3′側にxbaI部位を
配置した。プラスミドpYN15をxbalで切断して
、uPAコード配列を含有する1、 9 kb断片を単
離した。この断片を、xbaTで完全に消化したpUc
13に連結した。連結混合物で大腸菌株JM83を形質
転換した。形質転換体からプラスミドDNAを調製し、
正しく配向した挿入物を有するプラスミドをp D R
2010と命名した。プラスミドp D R2010を
ApaIで消化して線状化し、粘着末端をT、DNAポ
リメラーゼで平滑化した。
平滑化した断片をSmarで切断して585tipの3
“非コード領域を除去し後、再連結してプラスミドpD
R2011を得た。
“非コード領域を除去し後、再連結してプラスミドpD
R2011を得た。
次に、プラスミドp D R2011に存在するcDN
Aを変異させて、uPAの第一アミノ酸コドンの5′側
にBglT1部位を配置した。その後、プラスミドpD
R2011をxbal及びE c o RIで切断して
、1.35kb u P A断片を単離し、次に、xb
al及びEcoRIで完全に消化したM13rnp19
に連結した。得られたファージクローンをMI3mp1
9−2011と命名した。オリゴヌクレオチドZC55
8(5’−^GT TCA TG/l GAT
CTT TTG GAGT−3’ ) を、u
PAの最初のアミノ酸にBg111部位を生じるように
設計した。プラスミドM 13m p 19−2011
を、シラー及びスミス(1984年、前掲)の2−プラ
イマー法により、第一プライマーとしてZC558を用
い、第ニブライマーとしてZ C87(5’−TCCC
AGTCA C[;A CGT−3’)を用いて試験管
内突然変異誘発させた。キナーゼ処理したZC558へ
のハイブリダイゼーションにより同定した陽性クローン
をBglll及びEc oRTで切断して、BgllT
部位の導入を確認した。得られたファージmp19−2
011−558をxba I及び5stlで消化して、
突然変異誘発したuPA配列を含有する1、35kb断
片を単離した。この断片をxbaI及び5stlで消化
して線状化したp[Jc18に連結した。得られたプラ
スミドをp D R2012(第12図)と命名した。
Aを変異させて、uPAの第一アミノ酸コドンの5′側
にBglT1部位を配置した。その後、プラスミドpD
R2011をxbal及びE c o RIで切断して
、1.35kb u P A断片を単離し、次に、xb
al及びEcoRIで完全に消化したM13rnp19
に連結した。得られたファージクローンをMI3mp1
9−2011と命名した。オリゴヌクレオチドZC55
8(5’−^GT TCA TG/l GAT
CTT TTG GAGT−3’ ) を、u
PAの最初のアミノ酸にBg111部位を生じるように
設計した。プラスミドM 13m p 19−2011
を、シラー及びスミス(1984年、前掲)の2−プラ
イマー法により、第一プライマーとしてZC558を用
い、第ニブライマーとしてZ C87(5’−TCCC
AGTCA C[;A CGT−3’)を用いて試験管
内突然変異誘発させた。キナーゼ処理したZC558へ
のハイブリダイゼーションにより同定した陽性クローン
をBglll及びEc oRTで切断して、BgllT
部位の導入を確認した。得られたファージmp19−2
011−558をxba I及び5stlで消化して、
突然変異誘発したuPA配列を含有する1、35kb断
片を単離した。この断片をxbaI及び5stlで消化
して線状化したp[Jc18に連結した。得られたプラ
スミドをp D R2012(第12図)と命名した。
プラスミドp D R2012に存在するuPA c
DNAを変異して、ストップコドンにの3′側にXba
lを付加した。プラスミドp D R2012をEc
oRIで消化して綿状化し、粘着末端をDNAポリメラ
ーゼI (クレノー断片)で処理して平滑化した。末端
を平滑化した断片を、キナーゼ処理したXba Iリン
カ−(CTCTAGAG)に連結し、EcoRIaJM
83を形質転換した。形質転換体から単離したプラスミ
ドDNAを、Bfilll及びXba Iで消化して解
析した。陽性クローンをpZV112(第13図)と命
名した。
DNAを変異して、ストップコドンにの3′側にXba
lを付加した。プラスミドp D R2012をEc
oRIで消化して綿状化し、粘着末端をDNAポリメラ
ーゼI (クレノー断片)で処理して平滑化した。末端
を平滑化した断片を、キナーゼ処理したXba Iリン
カ−(CTCTAGAG)に連結し、EcoRIaJM
83を形質転換した。形質転換体から単離したプラスミ
ドDNAを、Bfilll及びXba Iで消化して解
析した。陽性クローンをpZV112(第13図)と命
名した。
部分的TPIIプロモーター、MFαlプレプロ配列及
びtPA cDNA(第13図)を含有するプラスミ
ドpDR1298中の組織プラスミノーゲン活性因子(
tPA)cDNA配列を、プラスミドpZV112に存
在するuPA cDNAで置換した。プラスミドp
D R1298をBglH及びxbaIで消化して、T
PIIブロモ−クー、MFα1シグナル配列及びpUc
18ヘクターを含有する3、25kb断片を単離した。
びtPA cDNA(第13図)を含有するプラスミ
ドpDR1298中の組織プラスミノーゲン活性因子(
tPA)cDNA配列を、プラスミドpZV112に存
在するuPA cDNAで置換した。プラスミドp
D R1298をBglH及びxbaIで消化して、T
PIIブロモ−クー、MFα1シグナル配列及びpUc
18ヘクターを含有する3、25kb断片を単離した。
プラスミドpZV112をBglll及びxbalで消
化して、uPAcDNAを単離した。この断片を3.2
5kb p D R1298断片と連結した。得られ
たプラスミドpZV117を5phr及びxbaTで消
化して、部分的TPII−プロモーター、肛α1シグナ
ル配列及びuPA cDNAを単離した。プラスミドp
DR1107(実施例2)を5phr及びxbalで消
化して、部分的TPIIプロモーター、TPIIクーミ
ネーター及びpUc13ベクターを含有している3、6
kb断片を単離した。次に、この断片を3.25kb
p Z V117断片に連結して、プラスミドpZV
120を得た。シラスミ)’ P Z V120をHi
ndl[l及びSma Iで消化して、発現単位を単離
した。プラスミドY E p 13を、BamHIで消
化後、DNAポリメラーゼI (クレノー断片)で末端
を平滑化した。次に、末端平滑化断片をHi ndnl
で切断して、ベクタ一部分を単離し、その後、pZV]
20の発現単位に連結してプラスミドpZ■125を得
た。
化して、uPAcDNAを単離した。この断片を3.2
5kb p D R1298断片と連結した。得られ
たプラスミドpZV117を5phr及びxbaTで消
化して、部分的TPII−プロモーター、肛α1シグナ
ル配列及びuPA cDNAを単離した。プラスミドp
DR1107(実施例2)を5phr及びxbalで消
化して、部分的TPIIプロモーター、TPIIクーミ
ネーター及びpUc13ベクターを含有している3、6
kb断片を単離した。次に、この断片を3.25kb
p Z V117断片に連結して、プラスミドpZV
120を得た。シラスミ)’ P Z V120をHi
ndl[l及びSma Iで消化して、発現単位を単離
した。プラスミドY E p 13を、BamHIで消
化後、DNAポリメラーゼI (クレノー断片)で末端
を平滑化した。次に、末端平滑化断片をHi ndnl
で切断して、ベクタ一部分を単離し、その後、pZV]
20の発現単位に連結してプラスミドpZ■125を得
た。
プラスミドpZVI25におけるuPA cDNAを
合成アダプターを用いて変異させて、uPAc D N
Aストンプコドンの3′側に5alI部位を配置した
。プラスミドPZV125をHi n d III及び
B ;i m HTで消化して、TPrlPrlプロモ
ーフ1プレプロ配列及び部分的ul)AcDNAを含有
している2、5kb断片を単離した。
合成アダプターを用いて変異させて、uPAc D N
Aストンプコドンの3′側に5alI部位を配置した
。プラスミドPZV125をHi n d III及び
B ;i m HTで消化して、TPrlPrlプロモ
ーフ1プレプロ配列及び部分的ul)AcDNAを含有
している2、5kb断片を単離した。
オリゴヌクレオチドZ C830(5’−TCG /I
cG TGA GCTAGCCCG TTT TC
A CCA CCA ACG TGA G
TG TG−3’)及びZ C831(5’−GA
T CCA CACTCA CGT TGG
TGG TGA八Aへ CGG GCT AGCTC
A CG−3’)をキナーゼ処理後、アリ−リングして
、BamHI及び5a11粘着末端を有するuPAの末
端の13個のアミノ酸をコードしている酵母コドン最適
化アダプターを生成した。Z C830/Z C831
7ダブタートpZV125からの2.5kb断片とを、
Iイindm及びS a I Tで消化して線状化した
pUcI3に、3部分連結で連結した。pZV157と
命名した得られたプラスミドは、uPAの第一コドンの
5°側にB gI 11部位を有し、そしてuPAスト
ップコドンの3″側に5ai1部位を有するuPA
cDNAを含有している。
cG TGA GCTAGCCCG TTT TC
A CCA CCA ACG TGA G
TG TG−3’)及びZ C831(5’−GA
T CCA CACTCA CGT TGG
TGG TGA八Aへ CGG GCT AGCTC
A CG−3’)をキナーゼ処理後、アリ−リングして
、BamHI及び5a11粘着末端を有するuPAの末
端の13個のアミノ酸をコードしている酵母コドン最適
化アダプターを生成した。Z C830/Z C831
7ダブタートpZV125からの2.5kb断片とを、
Iイindm及びS a I Tで消化して線状化した
pUcI3に、3部分連結で連結した。pZV157と
命名した得られたプラスミドは、uPAの第一コドンの
5°側にB gI 11部位を有し、そしてuPAスト
ップコドンの3″側に5ai1部位を有するuPA
cDNAを含有している。
pZV157からのuPA cDNAを一エエ」」−
プロモーター及びPH05シグナルペプチド配列に連結
してP S W148を造成した。プラスミドpZVI
57をBglII及び5ai1で消化して、1.3kl
+ uPA cDNAを単離した。プラスミドp
D R1394C酵母PH05(アリマ等、ヌクアシ・
ンズ レス (Nuc、八cids Res、) 、第
11巻、1657〜1672.1983年)シグナルペ
プチドをコードしている合成配列に連結されたTPII
ブロモターを含有しているpUc18系ブラスミF〕由
来のT’ P r ]]プロモーターーPH05シグナ
ルペプチド配列を含有する0、96kbB g 1 m
断片及びuPAcDNA断片を、BglH−3ail切
断prCI91−1に、3部分連結により連結した。得
られたプラスミドをpsW148と命名した。
プロモーター及びPH05シグナルペプチド配列に連結
してP S W148を造成した。プラスミドpZVI
57をBglII及び5ai1で消化して、1.3kl
+ uPA cDNAを単離した。プラスミドp
D R1394C酵母PH05(アリマ等、ヌクアシ・
ンズ レス (Nuc、八cids Res、) 、第
11巻、1657〜1672.1983年)シグナルペ
プチドをコードしている合成配列に連結されたTPII
ブロモターを含有しているpUc18系ブラスミF〕由
来のT’ P r ]]プロモーターーPH05シグナ
ルペプチド配列を含有する0、96kbB g 1 m
断片及びuPAcDNA断片を、BglH−3ail切
断prCI91−1に、3部分連結により連結した。得
られたプラスミドをpsW148と命名した。
物質I)の配列に融合したBAR1第三ドメイン配列及
びエヱユ止ターミネータ−を含有するプラスミt’ p
s W 152を、下記のようにして造成した。
びエヱユ止ターミネータ−を含有するプラスミt’ p
s W 152を、下記のようにして造成した。
プラスミドpSW22(実施例4)をPvullで消化
して、]、16kb B A R1−物質P断片を単
離した。−1−ナーゼ処理しそしてアニーリングした5
aIIリンカ−(5°−CGT CGA CG−3’)
を1.16kb断片に連結した。過剰のリンカ−を、5
alI及び5stlで消化して除去した。1.0kb断
片を単離後、Sa I T及びSs t I″?:線状
化したplc19Rに連結した。得られたプラスミドを
psW152と命名した。
して、]、16kb B A R1−物質P断片を単
離した。−1−ナーゼ処理しそしてアニーリングした5
aIIリンカ−(5°−CGT CGA CG−3’)
を1.16kb断片に連結した。過剰のリンカ−を、5
alI及び5stlで消化して除去した。1.0kb断
片を単離後、Sa I T及びSs t I″?:線状
化したplc19Rに連結した。得られたプラスミドを
psW152と命名した。
プラスミドpsW148をHindlrl及びSal■
で消化して、TPIIプロモーター、P tl 05シ
グナル配列及びuPA cDNAを含有する2、2k
b断片を単離した。プラスミドpsW152を5all
及びBglTIで消化して、BAR]]第三ドメインー
物質P融合物びTPI上ターミネータ−を含有する1、
1kb断片を単離した。この2,2kb psW14
8断片を、HindIII−BamlTI切断Y E
P 13に、3部分連結で連結した。得られたプラスミ
ドをpsW163と命名した(第15図)。
で消化して、TPIIプロモーター、P tl 05シ
グナル配列及びuPA cDNAを含有する2、2k
b断片を単離した。プラスミドpsW152を5all
及びBglTIで消化して、BAR]]第三ドメインー
物質P融合物びTPI上ターミネータ−を含有する1、
1kb断片を単離した。この2,2kb psW14
8断片を、HindIII−BamlTI切断Y E
P 13に、3部分連結で連結した。得られたプラスミ
ドをpsW163と命名した(第15図)。
酵母ベクターY E p 13中に土工ユ1−プロモー
タ、PH05シグナル配列、uPA cDNA。
タ、PH05シグナル配列、uPA cDNA。
BAR1第三ドメイン及び−TPIIターミネータ−を
含有しているプラスミドpsW]63により、酵Iυ株
ZY100(MATa ade2−101 1eu2
−3+112 ura3−52 5uc2−Δ9工」
」ス 上胆J4:CA丁)及びZY200 (MAた
uPAのレヘルは、細胞抽出物中で7.2 ttg/
l−及びZY200のPSW163形質転換体からの上
澄み液中で38z/I!であった。
含有しているプラスミドpsW]63により、酵Iυ株
ZY100(MATa ade2−101 1eu2
−3+112 ura3−52 5uc2−Δ9工」
」ス 上胆J4:CA丁)及びZY200 (MAた
uPAのレヘルは、細胞抽出物中で7.2 ttg/
l−及びZY200のPSW163形質転換体からの上
澄み液中で38z/I!であった。
CAT Mエエl)を形質転換した。ロイシン不存在
の合成増殖培地で増殖することのできる能力について形
質転換体を選択した。
の合成増殖培地で増殖することのできる能力について形
質転換体を選択した。
psW163形質転換体からのブタウロキナーゼの発現
及び分泌を、まず形質転換体を30°Cで一晩一−Le
u6%D+0.1MスクシネートpH5,5〔6%グル
コースを含有するーLeu及び0.1Mスクシネート(
オートクレーピング前にNaOHでpH5,5に調整)
)5mfi中で増殖させることにより行った。−晩培養
した培養物を、5藏の−Leu6%D+0.1Mスクシ
ネーt−pH5,5で1=1000に希釈し、30゛C
で37時間増殖させた。細胞をペレット化し、上澄み液
を傾しゃして保存した。
及び分泌を、まず形質転換体を30°Cで一晩一−Le
u6%D+0.1MスクシネートpH5,5〔6%グル
コースを含有するーLeu及び0.1Mスクシネート(
オートクレーピング前にNaOHでpH5,5に調整)
)5mfi中で増殖させることにより行った。−晩培養
した培養物を、5藏の−Leu6%D+0.1Mスクシ
ネーt−pH5,5で1=1000に希釈し、30゛C
で37時間増殖させた。細胞をペレット化し、上澄み液
を傾しゃして保存した。
uPA活性を、フィブリン溶解アッセイ(実施例16C
)により測定した。この方法を用いて測定しA、 PD
GF配列のクローニング PDGFのB鎮をコードしている配列の造成については
、ムレイ(Murray)等により開示されている〔米
国特許箱4.766.073号及び第4,7(i9,3
28号:これらの開示内容は本発明に用いることができ
る〕。
)により測定した。この方法を用いて測定しA、 PD
GF配列のクローニング PDGFのB鎮をコードしている配列の造成については
、ムレイ(Murray)等により開示されている〔米
国特許箱4.766.073号及び第4,7(i9,3
28号:これらの開示内容は本発明に用いることができ
る〕。
ムレイ等(米国特許箱4,766.073号)により記
載されているように、発現ベクターpBI2(第15図
)は、S、セレビシェ−TP11プロモーターに作用可
能に結合させたヒトPDGF B鎖をコードしているD
NA配列、M F α]フップロ配列及び1兄上1ター
ミネータ−を含有している。又、米国特許箱4,766
.073号に記載されているように、ベクターpsB1
(第15図)は、エヱ」」−プロモーター、M且α
1プレプロ配列、v−sisコード配列及びTP11タ
ーミネータ−からなる発現型位を含イラしている。
載されているように、発現ベクターpBI2(第15図
)は、S、セレビシェ−TP11プロモーターに作用可
能に結合させたヒトPDGF B鎖をコードしているD
NA配列、M F α]フップロ配列及び1兄上1ター
ミネータ−を含有している。又、米国特許箱4,766
.073号に記載されているように、ベクターpsB1
(第15図)は、エヱ」」−プロモーター、M且α
1プレプロ配列、v−sisコード配列及びTP11タ
ーミネータ−からなる発現型位を含イラしている。
psB1ベクター中のMFαl/v−sis配列を−Q
Fα1/B鎖配列に代って用いた。pS81発現単位を
、Ec oR1部位を欠く変異pBR322プラスミド
に挿入した。pKPlo(第10図)と命名した得られ
たベクターをEcoRI及びX b a Tで消化して
、MFαl/v−sis断片を除去した。次に、PB1
2 MFα1/B鎖断片をpKP10発現単位に挿入
して、pKP26(第15図)を造成した。
Fα1/B鎖配列に代って用いた。pS81発現単位を
、Ec oR1部位を欠く変異pBR322プラスミド
に挿入した。pKPlo(第10図)と命名した得られ
たベクターをEcoRI及びX b a Tで消化して
、MFαl/v−sis断片を除去した。次に、PB1
2 MFα1/B鎖断片をpKP10発現単位に挿入
して、pKP26(第15図)を造成した。
その後、コドン最適化α因子配列をこの発現単位に導入
した。α因子プレプロ配列及びインシュリン配列(実施
例3)を含有しているEcoRI−xbal断片を、I
Ec oRT及びxbalで消化したpUc18(ヴエ
イラ及びメッシング(Vieilaand Messi
ng)、メス・エンザイモロジー(Met九。
した。α因子プレプロ配列及びインシュリン配列(実施
例3)を含有しているEcoRI−xbal断片を、I
Ec oRT及びxbalで消化したpUc18(ヴエ
イラ及びメッシング(Vieilaand Messi
ng)、メス・エンザイモロジー(Met九。
Rn、zymolo6z) 、第153巻、3〜11(
1987) :l中でクローニング後、−末鎖鋳型DN
Aを調製した。次に、この鋳型を2−プライマー法〔シ
ラー及びスミス、l) N A、第3巻、479〜48
8(1984) ]に準じて、突然変異誘発性オリゴヌ
クレオヂIJ’ Z C862(5″−GGA 八TC
TTT TG八 GCT CAG 4八A C
/Ic c−3’ ) を用いて、突然変異誘発し
た。この突然変異誘発により、α因子リーダーの3“末
端に5sLT部位が生成した。正しく変異したプラスミ
ドを選択し、pKP23と命名した。リーダー配列を、
EcoRI及び5stIで消化してpKP23から除去
し、このリーダー断片をEcoRI+5acl切断p
I C19H(7−シユ(Marsh)等、ジーン−Ω
μ川と、第32巻、481〜486(1984) E中
でザブクローニングした。得られたプラスミドをPKP
2イ(第15図)と命名した。プラスミドpKP2Gを
JEcoRI及び5sLTで切断して、α因子配列を除
去した。次に、コドン最適化α因子配列を、Ec。
1987) :l中でクローニング後、−末鎖鋳型DN
Aを調製した。次に、この鋳型を2−プライマー法〔シ
ラー及びスミス、l) N A、第3巻、479〜48
8(1984) ]に準じて、突然変異誘発性オリゴヌ
クレオヂIJ’ Z C862(5″−GGA 八TC
TTT TG八 GCT CAG 4八A C
/Ic c−3’ ) を用いて、突然変異誘発し
た。この突然変異誘発により、α因子リーダーの3“末
端に5sLT部位が生成した。正しく変異したプラスミ
ドを選択し、pKP23と命名した。リーダー配列を、
EcoRI及び5stIで消化してpKP23から除去
し、このリーダー断片をEcoRI+5acl切断p
I C19H(7−シユ(Marsh)等、ジーン−Ω
μ川と、第32巻、481〜486(1984) E中
でザブクローニングした。得られたプラスミドをPKP
2イ(第15図)と命名した。プラスミドpKP2Gを
JEcoRI及び5sLTで切断して、α因子配列を除
去した。次に、コドン最適化α因子配列を、Ec。
oRI −3sLT断片としてpKP24から取り出し
、線状化したpKP26に接合した。得られたベクター
をpKP28(第16図)と命名した。
、線状化したpKP26に接合した。得られたベクター
をpKP28(第16図)と命名した。
ベクターの造成を容易にするために、次にα因子リーダ
ーに導入した5sLT部位を除去して野性型コード配列
を回復した。プラスミドpKP28EcolンI及びx
baIで消化し、α因子−Bg融合配列を回収した。こ
の断片をpucls中でりl:1−ニングし、−末鎖D
NAを単離した。鋳型を、2−プライマー法にベムして
、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドZ C1019(
5’−ACCCAA GGA TCT CTTGTCC
八八 へGへ ^へCACCTTCTTC−3“) を
用いて突然変異誘発した。正しく突然変異誘発したプラ
スミドをρKP32と命名した。
ーに導入した5sLT部位を除去して野性型コード配列
を回復した。プラスミドpKP28EcolンI及びx
baIで消化し、α因子−Bg融合配列を回収した。こ
の断片をpucls中でりl:1−ニングし、−末鎖D
NAを単離した。鋳型を、2−プライマー法にベムして
、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドZ C1019(
5’−ACCCAA GGA TCT CTTGTCC
八八 へGへ ^へCACCTTCTTC−3“) を
用いて突然変異誘発した。正しく突然変異誘発したプラ
スミドをρKP32と命名した。
次に、発現単位全体を第16図に示すようにして再造成
した。プラスミドpKP32をEcoRr及びxbal
で消化し、α因子−B−断片を回収した。この断片を、
EcoRr及びXba Tで切断したpKPloに挿入
してpKP34を造成した。
した。プラスミドpKP32をEcoRr及びxbal
で消化し、α因子−B−断片を回収した。この断片を、
EcoRr及びXba Tで切断したpKPloに挿入
してpKP34を造成した。
プラスミドpKP34をC]aI及びBamHIで消化
し、発現単位を回収した。この断片を、C1al及びB
、、Im II +で消化したpMPOT2 (酵母
及び細菌複製起点、アンピシリン耐性遺伝子並びにPO
T 1選択マーカーを含有する、酵母2ミクl:1ンを
ヘースにしたプラスミド)に挿入してpKl)3(iを
造成した。
し、発現単位を回収した。この断片を、C1al及びB
、、Im II +で消化したpMPOT2 (酵母
及び細菌複製起点、アンピシリン耐性遺伝子並びにPO
T 1選択マーカーを含有する、酵母2ミクl:1ンを
ヘースにしたプラスミド)に挿入してpKl)3(iを
造成した。
プラスミドpA7 (ムレイ等、米国特許第4.766
.073号)からのコドン最適化Pr1GF A鎖配列
を、B鎖(第2図)に関して」二連した一連の造成工程
に対応する工程番こより、コドン屋適化α因子リーダー
と連結した。 J)A7 A鎖配列を5sLTxbaI
断片として単則し、5stl及びXbalで切断したp
KP28に挿入してpKP27を造成した。プラスミド
pKP27をEcoRI及びXbalで消化し、α因子
−A鎖断片をpUc11B中でクローニングした。
.073号)からのコドン最適化Pr1GF A鎖配列
を、B鎖(第2図)に関して」二連した一連の造成工程
に対応する工程番こより、コドン屋適化α因子リーダー
と連結した。 J)A7 A鎖配列を5sLTxbaI
断片として単則し、5stl及びXbalで切断したp
KP28に挿入してpKP27を造成した。プラスミド
pKP27をEcoRI及びXbalで消化し、α因子
−A鎖断片をpUc11B中でクローニングした。
上記と同様にして、オリゴヌクレオチドZc1018(
5’−TTCGAT AGA TCT CTT
GTCCAA AGA AACACCTTCTT
C−3’)を用いて突然変異誘発を行い、5stI部位
を除去して野性型α因子配列を回復した。正しく突然変
異誘発したプラスミドをpKP31と命名した。
5’−TTCGAT AGA TCT CTT
GTCCAA AGA AACACCTTCTT
C−3’)を用いて突然変異誘発を行い、5stI部位
を除去して野性型α因子配列を回復した。正しく突然変
異誘発したプラスミドをpKP31と命名した。
次に、コドン最適化発現ベクターを造成した。
プラスミドpKP31をEcoRT及びXba Iで消
化し、α因子−へ鎖断片をEcoRI及びxbaTで切
断したpKPloに連結した。pK+’33(第17図
)と命名した得られたベクターは発現単位全体を含有し
ていた。プラスミドpKP33をCI a I及びBa
mHIで消化し、発現単位断片を回収した。この断片を
C1al及びBamHIで切断したpMPOT2に挿入
して、発現ベクタ−pr<p3sを造成した。
化し、α因子−へ鎖断片をEcoRI及びxbaTで切
断したpKPloに連結した。pK+’33(第17図
)と命名した得られたベクターは発現単位全体を含有し
ていた。プラスミドpKP33をCI a I及びBa
mHIで消化し、発現単位断片を回収した。この断片を
C1al及びBamHIで切断したpMPOT2に挿入
して、発現ベクタ−pr<p3sを造成した。
PDGF IV13’iをコードする配列は、第17図
に示すように造成したプラスミドpKP51に由来する
ものであった。プラスミドpKP32により、E、コリ
M V 1193を形質転換した。−重鎖鋳型DNAを
調製し、鋳型を突然変異誘発性オリゴヌクレオチドZC
1078(表3)を用いて突然変異誘発した。
に示すように造成したプラスミドpKP51に由来する
ものであった。プラスミドpKP32により、E、コリ
M V 1193を形質転換した。−重鎖鋳型DNAを
調製し、鋳型を突然変異誘発性オリゴヌクレオチドZC
1078(表3)を用いて突然変異誘発した。
ZC1078による鋳型の突然変異誘発により、PDG
FB tj′iコート配列の5゛末端にB a m I
(I制限部位の挿入が生した。陽性クローンをプラーク
ハイブリダイゼーション、制限解析及びジデオキシシー
フェンシングにより同定した。陽性クローンをpKP4
7と命名した。
FB tj′iコート配列の5゛末端にB a m I
(I制限部位の挿入が生した。陽性クローンをプラーク
ハイブリダイゼーション、制限解析及びジデオキシシー
フェンシングにより同定した。陽性クローンをpKP4
7と命名した。
PKI”47に存在するMFα1シグナル配列を合成シ
グナル配列で置換した。プラスミドpKP47をEco
RI及びBamHIで消化して、ヒl−B鎖配列及びp
Uc118を含有する断片を単離した。
グナル配列で置換した。プラスミドpKP47をEco
RI及びBamHIで消化して、ヒl−B鎖配列及びp
Uc118を含有する断片を単離した。
オリゴヌクレオチドZC1157、ZC115B、ZC
1076及びZC1077(表3)を、アリ−リングし
たときに、合成シグナル配列をコードするF、coRl
−BamHIアダプターをコードするように設計した。
1076及びZC1077(表3)を、アリ−リングし
たときに、合成シグナル配列をコードするF、coRl
−BamHIアダプターをコードするように設計した。
オリゴヌクレオチドZCII58及びZc1076をキ
ナーゼ処理した。オリゴヌクレオチドZC1158及び
ZC1157をアリ−リングし、そしてZC1076及
びZCI077をそれとは別個に反応さセてアニーリン
グした。pKP47がらのE c、 o RrB a
m Hr断片を、3部分連結で、ZC115B/ZC1
157及ヒZ C1076/ Z Cl077ニ連結し
た。
ナーゼ処理した。オリゴヌクレオチドZC1158及び
ZC1157をアリ−リングし、そしてZC1076及
びZCI077をそれとは別個に反応さセてアニーリン
グした。pKP47がらのE c、 o RrB a
m Hr断片を、3部分連結で、ZC115B/ZC1
157及ヒZ C1076/ Z Cl077ニ連結し
た。
pKP49と命名した得られたプラスミドは、合成シフ
ナル配列、PI)GF8 kM配列及びpUcII8ベ
クター配列を含有していた。
ナル配列、PI)GF8 kM配列及びpUcII8ベ
クター配列を含有していた。
TPIIプロモーター、合成シグナル配列、PDGF
B鎖配列及びTPIIターミネータ−をプラスミドpK
P49から造成後、酵母配列ベクターでサブクローニン
グした。プラスミドpKP34を(80〕 C1al及びB、 a m HTで消化して、TPII
プロモーター、MFαlシグナル配列、PDGF B鎖
配列及び工を士上ターミネーター発現単位を含有する2
、3kb断片を単離した。プラスミドJ)UCl3をH
i n d [7及びEcoRIで消化して線状化した
。
B鎖配列及びTPIIターミネータ−をプラスミドpK
P49から造成後、酵母配列ベクターでサブクローニン
グした。プラスミドpKP34を(80〕 C1al及びB、 a m HTで消化して、TPII
プロモーター、MFαlシグナル配列、PDGF B鎖
配列及び工を士上ターミネーター発現単位を含有する2
、3kb断片を単離した。プラスミドJ)UCl3をH
i n d [7及びEcoRIで消化して線状化した
。
オリゴヌクレオチドZC101G及びZ C1017(
表3)をキナーゼ処理後アリ−リングして、CIal、
。
表3)をキナーゼ処理後アリ−リングして、CIal、
。
Hi n d m、xho 1.、Acc I、xba
I及びB a m HT制限部位を含有するポリリン
カーアダプターを生成した。線状ベクターを、リガーゼ
処理により、:1−ナーゼ処理及びアニーリングしたZ
C101(i/ Z C10177ダプターに連結し
て、pUC12Tl1ndI[I及びEcoRI部位を
喪失せしめた。得られたベクターpUc12*をAcc
l及びBamHIにより線状化した。2.3kb発現単
位断片を、pUc12*にリガーゼ処理により連結した
。得られたプラスミドをpKP38と命名した。
I及びB a m HT制限部位を含有するポリリン
カーアダプターを生成した。線状ベクターを、リガーゼ
処理により、:1−ナーゼ処理及びアニーリングしたZ
C101(i/ Z C10177ダプターに連結し
て、pUC12Tl1ndI[I及びEcoRI部位を
喪失せしめた。得られたベクターpUc12*をAcc
l及びBamHIにより線状化した。2.3kb発現単
位断片を、pUc12*にリガーゼ処理により連結した
。得られたプラスミドをpKP38と命名した。
プラスミドpKP38をEcoRI及びxbaIで消化
して、TPTIプロモーター、TPIIターミネークー
及びptJcI2*ベクター配列を含有する4、 3
kb断片を単離した。プラスミドpKP49をEcoR
I及びxbaIで消化して、合成シグナル配列及びPD
GF B鎖配列を含有する0、8kb断片を単離した。
して、TPTIプロモーター、TPIIターミネークー
及びptJcI2*ベクター配列を含有する4、 3
kb断片を単離した。プラスミドpKP49をEcoR
I及びxbaIで消化して、合成シグナル配列及びPD
GF B鎖配列を含有する0、8kb断片を単離した。
この0.8kbltIr片をpKP37からの4.3k
b断片にリガーゼにより連結した。得られたプラスミド
をpKP51と命名した。
b断片にリガーゼにより連結した。得られたプラスミド
をpKP51と命名した。
B0発現ベクターの造成
PDGF B鎖発現を、次に、リーダー及びS、セレビ
シx −B A R1遺伝子の第三ドメインコード配列
を含有している分泌シグナルに連結した。その後、BA
R1分泌シグナルをBt!コード配列と連結して、発現
ベクター p S W2O3及びpZY76を造成した
。 以下余白オリゴヌ 去 3 配列(5゛→3”) 一’r” ll T↓プロモーター及びBARI分泌シ
グナルを含有するプラスミドpSW255をまず造成し
た。プラスミドpsW195(実施例5)に存在するr
+、4−rt土の第三1Sメインコ一ド配列を、α因子
のアミノ酸8]−85、Lys、−Arg開裂部位、5
’EcoRI粘着末端、3’Bglll粘着末端及びI
’DCP R鎖の最初のアミノ酸をコードする合成アダ
プターに融合した。オリゴヌクレオチドZC1135及
びZ C1136(表3)を、マニアチス(Mania
Lis)等(前掲)により記載されているのと実質的に
同様にして、キナーゼ処理及びアニーリングした。
シx −B A R1遺伝子の第三ドメインコード配列
を含有している分泌シグナルに連結した。その後、BA
R1分泌シグナルをBt!コード配列と連結して、発現
ベクター p S W2O3及びpZY76を造成した
。 以下余白オリゴヌ 去 3 配列(5゛→3”) 一’r” ll T↓プロモーター及びBARI分泌シ
グナルを含有するプラスミドpSW255をまず造成し
た。プラスミドpsW195(実施例5)に存在するr
+、4−rt土の第三1Sメインコ一ド配列を、α因子
のアミノ酸8]−85、Lys、−Arg開裂部位、5
’EcoRI粘着末端、3’Bglll粘着末端及びI
’DCP R鎖の最初のアミノ酸をコードする合成アダ
プターに融合した。オリゴヌクレオチドZC1135及
びZ C1136(表3)を、マニアチス(Mania
Lis)等(前掲)により記載されているのと実質的に
同様にして、キナーゼ処理及びアニーリングした。
プラスミドpsW195をHi n d III及びE
coRIで消化して、TPrlプロモーター及びB A
R上コード配列を含有する1、 4 kb断片を単離
した。
coRIで消化して、TPrlプロモーター及びB A
R上コード配列を含有する1、 4 kb断片を単離
した。
この1.4kb断片を、3部分連結により、ZC113
5/ZC1136アダプター並びにHi n d m及
び8g1■で消化して線状化したprcI9Rに接合し
た。
5/ZC1136アダプター並びにHi n d m及
び8g1■で消化して線状化したprcI9Rに接合し
た。
得られたプラスミドをp S W255(第18図)と
命名した。
命名した。
プラスミドpKP51に存在するPDGF ll鎖配列
をTPIIプロモーター、且AR」−シグナル配列、B
ARI第三ドメイン及びZ C1135/Z C’11
36アダプター(Lys−Arg開裂部位をコードして
いる)に連結して、p S W2O3(第18図)を造
成した。プラスミドpKP51をB a m HTで消
化して、PDGP B鎖コード配列及び丁T’TIター
ミネータ−を含有する1、09kb断片を単離した。プ
ラスミドpSW255を5phr及びBgll’Iで消
化して、部分的TPTIプロモーター、BAR1シグナ
ル配列、几N北上第三ドメイン及びZ C1135/Z
C113Gアダプターを含有する0、75kb断片を
単離した。
をTPIIプロモーター、且AR」−シグナル配列、B
ARI第三ドメイン及びZ C1135/Z C’11
36アダプター(Lys−Arg開裂部位をコードして
いる)に連結して、p S W2O3(第18図)を造
成した。プラスミドpKP51をB a m HTで消
化して、PDGP B鎖コード配列及び丁T’TIター
ミネータ−を含有する1、09kb断片を単離した。プ
ラスミドpSW255を5phr及びBgll’Iで消
化して、部分的TPTIプロモーター、BAR1シグナ
ル配列、几N北上第三ドメイン及びZ C1135/Z
C113Gアダプターを含有する0、75kb断片を
単離した。
これらの2つの断片を、5phT及びBamHTで消化
して線状化したpUclBに、3部分連結により連結し
た。正しい配向で成分断片を含有するプラスミドを同定
し、pSW262と命名した。
して線状化したpUclBに、3部分連結により連結し
た。正しい配向で成分断片を含有するプラスミドを同定
し、pSW262と命名した。
次に、ベクターpMPOT2中にTPII−プロモータ
ー、i人尺上シグナル配列、BAR1第三ドメイン、P
DGF In鎖及びTi1lターミネータ−を含有する
酵母発現ベクターpsW304を、第18し1に示すよ
うにして造成した。プラスミドpKP36をCIaI及
び5phTで消化して、工1:11..プロモーターの
0.76kb5”部分を単離した。プラスミドpKP3
6(第16図)もCIaI及びB[Inで消化して、P
DGF B鎖配列、TP11クーミネークー及びpMP
O72ヘクター配列を含有する1lkbヘクク一含有断
片を単離した。
ー、i人尺上シグナル配列、BAR1第三ドメイン、P
DGF In鎖及びTi1lターミネータ−を含有する
酵母発現ベクターpsW304を、第18し1に示すよ
うにして造成した。プラスミドpKP36をCIaI及
び5phTで消化して、工1:11..プロモーターの
0.76kb5”部分を単離した。プラスミドpKP3
6(第16図)もCIaI及びB[Inで消化して、P
DGF B鎖配列、TP11クーミネークー及びpMP
O72ヘクター配列を含有する1lkbヘクク一含有断
片を単離した。
プラスミドpSW262を5phr及びBgllIで消
化して、0.75kh部分的TPIIプロモーターBA
R1シグナル配列、BAR1第三ドメイン及びZ C1
135/ Z C1136を単離した。3つの断片を、
3部分連結により連結し、得られたプラスミドをpsW
304と命名した。
化して、0.75kh部分的TPIIプロモーターBA
R1シグナル配列、BAR1第三ドメイン及びZ C1
135/ Z C1136を単離した。3つの断片を、
3部分連結により連結し、得られたプラスミドをpsW
304と命名した。
B鎖発現単位をベクターpRPOTに挿入することによ
り発現ベクターp Z Y76 (第19図)を造成し
た。pRPOTベクターは、まずpcP。
り発現ベクターp Z Y76 (第19図)を造成し
た。pRPOTベクターは、まずpcP。
Tの750bp S’p h r−BamHr断片をp
BR322の186bp Sph I−Bam’HT断
片で置換することにより得られるp CP OT (A
TCC39685)に由来するものである。得られたプ
ラスミドpDPOTを、5phr及びB a m HT
で消化して、10.8kb断片を単離した。オリゴヌク
レオチドZC1551及びZ C1552(表1)をキ
ナーゼ処理及びアニーリングして、Sma i Ss
t T及びxlroT制限部位の側面に位置するB a
rn HT粘着末端及び5phT粘着末端を有するア
ダプターを形成した。
BR322の186bp Sph I−Bam’HT断
片で置換することにより得られるp CP OT (A
TCC39685)に由来するものである。得られたプ
ラスミドpDPOTを、5phr及びB a m HT
で消化して、10.8kb断片を単離した。オリゴヌク
レオチドZC1551及びZ C1552(表1)をキ
ナーゼ処理及びアニーリングして、Sma i Ss
t T及びxlroT制限部位の側面に位置するB a
rn HT粘着末端及び5phT粘着末端を有するア
ダプターを形成した。
10.8kb p D P OT断片をZ C155
1/ Z C1552アダプターに、連結により再環状
化した。4H7られたプラスミドをpR,POTと命名
した。
1/ Z C1552アダプターに、連結により再環状
化した。4H7られたプラスミドをpR,POTと命名
した。
TI”’TIターミネーターを次のようにしてサブクロ
ーニングした。プラスミドp S W195(第11図
)をBglll及びSma Iで消化して、TP11プ
ロモーター、BAR1アミノ末端及び第三ドメイン、M
I−3コ一ド配列及びTPIIターミネータ−を含有し
ている2、38kb断片を単離した。
ーニングした。プラスミドp S W195(第11図
)をBglll及びSma Iで消化して、TP11プ
ロモーター、BAR1アミノ末端及び第三ドメイン、M
I−3コ一ド配列及びTPIIターミネータ−を含有し
ている2、38kb断片を単離した。
この2.38kb断片を、Sm’aI及びBglllで
消化して線状化したプラスミドpRPOTに連結した。
消化して線状化したプラスミドpRPOTに連結した。
p S W313と命名した得られたプラスミドをxb
at及び5phIで消化して、0.76kbT P T
1ク一ミネーター断片を単離した。この0.76kb
断片を、5phI及びxba Iで消化して線状化した
pUC18に連結した。得られたプラスミドをpZY7
5と命名した。
at及び5phIで消化して、0.76kbT P T
1ク一ミネーター断片を単離した。この0.76kb
断片を、5phI及びxba Iで消化して線状化した
pUC18に連結した。得られたプラスミドをpZY7
5と命名した。
次に、プラスミドpZY76を造成した。プラスミドp
sW195をBglll及びEcoRIで消化して、T
I’llプロモーター並びにBAR1アミノ末6Q及び
第三ドメインを含有する1、 4 kb断片をtP、離
した。プラスミドpSW262(第18図)をEcoR
I及びxba Iで消化して、Z C1135/ZC1
136アダプター及びPDGP II鎖コード配列を包
含する0、35kb断片を単離した。プラスミドpZY
75をXba T及び5phrで消化して、1Lし1タ
ーミネータ−を含有する0、75kb断片を単離した。
sW195をBglll及びEcoRIで消化して、T
I’llプロモーター並びにBAR1アミノ末6Q及び
第三ドメインを含有する1、 4 kb断片をtP、離
した。プラスミドpSW262(第18図)をEcoR
I及びxba Iで消化して、Z C1135/ZC1
136アダプター及びPDGP II鎖コード配列を包
含する0、35kb断片を単離した。プラスミドpZY
75をXba T及び5phrで消化して、1Lし1タ
ーミネータ−を含有する0、75kb断片を単離した。
これらの3つの断片を、B a m T−(T及びsp
h+で消化して線状化したpRPOTに、3部分連結に
より連結した。TPIIプラスミド、BAR1アミノ末
端及び第三ドメイン、PDGFコード配列、TPIIタ
ーミネータ−並びにpRPOTヘクター配列を含有する
得られたプラスミドをpZY76と命名した。
h+で消化して線状化したpRPOTに、3部分連結に
より連結した。TPIIプラスミド、BAR1アミノ末
端及び第三ドメイン、PDGFコード配列、TPIIタ
ーミネータ−並びにpRPOTヘクター配列を含有する
得られたプラスミドをpZY76と命名した。
C,BBホモダイマーの発現
p S W2O3及びpZY76で形質転換した酵母株
からのPDGP BBの発現を、対照プラスミドT’B
170m(ムレイ等、米国特許出願筒896.485号
)及びpKP57(pRPOT中にpKP34発現単位
を含有する)からのPDGFの発現と比較した。プラス
ミドp S W2O3、P Z Y76、PBl、7O
n+及びpKP57により、酵母株E18#9 (MA
Ta I c u 23.112 h i s 4
−580 g3 」」シ二l ↓11」−3−43
(MATa ] eu2−3 .112
ura3 barl il肥 t il::LE
U2)及び2M114(MATa ade2−101
1eu2tpi::CAT)を、ベッグズ(Begg
s) (ネーチャー、第275巻、104〜10B(1
978)に記載の方法と実質的に同様にして形質転換し
た。
からのPDGP BBの発現を、対照プラスミドT’B
170m(ムレイ等、米国特許出願筒896.485号
)及びpKP57(pRPOT中にpKP34発現単位
を含有する)からのPDGFの発現と比較した。プラス
ミドp S W2O3、P Z Y76、PBl、7O
n+及びpKP57により、酵母株E18#9 (MA
Ta I c u 23.112 h i s 4
−580 g3 」」シ二l ↓11」−3−43
(MATa ] eu2−3 .112
ura3 barl il肥 t il::LE
U2)及び2M114(MATa ade2−101
1eu2tpi::CAT)を、ベッグズ(Begg
s) (ネーチャー、第275巻、104〜10B(1
978)に記載の方法と実質的に同様にして形質転換し
た。
単一コロニーからの形質転換体を醗酵培地(表4)に接
種し、30°Cで24時間増殖させた。
種し、30°Cで24時間増殖させた。
24時間後、グルコースを最終濃度2%となるように培
養物に添加し、培養物を30°Cで24時間増殖させた
。
養物に添加し、培養物を30°Cで24時間増殖させた
。
以下余白
天−一一先
醗酵培地:
NZ アミンタイプA20g
KIIzPOa 7 gNH,S
o、 6 gMgSOa
2 g固体を水に溶解し容積を1リツト
ルとする。
o、 6 gMgSOa
2 g固体を水に溶解し容積を1リツト
ルとする。
25分間オートクレーブ滅菌する。オートクレーブ滅菌
後、2 ml / I!、の微量元素液(下記の処方に
よる)、ビタミン液(下記の処方による)3ml、2M
コハク酸ナトリウム(pH5,5;最終モル濃度0.1
Mまで)及び50%グルコース(最終濃度2%まで)を
添加する。
後、2 ml / I!、の微量元素液(下記の処方に
よる)、ビタミン液(下記の処方による)3ml、2M
コハク酸ナトリウム(pH5,5;最終モル濃度0.1
Mまで)及び50%グルコース(最終濃度2%まで)を
添加する。
微量元素液:
ZnSO49,45mg
Fe2(So4)+ 284.8mgCu5
Oa ・511zO48mg 固体を希釈水に溶解し、最終容積]00mff1とする
。
Oa ・511zO48mg 固体を希釈水に溶解し、最終容積]00mff1とする
。
次に濾過滅菌する。
ビタミン液:
リボフラビン 420 mg
パントテン酸 5.4g
ナイアシン 6.1g
ピロトキシン 1.4g
ビオチン 60■
葉酸 40mg
イノシトール 6.6g
チアミン 1.3g
蒸留水に熔解し、最終容積100mff1とする。次に
濾過滅菌する。
濾過滅菌する。
細胞を遠心分離により培地から除去した。次に、上澄み
液を0.45tnhの濾過器を通して濾過し、細胞又は
細胞片を除去した。ライネス及びロス(1?aines
and Ross) Cメス・エンザイモロジー(M
eth■rI互リ−pH2>す、第109巻、749〜
773(1985) )により記載されたようにして、
濾過した培養上澄み液について有糸***誘発アッセイを
行った。結果(la地1 rrdl当たりのPDGF活
性をngで表したもの)を表5に示す。
液を0.45tnhの濾過器を通して濾過し、細胞又は
細胞片を除去した。ライネス及びロス(1?aines
and Ross) Cメス・エンザイモロジー(M
eth■rI互リ−pH2>す、第109巻、749〜
773(1985) )により記載されたようにして、
濾過した培養上澄み液について有糸***誘発アッセイを
行った。結果(la地1 rrdl当たりのPDGF活
性をngで表したもの)を表5に示す。
プラスミド
218#9
XB13−5B
M114
形質転換した酵母細胞によって産生されるPDGF類似
体は、一連のクロマトグラフィおよび濃縮工程によって
濃縮された培地上澄液から精製される。
体は、一連のクロマトグラフィおよび濃縮工程によって
濃縮された培地上澄液から精製される。
培地上澄液はミリボア・ペリカン・カセツタ(旧11i
pore Pe1lican Ca5settes)
(ミリボア(Millipore) 、ベツドフォード
、マサヂューセッツ)を用いて濃縮され、濃縮液はベッ
クマン(Bekcman) J −6B遠心分離装置(
ベックマン・インスツルメンツ・インコーポレーテド(
BeckmanInstruments+ Inc、)
、ブレア、カリフォルニア)で4200rpmで30分
間遠心分離することによってペレット化して濁りを除去
する。最終濃縮物に10mMになるようにEDTAを加
えて、混合物のpl+を5M水酸化ナトリウムで5.5
に調整する。次いで、濃縮液を水で希釈して、導電率を
約10ミリモーとする。
pore Pe1lican Ca5settes)
(ミリボア(Millipore) 、ベツドフォード
、マサヂューセッツ)を用いて濃縮され、濃縮液はベッ
クマン(Bekcman) J −6B遠心分離装置(
ベックマン・インスツルメンツ・インコーポレーテド(
BeckmanInstruments+ Inc、)
、ブレア、カリフォルニア)で4200rpmで30分
間遠心分離することによってペレット化して濁りを除去
する。最終濃縮物に10mMになるようにEDTAを加
えて、混合物のpl+を5M水酸化ナトリウムで5.5
に調整する。次いで、濃縮液を水で希釈して、導電率を
約10ミリモーとする。
生成する濃縮液をS−セファロース・ファスト・フロー
(Sepharose Fast Flow)(ファル
マシア(Pharmacia) 、ビス力タウエイ、ニ
ュー・シャーシー)カラム上でクロマ1−グラフィにか
ける。カラムを20IIMリン酸すトリウム、0.1
M塩化ナトリウム(pH7,3)で洗浄する。次に、カ
ラムを20+wMリン酸ナトリウム、1M塩化ナトリウ
ム(pH7,3)で溶出する。溶出液の280nmでの
吸収を測定して、ピーク分画をまとめて保存する。
(Sepharose Fast Flow)(ファル
マシア(Pharmacia) 、ビス力タウエイ、ニ
ュー・シャーシー)カラム上でクロマ1−グラフィにか
ける。カラムを20IIMリン酸すトリウム、0.1
M塩化ナトリウム(pH7,3)で洗浄する。次に、カ
ラムを20+wMリン酸ナトリウム、1M塩化ナトリウ
ム(pH7,3)で溶出する。溶出液の280nmでの
吸収を測定して、ピーク分画をまとめて保存する。
溶出液を一20°Cで凍結した後、融解する。溶出液か
ら粒状物質を遠心分離によって取り除く。
ら粒状物質を遠心分離によって取り除く。
」二泣液を集めて、0.87M酢酸を用いてpl+を3
.0に調整する。次に、溶出液をアミコン(Amico
n) Y M10フィルター(アミコン(4m1con
)、デンバース、マサデユー七ツッ)を用いて濃縮する
。濃縮溶出液を1M酢酸5倍容を用いて希釈し、塩化ナ
トリウム濃度を約0.2 Mに低下させる。
.0に調整する。次に、溶出液をアミコン(Amico
n) Y M10フィルター(アミコン(4m1con
)、デンバース、マサデユー七ツッ)を用いて濃縮する
。濃縮溶出液を1M酢酸5倍容を用いて希釈し、塩化ナ
トリウム濃度を約0.2 Mに低下させる。
次に、溶出液を第二のS−セファロース・カラム上でク
ロマトグラフィにかける。カラムを1M酢酸で洗浄し、
溶出液の280nmでの吸収を測定して、この吸収がベ
ースラインに戻るまで洗浄を続ける。カラムを1M酢酸
、1,5M塩化アンモニウム(pH4,8〜5.0 )
で溶出する。溶出液の280r++nでの吸収を測定し
、PDGFを最後の280nmにおける吸収ピークとし
て集める。このピーク分画をプールして、アミコンYM
IOフィルターを用いてW Knする。
ロマトグラフィにかける。カラムを1M酢酸で洗浄し、
溶出液の280nmでの吸収を測定して、この吸収がベ
ースラインに戻るまで洗浄を続ける。カラムを1M酢酸
、1,5M塩化アンモニウム(pH4,8〜5.0 )
で溶出する。溶出液の280r++nでの吸収を測定し
、PDGFを最後の280nmにおける吸収ピークとし
て集める。このピーク分画をプールして、アミコンYM
IOフィルターを用いてW Knする。
次いで、濃縮した溶出液をカラム容積の約1%の試料容
積を用いてセファデックスG−50スーパーフアイン(
Sephadex G−505uperfine)(フ
ァルマシア(Pharmacia) 、ビス力タウエイ
、ニュー・シャーシー)カラムにかける。カラムにM酢
酸アンモニウム(p)19.0)を5aa/時の流速で
流す。
積を用いてセファデックスG−50スーパーフアイン(
Sephadex G−505uperfine)(フ
ァルマシア(Pharmacia) 、ビス力タウエイ
、ニュー・シャーシー)カラムにかける。カラムにM酢
酸アンモニウム(p)19.0)を5aa/時の流速で
流す。
5DS−ゲル電気泳動で測定して、最も純粋な分画をプ
ールして、pnを酢酸で4.0に調整する。
ールして、pnを酢酸で4.0に調整する。
ル範例J−6=分析法9提具
A、MT−3免疫反応性物質についてのラジオイムノア
ッセイ。
ッセイ。
(実施例9に記載した方法で調製した)培養液」上澄液
についてラジオイムノアッセイを行った。
についてラジオイムノアッセイを行った。
試料(50μm/ウェル)を96ウエルのV型底マイク
ロクイタープレート(フロー・ラプス(FlowLab
s)、マクレーン、バージニア)に加えた。
ロクイタープレート(フロー・ラプス(FlowLab
s)、マクレーン、バージニア)に加えた。
Na FAM (0,04Mリン酸ナトリウム緩衝液(
pH7、4)100mffiに0.6g塩化ナトリウム
および5.9gウシ血清アルブミンを溶解し、0.1%
ウシ血清アルブミンを含有せしめ、最終pHを水酸化ナ
トリウムで7.3に調整したもの〕中ブターインシュリ
ンの希釈液からなる標準試料をそれぞれのプレートに加
えた。それぞれのウェルに50111のモルモットの抗
インシュリン抗血清を加えた。ウェル当たり2.5 X
10’cpm/ 50plの”5TFab’マウス抗
インシユリンを加えた。この混合物を室温で2時間イ刈
1−ユヘーションした。5taph Al4胞〔パン
ソルビン(Pansorbin) 、シグマ・ケミカル
・カンパニー(Sigma Chemical Co、
)、セントルイス、ミズーリー〕をNaFAMで1=1
0に希釈し、50ttlをそれぞれのウェルに加え、室
温で45分間インキュベーションした。プレートをヘッ
クマンTJ−6遠心機で4℃で3.00Orpmで5分
間遠心分離した。上澄液を捨てて、ウェルをTNEN
(50mM)リス塩基、10 mMNacI、1mMε
DT/l、0.5%NP40、 pH8,0に調整)中
1%ウシ血清アルブミン(BSA)150μlで2回洗
浄した。細胞をTNEN中1%BSAに再懸濁して、ガ
ンマ−カウンターで計数した。
pH7、4)100mffiに0.6g塩化ナトリウム
および5.9gウシ血清アルブミンを溶解し、0.1%
ウシ血清アルブミンを含有せしめ、最終pHを水酸化ナ
トリウムで7.3に調整したもの〕中ブターインシュリ
ンの希釈液からなる標準試料をそれぞれのプレートに加
えた。それぞれのウェルに50111のモルモットの抗
インシュリン抗血清を加えた。ウェル当たり2.5 X
10’cpm/ 50plの”5TFab’マウス抗
インシユリンを加えた。この混合物を室温で2時間イ刈
1−ユヘーションした。5taph Al4胞〔パン
ソルビン(Pansorbin) 、シグマ・ケミカル
・カンパニー(Sigma Chemical Co、
)、セントルイス、ミズーリー〕をNaFAMで1=1
0に希釈し、50ttlをそれぞれのウェルに加え、室
温で45分間インキュベーションした。プレートをヘッ
クマンTJ−6遠心機で4℃で3.00Orpmで5分
間遠心分離した。上澄液を捨てて、ウェルをTNEN
(50mM)リス塩基、10 mMNacI、1mMε
DT/l、0.5%NP40、 pH8,0に調整)中
1%ウシ血清アルブミン(BSA)150μlで2回洗
浄した。細胞をTNEN中1%BSAに再懸濁して、ガ
ンマ−カウンターで計数した。
以下余白
B、Ml−3の裔圧液体クロマトグラフィ(IIPLC
)分析法 犬二」− HP L C緩衝液処方 緩衝液A: 56.8 g NazsOn 1800d 1IPI、C級H20(オムニソルブ
(Omnisolv)、イー・エム・サイエンス(EM
5cience)、チェリー・ヒルズ、ニュー°シャ
ー シー) 5.4m1l IIxPO4(最低85%)エタノ
ールアミンでpl+を2.3に調整。4N水酸化ナトリ
ウムでpl+を3.6に調整。1(PLC級アモアセト
ニトリルメリカン・プルデイ・マク・アンド・ジャ・ン
クソン・ラボラトリ−(八m、Burdick & J
acksonLaboratory) 、ムスケゴンミ
シガン)156gを加える。IIPLc級11□0で容
積を2リツトル調整。0.45フイルターで濾過。
)分析法 犬二」− HP L C緩衝液処方 緩衝液A: 56.8 g NazsOn 1800d 1IPI、C級H20(オムニソルブ
(Omnisolv)、イー・エム・サイエンス(EM
5cience)、チェリー・ヒルズ、ニュー°シャ
ー シー) 5.4m1l IIxPO4(最低85%)エタノ
ールアミンでpl+を2.3に調整。4N水酸化ナトリ
ウムでpl+を3.6に調整。1(PLC級アモアセト
ニトリルメリカン・プルデイ・マク・アンド・ジャ・ン
クソン・ラボラトリ−(八m、Burdick & J
acksonLaboratory) 、ムスケゴンミ
シガン)156gを加える。IIPLc級11□0で容
積を2リツトル調整。0.45フイルターで濾過。
緩衝液Bニ
ア80 g HPLC級アセドアセトニトリル10
44 HPLClfgLHzO)IPLc分析はビス
ツ(VIST八) 550011PLC(パリアン(V
arian) )を用いて培地上澄液に就いて行った。
44 HPLClfgLHzO)IPLc分析はビス
ツ(VIST八) 550011PLC(パリアン(V
arian) )を用いて培地上澄液に就いて行った。
(実施例10に記載の方法で調製した)上澄液試料を融
解し、ミクロ遠心機中で室温で1分間遠心分離して、試
料から沈澱物を除去した。Ml−3標準試料〔ノボ・イ
ンダストリー・エイ/ニス(Novo Industr
i A/S) 、バグスベルト(Bagsvaerd)
、デンマークから入手〕2.0.1.0および0.5
nを0.025Mギ酸に加えた。それぞれの試料及び標
準試料100111を、C18逆相カラム〔リクロプレ
プ(LiChroprep) RP −10(5trt
a ) 、イー・メルク(E、Merck) 、ダルム
シュタット、西ドイツ)上に置いた。
解し、ミクロ遠心機中で室温で1分間遠心分離して、試
料から沈澱物を除去した。Ml−3標準試料〔ノボ・イ
ンダストリー・エイ/ニス(Novo Industr
i A/S) 、バグスベルト(Bagsvaerd)
、デンマークから入手〕2.0.1.0および0.5
nを0.025Mギ酸に加えた。それぞれの試料及び標
準試料100111を、C18逆相カラム〔リクロプレ
プ(LiChroprep) RP −10(5trt
a ) 、イー・メルク(E、Merck) 、ダルム
シュタット、西ドイツ)上に置いた。
カラムに60%緩衝液衝合40%緩衝液衝合表4に示し
た処方)からなる等グラデイエンド(isocrati
c gradient)を50°Cで1m1Z分の流速
で流し、214nmの検出水準0.05八〇FS (^
bsorbanceUnits Full 5cale
)を用いた。それぞれの試料を30分間流したところ、
MI−3ピークは18分後に現れた。M[−3物質の定
量は試料物質と既知のMT−3標準試料との比較に基づ
く。
た処方)からなる等グラデイエンド(isocrati
c gradient)を50°Cで1m1Z分の流速
で流し、214nmの検出水準0.05八〇FS (^
bsorbanceUnits Full 5cale
)を用いた。それぞれの試料を30分間流したところ、
MI−3ピークは18分後に現れた。M[−3物質の定
量は試料物質と既知のMT−3標準試料との比較に基づ
く。
C,uPA活性についての定量的フィブリン熔解測定
前記実施例に記載されたのと同様に適当に増殖した培養
物を遠心分離して細胞をベレット化した。
物を遠心分離して細胞をベレット化した。
上澄液を傾瀉して取り除いた。細胞ペレットを水で1回
洗浄し、リン酸緩衝化食塩水(PBS、シグマ・ケミカ
ル・カンパニー)と5mM EDTAとの混合物に再懸
濁した。ガラスピーズ(450〜500庫)を総容積の
半分になるように加えた。混合物の全速力での1分間撹
拌を3回行い、撹拌の間に試料を氷冷した。液体をパス
ツールピペットで試験管から取り出してミクロ遠心機に
移した。次いで、溶解産物をエッベンドルフ・ミクロ遠
心機(ブリンクマン(Rrinkmann) 、ウェス
トバリー、ニューヨーク)中で最高速度で15分間4
”Cで遠心分離した。上澄液を注意深く採取して分析し
た。
洗浄し、リン酸緩衝化食塩水(PBS、シグマ・ケミカ
ル・カンパニー)と5mM EDTAとの混合物に再懸
濁した。ガラスピーズ(450〜500庫)を総容積の
半分になるように加えた。混合物の全速力での1分間撹
拌を3回行い、撹拌の間に試料を氷冷した。液体をパス
ツールピペットで試験管から取り出してミクロ遠心機に
移した。次いで、溶解産物をエッベンドルフ・ミクロ遠
心機(ブリンクマン(Rrinkmann) 、ウェス
トバリー、ニューヨーク)中で最高速度で15分間4
”Cで遠心分離した。上澄液を注意深く採取して分析し
た。
フィプリンリ溶解測定はバインダー(Binder)ら
の方法(J、Biol、Chem、 254,1998
.1979)に基づいている。アガロースB(ファルマ
シア)150n+gを15m1のフィブリンプレート緩
衝液(1リットル中4.36g)リス−塩基、8.48
g塩化すトリウム、15 K CaC1z、200mg
NaN:+ 、 pl+8.4に調整)に加えた。ア
ガロース混合物を55°Cで融解して保持した。この溶
液に、ウシ−トロンビン(500U /m)を加えた。
の方法(J、Biol、Chem、 254,1998
.1979)に基づいている。アガロースB(ファルマ
シア)150n+gを15m1のフィブリンプレート緩
衝液(1リットル中4.36g)リス−塩基、8.48
g塩化すトリウム、15 K CaC1z、200mg
NaN:+ 、 pl+8.4に調整)に加えた。ア
ガロース混合物を55°Cで融解して保持した。この溶
液に、ウシ−トロンビン(500U /m)を加えた。
フィブリノーゲン(シグマ・ケミカル・カンパニー)を
フィブリンプレート緩衝液に溶解し、濾過陥凹して、次
にフィブリンプレート緩衝液で希釈して0D280を5
にした。フィブリノーゲン溶液5 mlをアガロース−
トロンビン溶液に加えた。混合物をゲルボンド・アガロ
ース・サポート・シート〔エフ・エム・シー・コーポレ
ーション(FMCCorp、) 、ロアクランド、メイ
ン〕に注入して、放冷した。ウェルをツガ1コース中で
切断し、これらのウェルに処理される試料10p1また
は 20IJ1を加えた。結果をヒトウロキナーゼ標準
曲線と比較し、ブタウロキナーゼの換算比活性に調整し
た。ウェルの周りの透明なハローの出現は生物学的に活
性なブタウロキナーゼの存在を示す。 上記の説明から
、本発明の特定の態様を例示の目的で記載してきたが、
各種の改変が本発明の精神および範囲から離反すること
なく可能であることが理解されるであろう。したがって
、本発明は特許請求の範囲による以外は制限されるもの
ではない。
フィブリンプレート緩衝液に溶解し、濾過陥凹して、次
にフィブリンプレート緩衝液で希釈して0D280を5
にした。フィブリノーゲン溶液5 mlをアガロース−
トロンビン溶液に加えた。混合物をゲルボンド・アガロ
ース・サポート・シート〔エフ・エム・シー・コーポレ
ーション(FMCCorp、) 、ロアクランド、メイ
ン〕に注入して、放冷した。ウェルをツガ1コース中で
切断し、これらのウェルに処理される試料10p1また
は 20IJ1を加えた。結果をヒトウロキナーゼ標準
曲線と比較し、ブタウロキナーゼの換算比活性に調整し
た。ウェルの周りの透明なハローの出現は生物学的に活
性なブタウロキナーゼの存在を示す。 上記の説明から
、本発明の特定の態様を例示の目的で記載してきたが、
各種の改変が本発明の精神および範囲から離反すること
なく可能であることが理解されるであろう。したがって
、本発明は特許請求の範囲による以外は制限されるもの
ではない。
第1−1図〜1−3図は、BARI遺伝子のヌクレオチ
ド配列および一次翻訳生成物の誘導されたアミノ酸配列
を示す。線より上の数字はヌクレオチド配列に関し;マ
イナスの数字は5”非コード配列を示す。線よりしたの
数字は、アミノ酸配列に関する。推定のシグナルペプチ
ドの切断部位を矢印で示す。星印は潜在的なグリコジル
化部位を意味する。 第2図は、プラスミドp Z ■135の造成を示す。 第3図は、プラスミドpGLY2.3の造成を示す。 第4図は、プラスミドpSW22の造成を示す。 第5図は、プラスミドp S WI51の造成を示す。 第6図は、発現ベクターpsW152およびpSW20
0の造成を示す。 第7図は、プラスミドpsW207の造成を示す。 第8図は、プラスミドpSW84の造成を示す。 第9図は、発現ベクターpsW210の造成を示す。 第10図は、発現ベクターpsW219の造成を示す。 第11図は、発現ベクターp Z V187の造成を示
す。 第12図は、プラスミドp D R2012の造成を示
す。 第13図は、プラスミドpZV125の造成を示す。 第14図は、プラスミドpsW1G’3の造成を示す。 第15図は、プラスミドpKP24およびpKP26の
造成を示す。 第16図は、プラスミドpKP36の造成を示す。 第17図は、プラスミドpKP51の造成を示す。 第18図は、発現ベクターpsW304の造成を示す。 第19図は、発現ベクターpZY76の造成を示す。
ド配列および一次翻訳生成物の誘導されたアミノ酸配列
を示す。線より上の数字はヌクレオチド配列に関し;マ
イナスの数字は5”非コード配列を示す。線よりしたの
数字は、アミノ酸配列に関する。推定のシグナルペプチ
ドの切断部位を矢印で示す。星印は潜在的なグリコジル
化部位を意味する。 第2図は、プラスミドp Z ■135の造成を示す。 第3図は、プラスミドpGLY2.3の造成を示す。 第4図は、プラスミドpSW22の造成を示す。 第5図は、プラスミドp S WI51の造成を示す。 第6図は、発現ベクターpsW152およびpSW20
0の造成を示す。 第7図は、プラスミドpsW207の造成を示す。 第8図は、プラスミドpSW84の造成を示す。 第9図は、発現ベクターpsW210の造成を示す。 第10図は、発現ベクターpsW219の造成を示す。 第11図は、発現ベクターp Z V187の造成を示
す。 第12図は、プラスミドp D R2012の造成を示
す。 第13図は、プラスミドpZV125の造成を示す。 第14図は、プラスミドpsW1G’3の造成を示す。 第15図は、プラスミドpKP24およびpKP26の
造成を示す。 第16図は、プラスミドpKP36の造成を示す。 第17図は、プラスミドpKP51の造成を示す。 第18図は、発現ベクターpsW304の造成を示す。 第19図は、発現ベクターpZY76の造成を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、シグナルペプチドをコードするDNA配列と、これ
に続くリーディングフレーム内に¥BAR1¥遺伝子生
成物の部分であって少なくともC−末端ドメインの部分
を含むもの及び異種蛋白質又はポリペプチドをコードす
る第二のDNA配列に作用可能に連結された転写プロモ
ーターを含んで成るDNA造成物。 2、前記C−末端ドメインの部分が、391番のセリン
から始まり526番のセリンで終わる第1図のアミノ酸
配列を有する、請求項1記載のDNA造成物。 3、前記C−末端ドメインの部分が、423番のアラニ
ンから始まり526番のセリンで終わる第1図のアミノ
酸配列を有する、請求項1記載のDNA造成物。 4、前記異種性蛋白質またはポリペプチドがウロキナー
ゼ、インシュリン、血小板由来の成長因子およびそれら
の類似体からなる群から選択される蛋白質である、請求
項1記載のDNA造成物。 5、前記転写プロモーターがTPI酵素またはADH酵
素をコードする遺伝子の転写プロモーターである、請求
項1のDNA造成物。 6、前記シグナルペプチドがバリヤーシグナルペプチド
または酵母抑制酸性ホスファターゼシグナルペプチドで
ある、請求項1記載のDNA造成物。 7、前記第二のDNA配列がBAR1遺伝子生成物のC
−末端ドメインの少なくとも一部をコードするセグメン
ト及びその下流にある異種性蛋白質またはポリペプチド
をコードするセグメントとを含んで成る、請求項1記載
のDNA造成物。 8、前記第二のDNA配列が異種性蛋白質またはポリペ
プチドをコードするセグメント及びその下流にあるBA
R1遺伝子生成物のC−末端ドメインの少なくとも一部
をコードするセグメントを含んで成る、請求項1記載の
DNA造成物。 9、前記第二のDNA配列が異種性蛋白質またはポリペ
プチドをコードするセグメントに隣接して配置された開
裂部位をコードするセグメントを含んで成る、請求項7
または8記載のDNA造成物。 10、前記開裂部位が二塩基性開裂部位またはトロンビ
ン開裂部位である、請求項9記載のDNA造成物。 11、前記第二のDNA配列がBAR1遺伝子生成物の
アミノ酸468および503の一方若しくは両方におい
て炭水化物の付加を妨げるために変異誘発されている請
求項1記載のDNA造成物。 12、前記第二のDNA配列がアミノ酸468のグルタ
ミン残基をコードする、請求項11記載のDNA造成物
。 13、前記第二のDNA配列がアミノ酸503のグルタ
ミン残基をコードする、請求項11記載のDNA造成物
。 14、請求項1〜13のいずれか1項記載のDNA造成
物で形質転換された酵母細胞。 15、請求項1〜13のいずれか1項記載のDNA造成
物で形質転換された哺乳類細胞。16、適当な媒質中で
請求項1〜13のいずれか1項記載のDNA造成物を含
有する宿主細胞を増殖させ、 該宿主細胞から蛋白質またはポリペプチド生成物を単離
することを含んで成る、蛋白質の産生方法。 17、単離工程の後、前記蛋白質生成物を精製する、請
求項16に記載の方法。 18、上記宿主細胞が酵母細胞または哺乳類細胞である
、請求項16に記載の方法。 19、請求項16の方法によって産生される蛋白質生成
物。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US229074 | 1981-01-28 | ||
US10431687A | 1987-10-02 | 1987-10-02 | |
US104316 | 1987-10-02 | ||
US22907488A | 1988-08-05 | 1988-08-05 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0216984A true JPH0216984A (ja) | 1990-01-19 |
JP2730923B2 JP2730923B2 (ja) | 1998-03-25 |
Family
ID=26801396
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63249710A Expired - Fee Related JP2730923B2 (ja) | 1987-10-02 | 1988-10-03 | Bar1分泌シグナル |
Country Status (8)
Country | Link |
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EP (1) | EP0310137B1 (ja) |
JP (1) | JP2730923B2 (ja) |
AU (2) | AU2334088A (ja) |
CA (1) | CA1314830C (ja) |
DE (1) | DE3887425T2 (ja) |
DK (1) | DK555488A (ja) |
ES (1) | ES2061585T3 (ja) |
FI (1) | FI96121C (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009102321A (ja) * | 1996-09-13 | 2009-05-14 | Transkaryotic Therapies Inc | α−ガラクトシダーゼA欠損症の治療 |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE170556T1 (de) * | 1989-06-16 | 1998-09-15 | Genencor Int | Dna-sequenzen, vektoren und fusionspolypeptide zur erhöhung der sekretion gewünschter polypeptide von filamentösen fungi |
WO1991018988A1 (en) * | 1990-06-08 | 1991-12-12 | Zymogenetics, Inc. | Barrier protease |
US5281520A (en) * | 1990-09-12 | 1994-01-25 | Zymogenetics, Inc. | Method for producing acyloxyacyl hydrolase |
WO1997039130A2 (en) * | 1996-04-18 | 1997-10-23 | North Carolina State University | Method for expressing and secreting keratinase |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5951300A (ja) * | 1982-04-15 | 1984-03-24 | ジエネンテツク・インコーポレイテツド | ヒトウロキナ−ゼ |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4546082A (en) * | 1982-06-17 | 1985-10-08 | Regents Of The Univ. Of California | E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins |
US4613572A (en) * | 1983-08-15 | 1986-09-23 | Kansas State University Research Foundation | Yeast BAR1 gene plasmid |
HU206897B (en) * | 1985-10-25 | 1993-01-28 | Zymogenetics Inc | Process for utilizing bar-1 gen for selecting strange proteins |
RU2091490C1 (ru) * | 1985-10-25 | 1997-09-27 | Зимодженетикс, Инк. | Способ получения гетерологичного полипептида в эукариотических микроорганизмов |
-
1988
- 1988-10-03 AU AU23340/88A patent/AU2334088A/en not_active Abandoned
- 1988-10-03 CA CA000579704A patent/CA1314830C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-10-03 EP EP19880116335 patent/EP0310137B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-03 JP JP63249710A patent/JP2730923B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1988-10-03 DK DK555488A patent/DK555488A/da not_active Application Discontinuation
- 1988-10-03 DE DE19883887425 patent/DE3887425T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-10-03 ES ES88116335T patent/ES2061585T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-03 FI FI884550A patent/FI96121C/fi not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-04-16 AU AU14987/92A patent/AU660172B2/en not_active Ceased
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5951300A (ja) * | 1982-04-15 | 1984-03-24 | ジエネンテツク・インコーポレイテツド | ヒトウロキナ−ゼ |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009102321A (ja) * | 1996-09-13 | 2009-05-14 | Transkaryotic Therapies Inc | α−ガラクトシダーゼA欠損症の治療 |
JP2012019793A (ja) * | 1996-09-13 | 2012-02-02 | Shire Human Genetic Therapies Inc | α−ガラクトシダーゼA欠損症の治療 |
JP2015044830A (ja) * | 1996-09-13 | 2015-03-12 | シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド | α−ガラクトシダーゼA欠損症の治療 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES2061585T3 (es) | 1994-12-16 |
FI884550A (fi) | 1989-04-03 |
FI96121B (fi) | 1996-01-31 |
EP0310137B1 (en) | 1994-01-26 |
AU660172B2 (en) | 1995-06-15 |
DK555488A (da) | 1989-06-14 |
FI96121C (fi) | 1996-05-10 |
DE3887425D1 (de) | 1994-03-10 |
AU2334088A (en) | 1989-05-18 |
AU1498792A (en) | 1993-01-21 |
DK555488D0 (da) | 1988-10-03 |
FI884550A0 (fi) | 1988-10-03 |
JP2730923B2 (ja) | 1998-03-25 |
EP0310137A2 (en) | 1989-04-05 |
CA1314830C (en) | 1993-03-23 |
DE3887425T2 (de) | 1994-06-23 |
EP0310137A3 (en) | 1990-06-06 |
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