JPH0215826B2 - - Google Patents
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Description
本発明は新規なリン酸モノエステルに関するも
のである。さらに詳しくは、アルカリ性ホスフア
ターゼの作用により加水分解されたアゾ色素を放
出する新規なモノ−4−アリールアゾアリールリ
ン酸エステルに関するものである。 人の体液中のアルカリ性ホスフアターゼの活性
を知ることは臨床検査上極めて重要である。すな
わち、一般にアルカリ性ホスフアターゼの活性が
高い時は、肝臓、骨等の新陳代謝が不順な状態に
あり、肝臓病、くる病、骨肉腫、甲状腔異常など
の症状が現われることはよく知られている。従つ
てアルカリ性ホスフアターゼの活性を測定するた
めの種々の方法が考え出されていることは極めて
当然なことである。 日常の臨床検査におけるアルカリ性ホスフアタ
ーゼ定量法としては操作が簡単でしかも再現性の
良いことが必要であるが、この目的にはいわゆる
比色法とケイ光法とがある。 すなわち、比色法とは、アルカリ性ホスフアタ
ーゼの作用によつて加水分解されて色素あるいは
色素の前駆体を放出する化合物を酵素反応の基質
として用い、酵素反応の結果放出される色素を比
色定量することにより、あるいは酵素反応の結果
放出される色素前駆体を、試薬を加えて化学反応
させて色素に変え、その色素を比色定量すること
によりアルカリ性ホスフアターゼの活性度を知る
方法であり、広く普及している比色計あるいは分
光光度計を用いて定量できるという利点がある。
一方ケイ光法とは、アルカリ性ホスフアターゼの
作用によつて加水分解されて、発ケイ光物質を放
出する化合物の酵素反応の基質として用い、酵素
反応の結果放出される発ケイ光物質のケイ光強度
を測定することによりアルカリ性ホスフアターゼ
の活性度を知る方法であり、比色法に比べて感度
が高い微量の共存する発ケイ光物質による妨害を
受けやすいことおよびケイ光光度計があまり普及
していないという難点がある。 本発明は比色法によるアルカリ性ホスフアター
ゼの定量法において好適な基質となる新規化合物
モノー4−アリールアゾアリールリン酸エステル
に関するものである。 従来、比色法によるアルカリ性ホスフアターゼ
の定量法として次の方法が用いられていた。 (1) p−ニトロフエニルリン酸二ナトリウムを基
質として用い、アルカリ性ホスフアターゼの作
用による加水分解の結果放出されるp−ニトロ
フエノールを比色定量する方法であり、具体的
方法についてはO.A.Bessey、O.H.Lowry、お
よびM.J.Brock著、Journal of Biological
Chemistry誌第164巻、321頁(1946年発行)に
記載されている。 (2) リン酸フエノールフタレインを基質として用
い、アルカリ性ホスフアターゼの作用による加
水分解の結果放出されるフエノールフタレイン
を比色定量する方法であり、具体的にはA.L.
Babson、S.J.Greeley、C.M.Coleman、および
G.E.Phillips著、Clinical Chemisty誌、第12
巻、482頁(1966年発行)に記載されている。 (3) リン酸チモールフタレインを基質として用
い、アルカリ性ホスフアターゼの作用による加
水分解の結果放出されるチモールフタレインを
比色定量する方法であり、具体例はC.M.
Colemann Clinal Chemistry誌、第13巻、401
頁(1966年発行)に記載されている。 (4) チモールブルーモノホスフエイトを基質とし
て用い、アルカリ性ホスフアターゼの作用によ
る加水分解の結果放出されるチモールブルーを
比色定量する方法であり、具体例は特開昭51−
136662号に記載されている。 (5) フエニルリン酸を基質として用い、アルカリ
性ホスフアターゼの作用による加水分解の結果
放出されるフエノールを、赤血塩の存在下で4
−アミノアンチピリンと酸化縮合させ、生じた
赤色キノンを比色定量する方法で、具体例とし
ては、P.R.N.Kind、およびE.J.king著、
Clinical Pathology誌、第7巻、322頁(1954
年発行);渡辺賢誠ほか著、「臨床病理」誌、第
15巻、708頁(1967年発行〕中山年正ほか著
「臨床病理」誌、第23巻(総会補冊)85頁
(1975年発行)に記載されている。 以上に述べた従来法のうち(1)の方法はアルカリ
性ホスフアターゼの定量法として最も広く用いら
れているが、比色波長が410nmであるため血清
中のビリルビンやヘモグロビンなどの有色物によ
る妨害を免れず、検体盲検が必要となり、それだ
け操作が繁雑になる欠点があつた。従来法(2)〜(5)
の方法においては、比色波長がさらに長波領域に
あるためこの欠点は一応克服されている。しかし
ながら、フタレイン類のモノリン酸エステルを基
質とする(2)、(3)および(4)の方法においては純度の
高い基質を合成することが難しい。つまり、これ
らのモノリン酸エステルは対応するフタレインを
分子中の1個の水酸基をオキシ塩化リンと反応さ
せて得られるフタレインのモノホスホロジクロリ
デートを加水分解して合成するが、フタレインに
対するオキシ塩化リンの量が多いとフタレイン分
子中の2個の水酸基がホスホリン化されてしま
い、またフタレインに対するオキシ塩化リンの量
が少ないとオキシ塩化リン1分子に対してフタレ
インが2分子あるいは3分子反応するので生成物
が2種あるいは3種も生成してしまう。いずれの
場合にもアルカリ性ホスフアターゼの定量用基質
として不適当な化合物が副生する。したがつて反
応後の単離精製が繁雑になり、純度の高い生成物
を多く手に入れることが困難であつた。一方、従
来法(5)の方法においてはフエノールを遊離させる
酵素反応と発色反応との2段階の反応過程を経る
ことが必要であるため操作もそれだけ繁雑であつ
た。このため以上のような欠点のないアルカリ性
ホスフアターゼ定量法の出現が望まれていた。 したがつて、本発明の目的は測定の際の操作性
に優れ、かつ血中の色素等の有色物による妨害を
受け難く、検出感度も優れ、しかも合成および精
製に難点のないアルカリ性ホスフアターゼ定量用
基質として有用な新規化合物及びそれを用いたア
ルカリ性ホスフアターゼの定量方法を提供するこ
とである。 上記の目的は、下記の一般式()または
()で示される新規なモノ−4−アリールアゾ
アリールリン酸エステルによつて効果的に達成さ
れ得ることを見出した。 (式中、Mは水素原子、ナトリウム原子またはカ
リウム原子であり、R1とR2の一方はメチルスル
ホニル基、R1とR2の他方はニトロ基であり、R3
は塩素原子または水素原子、R4は水素原子、ヒ
ドロキシル基、メチル基またはメチルカルボニル
アミノ基であり、R5は水素原子または塩素原子
であり、R6はメチル基または3−スルフアモイ
ルフエニル基である。) 一般式()または()で表わされる化合物
はいずれもアルカリ性ホスフアターゼの作用によ
つてアルカリ性ホスフアターゼの活性に比例した
速度で加水分解されて対応するアゾ色素を放出す
るため、アルカリ性ホスフアターゼの定量用基質
として用いることができる。 特に一般式()においてR4及びR5が水素原
子である化合物は、原料が入手し易く、また、酵
素反応の結果放出される色素の可視吸収スペクト
ルの吸収極大波長が大きくしかも分子吸光係数が
大きいので好ましい。 次に、上記一般式()または()で表わさ
れる化合物の具体例を示すが、本発明の範囲はこ
れらの化合物のみに限定されるものではない。 化合物1: 化合物2:化合物1においてNaのかわりにKと
なつた化合物 化合物3: 化合物4:化合物3においてNaのかわりにKと
なつた化合物 化合物5: 化合物6:化合物5においてNaのかわりにKと
なつた化合物 化合物7: 化合物8: 化合物9: 化合物10: 化合物11: 化合物12: 次に上記一般式()または()で表わされ
る化合物の合成法について述べる。ここで反応 式中、Aが
のである。さらに詳しくは、アルカリ性ホスフア
ターゼの作用により加水分解されたアゾ色素を放
出する新規なモノ−4−アリールアゾアリールリ
ン酸エステルに関するものである。 人の体液中のアルカリ性ホスフアターゼの活性
を知ることは臨床検査上極めて重要である。すな
わち、一般にアルカリ性ホスフアターゼの活性が
高い時は、肝臓、骨等の新陳代謝が不順な状態に
あり、肝臓病、くる病、骨肉腫、甲状腔異常など
の症状が現われることはよく知られている。従つ
てアルカリ性ホスフアターゼの活性を測定するた
めの種々の方法が考え出されていることは極めて
当然なことである。 日常の臨床検査におけるアルカリ性ホスフアタ
ーゼ定量法としては操作が簡単でしかも再現性の
良いことが必要であるが、この目的にはいわゆる
比色法とケイ光法とがある。 すなわち、比色法とは、アルカリ性ホスフアタ
ーゼの作用によつて加水分解されて色素あるいは
色素の前駆体を放出する化合物を酵素反応の基質
として用い、酵素反応の結果放出される色素を比
色定量することにより、あるいは酵素反応の結果
放出される色素前駆体を、試薬を加えて化学反応
させて色素に変え、その色素を比色定量すること
によりアルカリ性ホスフアターゼの活性度を知る
方法であり、広く普及している比色計あるいは分
光光度計を用いて定量できるという利点がある。
一方ケイ光法とは、アルカリ性ホスフアターゼの
作用によつて加水分解されて、発ケイ光物質を放
出する化合物の酵素反応の基質として用い、酵素
反応の結果放出される発ケイ光物質のケイ光強度
を測定することによりアルカリ性ホスフアターゼ
の活性度を知る方法であり、比色法に比べて感度
が高い微量の共存する発ケイ光物質による妨害を
受けやすいことおよびケイ光光度計があまり普及
していないという難点がある。 本発明は比色法によるアルカリ性ホスフアター
ゼの定量法において好適な基質となる新規化合物
モノー4−アリールアゾアリールリン酸エステル
に関するものである。 従来、比色法によるアルカリ性ホスフアターゼ
の定量法として次の方法が用いられていた。 (1) p−ニトロフエニルリン酸二ナトリウムを基
質として用い、アルカリ性ホスフアターゼの作
用による加水分解の結果放出されるp−ニトロ
フエノールを比色定量する方法であり、具体的
方法についてはO.A.Bessey、O.H.Lowry、お
よびM.J.Brock著、Journal of Biological
Chemistry誌第164巻、321頁(1946年発行)に
記載されている。 (2) リン酸フエノールフタレインを基質として用
い、アルカリ性ホスフアターゼの作用による加
水分解の結果放出されるフエノールフタレイン
を比色定量する方法であり、具体的にはA.L.
Babson、S.J.Greeley、C.M.Coleman、および
G.E.Phillips著、Clinical Chemisty誌、第12
巻、482頁(1966年発行)に記載されている。 (3) リン酸チモールフタレインを基質として用
い、アルカリ性ホスフアターゼの作用による加
水分解の結果放出されるチモールフタレインを
比色定量する方法であり、具体例はC.M.
Colemann Clinal Chemistry誌、第13巻、401
頁(1966年発行)に記載されている。 (4) チモールブルーモノホスフエイトを基質とし
て用い、アルカリ性ホスフアターゼの作用によ
る加水分解の結果放出されるチモールブルーを
比色定量する方法であり、具体例は特開昭51−
136662号に記載されている。 (5) フエニルリン酸を基質として用い、アルカリ
性ホスフアターゼの作用による加水分解の結果
放出されるフエノールを、赤血塩の存在下で4
−アミノアンチピリンと酸化縮合させ、生じた
赤色キノンを比色定量する方法で、具体例とし
ては、P.R.N.Kind、およびE.J.king著、
Clinical Pathology誌、第7巻、322頁(1954
年発行);渡辺賢誠ほか著、「臨床病理」誌、第
15巻、708頁(1967年発行〕中山年正ほか著
「臨床病理」誌、第23巻(総会補冊)85頁
(1975年発行)に記載されている。 以上に述べた従来法のうち(1)の方法はアルカリ
性ホスフアターゼの定量法として最も広く用いら
れているが、比色波長が410nmであるため血清
中のビリルビンやヘモグロビンなどの有色物によ
る妨害を免れず、検体盲検が必要となり、それだ
け操作が繁雑になる欠点があつた。従来法(2)〜(5)
の方法においては、比色波長がさらに長波領域に
あるためこの欠点は一応克服されている。しかし
ながら、フタレイン類のモノリン酸エステルを基
質とする(2)、(3)および(4)の方法においては純度の
高い基質を合成することが難しい。つまり、これ
らのモノリン酸エステルは対応するフタレインを
分子中の1個の水酸基をオキシ塩化リンと反応さ
せて得られるフタレインのモノホスホロジクロリ
デートを加水分解して合成するが、フタレインに
対するオキシ塩化リンの量が多いとフタレイン分
子中の2個の水酸基がホスホリン化されてしま
い、またフタレインに対するオキシ塩化リンの量
が少ないとオキシ塩化リン1分子に対してフタレ
インが2分子あるいは3分子反応するので生成物
が2種あるいは3種も生成してしまう。いずれの
場合にもアルカリ性ホスフアターゼの定量用基質
として不適当な化合物が副生する。したがつて反
応後の単離精製が繁雑になり、純度の高い生成物
を多く手に入れることが困難であつた。一方、従
来法(5)の方法においてはフエノールを遊離させる
酵素反応と発色反応との2段階の反応過程を経る
ことが必要であるため操作もそれだけ繁雑であつ
た。このため以上のような欠点のないアルカリ性
ホスフアターゼ定量法の出現が望まれていた。 したがつて、本発明の目的は測定の際の操作性
に優れ、かつ血中の色素等の有色物による妨害を
受け難く、検出感度も優れ、しかも合成および精
製に難点のないアルカリ性ホスフアターゼ定量用
基質として有用な新規化合物及びそれを用いたア
ルカリ性ホスフアターゼの定量方法を提供するこ
とである。 上記の目的は、下記の一般式()または
()で示される新規なモノ−4−アリールアゾ
アリールリン酸エステルによつて効果的に達成さ
れ得ることを見出した。 (式中、Mは水素原子、ナトリウム原子またはカ
リウム原子であり、R1とR2の一方はメチルスル
ホニル基、R1とR2の他方はニトロ基であり、R3
は塩素原子または水素原子、R4は水素原子、ヒ
ドロキシル基、メチル基またはメチルカルボニル
アミノ基であり、R5は水素原子または塩素原子
であり、R6はメチル基または3−スルフアモイ
ルフエニル基である。) 一般式()または()で表わされる化合物
はいずれもアルカリ性ホスフアターゼの作用によ
つてアルカリ性ホスフアターゼの活性に比例した
速度で加水分解されて対応するアゾ色素を放出す
るため、アルカリ性ホスフアターゼの定量用基質
として用いることができる。 特に一般式()においてR4及びR5が水素原
子である化合物は、原料が入手し易く、また、酵
素反応の結果放出される色素の可視吸収スペクト
ルの吸収極大波長が大きくしかも分子吸光係数が
大きいので好ましい。 次に、上記一般式()または()で表わさ
れる化合物の具体例を示すが、本発明の範囲はこ
れらの化合物のみに限定されるものではない。 化合物1: 化合物2:化合物1においてNaのかわりにKと
なつた化合物 化合物3: 化合物4:化合物3においてNaのかわりにKと
なつた化合物 化合物5: 化合物6:化合物5においてNaのかわりにKと
なつた化合物 化合物7: 化合物8: 化合物9: 化合物10: 化合物11: 化合物12: 次に上記一般式()または()で表わされ
る化合物の合成法について述べる。ここで反応 式中、Aが
【式】のとき、
Bは
【式】であり、
Aが
【式】のとき、
Bは
【式】である。
まず、芳香族アミンA−NH2()とフエノー
ル誘導体H−B−OHとを常法によりジアゾカツ
プリングさせてアゾ色素(A−N=N−B−
OH)()を合成する。なお、Aに強い電子吸
引性基であるメチルスルホニル基とニトロ基が存
在するため、ジアゾ化によつて生じるジアゾニウ
ム塩を合成するにあたつてはいわゆるニトロシル
硫酸法(たとえばS.R.SandlerおよびW.karo著
〔Organic Functional Group Preparations」第
2巻、295頁(1971年Academic Press発行)に
具体例が記載されている。)を用いることが好ま
しい。 A−NH2 ()ジアゾ化 ――――→ A−N2 + H−B−OH ――――――→ A−N=N−B−OH () 次いでピリジンの存在下にアゾ色素()を大
過剰のオキシ塩化リンと反応させてホスホロジク
ロリデート(V)とした後、(V)を水と反応さ
せてリン酸モノエステル(I′)とする。 ()より()を得る反応においては、()
の3倍モル以上、好ましくは3倍ないし10倍モル
のオキシ塩化リンをアセトン、トリメチルリン酸
あるいはアセトンとトリメチルリン酸との混合溶
媒にて2ないし50倍、好ましくは5〜10倍に希釈
した溶液に−15℃ないし10℃、好ましくは−10℃
ないし0℃で、()をピリジン、ピリジンを含
むアセトン、ピリジンを含むトリメチルリン酸、
あるいはピリジンを含むアセトンとトリメチルリ
ン酸との混合溶媒に溶かした溶液を滴下すること
により、ほとんど副生成物を生じることなく
()を()へ変換することができることを見
出した。なおピリジンの代りに、トリエチルアミ
ン等のピリジンより塩基性の強い3級アミン
()の溶液に加えてもさしつかえない。()の
生成はシリカゲル薄層クロマトグラフイーにおい
て()よりもRf値の小さいスポツトが出現す
ることによつて確認できる。従来たとえばp−ニ
トロフエニルホスホロジクロリデートのごときア
リールホスホロジクロリデートはオキシ塩化リン
とフエノールとを塩化カリウムなどの存在下に加
熱還流することにより合成されていた。 その具体例は、たとえば向山および橋本著、
Bulletin of the Chemical Society of Japan
誌、第44巻、196頁(1971年発行)に記載されて
いる。 しかしこのような激しい条件下では、上記化合
物()は効率よく生成しなかつた。 ()を(I′)へ交換する際には、()を単
離せずに反応液に水を加えればよい。ただし酸性
条件下では(I′)が分解することがあるから
()と水との反応に際しては発生する塩化水素
を捕捉し得るピリジン等の三級アミンを加えるか
酢酸エチルなどの水に不溶な溶媒を共存させて水
−油の2層系とすることによつて好ましい結果が
得られることがある。 こうして得た(I′)に濃い水酸化ナトリウムあ
るいは水酸化カリウムの水溶液を加えて溶解しPH
を約10に調節した後不溶部を濾去して得た溶液を
その約10〜20倍容のエタノール中に撹拌しつつ滴
下することによつて()または()の結晶を
得ることができる。 こうして得た化合物()または()を少量
の水の溶かした後、エタノール中に注入して晶析
することにより精製を行なうことができる。 なおこの方法によつて得た結晶には、1分子あ
たり数分子の結晶水を含むことが多い。 以上のようにして合成した上記一般式()ま
たは()で表わされる本発明の化合物はアルカ
リ性ホスフアターゼ定量用基質として優れてい
る。すなわち上記一般式()または()で表
わされる化合物は、(1)アルカリ性ホスフアターゼ
の作用によつて、アルカリ性ホスフアターゼの活
性度に比例した速度て加水分解されてアゾフエノ
ール色素を与え、(2)これらの色素は、従来広く行
なわれてきたp−ニトロフエニルリン酸ナトリウ
ムを基質として用いる方法における呈色色素であ
るp−ニトロフエノールよりも長波長側に可視光
吸収極大を有するので、それだけ血中色素等の有
色物質による妨害を受け難く、(3)かつこれらの色
素は水溶性であるため、酵素活性測定中に凝集や
沈澱を起こすことがなく、したがつてアルカリ性
ホスフアターゼ定量用基質として使用した場合、
定量試験条件設定の自由度が高く、(4)しかも合成
例に示す通り合成に難点がなく、本明細書の冒頭
に述べたとおりリン酸フタレイン、リン酸チモー
ルフタレイン、あるいはチモールブルーモノホス
フエイトの合成においては化合物の単離精製操作
が繁雑であるのとは対照的に、通常の晶析によつ
て精製できる。 本発明の化合物を用いてアルカリ性ホスフアタ
ーゼを定量するには、Bessey−Lowry法
(Journal of Biological Chemistry誌、第164巻、
321頁、1946年発行に記載されている。)における
p−ニトロフエニルリン酸二ナトリウムのかわり
に本発明の化合物を用い、Bessey−Lowry法に
おいて酵素反応の結果生じるp−ニトロフエノー
ルの量を求めるかわりに本発明の化合物から生じ
るアゾ色素A−N=N−B−OHの量を求めれば
よい。 例えば、まず、一般式()または()にて
示される化合物をPH10前後の緩衝液に溶解し基質
液を調製する。このとき、基質液に、酵素活性化
剤(例えば塩化マグネシウム)などを添加すると
好ましい。次に、この基質液に、被測定物である
アルカリ性ホスフアターゼを含有する液を添加し
反応を行なわしめる。このとき、一般式()ま
たは()で示される化合物は、基質液中に、1
〜20ミリモル/の濃度で存在しているのが好ま
しい。 また、一般式()または()で示される化
合物は、アルカリ性ホスフアターゼに対して、大
過剰に、すなわちモル比では10倍以上存在してい
ることが好ましい。上記反応は、10〜50℃より好
ましくは30〜40℃の温度にて、10〜60分間の時間
にて行なわれる。次に、必要に応じて、溶液のPH
を塩基または酸を添加して上げたり、下げたり、
場合によつては、DMF(ジメチルホルムアルド)、
メチルセロソルブ等の有機溶剤を添加してこの反
応を停止させこのときの生成したアゾ色素の濃度
を分光光度計などによつて濃度測定することによ
つて、必要により、検量線からアルカリ性ホスフ
アターゼを定量する。 比色波長は当該色素の吸収極大波長付近に設定
すればよいが、比色の際にシクロデキストリン類
好ましくはα−シクロデキストリンを添加するこ
とにより吸収極大波長を長波側へシフトさせるこ
とも可能である。 このとき、シクロデキストリン類の添加量は、
比色液1ml当り0.1mgないし20mgないし、好まし
くは1mgないし10mgである。 次に、本発明の一般式()または()で表
わされる化合物のうち代表的なものについて合成
例を示す。下記の化合物以外のものについても前
述の合成法に基づき、また下記の記載に順じて容
易に合成することができる。 合成例:化合物3の合成 オキシ塩化リン4mlとアセトン20mlとを混合し
−8℃に冷却した。この溶液に、4−(2−メタ
ンスルホニル−4−ニトロフエニルアゾ)フエノ
ール2gをアセトン20ml、トリメチルリン酸10
ml、ピリジン8ml、およびトリエチルアミン0.5
mlに溶かした溶液を25分間にわたつて滴下した。
この間、反応液の温度が0℃を越えぬように外部
から冷却した。さらに30分間0℃以下で撹拌を続
けた後、30mlの水を滴下した。室温で10分間撹拌
した後、200mlの飽和食塩水と氷との混合物中に
注入し、生じた結晶を濾取した。この結晶に1規
定の水酸化ナトリウム水溶液20mlを加えPHを約10
とした。不溶部を濾却した後、濾液をエタノール
150ml中に注入し、生じた結晶を濾取しエタノー
ルで洗浄し、減圧下に乾燥した。 収量2g、λ0.02N-NaOH nax382nm 次に、本発明について、代表的な化合物につい
て、実施例に基づき具体的に説明する。しかしな
がら、本発明は、下記の実施例にのみ限定される
ものではない。 実施例 1 基質液の調製:化合物3の結晶35.05mgを10ml
のグリシン緩衝液(PH10、0.5mmol/の塩化マ
グネシウムを含む)に溶かした。 酵素液の調製:シグマケミカル社アルカリ性ホ
スフアターゼTypeI約6mgを20mlの蒸留水に溶か
した液および、この液を2倍および4倍に希釈し
た液を3種類調製した。 操作:基質液1mlを試験管に入れ37℃に3分間
加温した。酵素液0.1mlを加え、37℃で30分間加
温し反応させた後0.02規定の水酸化ナトリウム水
溶液10mlを加えて反応を停止した。酵素液のかわ
りに蒸留水を用いる点を除いて全く同様に処理し
た盲検液を対照として520nmで吸光度(ΔOD)
を測定した。このようにして、濃度の異なつた3
種類の酵素液について各々測定を行なつた。これ
らと同じ酵素液についてBessey−Lowry法を適
用した場合の410nmにおける盲検液を対照とし
た吸光度(ΔOD)を測定した。 なおBessey−Lowry法の操作は上記化合物3
の結晶35.05mgのかわりにp−ニトロフエニルリ
ン酸ナトリウム20mgを用いて410nmで比色する
他は上記の操作と全く同様である。 これら2つの方法によるΔODの値の関係を第
1図に示した。 この第1図から次のことが明らかとなつた。 (1) 酵素濃度に比例して、すなわちBessey−
Lowry法による値に比例してΔODが変化する
のでΔODの値から酵素の活性を求めることが
できる。 (2) 化合物3を基質とした場合のΔODはBessey
−Lowry法の△ODより大きな割合で変化して
いるので(直線の勾配が1以上)、化合物3を
基質とした場合のほうがBessey−Lowry法よ
り感度が高い。 (3) 化合物3を基質とした場合には520nmで比
色できるので、410nmで比色するBessey−
Lowry法より、血中の色素などの有色物質に
よる妨害を受け難い。 このように本発明の化合物は、アルカリ性ホス
フアターゼの定量用基質として好適な化合物であ
ることがわかる。 実施例 2 実施例1の化合物3の結晶35.05mgのかわりに
48.18mgの化合物12の結晶を用い、吸光度の測定
を520nmではなく644nmで行なう他は実施例1
と同様の操作を行なつた場合の結果を第2図に示
した。この第2図から次のことが明らかである。 (1) 酵素濃度に比例して、すなわちBessey−
Lowry法による値に比例してΔODが変化する
のでΔODの値から酵素の活性を求めることが
できる。 (2) 化合物12を基質とした場合には644nmで比
色できるので、410nmで比色するBessey−
Lowry法より血中の色素などの有色物質に妨
害を受け難い。 このように本発明の化合物は、アルカリ性ホス
フアターゼの定量用基質として好適な化合物であ
ることがわかる。
ル誘導体H−B−OHとを常法によりジアゾカツ
プリングさせてアゾ色素(A−N=N−B−
OH)()を合成する。なお、Aに強い電子吸
引性基であるメチルスルホニル基とニトロ基が存
在するため、ジアゾ化によつて生じるジアゾニウ
ム塩を合成するにあたつてはいわゆるニトロシル
硫酸法(たとえばS.R.SandlerおよびW.karo著
〔Organic Functional Group Preparations」第
2巻、295頁(1971年Academic Press発行)に
具体例が記載されている。)を用いることが好ま
しい。 A−NH2 ()ジアゾ化 ――――→ A−N2 + H−B−OH ――――――→ A−N=N−B−OH () 次いでピリジンの存在下にアゾ色素()を大
過剰のオキシ塩化リンと反応させてホスホロジク
ロリデート(V)とした後、(V)を水と反応さ
せてリン酸モノエステル(I′)とする。 ()より()を得る反応においては、()
の3倍モル以上、好ましくは3倍ないし10倍モル
のオキシ塩化リンをアセトン、トリメチルリン酸
あるいはアセトンとトリメチルリン酸との混合溶
媒にて2ないし50倍、好ましくは5〜10倍に希釈
した溶液に−15℃ないし10℃、好ましくは−10℃
ないし0℃で、()をピリジン、ピリジンを含
むアセトン、ピリジンを含むトリメチルリン酸、
あるいはピリジンを含むアセトンとトリメチルリ
ン酸との混合溶媒に溶かした溶液を滴下すること
により、ほとんど副生成物を生じることなく
()を()へ変換することができることを見
出した。なおピリジンの代りに、トリエチルアミ
ン等のピリジンより塩基性の強い3級アミン
()の溶液に加えてもさしつかえない。()の
生成はシリカゲル薄層クロマトグラフイーにおい
て()よりもRf値の小さいスポツトが出現す
ることによつて確認できる。従来たとえばp−ニ
トロフエニルホスホロジクロリデートのごときア
リールホスホロジクロリデートはオキシ塩化リン
とフエノールとを塩化カリウムなどの存在下に加
熱還流することにより合成されていた。 その具体例は、たとえば向山および橋本著、
Bulletin of the Chemical Society of Japan
誌、第44巻、196頁(1971年発行)に記載されて
いる。 しかしこのような激しい条件下では、上記化合
物()は効率よく生成しなかつた。 ()を(I′)へ交換する際には、()を単
離せずに反応液に水を加えればよい。ただし酸性
条件下では(I′)が分解することがあるから
()と水との反応に際しては発生する塩化水素
を捕捉し得るピリジン等の三級アミンを加えるか
酢酸エチルなどの水に不溶な溶媒を共存させて水
−油の2層系とすることによつて好ましい結果が
得られることがある。 こうして得た(I′)に濃い水酸化ナトリウムあ
るいは水酸化カリウムの水溶液を加えて溶解しPH
を約10に調節した後不溶部を濾去して得た溶液を
その約10〜20倍容のエタノール中に撹拌しつつ滴
下することによつて()または()の結晶を
得ることができる。 こうして得た化合物()または()を少量
の水の溶かした後、エタノール中に注入して晶析
することにより精製を行なうことができる。 なおこの方法によつて得た結晶には、1分子あ
たり数分子の結晶水を含むことが多い。 以上のようにして合成した上記一般式()ま
たは()で表わされる本発明の化合物はアルカ
リ性ホスフアターゼ定量用基質として優れてい
る。すなわち上記一般式()または()で表
わされる化合物は、(1)アルカリ性ホスフアターゼ
の作用によつて、アルカリ性ホスフアターゼの活
性度に比例した速度て加水分解されてアゾフエノ
ール色素を与え、(2)これらの色素は、従来広く行
なわれてきたp−ニトロフエニルリン酸ナトリウ
ムを基質として用いる方法における呈色色素であ
るp−ニトロフエノールよりも長波長側に可視光
吸収極大を有するので、それだけ血中色素等の有
色物質による妨害を受け難く、(3)かつこれらの色
素は水溶性であるため、酵素活性測定中に凝集や
沈澱を起こすことがなく、したがつてアルカリ性
ホスフアターゼ定量用基質として使用した場合、
定量試験条件設定の自由度が高く、(4)しかも合成
例に示す通り合成に難点がなく、本明細書の冒頭
に述べたとおりリン酸フタレイン、リン酸チモー
ルフタレイン、あるいはチモールブルーモノホス
フエイトの合成においては化合物の単離精製操作
が繁雑であるのとは対照的に、通常の晶析によつ
て精製できる。 本発明の化合物を用いてアルカリ性ホスフアタ
ーゼを定量するには、Bessey−Lowry法
(Journal of Biological Chemistry誌、第164巻、
321頁、1946年発行に記載されている。)における
p−ニトロフエニルリン酸二ナトリウムのかわり
に本発明の化合物を用い、Bessey−Lowry法に
おいて酵素反応の結果生じるp−ニトロフエノー
ルの量を求めるかわりに本発明の化合物から生じ
るアゾ色素A−N=N−B−OHの量を求めれば
よい。 例えば、まず、一般式()または()にて
示される化合物をPH10前後の緩衝液に溶解し基質
液を調製する。このとき、基質液に、酵素活性化
剤(例えば塩化マグネシウム)などを添加すると
好ましい。次に、この基質液に、被測定物である
アルカリ性ホスフアターゼを含有する液を添加し
反応を行なわしめる。このとき、一般式()ま
たは()で示される化合物は、基質液中に、1
〜20ミリモル/の濃度で存在しているのが好ま
しい。 また、一般式()または()で示される化
合物は、アルカリ性ホスフアターゼに対して、大
過剰に、すなわちモル比では10倍以上存在してい
ることが好ましい。上記反応は、10〜50℃より好
ましくは30〜40℃の温度にて、10〜60分間の時間
にて行なわれる。次に、必要に応じて、溶液のPH
を塩基または酸を添加して上げたり、下げたり、
場合によつては、DMF(ジメチルホルムアルド)、
メチルセロソルブ等の有機溶剤を添加してこの反
応を停止させこのときの生成したアゾ色素の濃度
を分光光度計などによつて濃度測定することによ
つて、必要により、検量線からアルカリ性ホスフ
アターゼを定量する。 比色波長は当該色素の吸収極大波長付近に設定
すればよいが、比色の際にシクロデキストリン類
好ましくはα−シクロデキストリンを添加するこ
とにより吸収極大波長を長波側へシフトさせるこ
とも可能である。 このとき、シクロデキストリン類の添加量は、
比色液1ml当り0.1mgないし20mgないし、好まし
くは1mgないし10mgである。 次に、本発明の一般式()または()で表
わされる化合物のうち代表的なものについて合成
例を示す。下記の化合物以外のものについても前
述の合成法に基づき、また下記の記載に順じて容
易に合成することができる。 合成例:化合物3の合成 オキシ塩化リン4mlとアセトン20mlとを混合し
−8℃に冷却した。この溶液に、4−(2−メタ
ンスルホニル−4−ニトロフエニルアゾ)フエノ
ール2gをアセトン20ml、トリメチルリン酸10
ml、ピリジン8ml、およびトリエチルアミン0.5
mlに溶かした溶液を25分間にわたつて滴下した。
この間、反応液の温度が0℃を越えぬように外部
から冷却した。さらに30分間0℃以下で撹拌を続
けた後、30mlの水を滴下した。室温で10分間撹拌
した後、200mlの飽和食塩水と氷との混合物中に
注入し、生じた結晶を濾取した。この結晶に1規
定の水酸化ナトリウム水溶液20mlを加えPHを約10
とした。不溶部を濾却した後、濾液をエタノール
150ml中に注入し、生じた結晶を濾取しエタノー
ルで洗浄し、減圧下に乾燥した。 収量2g、λ0.02N-NaOH nax382nm 次に、本発明について、代表的な化合物につい
て、実施例に基づき具体的に説明する。しかしな
がら、本発明は、下記の実施例にのみ限定される
ものではない。 実施例 1 基質液の調製:化合物3の結晶35.05mgを10ml
のグリシン緩衝液(PH10、0.5mmol/の塩化マ
グネシウムを含む)に溶かした。 酵素液の調製:シグマケミカル社アルカリ性ホ
スフアターゼTypeI約6mgを20mlの蒸留水に溶か
した液および、この液を2倍および4倍に希釈し
た液を3種類調製した。 操作:基質液1mlを試験管に入れ37℃に3分間
加温した。酵素液0.1mlを加え、37℃で30分間加
温し反応させた後0.02規定の水酸化ナトリウム水
溶液10mlを加えて反応を停止した。酵素液のかわ
りに蒸留水を用いる点を除いて全く同様に処理し
た盲検液を対照として520nmで吸光度(ΔOD)
を測定した。このようにして、濃度の異なつた3
種類の酵素液について各々測定を行なつた。これ
らと同じ酵素液についてBessey−Lowry法を適
用した場合の410nmにおける盲検液を対照とし
た吸光度(ΔOD)を測定した。 なおBessey−Lowry法の操作は上記化合物3
の結晶35.05mgのかわりにp−ニトロフエニルリ
ン酸ナトリウム20mgを用いて410nmで比色する
他は上記の操作と全く同様である。 これら2つの方法によるΔODの値の関係を第
1図に示した。 この第1図から次のことが明らかとなつた。 (1) 酵素濃度に比例して、すなわちBessey−
Lowry法による値に比例してΔODが変化する
のでΔODの値から酵素の活性を求めることが
できる。 (2) 化合物3を基質とした場合のΔODはBessey
−Lowry法の△ODより大きな割合で変化して
いるので(直線の勾配が1以上)、化合物3を
基質とした場合のほうがBessey−Lowry法よ
り感度が高い。 (3) 化合物3を基質とした場合には520nmで比
色できるので、410nmで比色するBessey−
Lowry法より、血中の色素などの有色物質に
よる妨害を受け難い。 このように本発明の化合物は、アルカリ性ホス
フアターゼの定量用基質として好適な化合物であ
ることがわかる。 実施例 2 実施例1の化合物3の結晶35.05mgのかわりに
48.18mgの化合物12の結晶を用い、吸光度の測定
を520nmではなく644nmで行なう他は実施例1
と同様の操作を行なつた場合の結果を第2図に示
した。この第2図から次のことが明らかである。 (1) 酵素濃度に比例して、すなわちBessey−
Lowry法による値に比例してΔODが変化する
のでΔODの値から酵素の活性を求めることが
できる。 (2) 化合物12を基質とした場合には644nmで比
色できるので、410nmで比色するBessey−
Lowry法より血中の色素などの有色物質に妨
害を受け難い。 このように本発明の化合物は、アルカリ性ホス
フアターゼの定量用基質として好適な化合物であ
ることがわかる。
第1図および第2図において、横軸はBessey
−Lowry法を用いた場合の吸光度(ΔOD)であ
り縦軸は本発明の化合物を基質として用いた場合
の吸光度(ΔOD)である。
−Lowry法を用いた場合の吸光度(ΔOD)であ
り縦軸は本発明の化合物を基質として用いた場合
の吸光度(ΔOD)である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 一般式()または()で表されるリン酸
エステル。 (式中、Mは水素原子、ナトリウム原子またはカ
リウム原子であり、R1とR2の一方はメチルスル
ホニル基、R1とR2の他方はニトロ基であり、R3
は塩素原子または水素原子、R4は水素原子、ヒ
ドロキシル基、メチル基またはメチルカルボニル
アミノ基であり、R5は水素原子または塩素原子
であり、R6はメチル基または3−スルフアモイ
ルフエニル基である。) 2 一般式()または()で表されるリン酸
エステルを基質として用いることを特徴とするア
ルカリ性ホスフアターゼの定量方法。 (式中、Mは水素原子、ナトリウム原子またはカ
リウム原子であり、R1とR2の一方はメチルスル
ホニル基、R1とR2の他方はニトロ基であり、R3
は塩素原子または水素原子、R4は水素原子、ヒ
ドロキシル基、メチル基またはメチルカルボニル
アミノ基であり、R5は水素原子または塩素原子
であり、R6はメチル基または3−スルフアモイ
ルフエニル基である。)
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP56044325A JPS57159499A (en) | 1981-03-26 | 1981-03-26 | Substrate for determining alkaline phosphatase and determining method |
DE198282102524T DE61731T1 (de) | 1981-03-26 | 1982-03-25 | Phosphorsaeureester und ein verfahren zur quantitativen analyse einer alkalischen phosphatase unter verwendung derselben als substrat. |
DE8282102524T DE3273981D1 (en) | 1981-03-26 | 1982-03-25 | Novel phosphoric ester and a method for quantitative analysis of an alkaline phosphatase using the same as a substrate |
EP82102524A EP0061731B2 (en) | 1981-03-26 | 1982-03-25 | Novel phosphoric ester and a method for quantitative analysis of an alkaline phosphatase using the same as a substrate |
US06/906,098 US4797476A (en) | 1981-03-26 | 1986-09-10 | Mono-4-arylazoaryl phosphoric esters |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP56044325A JPS57159499A (en) | 1981-03-26 | 1981-03-26 | Substrate for determining alkaline phosphatase and determining method |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP13381591A Division JPH07103134B2 (ja) | 1991-03-29 | 1991-03-29 | リン酸エステル |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS57159499A JPS57159499A (en) | 1982-10-01 |
JPH0215826B2 true JPH0215826B2 (ja) | 1990-04-13 |
Family
ID=12688339
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP56044325A Granted JPS57159499A (en) | 1981-03-26 | 1981-03-26 | Substrate for determining alkaline phosphatase and determining method |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4797476A (ja) |
EP (1) | EP0061731B2 (ja) |
JP (1) | JPS57159499A (ja) |
DE (2) | DE3273981D1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0647624A (ja) * | 1992-07-30 | 1994-02-22 | Mitsubishi Electric Corp | 放電加工装置 |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3732871A1 (de) * | 1987-09-30 | 1989-04-20 | Behringwerke Ag | Chromogene substrate |
JPH0731201B2 (ja) * | 1987-12-31 | 1995-04-10 | トロピックス・インコーポレーテッド | 化学発光による測定法 |
DE4406665A1 (de) * | 1994-03-01 | 1995-09-07 | Biosynth Ag | Enzymsubstrate mit 2-(2-Thiazolylazo)-p-kresol als chromogener Gruppe |
EP3111224B1 (en) * | 2014-02-24 | 2018-12-26 | Ventana Medical Systems, Inc. | Quinone methide analog signal amplification |
JP2016084421A (ja) * | 2014-10-27 | 2016-05-19 | 富士フイルム株式会社 | アゾ色素のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩及びその互変異性体、着色組成物、染色方法及び染色物 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL222189A (ja) * | 1956-11-07 | |||
US2959582A (en) * | 1957-07-26 | 1960-11-08 | Hoechst Ag | Azodyestuffs soluble in water |
US4051240A (en) * | 1972-07-07 | 1977-09-27 | Ciba-Geigy Corporation | O,s-dialkyl-o-(4-phenylazophenyl)-thiophosphates and pesticidal compositions thereof |
FR2206358B1 (ja) * | 1972-11-13 | 1975-11-07 | Ugine Kuhlmann | |
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