JPH02138991A - 低分子量ペプチド組成物およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ゛［産業上の利用分野］ 本発明は、蛋白質を酸素加水分解し、分解生酸物の分子
量分画により、原料蛋白質の抗原側を認めない、含有さ
れるペプチドの分子量が１０００以下、遊離アミノ酸含
有量が２０ｗ４％以下、芳香族アミノ酸含有量が全アミ
ノ酸量の１．０ｗ１％以下のペプチド組成物及びその製
造方法に関する。

［技術の背景及び従来技術］ 従来から、蛋白質の可溶化、消化吸収の有効性、食餌ア
レルギーの予防および治療、芳香族アミノ酸代謝異常の
治療及び栄養補給の目的で、ペプチド混合物あるいは、
アミノ酸混合物を製造することが行なわれてきた。しか
しながら、これら混合物は、各々の目的を満たすものの
、すべての目的を満たすものではなく、病気の合併等に
より上記すべての目的を満たすペプチド組成物が求めら
れてきた。

最近では、腸管吸収の面から、低分子量ペプチドが、蛋
白質栄養源として極めて有効であることが研究者等によ
り明らかにされてきた。又、遊離アミノ酸が腸管におけ
る浸透圧を高め、輸送糸の負担を引き起こし、栄養効率
を低下させることも明らかにされてきている（栄養と食
糧。

３１　、２４７（１９７８））。特公昭５７−４５５６
０．特公昭６２−５８７１３等では、一定の大きさ（分
子量５００〜１５００程度）のペプチド混合物の製造法
が示され、又その栄養効率の面で有用であることが示さ
れている。従って消化吸収及び栄養生理の面から、遊離
アミノ酸含有量が少なく、分子量を規定したペプチド組
成物が求められている。

又、先天的あるいは肝臓疾患により、芳香族アミノ酸の
代謝能力が低下あるいは停止し、脳内に芳香族アミノ酸
が蓄積することで生じる脳疾患に対しては従来、蓄積し
てしまうアミノ酸を除いたアミノ酸混合物あるいは、ペ
プチド混合物が供されてきた（ＪＪＰＥＮ、　　９　；
　３４３（１９Ｂ？）、化学と生物、　２５；　３３２
　（１９８７））。しかしながらこれらは、高い遊離ア
ミノ酸含有率を示したり、抗原性が減少していない等の
問題点を有していた。

又、最近、食餌蛋白質由来のアレルギー患者数が急増し
、全国社会福祉協議会全国保母金の調査（１９８８）に
よれば、乳児の８％程度が食餌蛋白質由来のアレルギー
をもつと報告している。

これら患者に対しては、特公昭５４−３６２３５で示さ
れるような、抗原性のない蛋白質分解物が供されている
。しかしながらこれらは、遊離アミノ酸含有率が高く、
浸透圧、風味、消化吸収あるいは、栄養生理面から問題
点を有していた。

又、フェニルアラニン、チロシン欠乏食が、腫瘍細胞の
増殖を著しく抑制し、特にフェニルアラニン、チロシン
欠乏食が、白血病患者治療食餌として著効のあることが
報告されている（栄養学雑誌、　２６．３９（１９６８
））。又、これらは病態栄養の特殊性から、抗原性がな
く吸収性のよいものが好ましくこれらの目的を満たす組
成物が求められていた。

［発明が解決しようとする問題点］ このように、従来作られてきた蛋白質分解物、あるいは
アミノ酸混合物は、さまざまな状況に応じて利用できる
ものの、その利用範囲は制限されており、全ての状況に
対応しうる低分子量ペプチド組成物の製造方法は今だ確
立されていない。

［発明の目的及び発明の要約］ 従って本発明の目的は、前記従来技術の欠点を改善し、
含まれるペプチドの分子量が、１０００以下で、抗原性
を認めず、遊離アミノ酸含有量が、２０ｗ１％以下で、
芳香族アミノ酸含有量が、全アミノ酸の１．　Ｏｗｊ％
以下である低分子量ペプチド組成物及びその製造方法を
提供することにある。

本発明者等は、蛋白質原料の芳香族アミノ酸の９０％以
上を遊離アミノ酸状態にすることで、原料蛋白質の抗原
性をかなり低減させることができることを見出し、パン
クレアチンとエキソペプチダーゼあるいは、パンクレア
チンと他のプロテアーゼとエキソペプチダーゼの複合酵
素系を用いることにより、原料蛋白質から９０％以上の
芳香族アミノ酸を遊離アミノ酸にまで分解し、抗原性を
著しく低減できることを見出した。

この酵素分解物を排除限界分子量１００００以下、好ま
しくは、１０００以下のゲル濾過剤を使用し、さらに好
ましくは、芳香族アミノ酸に吸着性を示す疎水性側鎖た
とえばカルボキシル基やブチル基、フェニル基あるいは
、疎水的部位をもつゲル担体を使用し、溶出液に水ある
いは、芳香族アミノ酸の吸着性を高める目的で２〜１５
％エタノール溶液を用い、カラム高１０〜３０ｃｍのカ
ラムで分画することにより、目的とする低分子量ペプチ
ド組成物を得る方法を完成した。

即ち、本発明は、原料蛋白質をパンクレアチンを主体と
する複合酵素系を用いて分解し、不溶性成分を除いた後
、ゲル濾過により、ペプチド部分を回収することで、遊
離アミノ酸含有量及び芳香族アミノ酸含有量を減少させ
、含まれるペプチドの分子量が、１０００以下で、抗原
性を認めず、遊離アミノ酸含有量が２０ｗ１％以下で、
芳香族アミノ酸含有量が２０ｗｔ％以下である低分子量
ペプチド組成物及びその製造方法である。

［本発明の詳細な説明］ 以下、本発明の技術構成について詳述する。

（１）酵素分解物の調製 １）　ｌ０ｗｔ％カゼイン溶液（Ｐｈ８．０）に、乳酸
菌抽出物、アスペルギルス属由来プロテアーゼ。

パンクレアチンをそれぞれ１０００活性単位ずつ混合し
た酵素溶液を蛋白質１ｇ当り３種の活性単位の和が３０
００単位となるように添加し５０℃で分解し、経時的に
分解度を測定し、ホルモール態窒素／全窒素（％）が２
０．３０．４２　Ｃ％）になった時点で９０°０５分間
加熱失活する。失活後、沈殿物がなくなるまで濾過し、
凍結乾燥する。この凍結乾燥品を以下、サンプルＡ。

Ｂ、Ｃとする。

２）　１０ｗ＋％乳清蛋白質溶液（ｐＨ７，０）に上記
方法の酵素を添加し、上記方法と同様にして分解度、３
２％、４２％の分解物を調製する。この凍結乾燥品を以
下、サンプルＥ、Ｆとする。

３）　１０ｗｔ％カゼイン溶液（ｐＨ８，０）に蛋白質
１ｇ当り１５００活性単位のパンクレアチンを連続的あ
るいは、段階的に３〜５時間に分割して添加し、２〜５
ｗ４％水酸化ナトリウムでｐ）１８．０に維持し、１５
時間分解後乳酸菌抽出物を蛋白質１ｇ当り１５００活性
単位添加し、さらに分解を継続し全体で２θ〜２４時間
分解し、９０℃５分間加熱失活する。失活後、沈殿物が
なくなるまで濾過し、凍結乾燥する。この凍結乾燥品を
以下、サンプルＤとする。

分解物の調製に用いた酵素は、特に限定したものではな
く、トリプシン、キモトリプシン、ズブチリシン、エラ
スターゼ、プロリン特異性プロテアーゼ、　５ｌａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓプロテアーゼ、パパイン、ペプシン
、サーモリシン等が利用できる。又、エキソペプチダー
ゼとして、カルボキシペプチダーゼＹ。

ＡｓｐｅＢｉｌｌｕｓプロテアーゼ、　　Ｓｌｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓプロテアーゼ、　Ｒｈ１ｘｏｐｕｓプロテ
アーゼ、乳酸菌プロテアーゼが利用できる。本実験に使
用した乳酸菌抽出物は、ラクトバチルス・ヘルベティカ
スを培養し、特公昭４８−４３８７８の方法により１ｇ
当り２００００活性単位を有する乳酸菌抽出物を得た。

又、分解に使用する酵素量は、蛋白質原料１ｇ当り３０
００〜５０００活性単位となるように、パンクレアチン
とエキソペプチダーゼあるいは、パンクレアチンと他の
プロテアーゼとエキソペプチダーゼを混合あるいは、分
けて添加する。

温度条件は、４０〜５５℃、又ｐＨ条件は、酵素添加前
に原料蛋白質が変性しない範囲で、最適ｐｉ（に調整し
、好ましくは少なくとも１時間そのｐＨを維持する。

（２）芳香族アミノ酸遊離率の測定 自動アミノ酸分析計により、全アミノ酸及び遊離アミノ
酸を分析した。

前期（１）において作成した、サンプルＡ〜Ｆのアミノ
酸分析の結果を表１に示した。

以　　下　　余　　白 表１に示されるように分解度の上昇に伴って芳香族アミ
ノ酸遊離率が上昇していることが分る。

（３）抗原性試験 前記（１）において作成したサンプルＡ−Ｆの抗原性は
、ＥＬＩＳＡ抑制試験により測定した。

Ｎｕｎｃ社製９６穴プレートを用い、原料蛋白質をコー
ティングし、洗浄後、ウサギ抗力ゼイン血清と各種分解
調製物との混合液を反応させ、洗浄後ＺＹｍｅｄ　Ｌａ
ｂｏｒａｌｏＢｅｓ製アルカリフォスファターゼ標識フ
ォウサギＩｇＧを反応さつ、洗浄後、酵素基質であるｐ
−ニトロフェニルリン酸ナトリウムを加え、３０分後に
５Ｎ水酸化ナトリウムで反応を停止させ、反応産物をマ
イクロプレートリーダーで測定した（日本小児アレルギ
ー学会誌、　　１　、３６　（１９８７）　）。

その結果を図１，２に示した。

図１は、原料蛋白質をカゼインとした時の芳香族アミノ
酸の遊離率と抗原性との関係を示している。○は原料蛋
白質であるカゼイン。

ムは芳香族アミノ酸の遊離率が３０．２％（サンプルＡ
）、△は５５，１％（サンプルＢ）、マは９０．８％（
サンプルＣ）９口は９１．７％（サンプルＤ）を示して
いる。

この図によれば、５０％の抑制のかかる調製物濃度は、
カゼインで１０８６　（μｇ／　ｍｌ　）　、サンプル
Ａで１０３（ｐｇ／　ｍｌ　）　、サンプルＢで１０５
（μｇ／ｍｌ）　、サンプルＣ，Ｄでは、最高濃度でも
５０％の抑制がかからなかった。つまり芳香族アミノ酸
が３０％遊離したものはカゼインの約１／４００に、５
５％のものが、約１／３００００に抗原性が低減し、９
０％以上では、抗原性が消失していた。

図２は、乳清蛋白質を原料蛋白質とした時の芳香族アミ
ノ酸の遊離率と抗原性との関係を示している。○は原料
蛋白質である乳清蛋白質を、△は芳香族アミノ酸の遊離
率が５６．１％（サンプルＥ）、マは９０゜７％（サン
プルＦ）を示している。

この図によれば、原料蛋白質がカゼインの場合と同様に
乳清蛋白質内の芳香族アミノ酸の遊離率が高まるにつれ
て抗原性が低下し、９０％以上の遊離率で抗原性が認め
られなくなることが明らかとなった。

（４）分画方法 前記（１）で得られた抗原性を認めず、芳香族アミノ酸
が９０％以上遊離したサンプルＣ及びサンプルＦを使用
し下記方法によりペプチド組成物を分画した。この時の
溶出グラフを図３と図４に示した。

図３は、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１５（ファルマシア製
）２Ｘ１１ｃＩｎカラムを使用し、前記（１）で得られ
たカゼイン酵素分解物（サンプルＣ）を２０ｗ４％に溶
解し、１ｍｌをアプライ後、０．７ｍｌ／分の流速で水
溶出させた時のグラフを示している。実線はペプチド結
合の吸収を示す２２０ｎｍにおける吸光度、点線は芳香
族環の吸収を示す２８０ｎｍにおける吸光度を示してい
る。溶出量１０〜２０　ｍｌまでをペプチド分画として
アミノ酸分析と抗原性試験を実施した。

芳香族アミノ酸含有量は全アミノ酸量の０．４ｗｊ％で
あった。又、遊離アミノ酸含有量は１７ｗｔ％であった
。抗原性試験では、使用したサンプルＣ同様認められな
かった。溶出量２０ｍ１以降の分画は、芳香族アミノ酸
含有量、遊離アミノ酸含有量が顕著に増加し、本発明組
成物は、溶出量２０　ｍｌまでに溶出されていることが
わかった。

図４は、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１０（ファルマシア製
）２Ｘ１１ｃｍカラムを使用し、前記（１）で得られた
乳清蛋白質酵素分解物（サンプルＦ）を２０ｗｔ％に溶
解し、１　ｍｌをアプライ後、０．７ｍｌ／分の流速で
１２％エタノール溶液で溶出させたた時のグラフを示し
ている。前記同様、実線は２２０ｎｍ、点線は２８０ｎ
ｍの吸光度を示している。溶出量１０〜２０　ｍｌまで
をペプチド分画としてアミノ酸分析と抗原性試験を実施
した。

その結果、芳香族アミノ酸含有量は全アミノ酸量の０．
５ｗｔ％であった。又遊離アミノ酸含有量は１８ｗｊ％
であった。抗原性試験では、使用したサンプルＦ同様認
められなかった。溶出量２０　ｍｌ以降の分画は芳香族
アミノ酸含有量、遊離アミノ酸含有量が顕著に増加し、
本発明組成物は、溶出量２０　ｍｌまでに溶出されてい
ることがわかった。

又、この他のゲル濾過剤として、 ５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−１００（ファルマシア製）　
。ＴＳＫＧＥＬ　ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＨＷ−４０（東
ソー製）等が使用でき、溶出液として塩を含む水溶液も
使用できる。

（５）分子量測定 前記（４）でサンプルＣを分画した、抗原性がなく芳香
族アミノ酸含有量が全アミノ酸量の１．０ｗｔ％以下で
、遊離アミノ酸含有量が２０ｗｊ％以下であるペプチド
組成物の分子量を測定した。

図５は、上記組成物を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５を使
用し水溶出により分子量を測定したグラフである。この
結果により、本発明のペプチド組成物に含まれるペプチ
ドは、分子量ｌ０００以下であることがわかった。同様
にサンプルＦの分画物も含まれるペプチドの分子量は、
１０００以下であることがわかった。

以下に実施例を用いて本発明を説明する。

し実施例１コ 市販カゼイン２００ｇを１０％水酸化ナトリウムを使用
し、ｐＨ８，０に調整し］Ｏｗｊ％となるように溶解し
た。９［１’Ｃ１ｔ１分間加熱殺菌後、４５℃に調整し
、パンクレアチンＦ（天野製薬）１０ｇ１プロテアーゼ
Ｎ「アマノ」　（天野製薬）２ｇ１乳酸菌抽出物（（１
）酵素分解物の調整項記載）　　４ｇを加え４５℃で２
４時間酵素加水分解した。９０°Ｃ５分間加熱失活後、
濾過により沈殿物を除去した。

これを凍結乾燥し凍結乾燥品１７０ｇを得た。アミノ酸
分析の結果、芳香族アミノ酸の遊離率は９０．７％であ
った。この凍結乾燥品１８ｇを２０ｗ４％水溶液とし、
不溶解物を除去した後、５ｅｐｈａｄｅｘＧ−１０１０
Ｘ　１２ａｎカラムで溶出した。溶出液には、イオン交
換水を使用し、流速は１０ｍ１／分とした。

溶出量２００〜５００ｍ１を分画し凍結乾燥し、乾燥物
６ｇを得た。アミノ酸分析の結果、芳香族アミノ酸含有
量は全アミノ酸量の０．５ｗ１％であり、遊離アミノ酸
含有量は、１８，５％であった。又、ＥＬＩＳＡ抑制試
験では、原料カゼインの抗原性は認められず、又Ｇ−２
５による分子量測定では含まれるペプチドの分子量は１
００以下であった。

［実施例２］ 市販乳清蛋白質粉末２００ｇを脱イオン水に溶解し８ｗ
ｊ％水溶液とした。フィルター濾過による除菌後、４５
℃に調整し又、５％水酸化ナトリウムでｐＨ７，３にコ
ントロールしたまま、パンクレアチンＦ（天野製薬）２
ｇずつ３０分おきに６回添加し、１５時間後アクチナー
ゼＡＳ（科研製薬）１．５ｇを加え全体で２０時間分解
した。９０ｇ５分間加熱失活後濾過により沈殿物を除去
した。これを凍結乾燥し凍結乾燥品１６５ｇを得た。ア
ミノ酸分析の結果、芳香族アミノ酸の遊離率は９０．３
％であった。この凍結乾燥品５ｇを２０ｗｊ％水溶液と
し、不溶解物を除去した後、５ｅｐｈａｄｅｘＧ−２５
５Ｘ　１５ｃｍカラムで溶出した。溶出液には、１２％
エタノールを使用し、流速は１０ｍ１／分とした。溶出
量２００〜５００ｍ１を分画し、凍結乾燥し、乾燥物１
．５ｇを得た。アミノ酸分析の結果、芳香族アミノ酸含
有量は全アミノ酸量の０．５ｗ１％であり、遊離アミノ
酸含有量は、１９．３％であった。

又、ＥＬＩＳ＾抑制試験の結果、原料乳清蛋白質の抗原
性は認められず、又Ｇ−２５による分子量測定では含ま
れるペプチドの分子量は、１０００以下であった。

本発明は、含まれるペプチドの分子量が、１０００以下
であり、抗原性を呈さす、遊離アミノ酸含有量が２０ｗ
ｊ％以下で、組成物中の芳香族アミノ酸含有量が、全ア
ミノ酸量の］、　０ｗｔ％以下であることを特徴とする
、蛋白質原料全体を窒素源として得られる低分子量ペプ
チド組成物及びその製造方法である。以下に本発明にお
ける効果を説明する。

［本発明の効果］ 本発明による低分子量ペプチド組成物には、種々の用途
が考えられる。

本発明の組成物は、非抗原性、吸収良好性という特徴が
あり、アレルギー患者２休力減少。

疾病等による腸管免疫機構異常患者、アレルギー性下痢
症患者、乳幼児、術前術後患者等に、経口的あるいは胃
、腸に直接投与する蛋白質栄養源として利用できる。

又、本発明の組成物は、芳香族アミノ酸含有量が低減化
されているため、先天的芳香族アミノ酸代謝異常患者、
肝疾患による芳香族アミノ酸代謝異常患者、癌患者の食
餌療法剤として利用できる。

又、本発明の製造方法により、上記用途に使用しうる低
分子量ペプチド組成物を製造することができる。

【図面の簡単な説明】

図１は、カゼイン酵素分解物の芳香族アミノ酸の遊離率
と抗原性の関係を示したグラフである。 図２は、乳清蛋白質酵素分解物の芳香族アミノ酸の遊離
率と抗原性の関係を示したグラフである。 図３は、カゼイン酵素分解物（サンプルＣ）の５ｅｐｈ
ａｄｅｘ　Ｇ−１５による溶出グラフである。 図４は、乳清蛋白質酵素分解物（サンプルＦ）の５ｅｐ
ｂ＋＋ｄｅｘ　Ｇ−１０にる溶出グラフである。 図５は、低分子量ペプチド組成物の５ｅｐｈａｄｅｘＧ
−２５による溶出グラフである。 手続補正書　陽刻 平成元年３月２ビ日

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）含まれるペプチドの分子量が、１０００以下であ
   り、抗原性を呈さず、遊離アミノ酸含有量が、２０ｗｔ
   ％以下で、組成物中の芳香族アミノ酸含有量が、全アミ
   ノ酸量の１．０ｗｔ％以下であることを特徴とする、蛋
   白質原料全体を窒素源として得られる低分子量ペプチド
   組成物。
2. （２）蛋白質原料全体を蛋白質分解酵素により、原料蛋
   白質の抗原性を認めなくなるまで、かつ、原料蛋白質に
   含まれる芳香族アミノ酸が、９０ｗｔ％以上遊離アミノ
   酸になるまで分解し、分解後、ゲル濾過法により、ペプ
   チド部分を回収することで、特許請求の範囲第１項記載
   の低分子量ペプチド組成物を製造する方法。