JPH02131582A - Deoxyribonucleic acid - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To provide a novel DNA having a specific base sequence and autonomous replicating ability and capable of efficiently producing an useful peptide, protein, etc. CONSTITUTION:Autonomous replicating sequence DNA of the mammal cell has a base sequence expressed by the formula. The DNA is produced by the following method: DNA is taken out from a mammal cell and treated with a proper restriction enzyme to give a DNA fragment having proper size, which is then blended with DNA linking protein to afford a DNA-protein linked product. The aimed DNA can be obtained from the DNA-protein linked product by applying ordinary protein separating and obtaining means such as antigenantibody reaction. Gene product can be produced using selfrenewal ability of the resultant DNA sequence in a cultured cell or by a genetic animal and production of a plasmid containing the DNA, mammal cell transformed with the above-mentioned plasmid and gene product obtained by using the transformed cell are useful.

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は新規なＤＮＡに関する。[Detailed description of the invention] <Industrial application field> The present invention relates to a novel DNA.

く従来の技術〉 遺伝子工学を応用したべブチド類の製造法としては、ブ
ラスミドを利用して大腸菌、枯草菌等にペブチド、蛋白
質等を製造させる方法、ウイルスＤＮＡを利用してその
宿主にベブチド、蛋白等を製造させる方法等が知られて
いる。Conventional technology> Methods for producing peptides using genetic engineering include a method in which Escherichia coli, Bacillus subtilis, etc. are made to produce peptides, proteins, etc. using plasmid, and a method in which peptides, proteins, etc. are produced in a host using viral DNA. Methods for producing proteins and the like are known.

しかしながら、これらはブラスミドの安定性、使用細胞
種が限られることおよび生産効率等において必ずしも満
足できるものではない。However, these methods are not necessarily satisfactory in terms of plasmid stability, limited cell types, and production efficiency.

本発明者は、マウス細胞由来の自己複製配列（Ａｕｔｏ
ｎｏｍｏｕｓ　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎ３　Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅ，Ａ　Ｒ　Ｓ　）を含むＤＮＡフラグメントを！＃
離し、このフラグメントは塩基数が約２５００のＥｃｏ
Ｒ１及び１３ｇｌ　Ｉ＋切断断片であることを報告した
（文献１）。The present inventor has developed a self-replicating sequence derived from mouse cells (Auto
nomous Replicatin3 Sequen
ce, A R S ) containing the DNA fragment! #
This fragment is an Eco fragment with approximately 2500 bases.
It was reported that R1 and 13gl I+ cleavage fragments (Reference 1).

本発明者は、このＡＲＳフラグメントの性質について検
討したところ、ＡＲＳがｃ−ｍｙｃ　ｉｊ！伝子の産物
であるｍｙｃ−蛋白等のＤＮＡ結合性蛋白と特異的親和
性を有すること、およびｃ−ｍｙｃ蛋白はｃ−ｍｙｃ遺
伝子自体に結合してその発現調節をしていることを見出
し、これらの知見に基いてｍｙｃ−蛋白等を用いて種々
の哨乳動物細胞よりＡＲＳを分離、取得することを可能
にし、さらにこの啼乳動物細胞の自己複製配列ＤＮＡ（
ＡＲＳ）を利用して有用なベブチドや蛋白等を効率よく
生産させ得ることを見出して本発明を完成した。The inventor investigated the properties of this ARS fragment and found that ARS is c-myc ij! We discovered that c-myc protein has a specific affinity with DNA-binding proteins such as myc-protein, which is a gene product, and that c-myc protein binds to the c-myc gene itself and regulates its expression. Based on these findings, we have made it possible to isolate and obtain ARS from various mammalian cells using myc-protein, etc., and furthermore, we have made it possible to isolate and obtain ARS from various mammalian cells using myc-protein, etc.
The present invention was completed by discovering that useful bebutides, proteins, etc. can be efficiently produced using ARS).

く発明の構成〉 本発明は、哨乳動物細胞の自己複製配列ＤＮ＾に関し、
また補乳動物細胞の自己複製配列ＤＮＡ、プロモーター
およびベブチド類生産用遺伝子（翻訳開始コドンを含む
）を含有するプラスミドおよびこのブラスミドで形質転
換された咄乳動物細胞に関し、さらにこの補乳動物細胞
の自己複製配列ＤＮＡ、ブラスミドまたは形質転換細胞
を利用してベブチド類を製造する方法に関する。Structure of the Invention The present invention relates to a self-replicating sequence DN^ of mammalian cells,
In addition, regarding a plasmid containing the self-replicating sequence DNA, a promoter, and a gene for producing vebutides (including a translation initiation codon) of a complemented mammalian cell, and a mammalian cell transformed with this plasmid, furthermore, The present invention relates to a method for producing bebutides using self-replicating sequence DNA, plasmid or transformed cells.

ＡＲＳとは、真核生物の染色体が自己複製する際の複製
起点である。これを取得するには次のようにすればよい
。ARS is an origin of replication when eukaryotic chromosomes self-replicate. To obtain this, do the following:

すなわち、哨乳動物細胞よりＤＮＡを取り出して適当な
制限酵素（六塩基認識酵素が好ましく、例えば旧ｎｄｌ
ｌｌ　，　ＥｃｏＲＩ，　ＢａｍＨＩ）で処理して適当
な大ぎさのＤＮＡフラグメント（通常ｌ０００乃至１０
０００ｂｐ）となし、これをＤＮＡ結合性蛋白と混合処
理してＤＮ＾−蛋白結合体を生成させる。That is, DNA is extracted from mammalian cells and treated with an appropriate restriction enzyme (preferably a six base recognition enzyme, for example, old ndl).
ll, EcoRI, BamHI) to obtain DNA fragments of appropriate size (usually 1000 to 1000
000bp) and mixed with a DNA-binding protein to generate a DN^-protein conjugate.

ＤＮＡ結合性蛋白とは、細胞核内に存在してＤＮＡの機
能発現を制御している蛋白であって、ＤＮＡと親和結合
性を有し、非ヒストン蛋白に分類されているものであり
、例えば、ｃ−ｍｙｃ蛋白　（文献ｌ３参照）　，　Ｖ
−０１，！ＩＩＣ蛋白　（文献ｌ４参照）　，　Ｎ−ｎ
＋ｙｃ蛋白　（文献ｌ５参照），ｃ−ｍｙｂ蛋白　（文
献ｌ５参照）、　ｖ−ｍｙｂ蛋白（文献ｌ５参照），ｃ
−ｆｏｓ蛋白　（文献ｌ５参照），ｖ−ｆｏｓ蛋白　（
文献ｌ５参照）．ｐ５３（文献ｌ５参照），ＳＶ４０　
Ｔ抗原（文献１６参照）及びＲＢ遺伝子産物　（文献１
７参照）等の、ｍｙｃ蛋白やｍｙｂ蛋白等を挙げること
ができる。A DNA-binding protein is a protein that exists in the cell nucleus and controls the functional expression of DNA, has an affinity for DNA, and is classified as a non-histone protein. For example, c-myc protein (see reference 13), V
-01,! IIC protein (see reference 14), N-n
+yc protein (see Reference 15), c-myb protein (see Reference 15), v-myb protein (see Reference 15), c
-fos protein (see reference 15), v-fos protein (
(See Reference 15). p53 (see reference 15), SV40
T antigen (see Reference 16) and RB gene product (Reference 1
Examples include myc protein, myb protein, etc. (see 7).

ＤＮＡ一蛋白結合物を生成させた後は、抗原抗体反応等
の通常の蛋白分離取得手段を応用して目的のＤＮＡを取
得することかでぎる。After the DNA-protein complex is produced, the desired DNA can be obtained by applying ordinary protein separation and obtaining means such as antigen-antibody reaction.

すなわち、ＤＮＡ一蛋白結合物がそのままでは分列取得
しにくい場合は、これにＤＮＡ結合性蛋白に対する抗体
を結合させ、更にこの抗体と特異的に結合する物質、例
えばプロテインＡ、を結合させると、分子量の相当大き
な複合体が生成して沈殿しやすく分離取得が容易である
。That is, if it is difficult to obtain a DNA-protein complex as it is, by binding it with an antibody against the DNA-binding protein and further binding a substance that specifically binds to this antibody, such as protein A, A complex with a fairly large molecular weight is formed and easily precipitated, making it easy to separate and obtain.

抗体は、通常の方法で作成すればよく、例えばＮ−ｍｙ
ｃ遺伝子の第三エクソン（Ｎ−ｍｙｃに特異的な部分）
を大腸菌を用いて発現させ、産生された蛋白を精製後通
常の方法でマウスに免疫し、抗血清からＩｇＧ分画を取
り使用する。また市販のもの（例えばオンコー社製抗ｍ
ｙｃ蛋白抗体；α一ｍｙｃ）を利用しても良い． プロテインＡはスタフィ口コツカス・アウレウスの菌体
懸濁液（Ｐ７１５５：シグマ社）や、担体結合物（Ａ８
ａｒｏｓｅ　ＦＰ＾−ｌ；コスモ・バイオ社，　Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂ：ファルマシア社）も市販され
ている。Antibodies may be prepared using conventional methods, such as N-my
c gene third exon (part specific to N-myc)
is expressed using Escherichia coli, and the produced protein is purified and then immunized into mice using a conventional method, and the IgG fraction is collected from the antiserum and used. Also, commercially available products (for example, Onkor's anti-m
yc protein antibody; α-myc) may also be used. Protein A is a bacterial cell suspension of Staphylococcus aureus (P7155: Sigma), a carrier-conjugated product (A8
arose FP^-l; Cosmo Bio Inc., Sep
haroseCL-4B (Pharmacia) is also commercially available.

ＤＮＡと蛋白との結合物（例えばＤＮＡ−ｍｙｃ蛋白抗
体一プロテインＡ結合物）からのＤＮＡの単離も通常の
方法を利用すればよく、例えば２−メルカブトエタノー
ルのような試薬や蛋白を分解する酵素（Ｐｒｏｔｅａｓ
ｅ　Ｋ：シグマ社，Ｐｒｏｔｅｉｓａｓｅ　Ｎｏ．２４
５６８：メルク社）での処理によって蛋白部分を分解し
、それをフェノール抽出で除けばＤＮＡを得ることがて
きる（文献１０参照）。DNA can be isolated from a DNA-protein complex (e.g., a DNA-myc protein antibody-protein A complex) by using a conventional method, such as using a reagent such as 2-mercabutoethanol or decomposing the protein. enzymes (Proteas)
e K: Sigma, Protease No. 24
568: Merck & Co.) to decompose the protein portion and remove it by phenol extraction to obtain DNA (see Reference 10).

このようにして得るＤＮＡ結合性蛋白と特異的親和性の
あるＤＮＡフラグメントは、ＡＲＳのＤＮＡを含んでい
る。即ち、ＤＮＡ結合性蛋白とＡＲＳは非常に強い親和
性がある、ということは本発明者の見出した極めて重要
な事実である。The DNA fragment that has specific affinity with the DNA-binding protein thus obtained contains ARS DNA. That is, an extremely important fact discovered by the present inventors is that DNA-binding proteins and ARS have a very strong affinity.

ＡＲＳを含んだＤＮＡフラグメントは、必要に応じてＡ
ＲＳのみ、またはＡＲＳを含んだ適当な長さのＤＮＡフ
ラグメントにして利用することがでぎる。その操作やこ
のＡＲＳを利用してベブチト等の有用な物質を生産する
ためのＤＮＡ処理やスクリニング等の技術は、実施例等
を参考にして一般的な技術を利用すればこの分野の通常
の知識を有する者が容易に理解し実施できるであろう。ARS-containing DNA fragments can be added to ARS as needed.
It can be used as a DNA fragment of an appropriate length containing only RS or ARS. The operation and techniques such as DNA processing and screening for producing useful substances such as Bebutyto using this ARS can be done by referring to the examples and using general techniques. It will be easy for a knowledgeable person to understand and implement.

また、ＡＲＳは由来する細胞の動物の種差により、もし
くは細胞の種差により、または同一の細胞であってもそ
の中の他部位のＡＲＳであることによって、塩基配列が
僅かに異ることは充分に考えられる。従って、ＡＲＳは
上記のようにして単離されたＡＲＳの塩基配列と必ずし
も完全に同じでなければ利用し得ないわけではなく、そ
の一部の塩基を置換または除去、あるいは塩基を付加す
ることも可能であり、目的物の効率的な生産に適するか
否かは、本明細書の説明を参考にした通常の水準の試験
、研究により確めることができる。In addition, it is quite possible that the base sequence of ARS may be slightly different due to differences in the animal species of the cell from which it is derived, due to differences in the species of the cell, or due to ARS in other parts of the same cell. Conceivable. Therefore, ARS does not necessarily have to be completely the same as the base sequence of ARS isolated as described above in order to be used, and some bases may be replaced or removed, or bases may be added. Whether or not it is possible and suitable for efficient production of the target product can be confirmed by ordinary level tests and research with reference to the explanations in this specification.

本発明に関して、単離あるいは使用可能なＡＲＳとして
は、マウス、ラット、モルモット、牛、馬、羊、山羊、
兎、サル、チンパンジー、ヒト等の哨乳勤物細胞由来の
ものがあげられるが、特に細胞培養技術の発達している
マウスまたはヒト細胞由来のものが適当であると言うこ
ともできる。Regarding the present invention, ARS that can be isolated or used include mice, rats, guinea pigs, cows, horses, sheep, goats,
Examples include those derived from cells of rabbits, monkeys, chimpanzees, humans, etc.; however, those derived from mouse or human cells, for which cell culture techniques are well developed, are particularly suitable.

ＡＲＳを含んだＤＮＡを取得するための原料として使用
する細胞は特に限定されないが，　ＤＮＡ結合性蛋白を
多量に産生じている細胞を用いるのが便利である。その
例としは、　ｃ−Ｉｌｌｙｃ蛋白，　ｖ−ｍｙｃ蛋白、
Ｎ−ｍｙｃ蛋白，　ｃ−ｍｙｂ蛋白，　ｖ−ｍｙｂ蛋白
、ｃ−ｆｏｓ蛋白，ｖ−ｆＯＳ蛋白、ｐ５３　，ＳＶ４
０　Ｔ抗原，ＲＢ遺伝子産物を産生じている細胞、例え
ばヒトＨＬ−６０細胞、ヒトＩＭＲ細胞、ヒトＲａＪｉ
細胞、マウスＦＭ３ＡＭ胞等がある．ベブチド類の生産
に適した、ＡＲＳを含有する本発明のブラスミドの構築
には、通常の遺伝子組換技術を利用すればよい（文献７
参照）。Although there are no particular restrictions on the cells used as raw materials for obtaining ARS-containing DNA, it is convenient to use cells that produce large amounts of DNA-binding proteins. Examples include c-Illyc protein, v-myc protein,
N-myc protein, c-myb protein, v-myb protein, c-fos protein, v-fOS protein, p53, SV4
0 T antigen, cells producing RB gene products, such as human HL-60 cells, human IMR cells, human RaJi
There are cells, mouse FM3AM cells, etc. Conventional genetic recombination techniques may be used to construct the plasmid of the present invention containing ARS, which is suitable for producing bebutides (Reference 7
reference).

また、細胞へのブラスミドの導入、使用する細胞の種類
および細胞の増殖方法等も、一般に知られた哨乳類細胞
や技術を利用することができ、今後改良される方法や培
養細胞、培地等の応用も可能であろう（文献８〜１０参
照）。In addition, generally known sentinel cells and techniques can be used for the introduction of plasmids into cells, the types of cells used, and cell proliferation methods, and methods that will be improved in the future, cultured cells, culture media, etc. It may also be possible to apply (see References 8 to 10).

以下に一般的方法のうちのいくつかの例を挙げて更に説
明する。Some examples of common methods will be further explained below.

使用可能なプロモーターの例としては、チミジンキナー
ゼプロモーター、イムノグ口プリンプロモーター等の細
胞由来の各種プロモーター、または、ＳＶ４　０のＴ抗
原プロモーター、初期ブロモータ、ヘルペスウイルスの
チミジンキナーゼプロモーター等の咄乳動物細胞に感染
するウイルスのプロモーター等を挙げることができる。Examples of promoters that can be used include various cell-derived promoters such as the thymidine kinase promoter and immunoglucose purine promoter, or promoters derived from mammalian cells such as the SV40 T antigen promoter, early promoter, and herpesvirus thymidine kinase promoter. Examples include promoters of infecting viruses.

翻訳開始コドンには通常のＡＴＧを使用することができ
る。A normal ATG can be used as the translation initiation codon.

生産すべきペブチド類としては、インシュリン、成長ホ
ルモン、インターフェロン類、腫瘍壊死因子、インター
ロイキン等のリンホカイン、各種酵素等のべブチド、蛋
白、糖蛋白等の医薬として利用可能なものなどを挙げる
ことができる。Examples of the peptides to be produced include insulin, growth hormone, interferons, tumor necrosis factor, lymphokines such as interleukin, peptides of various enzymes, proteins, and glycoproteins that can be used as pharmaceuticals. can.

ペブチド類生産用遺伝子としては、前記のベプチド類の
アミノ酸配列をコードしたＤＮＡ、該ＤＮＡの３゜側下
流に翻訳を終了させる為のボリＡシグナルを配列させた
もの等を挙げることができる。Examples of genes for producing peptides include a DNA encoding the amino acid sequence of the peptides described above, and a gene in which a BoliA signal for terminating translation is arranged 3° downstream of the DNA.

本発明のブラスミドの製造には、適当な塩基対数を有し
て、通常使用される制限酵素による開裂部位を有するＤ
ＮＡフラグメント、プロモーター翻訳開始コドンおよび
ペブチド類生産用遺伝子を適宜所望の配列になるように
して結合させ、さらにＡＲＳを加えて環状とする。For the production of the plasmid of the present invention, D
The NA fragment, the promoter translation initiation codon, and the gene for producing peptides are linked together in a desired sequence, and then ARS is added to form a circle.

なお、ＡＲＳの向きおよび位置については特に限定的に
考慮する必要はない。Note that there is no need to specifically consider the direction and position of the ARS.

得られたブラスミドを、リン酸カルシウムを用いたトラ
ンスフエクション、マイクロインジエクション法、リポ
ソーム法、ブロトプラスト融合法等を用いて、種々の咄
乳動物細胞に導入して形質転換細胞を作製することがで
きる。培養細胞の例としてはマウスのＮＳ−１およびＦ
Ｍ３Ａ、ヒトのＨＬ−６０、ｕ９３７、Ｄａｕｄｉおよ
びＲａｊｉ等を挙げることかでぎる。The obtained plasmid can be introduced into various mammalian cells to produce transformed cells using transfection using calcium phosphate, microinjection method, liposome method, brotoplast fusion method, etc. can. Examples of cultured cells include mouse NS-1 and F.
M3A, human HL-60, u937, Daudi and Raji, etc. may be mentioned.

この形質転換細胞を増殖させることにより目的のべブチ
ド類を製造することができる。The desired bebutides can be produced by propagating these transformed cells.

この際、ＡＲＳの由来した細胞とプラスミドを導入する
相手の細胞の種が同じである必要がないことは、本発明
の特徴の一つである。In this case, one of the features of the present invention is that the cell from which the ARS was derived and the cell to which the plasmid is introduced do not need to be the same species.

形質転換細胞の培養には、使用された細胞の通常の培養
法、例えば適当量の仔牛血清を含有したＤＭＥＭ（Ｄｕ
ｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ
　ｌＩｌｅｄｉｕｍ）を用いて繋二酸化炭素の存在下３
７℃で培養する方法、あるいは動物腹腔内での増殖等が
ある（文献８〜ｌＯ参照）。The transformed cells can be cultured using conventional culture methods for the cells used, such as DMEM (Du
lbecco's modified Eagle's
3 in the presence of carbon dioxide
There is a method of culturing at 7°C or growth within the peritoneal cavity of an animal (see References 8 to 1O).

生産されたべブチド類は、培地中に遊離している場合に
は通常の分両方法、例えば遠心、ゲルろか等を、細胞中
に蓄積されている場合には細脂を破砕後通常の分両方法
を用いることにより、あるいは腹水から一般的方法によ
り単離することができる。If the produced bebutides are free in the culture medium, they can be subjected to conventional separation methods such as centrifugation or gel filtration, or if they are accumulated in cells, they can be processed by normal separation methods after crushing the lipids. or from ascites by conventional methods.

以下に、本発明を更に実施例により説明するがこれらに
よって限定されるものではない。EXAMPLES The present invention will be further explained below with reference to Examples, but is not limited thereto.

衷五■ユ プラスミドｐＭＩＪ６５　（文献１）をＥｃｏＲＩ及び
Ｂｇｌ　Ｉ＋で処理し、塩基対数約２５００のＤＮＡフ
ラグメントをＳａｔ，た。このフラグメントをプラスミ
ドｐＫｓＶ１０（ファルマシア社製）のＥｃｏＲＩ−Ｂ
ｇｌ　Ｉ１領域に挿入しプラスミドｐＡＲＳ６５を作製
した。The plasmid pMIJ65 (Reference 1) was treated with EcoRI and Bgl I+ to obtain a DNA fragment with a base pair number of about 2500. This fragment was added to EcoRI-B of plasmid pKsV10 (manufactured by Pharmacia).
It was inserted into the glI1 region to create plasmid pARS65.

ブラスミドｐＡＧＯ　（文献２）をＢａＩＩＩＨＩで処
理してヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子
を含むフラグメントを単離した。このフラグメントを上
記ブラスミドｐＡＲＳ６５のＢａｎ＋ＨＩサイトに挿入
し、プラスミドｐ６５−ｔｋを製した。このブラスミド
を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋｌ２　Ｃ６００）中で増殖
させた。Blasmid pAGO (Reference 2) was treated with BaIIIHI to isolate a fragment containing the herpesvirus-derived thymidine kinase gene. This fragment was inserted into the Ban+HI site of the above plasmid pARS65 to prepare plasmid p65-tk. This plasmid was grown in E. coli Kl2 C600.

（Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋｌ２　Ｃ６００　ＡＲＳ−１、徴工
研受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１４４３）。(E. coli Kl2 C600 ARS-1, Chokoken accession number FERMBP-1443).

ブラスミドｐＭＴＩＯＤ　（文献３）を、ＢａＩＩ＋ｔ
ｌｌおよびＰｖｕ　ＩＩで処理し、初期プロモーターを
有するＳＶ４０Ｔ抗原遺伝子を単離した。該遺伝子のＰ
ｖｕ　ＩＩサイトにＲａｍ｝ＩＩ　リンカー（宝酒造製
）を結合させた。Blasmid pMTIOD (Reference 3) was treated with BaII+t
11 and Pvu II, the SV40T antigen gene with the early promoter was isolated. P of the gene
A Ram}II linker (manufactured by Takara Shuzo) was attached to the vu II site.

得られたフラグメントをブラスミドｐＡＲＳ６５のＢａ
ｍ｝ＩＩサイトに挿入し、ブラスミドｐ６５−Ｔを得た
。The resulting fragment was transformed into Ba of plasmid pARS65.
m}II site to obtain plasmid p65-T.

３）蛋白（チミジンキナーゼ）の発現 リポソーム法（文献４）に従って１）で得たブラスミド
ｐ６５−ｔｋをＦＭ３Ａｔｋ一細胞に形質転換した。3) Expression of protein (thymidine kinase) The plasmid p65-tk obtained in 1) was transformed into FM3Atk cells according to the liposome method (Reference 4).

形質転換を行う際には、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ含有２０ｍ
Ｍ　トリスバッファ−（ｐｌ｛　７．５）を用い、リポ
ソームはフォスファチジルセリンを用いて公知の方法（
文献５）に従い調製した。When performing transformation, use 20mM containing 50mM EDTA.
Using M Tris buffer (pl{ 7.5) and phosphatidylserine, liposomes were prepared using a known method (
It was prepared according to literature 5).

形質転換後、細胞をｌＯｔ仔牛血清含有ＤＭＥＭを用い
５零二酸化炭素の存在下３７℃で培養した。２日後培地
をＨＡＴ培地に換えた。After transformation, cells were cultured in DMEM containing 100 calf serum at 37° C. in the presence of 50% carbon dioxide. Two days later, the medium was replaced with HAT medium.

形質転換細胞、即ちＦＭ３Ａｔｋ”細胞は約１週間後よ
り出現した。　２週間後に各コロニーを＊ｍし、それぞ
れ細胞数が１０’個程度になるまで｝ＩＡＴ培地で培養
した。この間約６０倍化回数を経過した。Transformed cells, namely FM3Atk'' cells, appeared after about 1 week. After 2 weeks, each colony was isolated and cultured in IAT medium until the number of cells reached about 10. During this period, the colonies multiplied by about 60 times. The number of times has passed.

この方法により１，０００個の細胞について形質転換を
試みたところ、約３００〜４００個の形質転換細胞が得
られた。従って、ｐ６５−ｔｋがＦＭ３Ａｔｋ−細胞中
で増殖していること及びチミジンキナーゼ遺伝子が発現
していることが確認された。When attempting to transform 1,000 cells using this method, approximately 300 to 400 transformed cells were obtained. Therefore, it was confirmed that p65-tk was proliferating in FM3Atk- cells and that the thymidine kinase gene was expressed.

４）　コピー数の検討 上記の１０’個の細胞より、ハート（｝Ｉｉｒｔ）法（
文献６）により低分子量ＤＮＡを抽出した。ブラスミド
が形質転換細胞中で複製したことを確認するため、得た
ＯＮ八を制限酵素Ｄｐｎ　Ｉで処理した。4) Examination of copy number From the above 10' cells, the Hart (}Iirt) method (
Low molecular weight DNA was extracted according to Reference 6). To confirm that the plasmid had replicated in the transformed cells, the obtained ON8 was treated with the restriction enzyme Dpn I.

ＦＭ３Ａｔｋ−細胞に導入されたｐ６５−ｔｋのアデニ
ン部分はメチル化されているが、該細胞中で複製したも
のはメチル化していない。Ｄｐ口Ｉはメチル化したＤＮ
Ａのみを選択的に切断するので、該細胞中で複製したブ
ラスミドは切断されず、細胞に入ったプラスミドのみを
切断して複数のＤＮＡフラグメントとする．従って、細
胞中で複製したブラスミドを容易に電気沫動法により区
別することができる。The adenine moiety of p65-tk introduced into FM3Atk- cells is methylated, but the one replicated in the cells is not methylated. Dp mouth I is methylated DN
Since only A is selectively cleaved, the plasmid that has replicated in the cell is not cleaved, but only the plasmid that has entered the cell is cleaved into multiple DNA fragments. Therefore, plasmids replicated in cells can be easily distinguished by electrophoresis.

Ｄｐｎ　Ｉ処理後アガロースゲル電気泳動（文献７）に
よりＤＮＡを分離し、これをサザンブ口ツテイング（文
献ｌ１）シた．即ち、３２ｐで標識したｐ６５−ｔｋを
ブローブとしてハイプリダイゼーションを行い次いでＸ
線感光フイルムを用いてオートラジオグラフィーを行い
、プロープとハイプリダイズするバンドを検出したとこ
ろ、検討した２０個のクローン全てについてｐ６５−ｔ
ｋが染色体外ＤＮＡ　として？３１１していることが確
肥された。After Dpn I treatment, DNA was separated by agarose gel electrophoresis (Reference 7), and this was subjected to Southern tube analysis (Reference 11). That is, hybridization was performed using p65-tk labeled with 32p as a probe, and then X
When autoradiography was performed using photosensitive film and bands that hybridized with the probe were detected, p65-t was detected in all 20 clones examined.
k as extrachromosomal DNA? It was confirmed that 311.

細胞当りのコピー数は、感光度から１００〜２００であ
った。このプラスミドは、細胞をＨＡＴ培地がら１０％
Ｆ仔牛血清を含むＤＭＥＭにかえて培養した場合でも安
定に複製し、ＤＮＡ上での改変は何ら見られなかった。The number of copies per cell was 100-200 based on photosensitivity. This plasmid was used to transform cells into HAT medium by 10%
Even when the cells were cultured in DMEM containing F calf serum, stable replication was observed, and no alterations were observed in the DNA.

また、このブラスミドは１５０倍化回数紅通しても安定
に細胞中に存在することが確証された。Furthermore, it was confirmed that this plasmid stably existed in cells even after 150 times of multiplication.

５）ブラスミドｐＡＲＳ−６５の各種細胞における複製 ｐＡＲＳ−６５を上記の方法に従いマウスＮＳ−１細胞
、ヒトＨＬ−６０細胞およびヒトＵ９３７細胞にそれぞ
れトランスフェクションし、１０ｋ仔牛血清を含んだＲ
ｌｌＭｌ　１６４０培地を用いて繋の二酸化炭素の存在
下３７℃で培養した。４０時間後に、上記４）の方法に
従い染色体外の低分子ｉＤＮＡを解析した。その結果Ｎ
Ｓ−１細胞に約５００コピー、｝ＩＬ−７＋５５：　に
約１０，０００コピー及びＵ９３７細胞に約１００コピ
ーのｐＡＲＳ−６５が複製していることが確記された。5) Replication of plasmid pARS-65 in various cells pARS-65 was transfected into mouse NS-1 cells, human HL-60 cells, and human U937 cells, respectively, according to the above method, and R
The cells were cultured at 37° C. in the presence of constant carbon dioxide using 11M1 1640 medium. After 40 hours, extrachromosomal low-molecular-weight iDNA was analyzed according to method 4) above. As a result N
It was established that approximately 500 copies of pARS-65 were replicating in S-1 cells, approximately 10,000 copies in IL-7+55: and approximately 100 copies in U937 cells.

従って、ｐＡＲＳ−６５はマウス以外の種の細胞でも複
製することが確認され、ｐ６５−ｔｋも該複製能を有す
ることが示唆された。Therefore, it was confirmed that pARS-65 replicates in cells of species other than mice, and it was suggested that p65-tk also has this replication ability.

実施例２ １）ヒト細胞のＡＲＳの単離（第３図　照）ヒトＨＬ−
６０細胞のＤＮＡをＳＯＳ−プロテイネースＫ法（ｐｒ
ｏｔｅｉｎａｓｅκ）（文献７）により抽出し、旧ｎｄ
■で処理した。得られたＤＮＡフラグメントよりｍｙｃ
蛋白と親和性を有するＤＮＡフラグメントを取り出すた
め、公知の方法（文献１２）に従い以下の操作を行った
。即ち、前記ＤＮ＾フラグメントをＨＬ６０核抽出液（
大量の＋ｎｙｃ蛋白が存在する）と混合し、０℃で３０
分間反応させてＤＮＡ−ｍｙｃ蛋白結合物を生成させた
． 次にｍｙｃ蛋白に対する抗体（αｍｙｃ、オンコ−社製
）を加え、ＤＮＡ−ｆｆｉｙｃ蛋白一ａ　ｍｙｃ？１合
体を形成させた。更に、αＢｃと特異的に結合するブロ
テイン＾を含むスタフイ口コツカス　アウレウス菌の水
溶液を加え、ＤＮＡ−ｍｙｃ蛋白一αｍｙｃ−プロテイ
ン＾複合体を形成させた． 該複合体は沈殿するのでこれを分離し、０．　１ｋＳＤ
Ｓ及びＯ．ｌＭ塩化ナトリウムを含むトリスバッファ−
（ｐＨ７．５）で洗浄した後、ｌ零ＳＤＳを含む７ｍＭ
　２−メルカブトエタノール水溶液を加えて３０℃で３
０分間反応させ，ＤＮ八をａｍさせた．反応混合物を１
５，０００　ｘ　ｇで５分間遠心し、上澄を単離した。Example 2 1) Isolation of ARS from human cells (see Figure 3) Human HL-
The DNA of 60 cells was subjected to the SOS-Proteinase K method (pr
teinase κ) (Reference 7), and the old nd
Processed with ■. From the obtained DNA fragment, myc
In order to extract a DNA fragment having affinity with the protein, the following operations were performed according to a known method (Reference 12). That is, the DN^ fragment was added to HL60 nuclear extract (
(a large amount of +nyc protein is present) and incubated at 0°C for 30
A DNA-myc protein conjugate was generated by reacting for a minute. Next, an antibody against myc protein (αmyc, manufactured by Onco) was added, and DNA-ffiyc protein - a myc? One coalescence was formed. Furthermore, an aqueous solution of Staphylococcus aureus containing protein^, which specifically binds to αBc, was added to form a DNA-myc protein-αmyc-protein complex. Since the complex precipitates, it is separated and 0. 1kSD
S and O. Tris buffer containing 1M sodium chloride
After washing with (pH 7.5), 7mM containing l0SDS.
Add 2-mercabutoethanol aqueous solution and incubate at 30°C.
DN8 was allowed to react for 0 minutes. 1 of the reaction mixture
The supernatant was isolated by centrifugation at 5,000 x g for 5 minutes.

これをフェノールで抽出し、目的とするＤＮ＾フラグメ
ントを得た後ｐＵｃ１９（ファルマシア社製）の旧ｎ　
ｄ　ＩＩ＋サイトに挿入した．また、得られたＤＮＡフ
ラグメントの塩基対数をアガロースゲル電気泳勅法で検
討したところ、約２００であった． 得られたブラスミドをＥ．ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｃ　６０
０中で増殖させた（Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋｌ２　Ｃ　６００
　ＡＲＳ−２　，徴工研受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−１４
４４）。This was extracted with phenol to obtain the desired DN^ fragment, and then the old n of pUc19 (manufactured by Pharmacia) was extracted with phenol.
d Inserted into the II+ site. Furthermore, the number of base pairs of the obtained DNA fragment was examined by agarose gel electrophoresis and was found to be approximately 200. The obtained plasmid was purified by E. coli K12C 60
(E. coli Kl2 C 600
ARS-2, Choikoken accession number FERM BP-14
44).

尚、上記の｝ＩＬ−６０核抽出液は以下のように調製し
た。即ち、ＨＬ−６０細胞の培養液（５Ｘ１０’／ＩＩ
ｌｌ）　ｌ　（ｉを遠心して細胞を集め、リン酸バッフ
ァ一生理食塩水で洗浄した。これを更に低張水溶液（２
０ｍＭ　｝ＩＥＰＥＳ．ｐ｝ｌ　７．５、５ＩｎＭ塩化
カリウム，０．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．５＋ｎＭ
ジチオスレイトール，０．２＋ｎＭショ糖）で洗浄した
。これを５ｍｌの低張水溶液（上記水溶液よりショ糊を
除いたもの）に懸濁して１０分間静置した。これをダウ
ンスホモジナイザーで４０回上下させ、次いで３０００
　Ｘ　ｇでｌＯ分間遠心し、沈殿物を得た。The above IL-60 nuclear extract was prepared as follows. That is, culture medium of HL-60 cells (5X10'/II
Cells were collected by centrifugation and washed with phosphate buffer and physiological saline. This was further diluted with a hypotonic aqueous solution (2
0mM }IEPES. p}l 7.5, 5InM potassium chloride, 0.5mM magnesium chloride, 0.5+nM
dithiothreitol, 0.2+nM sucrose). This was suspended in 5 ml of a hypotonic aqueous solution (the above aqueous solution minus the glue) and allowed to stand for 10 minutes. This was raised and lowered 40 times using a Dounce homogenizer, and then 3000
Centrifugation was performed at X g for 10 minutes to obtain a precipitate.

この沈殿物が核なので、これを２．５ｍｌの水溶液（５
ｍｌｉｌ　ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５、１（ｎショ糖）に
溶かし、液体窒素中に一時保管した。これを０℃でゆっ
くり溶かし、５Ｍ塩化ナトリウム水溶液を最終濃度０．
１Ｍになるように加えてθ℃で５分間処理した。これを
１５，０００　Ｘ　ｇで２０分間遠心し、上澄を核抽出
液として得た。This precipitate is the nucleus, so add it to 2.5 ml of aqueous solution (5 ml).
ml HEPES, pH 7.5, 1 (n sucrose) and temporarily stored in liquid nitrogen. This was slowly dissolved at 0°C, and a 5M aqueous sodium chloride solution was added to a final concentration of 0.
The solution was added to 1M and treated at θ°C for 5 minutes. This was centrifuged at 15,000 x g for 20 minutes, and the supernatant was obtained as a nuclear extract.

上記Ｅ．ｃｏｌｌ　Ｋ１２　Ｃ６００中で増殖したブラ
スミドを！＃離し（文献７　）　、ｌ｛ｉｎｄｌｌ！で
処理したところ該ブラスミドは旧ｎｄｌｌ＋で切断され
ないことから、菌によるブラスミドの再編成が起こって
いると考えられ、本プラスミドをｐＨＬ　ＩＩｙＣと命
名した。Above E. Blasmids grown in coll K12 C600! #Release (Reference 7), l{indll! When treated with pHL, the plasmid was not cleaved with old ndll+, suggesting that the plasmid was rearranged by the bacterium, and this plasmid was named pHL IIyC.

プラスミドｐＵｃ１９は、｝ｆｉｎｄ　ＩＩＩ以外にＢ
ａｍＨＩ及びＮａｒｌ等の制限酵素切断部位を有してい
るので、上記ブラスミドをＲａｍ｝ＩＩ及びＮａｒｌで
処理し、生成した二つのフラグメンのうち小さい分子量
を有するＤＮＡフラグメントを単離した。Plasmid pUc19 contains B in addition to }find III.
Since it has restriction enzyme cleavage sites such as amHI and Narl, the above plasmid was treated with Ram}II and Narl, and the DNA fragment having the smaller molecular weight of the two generated fragments was isolated.

このフラグメントを鋳型として３２ｐでラベルしたプロ
ーブを作製し，ＨＬ−６０細胞のＤＮＡとサザンハイプ
リダイゼーション（文献１１）を検討したところ、該ブ
ローブがＨＬ−６０細１ｆｉＤＮ八とハイブリダイズす
ることからＮａｒｌサイト及びＲａｍ｝１１サイトを両
端に有するフラグメント（ＮａｒＩ−Ｂａｍ｝ＩＩフラ
グメント）はｌ｛Ｌ−６０細胞由来のＤＮＡを含んでい
ることが確認された。Using this fragment as a template, we prepared a 32p-labeled probe and performed Southern hybridization with HL-60 cell DNA (Reference 11). As a result, we found that the probe hybridized with HL-60 fiDNA8. It was confirmed that the fragment having the NarI-Bam}11 site at both ends (NarI-Bam}II fragment) contained DNA derived from l{L-60 cells.

Ｎａｒｌ−ＢａＩＩｌｔｌｌフラグメントの塩基対数を
アガロースゲル電気沫動法で検討したところ、約２００
〜３００であった． ｐＵｃ１９の旧ｎ　ｄ　ＩＩ＋サイトとＮａｒｌサイト
は１３１塩基対離れ、旧ｎ　ｄ　ＩＩ１サイトとＢａｍ
ＨＩサイトは３５塩基対離れ、更にＰｓｔｌサイトとＢ
ａｍ旧サイトは２５塩基対離れている．更にブラスミド
ｐ｝ＩＬｍｙｃではＰｓｔ１部位は保持されていた。従
って、ブラスミドｐＨＬｍｙｃにおける｝ＩＬ−６０細
胞由来のＤＮＡの塩基対数は約１２０であると推定され
た． この塩基配列を解明したところ、ボリリンカの旧ｎ　ｄ
　ＩＩ１サイトの中に９９塩基が確認された。その配列
を次に示す。When the base pair number of the Narl-BaIIltll fragment was examined by agarose gel electrophoresis, it was found to be approximately 200.
It was ~300. The old n d II+ site and Narl site of pUc19 are 131 base pairs apart, and the old n d II1 site and Bam
The HI site is 35 base pairs apart, and the Pstl site and B
am old site is 25 base pairs away. Furthermore, the Pst1 site was retained in plasmid p}ILmyc. Therefore, the number of base pairs of DNA derived from IL-60 cells in the plasmid pHLmyc was estimated to be approximately 120. After elucidating this base sequence, we found that Borylinka's old n d
99 bases were confirmed in the II1 site. The arrangement is shown below.

ＧＴＡＴＧＡＴＡＣＡＧＡＴＣＧＴＧＡＧＡＡＴＡＣＧ
ＴＡＧＣＣＴＣＧＴＣＡＣＣＡＴＴＧＡＧＣＡＧＴＡＣ
ＧＴＴＧＴＡＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＣＣＡＴＧＣＴＣＴ
ＧＡＣＡＣＴＧＣＡＣＧＡＣＧＴＧＡＣＡＧＣＡＴＣこ
の配列についてインバーテツド・リピート（ｉｎｖｅｒ
ｔｅｄ　ｒｅｐｅａｔ）を検索したところ、第５図およ
び第６図に示すようなヘアピン構造をとる可能性が示唆
された。これに基けば、上記の９９塩基の１２から５９
またはｌ７から７４が最も重要な自己複製配列（ＡＲＳ
）の塩基配列であると考えられる。GTATGATACAGATCGTGAGAATACG
TAGCCTCGTCACCATTGAGCAGTAC
GTTGTACTGGAAGAGACCATGCTCT
GACACTGCACGACGTGACAGCATCInvert repeats for this sequence.
ted repeat), it was suggested that it may have a hairpin structure as shown in FIGS. 5 and 6. Based on this, from 12 to 59 of the 99 bases above
or l7 to 74 are the most important self-replicating sequences (ARS
) is considered to be the base sequence of

２）ブラスミド｝ＩＬｍｙｃがＡＲＳを有することの確
Ｌ リポソーム法を用いてｐ｝ｌＬｍｙｃで｝ＩＬ−６０細
胞を形質転換し、次いで上記の方法に従ってコピー数を
検討したところ、細胞当り約１０，０００であった。2) Confirmation that plasmid ILmyc has ARS IL-60 cells were transformed with pILmyc using the liposome method, and then the copy number was examined according to the above method. Met.

ブラスミドｐｍｙｃ　（オンコ−社製、ｍｙｃの構造遺
伝子およびＲｏｕｓ　ｓａｒｃｏＩＩｌａ　ｖｉｒｕｓ
のロングターミナルリピートプロモーター（ＬＴＲ）を
含む）をＢａｍ旧、Ｈｉｎｄｌｌ＋およびＥｃｏＲＩで
処理しｍｙｃの構造遺伝子およびＬＴＲを単離した．こ
のものをｐ｝ＩＬｍｙｃのＥｃｏＲＩＢａｍ｝ＩＩ領域
に挿入しブラスミドｐＡＲＳｍｙｃを作製した。このブ
ラスミドでヒトＵ９３７細胞をリポソーム法によって形
質転喚し、１０９６仔牛血清を含むＲＰＭＩｌ６４０培
地を用いて晴二酸化炭素の存在下３７℃で培養した。Blasmid pmyc (manufactured by Onco, structural gene of myc and Rous sarcoIIla virus)
The myc structural gene and LTR were isolated by treating the myc long terminal repeat promoter (LTR) with Bam old, Hindll+, and EcoRI. This product was inserted into the EcoRIBam}II region of p}ILmyc to create a plasmid pARSmyc. Human U937 cells were transformed with this plasmid by the liposome method, and cultured at 37°C in the presence of clear carbon dioxide using RPMI1640 medium containing 1096 calf serum.

３日後ノーザンハイプリダイゼーション法（文献７）を
用いて細胞中のｌｙｃ遺伝子のｍＲＮＡ量を検討し、ｐ
ＡＲＳを有しないＵ９３７細胞のｍＲＮＡ遺伝子の量と
比較したところ、約１００倍であった。従って、ブラス
ミドｐＡＲｓｍｙｃのｍｙｃ遺伝子よりｍＲＮＡが転写
されていると考えられた。After 3 days, the amount of lyc gene mRNA in the cells was examined using the Northern hybridization method (Reference 7), and p
When compared with the amount of mRNA gene in U937 cells that do not have ARS, it was about 100 times higher. Therefore, it was considered that mRNA was transcribed from the myc gene of plasmid pARsmyc.

Ｘ族■１ ｌ）　ヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子のサブクローニングヒトｃ
−ｍｙｃ遺伝子（　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏ＋．，　
”ｑ　　４１４〜４１８　（１９８５））の上流領域に
ある旧ｎｄｌｌｌ　−Ｋｐｎ　Ｉ　領域（約１２００ｂ
ｐ）および｝Ｉｉｎｄｌｌｌ　−Ｐｓｔ　Ｉ領域（約２
００ｂｐ）をそれぞれｐＵｃ１８およびｐＵｃ１９にサ
ブクローニングした。そのクローンのプラスミドを、各
々ｐｍｙｃ（Ｈ一Ｋ）、ｐｍｙｃ　（｝Ｉ−Ｐ）と名付
けた。Group X ■1 l) Subcloning of human c-myc gene human c
-myc gene (Mol. Cell Bio+.,
The former ndlll-Kpn I region (approximately 1200 b
p) and }Iindllll-Pst I region (approximately 2
00bp) were subcloned into pUc18 and pUc19, respectively. The plasmids of the clones were named pmyc (H1K) and pmyc (}I-P), respectively.

２　）　　Ｈ　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩ！−κｐｎｌフラグメ
ントおよび旧ｎｄｌｌｌ−ＰｓｔＩフラグメントとｃ−
ｍｙｃ蛋白との結合ＤＮＡと蛋白との結合を調べる方法
として近年さかんに使われている方法として、ゲルシフ
トアッセイがある。これは、アイソトープ標識したＤＮ
Ａを蛋白と結合させ、単にポリアクリルアミドゲルに流
すといった簡単なもので、ＤＮＡ一蛋白複合体はＤＮＡ
の移動がゲル中で遅れるということを利用したものであ
る（文献１８参照）。2) Hind II! -κpnl fragment and old ndlll-PstI fragment and c-
Binding to myc protein Gel shift assay is a method that has been frequently used in recent years to examine the binding between DNA and protein. This is an isotope-labeled DN
A simple method, such as binding A to a protein and simply running it on a polyacrylamide gel, converts the DNA-protein complex into a DNA-protein complex.
This method takes advantage of the fact that the movement of is delayed in gel (see Reference 18).

Ｃ−１ｙｃ蛋白を大量に産生じている｝ＩＬ−６０細胞
より核抽出液をとり、これをｃ−ｍｙｃ蛋白源とした．
上記ｃ−ｍｙｃ遺伝子の旧ｎｄｌｌｌ　−Ｋｐｎ　Ｉフ
ラグメントおよび旧ｎｄＴＩ１　−Ｐｓｔ　Ｉフラグメ
ントを核抽出液と混合し、３０℃１５分保温後、５ｔボ
リアクリルアミトゲルに流した。A nuclear extract was taken from IL-60 cells, which produce a large amount of C-1yc protein, and this was used as a c-myc protein source.
The old ndlll -Kpn I fragment and the old ndTI1 -Pst I fragment of the c-myc gene were mixed with the nuclear extract, incubated at 30°C for 15 minutes, and then poured onto a 5t polyacrylamide gel.

方、上記抽出液を先にｃ−ｍｙｃ抗体と反応させたもの
を同様に各フラグメントと処理した。結果として、両フ
ラグメントは蛋白と結合したが、予めｃ−ｍｙｃ抗体処
理したものでは阻害された。On the other hand, the above extract was reacted with c-myc antibody and treated with each fragment in the same manner. As a result, both fragments bound to the protein, but this was inhibited by prior treatment with c-myc antibody.

これから、Ｈｉｎｄｌｌｌ−Ｐｓｔ　Ｉフラグメント（
２１０ヌクレオチド）内にｃ−ｍｙｃ蛋白結合部位のあ
ることがわかった。From this, the Hindll-Pst I fragment (
It was found that there is a c-myc protein binding site within 210 nucleotides).

ｐＢｃ　（Ｈ−κ）を旧ｎ　ｄ　ＩＩＩおよびＫｐｎ　
Ｉで、ｐｍｙｃ　（ＩＩ−Ｐ）を旧ｎｄｌｌ＋およびＰ
ｓｔＩでそれぞれ処理して［ｌＮ＾フラグメントとなし
、これらを実施例２と同様に、ｃ−＋ｎｙｃ蛋白と混合
処理、抗体との処理、プロテインＡとの処理および蛋白
分解と除蛋白処理をしてＨｉｎｄｌｌｌ−κｐｎｌフラ
グメントおよび旧ｎｄｌｌｌ　−Ｐｓｔ　Ｉフラグメン
トを得た。pBc (H-κ) with former ndIII and Kpn
In I, pmyc (II-P) was replaced with old ndll+ and P
stI to obtain [lN^ fragments, which were mixed with c-+nyc protein, antibody, protein A, and proteolyzed and deproteinized in the same manner as in Example 2. Hindlll-κpnl fragment and old ndlll-Pst I fragment were obtained.

この旧ｎｄｌｌｌ　−Ｐｓｔ　Ｉフラグメントの塩基配
列をダイデオキシ法で決定した。これを次に示す。The base sequence of this old ndlll-Pst I fragment was determined by the dideoxy method. This is shown below.

＋　　　　　　　　　　　　　　　　　＋０　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　２０ＡＡＧＣＴＴＧＴ
ＴＴ　　　ＧＧＣＣＧＴＴＴＴＡＧＧＧＴＴＴＧＴＴＧ
　　　ＧＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＡＴＧ　　
　ＴＡＣＴＴＧＴＧＡＡＴＴＡＴＴＴＣＡＣＧ　　　Ｔ
ＴＴＧＣＣＡＴＴＡＣＣＧＧＴＴＣＴＣＣ　　　ＡＴＡ
ＧＧＧＴＧＡＴＧＴＴＣＡＴＴＡＧＣ　　　ＡＧＴＧＧ
ＴＧＡＴＡＧＧＴＴＡＡＴＴＴＴ　　　ＣＡＣＡＴＣＴ
ＣＴＴＡＴＧＣＧＧＴＴＧＡ　　　ＡＴＡＧＴＣＡＣＣ
ＴＣＴＧＡＡＣＣＡＡＴ　　　ＴＴＴＴＣＣＴＣＣＡＧ
ＴＡＡＣＴＣＣＴＣ　　　ＴＴＴＣＴＴＣＧＧＡＣＣＴ
ＴＣＴ．ＧＣＡＧ この配列の推定二次構造式を第７図に示す。また、マウ
スＡＲＳのｐＡＲｓ６５およびヒトＡＲＳのｐＨＬｍｙ
ｃとの相補性のある部分とその近辺を第８図に示す。星
印は塩基が一致している部分であり、アンダーラインし
た部分はＡＲＳに必須と考えられるステムルーブ構造の
ステム（軸）部分にあたり、自己複製開始点として重要
なＯＮ＾配列であると考えられ、特に、ＴＧＡＡＴＡＧ
ＴＣＡＣは極めて重要な配列と考えられる。また、ルー
プを形成する部分、例えばＣＡＴＣＴＣＴＴＴＡＴＧＣ
ＧＧＴは、ＤＮＡ結合蛋白（ｍｙｃ蛋白）の認識部位と
して重要であると考えられ、両方を合せた配列ＣＡＴＣ
ＴＣＴＴＴＡＴＧＣＧＧＴＴＧＡＡＴＡＧＴＣＡＣが実
際のＡＲＳ活性発現のために通していると言える。+ +0
20AAGCTTGT
TT GGCCGTTTTTAGGGTTTGTTG
GAATTTTTTTTTTCGTCTATG
TACTTTGTGAATTATTTCACCG T
TTGCCATTACCGGTTCTCC ATA
GGGTGATGTTCATTAGC AGTGG
TGATAGGTTTAATTTT CACATCT
CTTATGCGGTTGA ATAGTCACC
TCTGAACCAAT TTTTCCTCCAG
TAACTCCTCTTTCTTCGGACCT
TCT. GCAG The predicted secondary structural formula of this sequence is shown in FIG. In addition, pARs65 of mouse ARS and pHLmy of human ARS
FIG. 8 shows a portion complementary to c and its vicinity. The asterisk indicates the part where the bases match, and the underlined part corresponds to the stem (axis) part of the stem-lube structure that is considered essential for ARS, and is thought to be an important ON^ sequence as the starting point of self-replication. In particular, TGAATAG
TCAC is considered a very important sequence. Also, a portion forming a loop, for example CATCTCTTTATG
GGT is considered to be important as a recognition site for DNA binding protein (myc protein), and the sequence CATC
It can be said that TCTTTATGCGGTTGAATAGTCAC is used for actual expression of ARS activity.

これらのことから、上記のＤＮＡ配列、またはそれを含
む種々のＤＮＡ配列の自己複製能を利用して培養細胞中
で、または遺伝子導入動物（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ａ
ｎｉｍａｌ）により遺伝子産物を生産させることができ
、そのＤＮＡを含有するブラスミド、そのブラスミドで
形質転換された咄乳動物細胞、それらを利用した遺伝子
産物の製法等は極めて有用であると考えられる。Based on these facts, the self-replication ability of the above DNA sequence or various DNA sequences containing it can be used in cultured cells or in transgenic animals.
plasmids containing the DNA, mammalian cells transformed with the plasmids, and methods for producing gene products using them are considered to be extremely useful.

上記のＤＮＡ配列からなる自己複製配列を利用した種々
の実施態様を示す。Various embodiments using self-replicating sequences consisting of the above DNA sequences are shown.

（ａ）哨乳勤物細胞の自己複製配列ＤＮＡ　，プロモー
ターおよびベブチド類生産用遺伝子（翻訳開始コドンを
含む）を含有するプラスミド （ｂ）＠乳動物細胞の自己複製配列ＤＮＡ　、プロモー
ターおよびペブチド類生産用遺伝子（翻訳開始コドンを
含む）を含有するブラスミドを細胞中で増殖させてベブ
チド類を生産する方法 （ｃ）ＩＩＩＩ乳動物細胞の自己複製配列ＤＮＡ　、プ
ロモーターおよびペブチド類生産用遺伝子（ＩｆＩ訳開
始コドンを含む）を含有するブラスミドを咄乳動物の受
精卵に注入し、この受精卵から遺伝子導入動物生しさせ
る方法 （ｄ）上記遺伝子導入動物の体細胞中で組換遺伝子を発
現させ乳汁中等にペプチト類を生産させる方法 （ｅ）哨乳勤物細胞の自己複製配列ＤＮＡ　．プロモー
ターおよびベブチド類生産用遺伝子（翻訳開始コドンを
含む）を含有するブラスミトで形質転換された補乳勤物
細胞 （ｆ）上記の形質転｝奏咄乳動物細胞を培養してペプチ
ドを生産する方法 ブラスミドｐｍｙｃ（１１−Ｐ）を含有するＥ　．ｃｏ
ｌｉ　ＭＶ１１８４はＦＥＲＭ　ＢＰ−１９３２として
微生物工業技術研究所に受託保管されている。(a) Plasmid containing self-replicating sequence DNA, promoter and peptide production gene (including translation start codon) of mammalian cells (b) Self-replicating sequence DNA, promoter and peptide production of mammalian cells A method for producing peptides by propagating in cells a plasmid containing a gene for peptide production (including a translation initiation codon). A method of injecting a plasmid containing a codon) into a fertilized egg of a mammal, and producing a transgenic animal from this fertilized egg. (e) Self-replicating sequence DNA of sentinel cells. A method for producing peptides by culturing the above-mentioned transformed mammalian cell (f), which has been transformed with a plasmid containing a promoter and a peptide-producing gene (including a translation initiation codon). E. plasmid containing plasmid pmyc(11-P). co
li MV1184 is stored as FERM BP-1932 at the Microbial Technology Research Institute.

実施例４ 実施例２と同様にして各種細脂核ＤＮＡ、蛋白および抗
体を用いて各種プラスミドを得た。Example 4 In the same manner as in Example 2, various plasmids were obtained using various lipid nuclear DNAs, proteins, and antibodies.

ブラスミド名とその原料の関係を表に示す。The relationship between plasmid names and their raw materials is shown in the table.

ｐｍｙｃ　（Ｈ−κ）　，　ｐｍｙｃ　（Ｈ−Ｐ）　、
ｐ　ＩＭＲ−ＮおよびｐＲＪ−５３を各々実施例１の３
）以下と同様にリポソーム法で細胞に導入しコピー数の
検討をした．ブラスミド名、使用細胞およびコピー数を
表に示す。pmyc (H-κ), pmyc (H-P),
pIMR-N and pRJ-53, respectively, in Example 1-3.
) The cell was introduced into cells using the liposome method as described below, and the copy number was examined. Blasmid names, cells used and copy numbers are shown in the table.

く発明の効果〉 本発明によれば、種々の咄乳動物細胞中でＡＲＳの働き
によりプラスミドが効率よく複製され、即ちブラスミド
の細胞当りのコピー数が多いことから遺伝子産物の生産
効率が優れており、本発明は遺伝子工学的に優れたべブ
チド類の生産方法である． 参照文献 文献Ｉ　　Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．ＢＩｏｌ，．５．　５６
３−５６８　（１９８５）文献２　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６．３７５５　（１９
７９Ｊ文献３　Ｊ．Ｖｉｒｏ１ｏｇｙ，４８，４８１−
４９１　（１９８１）文献４　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１５
，１６６　（１９８２）文献５　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５．４１９４　（１９７
８）文献６　Ｊ．Ｍｏ１．Ｂｉｏ１．，９３，５０３−
５１７　（１９７５）文献７　Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ　
ｅｔ　ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｌｌ：ｌｏｎｉｎｇ
．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ　（１９８２）文献８　宗村編　細胞培養マ
ニュアル　講談社文献９　κ．Ｈａｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ
．，Ｆｏｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｉ
ｎ　ＶＩｒｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｊｃ　Ｐｒｅｓｓ
，Ｎ．Ｙ．（１９６９）文献ｌＯκｒｕｓｅ　＆　Ｐａ
ｔｔｅｒｓｏｎ　，Ｔｉｓｓｕｅ　ＣｕｌｔｕｒｅＡｃ
ａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９７３）文
献１１　Ｊ．Ｍｏ１．８ｉｏ＋．，２６，３８５−３６
９　（１９６７）文献１２　ＭｏＩＪｅ１１．８ｉｏ＋
．，３，１９５８−１９６８　（１９８３）文献１３　
Ｓｃｉｅｎｃｅ　　２２５，７１８−７２０　（１９８
４）文献１４　Ｎａｔｕｒｅ　２９６，２６２−２６４
　（１９８２）文献１５　Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．Ｂｉｏ
ｃｈｅ＋＋＋．５２，３０１−３１０　（１９８３）文
献１１ｉ　Ｃａｌｌ　１３，１６５（１９７８）文献１
７　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３５．　１３９４−１３９９　
（１９８７）文献１８　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒ
ｅｓ．，９　３０４７　〜３０６Ｇ（１９８！）Effects of the Invention> According to the present invention, plasmids are efficiently replicated in various mammalian cells by the action of ARS, that is, the number of copies of plasmid per cell is large, so the production efficiency of gene products is excellent. Therefore, the present invention is a method for producing bebutides using genetic engineering. References Document I Mo1. Cell. BIol,. 5. 56
3-568 (1985) Reference 2 Proc. Natl
．． Acad. Sci. USA, 76.3755 (19
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491 (1981) Reference 4 Science, 215
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【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]

第１図乃至第４図はプラスミドの構築概略図であり第５
図乃至第７図は推定二次構造である。 第８図はＤＮＡ配列の比較図である。Figures 1 to 4 are schematic diagrams of plasmid construction;
Figures 7 to 7 are estimated secondary structures. FIG. 8 is a comparison diagram of DNA sequences.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 次の塩基配列を有するＤＮＡ 【遺伝子配列があります】[Claims] DNA with the following base sequence [There is a gene sequence]