JPH02122267A

JPH02122267A - ヘモグロビン定量試薬キット及びそれを用いるヘモグロビン定量方法

Info

Publication number: JPH02122267A
Application number: JP27638788A
Authority: JP
Inventors: Masahiro Funayama; 船山　政弘; Asami Takada; 麻美高田; Miho Tsubouchi; 坪内　美保; Midori Nagatomo; 永友　緑
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1988-11-01
Filing date: 1988-11-01
Publication date: 1990-05-09

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は臨床検査領域のヘモグロビンの定量方法及びそ
れに用いる定量試薬キットに関し、更に詳しくは、テト
ラメチルベンジジンを酸化発色剤とする所謂カラー法に
よるヘモグロビンの定量に関する。

〔背景技術〕

血漿、血清及び尿中のヘモグロビン（以下Ｈｂと略す）
の量の変動は、血管的溶血の程度を知る上、また泌尿器
の疾病を診断する上端床上きわめて重要である。例えば
近時開心術の補助手段として対外循環が比較的安全に行
なわれる様になった。

しかし、体外循環中、生体は非生理的条件下に置かれる
為、様々な合併症を生じることがある。その中でも人工
心肺を用いた体外循環により生じる溶血は、術後腎不全
の主要な原因と考えられている。血漿中の遊離Ｈｂの定
量は体外循環時の溶血度を知る為の有効な検査法である
。

Ｈｂの臨床的測定、定量法は種々提案されかつ実施され
ている。分光光度計を用い希釈試料を直接測定する方法
は、操作は簡単であるか測定波長領域における他の血液
成分例えばビリルビン、乳び、更には混濁の影響をうけ
やすく高値側へ誤差を生じ易い。

Ｈｂはフェリシアン化カリウムで容易に酸化され、メト
ヘモグロビンになる。メトヘモグロビンは更にシアン化
カリウムによってンアンメトヘモグロビン（赤褐色）に
なり、５４０〜５４２ｎｍに吸収極大を示すので、この
波長領域の吸光度を測定する事により比色定量する。こ
の方法は１９６４年国際血液学会標準規格委員会から勧
告された方法であって、フェリシアン化カリウム及びシ
アン化カリウムを含む溶液の発色原液とシアンメトヘモ
グロビン標準溶液とよりなるキットとして市販されてい
る。市販品の説明書によると、標準溶液と発色溶液との
反応による検量線は、吸光度（ｙ）とヘモグロビン濃度
（χ）との間に、Ｈｂ４．５ｇ／ｄΩから１８．０ｇ／
ｄΩまでの実測において］：１の直線関係があることが
示されている。すなわち、この方法（以下シアンメト国
際標準法という）は、４．５ｇ／ｄＢ〜１８．０ｇ／ｄ
Ωのような比較的高濃度のＨｂの定量には適するけれど
も、４５００ｍｇ／ｄΩ以下の濃度、例えば１．ＯＯ＋
ｎｇ／ｄｊｌｌ以下のような低濃度のＨｂの定量には不
適であると推定できる。実際にシアンメト国際標準法で
定量した高濃度のＨｂ温溶液０及び１．０，２０，３０
，４０，５０，６０，７０゜８０．９０，１００＋ｎｇ
／ｄＪ７の濃度に希釈したものを用いてシアンメト国際
標準法で再定量、検量線を書くと、その検量線は直線に
ならない。つまるところ、この方法では０〜１００ｍｇ
／ｄΩの濃度のＨｂに対しては、正確な測定値が得られ
ない。

Ｈｂは、過酸化水素を分解するペルオキシダーゼ様作用
を有する。この作用を利用して元来無色のベンジジン化
合物を過酸化水素を介して酸化して発色させる反応によ
りＨｂを比色定量することができる。この方法は従来微
量のＨｂの定量方法の主流であった。ベンジジンそのも
のの発癌性が指摘されて以来、発癌性のない３．３’　
、５゜５′−テトラメチルベンジジン（以下ＴＭＢと称
す。）がこれに代った。これを本文においてカラ法と称
する。

ペルオキシダーゼ様作用Ｈ２Ｏ２２Ｈ２０ＨＣＣＨＣＨＨＣＣＨ３ＣＨ３還元型色原体　　　　　　酸化型色原体（無　色）　　
　　　　　　　（緑　色）発色を６６０　ｎｍで比色す
ることによりＨｂを定量する（Ｍｅｄｉｃａｌ　　Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、１３．Ｎｏ、Ｌ２．　ＰＰ
１２６４）　　。

カラー法を実施するのに次の試薬を用い、第１表の手順
による。

〈試　薬〉１）ＴＭＢ試薬：ＴＭＢ　　０．１ｇを９０％酢酸溶液
に溶解し、全量を１００ｍｇとする（４℃、３週間安定
）。

２）過酸化水素水■：３０％過酸化水素０，５ｍｇを蒸
留水２９．５ｍｇに加える（６〜８時間安定）。

３）過酸化水素水■：３０％過酸化水素０．１ｍｇを蒸
留水２９．９ｍ、Ｑに加える（６〜８時間安定）。

４）１０％酢酸溶液５）Ｈｂスタンダード（濃度約５０ｍｇ／ｄΩの希釈溶
液）第１表Ａ：試料の吸光度、Ａｓｔニスタンダートの吸光度、Ｓ
ｃニスタンダートのの濃度。

もし高い感度を必要とする時は１０％酢酸溶液を１／２
フイ１−（ｆｉｔ）にする。

ここに、ＴＭＢは、中性では殆ど水に解けないため、９
０％酢酸溶液として用いているので強酸性を示し、また
、この試薬の保存可能期間も極めて短い。また過酸化水
素試薬は用時調製を必要とし、また、測定操作か繁雑で
あるため（検量線の作成と検体とでは測定操作が異なる
）、この方法を自動分析器にかけるには問題がある。

また、過酸化水素の代りに過酸化ストロンチウムを用い
、酢酸カルシウム及びクエン酸と共にＴＭＢを固形剤と
して含む糞便中の潜血検査試薬も販売されているが、裸
眼による呈色の有無による検査方法であって到底定量を
］」的としたものではない（マイルス・三共株式会社：
へマチスト■）。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、血漿、血清及び尿中のヘモグロビンの微量定
量を可能とし、しかも自動分光光度計の使用に適う定量
用試薬キット及びそれを用いる方法を提供する。

本発明のＨｂ定量方法に用いる定量用試薬キットは、試薬１：ＴＭＢ及びクエン酸を含む水溶液試薬■：過酸
化ストロンチウムを含む水溶液及びＨｂスタンダード：シアンメト国際標準法で正確に含量
を定量した一定量度のＨｂ水溶液よりなる。

試薬■に含まれるクエン酸の量は、それを含む水溶液か必要量のＴＭＢを溶解するに足れば
よい。本発明の定量法において必要なＴらＭＢの量は、実際上の微量のＨｂに対応する０、２〜０
．３ｍｇ／ｍｌであるので、これを溶液に保つ量１．５
〜２．５ｍｇ／ｍ、Ｑである。

かくして、試薬■の水溶液はＴＭＢ２０〜３０ｍｇおよ
びクエン酸１５０〜２５０　ｍｇを水（好ましくは精製
水）１００ｍβに溶解した後にフィルタ（好ましくは０
．４５μｍ孔径）で濾過して得られる。また、試薬■の
水溶液は過酸化ストロンチウム６０〜９０ｍｇを水（好
ましくは精製水）１００ｍｌに溶解した後にフィルター
（好ましくは０．４５μｍ孔径）で濾過して得られる。

両試薬とも各々遮光のもと冷蔵（２〜］０°Ｃ）すれば
最低３ケ月の保存に耐え使用に供すことができる。

また、尿中のＨｂを４１１定するためには、２〜４％過
酸化水素水溶液をキットに含むことが好ましい。

上記のキットを用い血漿、血清又は尿などの中のＨｂの
微量定量は次のようにして行なう。

試薬■及び試薬■を用時混合する。混合比としは、］対
］程度か好ましい。しかる後にＨｂを含む一定量の検体
（例えば、血清、血漿、尿等）を添加して、１０〜３７
℃で一定時間（１〜６０分間程度）反応させる。さらに
、特定波長（３６５−３７５ｎｍあるいは６４５〜６５
５ｎｒＩＩ）における吸光度をブランクを対照として測
定する。同様の操作により作成した検量線（ヘモグロビ
ン濃度θ〜１００ｍｇ／ｄρ程度）から検体中のヘモグ
ロビン濃度を求める。

検量線を作成するために用いられる検体に代る対象は、
検体に相当する健康人の血漿、血清又は尿なとに種々の
濃度（〜１００ｍｇ／ｄΩ）にＨｂスタンダードを加え
たものが用いられる。Ｈｂスタンダードは高濃度のＨｂ
の水溶液であって、Ｈｂはシアンメト国際標準法により
正確にその含量を定量しておく。比色定量は、自動分光
光度計により簡単に行なうことができる。

定量に用いる波長領域は予め次のようにして定める。

例えば、ＨＩＴＡＣＨＩ　ＵＶ−ＶＩＳＩＢＩ、Ｅ　Ｒ
ＥＣＯＩ？ＤＩＮＧＳＰＥＣＴＲＯＰＨＯＴＯＭＥＴＥ
Ｉ？　ＵＶ−２４０を用いて（１）健康人血漿、（２）
ヒトヘモグロビン、（３）健康ヒト血漿十ヒトヘモグロ
ビン及び（４）被検ヒト血漿（含ヘモグロビン）十発色
試薬の吸収曲線を画いた（各吸収曲線を第１図にまとめ
た。）同様にして、（５）健康人尿、（６）ヒトヘモグロビン、（７）健康
人原子ヒトヘモグロビン、（８）被検ヒト尿（含へモク
ロビン）十発色試薬の吸収曲線を画き、これらを第２図
にまとめた。

以上に示した吸収曲線から血漿、血清、尿など中のヘモ
グロビンは共通して３７０ｎｍまたは６５０　ｎｍで比
色定量可能な事かわかる。

本発明のＨｂ定量法は０〜１００ｍｇ／ｄΩのＨｂ微量
領域て再現性よく、かつ自動分光光度計の使用を可能と
する方法であって、これを非限定的実施例をもって更に
説明する。実施例において使用された試薬は次の通りで
ある。

試薬■、クエン酸３８４　ｍｇおよびＴ　Ｍ　Ｂ　５２
　ｍｇを精製水に溶解して全量を２００ｍ、＆とした後
にフィルター（孔径０゜４５ μｍ）でｉ濾過する。

試薬■：過酸化ストロンチウム１５４ｍｇを精製水に溶
解して全量２００ｍｇとした後にフィルター（孔径０．４５μｍ）で枦遇する。

実施例］溶血していない健康人血漿に、シアンメト国際標準法に
より正確に定量したヘモグロビンを添加し、これを希釈
して１０，２０，３０，４０゜５０　６０．７０，８０
，９０，１００ｍｇ／ｄＲの濃度のヘモグロビン含有血
漿を調製した、試薬Ｉ及び試薬■の等量混合により調製
した発色試薬１ｍｌに各々の濃度のヘモグロビン含有血
漿１０μｇを添加、混合し、３７℃で正確に１０分間イ
ンキュベートした後、自己ブランクを対照として自動分
光光度計で６５０　ｎｍの吸光度を測定し、検量線（第
３図）を作成した。シアンメト国際標準法によりヘモグ
ロビン濃度を１００ｍｇ／ｄｊ）以下と判定された溶血
血漿について同様の操作を行ない、６５０　ｎｍの吸光
度を測定し、検量線から血漿中のヘモグロビン濃度を求
めた。

　ｚ実施例２実施例１を繰返した。但し発色試薬１ｍｌに各々の濃度
のヘモグロビン含有血漿の添加量を１００μｍとした。

得られた検量線を第４図に示す。

実施例３健康人尿にシアンメト国際標準法により正確に定量した
ヘモグロビンを添加し、１．０．２０゜３０．４０，５
０，６０，７０，８０，９０゜１００ｍｇ／ｄρの濃度
のヘモグロビン含有尿を調製した。試薬（１）及び試薬
（ＩＩ）の等量混合により調製した発色試薬１ｍ、Ｉｌ
ｌに各々の濃度のヘモグロビン含有尿１００μｇを添加
、混合し、３７°Ｃで正確に１０分間インキュベートし
た後、自己ブランクを対照として自動分光光度計で３７
０ｎＩｒｌの吸光度を測定し、検量線（第５図）を作成
した。シアンメト国際標準法により、ヘモグロビン濃度
１００＋ＩＩｇ／ｄρ以下と判定された血尿について同
様の操作を行ない、３７０　ｎｍの吸光度を測定し、検
量線から血尿中のヘモグロビン濃度を求めた。

実施例４健康人尿にシアンメト国際標準法により正確に定量した
ヘモグロビン溶液を添加し、２０，４０゜６０．８０，
１００ｍｇ／ｃｌＱの濃度のヘモグロビン含有床を調製
した。

試薬（１）及び試薬（ＩＩ）の等量混合により調製した
発色試薬１．９ｍｇに３％Ｈ２０２溶液１００μｌを添
加し、更に各々の濃度のヘモグロビン含有床５μｌを添
加、混合し、３７℃で正確に１０分間インキュベートシ
た後、自己ブランクを対照として自動分光光度計で３７
０　ｎｍの吸光度を測定し、検量線（第６図）を作成し
た。

シアンメト国際標準法により、ヘモグロビン濃度１、　
ＯＯ「ｇ／　ｄβ以下と判定された血尿について同様の
操作を行ない、３７０ｎｍの吸光度を測定し、検量線か
ら血尿中のヘモグロビン濃度を求めた。

実施例５溶血してない健康人血漿にシアンメト国際標準法により
正確に定量したヘモグロビンを添加し、２０．４０，６
０，８０，１００ｍｇ／ｄΩの濃度のヘモグロビン含有
血漿を調製した。試薬（Ｉ）及び試薬（ｎ）の等量混合
により調製した発色試薬２ｍβに各々の濃度のヘモグロ
ビン含有血漿５μｌを添加、混合し、３７℃で正確に１
０分間インキュベートした後、自己ブランクを対照とし
、３７０　ｎｍの吸光度を７１１１１定し、検量線（第
７図）を作成した。シアンメト国際標準法によりヘモグ
ロビン濃度１００ｍｇ／ｄｌ以下と判定された溶血血漿
について同様の操作を行ない、３７０ｎＩ１１の吸光度
を測定し、検量線から溶血血漿中のヘモグロビン濃度を
求めた。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、それぞれ本発明の比色分析に用い
る特定波長を求めるための関連組成物の自動分光光度計
による吸収曲線を示す図、及び第３〜第７図は、それぞ
れ順次実施例１〜５に対応する本発明の定量法に用いら
れる検量線を示す図である。１・・・健康人の血漿、２・・・ヒトヘモグロビン、３
・・・健康人血漿子ヒトヘモグロビン、４・・・被検人
血漿（含ヘモグロビン）十発色試薬、５・・・健康人尿
、６・・・ヒトヘモグロビン、７・・・健康人尿＋ヒト
ヘモグロビン、８・・・被検人尿（含ヒトヘモグロビン
）十発色試薬。

Claims

【特許請求の範囲】１、（イ）　３，３′、５，５′−テトラメチルベンジ
ジン及びクエン酸を含む水溶液、ならびに（ロ）過酸化
ストロンチウムを含む水溶液よりなるヒトヘモグロビン
定量試薬キット。２、キットが（ハ）ヒトヘモグロビンのスタンダード水
溶液を更に含む請求項１記載のキット。３、（イ）の水溶液が３，３′、５，５′−テトラメチ
ルベンジジン２０〜３０ｍｇ／１００ｍｌ及びクエン酸
１５０〜２５０ｍｇ／１００ｍｌの割合である請求項１
記載のキット。４、（ロ）の水溶液が過酸化ストロンチウムを６０〜９
０ｍｇ／１００ｍｌの割合で含む請求項１記載のキット
。５、（イ）３，３′、５，５′−テトラメチルベンジジ
ン及びクエン酸を含む水溶液と（ロ）過酸化ストロンチ
ウムを含む水溶液とを用時混合し、混合液にヘモグロビ
ンを含む検体を加え、反応発色させ、比色定量すること
からなるヘモグロビンの定量方法。６、ヘモグロビンを含む検体がヒトの血漿、血清又は尿
である請求項５記載の方法。７、（イ）の水溶液と（ロ）の水溶液の混合物に２〜４
％の濃度の過酸化水素溶液を更に加える請求項５記載の
方法。８、比色定量を、６４５〜６５５ｎｍ又は３６５〜３７５ｎｍの波長における吸光度に基づいて行
なう請求項５記載の方法。９、比色定量を自動分光光度計を用いることにより行な
う請求項５記載の方法。１０、比色定量を、１連の濃度にヘモグロビンを添加し
たヘモグロビン不含のスタンダード検体より得られた検
量線に基づいて行なう請求項５記載の方法。