JPH02119798A - Method for measuring activity of urokinase inhibitor - Google Patents
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
この発明は、ウロキナーゼインヒビターの活性測定法に
関し、さらに詳述するならば、血栓症治療において、ウ
ロキナーゼ、組織アクチベータ、ストレプトキナーゼ、
および、プラスミン−ストレプトキナーゼ複合体の何れ
かが血栓症の患者に投与された際に、その患者の血液中
に減少するところのウロキナーゼインヒビターの活性を
測定する方法で、そのウロキナーゼ、組織アクチベータ
、ストレプトキナーゼ、および、プラスミン−ストレプ
トキナーゼ複合体の有効投与量の判定に役立つところの
ウロキナーゼインヒビターの活性測定法に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Field of Industrial Application This invention relates to a method for measuring the activity of urokinase inhibitors, and more specifically, in the treatment of thrombosis, urokinase, tissue activator, streptokinase,
A method for measuring the activity of urokinase inhibitor, which decreases in the blood of a patient with thrombosis when any of the plasmin-streptokinase complexes is administered to a patient with thrombosis. The present invention relates to a method for measuring the activity of urokinase inhibitors, which is useful in determining effective doses of kinases and plasmin-streptokinase complexes.
背景技術
今日では、ヒトの胎盤中には、多量のウロキナーゼイン
ヒビターが存在し、部分精製されて、それの性状が明ら
かにされている。BACKGROUND ART Today, a large amount of urokinase inhibitor is present in the human placenta and has been partially purified and characterized.
そして、妊婦尿中には、胎盤から分泌されたところの胎
盤性ウロキナーゼインヒビターが認められ、それが、ま
た、妊娠の進行につれて増減する。Placental urokinase inhibitors secreted from the placenta are found in pregnant women's urine, and this increases and decreases as the pregnancy progresses.
その妊婦尿中のウロキナーゼインヒビターに関する通常
の活性測定法は、専ら尿に既知量のウロキナーゼを混和
し、その既知量のウロキナーゼの減少をもって、ウロキ
ナーゼインヒビターの活性としていた。しかしながら、
尿中には、ウロキナーゼインヒビターを上回る量のウロ
キナーゼが存在するので、これを除去しないところのそ
の通常のウロキナーゼインヒビターの活性測定法では、
見かげ上のウロキナーゼインヒビターの活性が測定され
たことになる。勿論、その通常の活性測定法は、妊婦以
外のヒトの尿や血液については、ウロキナーゼインヒビ
ターの活性を測定することが困難であった。The conventional method for measuring the activity of urokinase inhibitors in the urine of pregnant women is to mix a known amount of urokinase into the urine and measure the activity of the urokinase inhibitor as a decrease in the known amount of urokinase. however,
Since there is an amount of urokinase in urine that exceeds the amount of urokinase inhibitor, the usual method of measuring the activity of urokinase inhibitor, which does not remove this amount,
This means that the apparent activity of urokinase inhibitor was measured. Of course, it is difficult to measure the activity of urokinase inhibitors in the urine and blood of humans other than pregnant women using the conventional activity measurement method.
そして、具体的には、その通常の活性測定法は、妊婦尿
中のウロキナーゼインヒビターの活性も実際の値よりも
低いところの見かけの値を測定していたにすぎなかった
。Specifically, the conventional activity measurement method only measured the apparent value of the activity of urokinase inhibitor in the urine of pregnant women, which was lower than the actual value.
発明の目的・課題
この発明の目的・課題は、ヒトの血液、尿、および体液
中のウロキナーゼインヒビターの活性を迅速、高感度、
正確で、かつ、簡単に測定可能にするところのウロキナ
ーゼインヒビターの活性測定法の提供にある。OBJECTIVES AND PROBLEMS OF THE INVENTION The purpose and problem of the present invention is to rapidly, highly sensitively, and
An object of the present invention is to provide a method for measuring urokinase inhibitor activity that is accurate and easy to measure.
目的・課題に係る構成上の発明の概要：請求する発明の
内容
上述の目的・課題に関連して、この発明のウロキナーゼ
インヒビターの活性測定法は、合成基質あるいはプラス
ミノーゲン含有フィブリン平板、および、親和性カラム
を用いて、ウロキナーゼインヒビターの活性を測定する
ところにあって、その場合、ウロキナーゼに対する抗体
を固定化しであるカラムを用いるところにある。Summary of the invention in terms of structure related to objects/problems: Contents of the claimed invention In relation to the above-mentioned objects/problems, the method for measuring the activity of a urokinase inhibitor of the present invention provides a synthetic substrate or a fibrin plate containing plasminogen, and a method for measuring the activity of a urokinase inhibitor. The activity of a urokinase inhibitor is measured using an affinity column, in which case a column on which an antibody against urokinase is immobilized is used.
すなわち、この発明のウロキナーゼインヒビターの活性
測定法は、高度に精製されたウロキナーゼを動物に免疫
して、ウロキナーゼに対する特異抗血清を作製し、そし
て、これのＩｇＧ分画をセファロースカラムに固定化さ
せて抗ウロキナーゼ固定化カラムを作製し、ヒトの血液
、尿、および体液をそのカラムに通過させてこれらの中
に含まれているウロキナーゼを取り除き、そして、通過
分画に既知量のウロキナーゼを添加し、そのウロキナー
ゼ活性の阻害量を合成基質あるいは天然基質を用いて定
量化するところにある。That is, the method for measuring the activity of a urokinase inhibitor of the present invention involves immunizing an animal with highly purified urokinase to prepare a specific antiserum against urokinase, and then immobilizing the IgG fraction of this on a Sepharose column. An anti-urokinase immobilized column is prepared, human blood, urine, and body fluids are passed through the column to remove the urokinase contained therein, and a known amount of urokinase is added to the flow-through fraction, The purpose is to quantify the amount of inhibition of urokinase activity using synthetic or natural substrates.
そのようにして、この発明のウロキナーゼインヒビター
の活性測定法は、ヒトの生体中におけるウロキナーゼイ
ンヒビター量の正確な値が判明できるところにあり、そ
の結果、生体中における線溶の程度を把握可能にし、ま
た、血栓性疾患におけるウロキナーゼ、組織アクチヘー
タ、ストレプトキナーゼ、およびプラスミンースＩ・レ
ゾ１キナーゼ複合体の何れかの投与時においては、適切
なウロキナーゼ、組織アクチヘータ、ストレプトキナー
ゼ、およびプラスミン−ストレプトキナーゼ複合体の投
与量を知得可能にし、さらに、腎疾患、心筋梗塞、脳血
栓症、悪性腫瘍、および妊娠においては、血栓の進展お
よび線溶の状態を知得可能にする。In this way, the method for measuring the activity of urokinase inhibitor of the present invention makes it possible to determine the exact amount of urokinase inhibitor in the human body, and as a result, it becomes possible to understand the degree of fibrinolysis in the body. In addition, when administering any of urokinase, tissue acti- heta, streptokinase, and plasmin-reso-1 kinase complex in thrombotic diseases, appropriate urokinase, tissue acti- cheta, streptokinase, and plasmin-streptokinase complex should be administered. It makes it possible to know the dosage, and also makes it possible to know the progress of thrombus and the state of fibrinolysis in renal diseases, myocardial infarction, cerebral thrombosis, malignant tumors, and pregnancy.
また、この発明のウロキナーゼインヒビターの活性測定
法の特徴について、さらに詳述するならば、発明者は、
ヒトの血液（血漿）、尿、および体液（腹水、膨水）の
中に含まれているところのウロキナーゼとうロキナーゼ
インヒビターとを分離するために、ウロキナーゼ抗体カ
ラム、あるいは、ｐ （パラ）−アミノベンザミジンセ
ファロースを導入し、これらにそのウロキナーゼのみを
吸着させ、そして、そのウロキナーゼインヒビターを素
通りさせて両者の分離に成功し、そして、その素通りし
たウロキナーゼインヒビターに既知量のウロキナーゼを
混和し、減少したウロキナーゼの活性を特異的合成基質
、あるいは、寒天フィブリン（フィブリンプレート）に
よって測定し、その血液、尿、および体液の中のウロキ
ナーゼインヒビターのみを正確に、かつ、選択的に、し
かも、再現性よく測定することに成功したところにある
。In addition, to explain in more detail the characteristics of the method for measuring the activity of urokinase inhibitors of this invention, the inventors:
Urokinase antibody columns or p (para)-amino By introducing benzamidine Sepharose, only the urokinase was adsorbed, and the urokinase inhibitor was allowed to pass through, successfully separating the two. Then, the urokinase inhibitor that passed through was mixed with a known amount of urokinase, and the amount was reduced. Urokinase activity is measured using a specific synthetic substrate or agar fibrin (fibrin plate), and only urokinase inhibitors in blood, urine, and body fluids are measured accurately, selectively, and reproducibly. This is where we succeeded in doing so.
勿論、その特異的合成基質は、ウロキナーゼに対するも
ので、それには、ｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇｐ
Ｎａ （Ｋａｂｉ社：スウェーデン）、あるいは、Ｇ
ｌｕＧｌｙ −Ａｒｇ −ＭＣＡ （ペプチド研究所二
大阪）が使用され、また、その寒天フィブリンは、天然
基質であるプラスミノーゲンを含有するものである。Of course, its specific synthetic substrate is for urokinase, which includes pyro-Glu-Gly-Argp.
Na (Kabi: Sweden) or G
luGly-Arg-MCA (Peptide Institute Ni-Osaka) was used, and its agar fibrin contains the natural substrate plasminogen.
一方、発明者の研究によれば、健常者の尿中には、ウロ
キナーゼインヒビター活性は、殆んど認められず、認め
られても極めて低い値で、多くは複合体を形成している
と考えられ、そして、各種の腎炎、糖尿病性腎症、悪性
腫瘍、妊婦尿中に認められることが明らかであり、ウロ
キナーゼインヒビター活性を測定することは、これらの
病態との関係の解明や治療に大いに役立つものである。On the other hand, according to the inventor's research, urokinase inhibitor activity is hardly observed in the urine of healthy people, and even when it is observed, it is at an extremely low level, and it is thought that most of it forms a complex. It is clear that urokinase inhibitor activity is observed in various types of nephritis, diabetic nephropathy, malignant tumors, and in the urine of pregnant women, and measuring urokinase inhibitor activity will be of great help in elucidating the relationship with these pathological conditions and treating them. It is something.
さらには、心筋梗塞、脳梗塞、動静脈血栓症、腎疾患の
治療でウロキナーゼを静注すると、血液中のウロキナー
ゼインヒビター活性が低下されることも発明者によって
明らかにされたことから、血液中のウロキナーゼインヒ
ビター活性を測定することは、これら疾患の治療に多大
な有益をもたらす。Furthermore, the inventors have also found that intravenous injection of urokinase in the treatment of myocardial infarction, cerebral infarction, arteriovenous thrombosis, and renal disease reduces urokinase inhibitor activity in the blood. Measuring urokinase inhibitor activity has great benefits in the treatment of these diseases.
また、血液中には、３種類の免疫学的に異ったウロキナ
ーゼインヒビターが存在することも知られ、それぞれ、
プラスミノーゲンアクチヘーク・タイプ１、タイプ２、
およびタイプ３ （ＰＡＩＩ、ＰＡｈ、およびＰＡＩ３
）と呼ばれている。It is also known that there are three immunologically different types of urokinase inhibitors in the blood;
Plasminogen actihake type 1, type 2,
and type 3 (PAII, PAh, and PAI3
)It is called.
そのタイプ１は、血管内皮細胞由来、タイプ２は、胎盤
由来、そして、タイプ３は、プロティンＣインヒビター
と言われているものと同じである。Type 1 is derived from vascular endothelial cells, type 2 is derived from placenta, and type 3 is the same as what is called protein C inhibitor.
そして、発明者の方法によるウロキナーゼインヒビター
は、これら３種のウロキナーゼインヒビターの総和とし
て測定することが可能になる。Then, the urokinase inhibitor according to the inventor's method can be measured as the sum of these three types of urokinase inhibitors.
そのように、この発明によって、ヒトの血液、尿、およ
び体液の中に含まれるウロキナーゼインヒビターの活性
が正確に測定可能になる。As such, the present invention allows the activity of urokinase inhibitors contained in human blood, urine, and body fluids to be accurately measured.
具体例の説明
以下、この発明のウロキナーゼインヒビターの活性測定
法の特定された具体例について、図を参照して説明する
。Description of Specific Examples Specific examples of the method for measuring the activity of a urokinase inhibitor of the present invention will be described below with reference to the drawings.
具体例１
この測定法は、先ず、ウロキナーゼを精製し、次いで、
そのウロキナーゼを動物に注射して免疫させて抗血清を
得て、そして、その抗血清のイムノグロブリンＧ分画を
精製し、これをセファロースカラムに固定化し、このカ
ラムを用いてウロキナーゼインヒビター活性を測定する
ところにある。Specific Example 1 In this measurement method, first, urokinase is purified, and then,
The urokinase is injected into an animal and immunized to obtain an antiserum.The immunoglobulin G fraction of the antiserum is then purified and immobilized on a Sepharose column, and the urokinase inhibitor activity is measured using this column. It's there.
そこで、そのウロキナーゼの精製から述べる。Therefore, we will discuss the purification of urokinase.
これは、市販のウロキナーゼ製剤（１バイヤル６万単位
含有）をバラアミノヘンザミジンセファロースカラムに
通し、ウロキナーゼを吸着させて、賦形剤や安定化剤を
取り除き、０．０１Ｍリン酸、０、５ Ｍ Ｎａｃｌ緩
衝液ｐ）１７．６で十分に洗滌した。This is done by passing a commercially available urokinase preparation (one vial contains 60,000 units) through a column of aminohenzamidine Sepharose to adsorb urokinase, removing excipients and stabilizers, and adding 0.01M phosphoric acid, Wash thoroughly with 5 M NaCl buffer p) 17.6.
次いで、０．１Ｍ酢酸でその吸着されたウロキナーゼを
？容量させた。Then, remove the adsorbed urokinase with 0.1M acetic acid. Capacity increased.
その後、０．５Ｍ炭酸重炭酸緩衝液ｐＨ９，５で中和し
て、そのウロキナーゼを精製した。The urokinase was then purified by neutralization with 0.5M carbonate-bicarbonate buffer pH 9.5.
次には、そのウロキナーゼをフロイントの完全アジュバ
ントと等量ずつ混和し、家兎に２ｒｎｐ、を注射し、免
疫を行なった。Next, the urokinase was mixed with Freund's complete adjuvant in equal amounts, and 2rnp was injected into rabbits for immunization.
４週間後および８週間後に同様の操作を行ない、そして
、その家兎から採血して抗血清を得た。After 4 and 8 weeks, the same operation was performed, and blood was collected from the rabbit to obtain antiserum.
次に、そのようにして得られたウロキナーゼ抗血清から
イムノグロブリンＧ分画（ＩｇＧ分画）を精製する。す
なわち、その家兎のウロキナーゼ抗血清を等量の整理食
塩水で希釈してプロティンＡセファロースカラムに添加
し、そして、０．０１Ｍリン酸、０．５ Ｍ Ｎａｃｌ
緩衝液ｐｌ（７，６で十分に洗滌して後、そのカラムに
吸着したＩｇＧ分画を１Ｍ酢酸で溶出させ、さらに、そ
れを０．５Ｍ炭酸重炭酸緩衝液ｐＨ９，５で中和して抗
つロキナーゼ家兎ｒｇｃ分画を得た。Next, an immunoglobulin G fraction (IgG fraction) is purified from the urokinase antiserum thus obtained. Briefly, the rabbit urokinase antiserum was diluted with an equal volume of saline, applied to a protein A Sepharose column, and then diluted with 0.01 M phosphoric acid, 0.5 M NaCl.
After thorough washing with buffer pl (7.6), the IgG fraction adsorbed on the column was eluted with 1M acetic acid, and further neutralized with 0.5M carbonate-bicarbonate buffer pH 9.5. Anti-Turokinase rabbit RGC fraction was obtained.
次に、その抗つロキナーゼ家兎１ｇＧ分画をセファロー
スカラムに固定する。すなわち、この抗つロキナーゼ家
兎１ｇＧ分画を０．１Ｍリン酸緩衝液ｐ１１７．８で中
和し、そして、予め、０．００１Ｎ塩酸で活性化してお
いたＣＮＢｒ−セファロース４Ｂ（ファルマシア社製：
スウェーデン）と混合し、次に示した緩衝液（１）ない
しく４）でその抗つロキナーゼ家兎ＩｇＧ分画が固定さ
れたところのそのカラムを洗滌した。Next, the anti-Turokinase rabbit 1gG fraction is immobilized on a Sepharose column. That is, this anti-Turokinase rabbit 1gG fraction was neutralized with 0.1M phosphate buffer p117.8, and CNBr-Sepharose 4B (manufactured by Pharmacia: manufactured by Pharmacia: activated in advance with 0.001N hydrochloric acid)
Sweden) and the column on which the anti-rokinase rabbit IgG fraction was immobilized was washed with the following buffers (1) to 4).
（１）０．１Ｍリン酸緩衝液ｐｌ＋７．６ ５００
ｍｌ。(1) 0.1M phosphate buffer pl+7.6 500
ml.
（２） ０．０５ Ｍ トリス−リン酸（Ｈ３ＰＯ，
）緩衝液ｐＨ８，６５００ｍＲ。(2) 0.05 M Tris-phosphoric acid (H3PO,
) Buffer pH 8, 6500mR.
（３） ０．０５ Ｍ トリス−リン酸（１１３ＰＯ
４）緩衝液ｐＨ４，１５００ｍｌ、
（４） ０．１ Ｍ ’Ｊ ７酸緩衝液ｐＨ７，６５
００ＩＲＱ。(3) 0.05 M Tris-phosphoric acid (113PO
4) Buffer pH 4, 1500ml, (4) 0.1 M'J 7 acid buffer pH 7,65
00IRQ.
この場合、使用した抗血清は、家兎で作製されたが、こ
の方法は、羊、山羊、犬、猫、および豚で作製されたも
のにも、また、マウスを利用したモノクロナール抗体に
も適用できる。In this case, the antisera used were generated in rabbits, but this method also applies to those generated in sheep, goats, dogs, cats, and pigs, as well as monoclonal antibodies made in mice. Applicable.
次には、すなわち、そのようにして、その抗つロキナー
ゼ家兎１ｇＧ分画がそのセファロースカラムに固定化さ
れたならば、そのセファロースカラムの容量２００μ！
に検体（ヒトの尿、血漿、あるいは、体液）の０．５ｄ
を加え、これを素通りさせた。Then, if the anti-Turokinase rabbit 1gG fraction is immobilized on the Sepharose column in this way, the capacity of the Sepharose column is 200μ!
0.5d of specimen (human urine, plasma, or body fluid)
I added this and let it pass.
そして、ウロキナーゼ抗原が取り除かれたところのその
素通り分画の０．０５ ｄに既知量のウロキナーゼ熔液
１００ ＩＩ／ｍｆの０．０５ ｍｌを加え、温度３７
°Ｃで１５分間インキュへ−１−Ｌ、さらに、合成基質
Ｓ −２４４４（ｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−
ｐＮａ、３ ｍＭ、カビ社製：スウェーデン）の０．０
５ ｍｌおよび０．０５ Ｍ ）リス塩酸、０．３８
Ｍ Ｎａｃｌ緩衝液ｐＨ８，８の０．３５ ｍｌを加え
て温度３７°Ｃで１５分間反応させ、そして、５０％酢
酸の０．１滅を加えて反応を止め、その後において、比
色計を用いて４０５ｎｍの波長の吸光度を測定した。Then, 0.05 ml of a known amount of urokinase solution 100 II/mf was added to 0.05 d of the flow-through fraction from which the urokinase antigen had been removed, and the temperature was 37°C.
Incubate for 15 min at °C.
pNa, 3 mM, 0.0 of Kabi (Sweden)
5 ml and 0.05 M) Lis-HCl, 0.38
Add 0.35 ml of M NaCl buffer pH 8.8, react for 15 minutes at a temperature of 37°C, and stop the reaction by adding 0.1 ml of 50% acetic acid, after which the reaction was measured using a colorimeter. The absorbance at a wavelength of 405 nm was measured.
そのように、その検体のウロキナーゼインヒビター活性
を測定するのに、合成基質が、使われたが、プラスミノ
ーゲン含有フィブリン平板を用いてもよい。また、ウロ
キナーゼインヒビター活性の検量線は、ウロキナーゼイ
ンヒビター（ミドリ十字、１バイヤル５００Ｕ含有）を
用いて、２００ＩＵ／ｍＲ１１００１Ｕ／ｄ、５０ＩＵ
／ｄ、２５１Ｕ／ｍＲ１１０１０／ｍｆ、５ ＩＵ／雌
、およびＩＩＩ／ｍｆｆ１の標準液を作り、そして、そ
の溶液０．１ ｄに既知量のウロキナーゼ液の０．１
ｍｆｌを加えて得る。そして、それを図に示す。Thus, although a synthetic substrate was used to measure the urokinase inhibitor activity of the specimen, plasminogen-containing fibrin plates may also be used. In addition, the standard curve for urokinase inhibitor activity was calculated using urokinase inhibitor (Midori Juji, 1 vial containing 500 U), 200 IU/mR11001 U/d, 50 IU
Prepare standard solutions of /d, 251U/mR11010/mf, 5 IU/female, and III/mff1, and add 0.1 of a known amount of urokinase solution to 0.1 d of the solution.
Obtained by adding mfl. And it is shown in the figure.
また、上述の方法で測定したヒトの尿および血漿の中の
ウロキナーゼインヒビター活性の変動について示す。そ
して、各種の腎疾患３０例の尿中のウロキナーゼインヒ
ビター活性値は表１に示す通りであった。Also shown are changes in urokinase inhibitor activity in human urine and plasma measured by the method described above. The urinary urokinase inhibitor activity values of 30 patients with various renal diseases were as shown in Table 1.
表 １
また、急性心筋梗塞症のウロキナーゼ投与時の血漿ウロ
キナーゼインヒビター活性は、表２に示す通りで、その
血漿中のウロキナーゼインヒビター活性は、ウロキナー
ゼ投与により低下されることが示され、しかも、血漿中
のプラスミノーゲンアクチベータインヒビター活性（Ｆ
ＡＩ活性）によく似た変動を示した。Table 1 In addition, the plasma urokinase inhibitor activity upon administration of urokinase for acute myocardial infarction is as shown in Table 2, indicating that the plasma urokinase inhibitor activity is decreased by urokinase administration, and plasminogen activator inhibitor activity (F
showed a variation similar to that of AI activity).
表 ２
腎炎Ｂ
（非活動性）
腎不全Ｂ
（ＢＵＮ４０以下）
ＵＫ ： Ｓ−２４４４法
ＵＫＩ：Ｓ−２４４４法
ＰＬＧ：テストチームＰＬＧ
αｚＰＩ：テストチームα２ＰＩ
ＦＤＰニラテックス法
ＰΔＩ ： ５ＰＥＣＴＲＯＬＹＳＥ／ ｆ ｉｂｒ
１ｎＦＡＩはタイプ１由来
これらの成績から、上述されたウロキナーゼインヒビタ
ーの活性測定法は、臨床例におけるヒトの尿、および血
漿中の測定に極めて有用であることが明らかである。Table 2 Nephritis B (inactive) Renal failure B (BUN 40 or less) UK: S-2444 method UKI: S-2444 method PLG: Test Team PLG αzPI: Test Team α2PI FDP Nilatex method PΔI: 5PECTROLYSE/fibr
1nFAI is derived from type 1 From these results, it is clear that the above-described method for measuring urokinase inhibitor activity is extremely useful for measuring human urine and plasma in clinical cases.
具体例２
その具体例１では、検体中のウロキナーゼ抗原を取り除
くために、抗つロキナーゼ家兎１ｇＧセファロースカラ
ムが使用されたが、この具体例２では、そのカラムの代
りにパラアミノベンザミジンセファロースカラムが使用
された。Specific Example 2 In Specific Example 1, an anti-urokinase rabbit 1gG Sepharose column was used to remove the urokinase antigen in the specimen, but in this Specific Example 2, a para-aminobenzamidine Sepharose column was used instead of that column. used.
先ず、バラアミノヘンザミジン、ＥＤＣ（１エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイ
ドロクロライド：和光純薬）、および、ＣＨ−セファロ
ース４Ｂ（ファルヌシア社：スウェーデン）を混合し、
ｐｌ＋を４．５〜５．０に保ちながら、室温で一昼夜、
スターラを使用せずに混和し続けた。First, paraaminohenzamidine, EDC (1 ethyl-3
-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (Wako Pure Chemical Industries) and CH-Sepharose 4B (Farnusia: Sweden) were mixed,
While keeping pl+ at 4.5 to 5.0, at room temperature all day and night.
Continued mixing without using stirrer.
この操作で、カップリングが行なわれ、そのカップリン
グ終了後、次に示した緩衝液（１）ないしく４）でその
パラアミノベンザミジンセファロースカラムを洗滌した
。Coupling was performed by this operation, and after the coupling was completed, the para-aminobenzamidine Sepharose column was washed with the following buffers (1) to 4).
（１） ０．１ Ｍ ＩＪ ７酸緩衝液ｐＨ７，８５
００ｍＩｌ（２１０，０５Ｍ ｌ−リスリン酸（ＩｈＰ
Ｏ４）緩衝液ｐＨ８，６５００雁
（３） ０．０５ Ｍ ）リスリン酸（ＨｚＰＯ＜）
緩衝液ｐＨ４，１５００戚
（４） ０． ＯＩ Ｍ ＩＪ ン酸緩衝液ｐＨ７，
６５０１次に、すなわち、そのようにして、そのパラア
ミノベンザミジンセファロースカラムが洗滌されたなら
ば、そのパラアミノベンザミジンセファロスカラムの溶
量２００μ２に検体（ヒトの尿、血漿、あるいは、体液
）の０．５１ｄを加え、これを素通りさせた。(1) 0.1 M IJ 7 acid buffer pH 7,85
00ml (210,05M l-lysphosphoric acid (IhP)
O4) Buffer pH 8,6500 (3) 0.05 M) Lysphosphoric acid (HzPO<)
Buffer pH 4,1500 (4) 0. OIM IJ acid buffer pH7,
6501 Next, that is, once the para-aminobenzamidine Sepharose column has been washed, 0% of the sample (human urine, plasma, or body fluid) is added to the dissolution volume of the para-aminobenzamidine Sepharose column of 200μ2. I added .51d and let it pass.
この素通り分画には、ウロキナーゼ抗原が取り除かれる
が、プロウロキナーゼ（−木鎖ウロキナーゼ、ｓｃｕ
−ＰΔ）は素通りし、このプロウロキナゼはウロキナー
ゼインヒビターに結合しない。In this pass-through fraction, urokinase antigen is removed, but pro-urokinase (-wood chain urokinase, scu
-PΔ) passes through, and this prourokinase does not bind to the urokinase inhibitor.
そして、その素通り分画の０．０５ ｍｌ、に既知量の
ウロキナーゼ溶液１００１Ｕ／ｄの０．０５ ｍｆｌを
加え、温度３７°Ｃで１５分間インキュベートし、さら
に、合成基質Ｓ −２４４４（ｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌ
ｙ−ＡｒｇｐＮａ 、３ｍＭ、カビ社製：スウェーデン
）の０．０５ｍ！、および、０．０５ Ｍ ）リス塩酸
、０．３８ Ｍ Ｎａｃｌ緩衝液ｐＨ８，８の０．３５
ｄを加え、温度３７°Ｃで１５分間反応させ、そして
、５０％酢酸の０．１ ｍｆｌを加えて反応を止め、そ
の後において、比色計を用いて４０５ｎｍの波長の吸光
度を測定した。Then, 0.05 mfl of a known amount of urokinase solution (1001 U/d) was added to 0.05 ml of the flow-through fraction, incubated at a temperature of 37°C for 15 minutes, and the synthetic substrate S-2444 (pyro-Glu -Gl
0.05m of y-ArgpNa, 3mM, Kabi (Sweden)! , and 0.35 of 0.05 M) Lis-HCl, 0.38 M NaCl buffer pH 8.8
d was added, reacted for 15 minutes at a temperature of 37°C, and the reaction was stopped by adding 0.1 mfl of 50% acetic acid, after which the absorbance at a wavelength of 405 nm was measured using a colorimeter.
そのように、その検体のウロキナーゼインヒビター活性
を測定するのに、合成基質が、使われたが、ＭＣＡ基質
（Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ”ＭＩＡ）を用いてもよい。As such, although a synthetic substrate was used to measure the urokinase inhibitor activity of the specimen, the MCA substrate (Glu-Gly-Arg"MIA) may also be used.
また、ウロキナーゼインヒビター活性の検量線は、前述
の具体例１と同様にして製作された。In addition, a standard curve for urokinase inhibitor activity was prepared in the same manner as in Example 1 above.
具体例３
さらに、発明者は、前述のウロキナーゼインヒビター活
性をより迅速で、かつ、簡単にして、しかも光感度で特
異的に測定可能にするために、キットを開発した。Specific Example 3 Furthermore, the inventors developed a kit to enable the above-mentioned urokinase inhibitor activity to be measured more quickly, easily, and specifically with photosensitivity.
このキットは、前述の具体例１に通ずるように準備され
たもので、（１）抗つロキナーゼ家兎１ｇＧセファロー
ス（但、抗体を固定化した担体は、セライ１−やＡＦ−
トレシルトヨパーイル６５０ （東す−）でもよい）、
（２）合成基質Ｓ−２４４４液（ｐｙｒ。This kit was prepared in the same manner as in Specific Example 1 above, and included (1) anti-Turokinase rabbit 1gG Sepharose (however, the carrier on which the antibody was immobilized was Serai 1- or AF-
Toresil Toyopail 650 (Tosu-) may also be used),
(2) Synthetic substrate S-2444 solution (pyr.
Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮａ、但、ＭＣＡ基質でも
よい）、（３）ウロキナーゼインヒビター標準液、（４
）ウロキナーゼ標準液、（５）検体希釈液（０，０１Ｍ
リン酸緩衝液ｐＨ７，６、および（６）反応停止液（５
０％酢酸）を含めである。Glu-Gly-Arg-pNa (although MCA substrate may also be used), (3) urokinase inhibitor standard solution, (4
) Urokinase standard solution, (5) Specimen dilution solution (0.01M
Phosphate buffer pH 7.6, and (6) reaction stop solution (5
(0% acetic acid).
発明の利便・利益
上述から理解されるように、この発明のウロキナーゼイ
ンヒビターの活性測定法は、合成基質あるいはプラスミ
ノーゲン含有フィブリン平板、および、親和性カラムを
用い、特に、ウロキナーゼに対する抗血清のＩｇＧ分画
を固定化した抗つロキナーゼ動物１ｇＧ−セファロース
を応用することにより、すなわち、検体をその抗つロキ
ナーゼ動物ＩｇＧ−セファロースカラムに通過させてそ
の検体中に含まれている微量のうロキナーゼを取り除き
、この場合、分子量５５ｋｄおよび３３ｋｄのうロキナ
ーゼ以外に分子量１００ｋｄのウロキナーゼおよびウロ
キナーゼインヒビターの複合体も取り除かれ、その分画
を得、そして、その分画にウロキナーゼを添加してウロ
キナーゼの中和量からウロキナーゼインヒビターの活性
を測定するところにあるので、この発明のウロキナーゼ
インヒビターの活性測定法では、ウロキナーゼインヒビ
ターの活性が、迅速、簡単、高感度、かつ、特異的に測
定可能になり、それに伴って、血栓症の患者、腎炎の患
者、心筋梗塞症の患者、脳血栓症の患者、悪性腫瘍の患
者、婦人科疾患の患者、妊婦、および、その他の線溶異
常を示す患者の血液（血漿）、尿、および体液の中のウ
ロキナーゼインヒビターの活性の変動が、容易、かつ、
的確に把握可能となり、所謂、これら疾患に関する病態
が容易に解明可能になり、そのようにして、これら疾患
の診断や治療に役立つばかりでなく、血栓溶解剤（うロ
キナーゼ、プロウロキナーゼ、組織アクチヘータ、スト
レプＩ・キナーゼ、および、プラスミン−ストレプトキ
ナーゼ複合体）投与時の、適切な投与量、および、投与
時期を決定する示標となり得るものであり、極めて有用
である。Conveniences and Benefits of the Invention As can be understood from the above, the method for measuring the activity of a urokinase inhibitor of the present invention uses a synthetic substrate or a fibrin plate containing plasminogen, and an affinity column, and in particular, the IgG By applying anti-urokinase animal 1gG-Sepharose with immobilized fractions, i.e., passing the sample through the anti-urokinase animal IgG-Sepharose column to remove trace amounts of urokinase contained in the sample. In this case, in addition to urokinase with a molecular weight of 55 kd and 33 kd, the complex of urokinase with a molecular weight of 100 kd and a urokinase inhibitor is also removed, the fraction is obtained, and urokinase is added to the fraction to obtain the neutralized amount of urokinase. Since the purpose is to measure the activity of urokinase inhibitor, the urokinase inhibitor activity measurement method of the present invention allows the activity of urokinase inhibitor to be measured quickly, easily, highly sensitively, and specifically, and accordingly, Blood (plasma) and urine of patients with thrombosis, nephritis, myocardial infarction, cerebral thrombosis, malignant tumors, gynecological diseases, pregnant women, and other patients with abnormal fibrinolysis. , and fluctuations in the activity of urokinase inhibitors in body fluids are easy, and
It has become possible to accurately understand the so-called pathophysiology of these diseases, and in this way, it has become not only useful for the diagnosis and treatment of these diseases, but also for the use of thrombolytic agents (urokinase, prourokinase, tissue activator, etc.). Strep I kinase and plasmin-streptokinase complex) can serve as an indicator for determining the appropriate dose and timing of administration, and are extremely useful.
発明と具体例との関係
先のように、説明されたこの発明の具体例からして、こ
の発明の属する技術の分野における通常の知識を有する
者にとって、この発明の内容が、その発明の課題を遂行
ならしめる発明の成立に必須であり、その発明の性質で
あるその発明の技術的本質に由来し、そして、それを内
在させると客観的に認められる態様に容易に置き換えら
れる。As for the relationship between the invention and the specific examples, it is clear from the explained specific examples of the invention that the contents of this invention are clear to those who have ordinary knowledge in the technical field to which this invention pertains. It is essential for the establishment of the invention that allows the invention to be carried out, it originates from the technical essence of the invention that is the nature of the invention, and it can be easily replaced by a mode that is objectively recognized as incorporating it.
図は、この発明のウロキナーゼインヒビターの活性測定
法に使用されたウロキナーゼインヒビター活性の検量線
図である。
Ｋ１００
ＫＩＯ
ＫＩ
（ＰＬＡＣＥＮＴＡＬ ）
０７ｍ１
手続補正書（方式）
平成１年３月３０日
昭和６３年特許願第２７５８９６号
発明の名称
ウロキナーゼインヒビターの活性測定法補正をする者
事件との関係 特許出願人
住 所 東京都板橋区小茂根４丁目２８番１４号氏名
林 滋
４、代理人 〒−１６７
居 所 東京都杉並区西荻北１丁目４番３号７、 補
正の内容
（１）本願明細書の第２０頁第２０行ないし同第２１頁
第２行に記載した「図は、・・・である。」を、「第１
図は、ウロキナーゼ１００単位使用時のこの発明のウロ
キナーゼインヒビターの活性測定法のウロキナーゼイン
ヒビター活性検量線図、および、第２図は、ウロキナー
ゼ１０単位使用時のこの発明のウロキナーゼインヒビタ
ーの活性測定法のウロキナーゼインヒビター活性検量線
図である。Ｊ
に訂正しまず。
（２）本願の願書に添付した図面を別紙の通りに訂正し
ます。
以上
補正命令の日付
平成１年３月７日
補正の対象
窪ポ郵
ギ淑郵The figure is a calibration curve of urokinase inhibitor activity used in the method for measuring urokinase inhibitor activity of the present invention. K100 KIO KI (PLACENTAL) 07m1 Procedural amendment (method) March 30, 1999 Patent Application No. 275896, filed in 1988 Name of the invention Relationship with the case concerning the person amending the method for measuring the activity of urokinase inhibitor Patent applicant address 4-28-14, Komone, Itabashi-ku, Tokyo Name: Shigeru Hayashi 4, Agent: 〒-167 Address: 1-4-3-7, Nishiogikita, Suginami-ku, Tokyo Contents of the amendment (1) Page 20 of the specification of the present application "The figure is..." written in line 20 to page 21, line 2 of the same page is replaced with "1
The figure shows a urokinase inhibitor activity calibration curve of the method for measuring the activity of the urokinase inhibitor of the present invention when using 100 units of urokinase, and Figure 2 shows the urokinase inhibitor activity calibration curve of the method for measuring the activity of the urokinase inhibitor of the present invention when using 10 units of urokinase. It is an inhibitor activity calibration curve. First of all, please correct J. (2) The drawings attached to the application form will be corrected as shown in the attached document. Date of the above amendment order March 7, 1999 Subject of amendment
Claims (1)
ン平板、および、親和性カラムを用いるところのウロキ
ナーゼインヒビターの活性測定法。(1) A method for measuring urokinase inhibitor activity using a synthetic substrate or a fibrin plate containing plasminogen and an affinity column.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27589688A JPH02119798A (en) | 1988-10-31 | 1988-10-31 | Method for measuring activity of urokinase inhibitor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27589688A JPH02119798A (en) | 1988-10-31 | 1988-10-31 | Method for measuring activity of urokinase inhibitor |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02119798A true JPH02119798A (en) | 1990-05-07 |
Family
ID=17561948
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27589688A Pending JPH02119798A (en) | 1988-10-31 | 1988-10-31 | Method for measuring activity of urokinase inhibitor |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02119798A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5496879A (en) * | 1992-02-25 | 1996-03-05 | Siegwerk Druckfarben Gmbh & Co. Kg | Printing ink |
-
1988
- 1988-10-31 JP JP27589688A patent/JPH02119798A/en active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5496879A (en) * | 1992-02-25 | 1996-03-05 | Siegwerk Druckfarben Gmbh & Co. Kg | Printing ink |
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