JPH0158199B2 - - Google Patents
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Description
本発明は12β―ヒドロキシプレグナー１，４―
ジエン―３―オン―20α―カルブアルデヒド及び
その製造法に関する。
本発明により提供される12β―ヒドロキシプレ
グナー１，４―ジエン―３―オン―20α―カルブ
アルデヒドは公知文献に未記載の新規化合物であ
り、優れた抗炎症作用を有するプレドニゾン、プ
レゾニゾロンに代表されるコルチコイド系ステロ
イドの合成原料となる12β―ヒドロキシプレグナ
ー１，４―ジエン―３，20―ジオンを製造するた
めの中間体として有用である。
従来、プレドニゾンの製造法としては、デオキ
シコール酸を出発原料として20数段階の工程を経
る方法〔エル・エフ・フイーザー、エム・フイー
ザー共著；ステロイド（レインホルド社発行、
1959年）、634〜647頁参照〕が知られているが、
この方法は用いる試薬が高価であるうえに工程が
長く、工業的実施には必ずしも適していない。
本発明者らは先にプレドニゾンを製造するため
にその有用な中間体について鋭意検討し、新規な
12α―ヒドロキシプレグナー１，４―ジエン―３
―オン―20α―カルブアルデヒドがデオキシコー
ル酸及び／又はその塩にアルカリゲネス属に属す
る特定の細菌を作用させることによつて容易に得
られ、かつ簡単にプレドニゾンの合成原料となる
12α―ヒドロキシプレグナー１，４―ジエン―
３，20―ジオンに誘導できることを見出した（特
願昭57―30899号明細書参照）。本発明者らはさら
に上記のアルカリゲネス属に属する特定の細菌が
デオキシコール酸及び／又はその塩を基質として
12β―ヒドロキシプレグナー１，４―ジエン―３
―オン―20α―カルブアルデヒドをも生産するこ
とを見出し、本発明に至つた。なお、12β―ヒド
ロキシプレグナー１，４―ジエン―３―オン―
20α―カルブアルデヒドもまたプレドニゾンの合
成原料となる12β―ヒドロキシプレグナー１，４
―ジエン―３，20―ジオンに容易に誘導できる。
又は
（上記式中、Ｒは水素原子、アルカリ金属又は
アルカリ土類金属を示し、R1はアルキル基を示
す。）
本発明によれば、デオキシコール酸及び／又は
その塩を基質として12β―ヒドロキシプレグナー
１，４―ジエン―３―オン―20α―カルブアルデ
ヒドを生産するアルカリゲネス属に属する細菌
を、デオキシコール酸及び／又はその塩を含む培
地に培養することにより、12β―ヒドロキシプレ
グナー１，４―ジエン―３―オン―20α―カルブ
アルデヒドを得ることができる。通常、12α―ヒ
ドロキシプレグナー１，４―ジエン―３―オン―
20α―カルブアルデヒドが併産されるが、デオキ
シコール酸及び／又はその塩の転化が比較的緩や
かに起る条件下で培養するか及び／又は培養を短
期間に終らせることにより12β―ヒドロキシプレ
グナー１，４―ジエン―３―オン―20α―カルブ
アルデヒドが好収量で得られる。12α―ヒドロキ
シプレグナー１，４―ジエン―３―オン―20α―
カルブアルデヒドは12β―ヒドロキシプレグナー
１，４―ジエン―３―オン―20α―カルブアルデ
ヒドに対するのと同一の反応条件により12α―ヒ
ドロキシプレグナー１，４―ジエン―３，20―ジ
オンに、さらにはプレドニゾンに誘導することが
できるので、本発明の目的に関する限り12β―ヒ
ドロキシプレグナー１，４―ジエン―３―オン―
20α―カルブアルデヒドと12α―ヒドロキシプレ
グナー１，４―ジエン―３―オン―20α―カルブ
アルデヒドとは等価であり、これらの化合物を分
離する必要はない。
上記のアルカリゲネス属に属する細菌として
は、アルカリゲネス・フエカリスD4020―K15
（Alcaligenes faecalis D4020―K15）菌株（微
工研条寄第204号）がある。この菌株は土壌中か
ら取得したアルカリゲネス・フエカリスD4020
（Alcaligenes faecalis D4020）菌株（微工研条
寄第182号）に突然変異処理を施して得られた変
異株である。
アルカリゲネス・フエカリスD4020菌株及びア
ルカリゲネス・フエカリスD4020―K15菌株の菌
学的性質を列挙すると次表のとおりである。
The present invention provides 12β-hydroxy pregnar 1,4-
This invention relates to dien-3-one-20α-carbaldehyde and its production method. 12β-Hydroxypregner 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde provided by the present invention is a new compound that has not been described in known literature, and is typified by prednisone and prezonisolone, which have excellent anti-inflammatory effects. It is useful as an intermediate for producing 12β-hydroxypregner 1,4-diene-3,20-dione, which is a raw material for the synthesis of corticoid steroids. Traditionally, prednisone has been manufactured by using deoxycholic acid as the starting material and going through more than 20 steps [Co-authored by L.F. Fieser and M. Fieser; Steroids (published by Reinhold, Inc.;
(1959), pp. 634-647] is known.
This method uses expensive reagents and requires a long process, so it is not necessarily suitable for industrial implementation. The present inventors first conducted extensive studies on useful intermediates for producing prednisone, and developed a new method for producing prednisone.
12α-Hydroxypregner 1,4-diene-3
-On-20α-carbaldehyde is easily obtained by reacting specific bacteria belonging to the genus Alcaligenes with deoxycholic acid and/or its salts, and is easily used as a raw material for the synthesis of prednisone.
12α-hydroxy pregner 1,4-diene
It has been found that it can be induced into 3,20-dione (see Japanese Patent Application No. 30899/1989). The present inventors further found that the above-mentioned specific bacteria belonging to the genus Alcaligenes use deoxycholic acid and/or its salts as a substrate.
12β-Hydroxypregner 1,4-diene-3
-on-20α-carbaldehyde was also discovered, leading to the present invention. In addition, 12β-hydroxypregner 1,4-diene-3-one-
20α-carbaldehyde is also a 12β-hydroxypregner 1,4, which is a raw material for the synthesis of prednisone.
-Diene-3,20-dione can be easily induced. or (In the above formula, R represents a hydrogen atom, an alkali metal or an alkaline earth metal, and R 1 represents an alkyl group.) According to the present invention, 12β-hydroxyprecipitates using deoxycholic acid and/or a salt thereof as a substrate. By culturing bacteria belonging to the genus Alcaligenes that produce Gunnar 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde in a medium containing deoxycholic acid and/or its salts, 12β-hydroxypregnator 1,4 -Dien-3-one-20α-carbaldehyde can be obtained. Usually, 12α-hydroxypregner 1,4-diene-3-one-
Although 20α-carbaldehyde is co-produced, 12β-hydroxyprecipitation can be achieved by culturing under conditions where the conversion of deoxycholic acid and/or its salts occurs relatively slowly and/or by completing the culture in a short period of time. Gunner 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde is obtained in good yield. 12α-Hydroxypregner 1,4-diene-3-one-20α-
Carbaldehyde can be converted to 12β-hydroxypregner 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde by the same reaction conditions as for 12α-hydroxypregner 1,4-dien-3,20-dione, and further As far as the purposes of the present invention are concerned, 12β-hydroxypregner 1,4-dien-3-one-
20α-carbaldehyde and 12α-hydroxy pregnar 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde are equivalent and there is no need to separate these compounds. The above bacteria belonging to the genus Alcaligenes include Alcaligenes faecalis D4020-K15
(Alcaligenes faecalis D4020-K15) strain (Feikoken Joyori No. 204). This strain is Alcaligenes fuecalis D4020 obtained from soil.
(Alcaligenes faecalis D4020) strain (Feikoken Joyori No. 182) was subjected to mutation treatment. The following table lists the mycological properties of Alcaligenes fuecalis D4020 strain and Alcaligenes faecalis D4020-K15 strain.
【表】【table】
【表】【table】
【表】【table】
【表】
上記の表に示した菌学的性質に基づき、アルカ
リゲネス・フエカリスD4020菌株及びアルカリゲ
ネス・フエカリスD4020―K15菌株の同定を行な
つた。アルカリゲネス・フエカリスD4020菌株
は、桿菌であること、周鞭毛を有していること、
グラム染色が陰性であることなどの顕微鏡的所見
並びにオキシダーゼ反応及びカタラーゼ反応がと
もに陽性であること、好気性であること、Ｏ―Ｆ
テストの結果が酸化的（Oxidative）であること
などの生理学的性質からバージエイズ・マニユア
ル・オブ・デイターミネイテイブ・バクテリオロ
ジー第７版及び第８版に基づき、アルカリゲネス
属に属する細菌であると同定した。さらにアルカ
リゲネス・フエカリスD4020菌株は、ゼラチンを
液化しない点、ミルクがアルカリ性となる以外に
変化しない点及び脱窒反応がない点から、アルカ
リゲネス属のフエカリス種に属する細菌であると
同定した。また、一般に突然変異株はその親株と
同じ種に属するものと考えられており、アルカリ
ゲネス・フエカリスD4020―K15菌株はアルカリ
ゲネス属のフエカリス種に属する細菌であると判
定した。
本発明による12β―ヒドロキシプレグナー１，
４―ジエン―３―オン―20α―カルブアルデヒド
の生産は、デオキシコール酸及び／又はその塩を
基質として12β―ヒドロキシプレグナー１，４―
ジエン―３―オン―20α―カルブアルデヒドを生
産するアルカリゲネス属に属する細菌を、デオキ
シコール酸及び／又はその塩を含む培地に培養す
ることにより行なわれる。デオキシコール酸の塩
としては具体的にはデオキシコール酸のナトリウ
ム、カリウムなどのアルカリ金属の塩又はカルシ
ウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属の塩
が挙げられる。デオキシコール酸及び／又はその
塩の濃度は通常約１〜200ｇ／の範囲でよいが、
生産される12β―ヒドロキシプレグナー１，４―
ジエン―３―オン―20α―カルブアルデヒドの収
量、培養条件及び操作性などの経済的観点から約
10〜100ｇ／の範囲が好ましい。培養方法は原
則的には一般微生物の好気培養で採用される方法
と同じであるが、通常は液体培地による振盪培養
法又は通気撹拌培養法が用いられる。培地は上記
のデオキシコール酸及び／又はその塩を基質とし
て12β―ヒドロキシプレグナー１，４―ジエン―
３―オン―20α―カルブアルデヒドを生産するア
ルカリゲネス属に属する細菌が資化利用できる栄
養源を含有するものであればよい。炭素源として
はデオキシコール酸及び／又はその塩を単一炭素
源としてもよく、或いはデオキシコール酸及び／
又はその塩にグルコース、グリセリン、ペプト
ン、肉エキス、酵母エキスなどを併用してもよ
い。また窒素源としては、例えば硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、燐酸アンモニウム、硝酸
アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムな
どの無機窒素源、又はポリペプトン、ペプトン、
肉エキスなどの有機窒素源が用いられる。また、
この他に燐酸水素２カリウム、燐酸２水素カリウ
ム、硫酸マグネシウムなどの無機塩類が添加され
る。培養条件に特徴はないが、通常25〜35℃で10
時間〜７日間振盪培養又は通気撹拌培養を行な
う。
このようにして培養液中に蓄積された12β―ヒ
ドロキシプレグナー１，４―ジエン―３―オン―
20α―カルブアルデヒドは、基質のデオキシコー
ル酸又はその塩と比較して水に対する溶解度が著
しく小さく、通常は培養液中に析出沈澱してく
る。この12β―ヒドロキシプレグナー１，４―ジ
エン―３―オン―20α―カルブアルデヒドを分離
採取するには、沈澱している12β―ヒドロキシプ
レグナー１，４―ジエン―３―オン―20α―カル
ブアルデヒド又はこれと12α―ヒドロキシプレグ
ナー１，４―ジエン―３―オン―20α―カルブア
ルデヒドとの混合物（以下、この混合物を12α及
びβ―ヒドロキシ混合物と称す）をデカンテーシ
ヨンにより浮遊している菌体を含む培養液から分
離するか、または浮遊している菌体が沈澱しない
ような回転数で遠心分離を行ない、析出している
12β―ヒドロキシプレグナー１，４―ジエン―３
―オン―20α―カルブアルデヒド又は12α及びβ
―ヒドロキシ混合物を沈澱させたのち上記のデカ
ンテーシヨンにより12β―ヒドロキシプレグナー
１，４―ジエン―３―オン―20α―カルブアルデ
ヒド又は12α及びβ―ヒドロキシ混合物を分離す
る方法が採られる。沈澱した12β―ヒドロキシプ
レグナー１，４―ジエン―３―オン―20α―カル
ブアルデヒド又は12α及びβ―ヒドロキシ混合物
を除去した培養液に含まれる菌体その他の不溶成
分を濾過又は遠心分離などにより分離除去して得
られた培養濾液又は上清に、水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、水酸化カルシウムなどのアルカ
リを加えてその培養濾液又は上清をアルカリ性と
したのち、上記のアルデヒドを溶解しかつ水と相
分離する有機溶媒、例えば酢酸エチル、クロロホ
ルム、クロロホルムとメタノールの混合液などを
用いて抽出操作を行ない、得られた抽出液を集
め、これより溶媒を溜去することによつて、培養
液中に溶解している12β―ヒドロキシプレグナー
１，４―ジエン―３―オン―20α―カルブアルデ
ヒド又は12α及びβ―ヒドロキシ混合物を回収す
ることができる。この有機溶媒による抽出操作は
培養濾液又は上清についてのみでなく、培養液そ
のものについて行なうことができる。上記の方法
で得られた沈澱物又は抽出物中には12β―ヒドロ
キシプレグナー１，４―ジエン―３―オン―20α
―カルブアルデヒド又はこれと12α―ヒドロキシ
プレグナー１，４―ジエン―３―オン―20α―カ
ルブアルデヒドが含まれている他には残存基質の
デオキシコール酸及び／又はその塩並びに副生物
はほとんど含まれておらず、例えばメタノール水
溶液からの再結晶により容易に高純度の12β―ヒ
ドロキシプレグナー１，４―ジエン―３―オン―
20α―カルブアルデヒド又は12α及びβ―ヒドロ
キシ混合物を取得することができる。12α及びβ
―ヒドロキシ混合物からの12β―ヒドロキシプレ
グナー１，４―ジエン―３―オン―20α―カルブ
アルデヒドと12α―ヒドロキシプレグナー１，４
―ジエン―３―オン―20α―カルブアルデヒドと
の分離は、12α及びβ―ヒドロキシ混合物をシリ
カゲルカラムに吸着させ、クロロホルム―エタノ
ールの混合溶媒で溶出することにより行なう。ま
ず12β―ヒドロキシプレグナー１，４―ジエン―
３―オン―20α―カルブアルデヒドが溶出し、つ
いで12α―ヒドロキシプレグナー１，４―ジエン
―３―オン―20α―カルブアルデヒドが溶出す
る。溶出液から減圧下に溶媒を溜去することによ
り各々のアルデヒドを取得することができる。
本発明により得られる12β―ヒドロキシプレグ
ナー１，４―ジエン―３―オン―20α―カルブア
ルデヒドは、（方法―１）これを炭酸カリウム、
酸化バリウムなどの脱水剤の存在下にピペリジン
と反応させて12β―ヒドロキシ―22―（Ｎ―ピペ
リジン）ビスノル―１，４，20（22）―コラトリ
エン―３―オンとし、ついでこの生成物をオゾン
酸化することにより12β―ヒドロキシプレグナー
１，４―ジエン―３，20―ジオンに誘導できる。
また（方法―２）によれば、12β―ヒドロキシ
プレグナー１，４―ジエン―３―オン―20α―カ
ルブアルデヒドと一般式（）
R1COOH ……（）
（式中、R1はアルキル基を表わす。）で示され
るカルボン酸又はその反応性誘導体、例えば酸ハ
ライド、酸無水物などとを常法により反応させる
ことにより一般式（）で示される12β―アシル
オキシプレグナー１，４―ジエン―３―オン―
20α―カルブアルデヒドが得られる。代表的な反
応例として挙げられる12β―ヒドロキシプレグナ
ー１，４―ジエン―３―オン―20α―カルブアル
デヒドと一般式（）で示されるカルボン酸のク
ロライドとの反応はトリエチルアミン、ピリジン
などの第３級アミンの存在下に行なわれる。この
反応は溶媒中で行なうのが好ましく、溶媒として
塩化メチレン、クロロホルム又はこれらとベンゼ
ン、トルエン、酢酸エチルなどとの混合溶媒が好
ましく用いられる。この反応は通常室温で行なう
が、必要に応じて約60℃までの加温下に行なうこ
ともできる。反応後、反応混合物を希塩酸水、重
曹水、水などで洗滌したのち乾燥し、ついでこれ
より低沸点物を留去することにより一般式（）
で示される12β―アシルオキシプレグナー１，４
―ジエン―３―オン―20α―カルブアルデヒドの
粗生成物を得る。この粗生成物をそのまま次の反
応に用いることができる。一般式（）で示され
る12β―アシルオキシプレグナー１，４―ジエン
―３―オン―20α―カルブアルデヒドとピペリジ
ン、ピロリジン、モルホリンなどの第２級アミン
とを反応させることにより一般式（）で示され
るエナミンが生成する。第２級アミンは一般式
（）で示される12β―アシルオキシプレグナー
１，４―ジエン―３―オン―20α―カルブアルデ
ヒドに対して等モル〜２倍モル量用いる。反応中
に副生する水を、ベンゼン、トルエンなどの水と
共沸する溶媒を用いて加熱還流下に反応系から除
去する。この反応は特に触媒を要しないが、ｐ―
トルエンスルホン酸などの触媒の存在下に反応を
行なうこともできる。反応後、反応混合物から減
圧下に低沸点物を留去することにより、一般式
（）で示されるエナミンの粗生成物が得られる。
この粗生成物をそのまま次の反応に用いることが
できる。一般式（）で示されるエナミンをオゾ
ン酸化又は無水クロム酸、ピリジニウムクロルク
ロメート、重クロム酸ナトリウムなどを用いて酸
化することにより、一般式（）で示される12β
―アシルオキシプレグナー１，４―ジエン―３，
20―ジオンを得ることができる。なお、無水クロ
ム酸を用いる酸化反応は通常ピリジン溶媒中で行
なう。この場合、一般式（）で示されるエナミ
ンを溶解させたピリジン溶液に無水クロム酸とピ
リジンの混合液を徐徐に加えるか、又は無水クロ
ム酸とピリジンの混合液に一般式（）で示され
るエナミンを溶解させたピリジン溶液を徐々に加
えることにより反応を行なう。この酸化反応は氷
冷下ないしは室温下に行なわれる。反応後、反応
混合物をベンゼン、トルエンなどで希釈し、これ
より固形物を濾過により除去したのち、濾液に希
塩酸水を加え、ついでベンゼン、トルエンなどで
抽出し、抽出液から低沸点物を留去することによ
り、一般式（）で示される12β―アシルオキシ
プレグナー１，４―ジエン―３，20―ジオンの粗
生成物が得られる。この粗生成物を必要に応じて
シリカゲルカラムクロマトグラフイーにより精製
するか、再結晶法により精製することにより高純
度の一般式（）で示される12β―アシルオキシ
プレグナー１，４―ジエン―３，20―ジオンを得
ることができる。一般式（）で示される12β―
アシルオキシプレグナー１，４―ジエン―３，20
―ジオンを通常の加水分解反応に付することによ
り12β―ヒドロキシプレグナー１，４―ジエン―
３，20―ジオンが得られる。例えば、この加水分
解反応はメタノール、エタノールなどの溶媒中で
水酸化カリウム、水酸化ナトリウムなどの存在
下、室温ないし溶媒の還流温度で行なわれる。反
応後、反応混合物を減圧下に濃縮し、ついでベン
ゼン、トルエンなどで希釈し、水、希塩酸水など
で洗滌し、乾燥したのち、これより低沸点物を留
去することにより12β―ヒドロキシプレグナー
１，４―ジエン―３，20―ジオンの粗生成物が得
られる。この粗生成物は例えば酢酸エチルなどか
ら再結晶することにより精製することができる。
12β―ヒドロキシプレグナー１，４―ジエン―
３，20―ジオンは例えば次の方法によりプレドニ
ゾンに誘導できる。
（上記式中、Meはメチル基を表わし、Acはア
セチル基を表わす。）
すなわち、12β―ヒドロキシプレグナー１，４
―ジエン―３，20―ジオンを三酸化クロムで酸化
し、さらにその酸化生成物を水酸化カリウムの存
在下に二酸化セレンで酸化することによりプレグ
ナー１，４，９(11)―トリエン―３，12，20―トリ
オンを得る。このプレグナー１，４，９(11)―トリ
エン―３，12，20―トリオンを白金の存在下に水
素添加することにより12α―ヒドロキシプレグナ
ー１，４，９(11)―トリエン―３，20―ジオンと
し、ついでこの生成物に酸性条件下でメタノール
を作用させて12α―メトキシプレグナー１，４，
９(11)―トリエン―３，20―ジオンを得、この生成
物に塩化水素を作用させることにより12―クロロ
プレグナー１，４，９(11)―トリエン―３，20―ジ
オンを得る。この12―クロロプレグナー１，４，
９(11)―トリエン―３，20―ジオンを炭酸水素ナト
リウムで処理することによりプレグナー１，４，
11―トリエン―３，20―ジオンを得、この生成物
に臭素を作用させて11，12―ジブロモプレグナー
１，４―ジエン―３，20―ジオンとし、ついでこ
れをクロム酸銀及び三酸化クロムの存在下に加水
分解することにより12―ブロモプレグナー１，４
―ジエン―３，11，20―トリオンを得、この生成
物に金属亜鉛を作用させてプレグナー１，４―ジ
エン―３，11，20―トリオンとする。このプレグ
ナー１，４―ジエン―３，11，20―トリオンを無
水酢酸で処理することにより20―アセトキシ―
１，４，17（20）―トリエン―３，11―ジオンを
得る。この生成物に過テレフタル酸を作用させる
ことにより20―アセトキシ―17α，20α―エポキ
シプレグナー１，４―ジエン―３，11―ジオンと
し、これを加水分解して17α―ヒドロキシプレグ
ナー１，４―ジエン―３，11，20―トリオンを
得、ついでこの生成物にヨードを作用させて17α
―ヒドロキシ―21―インドプレグナー１，４―ジ
エン―３，11，20―トリオンを得る。この17α―
ヒドロキシ―21―インドプレグナー１，４―ジエ
ン―３，11，20―トリオンをアセトン中で酢酸カ
リウムで処理することにより21―アセトキシ―プ
レドニゾンとし、これを加水分解することにより
プレドニゾンを得ることができる。
また12β―ヒドロキシプレグナー１，４―ジエ
ン―３，20―ジオンは次の方法により公知化合物
であるプレグナー１，４，11(12)―トリエン―３，
20―ジオンを経由してプレドニゾン、さらにはプ
レドニゾロンに誘導できる。
（上記式中、R2はアルキル基を表わす。）
すなわち、12β―ヒドロキシプレグナー１，４
―ジエン―３，20―ジオンを通常のスルホネート
化反応に付することにより、一般式（）で示さ
れるスルホネートが得られる。例えば、このスル
ホネート化反応は、12β―ヒドロキシプレグナー
１，４―ジエン―３，20―ジオンをピリジン、ピ
コリン又はこれらとベンゼン、トルエンなどとの
混合溶媒に溶解し、この溶液に一般式（）
R2SO2Cl ……（）
（式中、R2はアルキル基を表わす。）で示され
るスルホン酸クロライドを該12β―ヒドロキシプ
レグナー１，４―ジエン―３，20―ジオンに対し
等モル〜２倍モル量を加え、室温ないしは必要に
応じて約80℃までの加温下に行なわれる。反応
後、反応混合物を希塩酸水などにあけ、ベンゼン
などで抽出し、抽出液を希塩酸水、重曹水、水な
どで洗滌し、乾燥したのち、これより低沸点物を
留去することにより一般式（）で示されるスル
ホネートの粗生成物が得られる。この粗生成物を
例えば酢酸エチルなどから再結晶することにより
高純度の一般式（）で示されるスルホネートを
得ることができる。一般式（）で示されるスル
ホネートは、これを脱スルホン酸反応に付するこ
とにより、公知化合物であるプレグナー１，４，
11(12)―トリエン―３，20―ジオンに誘導される。
この脱スルホン酸反応は通常、酢酸カリウム、塩
化リリウム、コリジン、ボタシウムｔ―ブトキサ
イドなどの反応助剤（スルホン酸を捕捉すること
ができる化合物）の存在下に行なわれる。反応助
剤の使用量は一般式（）で示されるスルホネー
トに対して等モル〜20倍モル量である。この反応
はヘキサメチルホスホルトリアミド、Ｎ，Ｎ―ジ
メチルホルムアミドなどの溶媒中で行なうのが好
ましく、通常約80〜140℃の温度下に加熱して行
なわれる。プレグナー１，４，11(12)―トリエン―
３，20―ジオンは常法によりプレドニゾン、さら
にはプレドニゾロンに誘導される。
以下、実施例及び参考例によつて本発明をさら
に詳細に説明する。
参考例
アルカリゲネス・フエカリスD4020―K15菌株
の取得方法
培地１（組成：デオキシコール酸0.5％、水酸化
ナトリウム0.05％、ペプトン0.5％、酵母エキス
0.5％、塩化ナトリウム0.5％及び寒天1.5％）のス
ラントに生育させたアルカリゲネス・フエカリス
D4020菌株の一白金耳を、予め試験管内に準備し
た培地２（組成：デオキシコール酸２％、水酸化
ナトリウム0.2％、硝酸アンモニウム0.2％、燐酸
２水素カリウム0.1％、燐酸水素２カリウム0.6
％、硫酸マグネシウム・７水和物0.02％及び酵母
エキス0.02％）の10mlに植菌し、30℃で８〜10時
間振盪培養した。この培養液の0.3mlを予め試験
管に準備した培地３（組成：デオキシコール酸0.5
％、水酸化ナトリウム0.05％、グルコース0.1％、
硝酸アンモニウム0.2％、燐酸２水素カリウム0.1
％、燐酸水素２カリウム0.6％、硫酸マグネシウ
ム・７水和物0.02％及び酵母エキス0.02％）の10
mlに加え、30℃で10〜15時間培養した。ついで、
この対数増殖期にある菌体を0.45μのメンブレン
フイルターで無菌的に濾過集菌し、0.1M燐酸塩
緩衝液（PH：7.0）20mlで洗滌後、同じ緩衝液25
mlに懸濁させた。これに終濃度が20μg／mlにな
るようにＮ―メチル―N′―ニトロ―Ｎ―ニトロ
ソグアニジンを添加し、30℃で10〜15分間振盪す
ることにより突然変異処理を行なつた。突然変異
処理を施した菌体を0.45μのメンブレンフイルタ
ーで濾過集菌し、0.1M燐酸塩緩衝液（PH：7.0）
20mlで洗滌後、同じ緩衝液20mlに懸濁した。得ら
れた菌懸濁液を滅菌生理食塩水で希釈し、それを
培地４（組成：デオキシコール酸0.5％、水酸化ナ
トリウム0.05％、硝酸アンモニウム0.2％、燐酸
２水素カリウム0.1％、燐酸水素２カリウム0.6
％、硫酸マグネシウム・７水和物0.02％、酵母エ
キス0.02％及び寒天1.5％）の寒天平板上に500〜
1000個のコロニーを出現させるように塗布したの
ち、30℃で３〜４日間培養した。出現したコロニ
ー中の極小コロニーを培地１のスラントに単離し
たのち、その一白金耳を予め試験管に準備した培
地５（組成：デオキシコール酸0.2％、水酸化ナト
リウム0.02％、グルコース0.1％、硝酸アンモニ
ウム0.2％、燐酸２水素カリウム0.1％、燐酸水素
２カリウム0.6％、硫酸マグネシウム・７水和物
0.02％及び酵母エキス0.02％）の10mlに植菌し、
30℃で24時間振盪培養した。得られたそれぞれの
培養液中の生成物を薄層クロマトグラフイーによ
り検定し、上記の培養条件下で12α―ヒドロキシ
プレグナー１，４―ジエン―３―オン―20α―カ
ルブアルデヒドを選択的に蓄積している一菌株を
見い出し、これをアルカリゲネス・フエカリス
D4020―K15と命名した。
実施例 １
アルカリゲネス・フエカリスD4020―K15菌株
（微工研条寄第204号）を次に示す方法で培養し
た。デオキシコール酸1.0ｇ、グルコース0.1ｇ、
硝酸アンモニウム0.2ｇ、燐酸２水素カリウム
0.12ｇ、燐酸水素２カリウム0.61ｇ、硫酸マグネ
シウム・７水和物0.02ｇ、酵母エキス0.02ｇ及び
水酸化ナトリウム0.1ｇに水道水を加えて容量を
100ml（PH：8.4）に調整し、これを培地とした。
この培地を大型試験管10本に10ml宛分注し、120
℃で15分間、蒸気殺菌を行なつた。予め上記の培
地と同じ培地で試験管振盪機にて１日間増殖させ
た種菌の0.5mlの上記の大型試験管に添加し、30
℃で２日間振盪培養した。培養後、この培養液を
集め、遠心分離機で培養中に生じた沈澱物と菌体
とからなる混合物を培養液上清と分離した。この
混合物に１規定の水酸化ナトリウム水溶液を加え
ることにより、この溶液のPHを９に調整し、つい
でこの溶液を酢酸エチル200mlで抽出した。一方、
培養液上清に１規定の水酸化ナトリウム水溶液を
加え、この溶液のPHを９に調整したのち、この溶
液を酢酸エチル200mlで抽出した。この抽出液と
上記で得られた抽出液との混合液を無水硫酸ナト
リウムで乾燥し、ロータリー・エバポレーターで
酢酸エチルを溜去することにより、12β―ヒドロ
キシプレグナー１，４―ジエン―３―オン―20α
―カルブアルデヒドと12α―ヒドロキシプレグナ
ー１，４―ジエン―３―オン―20α―カルブアル
デヒドの混合物を750mg得た。
得られた混合物の一部を取り、これにメタノー
ルを加えて１％溶液とし、この溶液25μlをミクロ
ボンダパツクＣ―18カラムを備えた高速液体クロ
マトグラフイー（米国ウオーターズ社製、HLC
―GPC―244型）に注入した。移動相としてPH4.0
に調整した水／メタノールの25／75容量比の混合
液を流速１ml／分で流し、検出を屈折率方式で行
なつた。得られた液体クロマトグラフにおける各
ピークの面積比を積分計（島津製作所製、島津ク
ロマトパツクＣ―R1A）で求めたところ、12β―
ヒドロキシプレグナー１，４―ジエン―３―オン
―20α―カルブアルデヒド及び12α―ヒドロキシ
プレグナー１，４―ジエン―３―オン―20α―カ
ルブアルデヒドの占める面積比の合計は全体の95
％であつた。また、上記の混合物中の12β―ヒド
ロキシプレグナー１，４―ジエン―３―オン―
20α―カルブアルデヒド／12α―ヒドロキシプレ
グナー１，４―ジエン―３―オン―20α―カルブ
アルデヒドの比率は１／８であつた。
上記で得られた混合物から12β―ヒドロキシプ
レグナー１，４―ジエン―３―オン―20α―カル
ブアルデヒド及び12α―ヒドロキシプレグナー
１，４―ジエン―３―オン―20α―カルブアルデ
ヒドの分離を次に示す方法で行なつた。まず、内
径2.6cm、長さ70cmのカラムチユーブに、クロロ
ホルム約200mlにシリカゲル約100ｇを懸濁させた
ものを担体として詰めた。一方、上記で得られた
混合物1.2ｇをクロロホルム約20mlに溶解させ、
不溶物を除去した。このクロロホルム溶液を約５
mlに濃縮したのち上記のシリカゲルカラムに吸着
させ、このカラムにクロロホルム、クロロホル
ム／エタノールの99／１容量比の混合液及びクロ
ロホルム／エタノールの97／３容量比の混合物を
この順序で流し、溶出を行なつた。クロロホル
ム／エタノールの99／１容量比の混合物を流し始
めてから約250ml〜280mlの画分に12β―ヒドロキ
シプレグナー１，４―ジエン―３―オン―20α―
カルブアルデヒドが溶出され、ついで約450ml〜
510mlの画分に12α―ヒドロキシプレグナー１，
４―ジエン―３―オン―20α―カルブアルデヒド
が溶出された。この２つのアルデヒドの判別は、
薄層プレート（米国メルク社製、シリカゲル60、
Ｆ―254）及びイソオクタン／酢酸エチル／酢酸
の10／10／２容量比の混合液からなる展開溶媒を
用いる薄層クロマトグラフイーにおいてRf値0.4
付近に12β―ヒドロキシプレグナー１，４―ジエ
ン―３―オン―20α―カルブアルデヒドのスポツ
トが現われ、Rf値0.34付近に12α―ヒドロキシプ
レグナー１，４―ジエン―３―オン―20α―カル
ブアルデヒドのスポツトが現われることを利用し
て行なつた。このようにして得られた各々の溶出
液からロータリー・エバポレーターを用いてクロ
ロホルム及びエタノールを溜去し、その残渣をジ
エチルエーテルで洗滌し、乾燥することにより
12β―ヒドロキシプレグナー１，４―ジエン―３
―オン―20α―カルブアルデヒドを約80mg、12α
―ヒドロキシプレグナー１，４―ジエン―３―オ
ン―20α―カルブアルデヒドを約360mg得た。
12β―ヒドロキシプレグナー１，４―ジエン―
３―オン―20α―カルブアルデヒド及び12α―ヒ
ドロキシプレグナー１，４―ジエン―３―オン―
20α―カルブアルデヒドの確認を下記の方法で行
なつた。
12β―ヒドロキシプレグナー１，４―ジエン―
３―オン―20α―カルブアルデヒド
融点：157〜160℃
マススペクトルｍ／Ｚ：342〔Ｍ〕+ [Table] Based on the mycological properties shown in the table above, the Alcaligenes faecalis D4020 strain and Alcaligenes faecalis D4020-K15 strain were identified. Alcaligenes fuecalis strain D4020 is a bacillus, has periflagella,
Microscopic findings such as negative Gram staining, positive oxidase and catalase reactions, aerobic status, O-F
Based on the physiological properties such as oxidative test results, it was identified as a bacterium belonging to the genus Alcaligenes based on the Verge's Manual of Determinative Bacteriology, 7th and 8th editions. . Furthermore, the Alcaligenes fuecalis strain D4020 was identified as a bacterium belonging to the Alcaligenes fuecalis species because it does not liquefy gelatin, does not change the milk other than to become alkaline, and does not have a denitrification reaction. Additionally, mutant strains are generally considered to belong to the same species as their parent strains, and the Alcaligenes fuecalis strain D4020-K15 was determined to be a bacterium belonging to the Alcaligenes fuecalis species. 12β-hydroxypregner 1 according to the invention,
4-dien-3-one-20α-carbaldehyde is produced using 12β-hydroxypregner 1,4- using deoxycholic acid and/or its salt as a substrate.
The method is carried out by culturing bacteria belonging to the genus Alcaligenes that produce dien-3-one-20α-carbaldehyde in a medium containing deoxycholic acid and/or its salt. Specific examples of the salts of deoxycholic acid include salts of deoxycholic acid with alkali metals such as sodium and potassium, and salts with alkaline earth metals such as calcium and magnesium. The concentration of deoxycholic acid and/or its salt may normally be in the range of about 1 to 200 g/
12β-Hydroxypregner 1,4- produced
From an economic point of view, such as the yield of diene-3-one-20α-carbaldehyde, culture conditions, and operability, approximately
The range of 10 to 100 g/ is preferable. The culture method is basically the same as that used for aerobic culture of general microorganisms, but usually a shaking culture method using a liquid medium or an aerated agitation culture method is used. The medium contains 12β-hydroxypregner 1,4-diene using the above deoxycholic acid and/or its salt as a substrate.
It is sufficient that it contains a nutrient source that can be assimilated and utilized by bacteria belonging to the genus Alcaligenes that produces 3-one-20α-carbaldehyde. As a carbon source, deoxycholic acid and/or a salt thereof may be used as a single carbon source, or deoxycholic acid and/or a salt thereof may be used as a single carbon source.
Alternatively, glucose, glycerin, peptone, meat extract, yeast extract, etc. may be used in combination with the salt. Examples of nitrogen sources include inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium nitrate, sodium nitrate, and potassium nitrate, or polypeptone, peptone,
Organic nitrogen sources such as meat extracts are used. Also,
In addition, inorganic salts such as dipotassium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, and magnesium sulfate are added. Culture conditions are not specific, but usually at 25-35℃ for 10
Shake culture or aerated agitation culture is performed for 7 days. The 12β-hydroxy pregnate 1,4-diene-3-one accumulated in the culture medium in this way
20α-carbaldehyde has significantly lower solubility in water than the substrate deoxycholic acid or its salt, and usually precipitates in the culture solution. In order to separate and collect this 12β-hydroxypregner 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde, the precipitated 12β-hydroxypregner 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde must be collected. Alternatively, a mixture of this and 12α-hydroxy pregner 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde (hereinafter, this mixture is referred to as a 12α and β-hydroxy mixture) is decanted to remove floating bacteria. Either the cells are separated from the culture medium containing the cells, or they are precipitated by centrifugation at a rotation speed that does not allow floating cells to settle.
12β-Hydroxypregner 1,4-diene-3
-on-20α-carbaldehyde or 12α and β
The method used is to precipitate the -hydroxy mixture and then separate the 12β-hydroxypregner 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde or the 12α and β-hydroxy mixture by decantation as described above. After removing precipitated 12β-hydroxy pregnate 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde or 12α and β-hydroxy mixture, bacterial cells and other insoluble components contained in the culture solution are separated by filtration or centrifugation. To the culture filtrate or supernatant obtained by removing sodium hydroxide,
After making the culture filtrate or supernatant alkaline by adding an alkali such as potassium hydroxide or calcium hydroxide, an organic solvent that dissolves the aldehyde and phase separates from water, such as ethyl acetate, chloroform, or chloroform and methanol, is added. The 12β-hydroxypregner 1,4-diene dissolved in the culture solution is extracted by performing an extraction operation using a mixed solution, collecting the obtained extract, and distilling off the solvent. 3-one-20α-carbaldehyde or a mixture of 12α and β-hydroxy can be recovered. This extraction operation using an organic solvent can be performed not only on the culture filtrate or supernatant, but also on the culture solution itself. The precipitate or extract obtained by the above method contains 12β-hydroxy pregnar 1,4-dien-3-one-20α.
- Contains carbaldehyde or 12α-hydroxypregner 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde, and almost no remaining substrate deoxycholic acid and/or its salts and by-products. 12β-Hydroxypregner 1,4-dien-3-one-
20α-carbaldehyde or 12α and β-hydroxy mixtures can be obtained. 12α and β
-12β-Hydroxypregner 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde and 12α-Hydroxypregner 1,4 from hydroxy mixture
Separation from -dien-3-one-20α-carbaldehyde is carried out by adsorbing the 12α and β-hydroxy mixture on a silica gel column and eluting with a mixed solvent of chloroform and ethanol. First, 12β-hydroxypregner 1,4-diene
3-one-20α-carbaldehyde elutes, followed by 12α-hydroxy pregner 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde. Each aldehyde can be obtained by distilling off the solvent from the eluate under reduced pressure. 12β-Hydroxypregner 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde obtained by the present invention is obtained by (method-1) potassium carbonate,
Reaction with piperidine in the presence of a dehydrating agent such as barium oxide gives 12β-hydroxy-22-(N-piperidine)bisnor-1,4,20(22)-choratrien-3-one, and the product is then treated with ozone. By oxidation, it can be induced into 12β-hydroxy pregner 1,4-diene-3,20-dione. Also, according to (Method 2), 12β-hydroxy pregner 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde and the general formula () R 1 COOH ... () (wherein R 1 is an alkyl group 12β-acyloxy pregner 1,4-diene represented by the general formula () is prepared by reacting a carboxylic acid represented by the formula () or a reactive derivative thereof, such as an acid halide, an acid anhydride, etc., by a conventional method. 3-on-
20α-carbaldehyde is obtained. A typical example of the reaction is the reaction between 12β-hydroxy pregner 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde and the chloride of a carboxylic acid represented by the general formula (). It is carried out in the presence of a grade amine. This reaction is preferably carried out in a solvent, and methylene chloride, chloroform, or a mixed solvent of these with benzene, toluene, ethyl acetate, or the like is preferably used as the solvent. This reaction is usually carried out at room temperature, but if necessary, it can be carried out with heating up to about 60°C. After the reaction, the reaction mixture is washed with diluted hydrochloric acid, sodium bicarbonate, water, etc., dried, and then the low-boiling substances are distilled off to obtain the general formula ().
12β-acyloxypregner 1,4 represented by
A crude product of -dien-3-one-20α-carbaldehyde is obtained. This crude product can be used as it is in the next reaction. By reacting 12β-acyloxy pregner represented by the general formula () with 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde and a secondary amine such as piperidine, pyrrolidine, or morpholine, enamines are produced. The secondary amine is used in an amount equal to or twice the molar amount of 12β-acyloxy pregner 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde represented by the general formula (). Water produced as a by-product during the reaction is removed from the reaction system under heating under reflux using a solvent that is azeotropic with water, such as benzene or toluene. This reaction does not require any particular catalyst, but p-
The reaction can also be carried out in the presence of a catalyst such as toluenesulfonic acid. After the reaction, low-boiling substances are distilled off from the reaction mixture under reduced pressure to obtain a crude enamine product represented by the general formula ().
This crude product can be used as it is in the next reaction. By oxidizing the enamine represented by the general formula () using ozone oxidation or chromic anhydride, pyridinium chlorochromate, sodium dichromate, etc., 12β represented by the general formula () is produced.
-Acyloxypregner 1,4-diene-3,
20 - You can get Zeon. Note that the oxidation reaction using chromic anhydride is usually carried out in a pyridine solvent. In this case, a mixture of chromic anhydride and pyridine is gradually added to a pyridine solution in which the enamine represented by the general formula () is dissolved, or the enamine represented by the general formula () is added to a mixture of chromic anhydride and pyridine. The reaction is carried out by gradually adding a pyridine solution in which . This oxidation reaction is carried out under ice cooling or at room temperature. After the reaction, the reaction mixture is diluted with benzene, toluene, etc., solids are removed by filtration, diluted hydrochloric acid is added to the filtrate, then extracted with benzene, toluene, etc., and low-boiling substances are distilled off from the extract. By doing this, a crude product of 12β-acyloxy pregner 1,4-diene-3,20-dione represented by the general formula () is obtained. This crude product is purified by silica gel column chromatography or recrystallization as necessary to obtain highly pure 12β-acyloxy pregner 1,4-diene-3, represented by the general formula (). 20 - You can get Zeon. 12β shown by the general formula ()
Acyloxypregner 1,4-diene-3,20
-12β-hydroxy pregner 1,4-diene by subjecting dione to normal hydrolysis reaction-
3,20-dione is obtained. For example, this hydrolysis reaction is carried out in a solvent such as methanol or ethanol in the presence of potassium hydroxide, sodium hydroxide, etc. at room temperature to the reflux temperature of the solvent. After the reaction, the reaction mixture is concentrated under reduced pressure, diluted with benzene, toluene, etc., washed with water, diluted hydrochloric acid, etc., dried, and then the low boiling point substances are distilled off to obtain 12β-hydroxypregner. A crude product of 1,4-diene-3,20-dione is obtained. This crude product can be purified, for example, by recrystallization from ethyl acetate. 12β-hydroxypregner 1,4-diene
3,20-dione can be derived into prednisone, for example, by the following method. (In the above formula, Me represents a methyl group and Ac represents an acetyl group.) That is, 12β-hydroxy pregner 1,4
-Diene-3,20-dione is oxidized with chromium trioxide, and the oxidation product is further oxidized with selenium dioxide in the presence of potassium hydroxide to produce pregner 1,4,9(11)-triene-3, 12, 20 - Gain Trion. By hydrogenating this pregner 1,4,9(11)-triene-3,12,20-trione in the presence of platinum, 12α-hydroxy pregner 1,4,9(11)-triene-3,20 - dione, and then this product was treated with methanol under acidic conditions to form 12α-methoxy pregner 1,4,
9(11)-triene-3,20-dione is obtained, and this product is treated with hydrogen chloride to obtain 12-chloropregner 1,4,9(11)-triene-3,20-dione. This 12-chloropregnant 1,4,
By treating 9(11)-triene-3,20-dione with sodium bicarbonate, pregner 1,4,
11-triene-3,20-dione is obtained, this product is treated with bromine to form 11,12-dibromo pregner 1,4-diene-3,20-dione, and then this is treated with silver chromate and trioxide. 12-Bromopregner 1,4 by hydrolysis in the presence of chromium
-Diene-3,11,20-trione is obtained, and this product is treated with metallic zinc to form pregner 1,4-diene-3,11,20-trione. By treating this pregner 1,4-diene-3,11,20-trione with acetic anhydride, 20-acetoxy-
1,4,17(20)-triene-3,11-dione is obtained. This product is treated with perterephthalic acid to produce 20-acetoxy-17α,20α-epoxy pregner 1,4-diene-3,11-dione, which is then hydrolyzed to form 17α-hydroxypregner 1,4 -Diene-3,11,20-trione is obtained, and then this product is treated with iodine to form 17α.
-Hydroxy-21-indopregner 1,4-diene-3,11,20-trione is obtained. This 17α-
Hydroxy-21-indopregner 1,4-diene-3,11,20-trione can be treated with potassium acetate in acetone to give 21-acetoxy-prednisone, and prednisone can be obtained by hydrolyzing this. can. In addition, 12β-hydroxy pregner 1,4-diene-3,20-dione can be prepared from the known compound pregner 1,4,11(12)-triene-3, by the following method.
It can be induced into prednisone and even prednisolone via 20-dione. (In the above formula, R 2 represents an alkyl group.) That is, 12β-hydroxy pregner 1,4
By subjecting -diene-3,20-dione to a conventional sulfonation reaction, a sulfonate represented by the general formula () can be obtained. For example, in this sulfonation reaction, 12β-hydroxy pregner 1,4-diene-3,20-dione is dissolved in pyridine, picoline, or a mixed solvent of these and benzene, toluene, etc., and the general formula () is added to this solution. R 2 SO 2 Cl ...() (In the formula, R 2 represents an alkyl group.) The sulfonic acid chloride represented by the formula is equimolar to the 12β-hydroxy pregner 1,4-diene-3,20-dione. ~2 times the molar amount is added, and the reaction is carried out at room temperature or, if necessary, under heating up to about 80°C. After the reaction, the reaction mixture is poured into diluted hydrochloric acid, etc., extracted with benzene, etc., the extract is washed with diluted hydrochloric acid, sodium bicarbonate, water, etc., dried, and the low boiling point substances are distilled off to obtain the general formula. A crude product of the sulfonate shown in parentheses is obtained. A highly pure sulfonate represented by the general formula () can be obtained by recrystallizing this crude product from, for example, ethyl acetate. By subjecting the sulfonate represented by the general formula () to a desulfonic acid reaction, it is possible to obtain the known compound pregner 1,4,
Induced by 11(12)-triene-3,20-dione.
This desulfonic acid reaction is usually carried out in the presence of a reaction aid (a compound capable of scavenging sulfonic acid) such as potassium acetate, lyllium chloride, collidine, and botanical t-butoxide. The amount of the reaction aid to be used is equimolar to 20 times the molar amount of the sulfonate represented by the general formula (). This reaction is preferably carried out in a solvent such as hexamethylphosphortriamide or N,N-dimethylformamide, and is usually carried out by heating at a temperature of about 80 to 140°C. Pregner 1, 4, 11(12) - Triene -
3,20-dione is derived into prednisone and further into prednisolone by conventional methods. Hereinafter, the present invention will be explained in more detail with reference to Examples and Reference Examples. Reference example Method for obtaining Alcaligenes faecalis D4020-K15 strain Medium 1 (composition: deoxycholic acid 0.5%, sodium hydroxide 0.05%, peptone 0.5%, yeast extract
Alcaligenes fuecalis grown on slants with 0.5% sodium chloride, 0.5% sodium chloride and 1.5% agar).
A loopful of D4020 strain was prepared in advance in a test tube in medium 2 (composition: 2% deoxycholic acid, 0.2% sodium hydroxide, 0.2% ammonium nitrate, 0.1% potassium dihydrogen phosphate, 0.6 potassium dihydrogen phosphate).
%, magnesium sulfate heptahydrate 0.02%, and yeast extract 0.02%) and cultured with shaking at 30°C for 8 to 10 hours. Culture medium 3 (composition: deoxycholic acid 0.5
%, sodium hydroxide 0.05%, glucose 0.1%,
Ammonium nitrate 0.2%, potassium dihydrogen phosphate 0.1
%, dipotassium hydrogen phosphate 0.6%, magnesium sulfate heptahydrate 0.02% and yeast extract 0.02%).
ml and cultured at 30°C for 10-15 hours. Then,
The cells in the logarithmic growth phase were collected by aseptic filtration using a 0.45 μ membrane filter, washed with 20 ml of 0.1 M phosphate buffer (PH: 7.0), and washed with 25 ml of the same buffer.
ml. Mutation treatment was carried out by adding N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine to the mixture at a final concentration of 20 μg/ml and shaking at 30° C. for 10 to 15 minutes. The mutant-treated bacteria were collected by filtration using a 0.45μ membrane filter, and collected in 0.1M phosphate buffer (PH: 7.0).
After washing with 20 ml, it was suspended in 20 ml of the same buffer. The obtained bacterial suspension was diluted with sterile physiological saline and mixed with medium 4 (composition: deoxycholic acid 0.5%, sodium hydroxide 0.05%, ammonium nitrate 0.2%, potassium dihydrogen phosphate 0.1%, dipotassium hydrogen phosphate). 0.6
%, magnesium sulfate heptahydrate 0.02%, yeast extract 0.02% and agar 1.5%) on an agar plate.
After applying the mixture so that 1000 colonies appeared, it was cultured at 30°C for 3 to 4 days. After isolating a very small colony among the colonies that appeared on a slant of medium 1, a loopful of it was prepared in a test tube in advance in medium 5 (composition: deoxycholic acid 0.2%, sodium hydroxide 0.02%, glucose 0.1%, Ammonium nitrate 0.2%, potassium dihydrogen phosphate 0.1%, dipotassium hydrogen phosphate 0.6%, magnesium sulfate heptahydrate
Inoculate 10ml of yeast extract (0.02% and yeast extract 0.02%),
The culture was incubated with shaking at 30°C for 24 hours. The products in each culture solution obtained were assayed by thin layer chromatography, and 12α-hydroxypregner 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde was selectively detected under the above culture conditions. We found one strain that was accumulating and identified it as Alcaligenes fuecalis.
It was named D4020-K15. Example 1 Alcaligenes fuecalis D4020-K15 strain (Feikoken Joyori No. 204) was cultured by the following method. Deoxycholic acid 1.0g, glucose 0.1g,
Ammonium nitrate 0.2g, potassium dihydrogen phosphate
Add tap water to 0.12g, dipotassium hydrogen phosphate 0.61g, magnesium sulfate heptahydrate 0.02g, yeast extract 0.02g and sodium hydroxide 0.1g to make up the volume.
The volume was adjusted to 100 ml (PH: 8.4) and used as a culture medium.
Dispense 10 ml of this medium into 10 large test tubes, and
Steam sterilization was performed at ℃ for 15 minutes. Add 0.5 ml of the inoculum grown in the same medium as the above medium for 1 day in a test tube shaker to the above large test tube, and
The cells were cultured with shaking at ℃ for 2 days. After culturing, the culture solution was collected, and a mixture consisting of precipitates and bacterial cells produced during the culture was separated from the culture solution supernatant using a centrifuge. The pH of this solution was adjusted to 9 by adding 1N aqueous sodium hydroxide solution to this mixture, and then this solution was extracted with 200 ml of ethyl acetate. on the other hand,
A 1N aqueous sodium hydroxide solution was added to the culture supernatant to adjust the pH of this solution to 9, and then the solution was extracted with 200 ml of ethyl acetate. A mixed solution of this extract and the extract obtained above was dried over anhydrous sodium sulfate, and ethyl acetate was distilled off using a rotary evaporator. -20α
750 mg of a mixture of -carbaldehyde and 12α-hydroxy pregner 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde was obtained. Take a portion of the resulting mixture, add methanol to it to make a 1% solution, and apply 25 μl of this solution to a high performance liquid chromatography system (manufactured by Waters, USA, HLC) equipped with a Microbondapak C-18 column.
-GPC-244 type). PH4.0 as mobile phase
A mixed solution of water/methanol in a volume ratio of 25/75, which had been adjusted to 25/75, was flowed at a flow rate of 1 ml/min, and detection was performed using a refractive index method. When the area ratio of each peak in the obtained liquid chromatograph was determined using an integrator (Shimadzu Chromato Pack C-R1A, manufactured by Shimadzu Corporation), it was found that 12β-
The total area ratio occupied by hydroxypregner 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde and 12α-hydroxypregner 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde is 95% of the total area.
It was %. In addition, 12β-hydroxy pregner 1,4-dien-3-one- in the above mixture
The ratio of 20α-carbaldehyde/12α-hydroxy pregner 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde was 1/8. From the mixture obtained above, 12β-hydroxypregner 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde and 12α-hydroxypregner 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde are separated as follows. This was done using the method shown below. First, a column tube with an inner diameter of 2.6 cm and a length of 70 cm was filled with a suspension of about 100 g of silica gel in about 200 ml of chloroform as a carrier. On the other hand, dissolve 1.2 g of the mixture obtained above in about 20 ml of chloroform,
Insoluble matter was removed. Approximately 50% of this chloroform solution
After concentrating to 1 ml, it was adsorbed on the silica gel column described above, and chloroform, a mixture of chloroform/ethanol in a volume ratio of 99/1, and a mixture of chloroform/ethanol in a volume ratio of 97/3 were passed through this column in this order, and the elution was carried out. I did it. After starting the flow of a 99/1 volume ratio mixture of chloroform/ethanol, 12β-hydroxy pregner 1,4-dien-3-one-20α- was added to a fraction of approximately 250 ml to 280 ml.
Carbaldehyde is eluted, then about 450 ml~
12α-hydroxypregner 1 in 510ml fraction,
4-dien-3-one-20α-carbaldehyde was eluted. To distinguish between these two aldehydes,
Thin layer plate (manufactured by Merck & Co., USA, silica gel 60,
F-254) and an Rf value of 0.4 in thin layer chromatography using a developing solvent consisting of a mixture of isooctane/ethyl acetate/acetic acid at a volume ratio of 10/10/2.
A spot of 12β-hydroxypregner 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde appears in the vicinity, and 12α-hydroxypregner 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde appears near the Rf value of 0.34. This was done by taking advantage of the appearance of spots. Chloroform and ethanol were distilled off from each eluate obtained in this way using a rotary evaporator, and the residue was washed with diethyl ether and dried.
12β-Hydroxypregner 1,4-diene-3
-On-20α-carbaldehyde approximately 80mg, 12α
About 360 mg of hydroxypregner 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde was obtained. 12β-hydroxypregner 1,4-diene
3-one-20α-carbaldehyde and 12α-hydroxy pregner 1,4-diene-3-one-
20α-carbaldehyde was confirmed by the following method. 12β-hydroxypregner 1,4-diene
3-one-20α-carbaldehyde Melting point: 157-160℃ Mass spectrum m/Z: 342 [M] +
Claims (1)
―３―オン―20α―カルブアルデヒド。 ２ デオキシコール酸及び／又はその塩を基質と
して12β―ヒドロキシプレグナー１，４―ジエン
―３―オン―20α―カルブアルデヒドを生産する
アルカリゲネス属に属する細菌を、デオキシコー
ル酸及び／又はその塩を含む培地に培養すること
を特徴とする12β―ヒドロキシプレグナー１，４
―ジエン―３―オン―20α―カルブアルデヒドの
製造法。[Claims] 1 12β-Hydroxypregner 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde. 2. Bacteria belonging to the genus Alcaligenes that produce 12β-hydroxypregner 1,4-dien-3-one-20α-carbaldehyde using deoxycholic acid and/or its salt as a substrate were treated with deoxycholic acid and/or its salt. 12β-Hydroxypregner 1,4 characterized in that it is cultured in a medium containing
-Production method of diene-3-one-20α-carbaldehyde.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8704782A JPS58204000A (en) | 1982-05-21 | 1982-05-21 | 12beta-hydroxypregna-1,4-dien-3-one-20alpha-carbaldehyde and its preparation |
| DE8383101884T DE3360856D1 (en) | 1982-02-26 | 1983-02-25 | Pregnane derivatives and method of producing the same |
| EP83101884A EP0087787B1 (en) | 1982-02-26 | 1983-02-25 | Pregnane derivatives and method of producing the same |
| US06/911,970 US4867914A (en) | 1982-02-26 | 1986-09-26 | Pregnane derivatives and method of producing the same |
Applications Claiming Priority (1)
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| JP8704782A JPS58204000A (en) | 1982-05-21 | 1982-05-21 | 12beta-hydroxypregna-1,4-dien-3-one-20alpha-carbaldehyde and its preparation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58204000A JPS58204000A (en) | 1983-11-28 |
| JPH0158199B2 true JPH0158199B2 (en) | 1989-12-11 |
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ID=13904022
Family Applications (1)
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| Country | Link |
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-
1982
- 1982-05-21 JP JP8704782A patent/JPS58204000A/en active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| JPS58204000A (en) | 1983-11-28 |
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