JPH01501838A - 取込みベクターによる核酸の外来配列の取込みに基づき真核細胞の代謝を変化させる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 取込みベクターによる核酸の外来配列の取込みに基づき真核細胞の代謝を変化さ せる方法 主里坐分１ 本発明は、外来の核酸の真核細胞への導入に関し、この核酸はそれら細胞におい て活性機能を果たすことが可能であり、例えば細胞機構のある作用を増強または 抑制する、即ち細胞代謝を変化させることが可能である。

この目的のため、本発明は、前記核酸を前記受容細胞へ運びそして実質的にそれ らの本来の生物機能を損傷または抑制することなく細胞膜を通過してその中への 浸透を促進することができる、適当なベクターまたは伝達物を提案するものであ る。−皮細胞に取り込まれた外来核酸は、その中で遺伝子の発現もしくは抑制、 ウィルス活性の封鎖、細胞増殖の抑制またはその種の他のものといった、ある特 性の機能を成し遂げることにより前記の活性を示す。

それ故に、本ベクターを使って本発明はまた細胞のトランスフェクション法、即 ち、核酸の外来配列を適当な真核受容体または宿主細胞へ導入しそして取り込む 方法を開示する。

前記核酸は前記細胞中で機能的に活性であり、即ちそれらは謝を変化させること ができ、またはその成長もしくは調節されない増殖を抑制することができよう。

これらの核酸が細胞核へ運ばれそしてそのゲノムの一部となる場合には、その結 果が細胞の形質転換の要因となるかもしれない。

先丘茨血 現在までに細胞のトランスフェクション（および／または形質転換）は、例えば 、Ｃａ−沈澱した核酸の細胞による優先的取込みを促進するＣａ”イオンの存在 下での操作（Ｆ、Ｌ。

ＧＲＡＨＡＭら、１９７３．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２．４５６−４６７）を含む 種々の方法により行われてきた。他の方法はまた、例えば卵母細胞核への遺伝子 の直接注入（Ｅ、Ｇ、ＤＩＡＫＩ］ＭＡＫＡＳ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｃｅ ｌｌＢｉｏｌｏｇｙ、　１９７３　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、第７巻、２ ８７−３１１）並びにウィルスベクターの利用（Ｄ、Ｈ，Ｈａｍｅｒら１９７９ ．　Ｃｅ１ｌ、　１８．１２９９）、または遺伝子を細胞内に運ぶためのリポソ ーム分散（Ｒ，Ｆｒａｌｅｙ１９８０、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５５． １０４３１）を含む、トランスフェクションは、またＤＥＡＥ−デキストランを 使って（Ｊ、Ｈ，ＭｃＣｕｔｈａｎ＋１９６８、　Ｇ、Ｎａｔｌ、、　Ｃａｎｃ ｅｒ　Ｉｎ５ｔ、　４１．３５１）および高圧電界における遺伝子転移により（ Ｅ、Ｎｅｕｍａｎｎら１９８２．　Ｅｍｂｏ　Ｊ、第１巻、第７号、８４１−８ ４５頁）、実施され得る＊　ＲＪｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ、　Ｃｒ１ｔ。

Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃ’ｈｅｍ、　１９８４．１６．３４９−３７９もまた参照され たい。

上記の技術は全て利点を有するけれども、一般的には適用できない。例えばＤＥ ＡＥ−デキストラン法を使って外因性のＤＮＡ配列は有効に組み込まれず、これ は、宿主ゲノムへのＤＮＡの取込みが頻繁に起こるカルシウム塩を使用する方法 と対照的である。細胞への直接注入は面倒でありそして十分に熟練した技術者が 必要である。ベクターとしてウィルスを使用すると高収率のトランスフエフシラ ンが起こるけれども、好ましくなくそしておそらく危険なウィルス因子の同時導 入から問題が生じるかもしれない。

さらに、現在までに療法目的で生体内に適用できる、例えば外来の活性核酸配列 を生存生物体に適用して細胞代謝のある欠陥を治療することのできる、トランス フェクション法は全く存在しない。しかしながら、そういった可能性はｓ、ｙ。

Ｃｈｅｎｇ、　Ｇ、Ｔ、ｌ’１ｅｒｌｉｎｏおよび１．Ｈ，Ｐａ５ｔａｎ、　Ｎ ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＩＨ１９８３）、　６５４−６６９ によって“遺伝子のスプライシング技術の医療適用の一つは、遺伝子欠損を有す る細胞へのＤＮＡの導入であろう”と記述されている。従っｔ、“核酸”という 表現が本発明においてはＤＮＡ　、二本鎖もしくは一本鎖ＲＮＡ　、アンチセン スＲＮＡ　、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、− ｉの単一ヌクレオチドおよびそれらのあらゆる機能誘導体を包含することは明ら かであろう。

それ故に、穏和な条件下で高い取込み率をもたらしそして高選択性である改良さ れたトランスフエフシラン技術、即ち、他の異種細胞の存在下である特定の種の 細胞を選択的にトランスフェクトおよび成る場合は形質転換することを可能にす る技術、が必要であった。この技術は、取り込もうとする核酸が特異的に限定さ れた標的細胞のみを遺伝子的に変性させ得る時、または、ガン療法の場合には、 正常細胞をそのままにしながら細胞毒性物質の発現を内部的に促進させる時、特 に有望である。他の用途として、活性のオリゴおよびポリヌクレオチド、例えば 細胞中で■−ＲＮＡとハイブリダイズして細胞のまたはウィルスの機能を抑制す ることができるアンチセンスＲＮＡの取込みを含む。

１王立概要 添付された請求項１において開示された方法は、前述の希望する目的物について ごく重要な段階である。

概して、核酸を輸送するベクターまたは伝達物は、着目配列を担持しそして一緒 になってそれを受容細胞へ運ぶことのできるリガンドと前記配列とを縮合して合 成され−次いでそのリガンドは、細胞中の核酸配列の取込みを促進または増大せ しめ、そしである場合には核酸を核へ運ぶであろう。取込みの後、外来核酸は、 前記宿主細胞の化学的性質の所望の逐次変化を伴って、宿主細胞中で意図される 本来の生物活性を発現するであろう。

この発明において使用される輸送ベクターは次のように模式化され得る。

（ＨＴ）−Ｂ−（ＮＴ）　（１） 式中、（ＨＴ）は前述のリガンド（頭部要素）を示し、そして末尾要素（ＮＴ） は輸送される核酸配列（ＤＮＡ、　ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオ チド等）である。Ｂは（ＨＴ）と（ＮＴ）とを接続する中間要素を示す。これは 橋渡しまたは連結要素であることができる。ある場合においては、Ｂが完全に欠 けており、（）ＩＴ）の化学基が（ＮＴ）のある橋渡し官能基、即ち５′−ホス フェートまたは３′−もしくは５′−水酸基に直接連結（共有結合的にまたは他 のもので）されている。（１’ｌＴ）および（ＮＴ）を接続する以外のＢの重要 な特徴は、細胞において（ＮＴ）の生物機能を妨害してはならないということで ある。この課題を達成するための１つの好ましい手段は、細胞性酵素、例えばリ ゾチーム酵素で容易に切断される少なくとも１つの結合を該ベクターに用意する ことである。この段階で、細胞のレセプターに対し高親和性を有するタンパク質 と結合した遺伝子を含む系の構想は既に報告されているということに留意するべ きである［Ｓ、　Ｙ、Ｃ）ＩＥＮＧ　ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ　ｎ（１９８３）、　ｐ、６５４−６６９参照）。しかしながら、その ような系〔α２−マクログロブリンと結合したクロラムフェニコール−アセチル トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子〕が３７３−４細胞中に取り込まれるとい うことは文献中に述べられたけれども、取り込まれたＤＮＡが該宿主細胞中で機 能を果たすことができるという証拠は提示されなかった。この場合においては、 該遺伝子および“矢じり”を連結するのに使用されたリンカ−のタイプは、おそ らく不活性化していた。

“頭部”　（）ＩＴ）は、６指向（ｈｏｓｉｎｇ）″または“標的（ｔａｒｇｅ ｔｉｎｇ）”因子とも名付は得る。“指向”という表現は、細胞膜を通る外来の 核酸の浸透を促進または増大せしめるが細胞認識に関しては全（またはほとんど 特異性をもたない因子を定義するのに使用される。指向因子の例としては、例え ば低密度リポタンパク（ＬＤＬ）　、リシンまたはアブリンといった毒素の６Ｂ ″部分、あるウィルスの抗原等である。指向因子の他の例は以後さらに詳細に論 じられるだろう。

“標的因子”という表現は、好ましくは前記取込み特性に加えて、“頭部”（） ＩＴ）が特異的な細胞マーカー認識特性を有する時、即ち、他種の細胞、例えば 健全な細胞に触れないままで、（ＨＴ）因子がある特異的に選択された細胞、例 えば腫瘍細胞の方へ該ベクターを導く“矢じり”として働く時に使用される。マ ーカーは、標的細胞が持つ特定の抗原またはレセプター部位、例えば、上皮のも しくは血小板由来の成長因子レセプターのような成長因子レセプターまたは免疫 グロブリン（ＥＰ−Ａ−１１２，７２０参照）もしくはα２−マクログロブリン （Ｃｈｅｎｇ、　ＦＩｅｒｌｉｎｏおよびＰａ５ｔａｎの上記文献を参照）に対 するレセプターとして定義される。標的因子の他の例は、この記載の過程で提示 されるであろう。

成分（ＮＴ）は、宿主細胞中で生産される特定のＲＮＡに対して相補的なＲＮＡ 、　ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドであることができるヌクレオチドもしくは ヌクレオチド配列である。さらに、たは二本鎖切断活性を与えるために、ある場 合において化学的に修飾されてもよい、また、（ＮＴ）は遺伝子、例えば宿主細 胞において着目生産物を発現するように操作された組換えＤＮＡを示してもよい 、転写産物（例えばアンチセンスＲＮＡ）または翻訳産物であることができるこ れらの生産物は、以下に詳細に示されるだろう。

ある場合には、成分（）ＩＴ）および（ＮＴ）は直接接続されてもよく；他のあ る場合においては、単に接続要素としてまたは、多くは例えば多数の（ＮＴ）が ただ１つの指向もしくは標的因子ＣＲＴ）と共に輸送される時の担体として役立 つことができる要素（Ｂ）により、それらは共に連結される。これもまた以後詳 細に示されるであろう。

連結要素Ｂの他のごく重要な機能は、（ＨＴ）および（ＮＴ）を相互の機能の阻 害なしに接続することである。即ち、（）ＩＴ）は、受容細胞への（ＮＴ）の取 込みおよび輸送を促進するべきであり且つ実質的に細胞中でその生物機能を妨害 してはならない。

相互的に、（ＮＴ）は、（）ＩＴ）がその輸送、標的および取込み機能を果たす ことを妨害してはならない。それ故、Ｂの役割、即ち（ＩＴ）および（ＮＴ）を 適当な距離で結合させることそして適当な結合部位、例えばタンパク質上の−Ｎ Ｏｘ、ＳＨ，０）１または−Ｃｏｏ）１部位および核酸上の３　’　−〇）１． 　５　’−〇）１または５′−ホスフェートを使用することは重要である。この ことは後に詳細に記されるだろう。

取り込まれた後で、核酸配列は細胞質中に蓄積されてもよく、または（（）ＩＴ ）要素の性質に依存して〕核に輸送されそして細胞の形質転換をもたらしてもよ い。故に、核酸（ＮＴ）の選択および運搬因子（ＨＴ）のそれは、該ポリヌクレ オチドの期待される最終機能に本質的に依存するであろう。即ち、細胞質におい て直ちに作用するか（例えば遮断剤として）それとも細胞のゲノムの一部となり （例えば合成遺伝子）そして有用な生産物を発現するかのどちらかである。これ に関連して宿主細胞の動態を変化させるために、例えば遺伝病を治療するために または悪性細胞の増殖を抑制するために、有用な生産物は、培養細胞において試 験管内で発現される生産物並びに生体内、例えば生存生物体内で生産される生産 物（例えばＲＮＡまたはタンパク質）を包含する。

このため、受容細胞に取り込まれた外来核酸の所望の目的物または最終利用はど んなものであっても、本発明は、宿主細胞中で該核酸の生物機能活性を、この活 性に起因する効果が達成されるまで、許容するまたは誘導することを含む。その ような活性機能の例は後で論じられよう。

二里皇註坦星ｎ藍 前記の式（１）により模式的に示されるベクターにおいて、成分（ＨＴ）は、好 ましくは、レセプターに媒介されるエンドサイト−シスによりまたはクラスリン 被覆窩を通して、ライｌレス、例えばアデノウィルス、水痘性口内炎ウィルス、 ラウス肉腫ウィルスおよびセムリキ森林熱ウィルスのような非被覆性の小胞にお いてはその後に蓄積を伴って、細胞に貫入することのできるタンパク質を表す。

また、（ＨＴ）成分として利用されるウィルス性タンパク質は、標的するべき細 胞およびウィルス因子の性質に依存して特異的または非特異的であることができ る。本発明においては、先導成分としてウィルス抽出物または特定のウィルス抗 原の利用もまた可能である。

受容細胞上のレセプターに特異的な親和性を有するタンパク質は、レセプター媒 介性エンドサイト−シスにおいて標的因子（ＨＴ）として利用される。適切な因 子としては、上皮成長因子、血小板由来の成長因子、ウロガストロンおよびそれ の類似体、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲ）り　、神経発育因子（ＮＧ Ｆ）　、ワクシニアウィルス成長因子そして他の特異的なウィルス因子、例えば １４９７８球の典型的なＴ４−レセプター（ただしこれは他の細胞においても確 認され得る）に対して特異的な）ＩＩＶウィルスのウィルス抗原（Ｐ、Ｊ、Ｍａ ｄｄｏｎら、１９８６、　Ｃｅ１ｌ　４７．３３３）を包含する。

加えて、他の因子もベクターＮ）の（）ＩＴ）成分として使用され得る。例えば 、ＩｇＧ　、α−２マクログロブリン、ソマトメジンＣ，）リョードサイロニン 、トロンビンおよび、リシン、アブリン、ジフテリア毒素を含む多くの毒素のＢ 鎖などである。

ベクター（１）の（ＢＴ）要素と（ＮＴ）要素との間のリンカ−とが重要となる 。さらに該リンカ−の化学結合官能基は、先導タンパク質および接合された核酸 の両方における適当な結合基に対して作用するように選択されるべきである。

末端アルギニンＮＨ，ｉを有する、例えばＥＧＦのような標的因子を使った結合 は、Ｃ，Ｆ、Ｃ）１０ら、１９８３．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＲｅｓｅａｒ ｃｈ　ＩＬ　６３１３−６５２９の方法により直接行うことができる。この方法 は、適当なカルボジイミド化合物の存在下ｐＨ６でイミダゾールＯＺ）を使って ポリヌクレオチド鎖の５′−ホスフェート基を活性化し、そして続いてｐＨ８， ５でＥＧＦの末端アミノ基によりこの遊離基を置換することを含む（ＥＧＦは５ ３個のアミノ酸を含むポリペプチドである。　Ｓａｖａｇｅら（１９７２）Ｊ、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓ、　２４７．７６０９を参照のこと〕。これは第１図におい て図式的に概説されている。

ＣＨＵらが前記のスキームに従って行った構成物は本発明の目的を達成するため に利用されるかもしれないと示唆していることが注目されるけれども、彼らはＤ ＮＡ−タンパク質付加物の実際の存在および受容細胞の作用を永久に変性させる ためのそのような付加物の有効利用については報告しなかった。

前記の縮合方法の反応式は下記の通りである。

ＥＧＦ−ＮＨｚ＋　（ＮＴ）　−ＯＰ　（０２）　−ＩＺ　ＥＧＦ−Ｎ）ｌ−（ ＰＯｚ）　−０（ＮＴ）上式中、テトラゾールをイミダゾールの代わりに使用す ることができる。

他の直接縮合法は、ヌクレオシドの糖部分の５　’　−ＯＨと、（ＢＴ）成分に 結合した末端のホスホルアミダイト基との反応により説明される。下記に示され るこの式は、既知の段階的（ｓｔｅｐ−ｂｙ−ｓｔｅｐ）縮合法によるオリゴヌ クレオチドの合成に使用されるものと同様であり、そして縮合に適する一〇Ｈ基 または一５Ｈ基を有するタンパク質に結合せしめるのに好都合である（８１０Ｆ ＵＴＬＩＲ，第５０号、１９８６年１０月、増補第１−１８頁を参照上式中、Ｒ １およびＲ２は低級アルキル、例えばメチルまたはイソプロピルである。

（肩）を結合するのに非常に有用な他のルートは、常法により、例えばＡｐｐｌ ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　Ｕｓｅ ｒＢｕｌｌｅｔｉｎ、第３８号、１１月３日、１９８６を参照のこと）により発 表されたサイクリックホスフィンアミダイトを使って、後で（）ＩＴ）に結合で きるアミノアルキレン結合を提供スることである。これは下記に示される。

（１Ｍｅ （ｎ） ”アミノが結合された”核酸（ｎ）は、常法、例えばグルタルアルデヒドが橋渡 しする反応（Ｓ、Ａｖｒａｍｅａｓ（１９６９）　Ｉ＋ｎ＋ｎｕｎｏ−ｃｈｅｍ ｊｓｔｒｙ　６ｐ　４３を参照のこと〕により、（ＨＴ）の−級アミノ基に後で 縮合することができる。

取込みの後に細胞性酵素により容易に開裂され得るリンカ−（Ｂ）（式Ｉを参照 ）を調達するために、適当なアミノ酸により提供される１個または複数個のペプ チド結合を（ＨＴ）と（ＮＴ）との間に挿入することが有利であるがもじれない 。今の目的に通するオリゴペプチドの例は、同時係属ＰＣＴ出［ＷＯ８？１０３ ８９１において開示されており、ここでは参考として引用され、そして式、−（ ＣＯ−ＣＨＲ−ＮＨ−）＋＊−（ｍ　）　Ｃ式中、Ｒは水素（グリシン）、メチ ル（アラニン）、ベンジル（フェニルアラニン）およびその地間種類のものであ り、そしてｍは、１〜約１０またはそれより大きい整数である〕として定義され ている。タンパク質と言わば弐Ｈの化合物との間にそのようなオリゴペプチドを 挿入する方法は、公知の技術に従った多くのルートに準じることが可能である。

多数のなかの１例によれば、オリゴペプチドを常法に従って最初に合成する。例 えば、第一のアミノ酸のアミノ基をベンゾカルボニルまたはｔｅｒｔ、ブトキシ カルボニルで保護し、ジシクロへキシルカルボジイミドおよびヒドロキシベンゾ トリアゾールの存在下活性エステルの形で第二のアミノ酸を縮合せしめ、加水分 解または水添分解によりそのアミノ保護基を除去し、第三のアミノ酸（保護され たアミノ基を有する）との縮合を繰り返し、そして全てのアミノ酸単位を付加し 終わるまでこの操作を繰り返す。

次いで、オリゴペプチドの活性エステルを化合物■と反応せしめアミド結合を与 え、もう一方の末端のアミノ基を脱保護し、そして従来のタンパク質縮合剤、例 えば前述のグルタルアルデヒドを使うことにより該タンパク質と縮合せしめる。

°上記のスキームは、次のように模式化される（Ｙは活性エステル基を表す）。

（ＩＴ）−ＮＨ（ＣＩりｓ−（ＮＨＣＨＲＣＯ）ｍ−ＮＨＣＣＨｚ）ｚ−ＯＰ　 （Ｏプ　（ＯＨ）−０−（ＮＴ）オリゴペプチドを逆位置においても挿入できる 、即ち活性エステルを該タンパク質と反応せしめそして同じかまたは相当の技術 を使って残った一ＮＨｚを■のアミノ基と縮合することができる、ということは 明らかである。

ペプチド鎖の末端官能基をタンパク質と接合するための多くの結合物質が先行技 術において開示されている。例えば、ＥＰ−Ａ−１１２，７２０（Ｙ、ＫＡＴＯ ら）は、下記の基をペプチドの末端に結合せしめること＝　（ｉ　）　）Ｉｓ（ ＣＨｚ）ｚ−ＣＯ−、（ｉｉ　）　ＨＳ（ＣＨｚ）ｚ−ＣＢ（ＮＨＡｃ）−ＣＯ −、（ｉｉｉ）　ＨＳ−ＣＨ（ＡｃＯＨ）−ＣＯ−、および下記の基をタンパク 質（ＴｇＧ）に結合せしめること：　（ａ）−ＣＯ−フェニμ：／　−Ｎ　−７ Ｌ、インイミド、（ｂ　）　−ＣＯ（ＣＨｄｚ−５５−２−ピリジン、を発表し ている。

これらは本発明において適用することができ、例えば本発明ニオイて（ｉ）と（ ｂ）を縮合することは、ジチオ結合を有する付加物： ＢＴ−ＣＯ−（Ｃ）ｌｚ）　ｚ−ＳＳ−（ＣＨｚ）　ｚ−（ＣＯ−ＣＨＲ−ＮＨ ）ｗａ　・旧＝ＮＨ（Ｃ）Ｉｔ）　ｚ−ＯＰＯｓ−ＮＴを提供する。

さらに、弐〇□Ｎ（２−カルボキシ−ｐ−フェニレン）−ＳＳ−（ＣＨｇ）ｚ　 ＣＯ−をオリゴペプチドに付着することは、タンパク質のＳＲ基と結合させるの に有用であり、そのようにしてタンパク質とポリアミノ酸との間に一５Ｓ（Ｃ） Ｉ２）ｚ−を提供する。

付加物ＣＩ）中のＢ基はまた、１個より多い核酸配列の担体として働くことがで きる。例えば、Ｂは受容細胞へ運ぶべき複数の核酸配列（１０、５０、１００ま たはそれより多数）を結合するための側鎖官能基を持ったポリペプチドであるこ とができる。適切なポリペプチドは例えばポリグルタミン酸またはポリアスパラ ギン酸である。

しかし、結合された基が核酸ではなく細胞毒性の有機分子である同等の構造の付 加物は、ＥＰ−Ａ−１１２，７２０および１９８７年８月６日出願の同時係属出 願ＵＳＡ　０７／８２．２４４において開示されており、ここに参照として引用 される。

基本的には、この態様における中間基（Ｂ）は式、〔式中、ｐは１または２であ り、ｍは０〜約１０であり、ｎは２０〜３００であり、Ａはオリゴペプチド（Ｎ ｌ（−ＣＵＲ−Ｃｏ）ｔｒｒと核酸ＮＴとの間のリンカ−１例えば前に開示され た鎖−Ｎ）ｌ（Ｃ１ｌ）！　−ホスフェートである〕により表すことができる。

この種の構造は、特に多数のオリゴペプチドを供給するのに有用であり、例えば １つだけの指向または標的因子を使って比較的短鎖のアンチセンスＩ）ＮＡまた はＲＮＡを細胞へ供給するのに有用である。オリゴヌクレオチドが細胞性または ウィルス性のＲＮＡを封鎖する配列に加えて取り込まれたオリゴヌクレオチドの 有効寿命を延長する配列を包むならば、そのようなベクターの能力はさらに増大 され得る。

式■により模式化されるような担体と指向または標的タンパク質との縮合は、連 結化合物ｍの場合において開示されたように実施される。関連技術は前記のＵＳ 出願０７／８２．２４４および関連出願ＥＰ−Ａ−８７，２０１，４９０，７に おいて詳しく発表されている。この技術は、下式のチオール化されたポリグルタ ミン酸またはポリアスパラギン酸活性エステルを最初に合成し、（ＣＨｚ）　２ −ＣＯｏＹ 次いで活性化されたエステル側鎖をアミノ誘導化ヌクレオチド化合物■と反応せ しめ、そして最後に担体およびヌクレオチドの中間付加物をタンパク質のマレイ ンイミド誘導体、即ち下式の化合物、 と反応せしめることに基づく。

縮合は、硫黄原子がマレインイミドの二重結合に付加することにより起こり、下 式の化合物 化合物Ｖはｍ＝０である式■の化合物の一態様である。変形はｍキＯにおいて達 成できる。そのような場合、核酸を担持している側鎖アームは、細胞内に輸送さ れる核酸の細胞内における酵素的放出を調節することのできる大きさおよび形態 のオリゴヌクレオチドを包む。

他の多くの縮合剤が本発明における有用な構造物の合成において使用され得ると いうことに留意すべきである。あるものは、ＰＩＥＲＣＥ　Ｂｉｏｒｅｓｅａｒ ｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　ｂｕｌｌｅｔｉｎ。

１９８３、第５巻、改訂版８４−８７において発表されており、例え今まで本発 明の主要な態様を簡単に説明したけれども、これから特定のＢ様をより詳細に記 載しよう。

第１の態様においては、選択された一片のＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば着目の一 遺伝子を適切なプロモーターおよびターミネータ−配列の支配下に置き：次いで それを細胞内でＤＮＡまたはＲＮＡの本来の機能を妨害することのないように選 択された適当な細胞指向または標的ベクター伝達物と縮合せしめる。

生じた系を標的細胞の存在下に置くと、ベクター−ＤＮＡ複合体は前記細胞の中 へ貫入し、そのことにより着目ＤＮＡまたはＲＮＡは高収率で取り込まれそして その中で機能性になり、例えばその後発現される。ここで指向（ｈｏｍｉｎｇ） 因子とは、該リガンドが取り込みを促進または増大させるが、即ち細胞膜の内側 へのルートを提供するが、特定の種類の細胞をそれらの細胞の特異的レセプター により認識する必要はない、と前述カーにより同定された特定の種類の細胞の方 へ導くであろう。

実際に、細胞レセプターに対し親和性を有するクンバク質に結合された遺伝子を 含む系の構想は既に報告されている（Ｓ、Ｙ、ＣＨＥＮＧ　ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ 　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ＩＨ１９８３）、　ｐ６５４−６６９　）　、 　Ｌかしながら、そのような系〔α２−マクログロブリンと結合したクロラムフ ェニコール−アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子〕は３Ｔ３−４細胞 の中に取り込まれるということが記述されたけれども、取り込まれたＤＮＡがそ の宿主細胞において機能を果たすことができるという証拠は全く提示されなかっ た。この場合において、該遺伝子と“矢じり”とを連結するために使われるリン カ−のタイプはおそらく不活性化している。

もちろん、本方法は１片だけの核酸を使ったトランスフェクション法に限定され ず；２つまたはそれより多くの配列での同時トランスフェクションもまた、１つ または幾つかの異なる指向因子を使って可能であり、これは場合に応じて１段階 において同時にまたは数段階において連続的に行われる。

２つまたはそれより多くの異なるポリヌクレオチド、例えばフラグメント土およ び上を使って同時トランスフェクションを行う時、これらフラグメントは別々に 標的ベクターに結合することにより導入され得る。また、主および互は同一のベ クターユニットに一緒に連結され得、１つの特定技術の選択は所望の結果および 操作条件に依存する。また、適切なリンカ−がリガンドとポリヌクレオチド、例 えばポリグルタミン酸またはポリリジンといった多官能価のアミノ酸との間に使 用されるならば（ＥＰ−Ａ−８７／２０１．４９０．７参照）、多数（１０−１ ００またはそれより多く）のポリヌクレオチド配列が１つの指向または標的因子 に付加され得る。

その概念、即ち細胞の形質転換の可能性を証明するために開発されたある実験モ デルにおいては、例えばＮＩＨ／３Ｔ３系のようなある種の真核細胞を使う場合 に外来の核酸は、細胞の成長を調節するための配列を含んでおり、前記の付加的 な配列は、組織培養においては可視できる細胞形質転換の腫瘍遺伝子であり、そ して生体内では腫瘍を連続的に発達させるヌードマウスのような温血動物への接 種後に増長する細胞の起点である。

この技術は、外来遺伝子が商品として注目される機能的生産物を発現するように 考案されている場合特に有用であり、そして結果的に変性された宿主細胞の増殖 が大スケールにおいて行えるということに注目するべきである（例えば、ストレ ス誘起性プロモーターにより支配された組換えＤＮＡによって発現されるタンパ ク質の工業生産）。

生体内における適用（例えば腫瘍の治療）の場合には、外来の核酸は熱誘導性遺 伝子、例えば細胞毒のタンパク質薬物をコードしそしてヒートショック支配配列 により作動される遺伝子、であることができる。この場合、標的ベクターは、悪 性細胞を認識しそしてその中への取込みを優先的に促進する能力のために選択さ れ；次いで、腫瘍細胞の効果的な生体内形質転換の後、熱が局所的に当てられ、 それにより該遺伝子が発現されそして、正常細胞をそのままにしておきながら悪 性細胞を抑制するかまたは殺す。

細胞認識が必須ではない時、即ちあるウィルス性疾患と戦う場合、指向因子は細 胞の取込みを促進する因子、例えばウィルス抗原、低密度リポタンパク質、リシ ンまたはアブリンのＢ部分などであることができる。

皿少旦皇星脱里 第１図は、オリゴヌクレオチドと細胞標的物質との結合の図式的描写である（こ こでは例として上皮成長因子ＥＧＦを使う）。

第２図は、選択された１片のＤＮＡ　（ＨＳ−１ｙｓ−ｔ／ＥＧＦ）の構成、即 ちヒトのヒートショックプロモーターにより作動されそしてＳＶ４０ターミネー タ−により停止するニワトリのりゾチーム遺伝子；およびこの選択されたＤＮＡ とＥＧＦとの結合を示した図である。

第３図は、ＨＳ−１ｙｓ−ｔ／ＥＧＦ連合系を使ってトランスフェクトしたＡ− ４３１ガン宿主細胞におけるストレス下での特異的ＲＮＡの生産を証明する電気 泳動図の写真である。

第４ａ−４ｃ図は、ＥＧＦ指向因子により輸送されたガン遺伝子の取込みおよび 発現の後の１正常”　ＮＩＢ／３Ｔ３細胞系の腫瘍細胞への形質転換の証拠を提 示する細胞培養物の写真である。

第５ａ図は、第４図に示されたガン遺伝子により形質転換されたＮＩＨ／３Ｔ３ 細胞（“細胞増殖巣″）の接種後３週間のヌードマウスにおける腫瘍形成を説明 する写真である。第５ｂ図は、ＥＧＦのみで処理したＮＩＨ／３Ｔ３細胞の接種 後３週間の対照のヌードマウスを示す。

第６ａ図は、拡大下で、ヒト扁平上皮ガン細胞系Ａ−４３１がその細胞膜のＥＧ Ｆレセプターの特異的染色によりその存在を示していることを表す。第６ｂ図は 、同じ拡大下で、対照細胞側ｌ−３８ヒトの胚線維芽細胞）を表す。

第１Ｂ様 本発明の第１態様においては、上皮成長因子（ＥＧＦ）を二フクトランスレーシ ョンにより”Ｐ　ｄｃＴＰでラベル化された腫瘍遺伝子Ｈａ−ｒａｓからの７０ ０ｂｐのＤＮＡ制限フラグメントに連結せしめ、そして生じた複合体（Ｉ）（第 １図参照）を、Ａ−４３１の培養物をトランスフェクションするために使用した ；これらの細胞（第６ａ図参照）の利用は、それらが高濃度のＥＧＦレセプター を有するので好都合であるＣＭ、Ｄ、Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ（１９８２）。

Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２０．１４９−１６１参照〕。

この縮合はＢ、Ｃ，Ｆ、ＣＨＵら（１９８３）、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈＩＨ１８）、　６５１３−６５２９に従って行った。初期に記 載されたこの方法は、この出願において第１図に図式的に概説される。

上記スキームに従って行った構成物が本発明の目的を達成するのに利用されるか もしれないとＣＨＵらが推察したということに既に注目した。しかしながら、彼 らはＤＮＡ−タンパク質付加物の実際の存在および受容細胞の作用を永久に変性 させるためのそのような付加物の有効利用については報告しなかった。

この事例においては、インキュベーション３時間後、放射能で標識されたＤＮＡ の取込みの程度を測定した。それの４５％が細胞質および核にあり、細胞膜には 存在しないということがわかった。対照実験は、比較のため５倍過剰の遊離のＥ ＧＦの存在下であること以外は同様にして行った。この時、細胞質および核のＤ ＮＡにおける放射能ラベルの量は１６％に減少し、複合体の取込みがＥＧＦレセ プターを通して進行しなかったという証拠を与える。

もちろん、この態様はリンカ−として５′−ホスフェートを使用することに限定 されない。取り込まれるポリヌクレオチドの所望の生物機能的能力を阻害または 妨害しないような、前に開示されたこの種の多くの他のリンカ−もまた可能であ る。

第２６１ 第２態様においては、ＥＧＦを式ＨＳ−１ｙｓ−ｔ　（式中、ＨＳはヒトのヒー トショフタブロモーター配列（Ｄｒｅａｎｏ　Ｌら（１９８７）　Ｇｅｎｅ４９ 、１−８）であり、ｌｙｓはニワトリのりゾチーム遺伝子であり、そしてｔはＳ Ｖ４０ターミネータ−である〕により示される１組のＤＮＡと結合した。この付 加物（化合物■）の調製を概説するスキームは第２図に示される。

化合物■はＡ−４３１扁平上皮ガン細胞の単層培養物の培地に導入され、そして インキュベーション時間の後、培養物を熱のストレスにさらした（４２℃で４時 間）。その後リゾチーム特異的ＲＮＡの生産物を抽出しそして続いてＳ−１ハイ ブリダイゼーシヨンにより確認した。その結果を第３図の電気泳動図に示す。

第３図中、レーン１はテストレーンである。リゾチームＲＮＡは、暗色のバンド （Ａ）として現れる。レーン２（対照）は先行技術の方法（リン酸カルシウムの 存在下）によりトランスフェクトされた培養物から得られたものである。レーン ３は化合物■を全く加えない対照実験を示す。レーン４はマーカーを使った測定 を目的としたものである。

これらの結果は、機能形において、即ち誘導的に発現され得る形においてＤＮＡ を取り込むこの技術の有効性を決定的に証明する。もちろん、この技術は誘導的 発現下に置かれた構造遺伝子に限定されるものではなく、構成的に発現される遺 伝子にも同様に適用され得るものであ々。

第３Ｂ様 第３態様においては、ユ旦腫瘍遺伝子をＥＧＦと縮合せしめた。生じた複合体（ Ｉ［［）をＮｌ）！／３Ｔ３細胞の培養物へ添加しそして一装置いた。２週間後 、多数の“細胞増殖巣（ｆｏｃｉ）”が認められ、細胞の安定した形質転換（即 ち、”ｒａｓ’ＤＮＡの“正常”ゲノムへの安定した取込み）の証拠を与えた。

“細胞増殖巣”は屈折した表現型および積み重なる傾向を有する濃厚に詰まった 細胞のかたまりである。“細胞増殖巣”は、第４ａ図に示されたペトリ皿の写真 における黒い斑点である。

第４ｂ図は、先行技術に従ってカルシウム塩の存在下腫瘍遺伝子（標的物質なし ）を使ってトランスフェクションを行った対照実験の結果を表す。第４ｃ図は、 Ｎ１）Ｉ／３Ｔ３細胞への添加に遊離のＥＧＦのみを使った別の対照実験を表す 。ｉｆ　Ｌ’ｔできる“細胞増殖巣”はこの時全く生じなかった。“細胞増殖巣 ”はヌードマウスに注射すると腫瘍形成を引き起こした。また、形質転換された コロニー（“細胞増殖巣′）を取り出し、そして試験管内で５Ｘ１０”細胞数に 達するまで増殖させた。

次いでこれら細胞を無胸腺のヌードマウスに注射した。対照として、ＥＧＦ（１ ００１ｔｇ／ｉ）で処理した５Ｘ１０６個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞もヌードマウス に注射した。３週間後、“細胞増殖巣゛から増殖された細胞を接種されたマウス は全て腫瘍を形成した（第５ａ図）が、それに対して対照マウスは形成しなかっ た（第５ｂ図）。

第２系列の対照において、塩化カルシウム法を使って」旦腫瘍遺伝子でトランス フェクトされたＮＩＨ／３Ｔ３細胞の“細胞増殖巣”から増殖された細胞をヌー ドマウスに注射すると、予想通り腫瘍を引き起こした。

このことは、本発明に従って細胞の中へ導入された腫瘍遺伝子が発現されそして 安定した様式で働くということをさらに証明する。

第４態様 ここの第４態様は、アンチセンスＲＮＡ　（ＤＮＡ）のまたは、ウィルス抗原に より取り込まれた後にアンチセンスＲＮ＾を発現するように操作された遺伝子の 、指向または標的に関する。

さらに詳しくは、ヌクレオチド配列〔ここではアンチセンスＲＮＡ　（ＤＮＡ） と称される〕、これはＲＮＡ、　ＤＮＡまたは修飾されたオリゴヌクレオチドで あることができ特定の細胞集団において生産される特定のＲＮＡと相補的である 、をウィルス抗原により標的しそして取り込ませる。または、アンチセンスＲＮ Ａを発現する遺伝子構成物をウィルス抗原により標的しそして取り込ませる。こ れらの化合物は、ある種のウィルス性タンパク質の発現を封鎖することによりウ ィルス怒染を特異的に抑制するように考案されている。アンチセンスＲＮＡは、 細胞内のハイブリダイゼーションによってｍＲＮＡの翻訳を阻害するということ がわかっている。本発明のアンチセンスＲＮＡ　（ＤＮＡ）−ウィルス抗原複合 体は、試験管内並びに生体内で使用できるように考案されている。この態様に対 する付加的な関心としては、ウィルス抗原を使って全ての遺伝子が標的に向けら れそして取り込まれ得、ＤＮＡの形において、細胞に新規なタンパク質合成の能 力をもたらす方法を提供する、という事実である。

ウィルスはそれらの活動を特定の細胞種に及ぼす。ウィルスの活動はウィルス粒 子全体の特異的な標的指向及び取込みにより媒介されることが記載されている。

この特異性および取込みは、ウィルス抗原により部分的に決定される。これらの ウィルス性タンパク質もまた、ｐＨ５〜６でのエンドソーム膜との融合によるリ ソソーム分解の経路をウィルスに回避させる。例えば、Ｔ４リンパ球のレセプタ ーに対するＨＩＶウィルス（ＬＡＶまたはＨＴＬＶ　ｎＩ　）の特異性は、その ウィルスの１つの抗原により決定されるＣＭ、Ｍａｒｃｈ（１９８４）、　Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、Ｊ、　２１ｆｌ。

１　；　Ｐ、Ｊ、Ｍａｄｄｏｎら（１９８６）、　Ｃｅ１ｌ　４７．３３３を参 照のこと〕。

本発明においては、そのようなウィルス抗原は、オリゴヌクレオチドおよび遺伝 子を標的に向けそして取り込ませるために使用され得る。

多くのウィルス、例えばアデノウィルス、水痘性口内炎ウィルス、ラウス肉腫ウ ィルスおよびセムリキ森林熱ウィルスは、細胞膜上を水平に滑ることにより細胞 をクラスリン被覆窩へ陥入させそして続いて被覆されていない小胞に蓄積する。

それらは上皮成長因子または血小板由来の成長因子のような多くの成長ホルモン 、α２−マクログロブリン、ソマトメジンＣ，）リョードサイロニン、トロンビ ン、赤痢およびジフテリア毒素のような分子と同じ経路を使って細胞に入りこむ （Ａ、Ｈｅ１ｅｎｉｕｓら（１９８０）、　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　８４． ４０；　Ｓ、Ｄａｌｅｓ（１９７３）。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　Ｒｅｖ、　３’Ｌ　１０３：　Ｒ，Ｂ、Ｄｉｃｋｓｏｎら （１９８１）、　Ｊ、Ｃｅ１ｌＢｉｏ１．８！Ｌ　２９；　Ｍ、Ｃ，Ｗｉｌｌｉ ｎｇｈａｍら（１９８１）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇ ｙ　１９８０−１９８１．　）１．Ｇ、Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒ監修、Ｓｐｒｉｎｇ ｅｒＶｅｒｌａｇ＋　Ｂｅｒｌｉｎ＋　ｐｐ、６１３−６２１；　１．Ｐａ５ｔ ａｎら（１９８１）、　５ｃｉｅｎｃｅ２１４　５０４）。ウィルス抗原を使っ てオリゴヌクレオチドを標的に向けることは、抗体およびホルモンを使うことに 関して新しい可能性を提示する。なぜなら、特定の細胞に貫入するのに携わる経 路はウィルスにより使用されるものと同じであるからである。ウィルス抗原を使 ったアンチセンスＲＮＡ　（ＤＮＡ）の駆動はそのモデルをよりいっそう端書に し、そしであるものは実質的に副作用があってはならない新しい標的療法薬を開 発せしめる。

取り込まれたウィルスは、リソソームに融合するレセプトソームにおいて分離さ れる。リソソームはタンパク質分解酵素の大きいカクテルを運ぶけれども、ウィ ルスは細胞質中にうまくのがれそして複製する。リソソームからの物質の脱出は 、他の多くの事例において認められる。例えば、あるＤＮＡはあらゆるトランス フェクション法においてリソソームから脱出する。例えばどんな様式のトランス フェクションでも、例えば電気衝撃、ＣａＣ１ｚまたはＤＥＡＥ−デキストラン でも、取り込まれたＤＮＡがいつもリソソーム酵素に暴露されるということがわ かっている（Ｒ，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら（１９８４）、　Ｃｒ１ｔ、Ｒｅ ｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１６．３４９参照〕。さらに、別の領域であるけれども、細 胞内薬物放出系として考案された多くの細胞毒性薬物が細胞に入りそしてリソソ ームで分解され、次いで薬物を放出し、それが細胞質または核へ運ばれる−（Ｒ ，Ａｒｎｏｎら（１９８３）　。

Ｔａｒｇｅｔｅｄ　Ｄｒｕｇｓ、　Ｅ、Ｐ、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ監修、Ｗｉｌｅｙ 　Ｐｕｂｌｉｃ＋　ｐ２３参照〕。それと同じ経路が、遺伝子またはアンチセン スＲＮＡを有しそしてウィルス抗原により輸送されるベクターを使って利用でき る。

アンチセンスＲＮＡが細胞内のタンパク質合成を阻害することは既知である。

アンチセンスＲＮＡを使ったタンパク質合成の阻害を記述している幾つかの論文 が発表されている０例えばＲ，Ｙ、Ｌ、Ｔｏら（１９８６）、　Ｍｏ１ｅｃ、Ｃ ｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　６　（１２）、　４７５Ｂは、アンチセンスＲＮＡを 発現するウィルスを使ったレトロウィルスの複製の阻害を発表した。１．Ｊ、Ｍ ｃＧａｒｒｙおよびＳ、Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ、　１．Ｊ。

ＭｃＧａｒｒｙら（１９８６）、　ＰＮＡＳ　ｕ、　３３９（ＵＳＡ）は、アン チセンスＲＮＡを発現する熱誘導性構成物を使ってヒートショックタンパク質の 合成を阻害した。Ｊ、Ｈｕｎｔら（１９８６）、　ＦＥＢＳ　４０８２．２０６ （２）。

３１９は、扁平上皮ガン細胞系にトランスフェクトされたアンチセンスＲＮＡベ クターを使ったＥＧＦレセプターの合成の阻害を記述した。ウィルス感染を抑制 する方法としてのアンチセンスＲＮＡの利用は、新規アプローチとしてしばしば 提唱されている：　Ｊ、Ｇ、Ｌｚａｎｔら（１９８５）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２ ９９．３４５；　Ｅ、Ｃ，Ｍ。

Ｍａｒｉｍａｎ（１９８５）、　Ｎａｔｕｒｅ（レター）、　３１８．４１４； 　Ｒ，Ｔｅ１ｌｉｅｒら（１９８５）、　Ｎａｔｕｒｅ　（レター）、　３１８ ．１４１　、この方法を潜在的に制限しているのは、ウィルス感染を抑制するの に必要なアンチセンス分子の量である。

本発明においては、ウィルス抗原（またはその一部分）をウィルス全体から抽出 しそして精製するか、または典型的なペプチド合成により合成することもでき； 次いでそれを前述の方法によりＤＮＡ　（またはＲＮＡ）と縮合する。オリゴヌ クレオチドは、半減期を延長せしめるためにまたは特定の性質を与えるために、 例えばＲＮＡ鎖にハイブリダイズされた時にそれらを切断するために考案された 修飾ヌクレオチドを含むことができる。オリゴヌクレオチド−抗体の縮合は、例 えばｃＨＵら（１９８３）、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ、Ｒｅｓ、　１１．（１８）、　 ６５１３により記載されたような種々の方法を使って実施され得る。

下記の操作は、本態様の有効性を立証するために実施される：ウイルスにより感 染された細胞にベクターを添加し、それによって： ウィルス抗原はそれの特異的なレセプターを認識し；ウィルス抗原−アンチセン スＲＮＡ　（ＤＮＡ）の複合体が細胞に入り； アンチセンスＲＮＡ　（ＤＮＡ）がレセプトソームを脱出し；アンチセンスＲＮ Ａ　（ＤＮＡ）が新しく合成されたウィルスＲＮ＾と特異的にハイブリダイズし ；そして ウィルスの感染が抑制される。

また、ウィルス感染が遺伝子を標的に向けそして取り込ませるためのベクターと して使用される場合、この遺伝子により発現されるタンパク質は抗ウィルス剤で あることができるし、またはウィルス感染と直接関連しない他の目的に役立つこ とができる。

第５態様 １　ここで第５態様（これは上記の第３態様と一緒にされるべきである）は、」 遺伝子の逆方向セグメント（例えばにｐｎｌ−ＸｍａＩ　フラグメント）を発現 するプラスミドの構成に関する。

また、」旦遺伝子の別の逆方向フラグメントも同様に使用され得る。これらのフ ラグメントはオリゴヌクレオチド合成により合成されてもよ（、遺伝子または他 のものから単離されてもよい。

ュ旦腫瘍遺伝子の役割は広く記載されている（Ｔ、Ｙ、５ｈｉｈおよびＭ、０． Ｗｅｅｋｓ、　１９８４＋　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１（ ２）、　１０９−２２３；Ｃ，Ｊ、Ｍａｒｓｈａｌｌ、　１９８６．　Ｊ、Ｃｅ １１．Ｓｃｉ、５ｕｐｐ１．　ｉ、　４１７−４３０　）。

それが細胞系並びに−次細胞を試験管内で形質転換するということが示されてい る。これらの細胞は形態的に異なりそしてヌードマウス内で腫瘍形成性である。

ｒａｓにコードされるタンパク質は細胞膜に位置しそしてＧタンパク質の１つの サブユニ’７トと類似している（）１．Ｒ，ＢｏｕｒｎｅおよびＸ、Ａ、５ｕｌ ｌｉｖａｎ。

１９８６、　Ｃａｎｃｅｒ　５ｕｒｖｅｙｓ、５　（２）、　２５７−４５１） 　、　Ｇタンパク質は成長因子により？、導されるシグナルにおける第二のメツ センジャーである。Ｇタンパク質のｒａｓ相同性サブユニットは、そのシグナル 化の強度を調節するＧＴＰ結合特性を有する。」旦にコードされるタンパク質は 、ＧＴＰに対し低い結合親和性しか持たず、それ故構成的なシグナルを細胞へ伝 達する（上記のＢｏｕｒｎｅの文献参照）。この機構が細胞を形質転換すると推 定される。

正常な」閃タンパク質が成長因子のシグナル経路において役割を果たすことは明 らかである（上記のＢｏｕｒｎｅの文献参照）。

この正常なｌ旦タンパク質および形質転換ｌ且タンパク質の配列に関する研究は 、一点突然変異が後者の形質転換活性の原因であり得るということを示した。こ の点突然変異はタンパク質Ｐ２１の１２　、１３　、５９　、６１および６３番 目のアミノ酸に位置する（上記のＢｏｕｒｎｅの文献参照）。別の系列の研究に おいて、コ遺伝子の過剰発現が培養において細胞を形質転換させることができ、 そしてその細胞への」閃腫瘍遺伝子に対する抗体の注入が血清刺激の後にそれら のＤＮＡを複製させないということが証明されている。これは細胞が悪性に進行 しないために」旦タンパク質の正確な投薬が必要であるということを示す。それ 故、正常のおよび／または変異のＪ…の発現を調節することが腫瘍抑制のための 重要なカギであるように思われる。

アンチセンスＲＮＡ技術を使って、本発明において開示された技術は、細胞（ま たはウィルス）のコードされた形質転換ｒａｓＲＮＡの変異部分に対しその場で 特異的にハイブリダイズするようにアンチセンスＲＮ＾が発現される系を設計す ることを可能にする。また第４Ｂ様に記載したものと同様にして、形質転換ｒａ ｓＲＮＡにハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチドを細胞に導入す ることもできる。

第１のアプローチに含まれる段階は次のものである：１、ｌｌ？ＩＩ乳類の細胞 においてアンチセンスＲＮＡを発現するプラスミドを構成する。」閃フラグメン トは、１２番目のアミノ酸の点突然変異として振る舞う」閃の逆方向Ｋｐｎｌ／ Ｘｍａｌフラグメントであるか、または構成的もしくは誘導的プロモーターの支 配下にある」且遺伝子の別の逆方向フラグメントである。

２、線状プラスミドを前記の技術に従ってベクターに結合せしめる。

３、　その接合体を培養物中の種々の哺乳類の細胞に適用する。

４．３１マフピングまたは免疫細胞化学により内因性の」閃発現を測定する。

５、腫瘍を有するヌードマウスにその接合体を注入することにより腫瘍の退行を 評価する。

このような構想の例は下記に概説される。

〔参考文献：　Ｃ，Ｊ、Ｔａｂｉｎら（１９８２）、　Ｎａｔｕｒｅ　３００． １４３−１５２　〕ＥＧＦ司一一丁耐丁、。＝ア７５−ヤ７ユオ１．お、ウォヶ 。

ユニオリゴヌクレオチドは分解性のリンカ−により結合される（血液中で安定お よび細胞中で分解性）。

第２のアプローチは次のように要約される：１、　形質転換活性ＲＮＡの変異部 分とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを合成する。

２、該オリゴヌクレオチドを担体〔前記式＜　ｒｖ　＞に定義されたものが好ま しい〕と縮合しそして標的因子（）ＩＴ）、例えばＥＧＦと縮合する。

３、該構成物を細胞にトランスフェクトする。

４、　これら接合体の細胞への取込みを評価する。

５、ＥＧＦレセプターをもつ細胞中の」Ｕの発現に関してそれら接合体の効果を 測定する（Ｓｌ、免疫細胞化学）。

６、腫瘍を有するヌードマウスに該接合体を注入することにより腫瘍の退行を評 価する。

このアプローチにおいて、ＲＮＡの定義された部分に相補的な短いオリゴヌクレ オチドは、繰返し配列を与えるように結合または合成され得る。この配列が標的 に向けられ、こうし）　で、担体としてポリグルタミン酸（これの遊離カルボキ シル鎮はオリゴヌクレオチドのためのδ−リンカ−として使用される）を使うこ とにより、単一の指向物質が複数の異なるＲＮＡ）分子を抑制することができる 。その構成物は血漿中で安定であるが標的細胞中では分解されるように考案され る。

この付加物は、ａ）多数のＲＮＡ分子とハイブリダイズさせるために作ったオリ ゴヌクレオチドの繰返し配列を使うことによる立体的問題を回避するために、そ してｂ）多量のアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内放出を可能にするため に、考案されている。加えて、これらのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ分解酵素 からそれらを保護するであろう末端アミノ酸を備えることができる。

この操作手順の第一目的はユ旦で形質転換された細胞に対する標的薬物を生産す ることである。ｒａｓが活性な形質転換作用を果たすと思われる種々の腫瘍が存 在する。我々はここで、それらの細胞に向けられる取込み特性を有する新しいＤ ＮＡ／タンパク質接合体を手にする。ＥＧＦは好ましくは標的ベクターとして使 われる。しかしながら、他の特異的または非特異的な標的および指向装置（成長 因子、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラクション、ＬＤＬ　、）ランスフェリン 、ウィルスおよび腫瘍特異的抗原のような）が駆動ユニットとして使用され得る 。

これらの指向装置を、構成物を発現する別のアンチセンスＲＮＡにまたはオリゴ ヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドに結合することが可能であり、そのため それらの構成物は幾つかの疾病、例えばウィルス疾患、ガンまたは遺伝的障害に 対する遺伝子治療薬として通用され得る。

第６態様 ６番目の可能な態様は、本発明の範囲内で旧Ｖ（ＡＩＤＳを引き起こすウィルス ）からの抗原の標的因子としての利用に関する。この方法における（）ＩＴ）は ｇｐ４１タンパク質であるらしい。

この抗原の約２９個のアミノ酸の短鎖は、リンパ球のＴ４レセプター、即ちこの ウィルスの主な標的に選択的に結合するということが証明されている。この鎖は 、ＤＴＩＴＬＰＣＲＩＸＱＩＩＮＭＷＱＥＶ（ＪＡＭＹＡＰＰＩＳ（７ミ／　酸 （Ｄ国際コート）のように表される。

このアミノ酸配列はポリヌクレオチド並びに抗ウィルス剤、例えばＡＺＴ、アシ クロビル、ＨＰＡ−２３またはスラミンを標的に向けるのに使用され得る。

この２９個のアミノ酸の鎖は、常法により合成され；次いでそれは標的因子（Ｂ Ｔ）としてウィルスのアンチセンスＲＮＡの担体（例えば弐■に示されたもの） と縮合される。そのベクターはＡＩＤＳ患者を治療するために使用され得る。こ れは、オリゴヌクレオチド類似体の形での抗ウィルス剤を標的に向けるために（ ＨＴ）因子を使用する一例である。

第７Ｂ様 第７態様は、ある腫瘍遺伝子の過剰発現により引き起こされるある形態のガン疾 患の治療を扱う、それ故、このＢ様は前記の第５態様に関連し、そしてそこで開 示された技術を同様に通用できる。

細胞は、ある腫瘍遺伝子の過剰発現により形質転換され得る。例えば、旦腫瘍遺 伝子が大量の胸部腫瘍において過剰発現されるという証拠が浸透している。過剰 生産された！腫瘍タンパク質が形質転換活性を存するという事実は、」些−形質 転換Ｎ１）Ｉ／３Ｔ３細胞の表現型を復帰させる抗体を使って簡潔に証明されて いる。」μしｃ−ｅｒｂ−Ｂおよび上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）間の配 列相同性は証明されている。それ故、アンチセンスＲＮＡによるタンパク質の抑 制は、そのような腫瘍タンパク質の活動を元に戻すための優れた可能性を提供す る。さらに、ある単一のオリゴヌクレオチドが３つのタンパク質全てを抑制する のに十分かもしれない、ここに記載されるアプローチは、アンチセンスオリゴヌ クレオチドを上皮成長因子により標的に向けられるポリマーに固定することであ る。この構成物、即ち標的に向けられるアンチセンスオリゴヌクレオチド放出系 は、１）血漿安定性、２）特異的性質、３）取込み特性、４）リソワーム生物分 解性特性および５）抗腫瘍活性を有するように考案される。多量のオリゴヌクレ オチドが１つのＥＧＦ分子により運ばれ得るという事実は、このモデルに有用性 を与える。

ＥＧＦレセプター遺伝子、ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂ−Ｂ　、ｒａｓおよび」Ｌを含む いくつかのプロト−腫瘍遺伝子はヒトの腫瘍において増幅されることがわかって いる。ヒトの神経芽細胞腫における」］バ腫瘍遺伝子および胸部腫瘍における一 皿腫瘍遺伝子の増幅コピーの存在は、その腫瘍の攻撃力と互いに関連がある。Ｅ ＧＦレセプター、ｃ−ｅｒｂ−Ｂ−２および」ユ腫瘍タンパク質は、密接な配列 相同性を有することがわかっている。これらの腫瘍タンパク質はアンチセンスＲ ＮＡ抑制実験の優れたモデルである。これらのタンパク質に対して有効なアンチ センスＲＮＡ発現構成物または合成アンチセンスオリゴヌクレオチドは、この開 示において揚藁される有効な生体内投与ルートが使用されるならば、高い可能性 の医薬的価値を有する。

ＥＧＦＲは、膀胱、胸部、肺、胃、皮膚および脳からの扁平上皮ガンにおいて多 量に認められる（Ｊ、Ｒ，Ｃ，Ｓｔａｉｎｓｂｕｒｇら、１９８７＋　Ｔｈｅ　 Ｌａｎｃｅｔ、６月２０日、１３９８−１４０２　；細胞毒性薬特許ＥＰ−Ａ− ８７，２０１，４９０，７）。増強された発現とより攻撃性の腫瘍の動態との関 連性がそれらの腫瘍について報告されている。ＥＧＦレセプターに対するアンチ センスＲＮＡを発現するプラスミドが構成されており、ＥＧＦレセプターの濃度 を減少させることが示されている。

ｃ−ｅｒｂ−Ｂ−２（ヒトの乳ガンから最初に単離された）は、ヒトの胃腺、前 原および唾液腺の腺ガンにおいて増幅される。

それは検査されたヒト腺ガン２５７人のうち５８人において認められ、そして１ ８９人のヒト胸部ガンの２６％において増幅が認められた。ｃ−ｅｒｂ−Ｂ−２ 遺伝子の増幅は過剰発現と互いに関係があることが示された（Ｄ、Ｊ、Ｖｅｎｔ ｅｒら、１９８７．　Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ。

６月号、６９−７１）。乳ガンの研究において、増幅は乏しい予後に関係があり そしてエストロゲンまたはプロゲステロンのレセプターの存在よりもより強力な 病気経過の予知体であった。

最近、この腫瘍遺伝子の過剰発現がＮＩＢ／３Ｔ３の形質転換に必要であること が証明された（Ｐ、Ｐ、Ｄｉ　Ｆｉｏｒｅら、１９８７＋　５ｃｉｅｎｃｅ。

２３７、１７８−１８２）。

」些（エチルニトロソウレアで誘発されたラットの神経芽細胞腫において最初に 単離された）は、神経芽細胞腫およびダリア芽細胞腫において強力に転写される 。証拠の幾つかの系は旦がｅｒｂ−Ｂ−２遺伝子の活性化型であることを示した 。

それは乳ガンの多くの症例において増幅されることが証明されている。それはＮ ＩＨ／３Ｔ３細胞を形質転換せしめ、ヌードマウス内でそれらを腫瘍形成性にす る。腫瘍形成のラット」匹タンパク質に対する抗体が生体内で腫瘍形成を抑制す ることが示された（Ｊ、Ａ、Ｄｒｅｂｉｎら、１９８５．　ＣａＩ２．４１．６ ９５−７０６）。

このように、これらタンパク質の発現の減少は、ある腫瘍の悪性を回復させるで あろう。標的に向けられた細胞内のアンチセンスオリゴヌクレオチド放出系は価 値あるアプローチである。本発明の意味の範囲内の幾つかのオリゴヌクレオチド を有する細胞内分解可能のポリマーに結合されたＥＧＦ分子から成る構成物は、 価値ある抗ガン剤である。

ＥＧＦＲ、ｃ−ｅｒｂ−Ｂ２および」ユ遺伝子により発現されるタンパク質の細 胞外の部分および細胞質内の部分において、アミノ酸の相同配列が認められ得る （Ｃ，Ｊ、Ｂａｒｇｍａｎｎら、１９８６＋　Ｎａｔｕｒｅ。

３１９、２２６−２３４）。これらのアミノ酸相同配列は、アンチセンスＲＮＡ のための標的として働くことができる苓幾つかの相同性ヌクレオチド配列を持つ 。これは、３つの異なるガン関連性遺伝子の合成を抑制するために同一のオリゴ ヌクレオチドを使用する良い機会を提供する。これら３つの着目タンパク質は外 部ドメインおよび内部ドメインを有する。これら腫瘍タンパク質問の最高の相同 性は、チロシンキナーゼセグメントにおいておよび外部ドメイン中の短いセグメ ントにおいて認められる。３つのタンパク質金てにおいて相同性である９個のア ミノ酸列が細胞外配列中に存在する。それは３つのタンパク質金てに相同である ８ヌクレオチド配列、ｃ−ｅｒｂ−Ｂ−２およびＥＧＦＲにおいて相同である１ １ヌクレオチド配列、ＥＧＦＲド配列を含む。細胞質内の配列中には、３つのタ ンパク質金てに相同である２８個のアミノ酸配列がある。それはそのタンパク質 のチロシンキナーゼ部分をコードするドメイン中にある。この部位におけるヌク レオチドの相同配列の長鎖は３つの腫瘍タンパク質金てについて認められる。こ れらの配列は、３つの腫瘍タンパク質のタンパク質合成を抑制するのに使用され 得る。もちろん、３つの遺伝千金てには相同でない配列を使った接合体も使用で きる。この態様を支持する参考文献は下記のものを含む：　Ｃ，Ｔ、ＢａｒｇＩ Ｉａｎｎら＋　Ｎａｔｕｒｅ＋　１９８６旦ム２２６−２３０；　Ｐ、Ｐ、Ｄｉ 　Ｆｉｏｒｉら、　５ｃｉｅｎｃｅ＋　１９８’Ｌ　２３７＋　１７８−１Ｂ２ ；　Ｊ、Ａ、Ｄｒｅｂｉｎ　ら、　Ｃｅ１ｌ、　１９８５．４１．６９５−７０ ６；　Ｊ、Ｈｕｎｔｓら。

ＦＥＢＳ４０８２．１９８６．　韮（２）、　３１９−３２２；　Ｇ、Ｔ、Ｍｅ ｒｌｉｎｏ　ら、　Ｍｏｌ。

ｃｅｌｌ、Ｂｉｏｌ、、　１９８５＋　５（７）＋　１７２２−１７３４；　Ｊ 、Ｒ，Ｃ，５ａｉｎｓｂｕｒｙ　ら。

Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ、６月２０．１９８７．１３９８−１４０２；　Ｄ、Ｊ、 Ｓｌａｍｏｎ　ら。

５ｃｉｅｎｃｅ、　１９８７．２３５＋　１７７−１８２；　Ｄ、Ｊ、Ｖｅｎｔ ｕｒｅら＋　Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ＋１１７月、　１９８７．６９−７１；　Ｔ 、Ｙａｍａｍｏｔｏ　ら、　Ｎａｔｕｒｅ　１９Ｂ７．３１９゜２３０−２３４ 　。

ここの実験的アプローチは、前の態様のものと全く同じである。要約すれば、オ リゴヌクレオチドは直接ＥＧＦにまたはＥＧＦにより標的に向けられるポリグル タミン酸に固定されて標的に向けられるアンチセンス細胞内オリゴヌクレオチド 放出系を生成する。後者はＥＧＦ　１分子について多数のオリゴヌクレオチドを 取り込む可能性を提供する。代わりの実験は、アンチセンスＲＮＡ発現構成物の ＥＧＦによる直接標的指向を含む。ＥＧＦの場合、オリゴヌクレオチドはポリマ ー−ＥＧＦ構成物に連結されそしてＡ４３１細胞のＥＧＦレセプターをダウンレ ギュレーションするのに使用される。そして、ベクターの効果を調べるために下 記の試験が行われる。

ａ）　ＥＧＦレセプター濃度の減少を見本ためのペルオキシダーゼラベル化免疫 試験、 ｂ）ＥＧＦ親和性の減少を見るためのＩ！Ｊ−ラベル化ＥＧＦ、Ｃ）細胞***の 減少を見るための３５３−メチオニン、ｄ）前処理された細胞の生体内での腫瘍 形成能、ｅ）腫瘍の進行の低下を観察することによる、標的に向けられたオリゴ ヌクレオチドを用いる生体内処置による阻害。

これは、リガンドがそれ自身で付着を抑制するかもしれない例である。これは、 新しい形のアンタゴニストを提供する。

」遺伝子の場合、オリゴヌクレオチドは、前記と同じポリマー−ＥＧＦ構成物に 連結され、そして工により形質転換されたＮＩＨ／３Ｔ３細胞において腫瘍形成 性の合成を阻害する。これは下記の試験により追求される： ａ）Ｈ肥により形質転換されたＮ１１（／３Ｔ３細胞の形質転換された屈折表現 型の消失を証明する。

ｂ）これらのＮＩＨ／３Ｔ３細胞の軟質寒天中での増殖を試験する。

Ｃ）ヌードマウスにおいてこれらの細胞の腫瘍形成能を試験する。

ｄ）　ｎｅｕにより形質転換されたＮＩＩＩ／３Ｔ３腫瘍を有するヌードマウス をＥＧＦと連結されたアンチセンスＲＮＡで治療する。

ｃ−ｅｒｂ−８２の場合、オリゴヌクレオチドはいつものようにＥＧＦに連結さ れ、そして」で形質転換されたＮ１）Ｉ／３Ｔ３細胞において細胞の形質転換を 抑制するために使用される。実験室の作業は」匹についてのものと同じであるが ｃ−ｅｒｂ−Ｂ−２で形質転換された細胞を使った。ｃ−ｅｒｂ−Ｂ−２で形質 転換された細胞または高レベルのＥＧＦを有する細胞を使った交差実験は有用で ある。

もちろん、本発明の他の態様におけるように、標的指向および取込み因子として のＥＧＦの利用は、同様の特性を存する他の分子（他の成長因子、モノクローナ ル抗体、Ｆａｂフラクション、ＬＤＬ、）ランスフェリン、ウィルス抗原など） にまで拡張される。その輸送体はまたポリグルタミン酸と異なってもよい（側鎖 を持ったまたは持たないアミノ酸のホモポリマーもしくはコポリマー、デキスト ランなど）。オリゴヌクレオチドは、それらの半減期を延長させるために修飾さ れてもされなくてもよい。加えて、そのモデルは各オリゴヌクレオチド間に生物 分解性の二重結合を持ったまたは持たない“ポリオリゴヌクレオチド”の標的指 向にまで拡張することができる。

第８態様 前記以外の第８態様をこれから記載する。ここにおいて本発明は、アンチセンス ＲＮＡを使ってポリオウィルス感染の抑制に適用されるであろう。

ウィルスがユニークな遺伝物質を有することは公知である。

それ故、特定のウィルスの配列は細胞性の配列から容易に区別され得る。アンチ センスＲＮＡは、ウィルス感染を遮断することのできる非常に特異的な手段であ る。それは旧Ｖ、即ちＡＩＤＳウィルスの複製を抑制するのに使用されているＣ Ｐ、Ｃ。

Ｚａｏ＋ｅｃｎｉｋら、（１９８６）、　ＰＮＡＳ　８３．４１４３）　、例え ば、ポリオウィルスの遺伝物質は正センスー末鎖ＲＮＡから成る。このウィルス の感染サイクルは該ウィルスのＩ？ＮＡ　と相補的なアンチセンスＲＮＡ（また はオリゴヌクレオチド）で遮断され得る。この抑制は複製レベルまたは翻訳レベ ルのどちらでも起こり得る。

プラスミドおよびオリゴヌクレオチドは、ベクターとして例えばＥＧＦを使って 標的に向けられそして取り込まれる。オリゴヌクレオチドは、細胞内オリゴヌク レオチド放出系を標的に向けることにより大量に運ばれる。これらの系並びに標 的に向けられる遺伝子もまた生体内で利用され、そしてここでは新規な抗ウィル ス剤として記載される。ポリオウィルスは、旧ν（ヒト免疫不全症ウィルス）、 ヘルペス、インフルエンザ、ライノウィルス、サイトメガロウィルス、ＨＴＬＶ 　（ヒトＴ細胞白血病ウィルス）を含む種々のウィルスへの他の適用についてこ の成果の有用性を立証するのに役立つ。

ここに記載されるベクターは、療法においておよびそれらの幾つかについては予 防において、抗ウィルス剤として使用され得るように考案される。ポリオウィル ス感染を抑制するための２つのルートを提冥する。

■）標的に向けられたアンチセンスＲＮＡを発現する遺伝子構成物 ■）標的に向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリ ゴヌクレオチド類の放出系Ｉ）アンチセンスＲＮＡを発現する遺伝子構成物が構 成されそして指向（ｈｏｍｉｎｇ）または標的ユニット（ＨＴ）が設けられる。

例えば、プラスミドはＳシ４０プロモーター支配下のネオマイシン耐性遺伝子、 ＳＶ４０複製開始点、アンチセンスＲＮＡ合成を調節するヒートショックプロモ ーター（即ち逆転されたポリオ配列）、およびアンピシリン耐性遺伝子（ｐ１７ ｐｎｅｏ）を含む。−駆動体（ＨＴ）としてＥＧＦを使った等該ベクターを、下 記を含む実験によりテストする： １）標的に向けられるｐ１７ｐｏｎｅｏによるネオマイシン耐性細胞系（Ｗｉｓ ｈ、　Ｈｅ１ａ、　Ｃｏ５）の確立または、代わりにＣｏｓ細胞へのｐ１７ｐｏ ｎｅｏのトランスフェクト及び増幅。これらの細胞はヒートショックを加えると 多量のアンチセンスＲＮＡを発現する。

２）熱処理の前または後での該細胞系の異なるウィルス希釈液での感染。ポリオ ウィルス感染の抑制は、−トリパンブルー算定 一軟寒天感染性コロニー算定 ２Ｈ−チミジンの取込み により評価される得る。

３）対照実験は下記を含むニ ーＲＮＡａｓｅ　Ｈで細胞質抽出物を処理しそして残った二本鎖を二フクトラン スレーションしたプローブとハイブリダイズすることにより、ハイブリッド（ウ ィルスＲＮＡ　／アンチセンスＲＮＡ）の存在について試験すること、３Ｓ３− メチオニンの取込みを利用してウィルス蛋白質の存在について試験すること、 一標準的なトランスフェクション法を利用し標的に向けられないｐ　１７Ｗｅ　 ｏを使って全ての試験を繰り返すこと。

■）合成アンチセンスオリゴヌクレオチドの利用に対する２つの限界は、細胞中 でそれらの半減期および細胞内に取り込まれ得る分子の濃度である１合成オリゴ ヌクレオチドを使用することの利点は、それらの半減期を延長するためにそれ指 向ベクターの本方法、即ち大量のオリゴヌクレオチドを存するＥＧＦ−標的指向 ポリマーによるこれらオリゴヌクレオナ。

ドの導入は、上記の欠点を改善する。

実際的作業はここでは下記を含む： １）常法（遺伝子合成機器）によるウィルスＲＮＡと相補的なオリゴヌクレオチ ドの合成。これらのうちあるものは直接ＥＧＦに付着され、そしであるものは標 的に向けられた担体、即ち標的に向けられたポリグルタミン酸に付着される。こ の担体は血流中安定でありそして標的細胞個体内で分解可能である。

２）ポリオウィルスで感染される前または後に細胞をこれらの遊離の（または標 的に向けられた）オリゴヌクレオチドと反応させる。

３）効果は、 一トリバンプルー算定 一軟寒天感染コロニー算定 ３Ｈ−チミジンの取込み により評価される。

４）対照実験は下記を含むニ ー　３１ヌクレアーゼで細胞質抽出物を処理し、遺伝物質をスポットし、そして ３２ｐ−プローブを使ってＳｌで保護されたフラグメントを明らかにすること、 −タンパク質合成を抑制するために３２ｐ−アンチセンスオリゴヌクレオチドを 使用し、Ｓ１消化し、そしてゲルにおいて泳動すること、 ３８３−メチオニンの取込みを利用してウィルスタンパク質の存在を分析するこ と。

標的に向けられた遺伝子、標的に向けられたアンチセンスＲＮＡ発現遺伝子構成 物、標的に向けられたアンチセンスＲＮＡおよび標的に向けられたアンチセンス オリゴヌクレオチド放出系は生体内で使用され得る。これらは血流中に注入され 、特定の細胞群に向けられ、そしてそれらの細胞内に取り込まれる。

これは、前記した同文献において発表された標的に向けられた薬物放出系に関し 、それは動物において有効であることが示されている。それ故、遺伝子標的指向 の概念に加えて、ここでの主要な革新は、薬物として使用されている、標的指向 、細胞の取込みおよび放出作用（ＥＰ−Ａ−８７，２０１，４９０，７）が核酸 にまで拡張されているということである。類推によれば、この組合わせは標的薬 物と同じくらい有効であるだろうが、望ましくない副作用を制限するような優れ た追加の利点を伴う。それ故、そのような化合物は有力な抗ウィルス剤となり、 そしである態様はガン療法において広く利用されるであろう。

この態様において記載される遺伝子構成物および標的に向けられた化合物は、種 々のプロモーターおよび配列、種々の標的指向成分（他の成長因子、モノクロー ナル抗体またはそれらのＦａｂフラクション、ＬＤＬ、）ランスフェリン、ウィ ルス抗原など）並びに種々のポリマー（側鎖を持つかまたは持たないアミノ酸の ホモポリマーもしくはコポリマー、デキストランなど）を含む使用遺伝子構成物 の実用可能性を例示する。

記載された成果は、ヒトおよび動物の健康管理のための全く新しい医薬化合物の 開発の新分野を開（。加えて、同様な概念に基づいて、植物通用のための新規抗 ウィルス剤を思いつくことができる。

第９態様 本発明の第９ＢＰＪは、核酸を受容細胞へ輸送するための式（Ｉ）のベクターに おける別の指向因子としての毒性部分の利用に関する。この毒性部分は、細胞レ セプターを認識しそして毒性的に活性な第２部分Ａの貫入を正常に促進する、あ る種の毒素のＢ部分であることができる。（これはＡ部分の性り 実際、リシンおよびアブリンといったある種の毒素は２つの部分、ＡおよびＢか ら成る。Ａ部分は毒性部分であり、一方Ｂ部分は細胞を認識しそしてＡ部分の貫 入を促進する。−炭化学的に分離したＡおよびＢフラクションは全く毒性活性を 欠く。

この毒性Ａフラクションは免疫毒素を作製するのに使用さＷ、に、Ｍｉｓｋｉ＋ ａｉｎｓ　ら、（１９７９）、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃ ｏｍｍｎ、。

９Ｈ１）、　１４３−１５１を参照のこと〕。かなり広範囲に有用な毒素は、ジ フテリア毒素、コリネバクテリウム・ジフテリア菌により分泌される外毒素、そ してそれぞれトウアズキ（＾ｂｒｕｓｐｒｅ、ｃａｔｏｒｉｕｓ）およびトウゴ マ（Ｒｉｃｉｎｉｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ）の種からの植物毒素アブリンおよび リシンである。これらは全てジスルフィド結合により連結さた２本のポリペプチ ド鎖から成る０分離された鎖は実質的に細胞毒性作用を欠く、そのＢ鎖は実質的 に全ての細胞種の表面に存在する分子を認識する結合部位を含む。アブリンおよ びリシンは、ガラクトースを末端に有する糖タンパク質および糖脂質を認識し、 一方ジフチリア毒素に対するレセプターは多分１５０．ＯＯＯＭＷの糖タンパク 質である。Ｂ鎖により結合した後、その毒素はレセプター媒介性エンドサイト− シスによりその細胞の中へ取り込まれる（Ｓ、　０１ｓｎｅｎｓ　ら、（１９８ ２）　、毒性レクチンおよび関連タンパク質。毒素およびウィルスの分子作用に ついて（Ｐ、Ｃｏｈｅｎ　＆　Ｓ。

ｖａｎ　Ｈｅｙｎｉｎｇｅｎ監修）第５１−１０５頁、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｂｉ ｏｍｅｄｉｃａｌＰｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　：ｌ　＠　Ａ鎖は、エンド サイト−シスの小胞の膜を通過しそして細胞質の可溶性相に入るらしい、そこで 、Ａ鎖はタンパク質合成のための細胞の機構を触媒的に不活性化する。前のもの と同じようにこの態様において、特定の細胞性またはウィルス性ＲＮＡに相補的 な配列であるアンチセンスＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドが利用される。これ らの配列は該ＲＮＡとハイブリダイズしそして翻訳を遮断するか、またはそれら が化学的に修飾されている場合にはハイブリダイズしたＲＮＡを切断する。もし 標的に向けられた配列が酵素的活性を有するならば（例えばＲＮＡを切断するこ とができる成るＲＮＡのように）、それはハイブリダイズしたＲＮＡを特異的に 消化することもできる。実験は、アンチセンス発現プラスミド、アンチセンスＲ ＮＡまたはオリゴヌクレオチドを利用することの有効性を証明している〔例えば 、Ｊ、Ｇ、　Ｉｚａｎｔら、（１９８４）、　Ｃｅ１ｌ、　３６．１００７−１ ０１５；　Ｊ、Ｇ、Ｔｚａｎｔら、（１９８５）　。

５ｃｉｅｎｃｅ、　２２９．３４５−３５２を参照のこと〕。ウィルス感染は試 験管内では抑制されたが、オリゴヌクレオチドは細胞中に自由１″浸透するわけ ではないので、生存生体内における実験の拡張は困難である（Ｃ，Ｈ，Ａｇｒｉ ｓ　ら＋　（１９８６）、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

２５、６２６８−６２７５；　Ｒ，Ｙ、Ｌ、Ｔｏ　ら＋　（１９８６）、　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ、　６　（１２）＋ 　４７５８−４７６２；　Ｐ、Ｊ、Ｇｒｅｅｎら。

（１９８６Ｌ　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　５５．５６９−５９７； 　Ｔ、Ｊ、ＭｃＧａｒｒｙら。

この問題を解決する１つの方法は、細胞の中へ取り込まれるであろう分子にそれ らのオリゴヌクレオチドを付着せしめることである。

ここで、我々は核酸のような生産物を取り込むために毒素のＢフラクションを利 用する可能性を発見した。これらの接合体は一般に（常にではないが）、その８ 鎖が広い種類の細胞を認識するという事実のために非特異的である。しかしなが ら、アンチセンスオリゴヌクレオチドが非常に特異的であるので、それらが機能 的に活性ではないような環境においてはおそらく全く損傷作用を起こさないであ ろう。

ジスルフィド結合により普通連結されているＡおよびＢフラクションは、そのＳ −８結合を還元することにより分離され得る。生じた２つのフラクションは前記 文献により発表された方法により分離され、そしてその−５）Ｉ基は、核酸、前 に開示された細胞内ヌクレオチド担体ビヒクル、ヌクレオチド１ｊＱ（１２体等 、の縮合に役立つ。

タンパク質の−ＳＲ基をポリアミノ酸担体に結合するための１つのルートは、以 前に記載されておりそしてこの適用のために好都合である。

前と同様に、駆動因子（ＨＴ）としての毒素Ｂ部分から成るベクター、中央のリ ンカ−または担体の部分および、そこに結合される着目の核酸は、前記核酸を受 容細胞の中へ、例えば生存生体内へそして細胞膜を通過して、輸送するために使 用され得る。この輸送系は、例えばそれらの電荷、大きさまたは化学的組成のた めに細胞膜を通過して自由に（または効果的に）浸透することのできない分子に ついて特に価値がある。

例としては核酸およびヌクレオチドｉ４以体を含む。ＲＮＡに結合するアンチセ ンス核酸のような翻訳阻害因子の場合、その配列の特異性が標的指向を回避する のに十分有効であるかもしれない。

ここに記載されるＢ様は、病気の予防および療法において応用され得、そして抗 ガン性、抗ウイルス性または抗菌性の作用を有する新規薬剤を考案する基礎とな る。遺伝子発現に作用する系は、血液病適用を含む様々な種類の新規薬剤を提供 するように構成され得る。

有効な遺伝子輸送の問題は植物においても存在する。それ故、植物中に核酸を導 入するためにこの種の系を利用することは有効であるかもしれない。これは新し いアプローチであり、そして優れた品種を生むことのできるまたはさらに種内も しくは種間の生殖を可能にする種々のクラスの殺虫剤でもある。標的指向が必要 であるならば、前に記載した技術もまた可能である。

本発明の主要点の１つを構成する式■のベクターについての１つの興味深い改善 は、細胞核への該接合体（または少な（とも核酸部分）の輸送を媒介することが できるアミノ酸配列の付加である。ここでは移動シグナル（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ 　ｓｉｇｎａＬＭＳ）と称されるそのようなアミノ酸配列は、ウィルスにおいて 発見されておりそしてＣ，Ｗｙｃｈｏｗｓｋｉら、（１９８６）、　ＥＭＢＯＪ 。

５．２５６９により発表されている。−配列は（ＭＳ）配列を使った、ＳＶ４０ 　ＶＰＩのＮ端の最初の８つのアミノ酸（Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａ ｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）により表され、また、そのベクター（１）は次式： （ＭＳ−移動シグナル；ＨＴ＝指向、標的、Ｂ＝リンカ−、ＮＴ＝核酸）により 表される。

好ましくは、この配列はポリヌクレオチドの前の部位で、例えば式（ＩＩ［）の 中間橋渡し要素（Ｂ）の終端で、または式（ＩＶ）の担持要素における対応部分 において、挿入される。

そのような挿入は増強された細胞形質転換特性をベクター（１）に授ける。

下記の例は、本発明をさらに詳細に例示する。開示される操作条件はまだ最適化 されていないことに留意するべきである。さらに改良された条件が収率を増加さ せそしてより改善された結果を提供することが期待される。

生体内の遺伝子療法の実施可能性を証明するために考案された他の態様において は、ＥＧＦまたは他の腫瘍細胞特異的マーカーのような指向ベクターと連結され た細胞毒性タンパク質をコードする遺伝子（例えばリシン、ジフテリア毒素また はシュードモナス毒素の遺伝子）から成る標的複合体は、ガン性の動物に局所的 または血流においてのどちらかで注入され得る。次いで、選択されたプロモータ ーがその遺伝子を熱誘導性にするならば、その被検体を局所的に加熱することが その腫瘍の部位においてのみその毒素の発現を誘導する。それにより、健全な組 織に対する有害な作用を伴わないで腫瘍細胞は破壊される。同様に作製された、 ただし他のプロモーター、例えば化学的誘導により発現を調節するためのプロモ ーターを含んでいる、標的に向けられた複合体もまた同様に使用され得る。

例　ｌ ＤＮＡとＥＧＦとの　Ａ 前記したＢ、Ｃ，Ｆ、Ｃ）ｌｌｉらの参考文献に従って、二本鎖ＤＮＡをＥＧＦ 分子と縮合した（ＥＰ−Ａ−８６，８１０，３４７，４もまた参照のこと）。

エンドヌクレアーゼ制限酵素での消化により、５′末端のホスフェートを残して 遺伝子をプラスミドから切り取った。

消化したプラスミド０．５〜１■を次いで１％アガロースゲルにおいて泳動し、 そして着目遺伝子に相当するバンドを切り、次のようにして電気的溶出により該 ゲルから精製した：先端にシリコン処理したグラスファイバーおよび透析袋が置 かれた５ｍ７のプラスチック製ピペットの中に該ＤＮＡを含むゲルを入れる。そ のピペットをＴＡＢ緩衝液（トリス−酢酸塩０．０４Ｍ＋ＥＤＴＡ　０．００１ Ｍ）の中に浸し、そして１５０Ｖで２時間電気泳動した。次いでその電流を２分 間逆に流した；該ＤＮＡを透析袋から回収し、そしてエタノールで２回沈澱させ た。−回目は該ＤＮＡを水に溶解し、そして２回目は０．１Ｍ、ｐＨ６，０のイ ミダゾール緩衝液２０ｍに溶解した。電気的溶出は１％アガロースゲルにおいて この溶液１ｊ１！を泳動することにより調節された。

該ＤＮＡ分子における５′−ホスホルイミダゾリドの形成は、該溶液をＮ−エチ ル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル−カルポジイミド塩酸塩）　（ＥＤＣ ）　（ＦＬＵＫＡ）で飽和することにより得られた。撹拌しながら４℃で一晩そ の反応を行った。３倍容量の１００１クエン酸塩緩衝液（Ｃ，Ｂ、）ｐＨ８，５ でその溶液を緩衝化し、そしてＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ）　４〜１０　ｇおよび１２ ５１　（Ｎｅ。

Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）でラベル化されたＥＧＦの痕跡量を添加する ことにより、ＥＧＦのアミノ末端による該ＤＮＡのイミダゾリドのアミツリシス を行った。それを撹拌しながら４℃で４８時間置いてＥＧＦ−ＤＮＡ接合体を生 成させた。０．１Ｍ炭酸アンモニウム溶液、ｐＨ７，０を使って該溶液をＣ７５ ５ＥＰＨＡＤＥＸ　（カラム１００Ｘ２ＣＩＩｌ）を通して流すことにより、Ｅ ＧＦ−ＤＮＡ複合体から遊離ＥＧＦを分離した。放射能の第一ピークは放射能ラ ベル化ＥＧＦ−ＤＮＡ接合体とみなされた。該当するフラクションを集め、アリ コートに公開しそして凍結乾燥した。該ＤＮＡ４度（２６０ｎｏ＋での吸光度） およびＥＧＦ分子の数（該ＤＮＡに結合した放射能の量）から計算すると、該Ｄ 　Ｎ　Ａの８５％までがＥＧＦ分子を結合していた。

咳ＥＧＦ−ＤＮＡ接合体は、用いるために増殖培地中で再水和させるまでプラス チック製容器中に凍結乾燥して４℃で保存し日　ペルオキシダーゼ仇　た８　上 のレセプー１声の　に　づく−スト　二の゛ Ａ−４３１扁平上皮ガンおよびＷ−１３８正常線維芽細胞のヒト細胞系における 間接免疫ペルオキシダーゼ染色を３５ｍ１のＰ−”Ｃプレート中のトリプシン処 理された細胞について行った。その表面をリン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）　ｐＨ７ ，２で前処理し、次いで過剰のものを除去し、そしてＰＢＳで洗った細胞（１０ ’個／ウェル５０　ｍ／ＰＢＳ中）を該プレートに入れそして２００Ｏｒｐｍで ５分間遠心分離した。５０ｔｄ／ウエルの冷ＰＢＳ中の０．５％グルタルアルデ ヒドをそのプレートに添加し、そして室温で１５分間インキュベートした。ＰＢ Ｓでの２回の洗浄の後、該ウェルを０．１χＢＳＡｔｇ液中の１００ｍ＋Ｍグリ シンで満たし、そして過剰のグルタルアルデヒドを阻害するために、室温で３０ 分間放置した。２回のＰＢＳ洗浄の後、エタノール−酢酸９９：１の氷冷混合物 を使って４℃で３０分間該細胞を最初に変性させることにより、間接免疫ペルオ キシダーゼ染色を行った。

この時間の間に３Ｊ１１の抗体を１ｍｆＰＢＳ＋１％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）中 に希釈した。該ウェルをＰＢＳで２回洗い、そしてＰＢＳ中の２０χＦ　ＣＳ　 ？ｇ液と共に５分間インキュベートした。次いでこれを２００ｄ／ウエルの該抗 体溶液により置換し、そして室温で３０分間インキュベートした。該ウェルをＰ ＢＳで２回、ＰＢＳ　＋　Ｔｗｅｅｎ　（０，１％）で１回、そして再びＰＢＳ で１回洗った。

ＰＢＳ−１ｘＰｖＳ中の抗−マウスペルオキシダーゼ接合抗体（ＤＡＫＯ）の１ 　／４００希釈液２００　！ｌｌ／ウェルを次いで加え、そして室温で３０分間 インキュベートした。その接合体をＰＢＳで２回、ＰＢＳ＋０．１χＴｗｅｅｎ で１回、そして蒸留水で２回洗った。該細胞を１０−の０．０１Ｍリン酸塩緩衝 液ｐＨ６，０，５ｍの３５％酸素添加水および１００Ｉのメタノール中１％オル トジアニシジン（Ｍｅｒｃｋ）の溶液と共に室温でインキュベートすることによ り、その場で発色を行った。

第６ａ図はＡ−４３１腫瘍細胞を表す。その中の大量のＥＧＦレセプターの存在 は、暗く染まっていることにより指摘される。

第６ｂ図は、わずかに染色されたごく少量のＥＧＦレセプターを含むト１３８細 胞を示し、これは対照として用いられた。

例３ ＥＧＦ−ＤＮＡの　入み　７ 例１に記載したようにしてＥＧＦをＤＮＡフラグメントに付着せしめた。この実 験において使用する該フラグメントは、ＮｅｗＩｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ 　Ｓｙｓｔｅｍを使った一’−７クトランスレーシヨンによりαＰ”ＡＴＰでラ ベル化された７００塩基対プローブである。

ここで使用する取込み研究のプロトコールは、Ｈｉｌｌ＋ｎａｎ、　Ｇ、Ｍ。

およびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ＋　Ｊ、（Ａｍｅｒ、Ｃｈｅ＋ｍ、　Ｓｏｃ、 ＋　１９８２＋　２１＋　１６６７−１６７２）により使用された方法から通用 する。要約すれば、細胞の単層をＥＧＦ−ＤＮＡ混合物と共にインキュベートし 、その後取り込まれたＤＮＡを計測するために溶解した細胞およびその膜からレ セプターを抽出する。

直径３ａｎのペトリ皿中の単層細胞培養物をｐ３Ｚでラベル化されたＥＧＦ−Ｄ ＮＡ複合体とともに溶液Ａ　（ＤＭＥＭ：４．５０ｍＭ　トリス、１００＋ｏＭ 　ＮａＣ１および０．１χＢＳＡ：１の割合、ｐ）１７．４に調整）中３７℃で ３．５時間インキュベートした。ついで氷冷したＰＢＳ　十（１ｍＭ　ＣａＣ］ ｚおよび１ｍＭ　ＭｇＣｈ）で該細胞を４回洗浄した。５０％トリクロロ酢酸溶 液を、集めた溶液ＡおよびＰＢＳ＋に対し１１５の割合で加え、そしてシンチレ ーションカウンターで計測した。該細胞膜を２００ｍＭ酢酸および１５０ｍＭ　 ＮａＣ１（ｉ液Ｂ）で６分間氷上で処理することにより不安定にさせた。次いで 溶液Ｂを除去し、そして該細胞を溶液Ｂで２回洗った。それらの集めた溶液をｐ ３２カウントした。この処理は細胞表面に結合したＥＧＦレセプターを遊離させ る。次いで該細胞を０．２ＮＮａｌ中に完全に溶解した。認められた放射能は、 取り込まれたＥＧＦ−ＤＮＡ複合体を意味した。

取込みＥＧＦレセプター系を利用して放射能ラベル化ＤＮＡが細胞に入るかどう かを照査するために、比較実験を設定した。

培地をＥＧＦ分子で飽和し、そうして大部分のＥＧＦ−ＤＮＡ複合体とＥＧＦレ セプターとの相互作用が完全に起こらないようにした。放射能ラベル化ＥＧＦ− ＤＮＡ複合体を含む培地に０．２　ｔｒｇの遊離のＥＧＦを添加し、そして３７ ℃のインキュベーションの３．５時間後、取り込まれた放射能をカウントした。

これらの実験において、培地に添加された放射能ラベル化ＥＧＦ−ＤＮＡ複合体 の４５％程度が、インキュベーション３．５時間後の細胞内区画に認められた。

同条件下、培地を遊離の非ラベル化ＥＧＦで飽和した時、取り込まれたＥＧＦ− ＤＮＡ複合体は１／３に減少し、これは取り込まれた生成物のわずか１６％内に 運ばれ得るという証拠を提供する。

例４ ＥＧＦと　ムした′−（に　そして−　・に四」Δにも ニワトリのリゾチーム遺伝子と融合されたヒトのヒートショック誘導プロモータ ーは、一時的発現系におけるモデルとして利用されている。ｐ１７１ｙｓと命名 されたそのような構成物は、サルのＣＯ８細胞及びアフリカッメガエルの卵母細 胞における機能について立証されている（Ｄｒｅａｎｏ　Ｌら、１９８６．　Ｇ ｅｎｅ印刷中）。ｐ１７］ｙｓをＥＧＦと縮合せしめ（例１に記載したようにし て）、そしてＥＧＦ−ｐ１７］ｙｓ複合体を完全増殖培地中で混合し、次のよう にしてＡ−４３１単層細胞培養物に加えた。

該細胞を最初無血清のＤ？ＩＥＭで２回洗って無血清の培地中で４時間インキュ ベートした。次いでＥＧＦ−ｐ１７］、ｙｓ複合体を１−の無血清培地に添加し た。３７℃での３時間のインキュベーションの後、９ｍＺのＤＭＥ？！　、　１ ０χＦＣＳを添加した。−晩のインキュベーションの後、該細胞を４２℃で４時 間ヒートショックせしめ、そして１ＲＮＡの抽出のために溶解せしめた。

ＰＢＳで洗浄した細胞を１０ｍ？！）リスｐ）１７．５．１ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、 １０ｍＭ　ＮａＣ１，１χＳＤＳおよび１■／ｒｎｌの新鮮なプロテイナーゼＫ を含む溶液で処理することにより、ＲＮＡ抽出を行った。該細胞をこの溶液中氷 上で１時間放置し、その後ＮａＣ１を０．３Ｍになるように加えた。細胞破片を 掻きとり、４℃の空気流（ａｉｒｆｕｇｅ）中１１００Ｏｒ、ｐ、ａ＋、で１０ 分間遠心した。その上清を取り出し、そしてドライアイス−エタノール浴中５分 間エタノール沈澱させた。１５分間の遠心の後、上清を捨て、ペレットを１０ｍ Ｍ　ＰＩＰＥＳ、　ｐＨ６，９，０，４Ｍ　ＮａＣ１，１ｍ１Ｉ　ＥＤＴＡ、　 ５０χホルムアミド２０ｊｔ１中に再び溶かした。４００ｂｐ、フラグメントの リゾチーム遺伝子構成物とのハイブリダイゼーションは、Ｒ，Ｇ。

ＳｔｕｍｍｅｎｂｅｒｇおよびＭ、Ｌ、Ｂｒ１ｎｓｔｉｅｌ（Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、 、　ＵＳＡ、　１９８２＋７９巻、第６２０１−６２０４頁）に従って行った。

全ＲＮＡの約３０Ｒアリコートを各分析に使用した。Ｓｌｌプロテクションアッ セイ、’ｄｅａｖｅｒ、　Ｒ，ＦおよびＷｅｉｓｓｍａｎｎ＋　Ｃ，（１９７９ ＋　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　、６　、１１７５−１１９３）に従って行 ったが、但しＤＮＡフラグ・メントを精製ホルムアミド中で加熱するのではなく 、ハイブリダイゼーション緩衝液中に直接懸濁しそして変性させた（Ｄｉｅｒｋ ｓら、１９８１．　Ｃｅ１１．３２．６９５−７０６）、ヌクレアーゼＳ１はＰ Ｌ／Ｐｈａｒｍａｃｉａから得た。消化の後、過剰のＲＮＡを０．ｌＮＮａＯＨ 中１００℃で３分間除去した。保護されたフラグメントを７Ｍ尿素、８％アクリ ルアミドゲル（０，４ｍｍ）において分析した。ｐＢＲ３２２の末端ラベル化１ ａｅ　ｍフラグメントを分子量マーカーとして使った。

第３図において理解され得るように、リゾチーム遺伝子は取り込まれており、Ｒ ＮＡを発現している。それ故、取り込まれた遺伝子は機能的な状態であることが ここでわかる。もちろん、該遺伝子を逆の配向においてクローン化するならば、 転写されるＲＮＡはアンチセンスＲＮＡであろうし、“センス２遺伝子によりコ ードされる“センス”ＲＮＡの翻訳を抑制することができるだろう。もちろん、 この例においては、ＨＴおよび核酸は他のものであってもよい。アンチセンス遺 伝子を使った遺伝子発現を抑制することの可能性の例示として、我々は別の系列 の実験において、ヒートショックプロモーターの支配下の“センス″および“ア ンチセンス″（Ｓａｉｌサイトにおいて逆転された遺伝子）のＣＡＴ遺伝子をア フリカッメガエルの卵母細胞中に同時注入した（第４６頁の例７における図面を 参照のこと）。後者は効果的にＣＡＴ合成を抑制したので、我々は“アンチセン ス”構成物を標的に向けることが“センス”遺伝子標的化の明白な応用であると 結論を、下した。

例　５ ＥＧＦに゛車′　れた゛（云　が　７の　に”　そして６した）　−　こ よく引用される系は、塩化カルシウムトランスフェクション技術を使ったユ且腫 瘍遺伝子によるＮＩＢ／３Ｔ３マウス線維芽細胞の形質転換である（Ｇｒａｈａ ｍ、　Ｆ、Ｌ、およびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　Ａ、Ｊ、＋１９７３＋　Ｖｉｒ ｏｌｏｇｙ＋　５２＋　４５６−４６７；　Ｗｉｇｌｅｒ、　Ｍ、ら、１９７９ ．　ＰＮＡＳ。

７６、１３７３−１３７６）。形質転換された細胞は、接触抑制を失っている屈 折細胞の細胞増殖巣を形成し、そして無胸腺マウスにおいて増殖し得る。

我々は例１に記載したようにしてヒト」且腫瘍遺伝子をＥＧＦ分子と融合し、そ してこの複合体をＮＩＨ／３Ｔ３細胞に対して試験した。コンフルエンスな単層 のＮＩ）Ｉ／３Ｔ３細胞を無血清のＤＭＥＭで２回洗い、そしてこの培地中で４ 時間インキュベートした。

この後、ＥＧＦ−ｒａｓ複合体をその培地に加え、そして３７℃で３時間インキ ュベートした。次いでｌ０ＸＦＣ３を有するＤＭＥＭ完全培地を１０／１　（Ｖ ／Ｖ）の割合でベトリ皿に入れ、そして３７℃で一晩放置した。翌日核細胞を１ 　／２０　、１　／４０および１／８０の希釈において分割し、そして１７日間 増殖させ、その後細胞増殖巣を記録した。

この実験操作は、ＥＧＦを使って」旦腫瘍遺伝子を細胞の中に取り込むことがで き、核へ運び、発現しそして機能タンパク質をコードすることができ、それによ って安定な状態でＮＩＢ／３Ｔ３細胞を形質転換させるということを示す、得ら れた結果は、ＥＧＦ−ｒａｓ複合体がリン酸カルシウム技術を使ったトランスフ ェクションよりもより高い効率で形質転換を行うということを示す。ＥＧＦ−ｒ ａｓ複合体を使って、１／４０の細胞希釈液において約５倍多くの細胞増殖巣が 得られた。（第４図）。

ＥＧＦ−ｒａｓ　４３Ｂ巣 ＣａＣ１ｚ＋　ｒａｓ　８２巣 対照　８巣 細胞増殖巣を採集し、５−１０’個の細胞培養物まで増殖し、そして無胸腺マウ スに注入した。ＥＧＦ−ｒａｓコロニーは、ＣａＣ１，でトランスフェクトされ た」且遺伝子と同様に３週間以内に腫瘍を形成したが、一方未処理のまたは過剰 のＥＧＦで２４時間処理したばかりのＮＩ）！／３Ｔ３細胞は、ヌードマウスに おいて全く腫瘍を形成しなかった。

明らかに、本発明は上記の態様に限定されるものではな（、生体外および生体内 におけるＤＮＡの取込みを含む他の多くの適用において利用され得る。

そのような適用の中に、下記のものが引用されてもよい。

１、本発明に係る細胞特異的遺伝子ベクターにより能率的に取り込まれた遺伝子 の誘導的および連続的発現による着目タンパク質の工業生産。それ故、大量の着 目タンパク質が、発酵槽において増殖された細胞によりまたは実験動物が有する 腫瘍細胞により、生産され得る。この発明は、選択されたタンパク質を生産する 細胞系を確立するための長（そして面倒な段階を回避することを可能にする。ク ンバク質に直接転写され得るＲ　Ｎ　Ａ複合体を取り込むこともまた可能である 。

２、様々な種類の活性、例えは療法性、予防性、抗ウイルス性、細胞毒性などを 有するクンバク質を発現する核酸に連結された取込み可能の分子から成る細胞特 異性薬剤は、細胞の制御機構に対して作用するかもしれない。該遺伝子はまた、 遺伝子欠損を補完するかまたはマーカーとして役立つことができる。そのような 薬剤は、ヒトまたは動物の治療のために生体内でまたは生体外で使用され得る。

３、細胞中にＤＮＡおよびＲＮＡを導入する本方法は、遺伝子療法に全く新しい 広がりを与える。なぜなら、毒性物質を全く使用することなく作業できる可能性 があり、そして特定の細胞集団に対する核酸の有効な標的指向を可能にするから である。この取込み技術を使ったアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡを利用する遺 伝子の発現の調節（例えば抑制）は、非常に有力なそして多角的な方法である。

例６ アンチセンスオリゴヌクレオチドに′士した　はそのレセブ　−ム　する これは、上皮成長因子（ＥＧＦ）レセプターＲＮＡに相補的な配列を有する合成 オリゴヌクレオチドをＥＧＦに付着せしめそして、レセプター陽性のＡ４３１細 胞と共にインキュベートした後にＥＧＦレセプター合成を減少させることができ た、という例である。この直接的な効果は、少量のレセプターのために新しいＥ ＧＦの付着が抑制されるということである。この新規な化合物は、細胞とりガン トとの結合が阻害されるのでレセプターのアンタゴニストと同様な最終的効果を 有する。

我々は、この例において合成オリゴヌクレオチドをＥＧＦタンパク質に付着する ために別の化学的縮合プロトコールを利用した。オリゴヌクレオチド合成の後、 サイクリックホスフィンアミダイト　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、 　Ｕｓｅｒ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、第３８巻、１９８６）を本明細書の第１１頁に 記載したようにして付加した。次いで、そのオリゴヌクレオチドをＥＧＦのアミ ノ基に連合底オリゴヌクレオチドは、２１ヌクレオチドの配列であり、ＡＵＧコ ドンをカバーしているＥＧＦレセプターＲＮＡの５′配列に相補的であり、下記 の配列を有する。

５　’　ＧＴ　ＣＧＣＴＡＣＧＣＴ　ＧＧＧ　ＡＧＧ　ＣＣＣＴ　３　’この配 列は、細胞に一度取り込まれると、このＲＮＡに特異的に“はり付き”、リポソ ームを遮断し、そしてＲＮＡ転写を停止させてＥＧＦレセプター合成を抑制する ため選択されている。

ＰＡＧＥで精製した接合体をトリプシン処理したＡ４３１細胞に添加した。種々 のインキュベーション時間の後に、ペレットを２回洗浄しそしてレセプター結合 性ＥＧＦを除去するために放置しておいた。追加の洗浄の後、６・１０’ｃｐ＋ ｎ　”Ｊ−ＥＧＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加し、そして該細胞と共にインキュ ベーションした。２回のＰＢＳ洗浄の後、細胞に結合した放射能をγカウンター で測定した。

大量のレセプターを有する細胞は大量の”Ｊ−ＥＧＦを結合するが、一方それに 対して、少量のレセプターを有する細胞は少量の”５Ｉ−ＥＧＦを結合する。こ の実験の結果は、該細胞が該接合体にさらされると、接合体を加えない対照細胞 に比較して６．６分の１までＥＧＦの結合が減少した、ということを示す。

細胞がＥＧＦ接合体と接触した後でレセプターの濃度が減少した。それ故、この 例において非常に驚くべきことに、細胞の取込みの後に該オリゴヌクレオチドが リソソームの包含から免れることができ、そして細胞質のまたは核のＲＮＡとハ イブリダイズしてレセプター合成を封鎖することができた。

これは、標的に向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドが特定タンパク質の 合成を抑制することができるという例である。それはまた、ＨＴ　（指向／標的 ）因子とそれらの生物学的機能を退化させない核酸との化学的結合の他の例でも ある。

もちろん、ＥＧＦは他のＨＴ因子であってもよいし、そしてオリゴヌクレオチド は別の大きさまたは組成を有してもよい。

もちろん、１つのＨＴ因子について数個のオリゴヌクレオチドを有するリンカ− を使ってこの例を反復すると、その接合体の効率を改善する。

例７ 人　（ＨＩ）−Ｂ−（ＮＴの　におしる　・、　入　おド主里 プラスミドを下記の線状構造で設計しそして合成した。

ＥｃｏＲＩ　Ｂｇｌｌ　ＢｇｌＩ　ＨＩ　Ｐｖｕｌｌ　ＥｃｏＲＩ本明細書の第 ９およびｓ１頁に記載したイミダゾール活性化プロトコールを使ってＨＳｐ７０ ｐ−ＣＡＴ−ＳＶ４０ｔを含む線状プラスミドフラクションを化学的にＥＧＦに 付着せしめた。次いでこの接合体をヌードマウス中で増殖しているＡ４３１腫瘍 性異種移植片の付近に直接注射した。２４時間後、該遺伝子の発現を正確に試験 するために、該動物から腫瘍を取り出しそしてヒートショック（４３℃、３時間 ）にさらした。翌日、定法（Ｇｏｒｍａｎら）に従ってアセチル化クロラムフェ ニコールを測定した。アセチル化クロラムフェニコールの弱いシグナルが観察で きた。アセチル化クロラムフェニコールの量は低いけれども、幾つかの遺伝子が Ａ４３１細胞中に入り込みそして機能タンパク質をコードできるということが示 される。

そして我々の技術を使って（）ＩＴ）　−Ｂ　−（ＮＴ）接合体を生体内に注入 することが新しい療法薬および治療薬のための優れたアプローチであることを示 す。

ＦＩＧ、　／ ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、　５ａ　ＦＩＧ、　５ｂ ＦＩＧ、　６ａ　ＦＩＧ、　６ｂ 国際調査報告 ｍ−一−Ｉ　ＡｅＮｔｅｌＭ　Ｎ＠、　ＰＣτ／ＥＰ　８７１００Ｂ２７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．宿主細胞において生化学的機能を果たすことのできるオリゴーもしくはポリ ーヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡといった、１片または複数片の選択された 外来核酸を該宿主細胞中に導入することにより、そして／または前記細胞の機構 部分の作用を変えることにより、前記受容宿主細胞の代謝を変化させる方法であ って、 （１）前記細胞における取込みを促進または許容するリガンドに前記核酸を化学 的に連結せしめることにより接合付加物を作製し、前記連結は、取り込まれる核 酸の生物機能を妨害または抑制しないようなリンカーまたは結合を介して行われ る段階； （２）前記細胞内への連結された前記核酸の効果的な浸透および取込みを達成す るのに十分な時間の間、前記宿主細胞を段階（１）から生じた前記付加物と一緒 にする段階；（３）前記外来核酸が前記宿主細胞において前記生物機能を果たす のを許容または誘導し、それにより前記変化が起こる段階； を含んで成る方法。 ２．前記オリゴーまたはポリーヌクレオチドが、ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、 一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、およびそれらの誘導体から成る群から選択され、 これらポリヌクレオチドの機能は細胞の働きまたは成長を抑制または変化させる ことである、請求項１に記載の方法。 ３．前記ポリヌクレオチドが、段階（３）において前記宿主細胞中で発現される 少なくとも１つの着目機能遺伝子を含んでいる配列である、請求項１または２に 記載の方法。 ４．前記遺伝子が同定可能な生産物をコードしそして前記ポリヌクレオチドの非 翻訳配列の調節下で発現される、請求項３に記載の方法。 ５．前記遺伝子が、ウイルス性ＲＮＡまたは細胞性ＲＮＡに対してアンチセンス でありそして前記細胞において対応するウイルスまたは細胞の機能を封鎖するこ とを成し遂げるＲＮＡをコードする遺伝子である、請求項３に記載の方法。 ６．前記遺伝子が、誘起性または非誘起性構成的プロモーターの作動下に、細胞 毒素、ホルモン、酵素、抗腫瘍遺伝子、抗有糸***薬、レクチン、抗体、商品価 値のあるタンパク質などから選択される生物的に活性な生産物をコードする、請 求項３に記載の方法。 ７．前記プロモーターが真核生物由来のヒートショック支配配列である、請求項 ６に記載の方法。 ８．前記核酸の取込みが前記宿主細胞のトランスフェクションまたは形質転換を 生む、請求項１に記載の方法。 ９．前記リガンドが、前記宿主細胞のあるレセプターに高親和性を有しそして前 記細胞への標的ベクターとして働く、請求項１に記載の方法。 １０．前記細胞レセプターが細胞成長因子（例えばＥＧＦ）、その合成または天 然誘導体、抗体および細胞種マーカーの中から選ばれる、請求項９に記載の方法 。 １１．前記リガンドが、ＥＧＦ、血小板由来の成長因子、α−２−マクログロブ リン、トロンビン、ウイルス抗原、インターロイキン、線維芽細胞成長因子、神 経発育因子などから選択される、請求項１に記載の方法。 １２．前記リンカーがオリゴペプチドまたはポリペプチドである、請求項１に記 載の方法。 １３．前記ポリペプチドがポリアミノ酸であり、これはそこに共有結合的にまた は錯体により結合した多数の配列の外来核酸を含み、この数は１０を超えている 、請求項１２に記載の方法。 １４．前記ポリペプチドがポリグルタミン酸またはポリアスパラギン酸であり、 そしてそこに幾つかの前記外来ポリヌクレオチド配列がそのカルボキシレート官 能基により結合している、請求項１に記載の方法。 １５．前記リンカーがリン酸ジエステル結合である、請求項１に記載の方法。 １６．前記リンカーが細胞内酵素により開裂可能なＰ−Ｎ，Ｎ−Ｃ，Ｓ−Ｓまた はＯ−Ｃ結合を含み、それの開裂が結合され取り込まれたポリヌクレオチドを遊 離させるであろう、請求項１に記載の方法。 １７．付加的段階： （４）前記着目遺伝子の発現生産物を単離する段階、をさらに含んで成る、請求 項３に記載の方法。 １８．前記ポリヌクレオチドが着目遺伝子生産物をコードする誘起性遺伝子を含 み、そして前記宿主細胞が無制限の増殖を有する真核細胞であり、下記の付加的 段階：（４）接種に応じて腫瘍を発達させる免疫不全の温血動物に前記形質転換 された細胞系を接種し、そして前記腫瘍を１０６−１０１０の細胞数まで成長さ せる段階；（５）前記腫瘍を個々の細胞に分割し、前記分割された細胞を培地中 で培養する段階； （６）前記培養物をストレスにさらし、それにより前記遺伝子を発現させる段階 ；そして （７）前記着目生産物を収集および精製する段階、をさらに含んで成る、請求項 ２に記載の方法。 １９．前記遺伝子が細胞毒素をコードし、前記付加物を血流中または、前記レセ プター部位を有する腫瘍細胞および正常細胞を含む生存組織中に注入することに より段階（２）を実施し、それにより前記付加物が選択的に前記腫瘍細胞に取り 込まれ、次いで （３）細胞毒素または抗腫瘍作用を有するタンパク質の生産を誘導するために前 記組織に局所的にストレスを加え、それにより前記正常細胞を損なわないままで 前記腫瘍細胞を抑制または破壊すること、 を含んで成る、請求項６および９に記載の方法。 ２０．少なくとも２つの独立した同一のまたは異なるポリヌクレオチドを使った 操作を含み、前記ポリヌクレオチドは１つまたは異なる２つのリガンドに縮合さ れている、請求項２に記載の方法。 ２１．細胞をトランスフェクトおよび／または形質転換する新しい組成物として のベクターであって、１つまたは複数の核酸配列から成り、この配列は該配列を 宿主細胞中に取り込むことのできるリガンドに化学的に連結されており、そして 取込みの後に該細胞における本質的な生化学機能を抑制しないように該細胞中で 十分に不安定な方法において該リガンド上に結合しているベクター。 ２２．患者の身体の特定部位において細胞が誤って機能している状態（ｍｉｓ− ｆｕｎｃｔｉｏｎｇ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を治療する方法であって、 （ａ）核酸−タンパク質接合体を前記部位の中に導入し、前記核酸はストレス誘 起性プロモーターおよび前記プロモーターに操作可能に連結した抗腫瘍薬または 細胞毒物質をコードする遺伝子を含み、前記タンパク質は病的細胞のレセプター に特異的な親和性を有し、このことにより前記接合体はそのような細胞を優先的 に標的しそしてそのような細胞に優先的に取り込まれ；そして （ｂ）前記細胞毒性物質の発現を誘導するのに十分な方法において身体の前記部 位に局所的にストレスを加える、ことを含んで成る方法。 ２３．前記ストレスが加熱でありそして前記プロモーターがヒートショックプロ モーターである、請求項２２に記載の方法。 ２４．前記病的細胞がガン性でありそしてＥＧＦに対するレセプターを有し、且 つ前記タンパク質がそれらレセプターに結合する、請求項２２に記載の方法。 ２５．前記遺伝子がメッセンジャ−ＲＮＡ中に転写され、前記ＲＮＡは前記病的 細胞にとって生来のメッセンジャ−ＲＮＡに関して“アンチセンス”であり、そ れにより前記アンチセンスＲＮＡが細胞機構を抑制しそしてそれ故に細胞毒性物 質として働く、請求項２２に記載の方法。 ２６．前記細胞毒性物質が細胞毒性のタンパク質または核酸である、請求項２２ に記載の方法。 ２７．前記細胞毒性タンパク質がリシン、アブリン、ジフテリア毒素、およびシ ュードモナス毒素から成る群から選択される、請求項２６に記載の方法。 ２８．前記リガンドが前記細胞のレセプター、マーカーまたは抗原部位に対し特 異的な親和性を有し、このレセプターは高収率における前記核酸の取込みを促進 する、請求項２１に記載のベクター。 ２９．前記取込みをするリガンドが、下記の化合物：ウイルス抗原；上皮細胞成 長因子、神経細胞成長因子、血小板由来の成長因子、線維芽細胞成長因子のよう な成長ホルモン因子、α−およびβ−形質転換因子、ワクシニア配列、ウロガス トロン、インターロイキン、メラニン細胞刺激ホルモンおよび甲状腺刺激ホルモ ン放出ホルモン、トランスフェリン、低密度リボタンパク質、免疫グロブリン、 リシン、アブリンおよびジフテリア毒素のような毒素のＢ部分、から成る群から 選択される、請求項２１に記載のベクター。 ３０．前記核酸配列が、遺伝子を生産するホルモンおよび酵素から選択され、そ の遺伝子はＥＧＦＲ、並びにｒａｓ，ｍｙｃ，ｓｒｃ，ｃ−ｅｒｂ−ｂ２および ｎｅｕ遺伝子のような腫瘍遺伝子の過剰発現、またはＨＩＶ、ポリオウイルス、 アルボウイルス、ロードウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、ヘルペス 、インフルエンザ、乳頭腫ウイルスのようなウイルスの遺伝子の過剰発現を封鎖 することのできる短鎖のアンチセンスＲＮＡから選択される、請求項２１に記載 のベクター。 ３１．前記核酸が、ＥＧＦＲ、腫瘍遺伝子およびウイルス遺伝子の発現を転写お よび／または翻訳のレベルで封鎖することのできる短鎖のアンチセンスＲＮＡか ら選択される、請求項２１に記載のベクター。 ３２．前記核酸および前記リガンドが、血しょう中では安定であるが細胞内酵素 により開裂される結合またはリガンドにより連結されている、請求項３１に記載 のベクター。 ３３．前記リンカーが、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、メチオニンお よび関連アミノ酸から成る群から選択されたアミノ酸である、請求項３２に記載 のベクター。 ３４．前記リンカーがポリグルタミン酸またはポリアスパラギン酸であり、その γ−側鎖に核酸配列を担持する、請求項３２に記載のベクター。 ３５．前記ポリペプチドが、ヌクレオチドまたはＡＺＴのような修飾ヌクレオチ ドを含む５００個までのまたはそれより多くの同一のもしくは異なる核酸を有す る、請求項３４に記載のベクター。 ３６．前記核酸配列と前記リンカーとの連結が、５′位において前記配列に付着 されたアミノ結合を通して行われる、請求項３４に記載のベクター。 ３７．前記リンカーが、レセプター細胞の細胞質から核への前記核酸配列の輸送 を媒介することのできるオリゴペプチドを含んで成る、請求項３２に記載のベク ター。 ３８．請求項１および２に記載された結合体の生体内における適用により、選択 された細胞の誤った機能を治療または予防する方法。