JPH01501228A - High concentration liposome treatment method - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 高濃度リボソーム処理方法 １．発明の分野 本発明は．高カプセル化効率および高脂質濃度により特徴づけられるリポソーム 懸濁液を調製するための方法に関する。[Detailed description of the invention] High concentration ribosome processing method 1. field of invention The present invention is. Liposomes characterized by high encapsulation efficiency and high lipid concentration A method for preparing suspensions.

２．参考文献 Ｃａｆｉｓｏ＋　Ｄ．Ｓ．，　Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ　６ ４９：１２９（１９８１）．Ｄｅａｍｅｒ，　Ｄ．＋　ら，　Ｂｉｏｃｈｉｍ　 Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ　４４３：６２９（１９７６）．Ｇａｂｉｚｏｎ．　 Ａ．＋ら，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　４２：４７３４（１９Ｂ２）． Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ，　Ｍ．Ｌ．ｔら，　Ｐｈａｒｍ　Ｒｅｖｓ　３６（４）： ２７７（１９８４）．Ｓｃｈｉｅｒｅｎ＋　Ｈ．＋　ら，　Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂ ｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ　５４２：１３７（１９７８）．Ｓｚｏｋａ，　Ｆ．　 Ｊｒ．＋　ら，　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）　７５：４ １９４（１９７８）．Ｓｚｏｋａ，　Ｆ．　Ｊｒ．，　ら，　八ｎｎ　Ｒｅｖ　 Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｂｉｏｅｎｇ　９：４６７（１９８０）．３．発明の背景 リポソームは薬物供給においていくつかの利点を提供する。2. References Cafiso+D. S. , Biochim Biophys Acta 6 49:129 (1981). Deamer, D. + et al., Biochim Biophys Acta 443:629 (1976). Gabizon.　 A. + et al., Cancer Research 42:4734 (19B2). Poznansky, M. L. et al., Pharm Revs 36(4): 277 (1984). Schieren+H. + et al., Biochim B iophys Acta 542:137 (1978). Szoka, F.　 Jr. + et al. Proc Nat Acad Sci (USA) 75:4 194 (1978). Szoka, F. Jr. , et al, 8nn Rev Biophys Bioeng 9:467 (1980). 3. Background of the invention Liposomes offer several advantages in drug delivery.

非経口的投与されたときに，静脈内もしくは筋肉内の経路のいずれであっても． 血流中における遊離の薬物の濃度を制限することにより．リポソームは．長時間 にわたりカプセル化された薬物の制御された“貯蔵的な”放出を提供し．該薬物 の副作用を減じることができる。リポソームは治療学的に好適な方法において． 薬物の組織分布ならびに取り込みを変化させることができ、そして、薬物投与の 頻度を低くすることにより、治療を便利にすることができる。リポソーム薬物供 給システムはＰｏｚｎａｎｓｋｙにより総論が出されている。When administered parenterally, whether by the intravenous or intramuscular route. By limiting the concentration of free drug in the bloodstream. Liposomes are. long time Provides controlled "depot" release of encapsulated drug over a period of time. the drug side effects can be reduced. Liposomes are used in a therapeutically suitable manner. Tissue distribution and uptake of drugs can be altered and drug administration Less frequent treatment can make treatment more convenient. liposome drug delivery A general discussion of the supply system has been given by Poznansky.

吸入法による薬物供給のためのリポソームの使用もまた研究されてきている。そ してそれは同出願人による米国特許出願、「リポソーム吸入およびその方法、出 願番号第７３７．２２１号（１９８５年５月２２日出願）に報告されている。吸 入リポソームは、脂質組成により、捕捉された薬物が選択された放出速度で放出 するように、調製され得る。その放出速度は、半減期が数時間から数日の間で変 化しうる。さらに、薬物がリポソーム内に隔翻されている限り、呼吸管および血 流中に象、速に取り込まれることによる副作用が減じられる。The use of liposomes for drug delivery by inhalation has also been investigated. So It is based on the same applicant's U.S. patent application, ``Liposomal Inhalation and Methods Thereof.'' It is reported in Application No. 737.221 (filed May 22, 1985). Sucking The lipid composition of the liposomes allows the entrapped drug to be released at a selected release rate. It can be prepared as follows. Its release rate varies with a half-life ranging from hours to days. can be transformed into Furthermore, as long as the drug is sequestered within liposomes, it can be used in the respiratory tract and bloodstream. Side effects due to rapid uptake into fluids are reduced.

リポソームと、親油性および親水性の薬物の両者との適合性、および選択された 薬物の放出速度を達成するための脂質組成を変化させる能力はまた。薬物を局所 的に投与することもしくは粘膜組織へ投与することに対してもまた有利である。The compatibility of liposomes with both lipophilic and hydrophilic drugs, and the There is also the ability to alter lipid composition to achieve drug release rates. drug locally It is also advantageous for administration locally or to mucosal tissues.

粘膜組織へ薬物供給するためのリポソームの付加的な利点は。An additional advantage of liposomes for drug delivery to mucosal tissues is.

標的組織部位でのリポソームの存在時間を長くするために。To increase the residence time of liposomes at the target tissue site.

該リポソーム表面が組織への粘着性を向上させるために改変され得ることである 。この現象は同出願人による特許出願である「粘膜組織でのリポソームの保持の 増強」出願番号８９０，８１５号（１９８６年７月２８日出願）に記載されてい る。The liposome surface can be modified to improve adhesion to tissues. . This phenomenon is explained in a patent application filed by the same applicant entitled ``Retention of Liposomes in Mucosal Tissues''. Enhancement” Application No. 890,815 (filed on July 28, 1986) Ru.

薬物を捕捉したリポソームを調製するためのいくつかの方法が知られている。あ る方法においては、小胞形成性脂質を。Several methods are known for preparing drug-entrapped liposomes. a In this method, vesicle-forming lipids are used.

フラスコの側面に薄いフィルムとして沈殿させ、そして、水性緩衝液を加えるこ とによりゆっくりと再水和させる。捕捉されるべき薬物は脂質層（親油性薬物の 場合）に、もしくは水性水和媒体（親水性薬物の場合）のいずれかに包含され得 る。生成するリポソームは、約０．５から１０ミクロンの間の不均一なサイズの 多重ラメラ小胞（？１ＬＶ）である。Let it settle as a thin film on the side of the flask, and then add the aqueous buffer. Rehydrate slowly by The drug to be captured is in the lipid layer (for lipophilic drugs) (in the case of hydrophilic drugs) or in the aqueous hydration medium (in the case of hydrophilic drugs). Ru. The resulting liposomes are of non-uniform size between approximately 0.5 and 10 microns. It is a multilamellar vesicle (?1LV).

このＭＬＶは、典型的には、ホモジナイズ（均質化）、超音波処理または膜を用 いた押出しによりひき続いて処理され。This MLV is typically processed using homogenization, sonication, or membrane treatment. Subsequently processed by extrusion.

より小さく、より均一化したサイズの懸濁液が生産される。A smaller, more uniform size suspension is produced.

約０．２から０．４　ミクロンまでにサイズを小さくしたリポソームが一般に好 適である。このサイズの領域のリポソームは。Liposomes reduced in size to approximately 0.2 to 0.4 microns are generally preferred. suitable. Liposomes in this size area.

０．４５ミクロンのフィルターを通過させることにより滅菌され得る。そして、 このようなリポソームは凝集する傾向が少なく、かつ静脈内投与を行ったときに 器官へのより好ましい分布を示し得る（Ｇａｂｉｚｏｎ）。It can be sterilized by passing through a 0.45 micron filter. and, Such liposomes have less tendency to aggregate and when administered intravenously (Gabizon).

ＭＬＶ法の欠点の１つは、水溶性の薬物のカプセル化効率に比較的劣ることであ る。典型的には、小胞が水性薬物溶液を添加することにより調製された場合には 、脂質フィルムに添加された全薬物のうち約５〜１５％のみが小胞にカプセル化 される。必要に応じてリポソームのサイズ調整を行うことにより、さらに遊離の 薬物の割合（％）が減じる。なぜならリポソームのサイズ調整法により、一般に カプセル化された物質のある程度の損失が起こるためである。One of the drawbacks of the MLV method is its relatively poor encapsulation efficiency for water-soluble drugs. Ru. Typically, when vesicles are prepared by adding an aqueous drug solution, , only about 5-15% of the total drug added to the lipid film is encapsulated in vesicles. be done. By adjusting the size of the liposomes as necessary, you can further increase the amount of free release. The percentage of drug is reduced. This is because liposome size adjustment methods generally This is because some loss of encapsulated material occurs.

より高いカプセル化効率でリポソームを調製する別の方法が報告されている。こ れらのうちの１つは溶媒注入である。Another method to prepare liposomes with higher encapsulation efficiency has been reported. child One of these is solvent injection.

この方法においては、溶媒中脂質溶液（ｌｉｐｉｄ−ｉｎ−ｓｏｌｖｅｎｔｓｏ ｌｕｔｉｏｎ）が水性媒体中に注入される（Ｄｅａｍｅｒ＋　５ｃｈｉｅｒｅｎ Ｃａｆｉｓｏ）。この方法により、カプセル化効率（捕捉容量）が約２０〜４５ ％で比較的均一な、単ラメラ小胞が生産される。捕捉容量がより高いのは、おそ らく比較的大きい単ラメラの構造の形成に関係すると思われる。In this method, a lipid-in-solvent solution (lipid-in-solventso solution) is injected into the aqueous medium (Deamer+5chemeren). Cafiso). With this method, the encapsulation efficiency (capture capacity) is approximately 20-45 % relatively uniform, unilamellar vesicles are produced. Higher capture capacity is probably due to This seems to be related to the formation of relatively large unilamellar structures.

カプセル化効率の上昇はまた。逆蒸発法（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｅｖａｐｏｒａｔｉ ｏｎｍｅｔｈｏｄ　）によるリポソームの調製によって達成される（Ｓｚｏｋａ 。There is also an increase in encapsulation efficiency. Reverse evaporation method This is achieved by the preparation of liposomes by the onmethod (Szoka et al. .

１９７８、１９８０）　、ここでは溶媒中脂質溶液が水性媒体と混合され、そし て乳化されて油中水型乳濁液が形成される。脂質溶媒、を除くことにより逆相の 脂質ゲルが生じる。次にそれを。1978, 1980), where a lipid solution in solvent is mixed with an aqueous medium and and emulsification to form a water-in-oil emulsion. of the reversed phase by removing the lipid solvent, A lipid gel forms. Then that.

好ましくは水性媒体を添加し、該水性媒体の存在下で撹拌し。Preferably, an aqueous medium is added and stirred in the presence of the aqueous medium.

逆蒸発小胞（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ　ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ　ｖｅｓｉ ｃｌｅｓ；　ＲＥＶ）力（形成される。このＲＥＶは、比較的大きなサイズと、 １から数層の二重層でなる殻により特徴づけられる。水溶性化合物のカプセル化 効率は、典型的には、最初の水性媒体中に存在していた化合物の約３０〜５０％ の間である。reverse-phase evaporation vesi cles; REV) force (formed. This REV has a relatively large size and It is characterized by a shell consisting of one to several double layers. Encapsulation of water-soluble compounds The efficiency is typically about 30-50% of the compound present in the initial aqueous medium. It is between.

溶媒注入とＲＥＶ法の両者において、濾過によるリポソームの滅菌を可能とする ために、および／またはリポソームの標的適合性を改善するために、リポソーム のサイズを減少させることは必須であろう。ＭＬＶの場合においては、リポソー ムのサイズ調整を行うとカプセル化された物質の損失が起こる。Enables sterilization of liposomes by filtration in both solvent injection and REV methods and/or to improve the targeting suitability of liposomes. It would be essential to reduce the size of. In the case of MLV, liposo Sizing of the membrane results in loss of encapsulated material.

リポソームによる薬物供給の利点はリポソームによる薬物の捕捉に依存するので 、主としてリポソームに捕捉された形態の薬物（つまり、少なくとも薬物の約５ ０％がリポソームに捕捉されたもの）として投与することが、一般に望ましい。The advantages of liposomal drug delivery depend on drug entrapment by liposomes. , primarily in the liposome-entrapped form of the drug (i.e., at least about 50% of the drug 0% entrapped in liposomes) is generally desirable.

これは、特に、薬物が遊離の形で投与されたときに望まれない副作用を引き起こ すことが知られている場合においては。This causes unwanted side effects, especially when the drug is administered in free form. In cases where it is known that

そのとおりである。水溶性の薬物を主としてリポソームの形で投与することの利 点は同出願人による特許出願「リポソーム吸入法およびシステム」出願番号第７ ３７，２２１号（１９８５年５月２２日出願）に記載されている。ここには、硫 酸メタプロテラノール（ＭＰＳ　）が主としてリポソームにカプセル化された形 で吸入されるときには該薬物の全身的な副作用が大きく減じられることが示され ている。That's right. Advantages of administering water-soluble drugs primarily in the form of liposomes The dot is the patent application “Liposomal inhalation method and system” application number 7 by the same applicant. No. 37,221 (filed May 22, 1985). Here, sulfur Acid metaproteranol (MPS) is mainly encapsulated in liposomes. It has been shown that the systemic side effects of the drug are greatly reduced when inhaled. ing.

水溶性薬物の場合には、既知のリポソーム調製法においては最高で３０〜５０％ のカプセル化が達成されているが、該リポソームに遊離の薬物を除去する処理を 行うことによりより高いカプセル化レベル（カプセル化薬物が５０％を越える） が達成され得る。これは、一般に１分子篩クロマトグラフィー。In the case of water-soluble drugs, up to 30-50% in known liposome preparation methods. encapsulation has been achieved, but the liposomes are subjected to treatment to remove free drug. Higher encapsulation level (more than 50% encapsulated drug) by can be achieved. This is generally single sieve chromatography.

遠心分離もしくは透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によりなされ得る。This can be done by centrifugation or diafiltration.

これらの方法のすべてにおいて２Ｍ離の薬物を含むバルク相（ｂｕｌｋ　ｐｈａ ｓｅ）の懸濁媒体は、薬物を含まないバルク媒体（ｂｕｌｋ　ｍｅｄｉｕｍ）に よって置換される。In all of these methods, a bulk phase containing 2M of drug is used. se) suspension medium is drug-free bulk medium. Therefore, it is replaced.

このアプローチの欠点は、遊離の薬物を除くために付加的な工程、および必要に 応じて除去された薬物の再利用が必要であることである。水溶性で、リポソーム 透過性の薬物の場合における第２の制限事項は、懸濁液中において、カプセル化 された部分とバルク相の部分との間で薬物が再平衡化し得ないうちにリポソーム 組成物を投与しなければならないことである。この第２の問題点は同出願人の特 許出願「リポソーム濃縮物および方法」出願番号第８６０．５２８号（１９８６ 年５月５日出＠）に述べられている。この発明によれば、水溶性でリポソーム透 過性の薬物を含むリポソームの希釈懸濁液は、脂質ペーストにまで濃縮される。The disadvantages of this approach are the additional steps to remove free drug, and the need to Accordingly, it is necessary to reuse the removed drug. Water-soluble, liposomal A second limitation in the case of permeable drugs is that in suspension, encapsulation The liposome is removed before the drug can re-equilibrate between the treated part and the bulk phase part. The composition must be administered. This second problem is the applicant's particular Patent application “Liposomal Concentrates and Methods” Application No. 860.528 (1986 Published on May 5th, 2015 @). According to this invention, water-soluble and liposome-permeable A dilute suspension of liposomes containing hyperactive drug is concentrated to a lipid paste.

この脂質ペーストには、水性物質が少なくとも約５０容量％、好ましくは約７０ 容量％カプセル化されて含有される。上記割合はまた。リポソームにカプセル化 された薬物の割合（％）を示す。この懸濁液は濃縮さ机た形で保存され、そして 、使用直前に希釈される。つまり。The lipid paste contains at least about 50% by volume of aqueous material, preferably about 70% by volume. % by volume is encapsulated and contained. The above percentage is also. Encapsulated in liposomes The percentage of drug administered (%) is shown. This suspension is concentrated and stored in storage, and , diluted immediately before use. In other words.

希釈された懸濁液中の薬物は非平衡状態で、主としてカプセル化された形態で投 与される。遊離の薬物の除去およびリポソームの濃縮は超遠心分離、遠心分離な どにより一工程で行われ得る。その有用性にもかかわらず、リポソームペースト を用いたアプローチは、遊離の薬物の損失およびリポソーム懸濁液を付加的処理 する工程を包含する。Drugs in diluted suspensions are non-equilibrium and administered primarily in encapsulated form. given. Removal of free drug and concentration of liposomes can be achieved by ultracentrifugation, centrifugation, etc. It can be carried out in one step. Despite its usefulness, liposome paste approach using the loss of free drug and additive processing of liposome suspensions. It includes the step of

４、発ユ■盟竹 本発明の一般的な目的は、従来技術の上記問題点およびリポソーム調製法の制限 を大きく克服するリポソーム処理方法を提供することにある。4. Hatsuyu■Meitake The general purpose of the present invention is to address the above-mentioned problems of the prior art and the limitations of liposome preparation methods. The object of the present invention is to provide a liposome processing method that greatly overcomes the above problems.

より詳細には２本発明の目的は、水溶性化合物のカプセル化効率が少なくとも約 ５０％、そして、　７０％もしくはそれ以上までとなるようなリポソームの調製 法を提供することにある。More particularly, it is an object of the present invention that the encapsulation efficiency of water-soluble compounds is at least about Preparation of liposomes with 50% and up to 70% or more It is about providing law.

本発明の他の目的は、付加的な脱水処理を行わずにペーストもしくは、ペースト に近い形態で存在する濃縮されたリポソーム懸濁液を調製する方法を提供するこ とにある。Another object of the present invention is to produce pastes or pastes without additional dehydration treatment. To provide a method for preparing concentrated liposome suspensions that exist in a form close to It's there.

それに関連した目的は、濾過滅菌により容易に滅菌され得るそのようなペースト を製造する方法を提供することにある。A related purpose is to prepare such pastes that can be easily sterilized by filter sterilization. The purpose is to provide a method for manufacturing.

本発明のさらに他の目的は、５０％を越えるカプセル化を保持しながら１例えば ０．１〜０．４　ミクロンという狭いサイズ領域のリポソームを製造するのに適 合し得るリポソーム処理法を提供することにある。Yet another object of the present invention is to maintain greater than 50% encapsulation while e.g. Suitable for producing liposomes in a narrow size range of 0.1 to 0.4 microns. The purpose of the present invention is to provide a liposome treatment method that can be combined with other methods.

本発明は、ある局面においては、主として水溶性化合物を含む（つまり、リポソ ームにカプセル化された形態で５０％を越える割合で含有する）リポソームの懸 濁液を調製する方法を包含する。本性を実施する場合には、クロロフルオロカー ボン溶媒を用いた小胞形成性脂質の溶液が、脂質の発泡が太き（避けられるよう な圧力、温度および撹拌条件下で、そして主としてオリゴラメラ小胞を生じるよ うな注入速度で、水性媒体中に液体状で注入される。カプセル化されるべき化合 物は水性媒体または脂質溶媒のいずれかに溶解させる。溶液の注入は、水性媒体 中の脂質濃度が約１５０〜５００μｍｏｌ／ｍとなるまで続けられる。注入され た溶媒は注入されたのと実質的に同じ速度で除去され、そして１選択された脂質 濃度に達したときに完全に除去される。The present invention, in certain aspects, includes primarily water-soluble compounds (i.e., liposol). suspension of liposomes (containing more than 50% in encapsulated form) A method of preparing a suspension is included. Chlorofluorocarbons A solution of vesicle-forming lipids using Bonn solvent is under suitable pressure, temperature and agitation conditions, and to produce predominantly oligolamellar vesicles. It is injected in liquid form into an aqueous medium at a high injection rate. compound to be encapsulated The substance is dissolved in either an aqueous medium or a lipid solvent. Injection of solutions in aqueous media This is continued until the lipid concentration in the mixture reaches approximately 150 to 500 μmol/m. injected The solvent is removed at substantially the same rate as it was injected, and one selected lipid It is completely removed when the concentration is reached.

最終リポソーム濃度が少なくとも約２５０　ｕ　ｍｏｌ／ｄになるまで溶媒の注 入を続けると、約６０〜７０％の捕捉効率が達成される。高濃度の懸濁液はリポ ソームペースト（例えば、薬物含有リポソームの貯蔵形態である）として使用す るのに適している。この高濃度の懸濁液は、水をさらに除去することにより簡単 にペーストに変換され得る。もしくは薬物を含有しない緩衝液で所望のリポソー ム濃度にまで希釈され得る。Infuse the solvent until the final liposome concentration is at least about 250 umol/d. With continued injection, a capture efficiency of approximately 60-70% is achieved. Highly concentrated suspensions are For use as a somatic paste (e.g., a storage form for drug-containing liposomes) It is suitable for This highly concentrated suspension is made easier by further removal of water. can be converted to paste. Alternatively, the desired liposomes can be prepared in a drug-free buffer. It can be diluted to a bulk concentration.

他の局面においては２本発明は、脂質濃度が約２００μｍｏｌ／−を越え、そし てリポソームのサイズが約０．６ミクロンを越えないリポソームを含む濃縮され たリポソーム懸濁液を調製する方法を包含する。この方法においては、クロロフ ルオロ−カーボン溶媒を用いた小胞形成脂質の溶液を上記のように。In another aspect, the present invention provides a method in which the lipid concentration exceeds about 200 μmol/−, and concentrated liposomes containing liposomes in which the size of the liposomes does not exceed about 0.6 microns. The method includes a method for preparing a liposome suspension. In this method, chlorophyll Solution of vesicle-forming lipids using a fluorocarbon solvent as described above.

脂質の発泡が大きく避けられるような圧力、温度、撹拌条件下で、そして、主と してオリゴラメラ小胞が生産されるような注入速度で、水性媒体中に注入される 。カプセル化されるべき化合物は水性媒体もしくはクロロフルオロカーボン溶媒 に溶解させる。注入工程の間に、この水性懸濁液は、リポソームを０．１〜０． ６　ミクロンの間のサイズに調整するのに有効な押出機により循環させる。溶媒 の注入、および引き続いて行われる押出および溶媒の除去は、最終的に所望のリ ポソーム濃度（それは３００〜５００μｍｏｌ／ＩＩｄｌと高濃度であり得る） およびリポソームサイズの範囲となるまで続けられる。濃縮された物質は、　０ ．４５もしくは０．２２ミクロンのフィルターを通すことにより滅菌され得る。under pressure, temperature, and stirring conditions such that foaming of the lipids is largely avoided; into an aqueous medium at an injection rate such that oligolamellar vesicles are produced. . The compound to be encapsulated is in an aqueous medium or a chlorofluorocarbon solvent. Dissolve in. During the injection step, this aqueous suspension contains 0.1-0. Circulate through an extruder effective to size between 6 microns. solvent injection, followed by extrusion and solvent removal to finally achieve the desired release. Posome concentration (it can be as high as 300-500 μmol/IIdl) and continues until the liposome size range is reached. The concentrated substance is 0 ．． It can be sterilized by passing through a 45 or 0.22 micron filter.

この２つの方法を組み合わせると、濃縮されたリポソーム懸濁液を製造するのに 有用である。このリポソーム懸濁液は。Combining these two methods can produce concentrated liposome suspensions. Useful. This liposome suspension.

ａ）リポソームサイズが約０．４ミクロンを下まわり、そして。a) the liposome size is below about 0.4 microns; and

ｂ）水溶性薬物を主としてカプセル化された形態で有する。b) Contains water-soluble drugs primarily in encapsulated form.

さらに他の局面においては、リポソーム懸濁液は、溶媒注入およびサイズ調整の 工程の間に濾過され９選択されたサイズ範囲を下まわるリポソームが除去される 。そして、これらのリポソームは再循環され、新たに注入された溶媒中脂質溶液 と混合される。この間に小さいリポソームの部分はより大きなものへと変換され る。連続的な濾過、再循環、および注入混合により、最終的にリポソーム懸濁液 が本発明の他の利゛点（例えば高カプセル化効率および高脂質濃度）を犠牲にす ることなく調製され、そしてこれはより小さなリポソームを実質的に含有しない 。In yet other aspects, liposome suspensions are prepared by solvent injection and size adjustment. During the process filtration removes liposomes below the selected size range. . These liposomes are then recycled and added to the freshly injected lipid solution in solvent. mixed with. During this time, small liposome parts are converted into larger ones. Ru. Continuous filtration, recirculation, and injection mixing ultimately yields a liposome suspension but at the expense of other advantages of the invention (e.g. high encapsulation efficiency and high lipid concentration). and is substantially free of smaller liposomes. .

本発明のこれらのそして他の目的と特徴とは１次の本発明の詳細な説明を添付の 図面とあわせて読むことにより、より充分に明らかとなるであろう。These and other objects and features of the invention are summarized in the accompanying detailed description of the invention. It will become clearer when read in conjunction with the drawings.

図面の簡単な説明 第１図は本発明を実施するのに用いた脂質処理システムをダイアグラムの形で示 し； 第２図はリポソーム調製において押出しによりリポソームのサイズを調整するた めに用いる。第１図のシステムにおける付加的な構成部分を示し； 第３図は所定の範囲のサイズを有するリポソームの調製に用いるためのリポソー ム処理システムの他の実施態様の一部を示し； 第４図は本発明に従って実施された２つの異なる処理方法における脂質濃度の関 数としてのカプセル化効率のプロットを示し；そして第５Ａ〜第５Ｄ図は、脂質 濃度５０μｍｏｌ／ｒｄ（４Ａ）　、　１００　μｍｏｌ／ｍ　（４Ｂ）　、　 １５０　μｍｏｌ／ｍ　（４Ｃ）　、および２００μｍｏｌ／ｍ　（４Ｄ　）に おいてリポソームの調製方法を実施したときに撮影したリポソームの顕微鏡写真 を示す。Brief description of the drawing FIG. 1 depicts in diagrammatic form the lipid processing system used to carry out the present invention. death; Figure 2 shows how to adjust the size of liposomes by extrusion in liposome preparation. used for Illustrating additional components in the system of FIG. 1; Figure 3 shows a liposome for use in preparing liposomes having a predetermined size range. 5 illustrates a portion of another embodiment of the system; Figure 4 shows the relationship between lipid concentration in two different treatment methods carried out according to the present invention. Figures 5A-5D show plots of encapsulation efficiency as a number; Concentration 50 μmol/rd (4A), 100 μmol/m (4B), 150 μmol/m (4C) and 200 μmol/m (4D) A micrograph of liposomes taken when the liposome preparation method was carried out at shows.

見所■詳■笈脱ユ 第１図は１本発明の方法により高カプセル化効率でリポソームを調製するのに用 いられる処理システムを示し、これは。Highlights ■Details■ Kodeyu Figure 1 shows the method used to prepare liposomes with high encapsulation efficiency by the method of the present invention. This shows the processing system that can be used.

１０で示される。このシステムは、密閉された溶媒注入槽１２を有し、この注入 槽は操作中においてリポソームが形成される水性媒体の所定量を含有する。この 槽の稼動容量は、小容量処理のための１００ｍＢもしくはそれ以下の容量から、 リポソームをスケールアップして生産するための１００！もしくはそれ以上の容 量の範囲であり得る。ここに述べる特定のシステムは、単一の槽において約４２ までのリポソーム懸濁液を調製するために設計され、そして、溶媒注入槽は約５ ２の総容積を有する。全体のシステムは、より大きな槽の容量を適合させるため に、スケールアップもしくはスケールダウンされ得ることは理解されるであろう 。10. This system has a sealed solvent injection tank 12, which The reservoir contains a predetermined amount of aqueous medium in which liposomes are formed during operation. this The working capacity of the tank ranges from 100mB or less for small volume processing. 100 tips for scaling up and producing liposomes! or more It can be a range of amounts. The particular system described herein has approximately 42 The solvent injection tank is designed to prepare liposome suspensions of up to It has a total volume of 2. The whole system adapts to larger tank capacity It will be appreciated that it can be scaled up or down to .

槽１２は、核種を取り囲むジャケラ）１６を介して温度調節槽１４（これは、所 望の温度の水もしくは他の適当な冷媒を循環させる）により、操作中所定の温度 に保持される。この槽は。The tank 12 is connected to a temperature control tank 14 (which is connected to the to maintain a predetermined temperature during operation by circulating water or other suitable refrigerant at the desired temperature. is maintained. This tank is.

該槽内の液体の内容物の温度を脂質溶媒の沸点を越える温度。A temperature that causes the temperature of the liquid contents in the vessel to exceed the boiling point of the lipid solvent.

典型的には約５　’Ｃから４５°Ｃの間の選択された温度に保持するように操作 可能である。Operated to maintain a selected temperature typically between about 5'C and 45°C It is possible.

溶媒中脂質溶液は、楢に連結した密閉溶媒供給タンクＩ８から供給ライン２０お よびインライン供給ポンプ２２を介して核種に注入される。溶媒物質は、好まし くは水性媒体の表面直下−に位置するノズル２４を介して槽内に導入される。ポ ンプ２２は。The lipid solution in solvent is transferred to supply line 20 from a closed solvent supply tank I8 connected to the oak. and injected into the nuclide via an in-line feed pump 22. The solvent substance is preferably The water is introduced into the tank through a nozzle 24 located just below the surface of the aqueous medium. Po The pump 22 is.

混合槽内の水性媒体１００　ｄにつき１分あたり約０．５〜２ｍ！。Approximately 0.5 to 2 m per minute per 100 d of aqueous medium in the mixing tank! .

好ましくは約１　ｍＲの副台で溶媒溶液を注入するように操作され得る。つまり 、もし混合槽が２７０　ｍｌの水性緩衝液を含むならば、このポンプは、１分あ たり約１．４から５．４ｍｌ、好ましくは約２．１ｍｌの溶媒を注入するように 操作され得る。Preferably, it can be operated to inject the solvent solution with a substage of about 1 mR. In other words , if the mixing tank contains 270 ml of aqueous buffer, this pump will run for 1 minute. inject about 1.4 to 5.4 ml, preferably about 2.1 ml, of solvent per hour. Can be manipulated.

タンクおよび供給ラインの溶媒は、操作中、温度調節槽２６により該溶媒の沸点 を下まわる選択された温度に保持される。During operation, the solvent in the tank and supply line is maintained at its boiling point by a temperature control tank 26. is maintained at a selected temperature below .

この恒温槽は、冷却水のような冷却された液体を、供給タンクを取り囲むジャケ ット２８および供給ラインを取り囲むジャケット状のスリーブ（図示しない）中 に循環させる。This thermostatic chamber is used to store a cooled liquid, such as cooling water, in a jacket surrounding a supply tank. in a jacket-like sleeve (not shown) surrounding the cut 28 and supply line. circulate.

槽中に延びるブレード３２を含む混合機３０は、操作中に槽中の液体を混合する のに用いられる。このブレードの速度は加減抵抗器３４により制御される。好ま しくは１分あたり約４００容器中の圧力は、操作中、真空ポンプ３６により約２ ００　ミリバールの真空度に維持させる。このポンプは２図示されるように、冷 却器３８により槽に連結される。この冷却器においては、ポンプにより除去され た溶媒が凝縮する。凝縮した溶媒は溶媒回収タンク４０に集められる。温度調節 槽４２は、冷却水のような冷却媒体を、冷却器の中の凝縮コイル４４およびタン ク４０を取り囲む水冷ジャケット４６に供給する。A mixer 30, including blades 32 extending into the tank, mixes the liquid in the tank during operation. used for. The speed of this blade is controlled by a rheostat 34. Like or approximately 400 per minute. During operation, the pressure in the vessel is increased by the vacuum pump 36 to approximately 2 A vacuum level of 00 millibar is maintained. This pump is shown in Figure 2. It is connected to the tank by a quencher 38. In this cooler, the pump removes The solvent will condense. The condensed solvent is collected in a solvent recovery tank 40. Temperature control Tank 42 supplies a cooling medium, such as cooling water, to a condensing coil 44 and tank in the cooler. The water is supplied to a water cooling jacket 46 surrounding the tank 40.

Ｂ、処理炭分 溶媒中脂質溶液は、クロロフルオロカーボン溶媒に溶解させた小胞形成性脂質を 含む。このクロロフルオロカーボン溶媒の沸点は、好ましくは室温を下まわり、 さらに好ましくは約２〜１０°Ｃの間である。ここで定義されている「クロロフ ルオロカーボン」とは、塩素化、フッ素化された炭素もしくは炭化水素であり、 上記沸点の特徴を持ち、そして脂質溶媒として用いられ得るものである。典型的 なりロロフルオロカーボンには、　「フレオンＩＩＪ　（ＣＣｈＦ）、　’フレ オン１２Ｊ　（ＣＣＩ□Ｆ、）。B. Treated coal content A lipid-in-solvent solution consists of vesicle-forming lipids dissolved in a chlorofluorocarbon solvent. include. The boiling point of the chlorofluorocarbon solvent is preferably below room temperature; More preferably, the temperature is between about 2 and 10°C. “Krolov” defined here "fluorocarbon" is a chlorinated or fluorinated carbon or hydrocarbon; It has the above boiling point characteristics and can be used as a lipid solvent. typical Rorofluorocarbons include Freon IIJ (CChF), Freon IIJ (CChF), On 12J (CCI□F,).

「フレオン２１　Ｊ　（ＣＨＦＣ１ｚ）　、　’フレオン２２Ｊ　（ＣＨＣＩＦ 、）　、ｒフレオン１１３　Ｊ　（ＣＣＩＪＣＣＩＦｚ）、’フレオン１１４　 Ｊ　（ＣＣＩＦ２ＣＣ１ｈ）。“Freon 21 J (CHFC1z), Freon 22J (CHCIF , ), r Freon 113 J (CCIJCCIFz), 'Freon 114 J (CCIF2CC1h).

および「フレオン１１５　Ｊ　（ＣＣＩＦ２ＣＦりが包含される。好ましい？８ 媒は、トリクロロフルオロメタン（「フレオン１１」）であり、その沸点は１気 圧で２３，８°Ｃである。または、トリクロロフルオロメタンとジクロロフルオ ロメタン（「フレオン２１」）との混合物であり、その沸点は１気圧で８．９° Ｃである。カプセル化されるべき化合物が９．＄５液を形成するのに使用される 水性媒体に含有され得す、かつ純粋なりロロフルオロカーボン溶媒に容易に溶解 しない場合には、溶媒は、クロロフルオロカーボンおよび水の両者に混合し得る エタノールのような溶媒を約１０〜２０％（ν／Ｖ）まで含有し得る。溶媒注入 の選択された条件下で揮発性であるか、もしくは、水性リポソームの懸濁液中で 低濃度であれば許容される他の少量の有機溶媒もまた含有され得る。and “Freon 115 J (includes CCIF2CF). Preferable?8 The medium is trichlorofluoromethane (“Freon 11”), whose boiling point is 1 atm. The pressure is 23.8°C. Or trichlorofluoromethane and dichlorofluoromethane It is a mixture with lomethane (“Freon 21”), whose boiling point is 8.9° at 1 atm. It is C. The compound to be encapsulated is 9. Used to form $5 liquid Can be contained in aqueous media and readily soluble in pure lorofluorocarbon solvents If not, the solvent may be miscible with both the chlorofluorocarbon and water. It may contain up to about 10-20% (v/V) of a solvent such as ethanol. solvent injection volatile under selected conditions or in suspension in aqueous liposomes. Small amounts of other organic solvents may also be included, as long as they are acceptable at low concentrations.

小胞形成性脂質は、リン脂質およびステロールを一般に包゛含する既知の小胞形 成性脂質の中から選択される。リポソームの調製に通常用いられるリン脂質のリ ストは、　５ｚｏｋａ、１９８０の４７１頁に記載されている。卵ホスファチジ ルコリン（卵ＰＣ）　。Vesicle-forming lipids are known vesicle-forming lipids that generally include phospholipids and sterols. selected from adult lipids. Phospholipid liposomes commonly used for liposome preparation The strike is described in 5zoka, 1980, p. 471. egg phosphatidium Lucorin (egg PC).

卵ＰＣ／コレステロール混合物のような天然の脂質成分が適当であり得る。しか し２本発明により行われる実験においては。Natural lipid components such as egg PC/cholesterol mixtures may be suitable. deer In the second experiment conducted according to the present invention.

ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）のような荷電した脂質が約５〜１０％存在 すると、リポソームの形成工程においてより小さく、より均一なサイズのリポソ ームが形成することが示された。実施例■および■に記載された好適な脂質組成 は。Approximately 5-10% of charged lipids such as phosphatidylglycerol (PG) are present. The liposome formation process then produces smaller, more uniformly sized liposomes. It was shown that a team was formed. Preferred lipid compositions as described in Examples ■ and ■ teeth.

５５モル％の卯ＰＣ，５モル％のＰＧ、および４０モル％のコレステロールを含 有する。Contains 55 mol% Rabbit PC, 5 mol% PG, and 40 mol% cholesterol. have

さらに、脂質溶液は、α−トコフェロールのような親油性保護剤および／または リポソームの脂質二重層中に捕捉されるべき親油性の薬物化合物を含有し得る。Additionally, the lipid solution may contain lipophilic protectants such as alpha-tocopherol and/or The liposome may contain a lipophilic drug compound to be entrapped within the lipid bilayer.

リポソーム中に捕捉された形で投与され得る代表的な親油性化合物としては。Representative lipophilic compounds that can be administered entrapped in liposomes include:

プロスタグランジン、アンファテリシンＢ、プロゲステロン。Prostaglandin, amphotericin B, progesterone.

硝酸イソソルビド、テストステロン、ニトログリセリン、エストラジオール、コ ルチゾン、デキサメタシンおよび関連するエステル、および吉草酸ベタメゾンが 包含される。上記のように、リポソームを形成するのに使用される水性媒体にこ れらを含有させることができないような場合には、脂質溶液はカプセル化される 水溶性化合物を含有し得る。ひとつの例として１本発明により行なわれ、以下に 説明される研究により、溶媒注入法に用いられる水性媒体中に水溶性化合物であ るプロプラノロールをはじめから溶解させた場合には、リポソームの破壊を引き おこすことが示される。しかし、脂質溶媒（フレオン１１：エタノール、１０： １）に溶解させると、非常に高い割合でプロプラノロールがカプセル化されたリ ポソームが形成される。Isosorbide nitrate, testosterone, nitroglycerin, estradiol, Lutisone, dexamethacin and related esters, and betamezone valerate Included. As mentioned above, the aqueous medium used to form the liposomes In cases where it is not possible to contain lipids, the lipid solution is encapsulated. May contain water-soluble compounds. As an example, the following is carried out according to the present invention: The studies described show that water-soluble compounds are present in the aqueous medium used in solvent injection methods. If propranolol is dissolved from the beginning, it may cause liposome destruction. It is shown that it occurs. However, lipid solvents (Freon 11:ethanol, 10: 1), a very high proportion of propranolol is encapsulated. Posomes are formed.

溶媒中−脂質溶液中の脂質濃度は１選択された溶液容量を導入した後の水性媒体 中における望ましい脂質濃度を達成するように調整される。後述のように、最終 的なリポソーム懸濁液中の脂質の最小濃度は約１５０μｍｏｌ／ｌｄであり、そ して水性媒体中に加えられる脂質溶液の総容量は混合槽の水性媒体の総容量の約 １／２から２倍である。望ましくは、脂質溶液は約２００〜７００μｌ１ｌＯ１ ／！ｌｄｌの間で調製される。ここでは、「フレオン１１」と「フレオン２１」 との等容量混合物のような混合クロロフルオロカーボン溶媒が、高濃度脂質溶液 に用いるのに好適であり得ることが示されている。従って、溶液中の脂質濃度は 、所望量の脂質がこの混合容量範囲内となるように水性媒体中に加えられること により調整される。In Solvent - The lipid concentration in a lipid solution is 1 after introducing the selected solution volume into the aqueous medium. adjusted to achieve the desired lipid concentration in the medium. As mentioned below, the final The minimum concentration of lipids in a typical liposome suspension is approximately 150 μmol/ld; The total volume of lipid solution added into the aqueous medium is approximately the total volume of the aqueous medium in the mixing tank. It is 1/2 to 2 times. Desirably, the lipid solution is about 200-700μl 1O1 /! Prepared between ldl. Here, "Freon 11" and "Freon 21" Mixed chlorofluorocarbon solvents such as equal volume mixtures of highly concentrated lipid solutions It has been shown that it may be suitable for use in Therefore, the lipid concentration in the solution is , the desired amount of lipid is added to the aqueous medium within this mixing volume range. Adjusted by

上記水性媒体は、典型的にはｐＨが約６．０および７．５の間の緩衝能のある水 溶液であり、そして通常、リポソーム内へカプセル化されるべき水溶性の薬剤ま たは化合物を含む。この薬剤は、水性媒体に比較的可溶であり、リポソームが非 経口的に２局所的に、吸入によりまたは他のルートにより投与されたときに、制 御された速度でリポソームから放出され得るあらゆる薬物、ホルモン、ペプチド 、ビタミン、あるいは他の薬学的試薬であり得る。制御された放出は、リポソー ム透過性の薬物の場合にはリポソーム膜を通しての薬物の通過により、あるいは 、リポソーム非透過性の薬物の場合にはリポソームの破壊により起こり得る。代 表的な水溶性薬物には。The aqueous medium is typically buffered water with a pH between about 6.0 and 7.5. solution and usually contains a water-soluble drug or drug to be encapsulated within liposomes. or compounds. The drug is relatively soluble in aqueous media and liposomes are Controlled when administered orally2topically, by inhalation or by other routes Any drug, hormone, or peptide that can be released from liposomes at a controlled rate , vitamins, or other pharmaceutical reagents. controlled release liposol by passage of the drug through the liposome membrane in the case of membrane-permeable drugs; In the case of liposome-impermeable drugs, this can occur due to liposome disruption. teenager For superficial water-soluble drugs.

テルブタリン、アルブチロール、アトロピンメチル、クロモリンナトリウム、プ ロプラノロール、フルノイソリド、イブプロフィン、ゲンタマイシン、トベルマ イシン、ペンタアミジン、ペニシリン、テオフィリン、プレオマイシン、エトポ シド、カブトプレル、ｎ−アセチルシクテイン、ベランビミル、フルオロウラシ ル、ヨードウリジン、トリフルオロウリジン、ビダラビン、アジドチミジン、リ バビリン、ホスホノフォルメート、ホスホノアセテート、アシクロビル、セメチ ジン、ナファゾリン、ロドキサミドおよびフェニルエビネフイリンが包含され、 リポソーム二重膜を通して拡散し得る比較的小さい化合物の例である。水溶性で リポソーム非透過性の適当な化合物としては、ペプチドホルモン、酵素、酵素阻 害剤、アポリポタンパク、および高分子量炭水化物が包含される。このクラスの 代表的な化合物には、カルシトニン、アトリオペブチン、α−１−アンチトリプ シン、インターフェロン、オキシトシン、バソプレッシン、インシュリン、イン ターロイキン２．スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲン活性化 因子、血漿第８因子１表皮細胞成長因子。Terbutaline, albutyrol, atropine methyl, cromolyn sodium, protein Lopranolol, flunoisolide, ibuprofin, gentamicin, tovelma Icin, pentaamidine, penicillin, theophylline, pleomycin, etopo Cid, Kabutoprel, n-acetylcycteine, Verambimil, Fluorouraci iodouridine, trifluorouridine, vidarabine, azidothymidine, Babilin, phosphonoformate, phosphonoacetate, acyclovir, cemethyl gin, naphazoline, lodoxamide and phenylebinephylline, An example of a relatively small compound that can diffuse through the liposome bilayer. water soluble Suitable liposome-impermeable compounds include peptide hormones, enzymes, and enzyme inhibitors. These include harmful agents, apolipoproteins, and high molecular weight carbohydrates. of this class Typical compounds include calcitonin, atriopebutin, and alpha-1-antitriptine. Syn, interferon, oxytocin, vasopressin, insulin, insulin Turleukin 2. superoxide dismutase, tissue plasminogen activation factor, plasma factor VIII 1 epidermal cell growth factor.

腫瘍壊死因子、肺胞界面活性タンパク、およびリボコルチンが包含される。水性 媒体中の薬物濃度は、リポソーム中に力゛ブセル化される体積であることが好ま しい。These include tumor necrosis factor, alveolar surfactant protein, and ribocortin. aqueous Preferably, the concentration of drug in the vehicle is such that the volume is bound into liposomes. Yes.

さらに該水性媒体には、貯蔵中に起こり得る脂質の酸化的加水分解、あるいは薬 剤の分解を減じるキレート化剤のような可溶性保護剤が含有され得る。In addition, the aqueous medium is susceptible to oxidative hydrolysis of lipids that may occur during storage, or Soluble protective agents such as chelating agents may be included to reduce degradation of the agent.

（以下余白） Ｃ０仏Ｊ１１作 この節は、水溶性化合物のカプセル化効率が約５０％以上。(Margin below) Made by C0 France J11 This node has an encapsulation efficiency of about 50% or more for water-soluble compounds.

および６５％またはそれ以上の高効率であるリポソーム製造に用いられる方法を 記述する。操作は、上述のＩＡおよびＩＢの節で詳述した処理システムおよび成 分に関して記述する。and methods used to produce liposomes with high efficiency of 65% or more. Describe. Operation is based on the processing system and components detailed in the IA and IB sections above. Describe in terms of minutes.

初めに、脂質を供給タンク１８に加え、そして水性媒体を槽１２に加える。そし て１選択された圧力における脂質溶媒の沸点以上および以下である槽およびタン クの温度に、この２つの溶液をそれぞれ温度調節槽１４．２４により平衡化する 。好ましくは、“フレオン１１”中に脂質溶媒がある場合には、脂質溶媒および 水性媒体を操作の間それぞれ約４°Ｃおよび２０°Ｃに平衡化し２維持する。First, the lipid is added to the feed tank 18 and the aqueous medium is added to the tank 12. stop 1 The vessel and tank are above and below the boiling point of the lipid solvent at the selected pressure. These two solutions are each equilibrated to the temperature of the temperature control tank 14.24. . Preferably, if there is a lipid solvent in "Freon 11", the lipid solvent and The aqueous medium is equilibrated and maintained at approximately 4°C and 20°C, respectively, during the operation.

混合機を１分間あたり約８５０回転の間の好ましい速度で操作し、混合槽内の真 空度を２００から４００ｍｂａｒＯ間に設定し。Operate the mixer at a preferred speed of between approximately 850 revolutions per minute and Set the air pressure between 200 and 400mbarO.

混合槽内に入れである水性媒体へ冷却した脂質溶媒を供給するようにポンプ２２ を作動する。上述したように、脂質表面の少し下、好ましくは脂質表面下約１か ら３ｃｍの間に溶媒を注入する。そして、１００ｍ！水性媒体あたり１分間に約 １　ｍｌの好ましい速度で溶媒を槽に供給する。もし注入速度が非常に遅い場合 には、脂質小胞はより多重ラメラの構造をとる傾向があり、該多重ラメラ構造は 単位脂質あたりのカプセル化量を減少させる傾向がある。もし注入速度が非常に 遅い場合には。A pump 22 is configured to supply the cooled lipid solvent to the aqueous medium contained within the mixing tank. operate. As mentioned above, slightly below the lipid surface, preferably about 1. Inject the solvent between 3 cm. And 100m! Approximately per minute per aqueous medium Feed the solvent to the vessel at a preferred rate of 1 ml. If the injection rate is very slow , lipid vesicles tend to adopt a more multilamellar structure; It tends to reduce the amount of encapsulation per unit lipid. If the injection rate is very In case it's late.

脂質材料は泡になる傾向があり、脂質材料の損失があり、カプセル化が十分に行 われない。起泡は溶媒蒸気の槽からの験去が速すぎることによっても引き起こさ れ得る。それゆえ。Lipid materials tend to foam, there is loss of lipid material, and encapsulation is insufficient. It won't happen. Foaming can also be caused by solvent vapor leaving the bath too quickly. It can be done. therefore.

もし起泡が観察された場合および溶媒の注入速度が上述した速度よりも早くない 場合には、起泡が十分に除去されるまでシステム内の真空度を減少すべきである 。If foaming is observed and the solvent injection rate is not faster than the above mentioned rate. If so, the vacuum in the system should be reduced until the foam is sufficiently removed. .

上述した処理条件下では、形成されたリポソームは、大部分がオリゴラメラであ る。すなわち、このリポソームは主に１つまたはほんのわずかの二重槽を含有す る。方法の初期段階では、リポソームは異なったサイズで分散されており、該サ イズはミクロンを下回るサイズから１０ミクロンまたはそれ以上の範囲である。Under the treatment conditions described above, the liposomes formed are predominantly oligolamellar. Ru. That is, the liposomes contain primarily one or only a few double cisternae. Ru. At the initial stage of the method, the liposomes are dispersed in different sizes and the The size ranges from submicron to 10 micron or more.

第５Ａ図は、混合槽内の総脂質濃度が５０μｍｏｌ／ｉｆに達したときに形成さ れるリポソームの典型的な範囲顕微鏡視野を示す。図中に見られるより大きなリ ポソーム゛は約１０〜１５ミクロンの間であり、より小さいリポソームは１．５ ミクロンかまたはそれよりも小さい。カプセル化された水溶性物質のパーセント の決定は、実施例２に記述した方法に従うと、５０μｍｏｌ／ｍ標品中の総封入 量は約３０〜３５％の間であることを示す（実施例Ｉ）。Figure 5A shows the amount of lipid formed when the total lipid concentration in the mixing tank reaches 50 μmol/if. A typical range microscopy field of liposomes is shown. The larger scale seen in the diagram Posomes are approximately between 10 and 15 microns, smaller liposomes are 1.5 Micron or smaller. Percentage of water-soluble substances encapsulated The determination of the total encapsulation in a 50 μmol/m standard was performed according to the method described in Example 2. The amount is shown to be between about 30-35% (Example I).

本発明の重要な見地に従い水性懸濁液への脂質の添加を続けると、３００μｍｏ ｌ／ｍｆｉまたはそれより濃い脂質濃度でカプセル化された水溶性マーカ（封入 量）のパーセントは、最大約６０〜６５パーセントの間のカプセル化に達するま で連続的に増加する。カプセル化効率の一般的上昇は、脂質濃度の関数として第 ３図に見られる。図中の上方のカーブ（黒丸）は、実施例Ｉで記述した処理の実 施の１つがらプロットしたものである。グラフ中の破線は、５０パーセントカプ セル化効率に達したときの脂質濃度示す。カプセル化された化合物はフルオレセ インであり、該フルオレセインは比較的小さい水溶性の化合物の典型であり、リ ポソーム懸濁液をつくるときに使用される水性の緩衝液に最初から含有される。Continuing the addition of lipids to the aqueous suspension in accordance with key aspects of the invention results in 300 μmo Water-soluble markers encapsulated at l/mfi or higher lipid concentrations amount) until reaching a maximum of between about 60 and 65 percent encapsulation. increases continuously. The general increase in encapsulation efficiency increases as a function of lipid concentration. Seen in Figure 3. The upper curve (black circle) in the figure is the actual result of the process described in Example I. This is a plot of one of the cases. The dashed line in the graph indicates the 50% cap. The lipid concentration when cellization efficiency is reached is shown. The encapsulated compound is fluorescein fluorescein, which is typical of relatively small water-soluble compounds, It is initially included in the aqueous buffer used when making the posome suspension.

小胞を形成する脂質がｐｃのように荷電した脂質成分を含有する場合、溶媒中脂 質の混合槽への連続的な添加は、懸濁液中のより大きなリポソームのサイズを徐 々に減少させる。この効果は第５Ｂ図〜第５Ｄ図に見られ、これらの図はそれぞ れ１００．１５０．および２００　、ｃ／　ｍｏ　１／　ｍｌでのリポソーム懸 濁液の一般的な様相を示す。１．００　ｕ　ＩｎｏＩ／ｍｌの脂質濃度では５０ μｌ１ｌｏ１／ｍ１−　の懸濁液に関して一般的にサイズの減少が容易に認めら れ。When the lipid forming the vesicle contains a charged lipid component such as PC, the lipid in the solvent Continuous addition of liposomes to the mixing tank slows down the size of larger liposomes in suspension. decrease gradually. This effect can be seen in Figures 5B to 5D, which are 100.150. and liposome suspension at 200, c/mo 1/ml. The general appearance of a turbid liquid is shown. 50 at a lipid concentration of 1.00 u InoI/ml Generally speaking, a decrease in size is easily observed for suspensions of μl1lo1/m1. Re.

５１５０μｍｏ１７ａｉｌの脂質濃度ではほとんどすべてのリポソームは約１． ５ミクロンまたはそれよりも小さい。さらに脂質を増加させて２００　ｉｔ　ｍ ｏ】／ｎｉｌにすると、リポソームのサイズ分布に有意な変化はない。このよう に、高いカプセル化効率に加えて。At a lipid concentration of 5150 μmol, almost all liposomes have a lipid concentration of ca. 5 microns or smaller. Further increase the fat to 200 itm o]/nil, there is no significant change in the liposome size distribution. like this In addition to high encapsulation efficiency.

本発明の方法は、約１．５ミクロンよりも小さな最大のリポソームサイズの比較 的均一なサイズ分布のリポソームを提供する。The method of the present invention allows comparison of maximum liposome sizes of less than about 1.5 microns. provides liposomes with a uniform size distribution.

（以下余白） この方法で見られるリポソームサイズのゆるやかな減少は。(Margin below) A gradual decrease in liposome size is seen with this method.

荷電した脂質成分の存在に、実施例１の場合には、５ｍｏｌｅ％ホスファチジル グリセロール（ＰＧ）の存在に関係していることを示している。以下の実施例■ および■では、荷電していない脂質、すなわちＰＣのみ、あるいはＰＣとコレス テロールとを含んだ溶媒非融合法について述べられている。両方の実施例では、 最終的なリポソームサイズは不均一であり約０．１ミクロンと１０ミクロンとの 間である。In the case of Example 1, 5 mole% phosphatidyl This indicates that it is related to the presence of glycerol (PG). Examples below■ and ■, uncharged lipids, i.e., PC only or PC and cholesterol. A solvent non-fusion method involving terol is described. In both examples, The final liposome size is non-uniform and varies between approximately 0.1 and 10 microns. It is between.

リポソーム懸濁液は、脂質濃度が約３００〜４００μｍｏｌ／ｍより大きくなる と極めて粘稠になる。そして、さらに脂質を導入することは困難であり、不可能 となる。濃縮された懸濁液はペースト状の粘稠性を有しており、以下の第■節で 考察されるように、リポソームペースト剤を利用するいくつかの応用例に適して いる。あるいは、出願人が共有している米国特許出願「リポソーム濃縮および方 法」、第８６０　、５２８号（１９８６年５月７日出願）に記述されている方法 に従って、このペースト状物質をさらに脱水し、カプセル化効率を約７０％また はそれ以上に増加させ得る。Liposomal suspensions have lipid concentrations greater than about 300-400 μmol/m It becomes extremely sticky. And it is difficult and impossible to introduce further lipids becomes. The concentrated suspension has a paste-like consistency and is described in Section ■ below. As discussed, liposome pastes may be suitable for several applications. There is. Alternatively, applicant's co-owned U.S. patent application ``Liposome Concentration and Methods'' The method described in "Act", No. 860, No. 528 (filed on May 7, 1986) Accordingly, this pasty material was further dehydrated to increase the encapsulation efficiency to about 70% or more. can be increased even more.

この製法は、無菌の脂質および水溶性成分を用い、また脂質成分と接触するシス テム内の容器や接続管を予め殺菌しておくことにより無菌状態で実施し得る。あ るいは、これらリポソームは、生体内に投与する前に濾過滅菌し得る。ここでは 、これらリポソームは最大サイズが約０．４ミクロンになるようにさらにサイズ を小さくしなければならない。好ましいサイズ調整方法では、リポソームを限定 した孔サイズを有する膜に通して押し出す。このような膜には１例えば０．４ミ クロンの孔サイズを有するポリカーボネート膜（Ｓｚｏｋａ、　１９８２）＋ま たは非対称なセラミック膜などがある。これらの方法については、出願人が共有 している米国特許出願「リポソーム押出し法」、第８２９．７１０号（１９８６ 年２月２８日出＠）に記載されており、また以下でも考察されている。This method uses sterile lipids and water-soluble ingredients, and also uses a system that comes into contact with the lipid ingredients. It can be carried out under aseptic conditions by sterilizing the containers and connecting pipes in the system in advance. a Alternatively, these liposomes may be filter sterilized prior to administration in vivo. here , these liposomes are further sized to a maximum size of approximately 0.4 microns. must be made smaller. The preferred sizing method is to limit the liposomes to extrude through a membrane with a pore size of Such a membrane has a thickness of 1, for example 0.4 mil. A polycarbonate membrane with a pore size of Kron (Szoka, 1982) + or asymmetric ceramic membranes. These methods will be shared by the applicant. No. 829.710 (1986) Published on February 28, 2015 @), and is also discussed below.

実施例■では、１００〜３５０μｍｏｌ／−の間の多くの脂質濃度のうちの１つ を有するリポソームＱ濁液に適用されるような。In Example ■, one of many lipid concentrations between 100 and 350 μmol/− As applied to Liposome Q suspensions with

ポリカーボネート膜による押出し法について述べられている。An extrusion method using polycarbonate membranes is described.

該実施例における表２には、押出した後のいくつかの調製物の各々について測定 したカプセル化効率が示されている。表１　（実施例Ｉ）におけるカプセル化デ ータと、このデータとを比較すると、カプセル化された物質は押出し工程により 失われている。これは、おそらく押出し中に大きな小胞が破壊され、より小さな 小胞を形成するためである。最大脂質濃度が約３５０μｍｏｌ／ｉｌの場合に、 この方法で達成し得る最高のカプセル化は約４５％である。従って、リポソーム 調製法とそれに続く押出しとの組合せは、リポソーム濃度が約３５０μｍｏｌ／ ｍｌに限定され、カプセル化効率が５０％より低く限定される。Table 2 in the example shows the measurements for each of several preparations after extrusion. The encapsulation efficiency is shown. Encapsulation data in Table 1 (Example I) Comparing this data with the encapsulated material, the extrusion process It's lost. This is probably due to the destruction of large vesicles during extrusion and the smaller This is to form vesicles. When the maximum lipid concentration is about 350 μmol/il, The highest encapsulation achievable with this method is about 45%. Therefore, liposomes The combination of the preparation method and subsequent extrusion results in a liposome concentration of approximately 350 μmol/ ml and the encapsulation efficiency is limited to less than 50%.

これらの制限は以下に記述される高濃度法により解消される。These limitations are overcome by the high concentration method described below.

実施例■では、カルシトニンを高い効率でカプセル化したリポソームの製造方法 の有用性について述べられている・カルシトニンは、もともとは水性媒体に含ま れる水溶性のり′ソーム非透過性化合物の代表例である。カルシトニン含有リポ ソームは、「フレオン１１」に溶解した非荷電脂質の溶液を。Example Ⅲ describes a method for producing liposomes that encapsulate calcitonin with high efficiency. ・Calcitonin is originally contained in aqueous media. This is a representative example of a water-soluble glue-some non-penetrating compound. calcitonin-containing lipo Somes are made from a solution of uncharged lipids dissolved in Freon-11.

カルシトニンの水溶液に、最終脂質濃度が約３００μｍｏｌ／ｍになるまで注入 することにより調製した。実施例で述べられているように、この方法によるカプ セル化効率は６０％を越えた。Inject into an aqueous solution of calcitonin until the final lipid concentration is approximately 300 μmol/m It was prepared by Coupling by this method as described in the examples The cell efficiency exceeded 60%.

非荷電脂質成分を使用したので、上で考察したように、最終的なリポソームサイ ズは約１０ミクロンまでの範囲内であった。Because we used an uncharged lipid component, the final liposome size, as discussed above, The size was in the range of about 10 microns.

実施例■では、プロプラノロールをカプセル化したリポソームを調製する方法の 有用性について述べられている。プロプラノロールは、もともとは脂質溶媒に含 まれる水溶性化合物の代表例である。このプロプラノロール含有リポソームは。Example ■ describes a method for preparing liposomes encapsulating propranolol. The usefulness is mentioned. Propranolol was originally contained in a lipid solvent. These are representative examples of water-soluble compounds. This propranolol-containing liposome.

「フレオン１１」：エタノール、１０：１（ｖ／ν）に溶解したｐｃおよびプロ プラノロールの溶液を水性緩衝液に注入することにより調製した。クロロフルオ ロカーボン溶媒（「フレオンＩＩＪと「フレオン２１」とについて試験した）中 に薬剤を溶解させるためには、脂質溶媒中にエタノールが存在する必要がある。"Freon 11": pc and proton dissolved in ethanol, 10:1 (v/v) A solution of pranolol was prepared by injecting it into an aqueous buffer. chlorofluor in carbon solvent (tested for Freon IIJ and Freon 21) Ethanol needs to be present in the lipid solvent in order to dissolve the drug in the lipid solvent.

プロプラノロールそれ自体は水溶性であるが、脂質溶液をプロプラノロールの水 溶液に注入することによりリポソームを調製する試みは成功しなかった。これは 明らかに、プロプラノロールが界面活性剤として作用し、リポソーム形成中に生 じる初期段階のリポソームを破壊するからである。Although propranolol itself is water-soluble, the lipid solution can be mixed with propranolol in water. Attempts to prepare liposomes by injection into solution were unsuccessful. this is Apparently, propranolol acts as a surfactant and is bioactive during liposome formation. This is because it destroys liposomes in their early stages.

注入工程は、最終脂質濃度が約３００μｍｏｌ／ｉｔになるまで続行した。この ような最終脂質濃度では、約７５％の薬剤が、形成されたリポソーム中にカプセ ル化された。実施例■における調製のように、非荷電脂質成分も含まれているが 、リポソームサイズは不均一であり、約１０ミクロンまでのサイズが存在する。The injection process continued until the final lipid concentration was approximately 300 μmol/it. this At a final lipid concentration of approximately 75% of the drug is encapsulated in the liposomes formed. has been converted into a file. As in the preparation in Example ■, an uncharged lipid component is also included; , liposome size is heterogeneous, with sizes up to about 10 microns existing.

「フレオン」溶媒を除去した後のリポソーム懸濁液中に残存しているエタノール は、必要に応じて透析濾過１分子篩クロマトグラフィーなどにより除去し得る。Ethanol remaining in liposome suspension after removal of “Freon” solvent can be removed by diafiltration, single molecular sieve chromatography, etc., if necessary.

しかし、懸濁液中にエタノールが存在することにより、リポソームが安定化した り、カプセル化効率が減少したりすることは明らかではない。However, the presence of ethanol in the suspension stabilized the liposomes. It is not clear that there is a decrease in encapsulation efficiency.

■、音１皮処旦 −Ａ、几　システムおよび　７、 高濃度法は、（ａ）好ましくは約２００μｒａｏ１／ｍＲを越え、そして約５０ ０　ａ　ｌｌ１ｏｌ／ｍＲまでの脂質濃度と、し）約０．４ミクロンを下回るリ ポソームサイズとを有するリポソーム懸濁液を製造するように設計されている。■, sound 1 skin punishment -A. System and 7. The high concentration method (a) preferably exceeds about 200 μrao1/mR and about 50 Lipid concentrations up to 0.0 all1 ol/mR and It is designed to produce liposome suspensions with a posome size.

この方法によれば、　０．４５ミクロンのフィルターを通して濾過することによ り容易に殺菌された高濃度のリポソーム懸濁液が直接得られる。水溶性化合物の 存在下で製造した場合、リポソームは５０〜６０％までのカプセル化効率を有す る。According to this method, by filtering through a 0.45 micron filter, A highly concentrated liposome suspension that is easily sterilized can be obtained directly. of water-soluble compounds Liposomes have an encapsulation efficiency of up to 50-60% when produced in the presence of Ru.

高濃度法を実施するのに使用するシステム１０を改変したものを第２図に示す。A modified system 10 used to perform the high concentration method is shown in FIG.

改変されたシステムは、第２図においては一般に４８で表され、第１図に示した システム１０のすべての構成要素を包含している。これら構成要素には、第２図 に示すように、混合槽１２．水冷ジャケット１６．および混合ブレード３２が含 まれる。このシステムには、さらにリポソームを押出すための側路（ｓｈｕｎｔ ）も包含される。該押出し側路には。The modified system is generally designated 48 in FIG. 2 and is similar to that shown in FIG. Contains all components of system 10. These components include Figure 2. As shown in the figure, the mixing tank 12. Water cooling jacket 16. and a mixing blade 32. be caught. This system also includes a shunt for extruding the liposomes. ) are also included. In the extrusion side channel.

バルブ５０．ポンプ５２．およびインライン押出し装置５４が含まれる。側路は 、好ましくは１分間あたり混合槽の全容量の少なくとも約５〜１０％の割合で、 混合槽内の懸濁液を循環するように設計される。すなわち、側路は、少なくとも １０〜２０分毎に、混合槽の全容量に相当する懸濁液を処理するように設計され る。ポンプは、好ましくは上述した容量レベルにおいて、圧力を数１００ｐｓｉ にまで上昇させ得るように設計される。Valve 50. Pump 52. and an in-line extrusion device 54. The side road is , preferably at a rate of at least about 5-10% of the total volume of the mixing vessel per minute. Designed to circulate the suspension within the mixing tank. That is, the bypass is at least Designed to process suspension equivalent to the entire volume of the mixing tank every 10-20 minutes. Ru. The pump preferably produces pressures of several 100 psi at the capacity levels mentioned above. It is designed to be able to rise up to

このシステムに対するある実施態様では、押出し装置は。In one embodiment for this system, the extrusion device is.

第１Ｃ節で示される形式であって、０．２〜０．６　ミクロンの孔サイズを有す るポリカーボネートフィルターを備えた濾過装置である。この方法はフィルター の最大孔サイズに近いリポソームをサイズ調整するのに効果的である。このよう な孔サイズは、０．１ミクロン〜２ミクロンまたはそれ以上までの孔サイズから 選択することができる。of the type shown in Section 1C, with a pore size of 0.2 to 0.6 microns. This is a filtration device equipped with a polycarbonate filter. This method uses a filter is effective in sizing liposomes close to their maximum pore size. like this Pore sizes range from 0.1 micron to 2 micron or larger. You can choose.

別の実施態様では、押出し装置は、一連の同心状セラミック層から構成される形 式の非対称セラミックフィルターである。このセラミック層は、内部の環状空間 から外部の環状空間へ進むに従って、セラミックの目が密なものから粗なものに 変化している。この種のフィルターは、　Ｎｏｒｔｏｎ　Ｃｏ（サンジエゴ、Ｃ Ａ）からカートリッジの形で市販されている。これらフィルターは、　０．２． ０．４．または１．０ミクロンの大きさの粒子を捕捉するのに効果的な内部孔サ イズ（フィルターの目のサイズ）のものを利用することができる。リポソームの サイズ調整を効果的に行うのに、この種のフィルターを使用することは、上記の 米国特許出願［リポソーム押出し法」に記載されている。この発明の重要な局面 に従って、１ミクロンのセラミックフィルターを内側から外側へ通過させるリポ ソームは、この膜を単に１回または数回通過させるだけで約０．４ミクロン以下 の所望サイズにまで縮小されるということが見い出された。In another embodiment, the extrusion device comprises a series of concentric ceramic layers. It is an asymmetric ceramic filter of the type. This ceramic layer forms an internal annular space As you move from the to the outer annular space, the ceramic texture changes from dense to coarse. It's changing. This type of filter is manufactured by Norton Co (San Diego, C It is commercially available in cartridge form from A). These filters are 0.2. 0.4. or internal pore size effective to trap particles as small as 1.0 microns. (filter eye size) can be used. of liposomes Using this type of filter to effectively perform sizing is similar to the above Described in US Patent Application ``Liposome Extrusion Method''. Important aspects of this invention According to the standards, lipo filters pass through a 1 micron ceramic filter from the inside to the outside. By simply passing through this membrane once or several times, somes can form particles of approximately 0.4 microns or less. It has been found that the desired size can be reduced.

セラミック濾過装置は、以下のような理由により本発明において利点を有する： ａ）高い押出し圧力を用いることにより、処理速度を高めることができる；ｂ） 複数のフィルターカートリッジを用いることにより、かなり大きな容量をスケー ルアンプした操作で取り扱うことができる；Ｃ）周期的に逆方向に（外側から内 側へ）装置を操作することにより、膜の目詰まりを防止することができる；そし て、ｄ）この装置はその場所で高温または化学処理により殺菌することができる 。Ceramic filtration devices are advantageous in the present invention for the following reasons: a) Processing speed can be increased by using high extrusion pressure; b) By using multiple filter cartridges, you can scale significantly larger volumes. C) periodically in the opposite direction (from outside to inside) clogging of the membrane can be prevented by operating the device; d) This equipment can be sterilized in situ by high temperature or chemical treatment. .

高濃度処理法は、第１節で述べた高カプセル化法において用いられるような溶媒 中脂質および水性媒体成分を使用する。The high concentration treatment method uses the solvent used in the high encapsulation method described in Section 1. Medium lipid and aqueous medium components are used.

リポソームにカプセル化される水溶性の薬剤化合物を含有してもよいが、必ずし も含有する必要はない。すなわち、リポソームは親油性化合物（好ましくは溶媒 中脂質溶液に含有されている）、またはカプセル化された水溶性化合物のいスレ か、あるいはその両方を含有するように処方され得る。Liposomes may contain water-soluble drug compounds encapsulated, but do not necessarily include It is not necessary to also contain That is, liposomes contain lipophilic compounds (preferably solvents). (contained in lipid solutions) or encapsulated water-soluble compounds. or both.

Ｂ、兜」１１作 このシステムは実質的に第１Ｃ節で述べたように操作される。混合槽における脂 質濃度が所定の濃度に達した時に、押出し側路が開放され、混合槽中の物質は押 出し装置を通って適当な流速で循環する。側路は最初の溶媒が槽へ注入された時 から操作されるが、一般に槽中の脂質濃度が５０〜１００μｍ０１７ｍ１に達す るまで押出しを開始する必要はない。この濃度以下では、荷電脂質成分で形成さ れている小胞は、上述したように、注入が進むにつれて次第に小さくなる。この 濃度以上では、リポソームの押出しが困難になるため、高い圧力が必要となり、 また押出し速度が遅くなるので効果的なサイズ調整゛が行えなくなる。上述した ように、側路は、好ましくは約２０分またはそれ以下で＝、−＝Ｓ液の全容量を 処理するような速度で操作される。より一般的には、側路は、注入工程の間に水 性媒体の容量を約５〜１０回通過させるような流速で操作される。B. Kabuto” 11 works The system operates substantially as described in Section 1C. fat in mixing tank When the substance concentration reaches a predetermined concentration, the extrusion channel is opened and the substance in the mixing tank is pushed out. Circulate at a suitable flow rate through the outlet device. The bypass is when the first solvent is injected into the tank. Generally, the lipid concentration in the bath reaches 50-100μm017ml. There is no need to start extrusion until Below this concentration, charged lipid components form The vesicles present become progressively smaller as the injection progresses, as described above. this At higher concentrations, extrusion of liposomes becomes difficult and high pressure is required. Furthermore, since the extrusion speed becomes slow, effective size adjustment cannot be performed. mentioned above As such, the bypass preferably removes the entire volume of =,-=S liquid in about 20 minutes or less. Operated at processing speed. More commonly, a bypass is used to remove water during the injection process. The flow rate is such that about 5 to 10 passes are made through the volume of the sexual medium.

この方法の重要な特徴によれば、この方法において組み込まれたリポソームのサ イズ調整段階は、高い脂質濃度で懸濁液の粘度を有意に減少させる。そして、こ の特徴により、サイズ調整を組み込むことなく達成し得るレベルよりも実質的に 高いレベルで、懸濁液中にさらに脂質を注入することができる。実施例Ｖから明 らかなように、脂質の注入は、最終脂質濃度が約５００μｍｏｌ／ａｙｅに達す るまで続行し得る。このような最終脂質濃度では、水溶性化合物のカプセル化効 率が５０％を越える。サイズ調整を同時に行わなければ、小胞懸濁液は非常に粘 稠になり、高い押出し圧力を印加しても約３００μｍｏｌ／ｍｌの脂質濃度を越 えるものは押し出すことができない。An important feature of this method is that the liposomes incorporated in this method The viscosity adjustment step significantly reduces the viscosity of the suspension at high lipid concentrations. And this features substantially higher levels than could be achieved without incorporating size adjustment. At higher levels, more lipids can be injected into the suspension. From Example V As shown, lipid injection reaches a final lipid concentration of approximately 500 μmol/aye. You can continue until you reach the end. At these final lipid concentrations, the encapsulation efficiency of water-soluble compounds is The rate exceeds 50%. Without simultaneous size adjustment, vesicle suspensions become very viscous. It becomes thick and the lipid concentration exceeds about 300 μmol/ml even when high extrusion pressure is applied. You can't push out what you can.

実施例Ｖでは、以下のような特性を有するリポソームサイズを製造する方法の有 用性について述べられている：ａ）最終脂質濃度が５００μｍｏｌ／ｍＲ；　ｂ 　）リポソームサイズが約０．２ミクロンを下回る；そしてＣ）捕捉された水溶 性物質のカプセル化効率が約５５％である。実施例Ｉおよび■におけるようニ、 　？ｊ’／Ｉｉｔ？ｆｌは水溶性マーカのカプセル化を測定するために。Example V describes a method for producing liposome sizes having the following properties: Usability is stated: a) Final lipid concentration is 500 μmol/mR; b) ) the liposome size is less than about 0.2 microns; and C) the entrapped aqueous solution The encapsulation efficiency of sexual substances is about 55%. As in Examples I and ■, ? j’/Iit? fl to measure encapsulation of water-soluble markers.

脂質濃度を増加させてモニターした。カプセル化のデータは。Increased lipid concentrations were monitored. Encapsulation of data.

実施例■の表に示され、第４図にプロットされている（白丸）。It is shown in the table of Example 2 and plotted in FIG. 4 (open circles).

明らかに押出し工程は、同等の脂質濃度では第１節で述べた゛システムよりもカ プセル化効率を低下させる。しかしながら。Clearly, the extrusion process is more powerful than the system described in Section 1 at equivalent lipid concentrations. Decrease packaging efficiency. however.

この方法は高い脂質濃度を用い得るので、５０％以上のカプセル化効率が達成さ れる。第１節で述べた調製の場合のように。Since this method can use high lipid concentrations, encapsulation efficiencies of over 50% can be achieved. It will be done. As in the case of the preparation mentioned in Section 1.

大きなカプセル化効率（リポソーム透過性化合物に対して）は、第１節で述べた ような脱水工程を付加することにより達成され得る。The large encapsulation efficiency (for liposome-permeable compounds) was mentioned in Section 1. This can be achieved by adding a dehydration step such as

■、；−なサイズ８周　几 この節では、　０．０８ミクロンより大きく、好ましくは０．１ミクロンと、１ ．０ミクロンを下回る選択されたサイズ、例えば０．４　ミクロンとの間のサイ ズ範囲内に主として存在するリポソームの懸濁液を製造するためのシステムおよ び方法について述べる。この方法を、第１節および第■節で述べた方法の一方ま たは両方と組合せた場合には、この懸濁液は高し）カフ。■、;- size 8 laps 几 In this section, 0.08 microns, preferably 0.1 microns, and 1 ．． Selected sizes below 0 microns, e.g. between 0.4 microns A system and system for producing suspensions of liposomes present primarily in the range of We will explain how to do this. This method can be used as one of the methods described in Section 1 and Section ■. This suspension is highly effective when combined with or both cuffs.

セル化効率および／または高い脂質濃度により特徴付けることができる。It can be characterized by cellization efficiency and/or high lipid concentration.

Ａ、売月３≦（Ｌム 第３図には９本発明のこのような局面に従って均一なサイズのリポソームを製造 するために設計されたシステム６０を示す。簡単のために、このシステムは２図 に点線で示した４つの機能的なサブシステムＩ〜■について述べられる。これら サブシステムは以下のことを行うために設計した：（Ｉ）緩衝液と溶媒中脂質溶 液との混合；　（■）溶媒の注入および除去−；　（Ｉ［［）サイズを縮小する 濾過；および（ＴＶ）透析濾過および濃縮。A, Selling month 3≦(Lm FIG. 3 shows a method for producing uniformly sized liposomes according to these aspects of the invention. 6 shows a system 60 designed to do so. For simplicity, this system is shown in two diagrams. Four functional subsystems I to (2), indicated by dotted lines, will be described. these The subsystem was designed to: (I) dissolve lipids in buffers and solvents; Mixing with liquid; (■) Injection and removal of solvent -; (I [[) Reduce size filtration; and (TV) diafiltration and concentration.

溶媒混合サブシステムＮ）は、一対の材料供給タンク６２および６４を包含する 。これら材料供給タンクは、それぞれ溶媒中脂質溶液および水性緩衝液を供給す るのに使用される。Solvent mixing subsystem N) includes a pair of material supply tanks 62 and 64 . These material supply tanks supply lipid solution in solvent and aqueous buffer, respectively. used for

両方のタンクは濾過した窒素ガスで加圧することにより、タンク中への逆流を防 止し、システム内を不活性雰囲気とする。Both tanks are pressurized with filtered nitrogen gas to prevent backflow into the tank. Stop and create an inert atmosphere in the system.

溶媒中脂質溶液は、計量ポンプ６８を用いてタンク６２力１ら混合槽６６へ注入 される。緩衝液は圧力下で混合槽へ供給され、その流れはバルブ７０で調節され る。これら２つのタンク、ン昆合槽、および該タンクと核種とを接続しているラ インは１図示されているような適当なりンクジャケ・ントおよび管状の熱交換器 により、脂質溶媒の沸点以下の温度に保たれてし）る。The lipid solution in solvent is injected from tank 62 into mixing tank 66 using metering pump 68. be done. The buffer solution is supplied under pressure to the mixing tank, the flow of which is regulated by valve 70. Ru. These two tanks, the nuclide tank, and the lamp connecting the tank and the nuclide. Insert a suitable jacket and tubular heat exchanger as shown. The temperature is kept below the boiling point of the lipid solvent).

溶媒注入サブシステム（ｎ）は、熱シャケ・ントで被覆された真空槽７２を包含 する。該真空槽は、熱シャケ・ントで被覆された静的混合機７４を経て混合槽に 接続されてし）る。この混合機は、脂質と緩衝溶液とが混合槽から真空槽へ通過 するＧこつれて、それらを混合する機能を有し、そして混合された物質を、噴霧 ノズル７５を通すことにより細かい霧状にして槽中Ｇこ供給する。図から明らか なように、混合機のジャケットを通って循環している加熱された流体は、混合機 中の溶媒／緩衝液混合物を、真空槽に注入する前に、該溶媒の沸点以上に暖める 。真空槽は、真空源７７により９選択された圧力に減圧される。The solvent injection subsystem (n) includes a vacuum chamber 72 coated with a thermal dampener. do. The vacuum chamber is passed through a static mixer 74 covered with a thermal dampener to a mixing tank. connected). This mixer allows lipids and buffer solutions to pass from a mixing tank to a vacuum tank. G has the function of mixing them, and the mixed substance is sprayed By passing it through the nozzle 75, it is made into a fine mist and is supplied into the tank. It is clear from the figure The heated fluid circulating through the jacket of the mixer is Warm the solvent/buffer mixture inside above the boiling point of the solvent before injecting it into the vacuum chamber. . The vacuum chamber is evacuated to nine selected pressures by a vacuum source 77.

一槽７２はドレイン７６を経て高圧ポンプ７８に接続されて（する。One tank 72 is connected to a high pressure pump 78 via a drain 76.

該高圧ポンプ７８は、槽中に含まれる流体を閉じたループして連続的に再循環す る機能がある。この閉じたループ三方の流れを調節するバルブ８０、導管８２， および混合機７４力く含まれる。明らかなように，導管８２は混合槽の下流Ｇこ ある混合機に物質を供給する。導管の下流末端部分は．熱シャケ・ントで被覆さ れており，混合機への供給物質を脂質溶媒の沸点以下に冷却する。The high pressure pump 78 continuously recirculates the fluid contained in the tank in a closed loop. There is a function to A valve 80, a conduit 82, which regulates the flow on three sides of this closed loop. and a mixer 74 units. As can be seen, the conduit 82 is connected downstream of the mixing tank. Feed a substance into a mixer. The downstream end of the conduit. coated with heat shield The feed material to the mixer is cooled below the boiling point of the lipid solvent.

サイズ縮小サブシステム（Ｉ［ｌ）は、上述した形式のポリカーボネートフィル ターやセラミックフィルターのようなフィルター８４を包含する。該フィルター は．選択されたサイズ範囲．好ましくは約１〜２ミクロン以下にリポソームのサ イズを縮小するのに効果的である。物質は，ノ〈バルブ８０力・ら該フイルター に供給される。バルブ８ｏを調節することにより、真空槽からフィルターを通し て液体の一部の進路を変更することができる。フィルターの下流末端部はバルブ ８６を経て第４のサブシステムに接続されている。第４のサブシステムについて は以下に述べる。The size reduction subsystem (I[l) is a polycarbonate film of the type described above. The filter 84 includes a filter 84 such as a filter or a ceramic filter. the filter teeth. Selected size range. Preferably, the size of the liposome is about 1-2 microns or less. It is effective in reducing the size of the image. The substance is no <valve 80 force> supplied to By adjusting valve 8o, the filter is passed from the vacuum chamber. can be used to redirect some of the liquid. The downstream end of the filter is a valve. 86 to the fourth subsystem. About the fourth subsystem is described below.

第４のサブシステムは、底部ドレイン９ｏを備えた貯蔵タンク８８から構成され ている。ドレイン９０はポンプ９２の吸入口に接続されており、該ポンプ９２は 貯蔵タンクに収容されている流体を透析濾過フィルター９４に通して循環させる 。透析濾過フィルターの孔サイズは、好ましくは約０．２ミクロンより大きなリ ポソームを保持するように選択される。透析濾過フィルターに保持されたもの（ 大きなリポソーム）は貯蔵タンクへ回収し、濾液は三方バルブ９６を通過させる 。該三方バルブ９６は、濾液（小さなリポソーム）の進路を濃縮操作におけるド レインの方へ、あるいは透析濾過操作およびサイズ拡大操作を行うために三方の 流れを調節するバルブ７０の方へ変更する。これら後者の操作を行っている間、 濾液は、バルブ７ｏを調節することにより、混合槽６６に供給される。緩衝液を タンク６４からタンク８８ヘバルブ９８を経て直接供給することができることを 述べて第４のサブシステムに関する記述を完了する。The fourth subsystem consists of a storage tank 88 with a bottom drain 9o. ing. The drain 90 is connected to the inlet of a pump 92, and the pump 92 Circulating the fluid contained in the storage tank through the diafiltration filter 94 . The pore size of the diafiltration filter is preferably greater than about 0.2 microns. Selected to retain posomes. What is retained in the diafiltration filter ( large liposomes) are collected into a storage tank and the filtrate is passed through a three-way valve 96. . The three-way valve 96 directs the path of the filtrate (small liposomes) during the concentration operation. towards the rain or on three sides for performing diafiltration and size expansion operations. Change to valve 70 to regulate flow. While performing these latter operations, The filtrate is supplied to the mixing tank 66 by adjusting the valve 7o. buffer solution It is noted that the tank 64 can be directly supplied to the tank 88 via the valve 98. This completes the description of the fourth subsystem.

Ｂ・−ンス１Ｊｄｌｉ作 このシステムの操作は、５つの段階に分けることができる：（］）開始；（２） 注入／溶媒除去；（３）サイズ縮小；（４）透析濾過／サイズ拡大；および（５ ）透析濾過と濃縮。B・-nce 1Jdli The operation of this system can be divided into five stages: (]) initiation; (2) injection/solvent removal; (3) size reduction; (4) diafiltration/size expansion; and (5) ) Diafiltration and concentration.

システム開始段階においては、溶媒中脂質溶液は供給タンク内に保持されるが、 水性緩衝液はタンク６４がら真空槽７２へ咳真空槽が約半分だけ満たされるまで 通過し得る。この槽は。During the system startup phase, the lipid-in-solvent solution is held in the feed tank; The aqueous buffer is poured from tank 64 into vacuum tank 72 until the cough vacuum tank is about half full. can pass. This tank is.

その中の緩衝液が脂質溶媒の沸点以上になるまで熱ジャケットにより加熱される 。槽の圧力は真空源７７により低下させる。The buffer solution therein is heated by a thermal jacket until it reaches a temperature above the boiling point of the lipid solvent. . The pressure in the vessel is reduced by a vacuum source 77.

槽６６内に収容されている加熱緩衝液は、ポンプ７８により導管８２と混合機７ ４とを通って循環し、再び槽７２に戻る。開始段階においては、バルブ８ｏはポ ンプ７８がらのすべての流れを導管８２へ通す方向に設定されるが、以下に述べ るように、サイズ縮小の操作段階および透析濾過／サイズ拡大の段階においては 、このバルブはループ状の流れの一部をサイズ調整フィルターに通して透析濾過 のループ状循環部へ計量して流すように設定される。The heated buffer solution contained in tank 66 is pumped through conduit 82 and mixer 7 by pump 78. 4 and returns to tank 72 again. In the starting phase, the valve 8o is in the The pump 78 is configured to direct all flow from the pump 78 to the conduit 82, as described below. During the size reduction operation stage and the diafiltration/size expansion stage, , this valve passes a portion of the looped flow through a sizing filter for diafiltration. It is set to flow in a metered manner into the loop-shaped circulation section.

加熱緩衝液は導管８２を通って循環しているので、脂質溶媒の沸点以下の導管内 における熱交換体により冷却される。真空槽に再び入る前に、再循環された緩衝 液は静的混合機を通過する。該静的混合機は、ここでは２つの目的を有する：　 （注入／溶媒除去の段階の間に）ループを通り再循環している流体と溶媒中脂質 ／緩衝液混合物とを混合すること；および該混合物を脂質溶媒の沸点以上の温度 に加熱することである（これは真空槽における溶媒除去を促進する）。開始段階 は。As the heated buffer is circulated through conduit 82, the temperature within the conduit is below the boiling point of the lipid solvent. It is cooled by a heat exchanger at. Recirculated buffer before reentering the vacuum chamber The liquid passes through a static mixer. The static mixer has two purposes here: Fluid and lipids in solvent recirculating through the loop (during injection/solvent removal steps) /buffer mixture; and bringing the mixture to a temperature above the boiling point of the lipid solvent. (this facilitates solvent removal in a vacuum chamber). starting stage teeth.

真空槽および処理ライン内における流体の温度と圧力とが適当な値で平衡状態に 達すれば終了する。The temperature and pressure of the fluid in the vacuum chamber and processing line are in equilibrium at appropriate values. It ends when it reaches that point.

第２の溶媒注入の操作段階においては、溶媒中脂質／緩衝液混合物から脂質溶媒 を除去してリポソームを製造する。ここで、タンク６２内の溶媒中脂質溶液は計 量ポンプ６８により槽６２に導入され、タンク６４に保持されている水性緩衝液 は圧力下で混合槽に供給される。これら２つの溶液は混合槽６６内で混合され、 溶媒中脂質／緩衝液混合物は引続いて水性緩衝液と混合される。この水性緩衝液 は、静止混合機のすぐ上流にある溶媒除去サブシステムを通って再循環している 。混合の段階において、全ての溶液は脂質溶媒の沸点以下の温度であることが重 要である。混合物は静止混合機を通過するので。In the second solvent injection step, the lipid solvent is extracted from the lipid/buffer mixture in solvent. is removed to produce liposomes. Here, the lipid solution in the solvent in the tank 62 is Aqueous buffer solution introduced into tank 62 by volume pump 68 and held in tank 64 is fed to the mixing tank under pressure. These two solutions are mixed in a mixing tank 66, The lipid/buffer mixture in solvent is subsequently mixed with an aqueous buffer. This aqueous buffer is recirculated through the solvent removal subsystem immediately upstream of the static mixer. . During the mixing step, it is important that all solutions are at a temperature below the boiling point of the lipid solvent. It is essential. As the mixture passes through a static mixer.

その温度は脂質溶媒の（真空槽中で設定された圧力における）この混合物はノズ ル８０により細かな霧として真空槽内に噴霧される。脂質溶媒は槽内の温度およ び圧力において蒸発するので、溶媒の小滴が槽を通って落下するにつれて、溶媒 全体が混合槽から除去される。蒸発した溶媒は、真空システムに接続されている 冷却器（図示していない）により凝縮する。The temperature of this mixture (at the pressure set in the vacuum chamber) of the lipid solvent is A fine mist is sprayed into the vacuum chamber by the filter 80. The lipid solvent is As a droplet of solvent falls through the bath, the solvent evaporates under pressure and pressure. The whole is removed from the mixing tank. The evaporated solvent is connected to a vacuum system It is condensed by a cooler (not shown).

溶媒が除去されるにつれて、後に残る脂質は、直径が約０．１ミクロンから２０ ミクロンまでの間であるようなサイズの範囲にあるリポソームを形成する。溶媒 の除去と組み合わせた溶媒中脂質／緩衝液混合物の注入は、水相中の脂質濃度が 所望のレベルに達するまで続行する。その後、バルブ８ｏを調節して・ポンプ７ ８から供給された流体のある部分の流れをサイズ縮小フィルターサブシステムの 方向へ変更する。注入システムを通じて流入する緩衝液と同じ容量の流れがサイ ズ縮小フィルターサブシステムの方向へ変更されるようにバランスをとる。As the solvent is removed, the lipids left behind range in size from about 0.1 microns to 20 microns in diameter. Liposomes are formed that range in size from down to microns. solvent Injection of a lipid/buffer mixture in solvent combined with the removal of Continue until desired level is reached. After that, adjust the valve 8o and pump 7 A portion of the fluid supplied from 8 is routed through the size reduction filter subsystem. Change direction. A flow of the same volume as the buffer flowing through the injection system is balance to be changed in the direction of the filter subsystem.

第３のサイズ縮小の操作段階においては、真空槽内への注入段階中に形成される リポソームは、フィルター８４を通すこと（押し出すこと）によりサイズ調整す る。押し出した後。In the third size reduction operation step, formed during the injection step into the vacuum chamber The size of the liposome is adjusted by passing it through (extruding) the filter 84. Ru. After extruding.

サイズが縮小したリポソームの懸濁液は、バルブ８６を調節することにより、透 析濾過システムを通って循環している流体と混合される。The suspension of the reduced size liposomes is made transparent by adjusting the valve 86. mixed with the fluid circulating through the analytical filtration system.

透析濾過／サイズ拡大の操作段階においては、透析濾過フィルターの孔サイズ、 すなわち０．１　ミクロンよりも小さなリーポソームが濾液に入り、バルブ９６ およびバルブ７０を通過した後、混合槽に供給される。混合槽において、いった ん濾液を。During the diafiltration/size expansion operation step, the pore size of the diafiltration filter, That is, liposomes smaller than 0.1 micron enter the filtrate and enter the valve 96. After passing through the valve 70, it is supplied to the mixing tank. In the mixing tank, The filtrate.

タンク６２から導入されている溶媒中脂質溶液にさらす。混合槽における溶媒量 は、濾液中に存在する小さなリポソームから脂質を抽出するのに充分である。こ の脂質は、溶媒中脂質溶液中に導入される脂質と混合され、新しいリポソームを 形成するための溶媒中脂質／緩衝液注入および溶媒除去サブシステムに注入され る。この操作段階においては、透析濾過フィルターにおける残留物の体積損失を 差し引くために、新しい緩衝液をタンク６４から濾液物質に導入するか、あるい は濾液にさらに緩衝液を加えることなく操作中にリポソーム懸濁液が濃縮される ように、このシステムを操作し得る。Exposure to the lipid solution in solvent being introduced from tank 62. Amount of solvent in mixing tank is sufficient to extract lipids from the small liposomes present in the filtrate. child The lipids are mixed with the lipids introduced into the lipid solution in a solvent and form new liposomes. Lipid/buffer injection in solvent to form and injected into solvent removal subsystem Ru. At this stage of operation, the volume loss of the residue in the diafiltration filter is Either fresh buffer is introduced from tank 64 into the filtrate material for subtraction, or The liposome suspension is concentrated during the operation without adding further buffer to the filtrate. This system can be operated as follows.

最終的な透析濾過の操作段階においては、バルブ９６を調整して、濾液の流れを 透析濾過フィルターからドレインの方向へ変更する。また、バルブ９８を調整し て、透析濾過により除去されるのと同じ容量の新しい緩衝液をタンク８４に供給 する。During the final diafiltration step, valve 96 is adjusted to control the flow of filtrate. Change the direction from the diafiltration filter to the drain. Also, adjust valve 98. and supply tank 84 with the same volume of fresh buffer that is removed by diafiltration. do.

最終的な濃縮の操作段階は、新しい緩衝液を加えないようにバルブ９８を閉じる こと以外は、透析濾過の間に用いられる手順に従う。タンク８８内の生産物は、 濾液が透析濾過カートリッジにより除去されるにつれて１次第に濃縮される。リ ポソーム懸濁液が所望の濃度に達すれば、この工程は終了する。The final concentration step involves closing valve 98 to avoid adding new buffer. Otherwise follow the procedures used during diafiltration. The product in tank 88 is The filtrate becomes progressively more concentrated as it is removed by the diafiltration cartridge. Li The process ends when the posome suspension reaches the desired concentration.

リポソームを基にしたある診断検査は、関心のある分析物の有無に応じて補体が 介在するリポソームの溶解に基づいている。検査に用いられるリポソームは、関 心のある分析物に結合するか、または競合するように設計される表面結合リガン ドと、カプセル化されたレボータ（例えば、蛍光団１発色囲または酵素）とを含 有する。熔解したリポソームからのカプセル化されたレボータの放出を定量する ことにより９反応試料中における分析物の濃度を決定し得る。Certain liposome-based diagnostic tests show that complement is dependent on the presence or absence of the analyte of interest. Based on mediated liposome lysis. The liposomes used for testing are Surface-bound ligands designed to bind or compete with certain analytes and an encapsulated reporter (e.g., a fluorophore, a fluorophore, or an enzyme). have Quantifying the release of encapsulated revota from molten liposomes By this, the concentration of analyte in the 9 reaction sample can be determined.

ここに述べる方法は、この種の分析に適当なリポソームの調製における２つの重 要な利点を与える。第１に、形成されたリポソームは、主として単ラメラリポソ ームおよびオリゴラメラリポソームであり、それゆえ多重ラメラリポソームより も溶解に対して感受性を有する。第２に、特にカプセル化されたレボータが酵素 である場合には、一般的に酵素活性を破壊することのない条件下で、酵素をほと んど損失させることなく、リポソームを形成することができる。The method described here addresses two important issues in preparing liposomes suitable for this type of analysis. provide essential benefits. First, the liposomes formed are primarily unilamellar liposomes. lamellar and oligolamellar liposomes, and hence more so than multilamellar liposomes. are also susceptible to lysis. Second, specifically the encapsulated revota If the enzyme is Liposomes can be formed without any loss.

Ｂ、非Ｘ工ｊＵｌ交与 サイズが約０．４　ミクロンより小さく、薬剤が充分にカプセル化されたリポソ ームは、静脈内または筋肉内経路のいずれかにより薬剤を非経口投与するのに理 想的に通している。本発明は、この種のリポソーム懸濁液を調製する単純で効率 のよい方法を提供する。特に、水溶性化合物に対して、サイズ調整していないリ ポソームの場合には約７５％まで、同時にサイズ調整したリポソームの場合には 約５５％までのカプセル化率を、さらにサイズ調整や脱水処理を施さずに達成し 得る。B. Non-X engineering j Ul grant A liposol whose size is smaller than about 0.4 microns and the drug is fully encapsulated. The system is rational for administering drugs parenterally, either by intravenous or intramuscular routes. It goes through my imagination. The present invention provides a simple and efficient way to prepare this type of liposome suspension. provide a good way to Especially for water-soluble compounds, up to about 75% for posomes and at the same time for size-adjusted liposomes. Encapsulation rates of up to approximately 55% are achieved without further size adjustment or dehydration treatment. obtain.

）プセル化効率が高いということは、カプセル化されていない物質の全量が比較 的少なく、化合物の回収問題が回避されるかあるいは低減されるので、ペプチド またはホルモンをカプセル化したリポソームを形成するのに特に有利である。) High encapsulation efficiency means that the total amount of unencapsulated material is Peptide or are particularly advantageous for forming liposomes encapsulating hormones.

高濃度でサイズ調整されたリポソームを製造する能力は。The ability to produce size-tuned liposomes at high concentrations.

ある非経口的な用途においては、さらに有利であるかもしれない。その−例は、 出願人が共有している米国特許出願「放出を制御されたリポソーム供給系」、第 ８２８．１５３号（１９８６年２月１０日出願）に報告されているような、筋肉 内部値から放出される制御された薬剤に対するリポソームの使用である。It may be even more advantageous in certain parenteral applications. An example of this is Co-owned U.S. Patent Application ``Controlled Release Liposome Delivery System'', No. Muscles as reported in No. 828.153 (filed February 10, 1986) The use of liposomes for controlled drug release from internal sources.

このシステムは１部分的には、投与したリポソームからのカプセル化された薬剤 の放出が、この部位に注入されたリポソーム脂質量を増加させることにより制御 して増加させ得るという発見に基づいている。本発明により製造された高濃度の 組成物が、従来技術による組成物よりも放出時間が長いという可能性を有するこ とは明白である。This system is based, in part, on encapsulated drug from administered liposomes. release is controlled by increasing the amount of liposomal lipid injected into this site. It is based on the discovery that it can be increased by The high concentration produced by the present invention The composition may have the potential for longer release times than prior art compositions. It is obvious.

Ｃ，ユ±又二左亘入 吸入経路による薬剤の投与に対するリポソームペーストおよび高カプセル化！Ｑ 濁液の使用は、上記の米国特許出願「リポソーム吸入法およびシステム」に述べ られている。簡単には、捕捉された薬剤が水溶性でありリポソーム透過性である （例えば、カプセル化された水相部分とバルクの水相部分との間で薬剤が平衡に 達する）ようなペースト組成物は、リポソームに対して理想的な貯蔵形態を提供 する。本発明は、こ９ようなペーストを直接形成するか、あるいはさらに水をほ とんど除去することなく形成する簡単な手段を提供する。薬剤投与に際し、この ペーストは、好ましくは約１０〜３０容量％まで希釈され、そして希釈された懸 濁液は、薬剤平衡が有意に達する前に、吸入に適した形態で噴霧される。C, Yu±Mataji left Liposomal paste and high encapsulation for administration of drugs by inhalation route! Q The use of suspensions is described in the above-mentioned US patent application ``Liposomal Inhalation Methods and Systems.'' It is being Briefly, the entrapped drug is water soluble and liposome permeable. (e.g., when the drug is in equilibrium between the encapsulated and bulk aqueous phase portions) Paste compositions such as do. In the present invention, such a paste can be formed directly or by adding water to the paste. To provide a simple means of forming without much removal. When administering drugs, this The paste is preferably diluted to about 10-30% by volume and the diluted suspension The suspension is nebulized in a form suitable for inhalation before a significant drug equilibrium is reached.

あるいは、出願人が共有している上記の特許出願に詳述されているように、これ らリポソームは乾燥した微粒子状で投与し得る。ここでは、リポソームは賦形剤 （例えば、マンニトールやソルビトールなど）の存在下で調製し、脱水すること により乾燥させ、そして例えば粉砕することにより微粒子状にする。これら粒子 は１粒末状で噴霧するか、あるいは噴霧のためのクロロフルオロカーボン溶媒中 に懸濁することができる０本出願における高カプセル化法の利点は、（１）脱水 時間が短縮されること、（２）凍結乾燥前の凍結時にリポソームがほとんど損傷 を受けないこと、そして（３）水溶性物質を効率よくカプセル化し得ることであ る。Alternatively, as detailed in the above mentioned patent application co-owned by the applicant, this Liposomes can be administered in dry microparticle form. Here, liposomes are excipients (e.g., mannitol or sorbitol) and dehydrated. and reduced to fine particles, for example by grinding. these particles can be sprayed as a single powder or in a chlorofluorocarbon solvent for spraying. The advantages of the high encapsulation method in this application are: (1) dehydration; (2) liposomes are mostly damaged during freezing before lyophilization; and (3) be able to efficiently encapsulate water-soluble substances. Ru.

Ｄ、ｌ　、およびＵに・する 本発明により製造し得るリポソームペースト組成物は９局所的に施用する軟膏や クリームとして、さらに処理することなく、用いるのに適している。局所的に用 いた場合、リボ・ノームは２局所的に施用する種々の薬剤（例えば、抗菌性物質 または抗真菌剤、およびステロイド）を制御して放出することができ、また脂質 に湿気を与える源として作用する。D, l, and U Liposomal paste compositions that can be produced according to the present invention can be used as topical ointments or Suitable for use as a cream without further processing. used topically If the ribo-nome is present, the ribonome may be treated with a variety of topically applied agents (e.g. antibacterial agents). or antifungal agents, and steroids), and also lipids. acts as a source of moisture.

眼に対する施用に対し、ペースト組成物は、この物質が高れるという利点と、カ プセル化された薬剤の割合が高しまため薬剤を制御して放出し得るという利点と を提供する。For ocular applications, paste compositions have the advantage of being high in this substance and The advantage is that the percentage of encapsulated drug is high and the drug can be released in a controlled manner. I will provide a.

以下の実施例は１本発明の種々の実施態様を例示するものであって、その範囲を 限定するものではなし）。The following examples are illustrative of various embodiments of the present invention and are intended to illustrate the scope of the invention. (not limited).

（以下余白） 某去Ｉ１１ リポソーム　出しをイ″わないｍ々の゛ホスファチジルコリン（ｐｃ）はアサヒ 　リビソド（ＡｓａｈｉＬｉｐｉｄｓ　；日本）より、コレステロール（Ｃ）り はシグマ　ケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、；　Ｓｔ、　Ｌ ｏｕｉｓ、　ＭＯ）より得た。そして、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）は アバンティ　リピッド（Ａｖａｎｔｉ　Ｌｉｐｉｄ；　Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、 八Ｌ）より得た。(Margin below) A certain person I11 Phosphatidylcholine (PC), which does not require liposome release, is available from Asahi Cholesterol (C) from Asahi Lipids (Japan) is Sigma Chemical Co., Ltd. Ouis, MO). And phosphatidylglycerol (PG) Avanti Lipid (Birmingham, 8L).

ＰＣ（５５モルパーセント）、コレステロール（４５モルパーセント）およびＰ Ｇ（５モルパーセント）を２７０ｍＲのフレオンに溶解し、最終リポソーム濃度 を５００　μｍｏ１７ｍｌにした。１０ｍ？トリスーＨＣｌ、ＰＨ７，０中のＩ ｎ＋Ｍカルボキシフルオレセン（ＣＦ）溶液を、最終濃度が２１０ｍ１ｌとなる ように調製した。PC (55 mole percent), cholesterol (45 mole percent) and P G (5 mole percent) was dissolved in 270 mR Freon and the final liposome concentration was made into 500μmo17ml. 10m? I in Tris-HCl, PH 7.0 Add n+M carboxyfluorescein (CF) solution to a final concentration of 210 ml. Prepared as follows.

第１図に示し、ＩＡ節で上述した処理システムをリポソームの調製に用いたが、 インライン押出しは用いながった。溶媒中脂質溶液（２７０ｄ）を溶媒供給タン クに入れ、温度調節槽に循環させる方法により４°Ｃに平衡化した。ＣＦの水溶 液（２７０ｍｅ）を水和タンクに入れ、２０°Ｃに平衡化した。The processing system shown in Figure 1 and described above in Section IA was used for the preparation of liposomes. In-line extrusion was not used. Add the lipid solution in solvent (270d) to the solvent supply tank. The temperature was equilibrated to 4°C by placing the sample in a tank and circulating it through a temperature control tank. CF water solution The solution (270me) was placed in a hydration tank and equilibrated to 20°C.

脂質溶液を、流速２．７ｍｌ／分で水和タンクに注入した；すなわち、水和タン ク中の速度調節混合機を約８５０回転／分にセットし、ｌｄ／分／　１００　ｒ ｎｌｌ水性媒体で注入した。タンクを除圧（約２００　ｍｂａｒ）に保ち、沸騰 により除かれた溶媒を凝縮し、溶媒回収タンクに入れた。タンク中の溶媒の量は すぐに平衡に達した。溶媒注入の間定期的に、水和タンク中のリポソーム懸濁液 の一定量を、（ａ）脂質濃度、（ｂ）リポソームサイズ分布、および（ｃ）カプ セル化効率について分析するために採取した。懸濁液試料を、リポソーム懸濁液 中の計算された脂質濃度が５０．１００　、１５０　、２００　、２５０　、３ ００　、３５０　、および４００μｍｏｌ／ｍに相当する時間で採取した。すな わち、溶媒注入工程の間約１２．５分毎に採取した。The lipid solution was injected into the hydration tank at a flow rate of 2.7 ml/min; Set the speed-adjusting mixer in the tank to about 850 revolutions/minute, and nll was injected with aqueous medium. Keep the tank depressurized (approximately 200 mbar) and boil The solvent removed by was condensed and placed in a solvent recovery tank. The amount of solvent in the tank is Equilibrium was quickly reached. Periodically during solvent injection, remove the liposome suspension in the hydration tank. A fixed amount of Samples were taken for analysis of cellization efficiency. Suspension sample, liposome suspension The calculated lipid concentration in 50.100, 150, 200, 250, 3 Samples were taken at times corresponding to 00, 350, and 400 μmol/m. sand Samples were taken approximately every 12.5 minutes during the solvent injection step.

試料の脂質濃度はＢａｒｔｌｅｔｔの方法により測定した。リポソームのサイズ およびサイズ分布は電子顕微鏡写真から決定した。懸濁液を固定し、従来通りに 染色し、そして切片とするためにエボキシブロソクに包埋した。カプセル化効率 を決定するために試料を超遠心によりペレットとし、遠心分離前の容積になるよ うにＣＦを含有しないトリス緩衝液でリポソームペレットを再懸濁した。再懸濁 したリポソームは１０％トリトン−ｘｌｏｏを多量に加えて可溶化し、励起波長 ４９２ｎｍおよび螢光波長５２０　ｎｍにおける螢光の発生によりｃｐｓ度を決 定した。The lipid concentration of the samples was determined by Bartlett's method. Liposome size and size distribution were determined from electron micrographs. Fix the suspension and proceed as usual. They were stained and embedded in epoxy broth for sectioning. Encapsulation efficiency To determine the The liposome pellet was resuspended in Tris buffer without CF. resuspension The liposomes were solubilized by adding a large amount of 10% Triton-xloo, and the excitation wavelength was The CPS degree is determined by the generation of fluorescence at 492 nm and the fluorescence wavelength 520 nm. Established.

最初の水性媒体中のＣＦ濃度は、トリトン−×１００で適当に希釈した後に同様 に決定した。カプセル化のパーセントは、リポソームペレット中のＣＦ／元の媒 体中のＣＦの比から決定した。The initial CF concentration in the aqueous medium was the same after appropriate dilution with Triton-x100. It was decided. The percentage of encapsulation is CF/original vehicle in the liposome pellet. It was determined from the ratio of CF in the body.

以下の表１は、３つの異なる試験から得た典型的な結果を示す。第１の試験では ２表に示したように、２５から２００μｍｏ１／ｍＩｌの間の脂質濃度に相当す る時間でリポソーム試料を採取した。Table 1 below shows typical results from three different tests. In the first test As shown in Table 2, this corresponds to a lipid concentration between 25 and 200 μmol/ml. Liposome samples were collected at a certain time.

Ｂａｒｔｌｅｔｔ分析から決定した実際の脂質は中央の欄に示す。カプセル化効 率は欄の右側に示す。期待される濃度に関して常により低い脂質濃度は、恐らく リポソーム自身の基本体積の置換による。表１に見られるように、約５０パーセ ントを上回るカプセル化効率は、約１５０μｍｏｌ／Ｉｄ以上の脂質濃度で達成 さ５０、１００　、１５０　、および２００　μｍｏｌ／ｉｆｆの試料濃度での リポソームの出現形態を第４Ａ−４Ｂ図に示す。５０μｍｏｌ／ｍでは。Actual lipids determined from Bartlett analysis are shown in the middle column. Encapsulation effect Rates are shown on the right side of the column. A lipid concentration that is always lower with respect to the expected concentration probably By displacement of the liposome's own basic volume. As seen in Table 1, approximately 50% Encapsulation efficiencies exceeding the at sample concentrations of 50, 100, 150, and 200 μmol/iff. The morphology of liposomes is shown in Figures 4A-4B. At 50 μmol/m.

リポソームはミクロンを下回るサイズから１０ミクロンまたはそれより大きなサ イズ範囲にかなり様々に分散している。１００μｍｏｌ／ａｙｅでは、より大き なリポソームの、約１．５　ミクロンまたはそれよりも大きいより均一なサイズ への変化が見られる。Liposomes range in size from submicron to 10 micron or larger. They are quite diversely distributed over the size range. At 100 μmol/aye, the larger more uniform size of liposomes, about 1.5 microns or larger Changes can be seen.

１５０および２００　μｍｏｌ／ｍｊ！では、懸濁液は約１．５　ミクロンより も大きいサイズのリポソームを実質的に含有しない。150 and 200 μmol/mj! So, the suspension is about 1.5 microns It also contains substantially no large-sized liposomes.

第２の試験では、脂質濃度範囲１００−４００μｍｏｌ＃＋１．すなわち全ての 溶媒中脂質溶媒を水性媒体に注入することにより達成される最も高い濃度でのカ プセル化効率を調べた。最終の脂質濃度で懸濁液は、さらに脂質材料の注入を困 難にするペーストのようなコンシスチンシーを有した。観察されるように、脂質 濃度をさらに増加させるとカプセル化効率は約６６％効率にまで増大する。In the second test, lipid concentrations ranged from 100-400 μmol #+1. i.e. all Lipid in solvent The highest concentration achieved by injecting the solvent into an aqueous medium The packaging efficiency was investigated. Suspension at final lipid concentration complicates injection of further lipid material. It had a paste-like consistency that made it difficult to coat. As observed, lipids Further increasing the concentration increases the encapsulation efficiency to about 66% efficiency.

第３の試験は、　２００−４００μｍｏｌ／ｍｌ！の間の脂質濃度について表１ 中の下方に示しており、前の試験に一致する。The third test was 200-400 μmol/ml! Table 1 for lipid concentrations between It is shown at the bottom of the middle and corresponds to the previous test.

（以下余白） 実画ＬｆＬＬ 汐媒注　′のリポソームのサイズ＝。(Margin below) Actual picture LfLL Size of liposomes in tidal medium injection =.

カプセル化されたＣＦを含むリポソームの懸濁液は、　Ｎｕｃｌｅｏ−ｐｏｒｅ 　Ｃｏｒｐ、（Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、　ＣＡ）の０．４ミクロンのポリカーボ ネート膜を通して押出すことによりサイズ調整された。このリポソームは押出し 圧力２００ｐｓ　ｉで押し出された。押し出され得る最大の脂質濃度は３５０μ ｍｏｌ／ｍｆであり、そのような濃度においては、最初の押出速度は極めて遅か った。押出後の粒子径はＮｉｃｏｍｐ　Ｌａ５ｅｒＰａｒｔｉｃｌｅ　５ｉｚｅ ｒ、　２００型（Ｎｉｃｏｍｐ　Ｃｏｒｐ、　Ｇｏｌｅｔａ。The suspension of liposomes containing encapsulated CF is Corp. (Pleasanton, Calif.) 0.4 micron polycarbonate The size was adjusted by extrusion through a nate membrane. This liposome is extruded It was extruded at a pressure of 200 ps i. The maximum lipid concentration that can be extruded is 350μ mol/mf, and at such concentrations the initial extrusion rate is extremely slow. It was. The particle size after extrusion is Nicomp La5er Particle 5ize r, type 200 (Nicomp Corp, Goleta.

ＣＡ）　（ラテックス粒子を用いて較正）により確認された。これらの懸濁液に おいてはすべて、主として０．１〜０．４　ミクロンあ範囲の粒子径を示した。CA) (calibrated using latex particles). In these suspensions All exhibited particle sizes primarily in the 0.1-0.4 micron range.

押出されたリポソームのカプセル化効率は、上記のようにして決定された。つま り、リポソームをペレット化し、　ＣＦを含有しない緩衝液に再懸濁させ、そし て、リポソーム中の総ＣＦ１度ともとの水性懸濁液中のそれとを比較することに より決定された。Encapsulation efficiency of extruded liposomes was determined as described above. wife pellet the liposomes, resuspend in CF-free buffer, and Therefore, we compared the total CF in the liposomes with that in the original aqueous suspension. More determined.

その結果を下記の表２に示す。押出しの前と後とのカプセル化効率（それぞれ表 １および表２）を比較すると３次のことが示される。つまり、脂質が高濃度の場 合には、最終カプセル化効率約４０％またはそれ以上が得られるにもかかわらず 。The results are shown in Table 2 below. Encapsulation efficiency before and after extrusion (tables respectively) Comparing Table 1 and Table 2) shows the following. In other words, when lipids are highly concentrated, Although in some cases a final encapsulation efficiency of about 40% or more can be obtained. .

社もとからカプセル化されているＣＦの実質量は押出しにより失われることが示 される。It has been shown that a substantial amount of the originally encapsulated CF is lost during extrusion. be done.

濠ニーａ 実新直１」 カルシトニンをカプセル化したリポソーム°部分加水分解ダイズホスファチジル コリン（ＰＩ（ＳＰＣ）はＡａ＋ｅｒ−ｉｃａｎ　Ｌｅｃｉｔｈｉｎ（Ａｔｌａ ｎｔａ、　ＧＡ）から、そしてコレステロール（ＣＨ）およびα−トコフエｏ− ル（ａ−Ｔ）はＳｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、　（Ｓｔ、Ｌｏｕｓｉｓ、 　ＭＯ）から入手した。moat knee a Jitshin Nao 1” Liposome encapsulating calcitonin ° Partially hydrolyzed soy phosphatidyl Choline (PI (SPC) is Aa + er-ican Lecithin (Atra nta, GA), and cholesterol (CH) and α-tocophye o- (a-T) is from Sigma Chemical Co, (St, Lousis, Obtained from MO).

Ｐ）ＩｓＰｃ　（６７モル％）、コレステロール（３３モル％）およびα−Ｔ（ ０，１モル％）を“フレオン１１”５０ｄに溶解させ、脂質の最終濃度を約３０ ０　μｍｏｌ／ｍｆｌとした。この系の水性媒体は　１２５１標識化カルシトニ ン（２００μｇ／ｍ１ｌ）の酢酸塩緩衝液（４ｇ／ｌ酢酸ナトリウム）　、　ｐ Ｈ４，２，の溶液５０ｍ！であった。P) IsPc (67 mol%), cholesterol (33 mol%) and α-T ( 0.1 mol%) was dissolved in 50d of "Freon 11" to bring the final concentration of lipids to about 30 It was set to 0 μmol/mfl. The aqueous medium of this system is 1251-labeled calcitonyl (200 μg/ml) in acetate buffer (4 g/l sodium acetate), p 50ml of solution of H4,2! Met.

溶媒注入工程は、実施例Ｉに記載したのと全く同様に、脂質溶液を水和タンク中 に約０．５ｄ／分（例えば、１ｍｌ／分／水性媒体１００　ｄ）の流速で注入す ることにより行われた。この処理の最後における懸濁液中のリポソーム濃度は２ ８８μｍｏｌ／ｍｆｆ１であった。最終的に得られる懸濁物質の一部を、薬物を 含有しない緩衝液で１　：１０．　１　：２０．または１：４０に希釈し、ポル テックスにかけ、リポソームの均一な分散液を得た。放射性物質の総画収率（下 記の表３で２種の調製物について示される）により、上記３種の希釈物の各々に おいて、カルシトニン物質が実質的に１００％回収されることが示される。The solvent injection step consisted of placing the lipid solution in a hydration tank exactly as described in Example I. at a flow rate of approximately 0.5 d/min (e.g. 1 ml/min/100 d of aqueous medium). This was done by The liposome concentration in the suspension at the end of this treatment is 2 It was 88 μmol/mff1. A portion of the final suspended solid is added to the drug. 1:10 with no buffer. 1:20. Or dilute 1:40 and Tex to obtain a uniform dispersion of liposomes. Total image yield of radioactive materials (bottom) shown for the two preparations in Table 3 below) for each of the three dilutions above. It is shown that virtually 100% of the calcitonin material is recovered.

希釈された試料を高速で遠心分離してリポソームをペレット化し、そして、該ペ レット中の放射活性を測定し、試料中に含有される総放射活性と比較した。２つ の値の比をカルシトニンのカプセル化の側合（％）を算出するのに用いた。その 結果を２種の調製物のそれぞれについて表３に示す。表３から、各調製物におい て測定したカプセル化の平均値（％）は約６０％を越えることがわかる。Centrifuge the diluted sample at high speed to pellet the liposomes, and The radioactivity in the samples was measured and compared to the total radioactivity contained in the sample. two The ratio of the values of was used to calculate the % encapsulation of calcitonin. the The results are shown in Table 3 for each of the two preparations. From Table 3, each preparation It can be seen that the average value (%) of encapsulation measured by the method is over about 60%.

調製物のリポソームのサイズ分布は非常に異なって分散した状態であり、サイズ の範囲は約０．１から１０．０ミクロンを示す・この結果により、荷電脂質成分 が存在しない方法において期待され得るリポソームのサイズ不均質性の程度が示 される・これとは逆に、実施例Ｉのように荷電脂質成分が使用された場合には、 最大リポソームサイズ約１．５ミクロンが期待され得る。The size distribution of the liposomes in the preparation is very different and dispersed, with size ranges from approximately 0.1 to 10.0 microns. This result indicates that the charged lipid component The degree of size heterogeneity of liposomes that can be expected in a method in which there is no On the contrary, if a charged lipid component is used as in Example I, A maximum liposome size of about 1.5 microns can be expected.

１施±Ｎ カプセルヒブロプラノールのリポソームＰＣ（実施例■）および３Ｈ−プロプラ ノール（１−イソプロピルアミノ）−３−（１−ナフチルオキシ）−２−プロパ ツール）を、フレオン１１／エタノール　１０　：　１　（ｖ／ｖ）５０　ｍｌ 中に。1 ±N Liposomal PC of capsule hybropranol (Example ■) and 3H-propropyl Nor(1-isopropylamino)-3-(1-naphthyloxy)-2-propa tool), Freon 11/Ethanol 10:1 (v/v) 50 ml inside.

最終脂質濃度が約３００μｍ　ｏ　］　／　ｄ　＋　そして最終プロプラノール 濃度が１００■／　ｍｌとなるように溶解させた。この系における水性媒体は、 １０ｍＭ）リス）ＩＣＩ、　ｐ）１７．０．５０ｍであった。The final lipid concentration is approximately 300μm　o　　/　d　+　and the final propranol It was dissolved to a concentration of 100 μ/ml. The aqueous medium in this system is 10mM) Squirrel) ICI, p) 17.0.50m.

溶媒注入工程は、実施例Ｉに記載したのと全く同様に、脂質溶液を水和タンク中 に約０．５ｍ１１分（例えば、１ｍｌ／分／水佐媒体１００Ｉｎｌ）の流速で注 入することにより行われた。この処理の最後における懸濁液中のリポソーム濃度 は２８８μ１ｏｏｌ／ｍであった。最終的に得られる懸濁物質の一部を、緩衝液 で１：５に希釈し、ポルテックスにかけ、リポソームの均一な分散液を得た。希 釈された試料を高速で遠心分離してリポソームをペレット化し、そして、ベレッ ト中の総放射活性を測定し。The solvent injection step consisted of placing the lipid solution in a hydration tank exactly as described in Example I. at a flow rate of approximately 0.5 mL/min (e.g., 1 ml/min/100 Inl of water medium). This was done by entering the Liposome concentration in suspension at the end of this treatment was 288μ1ool/m. A portion of the final suspended solids is added to the buffer solution. The mixture was diluted 1:5 with water and applied to Portex to obtain a homogeneous dispersion of liposomes. Rare The diluted sample is centrifuged at high speed to pellet the liposomes, and then The total radioactivity in the sample was measured.

試料中に含有される総放射活性と比較した。材料全体に対するカプセル化物の比 率は約７５％であった。The total radioactivity contained in the sample was compared. Ratio of encapsulation to total material The rate was approximately 75%.

夫施貫Ｍ ｒ　注　リポソーム　しの　人せ 実施例Ｉに準じ２次の（１）および（２）の改変を行ない、リポソーム懸濁液を 調製した：（１）溶媒中脂質溶液は５００μｓｏｌ／ｄを含有した。および（２ ）水和タンク中の水性リポソーム懸濁液を第１図に示すシステムのフィルター抽 出しラインを通して循環させた。このラインは、高圧ポンプ、および密閉された 膜チャンバー（ここには、０．４ミクロンのポリカーボネートフィルターがとり つけられている）を有する。濾過槽の上流側の圧力を約　ｐｓｉに保ち、操作の 最初の段階において流速が約　ｄ／分となるようにした。Husband M r Note Liposome Shino Hitose According to Example I, the following modifications (1) and (2) were made to obtain a liposome suspension. Prepared: (1) Lipid solution in solvent contained 500 μsol/d. and (2 ) The aqueous liposome suspension in the hydration tank was filter extracted using the system shown in Figure 1. It was circulated through the output line. This line is equipped with a high pressure pump and a sealed Membrane chamber (where a 0.4 micron polycarbonate filter is installed) attached). Maintain the pressure upstream of the filtration tank at approximately psi, and The flow rate was approximately d/min in the first stage.

サイズ調整を同時に行わない溶媒注入方法とは異なり、最も高い脂質濃度（約５ ００μｍｏｌ／ｍ１）でさえもリポソーム懸濁液は充分に液体であるため、さら に引き続いて注入を行うことが可能である。この方法によればまた。押出しが行 われた後に溶媒注入により、リポソーム調整が行われる場合には。Unlike solvent injection methods that do not simultaneously perform size adjustment, the highest lipid concentration (approximately 5 00 μmol/ml), the liposome suspension is sufficiently liquid that even It is possible to perform subsequent injections. Also according to this method. extrusion line If liposome preparation is performed by solvent injection after

より高濃度（例えば、５００μｍｏｌ／Ｉｎｊ！対３５０　μｍｏｌ／ｉｆ）の 脂質懸濁液の押出しが可能である。At higher concentrations (e.g. 500 μmol/Inj! vs. 350 μmol/if) Extrusion of lipid suspensions is possible.

種りの濃度におけるリポソーム物質のカプセル化効率を表４に示す。このデータ により、（ａ）約０．４ミクロンを下まわるサイズ、および（ｂ）約５０％を越 えるカプセル化効率、を有する高濃度の調製物がこの方法により直接調製される ことが示さ本発明は好適な実施態様について記載されているが９種々の変更およ び修飾が本発明から逸脱することなくなされ得ることは、当業者に明らかである 。The encapsulation efficiency of liposomal materials at seed concentrations is shown in Table 4. this data (a) less than about 0.4 microns in size; and (b) greater than about 50%. Highly concentrated preparations with a high encapsulation efficiency are directly prepared by this method. While the present invention has been described in terms of preferred embodiments, it has been shown that nine modifications and variations may be made. It will be apparent to those skilled in the art that modifications and modifications may be made without departing from the invention. .

Ｂ　ｈｉ　Ｊ　ｌ　（ＪＪｍｏｌ／ｍ１）ＦＩＧ、　５Ａ　ＦＩＧ、　５８ 国際調査餠牛 Ｉ＋−嘲一す〜１−＋１喀＾＋圃噛−−Ｉ−Ｍ、ＰＣＴ／ＵＳ８７１０２３９６B hi J l (JJmol/m1) FIG, 5A FIG, 58 international survey beef I+-Mockery~1-+1喀＾+圃口--I-M, PCT/US87102396

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．脂質濃度が約２５０ｕｍｏｌ／ｍｌより高くかつリボソームのサイズが約０ ．６ミクロンを越えないリボソーム懸濁液を調製する方法であって，該方法は， 小胞形成性脂質をクロロフルオロカーボン溶媒に溶解させ，溶媒中脂質溶液を形 成すること， 該脂質溶液を液体の状態で，脂質の発泡が大きく避けられるような圧力および温 度条件下で，そして主としてオリゴラメラ小胞を生じるような注入速度で，水性 媒体中に注入すること， 該注入工程の間に，注入されたクロロフルオロカーボン溶媒を，それが水性媒体 中に導入されるのと実質的に同じ速度で，該媒体から除去すること， また，該注入工程の間に，該水性媒体中に形成されたリボソームを押出し，最大 のリポソームのサイズを約０．６ミクロンを下まわるように減少させること，お よび該水性媒体中の脂質濃度が少なくとも約２５０ｕｍｏｌ／ｍｌとなるまで， 該注入，除去および押出しを継続すること，を包含する。 ２．前記脂質が「フレオン１１」に約１００〜７００ｕｍｏｌ／ｍｌの濃度で溶 解する請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．前記脂質溶媒がまた．「フレオン２１」を包含する請求の範囲第２項に記載 の方法。 ４．前記脂質溶液の脂質濃度が約２５０〜７００ｕｍｏｌ／ｍｌであり，そして 前記リボソームが，水性媒体１００ｍｌにつき１分あたり脂質溶液として約０． ５〜２ｍｌの注入速度で該水性媒体に注入される請求の範囲第１項に記載の方法 。 ５．前記リボソームが，０．１〜０．４ミクロンの選択された孔サイズのポリカ ーボネート膜を通して押し出される請求の範囲第１項に記載の方法。 ６．前記リボソームが約１ミクロンの孔サイズを有する非対称性セラミックフィ ルターを通して押出される請求の範囲第１項に記載の方法。 ７．捕捉された親油性化合物を含有するリボソームを調製するのに用いられる請 求の範囲第１項に記載の方法であって前記化合物は脂質溶液に溶解している。 ８．水およびクロロフルオロカーボンの両者に可溶な溶媒をさらに含むクロロフ ルオロカーボン溶媒に可溶な水溶性化合物を含む，リボソームを調製するのに用 いられる請求の範囲第１項に記載の方法であって，該化合物は該脂質溶媒中に最 初から溶解している。 ９．前記化合物がプロプラノールであり，前記クロロフルオロカーボン溶媒が， 該化合物を該溶媒中に溶解するのに必要とされる容量％のエタノールを含有する 請求の範囲第８項に記載の方法。 １０．主として約０．１ミクロンを下まわるサイズのリボソームを含有しないリ ボソームを形成するのに用いられる請求の範囲第１項に記載の方法であって，前 記懸濁液は脂質溶液および水性媒体が連続的に供給される反応器中で形成され， そして該方法はさらに，前記注入工程の間に該懸濁液を透析濾過し，主として約 ０．１ミクロンを下まわるサイズのリボソームを含む濾液および主として約０． １ミクロンを上まわるサイズのリボソームを含む濾過残渣を形成すること，およ び該脂質溶液を濾液中に注入すること，を包含する。 １１．主としてリポソームにカプセル化された形態の水溶性化合物を含むリボソ ームの懸濁液を調製する方法であって，該方法は， 小胞形成性脂質をクロロフルオロカーボン溶媒に溶解させ，溶媒中脂質溶液を形 成すること， 該脂質溶液を液体の状態で，脂質の発泡が大きく避けられるような圧力条件下で ，そして主としてオリゴラメラ小胞を生じるような注入速度で，該溶媒の沸点を 越える温度に維持され，カプセル化されるべき化合物が緩衝液または溶媒系に溶 解している水性媒体中に注入すること，該注入工程の間に，注入されたクロロフ ルオロカーボン溶媒を，それが水性媒体中に導入されるのと実質的に同じ速度で ，該媒体から除去すること，および 該水溶性媒体中の脂質濃度が約１５０〜４００ｕｍｏｌ／ｍｌとなるまで該注入 を継続すること， を包含する。 １２．前記注入を，前記懸濁液中の脂質濃度が約２５０ｕｍｏｌ／ｍｌもしくは それ以上となり，そしてカプセル化効率が少なくとも約６０％となったときに終 了させる請求の範囲第１１項に記載の方法。 １３．主として約０．６ミクロンを下まわるサイズを有するリボソームの懸濁液 を製造するのに用いられる請求の範囲第１１項に記載の方法であって，該方法は さらに前記注入工程の間にリボソームを押出すことを包含する。 １４．主として約０．１ミクロンを下まわるサイズのリボソームを含有しないリ ボソームを形成するのに用いられる請求の範囲第１１項に記載の方法であって， 前記懸濁液が脂質溶液および水性媒体が連続的に供給される反応器中で形成され ，そして該方法はさらに，前記注入工程の間に該懸濁液を透析濾過し，主として 約０．１ミクロンを下まわるサイズのリボソームを含む濾液および主として約０ ．１ミクロンを上まわるサイズのリボソームを含む濾過残渣を形成すること，お よび該脂質溶液を濾液中に注入すること，を包含する。 １５．リボソームペーストを形成するのに用いられる請求の範囲第１１項に記載 の方法であって，該方法はさらに前記懸濁液を限外濾過によって濃縮することを 包含する。 １６．前記小胞形成性脂質が少なくとも約５モル％の荷電脂質を含有し，そして 前記注入が，前記水性媒体中の脂質濃度が約１５０ｕｍｏｌ／ｍｌに達したとき に，リポソームサイズを約１．５ミクロンを下まわるように減少させるのに有効 である，請求の範囲第１１項に記載の方法。 １７．前記荷電脂質がホスファチジルグリセロールである請求の範囲第１６項に 記載の方法。[Claims] 1. The lipid concentration is higher than about 250 umol/ml and the ribosome size is about 0. ．． A method for preparing a suspension of ribosomes not exceeding 6 microns, the method comprising: Dissolve the vesicle-forming lipid in a chlorofluorocarbon solvent and form the lipid solution in the solvent. to accomplish, The lipid solution is kept in a liquid state at a pressure and temperature that largely avoids foaming of the lipid. Aqueous injecting into the medium; During the injection process, the injected chlorofluorocarbon solvent is removed from the aqueous medium. removing it from the medium at substantially the same rate as it is introduced into it; Also, during the injection process, the ribosomes formed in the aqueous medium are extruded and maximally reducing the size of the liposomes to below about 0.6 microns; and until the lipid concentration in the aqueous medium is at least about 250 umol/ml. continuing the injection, removal and extrusion. 2. The lipid is dissolved in "Freon 11" at a concentration of about 100 to 700 umol/ml. 1. The method according to claim 1, which 3. The lipid solvent is also. Claim 2 includes “Freon 21” the method of. 4. The lipid concentration of the lipid solution is about 250-700 umol/ml, and The ribosomes are absorbed at a rate of approximately 0.0% as a lipid solution per minute per 100ml of aqueous medium. The method according to claim 1, wherein the method is injected into the aqueous medium at an injection rate of 5 to 2 ml. . 5. The ribosomes are made of polycarbonate with a selected pore size of 0.1 to 0.4 microns. 2. The method of claim 1, wherein the method is extruded through a carbonate membrane. 6. The ribosomes are made of asymmetric ceramic fibres, with a pore size of about 1 micron. A method according to claim 1, wherein the method is extruded through a router. 7. A sample used to prepare ribosomes containing entrapped lipophilic compounds. The method according to claim 1, wherein the compound is dissolved in a lipid solution. 8. chlorofluorocarbons further containing a solvent soluble in both water and chlorofluorocarbons Contains water-soluble compounds soluble in fluorocarbon solvents, used to prepare ribosomes 2. The method according to claim 1, wherein the compound is present in the lipid solvent. It has been dissolved from the beginning. 9. The compound is propranol, and the chlorofluorocarbon solvent is Contains % ethanol by volume required to dissolve the compound in the solvent The method according to claim 8. 10. Primarily ribosome-free ribosomes less than about 0.1 microns in size. A method according to claim 1 used to form bosomes, comprising: The suspension is formed in a reactor that is continuously fed with a lipid solution and an aqueous medium; And the method further includes diafiltering the suspension during the injection step, primarily about The filtrate contains ribosomes below 0.1 micron in size and mainly about 0.1 micron in size. forming a filtration residue containing ribosomes greater than 1 micron in size; and injecting the lipid solution into the filtrate. 11. Ribosomes containing water-soluble compounds primarily in the form of encapsulation in liposomes 1. A method for preparing a suspension of Dissolve the vesicle-forming lipid in a chlorofluorocarbon solvent and form the lipid solution in the solvent. to accomplish, The lipid solution is in a liquid state under pressure conditions that largely avoid foaming of the lipid. , and the boiling point of the solvent at an injection rate that produces predominantly oligolamellar vesicles. the compound to be encapsulated is dissolved in the buffer or solvent system. during the injection process, the injected chlorophyll fluorocarbon solvent at substantially the same rate as it is introduced into the aqueous medium. , removing from the medium, and The infusion until the lipid concentration in the aqueous medium is about 150-400 umol/ml. to continue, includes. 12. The injection is performed until the lipid concentration in the suspension is about 250 umol/ml or or more, and the encapsulation efficiency is at least about 60%. 12. The method according to claim 11. 13. A suspension of ribosomes primarily having a size below about 0.6 microns 12. A method according to claim 11, wherein the method is used to produce It further includes extruding ribosomes during the injection step. 14. Primarily ribosome-free ribosomes less than about 0.1 microns in size. 12. A method according to claim 11 used to form bosomes, comprising: The suspension is formed in a reactor that is continuously fed with a lipid solution and an aqueous medium. , and the method further comprises diafiltering the suspension during the injection step, primarily Filtrate containing ribosomes of size less than about 0.1 microns and mainly about 0 ．． The formation of a filtration residue containing ribosomes greater than 1 micron in size; and injecting the lipid solution into the filtrate. 15. Claim 11 for use in forming ribosome paste The method further comprises concentrating the suspension by ultrafiltration. include. 16. the vesicle-forming lipid contains at least about 5 mol% charged lipid; and when the injection reaches a lipid concentration of about 150 umol/ml in the aqueous medium. is effective in reducing liposome size to below approximately 1.5 microns. The method according to claim 11. 17. Claim 16, wherein the charged lipid is phosphatidylglycerol. Method described.