JPH01500059A - assay - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 アッセイ 本発明は、イムノアッセイのような特異的結合を利用するアッセイに係る。[Detailed description of the invention] assay The present invention relates to assays that utilize specific binding, such as immunoassays.

固相、例えば粒子をベースとするイムノアッセイシステムは既に知られている。Immunoassay systems based on solid phases, such as particles, are already known.

これらのシステムは免疫原種ｉｍ＋ｓｕ−ｎｏｇｅｎｉｃ　５ｐｅｃｉｅｓ（分 析物ａｎａｌｙｔｅ）と１種以上のその特異的結合パートナ−（該結合パートナ −の少なくとも１つはテストサンプルを含む液体媒体に接触する不溶性キャリア 物質にリンクしている）との免疫結合反応を介してテストサンプル中で該免疫原 種の定性及び／又は定量分析を実施する。These systems contain immunogenic species im+su-nogenic 5 pecies (min. an analyte) and one or more of its specific binding partners (the binding partner(s) - at least one of the insoluble carriers is in contact with the liquid medium containing the test sample; the immunogen in the test sample through an immunological binding reaction with the substance (linked to the substance). Perform qualitative and/or quantitative analysis of species.

形成される免疫複合体がキャリア物質にリンクするという事実は、その後に結合 反応の生じた程度を決定する際に有効に利用される。決定は一般に標識した特異 的結合パートナ−を使用して行われ、結合反応はいずれも当該技術分野で現在広 く使用されている「競合」反応又は「サンドイッチ」反応のいずれかであり得る 。The fact that the immune complex formed is linked to a carrier substance, which subsequently binds It is effectively used in determining the extent to which a reaction has occurred. Determination is generally labeled specific The binding reactions are performed using standard binding partners, all of which are currently widely used in the art. Can be either a commonly used “competitive” reaction or a “sandwich” reaction .

典型的な「競合」反応では、一般に水性であるアッセイ媒体を、分析すべき分析 物に対して特異性を有する特異的結合試薬（例えばモノクローナル抗体）が固定 された固相キャリアと接触させ、アッセイ媒体はラベルを担持する既知量の分析 物（又は同一のエピトープを有するその類似体）及び分析物を含んでいる疑いの ある既知量のサンプルを含んでいる。サンプル中に分析物が存在しないと、標識 した分析物又は類似体は固相キャリアに固定された特異的結合試薬と結合し、こ の結合の程度は標準実験から決定される。サンプルが分析物を含んでいる場合、 分析物は標識した分析物又は類似体と特異的結合試薬に関して競合し、従って、 特異的結合試薬が標識した成分に結合する程度は低下する。In a typical "competitive" reaction, the assay medium, which is generally aqueous, is mixed with the analyte to be analyzed. A specific binding reagent (e.g. monoclonal antibody) that has specificity for the substance is immobilized The assay medium is then placed in contact with a solid phase carrier that carries a label for analysis of a known amount. (or its analogs with the same epitope) and those suspected of containing the analyte. Contains a known amount of sample. If no analyte is present in the sample, the label The analyte or analogue is bound to a specific binding reagent immobilized on a solid phase carrier, and this The extent of binding is determined from standard experiments. If the sample contains the analyte, The analyte competes with the labeled analyte or analog for the specific binding reagent, thus The extent to which the specific binding reagent binds to the labeled component is reduced.

これを標準状Ｂ（即ち分析物の不在下で得られる結果）と比較することにより、 サンプル中の分析物濃度を測定することができる。By comparing this with standard B (i.e. the results obtained in the absence of analyte), The analyte concentration in the sample can be measured.

典型的な「サンドイッチ」反応では、分析物に対して特異性を有する第１の結合 試薬を固相キャリアに固定し、同じく一般に水性であるアッセイ媒体は更に、分 析物に対して特異性を有しており且つラベルを担持する第２の結合試薬を含んで いる０分析物の不在下では固定した試薬と標識した試薬との間に結合は生じ得な い０分析物が存在する場合、分析物は固定した特異的結合試薬及び標識した特異 的結合試薬の間のブリッジとして機能し、標識した試薬を固相と間接的に結合さ せる。この結合の程度はサンプル中の分析物の濃度の尺度となる。固定した試薬 と標識した試薬との分析物に対する特異性は異なり得るが、分析物分子が２以上 の同一のエピトープを有しているなら、固定形態及び無標識形態の両方で同一の 特異的結合試薬を使用することが可能である。In a typical "sandwich" reaction, a first bond with specificity for the analyte The reagents are immobilized on a solid phase carrier and the assay medium, which is also generally aqueous, is further separated. a second binding reagent having specificity for the analyte and carrying a label; No binding can occur between the immobilized and labeled reagents in the absence of the analyte present. If no analyte is present, the analyte is bound to the immobilized specific binding reagent and the labeled specific binding reagent. acts as a bridge between the labeled reagents and indirectly binds the labeled reagents to the solid phase. let The extent of this binding is a measure of the analyte concentration in the sample. Fixed reagent Although the specificity for the analyte between the labeled reagent and the labeled reagent may differ, if two or more analyte molecules have the same epitope in both fixed and unlabeled form. It is possible to use specific binding reagents.

粒子をベースとするイムノアッセイシステムは数種類のものが既に知られている 。これらのシステムのうちのあるものは特異的結合反応により形成される複合体 の検出システムが複雑であり、及び／又は被験種の分析前に複合体を担持する粒 状キャリア物質がテスト媒体から完全に物理的に分離され、全非結合物質が除去 される。−態様によると、本発明は被験種の分析を迅速且つ簡単に実施できるよ うな非分離粒子ベースイムノアッセイシステム、特にただ１ステツプしか必要と しないイムノアッセイを提供することを目的とする。Several types of particle-based immunoassay systems are already known. . Some of these systems are complexes formed by specific binding reactions. The detection system for the test species is complex and/or the particles carrying the complex are The carrier material is completely physically separated from the test medium and all unbound material is removed. be done. - According to an aspect, the present invention enables the analysis of test species to be carried out quickly and easily. Non-isolated particle-based immunoassay systems such as The aim is to provide an immunoassay that does not.

アッセイ媒体中に粒状固相キャリアを局在化させるイムノアッセイは種々の文献 中に記載されている。ヨーロッパ特許第０１６９４３４号は、抗原が測定時に磁 場により測定容器の壁に引き寄せられる磁性粒子に付着される蛍光測定免疫アッ セイ方法について記載している。このようなシステムで分析結果を得るためには 、紫外線のようなエネルギーを外部から加えることにより蛍光を刺激することが 当然必要である。Immunoassays that localize particulate solid phase carriers in the assay medium are described in various publications. It is written inside. European Patent No. 0169434 discloses that the antigen is magnetically detected during measurement. Fluorometric immunoassays attached to magnetic particles that are attracted to the walls of the measurement vessel by a field. It describes how to do it. In order to obtain analytical results with such a system, , fluorescence can be stimulated by externally applying energy such as ultraviolet light. Of course it is necessary.

ヨーロッパ特許第０１４９５６５号は、標識した試薬と液体アッセイ媒体に懸濁 可能で且つ不溶性の磁気的に誘引可能な粒子に結合した別の試薬とを使用して実 施されるイムノアッセイについて記載している。標識した試薬がサンプル中の分 析物の濃度に依存する割合で液相と粒子との間に分配するようになった後に、液 相を除去する。その後、粒子を別の液体媒体に再懸濁させ、ラベルの濃度を観測 する。該方法は蛍光及び化学発光ラベルシステムに特に好適であるといわれ、ウ ェルを光学的に相互に遮蔽した微量滴定プレートで実施すると好適である。その 際、ウェルの上又は下から観測する。ヨーロッパ特許第０１４９５６５号は、粒 状試薬を懸濁から外すことにより形成されたペレットから発生される光学信号の 測定を有用にすることは困難であると明示している。European Patent No. 0149565 describes the use of labeled reagents suspended in a liquid assay medium. and another reagent bound to the insoluble magnetically attractable particles. The immunoassays performed are described. The amount of labeled reagent in the sample After the liquid has become partitioned between the liquid phase and the particles in a proportion that depends on the concentration of the precipitate, Remove phase. Then, resuspend the particles in another liquid medium and observe the concentration of the label. do. The method is said to be particularly suitable for fluorescent and chemiluminescent label systems, and It is preferred to carry out this in a microtitration plate in which the wells are optically shielded from each other. the Observe from above or below the well. European Patent No. 0149565 of the optical signal generated from the pellet formed by removing the reagent from suspension. It clearly shows that it is difficult to make measurements useful.

ヨーロッパ特許第０１４９５６５号に記載された発明の背後の哲学は、本発明が 依拠する哲学と完全に対置するものである。何となれば本発明者らは分散した固 相からでなく局在化した固相から該当する観測を実施することが可能であるのみ ならず実際に非常に有利であることを発見したのである。The philosophy behind the invention described in European Patent No. 0149565 is that the invention It is in complete contrast to the philosophy upon which it is based. After all, the inventors It is only possible to carry out the relevant observations from the localized solid phase rather than from the phase. They discovered that it was actually very advantageous.

本発明は、ラベルがテスト媒体中で信号を連続的に発生するように標識された特 異的結合パートナ−を使用するキャリアベースのアッセイ方法を提供するもので あり、該方法では、結合反応後にキャリア物質をアッセイ媒体内の環境に移動さ せて強化した局在信号フラックスｆｌｕｘを検出することができる。The present invention is characterized in that the label is labeled in such a way that it continuously generates a signal in the test medium. Provides a carrier-based assay method using heterogeneous binding partners. Yes, the method involves transferring the carrier material to the environment within the assay medium after the binding reaction. In this way, an enhanced local signal flux can be detected.

より特定的には、本発明は特異的結合によりサンプル中の分析物の存在を定性及 び／又は定量分析するためのアッセイ方法を提供するものであり、該方法では分 析物に対して特異性を有する第１の結合試薬が固定された可動性固相キャリア物 質、及び分析物の存在下で第１の試薬とのｒサンドイッチ」又は「競合」反応に 関与し得る標識化特異的結合試薬にサンプルを接触させ、反応を生じるに十分な インキュベーション時間後に、可動性固相キャリア物質をアッセイ媒体内で信号 感知手段に隣接する場所に移動させ、アッセイ媒体中でラベルから連続的に信号 を発生させ、感知手段の近傍で発生された信号の大きさを結合反応が生じた尺度 として使用する。More specifically, the present invention qualitatively determines the presence of an analyte in a sample by specific binding. The present invention provides an assay method for quantitative analysis. a mobile solid phase carrier on which a first binding reagent having specificity for the analyte is immobilized; in a ``sandwich'' or ``competitive'' reaction with the first reagent in the presence of the analyte and the analyte. The sample is contacted with a labeled specific binding reagent that may be involved, and sufficient After the incubation period, the mobile solid phase carrier material is released into the assay medium. Move the signal adjacent to the sensing means and continuously output the signal from the label in the assay medium. The magnitude of the signal generated in the vicinity of the sensing means is a measure of the binding reaction that has occurred. Use as.

以下の説明では主に粒子ベースのイムノアッセイの関係で本発明を詳細に記載す るが、本発明の広義の趣旨から逸脱することなしに他の実用上の適用も可能であ ることは以下の説明から明らかであろう。The following discussion mainly describes the invention in detail in the context of particle-based immunoassays. However, other practical applications are possible without departing from the broad spirit of the invention. This will be clear from the explanation below.

本発明は、ラベルがアッセイ媒体中で信号を連続的に発生するように標識される 特異的結合試薬を使用する粒子ベースのイムノアッセイ方法を一態様として提供 するものであり、該信号は標識した結合試薬がアッセイ媒体中に均一に分散され ている間は抑制される。更に、該方法では結合反応後に粒状キャリア物質は局在 的に発生した信号を凌駕するには不十分な信号抑制能力を有する環境に局在化さ れ、従って、分析物と粒子により担持される特異的結合試薬との間に生じた結合 の程度に依存する性質及び／又は大きさを有する検出可能な信号が発生され得る 。The present invention provides that the label is labeled such that it continuously generates a signal in the assay medium. In one embodiment, a particle-based immunoassay method using specific binding reagents is provided. The signal is determined when the labeled binding reagent is uniformly dispersed in the assay medium. is suppressed while Furthermore, in this method, the particulate carrier material is localized after the binding reaction. localized in an environment with insufficient signal suppression capacity to outweigh the signals generated locally. and thus the binding that occurs between the analyte and the specific binding reagent carried by the particles. A detectable signal may be generated whose nature and/or magnitude depends on the extent of .

より好適な態様によると、本発明はラベルがテスト媒体中で連続的に信号を発生 するように標識される特異的結合パートナ−を使用する粒子ベースのイムノアッ セイ方法を提供するものであり、該信号は標識した結合パートナ−がテスト媒体 中に均一に分散されている間はマスク又はクエンチ又は他の方法で抑制される。According to a more preferred embodiment, the invention provides that the label continuously generates a signal in the test medium. Particle-based immunoassays using specific binding partners that are labeled to the signal is detected by a labeled binding partner in a test medium. masked or quenched or otherwise suppressed while uniformly dispersed in the liquid.

更に、該方法では結合反応後に、粒子により担持される複合体化標識化結合パー トナ−の局在濃度がテスト媒体の局在信号抑制能力を凌駕し、従って被験免疫原 種と粒子により担持される特異的結合パートナ−との間に生じた結合の程度に依 存する性質及び／又は大きさを有する検出可能な信号を提供するに十分な局在信 号フラックスを提供するように、粒状キャリア物質の局在濃度がテスト媒体中に 確立される。Furthermore, the method further includes, after the binding reaction, the complexed labeled binding particles carried by the particles. The localized concentration of toner exceeds the ability of the test medium to suppress the localized signal, thus suppressing the test immunogen. It depends on the degree of binding that has occurred between the species and the specific binding partner carried by the particle. sufficient localized signal to provide a detectable signal of a given nature and/or magnitude. A localized concentration of particulate carrier material is present in the test medium so as to provide a flux of Established.

本発明の関連では、「信号」なる用語は定性又は定量的に観測又は測定され得る あらゆる現象を表すために使用され、「検出可能な信号」なる用語は、観測又は 測定され得る信号中のあらゆる顕著な変化を表すために使用される０例えば、信 号は化学的存在の濃度であり得、検出可能な信号は比較的均一な「バックグラウ ンド」信号（ゼロであり得る）からの濃度の増加又は減少であり得る。検出可能 な信号の別の例は、化学的存在の蓄積率の変化であり得る。検出可能な信号の更 に別の例は、化学発光剤のような化学種により発生される可視光線のような電磁 放射の強さの変化であり得る。In the context of the present invention, the term "signal" can be observed or measured qualitatively or quantitatively. The term "detectable signal" is used to describe any phenomenon that can be observed or 0 used to represent any significant change in the signal that can be measured, e.g. The signal can be the concentration of a chemical entity, and the detectable signal is a relatively uniform ``background''. It may be an increase or a decrease in concentration from the "end" signal (which may be zero). detectable Another example of a signal can be a change in the rate of accumulation of a chemical entity. Change of detectable signal Another example is electromagnetic radiation such as visible light produced by chemical species such as chemiluminescent agents. It can be a change in the intensity of the radiation.

従って、本発明のイムノアッセイ方法は以下の特徴を有する： ａ、ラベルがテスト媒体内にある間連続的に信号を発生する。Therefore, the immunoassay method of the present invention has the following characteristics: a. Generate a signal continuously while the label is in the test medium.

ｂ、ラベルがテスト媒体中に分散されている間は、ラベルが遊離しているかキャ リア物質にリンクした複合体に結合しているかに拘わらず、信号はマスク又はク エンチ又は他の方法で抑制される。b. While the label is dispersed in the test medium, ensure that the label is free or Whether bound to a complex linked to a rear substance, the signal is masked or enquenched or otherwise suppressed.

Ｃ０標識化結合パートナ−と他の結合パートナ−との複合体化自体は、ラベルに より発生される信号を著しく変化させない。The complexation of the C0-labeled binding partner with other binding partners itself does not significantly change the signal generated by the

ｄ、複合体化ラベルがリンクしているキャリア物質がテスト媒体内の比較的小さ いゾーンに局在化している時にしか検出可能な信号は発生しない。d, the carrier material to which the complexed label is linked is relatively small in the test medium. A detectable signal is generated only when localized in a dark zone.

例えば粒状キャリアのような固相は、最初はテスト媒体のバルクｂｕｌｋに接触 しており、従ってバルク媒体が有する信号抑制活性の影響下にあり得る。その後 、固相はバルクサンプルから比較的自由であり従って信号抑制効果の影響をあま り受けない状況に置かれる。固相の移動は読出可能な結果をもたらすために実施 することが必要な唯一の作用である。ラベル自体により一定の信号が発生される ので、粒子が局在化された後に別の試薬を加えるか又は別の刺激を与える必要が なくなり、最小の複雑さ又は最小の操作数で最大の検出感度を与える。検出可能 な信号を発生させるのに必要なのは、キャリア粒子を物理的に局在化させるとい う単純な動作のみである。A solid phase, e.g. a granular carrier, is initially in contact with the bulk of the test medium. and therefore may be under the influence of the signal suppressing activity possessed by the bulk medium. after that , the solid phase is relatively free from the bulk sample and is therefore less susceptible to signal suppression effects. be placed in a situation where they cannot accept the situation. Solid phase transfer is performed to yield readable results This is the only action required. The label itself generates a constant signal Therefore, it is necessary to add another reagent or provide another stimulus after the particles are localized. and provides maximum detection sensitivity with minimum complexity or number of operations. detectable To generate a signal, it is necessary to physically localize the carrier particles. It's just a simple action.

テスト媒体中に分散されている時に標識化結合パートナ−により発生される信号 を抑制することは、本発明の最も重要な特徴である。信号が抑制されるメカニズ ムは信号発生システム自体の性質に依存する１例示としてのみ与える以下のメカ ニズムは存在する可能性の範囲を示すものである。バルクサンプル中の信号抑制 効果は、ラベルの局在濃度が検出可能な信号を発生するように平衡化されなけれ ばならない、任意の所与のシステムでは、抑制レベルは実験又は経験により決定 すべきである。しかしながら、この決定は困難なことではない、非局在化サンプ ル中に予想される濃度を表すキャリア物質、結合信号ジェネレータ及び遊離信号 ジェネレータの分散混合物は、信号抑制レベルが結合信号ジェネレータの局在化 の不在下で信号の純発生量を生じないようにするにちょうど十分なレベルに達す るまで適当な信号抑制手段（例えばコンシューマ−試薬）で「滴定」される。Signal generated by a labeled binding partner when dispersed in a test medium is the most important feature of the present invention. Mechanism of signal suppression The following mechanism is given as an example only, depending on the nature of the signal generation system itself. Nisms indicate the range of possibilities that exist. Signal suppression during bulk samples The effects must be balanced so that the local concentration of label generates a detectable signal. For any given system, the level of suppression must be determined by experiment or experience. Should. However, this determination is not difficult; carrier material, bound signal generator and free signal representing the expected concentration in the sample. Distributed mixtures of generators combine signal suppression levels to localize the signal generators reach a level just high enough to cause no net generation of signal in the absence of is "titrated" with suitable signal suppression means (e.g., consumer reagents) until

ラベルは、媒体中に存在する基質と反応して化学生成物を生成する化学剤であり 得る。化学生成物が生成されるや否やその全部又は大部分を破壊するコンシュー マ−試薬をテスト媒体が適当な濃度で含有するなら、ラベルがテスト媒体のバル ク全体に分散されている限り、均一なバックグラウンド信号（例えば化学生成物 の絶対濃度又は濃度の変化率）が維持される。しかしながら、キャリア粒子にリ ンクした特異的結合パートナ−との結合反応後は、テスト媒体中のあるゾーン内 の粒子の局在化により、コンシューマ−試薬が該ゾーンで化学生成物を破壊する 速度よりも著しく高い速度で化学生成物が蓄積し得る９局在化した粒子のすぐ近 傍における増加量の化学生成物は検出可能な信号を構成する。A label is a chemical agent that reacts with a substrate present in a medium to produce a chemical product. obtain. Consumers that destroy all or most of the chemical products as soon as they are produced If the test medium contains the marker reagent at the appropriate concentration, the label will appear on the bulk of the test medium. A uniform background signal (e.g. a chemical product) as long as it is distributed throughout the screen. (absolute concentration or rate of change in concentration) is maintained. However, the carrier particles After the binding reaction with the linked specific binding partner, the The localization of the particles allows consumer reagents to destroy chemical products in the zone. In the immediate vicinity of localized particles, chemical products can accumulate at a rate significantly higher than the An increased amount of chemical product in the vicinity constitutes a detectable signal.

粒状キャリア物質がテスト媒体中のあるゾーン内に局在化している間、コンシュ ーマ−試薬はテスト媒体のバルク全体に均一に分散していなければならない。While the particulate carrier material is localized in a zone in the test medium, the The marker reagent must be uniformly distributed throughout the bulk of the test medium.

このような化学的抑制は例えばラベルととしてグルコースオキシダーゼ酵素、テ スト媒体中の基質としてグルコース、コンシューマ−試薬としてテスト媒体中の カタラーゼ酵素を使用することにより容易に得られる。テスト媒体中のカタラー ゼの濃度は、通常状態ではグルコースオキシダーゼがテスト媒体中に均一に分散 されている間はグルコースオキシダーゼとグルコースとの反応により生成される 過酸化水素の全部又は大部分がカタラーゼにより即座に破壊されるように選択さ れ得る。過酸化水素のバックグラウンドレベルは一定に維持されるか又は変化す るとしてもゆっくり且つ均一にしか変化しない、しかしながら、グルコースオキ シダーゼで標識した特異的結合パートナ−を含む複合体を担持する粒状キャリア がテスト媒体中の比較的小さいゾーンに集中している場合、この場所に蓄積され る過酸化水素の量はカタラーゼの作用を凌駕するに十分であり、過酸化物の増加 蓄積速度として測定され得る。過酸化水素は例えば適当な電極を使用することに より検出され得、粒状キャリアの局在化は電極のすぐ近傍で得られる。アスコル ビン酸又はバラセタモールのようなサンプル中に存在し得る干渉化学物質で過酸 化物により発生されるようなスプリアス電気化学的信号を発生し得る物質は、セ ル中の電極により消費され得る。従って、選択的膜により動作電極を保護する必 要がなくなる。Such chemical inhibition can be used, for example, as a label for glucose oxidase enzymes, proteins, etc. Glucose as a substrate in the test medium and as a consumer reagent in the test medium. It is easily obtained by using catalase enzyme. Katara in test medium Under normal conditions, the concentration of glucose oxidase is such that glucose oxidase is uniformly distributed in the test medium. produced by the reaction between glucose oxidase and glucose selected such that all or most of the hydrogen peroxide is immediately destroyed by catalase. It can be done. The background level of hydrogen peroxide remains constant or varies. However, glucose oxidation changes only slowly and uniformly. Particulate carrier carrying a complex containing a specific binding partner labeled with a sidase is concentrated in a relatively small zone in the test medium, it will accumulate in this location. The amount of hydrogen peroxide produced is sufficient to overcome the action of catalase, and the increase in peroxide It can be measured as the rate of accumulation. For example, hydrogen peroxide can be The localization of particulate carriers is obtained in the immediate vicinity of the electrodes. Ascol peracid with interfering chemicals that may be present in the sample such as avic acid or valacetamol. Substances that can generate spurious electrochemical signals such as those generated by can be consumed by the electrodes in the cell. Therefore, it is necessary to protect the working electrode with a selective membrane. It becomes unnecessary.

或いは、化学生成物「信号」は表面上又は表面中に局在化する別の試薬との別の 化学反応を介して検出され得る０例えば、複合体がリンクした粒状キャリア物質 は「信号」生成物と反応して例えば表面内又は表面上に色の変化を生じるか又は 表面から発光する試薬を含有又は担持する表面（例えばスラブ、シート、フィル ム又は膜、あるいは第２の粒状キャリア物質）に隣接して局在化され得る。−例 として前述の過酸化水素発生システムの場合を挙げると、デテクタ表面はデテク タ表面内又は表面上の基質の酸化により着色生成物を生成する西洋ワサビペルオ キシダーゼ（ＨＲＰ）のような過酸化物を使用する酵素を含有又は担持し得る。Alternatively, the chemical product "signal" may be a separate product with another reagent localized on or in the surface. For example, a particulate carrier substance linked to a complex can be detected via a chemical reaction. may react with a "signal" product to produce, for example, a color change in or on the surface, or Surfaces containing or carrying reagents that emit light from the surface (e.g. slabs, sheets, films) (or a second particulate carrier material). −Example In the case of the hydrogen peroxide generation system mentioned above, the detector surface is horseradish periodine, which produces colored products by oxidation of substrates in or on the surface of the It may contain or carry peroxide-using enzymes such as oxidase (HRP).

別の例としては、テスト媒体のｐ）ｌを変化させるラベル（例えばウレアーゼ又 はベニシリナーゼ）を適当な基質（例えば尿素）と共にテスト媒体中で使用して もよい０分散状態では、ラベルの効果はテスト媒体にｐＨ［衝液を加えることに よりマスク又はクエンチされ得る。複合体を担持する粒子の結合反応及び局在化 後、ラベルの局在濃度はｐＨの変化をもたらし、局在化キャリア粒子のすぐ近傍 のテスト媒体の緩衝能力を凌駕する。このｐ）ｌ変化は例えばｐＨ電極又はｐＨ 反応性指示紙を使用して検出され得る。Another example is a label that changes the p)l of the test medium (e.g. urease or benicillinase) in the test medium with a suitable substrate (e.g. urea). In a well-dispersed state, the effect of the label is on the pH of the test medium. can be masked or quenched. Binding reaction and localization of particles carrying complexes Afterwards, the localized concentration of the label leads to a change in pH and the localized concentration of the label in the immediate vicinity of the localized carrier particles. exceeds the buffering capacity of the test medium. This p)l change can be carried out by e.g. a pH electrode or a pH Can be detected using reactive indicator paper.

更に別の態様では、５知手段はアッセイが実施される容器の外側に配置されたガ スデテクタを含んで構成される。In yet another embodiment, the sensing means is a gas disposed outside the container in which the assay is performed. It consists of a sample detector.

センサは例えばアンモニアを感知する化学的電界効果トランジスタ（Ｃｈｅｓｉ ｆｅｔ）であり得る。センサはキャリア物質が局在化された容器壁内の気体透過 性膜に隣接して配置され得る。ラベルは基質尿素をアンモニアに変換するウレア ーゼ酵素であり得、テスト媒体はコンシューマ−試薬として１−グルタミン酸デ ヒドロゲナーゼを含有し得る。The sensor may be, for example, a chemical field effect transistor (Chesi) that senses ammonia. fet). The sensor detects gas permeation within the container wall where the carrier material is localized. It may be placed adjacent to the sexual membrane. The label is urea, which converts the substrate urea to ammonia. The test medium may be a 1-glutamate enzyme as a consumer reagent. May contain hydrogenase.

化学発光性であるか又はテスト媒体の他の成分との化学発光反応に関与するラベ ルを使用することにより、細部においては完全に異なるが原理上は類似のシステ ムを作成することができる。標識した特異的結合パートナ−がテスト媒体中に均 一に分散されている時に観測可能な光に対してテスト媒体が不透明であるか又は 少なくとも不十分に半透明である場合、光学信号は検出できない、その代りに、 テスト媒体は発光システムの成分と反応して光学信号の発生をクエンチ又は阻止 する化学種を含有してもよい、標識した特異的結合パートナ−を含む複合体がリ ンクした粒状キャリアが後で局在化すると、検出し得るに十分な強度な有する局 在化光学信号が発生され得る０局在化は例えばテスト媒体を収容する容器内の「 窓」に隣接して、あるいは光学センサに隣接して生じさせ得る。バックグラウン ド光強度を測定するためにテスト流体の本体に（第２の）光学センサを配置する と、較正又は正規化手段を構成するのに有用である。Labels that are chemiluminescent or participate in chemiluminescent reactions with other components of the test medium. system that is completely different in detail but similar in principle. You can create a program. The labeled specific binding partner is distributed evenly in the test medium. The test medium is opaque to observable light when uniformly dispersed or If it is at least insufficiently translucent, no optical signal can be detected; instead, The test medium reacts with components of the luminescent system to quench or prevent the generation of optical signals. A complex containing a labeled specific binding partner, which may contain a chemical species that When the linked particulate carriers are later localized, they become localized with sufficient intensity to be detected. The zero localization at which the localized optical signal can be generated is, for example, " window" or adjacent an optical sensor. background Place a (second) optical sensor in the body of the test fluid to measure the light intensity and is useful for constructing a calibration or normalization means.

このようなシステムは、例えば媒体中でルミノール及び過酸化物（例えば０２０ ２）と共にラベルとして西洋ワサビペルオキシダーゼを使用することにより提供 され得る。媒体は過酸化物反応により影響されないように化学的に十分に不活性 な染料を含有し得、分散したラベルにより発生される光をラベルの局在化濃度か ら観測可能な光に比較して些少レベルにするに十分高い適当な波長の光学濃度（ 好ましくは０．Ｄ、が少なくとも約２）を媒体に与える。標識システムとして発 光反応を使用するイムノアッセイで発生された発光の波長を含む波長の光を吸収 する染料（アテニュエータ）を使用することはヨーロッパ特許第０１６５０７２ 号に記載されている。また、テスト媒体は発光に干渉する化学試薬を含み得る。Such a system can e.g. contain luminol and peroxide (e.g. 020 2) Provided by using horseradish peroxidase as a label with can be done. The medium is sufficiently chemically inert to be unaffected by peroxide reactions The light generated by the dispersed label can be converted into a localized concentration of the label. The optical density at a suitable wavelength ( Preferably 0. D, imparts at least about 2) to the medium. Issued as a sign system Absorbs light at wavelengths that include the wavelength of the luminescence generated in immunoassays that use photoreactions The use of a dye (attenuator) that listed in the number. The test medium may also contain chemical reagents that interfere with luminescence.

化学発光信号がバルクテストサンプル中で減少又は除去され得る更に別の方法で は、サンプル中に消光剤試薬ｑｕｅ−ｎｃｈｅｒ　ｒｅａｇｅｎｔを含有させる ０例えば、西洋ワサビ過酸化物酵素をラベルとして使用し、溶液中の過酸化物及 びルミノールと反応させて可視光線を発生する場合、反応は没食子酸又はチオジ グリコール酸のような競合試薬をサンプル中に加えることにより阻止され得る。In yet another way the chemiluminescent signal can be reduced or eliminated in the bulk test sample. contains a quencher reagent in the sample. For example, horseradish peroxide enzyme can be used as a label to detect peroxide and When reacting with gallic acid or thiodiluminol to generate visible light, the reaction This can be inhibited by adding a competitive reagent such as glycolic acid into the sample.

化学発光を吸収して異なる波長で発光し得る蛍光体システムを組み込むと有利で あり得る。このようなシステムは、特に適当なフィルターを通して発光を観察す る場合にバルクサンプル中に生じる光の効果を選別するのに役立ち得る。It is advantageous to incorporate phosphor systems that can absorb chemiluminescence and emit light at different wavelengths. could be. Such systems are particularly useful for observing the luminescence through suitable filters. can be useful for sorting out light effects that occur in bulk samples.

例えば、ルミノールからの青色光は黄／緑色光を発生するクマリンにより吸収さ れ得る。蛍光体は信号怒知手段又はその近傍に配置され得る。また、蛍光体をバ ルクサンプル中に分散した標識剤として使用し、化学発光の局在化発生のみを観 測できるようにしてもよい。For example, blue light from luminol is absorbed by coumarin, which produces yellow/green light. It can be done. The phosphor may be placed at or near the signal emitting means. Also, the phosphor can be It is used as a labeling agent dispersed in a luminescent sample to observe only the localized occurrence of chemiluminescence. It may also be possible to make it measurable.

本発明の関連で使用する蛍光発光剤としてはルミノール（５−アミノ−２，３− ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン）が特に好適であるが、一連の別の化合物 及び反応も使用できる０例えば、６−アミノ誘導体（イソルミノール）のような ２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオンの他の誘導体も使用できる。Fluorescent agents used in connection with the present invention include luminol (5-amino-2,3- dihydro-1,4-phthalazinedione) is particularly preferred, but a series of other compounds and reactions can also be used, such as 6-amino derivatives (isoluminol) Other derivatives of 2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione can also be used.

他の例としてはルシフェリン及びアクリジニウムエステルがある。このようなシ ステムは例えば英国特許第１５５２６０７号、英国特許出願公開第２１１２７７ ９号及び英国特許出願公告第２０９５８３０号に概括的に記載されている。一般 に、化学発光反応は短命であり、アッセイ手順に時間的制約を生じる傾向がある 。従って、例えば放射を延長又は遅延させる試薬を加えることにより、光放射の 有効なディネーション（ｄｅｎａｔｉｏｎ）を強化することが有用である。置換 基を有する６−ヒドロキシベンゾチアゾール、ｐ−ヨードフェノール、４−フェ ニルフェノール及び／又は２−クロロ−４−フェニルフェノール及び芳香族アミ ンのような化合物を使用する化学発光反応の強化はヨーロッパ特許第８７９５９ 号、同第１１６４５４号及び英国特許出願公開第２１６２９４６号に記載されて いる。　ｐ−ヨードフェノールを使用するのが特に好適である。Other examples include luciferin and acridinium esters. Such a scene For example, the stem is disclosed in British Patent No. 1552607, British Patent Application Publication No. 211277. No. 9 and UK Patent Application Publication No. 2,095,830. general However, chemiluminescent reactions tend to be short-lived and impose time constraints on assay procedures. . Thus, for example, by adding reagents that prolong or delay the emission, It is useful to strengthen effective denation. replacement 6-hydroxybenzothiazole, p-iodophenol, 4-phenylated Nylphenol and/or 2-chloro-4-phenylphenol and aromatic amines Enhancement of chemiluminescent reactions using compounds such as No. 116454 and British Patent Application No. 2162946. There is. Particular preference is given to using p-iodophenol.

本発明の重要な一態様は、化学発光反応に関与する試薬で標識した特異的結合パ ートナ−を使用する粒子ベースのアッセイ方法であり、テスト媒体中で化学発光 反応が連続的に生じるようにテスト媒体中には化学発光に不可欠な他の試薬が多 量に存在しており、こうして発生された光は標識した結合パートナ−がテスト媒 体中に均一に分散されている間はマスク又はクエンチされる。更に、該方法では 結合反応後に、粒子により担持されている複合体化標識化結合パートナ−の局在 濃度が、テスト媒体の局在マスキング又はクエンチング能力を凌駕し、従って被 験種と粒子により担持される特異的結合パートナ−との間に生じた結合の程度に 依存する性質及び／又は大きさを有する検出可能な信号を提供するに十分な光を 局在的に発生するように、検出手段に隣接するテスト媒体中に粒状キャリア物質 の局在濃度が確立される。An important aspect of the present invention is a specific binding protein labeled with a reagent involved in a chemiluminescent reaction. It is a particle-based assay method that uses toner to produce chemiluminescence in the test medium. There are many other reagents essential for chemiluminescence in the test medium so that the reaction occurs continuously. The light thus generated is detected by the labeled binding partner in the test medium. It is masked or quenched while being evenly distributed throughout the body. Furthermore, the method Localization of complexed labeled binding partners carried by particles after binding reaction concentration exceeds the local masking or quenching ability of the test medium and is therefore the degree of binding that occurs between the test species and the specific binding partner carried by the particles. sufficient light to provide a detectable signal of dependent nature and/or magnitude. Particulate carrier material in the test medium adjacent to the detection means so as to occur locally A local concentration of is established.

本発明の別の態様は、 （ａ）被験化学種の特異的結合パートナ−を担持する局在化可能な粒子（例えば 「磁性」粒子）の第１の集団、（ｂ）特異的結合パートナ−がテスト媒体中に化 学発光反応の前駆物質を連続的に発生するように標識された粒子に担持されない 特異的結合パートナ−１ （ｃ）標識した特異的結合パートナ−がテスト媒体中に分散されている間は前駆 物質に有効に競合し、こうして化学発光の発生を阻止するテスト媒体中に分散さ れたコンシューマ−試薬、及び （ｄ）前駆物質と反応して化学発光を発生し得る試薬を担持又は含有する局在化 可能な粒子の第２の集団、を使用する粒子ベースのアッセイ方法であり、該方法 では光検出手段に隣接する２つの粒子集団の共局在化により、第１の粒子集団に 担持される特異的結合パートナ−が被験種に結合した程度に依存する量だけ発生 した化学発光を観測することができる。Another aspect of the invention is (a) localizable particles (e.g. (a) a first population of "magnetic" particles) (b) a specific binding partner are present in the test medium; Precursors for chemiluminescent reactions are not loaded onto labeled particles to continuously generate Specific binding partner-1 (c) the precursor while the labeled specific binding partner is dispersed in the test medium; dispersed in the test medium that effectively competes with the substance and thus prevents the generation of chemiluminescence. consumer reagents, and (d) a localization carrying or containing a reagent capable of reacting with a precursor to generate chemiluminescence; A particle-based assay method using a second population of possible particles, the method Then, due to the colocalization of two particle populations adjacent to the photodetection means, the first particle population generated in an amount that depends on the extent to which the carried specific binding partner binds to the test species. chemiluminescence can be observed.

前述の態様では、ラベルは例えばテスト媒体中のグルコース及び酸素と反応し、 前駆物質として過酸化水素を発生するグルコースオキシダーゼであり得、コンシ ューマ−はカタラーゼ酵素であり得、結合試薬はテスト媒体中でルミノールと反 応する西洋ワサビペルオキシダーゼであり得る。In the foregoing embodiments, the label reacts with, for example, glucose and oxygen in the test medium; It may be glucose oxidase, which generates hydrogen peroxide as a precursor; The luminol can be a catalase enzyme and the binding reagent reacts with luminol in the test medium. horseradish peroxidase.

必要であれば、結合試薬は第２の集団の粒子表面に担持させてもよいし又は粒子 内にトラップさせてもよい。If desired, the binding reagent may be supported on the surface of the particles of the second population or You can also trap it inside.

例えばラベルによる信号の発生に必要な基質を加える前に免疫結合反応が生じる に十分な時間（「インキュベーション」）を設けるためには、テスト媒体中に成 分を逐次加えると有利であり得る。従って、ラベルによる信号の連続発生は必要 な基質が加えられた時に初めて生じることが理解されよう、基質を加えるのは常 に固相が検出ゾーン又は環境に再配置される以前である。信号発生の連続性は、 少なくとも固相を局在化させ且つ固相から発生される信号を検出するのに費やさ れる時間、継続していなければならない。For example, an immune binding reaction occurs before the addition of the substrate necessary for the generation of a signal by the label. To allow sufficient time (“incubation”) for the formation of It may be advantageous to add the minutes sequentially. Therefore, continuous generation of signals by labels is necessary. It will be understood that this occurs only when a specific substrate is added; before the solid phase is relocated to the detection zone or environment. The continuity of signal generation is spent at least localizing the solid phase and detecting the signal generated from the solid phase. It must be continued for as long as possible.

特異的結合反応が生じるのに必要なインキュベーション時間は試薬及び分析物の 性質、それらの相対及び絶対濃度のような多くの因子、並びに温度のような物理 的因子に依存する。これらのパラメーターは当業者に周知である。一般に、イン キュベーション時間は約１時間を越えず、はとんどの用途では３０分〜１時間の 間である。The incubation time required for the specific binding reaction to occur depends on the reagents and analytes. properties, many factors such as their relative and absolute concentrations, and physical properties such as temperature Depends on specific factors. These parameters are well known to those skilled in the art. Generally, in Curation time does not exceed approximately 1 hour, with most applications requiring 30 minutes to 1 hour. It is between.

キャリア物質の局在化は多様な方法で実施され得る。Localization of the carrier substance can be carried out in a variety of ways.

１つの簡単な態様によると、粒子を重力下で沈降させるが、この方法は結合反応 が生じている間、例えば撹拌によりテスト媒体中の粒子の均一な悲濁を維持する 必要がある。According to one simple embodiment, the particles are allowed to settle under gravity; this method Maintain a uniform turbidity of particles in the test medium, e.g. by stirring, while There is a need.

重力作用に替わる手段として遠心分離も使用できる。あるいは、多孔膜又はフィ ルターをテスト媒体のバルクに通すことにより粒子を局在化させ、こうして粒子 を小体積にまとめることもできる。更に別の方法として、磁気作用又は他の外部 から加えられる力の影響下にテスト媒体のバルク内の特定の場所に移動し得る粒 状キャリア物質を使用してもよい０粒子はドリフティングｄｒｉｆｔｉｎｇ定常 波の超音波発生によりテスト媒体を通って移動し得る。Centrifugation can also be used as an alternative to gravity. Alternatively, porous membrane or filament The particles are localized by passing the filter through the bulk of the test medium, thus can also be combined into a small volume. As a further alternative, magnetic or other external A grain that can move to a specific location within the bulk of the test medium under the influence of a force applied from 0 particle drifting steady state carrier material may be used Waves may be moved through the test medium by ultrasonic generation.

固相は任意の適当なキャリア物質から形成され得る１例えば約１ｐｍ未満から約 ３００．態量上までの広い好適な寸法の所謂「磁性」粒子（即ち磁場の影響下で 液体中を移動するように誘導され得る粒子）が市販されている０重力分離のため には、物質の密度に応じて少なくとも約５０１＋ｍ以上で約３００１以下の粒径 が好適である。特に標識したハブテンを使用するアッセイには市販のオキシラン アクリル酸ビーズが特に好適である。このような固相キャリアをイムノグロブリ ンのような結合試薬に感作及び／又は結合する技術は当該技術分野で周知の標準 技術であるので、本発明の構成要素とはしない。The solid phase may be formed from any suitable carrier material, e.g. from less than about 1 pm to about 300. So-called "magnetic" particles of a wide range of suitable dimensions (i.e. under the influence of a magnetic field) For commercially available zero gravity separations (particles that can be induced to move through a liquid) has a particle size of at least about 501+ m or more and about 3001 m or less, depending on the density of the material. is suitable. Commercially available oxiranes are used specifically for assays using labeled habten. Acrylic acid beads are particularly suitable. Immunoglobulin using such a solid phase carrier Techniques for sensitizing and/or conjugating to binding reagents such as Since it is a technology, it is not considered as a component of the present invention.

本発明が適用され得る分析物の範囲は広い。単なる例示として以下のものが挙げ られる。妊娠中に関係があるがあるいは生殖に影響するステロイドホルモン、例 えばプロゲステロン及びエストロゲン、エストロン−３−グルクロニド及びプレ グナンジオール−３−グルクロニドのような尿代謝物、ヒト絨毛性性腺刺激ホル モン、黄体形成ホルモン及び卵胞刺激ホルモンのようなペプチドホルモン、尿ア ルブミン、β−２ミクログロブリン及びレチノール結合タンパク質のようなタン パク質。その検出が心血管監視に有益な高密度及び低密度リポタンパク質、及び 心トロボニン。Ｒｕｂｅｌｌａ抗体及び７抗体のような６染疾患マーカー。モノ クローナル抗体のようなイムノグロブリン。The range of analytes to which the present invention can be applied is wide. The following are listed as mere examples: It will be done. Steroid hormones that are relevant during pregnancy or affect reproduction, e.g. For example, progesterone and estrogen, estrone-3-glucuronide and pre- Urinary metabolites such as gnanediol-3-glucuronide, human chorionic gonadotropin Peptide hormones such as luteinizing hormone and follicle-stimulating hormone, urinary Proteins such as rubumin, beta-2 microglobulin and retinol binding protein Pak quality. high-density and low-density lipoproteins, the detection of which is useful for cardiovascular monitoring, and Cardiac trobonin. 6-stained disease markers such as Rubella antibody and 7 antibody. mono Immunoglobulins such as clonal antibodies.

従って、テスト媒体は各種のソース、特に尿、血清及び血漿のような体液から得 られる０本発明は特に、例えばモノクローナル抗体の産生におけるイムノグロブ リンの細胞培養培地のスクリーニングに適用され得る。Therefore, test media can be obtained from various sources, especially body fluids such as urine, serum and plasma. The invention particularly relates to the use of immunoglobulins, e.g. in the production of monoclonal antibodies. It can be applied to screening cell culture media for phosphorus.

特異的結合パートナ−はポリクローナルもしくはモノクローナル抗体又は抗原、 レクチン、又はホルモン及びそのレセプターであり得る。このような物質は当該 技術分野で周知であり、多くのものが市販されているので、それらの厳密な性質 は本発明の構成要素としない。the specific binding partner is a polyclonal or monoclonal antibody or an antigen; It can be a lectin, or a hormone and its receptor. Such substances are Their exact nature is well known in the art and many are commercially available. are not considered as constituent elements of the present invention.

分析物を含有している疑いのあるサンプルが可変性質である場合（例えば血清及 び尿）、あるいは特異的結合反応又は観測可能な信号の発生に干渉し得る成分を 含んでいる場合、本発明のアッセイ方法を適用する前に、このような干渉の可能 性を減少させるためにサンプルを例えば水又は緩衝液で希釈すると有利であり得 る。If the sample suspected of containing the analyte is of variable nature (e.g. serum or or contain components that may interfere with the specific binding reaction or the generation of an observable signal. If possible, such interference should be evaluated before applying the assay method of the present invention. It may be advantageous to dilute the sample with e.g. water or a buffer to reduce the Ru.

本発明のアッセイテストキットは、例えば再使用可能なセル又は複数のこのよう なセルと信号恩知手段（例えば電りの組み合わせ、あるいは再使用可能な悪用手 段に向かう信号を透過し得る膜を内蔵する使い捨てセル、あるいは完全に使い捨 てのセルと信号感知手段との組み合わせから構成され得る。必要に応じて例えば 固相又は他の必須成分のような適当な試薬を備えてもよい。The assay test kit of the invention comprises, for example, a reusable cell or a plurality of such cells. suitable cell and signal detection means (e.g. combination of electricity or reusable exploits) Disposable cells with membranes that are transparent to the signal destined for the stage, or completely disposable. It may consist of a combination of all cells and signal sensing means. For example if necessary Appropriate reagents such as a solid phase or other essential components may also be provided.

本発明の種々の特徴は下記の実施例によって明らかにされよう。Various features of the invention will be made clear by the following examples.

天」１伝」一 本発明の原理は、添付図面の第１図に示した装置を用いて説明することができる 。Ten'1 Legend'1 The principles of the invention may be explained using the apparatus shown in FIG. 1 of the accompanying drawings. .

この装置は、成る量の液体テスト媒体１０２を収容したセル１０１（ここでは矩 形状であるが、実際には任意の形態を有し得る）を含んでいる。セル１０１の１ つの壁１０３の内面にはプラチナ箔電極１０４が配置されている。この電極１０ ４は接続線１０５を介して、セル１０１の外側のポーラログラフ分析器（図示せ ず）に接続される。テスト媒体１０２の中にはセル１０１の開放上部からプラチ ナ対電極１０７とｌ／塩化銀基準電極１０８とが浸漬されている。セル内の物質 の分散を助けるために撹拌機１０９も具備されている。セルの外側では電極詔＝ ＝１１０４のすぐ近傍に可動棒磁石１１０を随意に配置し得る。The device comprises a cell 101 (here a rectangular cell) containing a volume of liquid test medium 102. shape, but can actually have any shape). Cell 101-1 Platinum foil electrodes 104 are arranged on the inner surfaces of the two walls 103. This electrode 10 4 is connected to a polarographic analyzer (not shown) outside the cell 101 via a connecting line 105. ). Plasma is inserted into the test medium 102 from the open top of the cell 101. A counter electrode 107 and a l/silver chloride reference electrode 108 are immersed. substance inside the cell A stirrer 109 is also provided to aid in the dispersion of the liquid. Outside the cell, the electrodes = A movable bar magnet 110 may optionally be placed in the immediate vicinity of =1104.

プラチナ箔電極１０４は＋０．７ボルトの電圧にセットし得、その状態で過酸化 水素の存在を検出できる。The platinum foil electrode 104 can be set to a voltage of +0.7 volts, at which point the peroxide Can detect the presence of hydrogen.

テスト媒体が免疫結合対の一方のメンバーを担持する磁性微粒子を含んでいる場 合には、前記粒子が該テスト媒体中に均一に分散される間に結合反応が生起し得 る。その後磁石１１０を導入すれば、前記磁性粒子を検出電極１０４のすぐ近傍 に局在させることができる。If the test medium contains magnetic microparticles carrying one member of an immune binding pair, In some cases, a binding reaction may occur while the particles are uniformly dispersed in the test medium. Ru. If the magnet 110 is then introduced, the magnetic particles will be brought into the immediate vicinity of the detection electrode 104. can be localized.

このような装置を使用して下記の実験を行った。The following experiment was conducted using such an apparatus.

材１＾でΣ杭抹− Ｐｏｕｒｆａｒｚａｎｅｈ他の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｃａｌ　Ａｎａｌｙ−ｓｉｓ、１９８２．硯、２６７−２９５）で製造した磁性 粒子を過ヨウ素酸で酸化して表面アルデヒド基を形成し、これに市販のアビジン を結合させた。この結合操作は、蒸留水１２．５＋ａｌ中の洗浄した粒子５００ ｍｇを蒸留水５ｍｌ中の過ヨウ素酸ナトリウム４００１ｇで処理することによっ て実施した。転倒混合ｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ　ｍｉｘｉｎｇを行いながら、 この処理を暗所、室温で１時間続けた。過剰の過ヨウ素酸塩溶液を除去した後、 酸化粒子を蒸留水で２回、ｐＨ９，０のホウ酸塩緩衝液で３回洗浄し、その後ア ビジンのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９，０）中温液（２ｍｇ／ｍｌ）を２５１加えた 。この結合反応を転倒ミキサー内で、室温で１時間生起させ、その後未結合アビ ジンを除去し、粒子をホウ酸塩緩衝液で５回洗浄した。残留アルデヒド基は先ず 過剰量の水素化ホウ素ナトリウムで還元しくその結果アビジン−セルロース結合 も安定した）、次いでｐＨ９，０のエタノールアミン０．１１と反応させること によって除去した。最後に、０．１５％の’　Ｔｗｅｅｎ　２０　Ｊを含むリン 酸塩緩衝液（ＰＢＳＴ＞中に前記粒子を５００ｍｇ７２５ｍｌの濃度で懸濁させ た。この処理の各段階で磁気分離を用いて試薬溶液及び洗浄液を粒子から除去し た。その後の使用時には、粒子が均一に懸濁されるように、このストック調製物 をサンプル採取直前に激しく撹拌した。Σ pile with 1^ material Methods or Biochemistry of Pourfarzaneh et al. cal Analysis-sis, 1982. Magnetism made with inkstone, 267-295) The particles were oxidized with periodic acid to form surface aldehyde groups, which were then treated with commercially available avidin. were combined. This binding operation was carried out using 500% of the washed particles in 12.5+al of distilled water. mg by treating with 4001 g of sodium periodate in 5 ml of distilled water. It was carried out. While performing end-over-end mixing, This treatment continued for 1 hour at room temperature in the dark. After removing excess periodate solution, The oxidized particles were washed twice with distilled water and three times with borate buffer, pH 9.0, and then washed with A medium-temperature solution (2 mg/ml) of Vidin in borate buffer (pH 9,0) was added. . The binding reaction was allowed to occur in an end-over-end mixer for 1 hour at room temperature, after which unbound Gin was removed and the particles were washed five times with borate buffer. The residual aldehyde group is first Reduction with excess sodium borohydride results in avidin-cellulose bonding. (also stabilized), then reacted with ethanolamine 0.11 at pH 9.0 removed by. Finally, rinsing containing 0.15% 'Tween 20J Suspend the particles at a concentration of 500 mg and 725 ml in salt buffer (PBST). Ta. At each stage of this process, magnetic separation is used to remove reagent solutions and wash solutions from the particles. Ta. For subsequent use, this stock preparation should be used to ensure that the particles are evenly suspended. was vigorously stirred immediately before sample collection.

此釦制 凍結乾燥粉末として市販されているビオチニル化グルコースオキシダーゼを入手 した。これにはタンパク質ＩＢ当たり約２０ｎｍｏｌのビオチンが含まれている 。使用直前にこの粉末を指示に従って液体状に戻し、ＰＢＳＴで希釈した。This button system Obtain biotinylated glucose oxidase commercially available as lyophilized powder did. It contains approximately 20 nmol of biotin per protein IB. . Immediately before use, the powder was reconstituted as a liquid according to the instructions and diluted with PBST.

立！ｊ濾二ニー 精製粉末として市販されているウシ肝臓カタラーゼを入手した。　ＰＢＳ中使用 溶液（ｗｏｒｋｉｎｇ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）は毎日新しく調製した。Stand! j filtration Bovine liver catalase, which is commercially available as a purified powder, was obtained. Used during PBS Working solutions were prepared fresh each day.

くＪ二しンー 結晶質固体として市販されているｄ−ビオチンを入手し、正確に計量したビオチ ンをＰＢＳ中に溶解して得た基準溶液を希釈することによって、適当な濃度の溶 液を調製した。KuJ Nishin Obtain commercially available d-biotin as a crystalline solid and accurately weigh biotin. The appropriate concentration of the solution is obtained by diluting the reference solution obtained by dissolving the sample in PBS. A liquid was prepared.

【双１船 １．０ｍｇ／ｍｌのグルコースと２．ｈｇ（約２５単位／鵬ｌ）のカタラーゼと を含むＰＢＳに前記粒子、抱合体及びサンプルを懸濁させた。これらの溶液及び 反応体はいずれもアジ化ナトリウムを含んでいなかった。[Twin 1 ship 1.0 mg/ml glucose and 2. hg (approximately 25 units/pengl) of catalase and The particles, conjugate, and sample were suspended in PBS containing PBS. These solutions and None of the reactants contained sodium azide.

７　Ｌ立ｍ 液体状に戻したストック溶液ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ　５ｔｏｃｋｓｏｌｕ ｔｉｏｎをＰＢＳＴのみ１０−１の中に溶解した溶液１００ｕ　ｌ　（最大の抱 合体結合信号を与える）、又は遊離ビオチン１０ｈｇを含むＰＢＳ７１０ｍｌの 中に溶解した溶液１０ｈｌ（絶対最小完全阻害信号を与える）で希釈することに よって、ビオチン−グルコースオキシダーゼ抱合体溶液を調製した。これらの溶 液１００．１にアビジン−磁性粒子のストック懸濁液１００μｍを加えて１０分 以上（結合を生起させるため）した後で、この混合物を３．８輪１の反応媒体と 共に電気化学セル内に配置した。この時点でポーラログラフ分析器及びレコーダ のスイッチを入れて、電極に到達するＨ２Ｏ，の量をモニターした。ベースライ ンが平坦になったら磁石を適用して、磁気の誘引力により粒子を電極の表面に気 めた。磁石を除去し且つ溶液を撹拌すれば、粒子を再び懸濁状態に戻すことがで きる。7 L standing m Stock solution reconstituted 5tocksolu 100ul of solution of ion dissolved in PBST only (10-1) (maximum retention) give a combined binding signal), or 710 ml of PBS containing 10 hg of free biotin. diluted with 10 hl of solution (gives the absolute minimum complete inhibition signal) Therefore, a biotin-glucose oxidase conjugate solution was prepared. These melts Add 100 μm of stock suspension of avidin-magnetic particles to solution 100.1 and incubate for 10 minutes. After this (to cause bonding), mix this mixture with 3.8 wheels 1 of reaction medium. Both were placed in an electrochemical cell. At this point the polarographic analyzer and recorder was turned on and the amount of H2O reaching the electrode was monitored. bass rye Once the electrode is flat, a magnet is applied to attract the particles to the surface of the electrode through magnetic attraction. I met. By removing the magnet and stirring the solution, the particles can be brought back into suspension. Wear.

直ｌ 第２図の線Ａはポーラログラフ分析器によって得られる典型的トレースを示して いる。磁石を導入すると（点２０１）反応が急激に約Ｏ，４Ｕ＾上がった。これ は、電極の近傍で過酸化物が大量に生成されていることを意味する。点２０２で 磁石を除去すると、粒子はかなり急速にテスト媒体中に再分散された。従って反 応はバックグラウンドレベル２０３に落ち、このレベルはカタラーゼによって完 全には破壊されていないテスト媒体中での過酸化物の漸進的生成に伴い均一の低 速度で上昇していった１点２０４で磁石を再導入する東 と、同じ反応が点２０５まで得られ、その後磁石を再び除去した。その結果反応 は、先のバックグラウンドレベルよりほんの僅か上のバックグラウンドレベルに 戻った。セル内のＨ２Ｏ２の正味の生成量は全体としては同じであったが、固相 への結合とそれに次ぐ検出点での固相の局在化とに起因して抱合体が非対称的に 分布されたため、電極に得られるようになるＨ２Ｏ２の割合が明らかに増加した 。Director Line A in Figure 2 shows a typical trace obtained by a polarographic analyzer. There is. When a magnet was introduced (point 201), the reaction suddenly increased by about O.4 U^. this means that a large amount of peroxide is generated near the electrode. At point 202 Upon removal of the magnet, the particles redispersed into the test medium fairly rapidly. Therefore, anti The response drops to a background level of 203, and this level is completed by catalase. A uniform low temperature with gradual formation of peroxide in the test medium that is not completely destroyed. East reintroduces the magnet at one point 204, which increases in speed. The same reaction was obtained up to point 205, after which the magnet was removed again. resulting reaction is set to a background level just slightly above the previous background level. I'm back. Although the net production of H2O2 in the cell was the same overall, the solid phase The conjugate asymmetrically due to binding to and subsequent localization of the solid phase at the detection point. Because of the distribution, the proportion of H2O2 that became available at the electrode increased obviously. .

テスト媒体が遊離無標識ビオチンを過剰に含む場合には全く異なるトレース（線 Ｂ）が得られた。このビオチンが競合的にアビジンと結合したため、磁性粒子の 殆どはグルコースオキシダーゼで標識したビオチンを極めて少ししか含まない複 合体を担持していた。この場合は、１を極により検出される過酸化物のバックグ ラウンドレベルが実験の間に明らかに下降した。磁性粒子が検出電極の近傍に局 在しても過酸化物が大量に蓄積されることはなかった。これは、標語ビオチンの 殆どがテスト媒体中に分散された状態を維持し、従ってＨ２Ｏ２発生グルコース オキシダーゼの分布が粒子の位置に拘わらず対称状態を維持したからである。A completely different trace (line B) was obtained. This biotin competitively binds to avidin, causing the magnetic particles to Most are complex compounds that contain very little biotin and are labeled with glucose oxidase. It was responsible for the union. In this case, 1 is the background of peroxide detected by the electrode. The round level clearly decreased during the experiment. Magnetic particles are localized near the detection electrode. Even when present, large amounts of peroxide did not accumulate. This is based on the slogan biotin. Most of the glucose remains dispersed in the test medium and therefore H2O2 evolved glucose This is because the distribution of oxidase remained symmetrical regardless of the particle position.

え１匠ｉ このシステムでも試薬、溶液及び方法は総て実施例１°の場合と同じである。但 し、電極の形態及び配置は異なる。E1 Takumi i In this system, all reagents, solutions, and methods were the same as in Example 1°. However, However, the shape and arrangement of the electrodes are different.

ここでは、成る長さのプラチナワイヤを酢酸セルロースのアセトン溶液中に浸漬 し、これを取り出す際に液面下にあったワイヤ部分全体が溶液の層によって被覆 されるようにした。アセトンを蒸発させ、プラチナを被覆する酢酸セルロースの 連続膜を残して、潜在的な妨害分子は遮断するが８２０□は通過させるようなバ リヤを得た。Here, a length of platinum wire consisting of immersed in an acetone solution of cellulose acetate When the wire was removed, the entire part of the wire that was under the liquid surface was covered with a layer of solution. I made it so that it would be done. Evaporate the acetone and prepare cellulose acetate to coat the platinum. Leave a continuous membrane to block potential interfering molecules but allow 820□ to pass through. I got Riya.

このようにコーティングしたワイヤをポリスチレンセメントでセルの上部の角に 付着させた。このような配置では、磁石の極を前記角の外側に配置すれば粒子を 電極に誘引することができる。その結果、粒子が電極の周りに房状に集まった。Place the coated wire in this way in the top corner of the cell with polystyrene cement. Attached. In such an arrangement, if the poles of the magnet are placed outside the corner, the particles will be It can be attracted to electrodes. As a result, particles clustered around the electrode.

最大及び最小結合の効果を示すための実験を実施例１と同様の方法で繰り逐えし た。結果は実施例１と類似していたが、この反応の大きさの方が大きかった。こ れは、電極と酵素担持粒子との間の相互作用がより効果的だからだと考えられる 。Ｎｆｉの表面積がより小さく且つ酢酸セルロースの膜が存在しているにも拘わ らずこうだったのである。Experiments to demonstrate the effects of maximum and minimum coupling were repeated in the same manner as in Example 1. Ta. The results were similar to Example 1, but the magnitude of this reaction was greater. child This may be due to the more effective interaction between the electrode and the enzyme-loaded particles. . Despite the smaller surface area of Nfi and the presence of a cellulose acetate membrane, It was Zuko.

えＩ１支 この実施例では、重力による粒子の局在化を説明する。E I1 branch This example describes particle localization due to gravity.

使用した装置はＲａｎｋ　Ｏｘｙｇｅｎ　Ｅｌｅｃｒｏｄｅを少し改変したもの であり、第４図に断立面図で示した。この装置は、上端４０２が完全に開放され 且つ下端４０３が部分的に開放された直立型円筒形ウォータージャケットスリー ブ４０１を含む、下端４０３は該スリーブの内面４０５の環状延長部４０４によ って部分的に閉鎖され、中央円形開口４０６が残されている。このスリーブ４０ １は外壁４０９の下端４０８の周縁に延在する外側フランジ４０７を備え、円筒 形ベース４１１の上表面４１０に端と端を合わせた状態で接合される。スリーブ ４０１及びベース４１１は外側リング４１２によって互いに固定することができ る。The device used was a slightly modified version of Rank Oxygen Elecrod. This is shown in cross-sectional elevation in FIG. This device is completely open at the top end 402. and an upright cylindrical water jacket sleeve whose lower end 403 is partially open. The lower end 403 includes an annular extension 404 of the inner surface 405 of the sleeve. is partially closed, leaving a central circular opening 406. This sleeve 40 1 has an outer flange 407 extending around the periphery of the lower end 408 of the outer wall 409, and has a cylindrical shape. It is joined end to end to the upper surface 410 of the shaped base 411. sleeve 401 and base 411 can be fixed to each other by outer ring 412. Ru.

このリングは内側にネジ山を備え、ベース４１１の外面４１４のネジ山付き部分 ４１３と係合する。このリングはまた内側環状リップ４１５も備え、このリップ が前記スリーブのフランジ４０７上に載置される。ベース４１１の下方部分は磁 気撹拌機駆動手段４１７を収容すべく中央に凹部４１５を有する。This ring is internally threaded and has a threaded portion on the outer surface 414 of the base 411. 413. The ring also includes an inner annular lip 415, which lip is placed on the flange 407 of the sleeve. The lower part of the base 411 is magnetic. It has a recess 415 in the center to accommodate the air agitator drive means 417.

ベース４１１の上表面４１０の中央にはプラチナボタン電極４１８が配置される 。この電極は、組立て後の装置では、スリーブ４０１の部分的に閉鎖された下端 ４０３の中央開口４０６の中に配置される。電極４１８からは電気接続線４１９ がベース４１１を貫通してポーラログラフ分析器（図示せず）まで延びる。ベー ス４１１には銀リング電極４２０がプラチナ電Ｗ　４１８と同心的に、但し距離 をおいて配置される０組立て後の装置では、リング電極４２０は環状延長部４０ ４の下に配置される。A platinum button electrode 418 is disposed at the center of the upper surface 410 of the base 411. . This electrode is located at the partially closed lower end of the sleeve 401 in the assembled device. 403 is located within the central opening 406 of 403 . From the electrode 418 is an electrical connection line 419 extends through the base 411 to a polarographic analyzer (not shown). Bae A silver ring electrode 420 is placed concentrically with the platinum electrode W 418 at the base 411, but at a distance. In the assembled device, the ring electrode 420 is located at a distance from the annular extension 40. It is placed under 4.

このリング電極４２０がセル４２１（スリーブ４０１及びベース４１１からなる ）内の任意の流体と容易に接触できるようにするために、環状延長部４０４に複 数の穴４２２を設けた。第４図にはこれらの六のうち２つが示されている。リン グ電ｉ　４２０からは第２の電気接続！　４２３がベース４１１を貫通して延び る。This ring electrode 420 is a cell 421 (consisting of a sleeve 401 and a base 411). ) in the annular extension 404 to facilitate contact with any fluid within the annular extension 404. A number of holes 422 were provided. Two of these six are shown in FIG. Rin Second electrical connection from Guden i420! 423 extends through the base 411 Ru.

スリーブ４０１及びベース４１１の間にはＭ　４２４　（標準的実験室透析膜か らなる）が挟持され、前記電極を両方共被覆する。Between the sleeve 401 and the base 411 is M424 (a standard laboratory dialysis membrane). ) are sandwiched and cover both of the electrodes.

磁気撹拌機の棒４２５はセル４２１のスリーブ内に配置され、撹拌機ヘッド４１ ７によって作動し得る。A magnetic stirrer rod 425 is placed within the sleeve of the cell 421 and is connected to the stirrer head 41. 7.

材」Ｌ又でＬｔ法− 固相は、卵白から得たアビジンをエポキシで活性化した市販のアガロースに結合 したもの（直径１０〜１８０ミクロン）であり、１〜２ｘｌＯ’／＋ｓｌの粒子 を含み、１ｍｌ当たり２０．ｇのビオチン結合能力を有していた。Lt method with L-mata material The solid phase is avidin obtained from egg white bound to commercially available epoxy-activated agarose. particles (10-180 microns in diameter) and 1-2xlO'/+sl Contains 20.0ml per ml. It had a biotin-binding ability of g.

抱合体、カタラーゼ及びビオチンは実施例１の場合と全く同じものを使用した。The conjugate, catalase and biotin used were exactly the same as in Example 1.

抱合体及びビオチン溶液を含むリン酸塩Ｍｌｌ液（ＰＢＳ）１ｍｌ中のアビジン −アガロース（５０ｕｌのゲル）からアッセイ媒体を調製し、室温でインキュベ ートした。各実験毎に、予備インキュベートしたゲル／抱合体／ビオチン溶液の ２５．　Ｉアリコートを、グルコース５Ｂ／ｓ＋１とカタラーゼ１０．ｇとを含 むＰＢＳ２．５＋Ｉに添加した。これは、合計でゲルｉｏｕ　ｌとグルコ−イン Ｈ２０□濃度を簾定し、手に保持した磁石を用いて磁気撹拌機の棒を取り除いた 後で、局在信号を測定した。この磁気棒を再配置して粒子を再び撹拌し、成分を 再分布させた。Avidin in 1 ml of phosphate Mll solution (PBS) containing conjugate and biotin solution. - Prepare assay medium from agarose (50 ul of gel) and incubate at room temperature. I started. For each experiment, prepare a pre-incubated gel/conjugate/biotin solution. 25. I aliquot was mixed with glucose 5B/s+1 and catalase 10. g and The mixture was added to PBS2.5+I. This is the total amount of gel ioul and glucoin. The H20□ concentration was determined and the magnetic stirrer bar was removed using a hand-held magnet. Later, localization signals were measured. Reposition the magnetic bar to stir the particles again and mix the ingredients. redistributed.

磁気棒を取り出すと必ず、粒子が電極被覆膜上に極めて急速に沈澱した。Whenever the magnetic bar was removed, particles were deposited very quickly onto the electrode coating.

この実験で得られた典型的トレースを第３図に示す。A typical trace obtained in this experiment is shown in FIG.

撹拌機を作動させながらプラチナ電極によって検出した過酸化水素の「定常状態 」は平坦なベースライン３０１によって示されている０点３０２で磁気撹拌機棒 をセルから取り出すと、粒状キャリア物質が重力によって即刻沈澱した。過酸化 水素がすぐにプラチナ電極の直近傍で蓄積し始め１反応が急激に上昇した。点３ ０３で撹拌機の棒をセル内に再導入すると粒状物質が分散した０反応はその後元 のベースライン３０４まで急速に下降した。その後のサイクルから明らかなよう に、この効果は撹拌機棒の連続的出し入れに伴って完全に再現される。``Steady state'' of hydrogen peroxide detected by a platinum electrode while the stirrer was running. ” is a magnetic stirrer bar at the zero point 302 indicated by a flat baseline 301 When removed from the cell, the particulate carrier material immediately precipitated by gravity. peroxide Hydrogen immediately began to accumulate in the immediate vicinity of the platinum electrode and the 1 reaction increased rapidly. Point 3 When the stirrer rod was reintroduced into the cell at 03, the 0 reaction in which particulate matter was dispersed was then restored. rapidly decreased to the baseline of 304. As is clear from subsequent cycles This effect is perfectly reproduced with continuous insertion and removal of the stirrer rod.

３つの測定結果の平均値を下記の表１に示す。The average value of the three measurement results is shown in Table 1 below.

１０μｇ／ｍｌ　ビオチン　Ｏ １ｕｇ／＋＊ｌ　ビオチン　２３．７ １００ｎｇ／ｍｌ　ビオチン　１２５．９Ｌｏｎｇ／ｍｌ　ビオチン　１４５． ３無ビオチン　１７４．２ えＩ匠り この実施例では、分析物としてのエストロン−３−グルクロニド（Ｅ３Ｇ）の測 定を説明する。10μg/ml biotin O 1ug/+*l Biotin 23.7 100ng/ml Biotin 125.9Long/ml Biotin 145. 3 No biotin 174.2 I'm a craftsman This example describes the measurement of estrone-3-glucuronide (E3G) as an analyte. Explain the definition.

使用した装置は実施例３と同じであるが、磁気撹拌機に代えて機械的トップ駆動 撹拌機を使用した。また、電極システムは、セルの底表面全体を被覆する単一の 平たいディスク状プラチナ作動電極と、上部からセル中に浸漬されるプラチナ対 電極と銀／塩化銀基準電極とで構成した。The equipment used was the same as in Example 3, but with a mechanical top drive instead of a magnetic stirrer. A stirrer was used. Additionally, the electrode system consists of a single electrode that covers the entire bottom surface of the cell. A flat disk-shaped platinum working electrode and a platinum pair immersed into the cell from the top. It consisted of an electrode and a silver/silver chloride reference electrode.

Ｉ側 市販のオキシランアクリルビーズ（エポキシで活性化）を入手し、これをウサギ 抗マウス血清のＴｇＧフラクションに結合した。この抗体結合ビーズをｐＨ７， １のリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）中に貯蔵した。I side Obtain commercially available oxirane acrylic beads (activated with epoxy) and apply them to the rabbit. Bound to the TgG fraction of anti-mouse serum. The antibody-coupled beads were washed at pH 7, 1 in phosphate buffered saline (PBS).

抱イＬ体− ５ＰＤＰ法を改変して、即ちグルクロニドのカルボキシル基をピリジルチオアミ ン誘導体及び水溶性カルボジイミドと反応させることによって活性化させる方法 により、ＥＧ３をグルコースオキシダーゼに化学的に結合させた。得られた抱合 体はＥＧ３に対するモノクローナル抗体に結合することができ、グルコースオキ シダーゼ活性を殆ど完全に保持していた。これを＋４℃でＰＢＳ溶液として貯蔵 し、アリコートを毎日必要に応じて使用濃度ｗｏｒｋｉｎｇ　ｓｔｒｅｎｇｔｈ に希釈した。Hug L body 5PDP method was modified, i.e., the carboxyl group of the glucuronide was replaced with pyridylthioamide. Activation method by reacting with a carbon derivative and a water-soluble carbodiimide EG3 was chemically coupled to glucose oxidase. the resulting conjugation The body can bind to monoclonal antibodies against EG3 and Sidase activity was almost completely retained. Store this as a PBS solution at +4°C. and aliquot daily as needed for working strength. diluted to

モノクローナル 遊Ｍ　ＥＧ３に対する特異性をもつマウスモノクローナル抗体を、イムノゲンと してＥＧ３／ＢＳ＾抱合体を用いて従来の方法で作成した。このハイブリドーマ 細胞を無血清培養培地で成長させ、モノクローナル抗体をイオン交換クロマトグ ラフィーによって単離した。monoclonal A mouse monoclonal antibody with specificity for EG3 was used as an immunogen. was prepared using a conventional method using an EG3/BS^ conjugate. This hybridoma Cells were grown in serum-free culture medium and monoclonal antibodies were chromatographed using ion-exchange chromatography. isolated by Rafi.

ＬＬｉ二覧 精製粉末として市販されているウシ肝臓カタラーゼを入手した。ＰＢＳ中使用溶 液は毎日新しく調製した。LLi list Bovine liver catalase, which is commercially available as a purified powder, was obtained. Dissolved in PBS The solution was prepared fresh every day.

乙ムｍ ＥＧ３含有テストサンプル１００１１１に、ＥＣ３／グルコ一スオキシダーゼ抱 合体（１１５０希釈物）と６５０．ｇ／論１の抗ＥＣ３抗体とを含むＰＢＳを５ ０μＩ加えた。室温で３０分インキュベートした後、該反応混合物に２０．１の 固相懸濁液（１ｍｇ）を加え、この混合物全体を更に３０分間転転倒台にかけた 。この時点で、ＰＢＳｌ、２１中の使用濃度（夫々１５０Ｊ及び６，０００単位 ）のグルコース及びカタラーゼを添加し、このサンプル全体をセルに移した。otomu m EG3-containing test sample 100111 contains EC3/glucose oxidase. Combined (1150 dilution) and 650. 5 g of PBS containing anti-EC3 antibody of theory 1. 0μI was added. After incubating for 30 minutes at room temperature, the reaction mixture was charged with 20.1 The solid phase suspension (1 mg) was added and the entire mixture was placed on an inversion table for an additional 30 min. . At this point, the working concentrations in PBSl, 21 (150 J and 6,000 units, respectively) ) of glucose and catalase were added and the entire sample was transferred to the cell.

セル内の物質を撹拌しながら定常状態ベースライン過酸化物レベルを確定した。Steady state baseline peroxide levels were established while stirring the material in the cell.

撹拌を停止して粒状固相を電極被覆膜上に沈澱させた。得られた信号をストリッ プチャートレコーダのトレースから得た任官単位ａｒｂｉｔｒａｒｙ　ｕｈｉｔ ！表される過酸化物生成率として記録した。標準曲線を確定すべく、成る濃度範 囲（３ｎｇ／ｍｌ〜１　、ＯＯＯｎｇ／ｍｌ）のＥ３Ｇを用いて一連のサンプル を調製し、各サンプルを３点ずつ用意してアッセイを実施した。Stirring was stopped to allow the particulate solid phase to settle onto the electrode coating membrane. Strip the obtained signal. Unit of appointment obtained from the trace of the chart recorder Uhit ! It was recorded as the expressed peroxide production rate. To establish a standard curve, a concentration range consisting of A series of samples using E3G of The assay was performed using three samples of each sample.

得られた結果を第５図に示す。The results obtained are shown in FIG.

え創九ｉ この実施例では、ゲルから可視光を発光させることになる化学反応によって過酸 化物を検出できるゲル層上に粒状キャリアを局在させることによって検出可能な 過酸化水素信号を発生させる方法を説明する。キャリア物質がサンプル中に分散 している間に遊離カタラーゼ酵素を用いて過酸化物を破壊し、バルクサンプルか らの信号を総て消去する。E Sokui In this example, a chemical reaction that causes visible light to be emitted from the gel can be detected by localizing particulate carriers on a gel layer that can detect compounds. A method for generating a hydrogen peroxide signal will be explained. Carrier material dispersed throughout the sample Free catalase enzyme is used to destroy the peroxide while the bulk sample is Erase all signals from them.

基本的アッセイ用セルとしては、−組の閉鎖し得る小さい透明プラスチックサン プル管を使用する。これらの管の正確な大きさは重要ではないが、通常は直径が 約ｌａｗ、高さが約３ｃｍである。容管の底に少量（例えば０．１５ｍ１）のア ガロース検出ゲルを流し込む。The basic assay cell consists of - a set of small, closable, transparent plastic cells; Use a pull tube. The exact size of these tubes is not critical, but they usually have a diameter of It is about 3cm tall and about 3cm tall. Add a small amount (e.g. 0.15ml) to the bottom of the container. Pour the galose detection gel.

市販のエポキシ活性化オキシランアクリルビーズ（１００〜２００１ｓの大きさ ）を鶏卵から抽出したアビジンにより、ビーズ乾燥重ｆｌｏｇ当たり１６Ｂのア ビジンの割合で感作したものを使用した。このアビジン結合ビーズは、ｐＨ７， １のリン酸塩Ｍ衝液（ＰＢＳ）中に貯蔵し得る。Commercially available epoxy activated oxirane acrylic beads (size 100-2001s ) with avidin extracted from chicken eggs, 16B of a The one sensitized with the proportion of Vidin was used. The avidin-conjugated beads have a pH of 7, 1 in phosphate M buffer (PBS).

此１船 凍結乾燥粉末形状を有し、タンパク質１ｍｇ当たり約２０ｎｍｏｌのビオチンを 含む市販のビオチニル化グルコースオキシダーゼを使用した。これは指示に従っ て使用直前に液体状に戻し、ＰＢＳＴで希釈する。This one ship It has a lyophilized powder form and contains approximately 20 nmol of biotin per mg of protein. A commercially available biotinylated glucose oxidase was used. This is according to the instructions Just before use, reconstitute the liquid and dilute with PBST.

ｕｔ九乙 結晶質固体として市販されているｄ−ビオチンを使用し、精秤したビオチンをＰ ＢＳ中に溶解したものからなる基準溶液を希釈して適当な濃度の溶液を調製する 。ビオチン濃度は例えば５ｎｇ／■Ｉ〜１１００ｎ／ｍｌの範囲で変える。ut Kuotsu Using d-biotin, which is commercially available as a crystalline solid, precisely weighed biotin was Prepare a solution with an appropriate concentration by diluting a standard solution consisting of dissolved in BS. . The biotin concentration is varied, for example, in the range of 5 ng/I to 1100 n/ml.

１此吐乞［ 成る量のゲルを製造する。このゲルは１．２５ｍＭのルミノールと０．００５単 位のカプセル化ホースラディシュ過酸化物酵素とを含む、カプセル化１（ＲＰは 市販されており−、ポリアミドのミクロカプセル（直径２０〜８０１１）内に湿 潤固体−半蟲←繭ＩＢ当たり０．６５６単位の割合で封入した酵素からなる。前 記カプセルの膜は半透性であり、過酸化水素のごとき小分子は自由に拡散させる が、１０，０００より大きい分子量の分子は保持する。1 This beggar [ A quantity of gel is produced. This gel was prepared with 1.25mM luminol and 0.005mM luminol. Encapsulation 1 (RP is It is commercially available and contains moisture in polyamide microcapsules (diameter 20-8011). Water solid - Hanmushi ← Consists of enzymes encapsulated at a ratio of 0.656 units per cocoon IB. Before The membrane of the capsule is semipermeable, allowing small molecules such as hydrogen peroxide to diffuse freely. However, molecules with molecular weights greater than 10,000 are retained.

乙Ｌ（光りえ アビジンで感作したビーズのサンプルを遠心分離にかけて上澄みを除去する。ケ ルトロールの０．０５％緩衝溶液を加えて５０１５０ビーズ懸濁液を作成する。Otsu L (Hikari Rie) The sample of avidin-sensitized beads is centrifuged to remove the supernatant. Ke Add Lutrol 0.05% buffer solution to create a 50150 bead suspension.

ストック試薬からグルコースオキシダーゼビオチン抱合体の１ｍｌ当たり５１ｊ ｇの溶液を、緩衝液中０．０５％のゲルトロールを用いて製造する。51j per ml of glucose oxidase biotin conjugate from stock reagent A solution of g is prepared using 0.05% geltrol in buffer.

多数のマイクロフユージュ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）管の各々に前記ビーズ懸濁液 １００μｍと、前記抱合体５００μｍと、ビオチン溶液５００、　ｌとを加える 。容管に蓋をし、室温で２時間転倒ミキサ内に配置する。The bead suspension is placed in each of a number of microfuge tubes. Add 100 μm, 500 μm of the conjugate, and 500 liters of biotin solution. . Cap the tube and place in an end-over-end mixer for 2 hours at room temperature.

インキュベーション後、ｌｓｇ／ａ＋１のグルコースと約２５１１位／１の市販 ウシ肝臓カタラーゼ酵素とを含むＰＢＳＩＩ衝液２−１中５０．１のビーズを容 管に加える。ビーズはゲル表面に沈澱し、ビオチンを少量しか又は全く含まない サンプルの場合は明らかな青色可視光がゲル層から発光する。After incubation, glucose at lsg/a+1 and commercially available at position 2511/1 50.1 beads in PBS II buffer 2-1 containing bovine liver catalase enzyme. Add to tube. The beads settle on the gel surface and contain little or no biotin. In the case of the sample, clear blue visible light is emitted from the gel layer.

え４」［ この実施例では、モノクローナル抗体のアッセイにおける化学発光信号の発生及 び粒状キャリア物質の局在化の使用を説明する。この操作は細胞培養培地のスク リーニング、例えばモノクローナル抗体のごときイムノグロブリンの存在に関す るスクリーニングに使用できる。E4” [ This example describes the generation and development of chemiluminescent signals in monoclonal antibody assays. and the use of localized particulate carrier materials. This operation is performed using a screen of cell culture medium. Leaning, for example regarding the presence of immunoglobulins such as monoclonal antibodies. It can be used for screening.

彬１ 平均粒径２．６ｐｍの市販のマクロ多孔性ｍａｅｒｏｐｏｒｏｕｓポリスチレン 粒子（Ｄｙｎｏ：Ｄｙｎｏｓｐｈｅｒｅｓ　ＸＰ−６００６）、この粒子には酸 化鉄が均等に分布されている。これらの均質球状ビーズはペンダントｐｅｎｄａ ｎｔ　）シル基で誘導体化処理したｃｌｅｒｉｖａｔｉ−ｓｅｄヒドロキシエチ ルメタクリレートベースの外側シェルを有する。トシル成分はタンパク質の外表 面に存在するようなアミノ基によって簡単に核置換を受け、その結果不動化され る。これらの粒子を下記の方法で市販のウサギ抗マウスモノクローナル抗体（Ｄ ａｋｏ社の２２５９）により感作した。Akira 1 Commercially available macroporous maeroporous polystyrene with average particle size of 2.6 pm Particles (Dyno:Dynospheres XP-6006), this particle contains acid. Iron oxides are evenly distributed. These homogeneous spherical beads are pendant penda nt) clerivati-sed hydroxyethyl derivatives derivatized with sil groups with a methacrylate-based outer shell. Tosyl component is the outer surface of protein It easily undergoes nuclear substitution by amino groups such as those present on the surface, resulting in immobilization. Ru. These particles were treated with a commercially available rabbit anti-mouse monoclonal antibody (D The cells were sensitized using Ako's 2259).

Ｄｙｎｏｓｐｈｅｒｅｓ　ＸＰ−６００６を含む懸濁液のアリコー）　（１０ｍ ｇ）にホウ酸緩衝液（０，００５Ｍ、ｐＨ９，５，０，５ｍ１）を加えた０次い でこれにヒツジｒｇｃ溶液（ＰＢＳ１ｓｌ中２００しｇ、ｐＨ７，２）を加え、 その後ホウ酸緩衝液（０，５Ｍ、ＮａＯＨでｐＨ９，５に調整、０．５ｍ１）を 加えた。Dynospheres (Aliquot of suspension containing XP-6006) (10 m g) with borate buffer (0,005M, pH 9,5,0,5ml) Add sheep RGC solution (200 g in 1 sl of PBS, pH 7.2) to this, Then add borate buffer (0.5M, adjusted to pH 9.5 with NaOH, 0.5ml). added.

これを室温で一晩軌道シェーカーにかけて結合を生起させた０次いでビーズを磁 石で沈澱させ、タンパク質溶液を吸引した。ビーズをＰＢＳ（５ｍｌ）で−回洗 浄し、前記結合処理を繰り返した。但し、この場合はＯＳ＾（２０ａ＋ｇ）を用 いて未反応トシル基に結合させた０次いでビーズをリン酸塩緩衝液（０，２５８ Ｋ）１２ＰＯ，、ＮａＯＨでｐＨ８に調整、０．５％のＢＳ八と０．１％のＴｗ ｅｅｎ　２０とを含む、５＋ａｌ）中で一晩洗浄して、ビーズ表面から吸着■８ Ｇを除去した。最後に、前記緩衝液（２％５ｍｌ）及びＰＢＳ（２％５ｍｌ）中 でビードを順次洗浄し、０．１％のＢＳ＾と０．０１％のチメロサール防腐剤と を含む既知量のＰＢＳ中に４℃で貯蔵した。This was placed on an orbital shaker overnight at room temperature to induce binding.Then the beads were placed under a magnet. Precipitate with a stone and aspirate the protein solution. Wash beads twice with PBS (5 ml) and the above bonding process was repeated. However, in this case, use OS^(20a+g). The beads were then soaked in phosphate buffer (0,258 K) 12PO, adjusted to pH 8 with NaOH, 0.5% BS8 and 0.1% Tw Wash overnight in 5 + al) containing een 20 and adsorb from the bead surface.■8 G was removed. Finally, in the buffer (2% 5 ml) and PBS (2% 5 ml) Wash the beads sequentially with 0.1% BS^ and 0.01% thimerosal preservative. The samples were stored at 4°C in a known amount of PBS.

損ｊづ（ 市販のヒツジ抗マウスＩｇＧモノクローナル抗体をＳｉｇｍａ社のホースラディ ツシュペルオキシダーゼ八６７８２と抱合したもの。Loss ( A commercially available sheep anti-mouse IgG monoclonal antibody was used with Sigma's Horseradish. Conjugated with Tush peroxidase 86782.

分］［物− 全培養培地（１０％ウマ血清／［ＩＡＺ）１ｍｌ当たりＯ〜８９Ｈの標準濃度の 抗アルファ■ＣＧマウスモノクローナルイムノグロブ分析物サンプル以外の総て の試薬をｐＨ８，６の０．ＩＭ）リス／ＨＣ１［漬液中に導入した。ウサギ抗マ ウス感作磁性粒子の０．６２５％（容量）懸濁液２０ν１を分析物溶液１００． １及び希釈度１／２００の前記抱合体１００，１と共に管に入れた。標準的実験 用シェーカーを用いてこの混合物を３０分間室温でインキュベートした。minute] [thing- Total culture medium (10% horse serum/[IAZ) at a standard concentration of 0 to 89H per ml. All except anti-alpha CG mouse monoclonal immunoglobe analyte sample reagent at pH 8.6. IM) Squirrel/HC1 [introduced into the soaking solution. rabbit anti-ma 20 ν1 of a 0.625% (volume) suspension of sensitized magnetic particles was added to 100 mL of the analyte solution. 1 and the conjugate 100.1 at a dilution of 1/200. standard experiment This mixture was incubated for 30 minutes at room temperature using a mechanical shaker.

その後、下記の試薬を下記の順序で前記管内に添加した＝２５０．１の１０謡Ｈ ルミノール、 ２５０μｍの５−Ｎバラヨードフェノール、１５μｌの市販の黒色水性インキ（ 化学発光反応を妨害しないようなものを選択する）、 ｚｓｏｕ　ｌの１００鵬Ｈ過酸化水素。Thereafter, the following reagents were added to the tube in the following order: 10 H = 250.1 Luminor, 250 μm of 5-N balayodophenol, 15 μl of commercially available black water-based ink ( (select one that does not interfere with the chemiluminescence reaction), zsou　100H hydrogen peroxide.

前記管内の内容物を十分に混合し、永久磁石を前記管の下方側面の近傍に５分間 配置することによって、磁性固相を管の底部に集中させた１次いで管を磁石から 離し、注意深く（局在粒子ベレットが移動しないように）光センサ内に配置した 。Mix the contents in the tube thoroughly and place a permanent magnet near the lower side of the tube for 5 minutes. The magnetic solid phase is concentrated at the bottom of the tube by placing the tube away from the magnet. separated and carefully placed inside the optical sensor (so that the localized particle pellet does not move). .

この実施例で使用する光学的感知装置の本質的特徴を、該装置の樅断立面図を示 す第６図に簡単に示した。The essential features of the optical sensing device used in this example are shown in a cross-sectional elevational view of the device. This is briefly shown in Figure 6.

この装置は光電子増倍管６０１を収容する上部開放直立型円筒形容器６００を含 む、光電子増倍管６０１の窓６０２は容器６００の上表面６０３と同じレベルに あり、鉛直に上方へ向かう。The apparatus includes an open top erect cylindrical container 600 containing a photomultiplier tube 601. The window 602 of the photomultiplier tube 601 is at the same level as the upper surface 603 of the container 600. Yes, it moves vertically upwards.

光電子増倍管６０１の詳細な構造は本発明には係わりないため、図示しなかった 。The detailed structure of the photomultiplier tube 601 is not shown because it is not related to the present invention. .

容器６００の上表面６０３には容器６００と同じ直径の平たい円形プレート６０ ４が配置されている。このプレート６０４の中央には、光電子増倍管６０１の窓 ６０２のすぐ上に位置するように、小さい円形開口６０５が設けられている。プ レート６０４の下方表面６０６には、プレート６０４と円筒形容器６００の上表 面６０３との間に狭い間隙を残す水平スロットが形成され、水平方向に滑動し得 るシャッタ６０８が前記間隙内を移動できるように゛なっている。シャッタ６０ ８は該装置の外部に連通し、従って手動で開閉できる。第６図では、シャッタ６ ０８が開放状態にある。シャッタ６０８を完全に挿入すると開口６０５が閉鎖さ れ、光電子増倍管６０１の窓６０２から送られる光が完全に遮　断される。A flat circular plate 60 having the same diameter as the container 600 is provided on the upper surface 603 of the container 600. 4 is placed. In the center of this plate 604 is a window for a photomultiplier tube 601. Located just above 602 is a small circular opening 605 . P The lower surface 606 of the plate 604 includes the plate 604 and the upper surface of the cylindrical container 600. A horizontal slot is formed leaving a narrow gap between the surface 603 and the surface 603, allowing horizontal sliding. A shutter 608 is movable within the gap. shutter 60 8 communicates with the outside of the device and can therefore be opened and closed manually. In Figure 6, the shutter 6 08 is in the open state. When the shutter 608 is fully inserted, the opening 605 is closed. As a result, light sent from the window 602 of the photomultiplier tube 601 is completely blocked.

プレート６０４上には容器６００及びプレート６０４と同じ外径の環状体６０９ が配置される。この環状体の鉛直円筒軸線は開口６０５及び光電子増倍管６０１ の軸線と同じ線上にある。前記環状体６０９の内面６１０は開口６０５の直径よ り大きい直径を有し、アッセイ管６１２を嵌め込むことができる凹部６１１を構 成する（以下の説明参照）。On the plate 604 is a container 600 and an annular body 609 having the same outer diameter as the plate 604. is placed. The vertical cylinder axis of this annular body is the opening 605 and the photomultiplier tube 601. is on the same line as the axis of The inner surface 610 of the annular body 609 is larger than the diameter of the opening 605. A recess 611 having a larger diameter and into which an assay tube 612 can be fitted is constructed. (see explanation below).

環状体６０９及び円形プレート６０４は複数のボルト６１３（図面には１つしか 示されていない）によって円筒形容器６００の上に固定される。前記ボルトは環 状体６０９の上表面６１４から下方に延びて円筒形容器６００中に侵入する。The annular body 609 and the circular plate 604 are connected by a plurality of bolts 613 (only one is shown in the drawing). (not shown) onto the cylindrical container 600. The bolt is a ring It extends downwardly from the upper surface 614 of the body 609 and into the cylindrical container 600 .

円筒形容器の環状体６０９の上表面６１４には、取り外しが容易な遮光性の蓋６ １５が具備され、その下方リム６１６を上表面６１４の環状ｌ　６１７と係合さ せると、凹部６１１に入る光が蓋６１５によって遮断されることになる。A light-shielding lid 6 that is easily removed is provided on the upper surface 614 of the annular body 609 of the cylindrical container. 15 is provided, the lower rim 616 of which is engaged with the annular l 617 of the upper surface 614. Then, light entering the recess 611 is blocked by the lid 615.

第６図に示したように、環状体６０９の凹部６１１には分析用の液体サンプル６ １８が入った円底ガラス管６１２が配置される。As shown in FIG. 6, the recess 611 of the annular body 609 contains a liquid sample 6 for analysis. A round bottom glass tube 612 containing 18 is placed.

管６１２の底部６１９はディスク６０４の開口６０５内に配置される。A bottom 619 of tube 612 is positioned within opening 605 of disk 604.

この実験で使用する粒状固相キャリア物質６２０はガラス管６１２の底６１９に 局在して示されている。この粒状キャリア物質の近傍に発生する化学発光光は管 の底のガラス壁を透過し、ディスク６０４の開口６０５を通って直接到達する。The particulate solid phase carrier material 620 used in this experiment is placed at the bottom 619 of the glass tube 612. Shown locally. The chemiluminescent light generated near this particulate carrier material is through the glass wall at the bottom of the disc 604 and directly through the opening 605 in the disc 604.

操作を行う時は、総ての分析試薬を管６１２内で混合した後で磁性粒子を底部に 集中させ、この管を凹部６１１内に配置して蓋６１５を環状体６０９にかぶせる 。シャッタ６０８を所定時間、例えば１０秒間開けて、光電子増倍管からの読取 りを記録する。When performing the operation, after all analytical reagents are mixed in the tube 612, the magnetic particles are placed at the bottom. This tube is placed in the recess 611 and the lid 615 is placed over the annular body 609. . The shutter 608 is opened for a predetermined period of time, for example 10 seconds, and the reading from the photomultiplier tube is taken. Record the results.

種々の既知の分析物濃度を用いた一連の実験の結果を任意単位で表して下記の表 １に示し、且つ添付図面第７図にもグラフで示した０分析物源度が高い時に見ら れる下降は「フック（ｈｏｏｋ）　Ｊ効果に起因する。The table below shows the results of a series of experiments using various known analyte concentrations, expressed in arbitrary units. 1 and also shown graphically in Figure 7 of the attached drawings, which can be seen when the 0 analyte source level is high. The decline caused by the "hook J effect".

塁−−Ｌ Ｏ（Ｍ両液）　２９３４ ７．８　２６４１ １５．６　６００６ ３１．２５　１０６０８ ６２．５　１９５６２ 国際調査報告 一−Ｎ−−ム紳−−−１−．ＰＣＴ／ＧＢ　Ｂフ１００３５１ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ 　ＴＨＩＥ　！ｍＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＰＯＲＴ　０ＮＥＰ−に− ０１４９５６５２４１０フ／８５　ＪＰ−Ａ−６０１５９６５！　２１７０８／ ８５ＩＮＴＥＲＮＡτ！０ＮＡｒ、ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ　Ｎｏ、　ＰＣ丁７ ＧＢ　Ｂ７１００３Ｓ１　（ＳＡ　１７２２１）Base--L O (M both liquids) 2934 7.8 2641 15.6 6006 31.25 10608 62.5 19562 international search report 1-N--M---1-. PCT/GB B 100351ANNEX To THIE! mATIONAL 5EARCHREPORT 0NEP-ni- 01495652410fu/85 JP-A-6015965!　21708/ 85 INTERNAτ! 0NAr, APPLICATION No, PC 7 GB B71003S1 (SA 17221)

Claims (16)

【特許請求の範囲】[Claims] １．特異的結合によりサンプル中の分析物の存在を定性及び／又は定量分析する ためのアッセイ方法であって、分析物に対して特異性を有する第１の結合試薬が 固定された粒状キャリアのような可動性固相キャリア物質、及び分析物の存在下 で第１の試薬との「サンドイッチ」又は「競合」反応に関与し得る標識化特異的 結合試薬にサンプルを接触させ、反応を生じるに十分なインキュベーション時間 後、可動性固相キャリア物質をアッセイ媒体内で信号感知手段に隣接する場所に 移動させ、ラベルからアッセイ媒体中に信号を連続的に発生させ、感知手段の近 傍で発生された信号の大きさを結合反応が生じた程度の尺度として使用するアッ セイ方法。1. Qualitative and/or quantitative analysis of the presence of an analyte in a sample by specific binding an assay method for analyte comprising: a first binding reagent having specificity for an analyte; In the presence of a mobile solid phase carrier material, such as a fixed particulate carrier, and the analyte A labeled specific compound that can be involved in a "sandwich" or "competitive" reaction with a first reagent in Sufficient incubation time to contact the sample with the binding reagent and cause a reaction After that, the mobile solid phase carrier material is placed in the assay medium adjacent to the signal sensing means. to continuously generate a signal from the label into the assay medium and close to the sensing means. An assay that uses the magnitude of the signal generated nearby as a measure of the degree to which a binding reaction has occurred. Say how. ２．ラベルがアッセイ媒体中で連続的に信号を発生するように標識された特異的 結合試薬を使用する方法であって、該信号は標識した結合試薬がアッセイ媒体中 に均一に分散されている間は抑制され、結合反応後、粒状キャリア物質は局在的 に発生された信号を凌駕するには不十分な信号抑制能力を有する環境に局在化さ れ、従って分析物と粒子に固定された特異的結合試薬との間に生じた結合の程度 に依存する性質及び／又は大きさを有する検出可能な信号が発生され得る請求項 １に記載のアッセイ方法。2. Specific labeled so that the label generates a signal continuously in the assay medium A method using a binding reagent, wherein the signal is detected when a labeled binding reagent is present in the assay medium. After the binding reaction, the particulate carrier material is suppressed while being uniformly dispersed in the localized in the environment with insufficient signal suppression capacity to outweigh the signals generated by and thus the degree of binding that has occurred between the analyte and the specific binding reagent immobilized on the particle. Claims in which a detectable signal can be generated having a nature and/or magnitude depending on The assay method described in 1. ３．感知手段により検出される信号が化学発光反応に由来する可視光線である請 求項１又は２に記載のアッセイ方法。3. The signal detected by the sensing means is visible light originating from a chemiluminescent reaction. The assay method according to claim 1 or 2. ４．ラベルがアッセイ媒体中で過酸化水素を発生し、該過酸化物が化学発光反応 への関与により検出される請求項３に記載のアッセイ方法。4. The label generates hydrogen peroxide in the assay medium, and the peroxide undergoes a chemiluminescent reaction. The assay method according to claim 3, wherein the assay method is detected by involvement in . ５．ラベルが化学発光反応に関与する過酸化物破壊酵素である請求項４に記載の アッセイ方法。5. 5. The label according to claim 4, wherein the label is a peroxide-destroying enzyme involved in a chemiluminescent reaction. Assay method. ６．ラベルがアッセイ媒体中で過酸化水素を発生し、該過酸化物が電気化学的に 測定される請求項１又は２に記載のアッセイ方法。6. The label generates hydrogen peroxide in the assay medium, and the peroxide is electrochemically The assay method according to claim 1 or 2, wherein the assay method is performed. ７．アッセイ媒体が信号感知手段から離れたアッセイ媒体の領域で発生された信 号を抑制するアスキング又はクエンチング剤を含んでいる請求項１から６のいず れかに記載のアッセイ方法。7. A signal generated in a region of the assay medium where the assay medium is remote from the signal sensing means. Claims 1 to 6 contain an asking or quenching agent that suppresses the The assay method described in any of the following. ８．検出可能な信号が化学発光光であり、マスキング又はクエンチング試薬が信 号感知手段から離れた領域から信号感知手段に至る光に対してアッセイ媒体を不 透明又は少なくとも不十分に半透明にする請求項７に記載のアッセイ方法。8. If the detectable signal is chemiluminescent light and the masking or quenching reagent is The assay medium is protected from light reaching the signal sensing means from an area remote from the signal sensing means. 8. Assay method according to claim 7, which is transparent or at least partially translucent. ９．マスキング又はクエンチング試薬が信号発生システムの必須成分を消費する 化学試薬である請求項７に記載のアッセイ方法。9. Masking or quenching reagents consume essential components of the signal generation system The assay method according to claim 7, which is a chemical reagent. １０．ラベルがアッセイ媒体中で過酸化水素を発生し、コンシューマー試薬がカ タラーゼ酵素である請求項９に記載のアッセイ方法。10. The label generates hydrogen peroxide in the assay medium and the consumer reagent The assay method according to claim 9, wherein the assay method is thalase enzyme. １１．ラベルが西洋ワサビペルオキシダーゼであり、アッセイ媒体が過酸化水素 のような過酸化物、及びルミノールのような化学発光性２，３−ジヒドロ−１， ４−フタラジンジオンを含有しており、アッセイ媒体が場合によってはパラヨー ドフェノール、パラフェニルフェノール及び／又は２−クロロ−４−フェニルフ ェノールのような化学発光反応のエンハンサーも含有している請求項５に記載の アッセイ方法。11. The label is horseradish peroxidase and the assay medium is hydrogen peroxide. and chemiluminescent 2,3-dihydro-1, such as luminol. 4-phthalazinedione and the assay medium may optionally contain paraiodine. Dophenol, paraphenylphenol and/or 2-chloro-4-phenylphenol 6. The method according to claim 5, which also contains an enhancer for chemiluminescent reactions such as phenol. Assay method. １２．アッセイ媒体が、 ａ）分析物に対して特異性を有する結合試薬が固定された局在化可能な粒子の第 １の集団、 ｂ）アッセイ媒体中で化学発光反応の前駆物質を連続的に発生するように標識さ れた第２の特異的結合試薬、ｃ）標識した特異的結合試薬がアッセイ媒体中に分 散されている間、前駆物質に有効に竸合して化学発光の発生を阻止するテスト媒 体中に分散されたコンシューマー試薬、ｄ）前駆物質と反応して化学発光光を発 生し得る試薬を担持又は含有する局在可能な粒子の第２の集団、を含んでおり、 光検出手段に隣接する２つの粒子集団の共局在化により、第１の粒子集団に固定 された特異的結合試薬が分析物に結合した程度に依存する量だけ発生された化学 発光を観測することができる請求項１に記載のアッセイ方法。12. The assay medium is a) localizable particles having immobilized binding reagents with specificity for the analyte; 1 group, b) labeled to continuously generate precursors for chemiluminescent reactions in the assay medium; c) the labeled specific binding reagent is dispersed into the assay medium; A test medium that effectively combines with the precursor to prevent chemiluminescence from occurring during dispersion. consumer reagents dispersed throughout the body; d) react with precursors to emit chemiluminescent light; a second population of localizable particles carrying or containing a reagent that can be produced; Co-localization of two particle populations adjacent to the photodetection means fixation to the first particle population The amount of chemical generated depends on the degree to which the specific binding reagent bound to the analyte. The assay method according to claim 1, wherein luminescence can be observed. １３．ラベルがグルコースオキシダーゼであり、アッセイ媒体がグルコースとル ミノールのような化学発光性２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオンとを 含有しており、コンシューマー試薬がカタラーゼ酵素であり、局在化可能な粒子 の第２の集団に会合した試薬が西洋ワサビペルオキシダーゼであり、アッセイ媒 体が場合によってはパラヨードフェノールのようなエンハンサーも含有している 請求項１２に記載のアッセイ方法。13. The label is glucose oxidase and the assay medium is glucose and glucose. chemiluminescent 2,3-dihydro-1,4-phthalazinediones such as minol. The consumer reagent is the catalase enzyme, and the particles can be localized. The reagent associated with the second population is horseradish peroxidase, and the assay medium In some cases, the body also contains enhancers such as paraiodophenol. The assay method according to claim 12. １４．化学信号と反応する試薬を含有又は担持する表面に隣接して粒状キャリア を局在化することにより化学信号を検出する請求項１に記載のアッセイ方法。14. a particulate carrier adjacent to the surface containing or carrying a reagent that reacts with the chemical signal; The assay method according to claim 1, wherein the chemical signal is detected by localizing the chemical signal. １５．化学信号が過酸化水素であり、表面が西洋ワサビペルオキシダーゼと化学 発光性２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオンルミノール、及び場合によ ってはパラヨードフェノールのようなエンハンサーを含有するゲル体である請求 項１４に記載のアッセイ方法。15. The chemical signal is hydrogen peroxide, and the surface is horseradish peroxidase. Luminescent 2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione luminol and optionally The claim is that it is a gel containing an enhancer such as paraiodophenol. Assay method according to item 14. １６．細胞培養培地のスクリーニングに適用される請求項１から１５のいずれか に記載のアッセイ方法。16. Any one of claims 1 to 15 applied to screening of cell culture media. Assay method described in.