JPH01308296A - ホスホロアニリダート類からのアニリノまたはその誘導体残基の除去法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕・ 本発明は、ホスホロアニリダート類からの効率的なアニ
リノまたはその誘導体残基の除°去方法に関するもので
ある。

〔従来の技術〕

従来、リン酸トリニス゛チル法におけるオリゴヌクレオ
チドの合成は、たとえば、下記反応式で示されているご
とく、式（１）化合物と式（２）化合物を縮合させるこ
とにより行われる。

〔式中、Ｂは核酸塩基または保護基を有する核酸塩基、
Ｒ１はジメトキシトリチル基などの水酸基の保護基、Ｒ
２は水素原子またはテトラヒドロピラン−２−イル基な
どの保護基で保護された水酸基、Ｒ３はオルトクロロフ
ェニル基などのリン酸残基の保護基、Ｒ４は水酸基の保
護基、式（４）（式中、Ｒ３は前記と同意義、Ｒ５はＲ
３とは異なる条件下で除去可能なリン酸残基の保護基を
示す。

）で表わされる完全保護リン酸残基、またはスペーサー
を介して連結した不溶性担体、ｍおよびｎはＯまたは１
以上の整数を示す。〕 □　上記反応式中、式（１）で表わされる化合物は、式
（５） 〔式中、Ｂ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびｍは前記と
同意義。〕で表わされる化合物のＲ５で表わされるリン
酸残゛基の保護基を除去して上述の縮合反応に供してい
た。

従来、Ｒ５の保護基としてはトリエチルアミンで除去す
ることのできるβ−シアノエチル基が繁用されていた。

しかしながら、β−シアノエチル基は塩基性条件下で不
安定であったり、シリカゲルクロマドグラフイーによる
精製時に脱落するという問題点を有するため、必ずしも
満足することのできる保護基ではなかった。

β−シアノエチル基以外の保護基としては、アニリノ基
、４−メトキシアニリノ基などのアニリノ誘導体残基が
開発されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

アニリノまたはその誘導体残基は、β−シアノエチ／ｊ
／基と比較して安定性に優れており、また中性条件下で
除去できるなどの特徴を有し、β−シアノエチル基に代
わりうる優れた保護基であるが、たとえば、溶媒量の亜
硝酸イソアミルによるアニリノまたはその誘導体残基の
除去に長時間要するという欠点を有していた（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、よ互、３７６１
〜３．７７２　（１９８７））。

畑らはアニリノまたはその誘導体残基を短時間で除去す
る方法に関して種々研究を重ねた結果、反応液中に無水
酢酸を添加すれば約３５分間〜３時間でアニリノまたは
その誘導体残基を除去することができることを報告して
いる（　Ｔ６ｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ、、　２４．
５７４１　（１９８３）、Ｃｈｅｍ、Ｌｅｔｔ、　。

１７５　（１９８４））。

しかしながら、約３５分間〜３時間の反応時間でも、ま
だまだ長時間であり、リン酸トリエステル法を連続的に
短時間で完了するためにはもっと短時間でアニリノまた
はその誘導体残基を除去することができる方法の確立が
要望されていた。

したがって、本発明は短時間でホスホロアニリダート類
、特に（モノまたはオリゴ）ヌクレオチド中の３７−末
端ホスホリル基上のアニリノまたはその誘導体残基を短
時間で除去することのできる方法を提供することを主目
的とするものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、アニリノまたはその誘導体残基の迅速な
除去法に関して種々研究を重ねた結果、脱保護剤として
亜硝酸テトラアルキルアンモニウムおよび無水カルボン
酸を併用することにより５分以内という極めて短時間で
アニリノまたはその誘導体残基を除去することができる
ことを発見し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、リン酸残基の保護基としてアニリ
ノまたはその誘導体を有するホスホロアニジダート類か
らアニリノまたはその誘導体残基を脱保護反応により除
去する方法において、脱保護剤として、亜硝酸テトラア
ルキルアンモニウムと無水カルボン酸を併用することを
特徴とするアニリノまたはその誘導体残基の除去法に関
するものである。

また、本発明は上記アニリノまたはその誘導体残基の除
去法を応用したリン酸トリエステル法によるオリゴヌク
レオチドの合成に関するものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明方法に供する原料化合物であるホスホロアニジダ
ート類は式［１） 〔式中、Ｘはアニリノまたはその誘導体残基、Ｙは水素
原子またはリン酸残基の保護基を示す。〕で表わされる
アニリノまたはその誘導体残基で保護されたリン酸残基
を有するものであればいずれの化合物であってもよい。

このようなホスホロアニジダート類としてはたとえば（
モノまたはオリゴ）リボヌクレオシド３′−ホスホロア
ニリダー１へ、（モノまたはオリゴ）２′−デオキシリ
ボヌクレオシド３′−ホスホロアニジダート、　（モノ
またはオリゴ）リボヌクレオシド３′−ホスホロアニジ
ダート、（モノまたはオリゴ）２′−デオキシリボヌク
レオシド３′−ホスホロアニジダートなどを例示するこ
とができる。

本発明方法は、上述の原料化合物からアニリノまたはそ
の誘導体残基を脱保護反応により除去する方法において
、脱保護剤として亜硝酸テトラアルキルアンモニウムと
無水カルボン酸を併用する方法である。・ 本発明方法に使用される亜硝酸テトラアルキルアンモニ
ウムは、そのアルキル部分として炭素数１〜５個の直鎖
または分枝を有するアルキル、具体的にはメチル、エチ
ル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル
、ｎ−ペンチルなどの低級アルキルを有するものが例示
される。このような亜硝酸テトラアルキルアンモニウム
を具体的に例示すれば、亜硝酸テトラメチルアンモニウ
ム、亜硝酸テトラエチルアンモニウム、亜硝酸テトラプ
ロピルアンモニウム、亜硝酸テトラメチルエチルアンモ
ニウム、亜硝酸テトラブチルアンモニウム、亜硝酸テト
ラペンチルアンモニウムなどが挙げられる。

本発明方法に使用される無水カルボン酸としては、無水
酢酸、無水プロピオン酸、無水酪酸、無水吉草酸、無水
カプロン酸などの炭素１〜５のカルボン酸よりなる無水
カルボン酸を例示することができ、特に無水酢酸、無水
プロピオン酸が好ましい。

亜硝酸テトラアルキルアンモニウムと無水カルボン酸の
使用量は、原料化合物１モルに対して、それぞれ１〜５
倍モル使用すればよい。

本発明方法の脱保護反応に使用する反応溶媒としては、
ピリジン、ピコリン、ジエチルアニリン、１ヘリブチル
アミン、トリエチルアミンなどの塩基性溶媒単独または
該塩基性溶媒とアセトニトリル、ジメチルアセトアミド
、ジメチルアセトアミド、ホルムアミド、クロロホルム
、二塩化メタン、ジオキサン、テトラヒドロフランなど
の混合溶媒であっても使用することができる。

本発明方法による反応は、反応温度０〜５０℃、好まし
くは室温付近で１〜１０分間、必要に応じて撹拌しなが
ら反応させることにより実施することができる。

このようにして得られた反応生成物は、必要に応じて反
応生成物の単離に通常使用されている単離精製手段を適
宜組み合わせて単離精製してもよく、また単離せずに次
の反応に原料として供してもよい。

次に、本発明のアニリノまたはその誘導体残基の除去方
法を応用したリン酸トリエステル法（液相法）によるポ
リヌクレオチドの合成について、ジヌクレオ゛シトの合
成を例に挙げて説明する。

ジヌクレオチドを合成するための原料化合物である２種
類のヌクレオチドは下記の反応工程により調製すること
ができる。　　　　・ 〔式中、Ｂ、Ｒ’、Ｒ２およびＲ３は前記と同意義。

Ｘはアニリ・）またはその誘導体残基を示す。〕すなわ
ち、化合物（Ａ）より化合物（Ｂ）を調製するためには
、上述したごとく、化合物（Ａ）１モルに対して亜硝酸
酸テトラアルキルアンモニウムと無水カルボン酸を１〜
５倍モル使用して塩基性溶媒中で０〜５０℃で１〜１０
分間反応させることによりＸで表わされるアニリノまた
はその誘導体残基を容易に除去′し、化合物（Ｂ）を得
ることができる。

なお、化合物（Ａ）中の核酸塩基Ｂがアデニン、シトシ
ン、グアニンである場合には、塩基部分のアミノ基が反
応して副生成物を生成するため、該アミノ基を活性水素
がない形で保護できる保護基、たとえばサクシニル基あ
るいはフタロイル基などで保護したものを使用するのが
好ましい。

このような核酸塩基部のアミノ基への保護基の導入は常
法に従って行えばよく、たとえばアデノシンのＮ５位を
サクシニル基で保護するには、アデノシンの糖部水酸基
を適当な保護基で保護したのち、１〜］−０倍当量の無
水コハク酸を加えて、塩基性溶媒中で１００℃で１〜５
時間加熱反応させることにより実施することができる。

一方、化合物（Ａ）から化合物（Ｃ）の調製は、Ｒ１の
保護基の除去法として常用されている方法に従って行え
ばよく、たとえばＲ１としてジメトキシトリチル基を使
用した場合には、１％ｐ−トルエンスルホン酸・王水和
物含有のクロロホルム−メタノール混合溶液を用いて０
℃で１０分程度反応させることによりジメトキシトリチ
ル基を除去することができる。

このようにして調製した化合物（Ｂ）と化合物（Ｃ）は
リン酸トリエステル法で常用されている縮合剤（たとえ
ば、塩化２，４．６〜トリイソプロピルベンゼンスルホ
ニルと１−メチルイミダゾールの混合物など）を用いて
縮合することにより目的とする化合物（Ｂ）と化合物（
Ｃ）のダイマーを調製することができる。

かくして得られたダイマーは、シリカゲルカラムクロマ
トグラフィーなどのオリゴヌクレオチド合成に通常用い
られている単離精製法を用いて単離精製することができ
る。

〔発明の効果〕

本発明方法によれば、亜硝酸テトラアルキルアンモニウ
ムと無水カルボン酸を使用することにより５分以内とい
う極めて短時間にアニリノまたはその誘導体残基により
リン酸残基を保護されたホスホロアニリダート類からア
ニリノまたはその誘導体残基を除去することができる。

また本発明方法、を応用したリン酸１ヘリエステル法に
よるオリゴヌクレオチドの合成法は、β−シアノエチル
基を使用した場合と同様に迅速にオリゴヌクレオチドを
合成することができ、かつβ−シアノエチル基よりも安
定性の高いアニリノまたはその誘導体残基を使用するた
め、より確実にオリゴヌクレオチドの合成を行うことが
できる。

〔実施例〕

以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。

実施例　１ ５′−９−ジメトキシトリチルチミジン３′−（２−ク
ロロフェニル）ホスホロアニリダートからのアこリノ基
の除去 ５′−〇−ジメトキシトリチルチミジン３′−（２−ク
ロロフェニル）ホスホロアニリダート０、４０５　ｇ　
（０，５ｍｍｏｌ）、をピリジン０．５ｍＱに溶解させ
、こ九に０．８Ｍ亜硝酸テトラブチルアンモニウム含有
ピリジン溶液１　、８８ｍｆｌ　（１，５ｍｍｏｌ）と
無水酢酸０　、１９　ｍＱ　（２ｍｍｏ］、）を加え、
室温で１分間撹拌反応させた。次に反応液に０．５Ｍ炭
酸水素トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）水溶液４ｍ
Ｑを加えて反応を停止させ、塩化メチレンで抽出し、残
渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（２，５
Ｘ１０■、２０−４０％アセ１−ンー０．０５Ｍ　　Ｔ
ＥＡＢ水溶液）で精製し、５′−〇−ジメトキシトリチ
ルチミジン３′−（２−クロロフェニル）リン酸の１−
リエチルアンモウニム０．３７ｇ　（収率８８％）を得
た。

実施例　２ ５′−〇−ジメトキシトリチルチミジン３′−（２−ク
ロロフェニル）ホスホロアニシダ−１−からの４−メ１
−キシアニリノ基の除去 ５′−〇−ジメトキシトリチルチミジン３′−（２−ク
ロロフェニル）ホスホロアニジダート１、１　ｇ　（１
，、３ｍｍｏｌ）をピリジ’／２．６ｍＱに溶かし、１
Ｍ亜硝酸テトラブチルアンモニウム含有ピリジン溶液（
３，９３ｎ＋Ｑ）と無水酢酸（０，４９４ｍＤ、）を加
え室温で５分間撹拌した。０．５ＭＴＥＡＢ水溶液を加
えて反応を停止し、塩化メチレンで抽出し、減圧上溶媒
を留去した後、残渣を水−ピリジン（２：　１　（Ｖ／
Ｖ）　）溶液に溶解させエーテルで洗浄した。水−ピリ
ジンの層を減圧上濃縮した後、０．５Ｍ、ＴＥＡＢ水溶
液を加え、塩化メチレンで抽出し、減圧上溶媒を留去し
、残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１
０％〜５０％アセトン−０，０５ＭＴＥＡＢ水溶液系）
により精製し、５′−９−ジメトキシトリチルチミジン
３’−（２−クロロフェニル）リン酸のトリエチルアン
モニウム９８６■（収率９０％）を得た。

実施例　３ ５′−９−ヅメ１−キシ１〜リチルーＮ４−サクシニル
−２′−デオキシシチジン３’　−（２−クロロフェニ
ル）ホスホロアニジダートからの４−メ１−キシアニリ
ノ基の除去 ２′−チオキシシチジン−５′−〇−ジメトキシトリチ
ルーＮ４−サクシニル−３’−（２−りロロフェニル）
ホスホロアニジダート８５５■をピリジン１．９ｍＱに
溶解させ、１Ｍ亜硝酸テトラブチルアンモニウム含有ピ
リジン溶液（２，８３ｍＱ）と無水酢酸（０，３５６＋
＋＋Ｑ）を加えて室温で５分間撹拌した。０．５ＭＴＥ
ＡＢ水溶液を加えて反応を停止し、塩化メチレンで抽出
し、減圧上溶媒を留去した後、残渣を水−ピリジン（２
：１（Ｖ／Ｖ））溶液に溶解させ、エーテルで洗浄した
。水−ピリジンの層を留去した後、残渣を逆相シリカゲ
ルカラムクロマトグラフィー（１０〜５０％アセトン−
０，０５ＭＴＥＡＢ水溶液系）により精製し、５′−９
−ジメトキシトリチル−Ｎ４−サクシニル−２′−デオ
キシシチジン３′−（２−クロロフェニル）リン酸のト
リエチルアンモニウム７８１■（収率９３％）を得た。

実施例　４ ジヌクレオチドの合成 ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎｇ−サクシニル−２
′−デオキシアデノシン３’　−（２−クロロフェニル
）ホスホロアニジダート５２９．０■をピリジン１．１
ｎ＋Ｑに溶かし１Ｍ亜硝酸テトラブチルアンモニウム含
有ピリジン溶液（１，７０＋ｎＱ）と無水酢酸（０，２
１４，ｍ１１）を加えて室温で５分間撹拌した。０．５
ＭＴＥＡＢ水溶液を加えて反応を停止し、塩化メチレン
で抽出した。減圧上溶媒を留去した後、残渣を、水−ピ
リジン（２：１　（ｖ／Ｖ））溶液に溶解させ、エーテ
ルで洗浄した。水−ピリジン層を減圧上濃縮した後、０
．５ＭＴＥＡＢ水溶液を加えて塩化メチレンで抽出した
。減圧上溶媒を留去してジエステル体を得た。

このジエステル体に２′−デオキシ−Ｎ６−サクジニル
ーアデノシン３’　−（２−クロロフェニル）ホスホロ
アニジダート３１８．５■を加えピリジンで共沸脱水し
た後にピリジン２．５ｍＱに溶解させ、塩化２，４．６
−トリイソプロビルベンゼンスルホニル（５１６■、１
　、７０４ｍｍｏｌ）と１−メチルイミダゾール（０，
２７ｍＱ、３．４．０８ｍｍｏ１）を加えて室温で２時
間撹拌した。水を加えて反応を停止した後、飽和炭酸水
素ナトリウム水溶液を加えて塩化メチレンで抽出した。

減圧下溶媒を留去した後に、残渣をシリカゲルカラムク
ロマ１−グラフィーにより精製して目的ジヌクレオチド
を６１６．０■（収率８５％）得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）リン酸残基の保護基としてアニリノまたはその誘導
   体を有するホスホロアニリダート類からアニリノまたは
   その誘導体残基を脱保護反応により除去する方法におい
   て、脱保護剤として、亜硝酸テトラアルキルアンモニウ
   ムと無水カルボン酸を併用することを特徴とするアニリ
   ノまたはその誘導体残基の除去法。 ２）ホスホロアニリダート類がヌクレオチドである請求
   項１記載のアニリノまたはその誘導体残基の除去法。 ３）リン酸トリエステル法によるオリゴヌクレオチドの
   製造法であって、縮合反応に付すヌクレオチドまたはオ
   リゴヌクレオチドのリン酸残基の保護基としてアニリノ
   またはその誘導体残基を使用する方法において、該アニ
   リノまたはその誘導体残基の脱保護反応を亜硝酸テトラ
   アルキルアンモニウムと無水カルボン酸を併用して行う
   ことを特徴とするリン酸トリエステル法によるオリゴヌ
   クレオチドの製造法。