JPH01289500A - 鮮度測定法及びこれに用いる測定用キット - Google Patents

鮮度測定法及びこれに用いる測定用キット

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JPH01289500A
JPH01289500A JP63328329A JP32832988A JPH01289500A JP H01289500 A JPH01289500 A JP H01289500A JP 63328329 A JP63328329 A JP 63328329A JP 32832988 A JP32832988 A JP 32832988A JP H01289500 A JPH01289500 A JP H01289500A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、鮮度を判定する方法に関し、更に詳細には魚
介類や食肉類の鮮度低下に伴なって生成するＡＴＰ関連
化合物を簡易かつ迅速に測定する方法及びこれに使用す
るキットに関する。
〔従来の技術〕
近年、魚介類や食肉類の流通において、その鮮度を客観
的に判定することが流通部門を中心に強く要望されてい
る。
従来から魚介類等の鮮度を判定する指標として、ＡＴＰ
の分解生成物の消長を調べることが知られている。つま
りＡＴＰは、ＡＤＰ。
ＡＭＰ、イノシン酸、イノシン、ヒボキサンチンの順に
分解し魚肉中に蓄積する。ＡＴＰ関連化合物全量とイノ
シン、ヒボキサンチン量の比であるに値は鮮度の判定指
標として最も的確な指標と評価されている。このに値測
定法としては、すでに紫外部吸光魔法、可視部吸光度法
、酸素電極法などが実用化されている。これらの方法の
中で可視部吸光度法はＡＴＰ関連化合物すべてを尿酸に
まで分解する系を用いている。
即ち、酵素反応系では尿酸とともに過酸化水素（）１２
０２）が生成するが、このＨ２Ｏ２を発色法により測定
するのが可視部吸光度法である。この方法においては、
各酵素試液にカタラーゼ及び発色剤、例えば４−アミノ
アンチピリン（カップラー）とフェノール、ジメチルア
ニリン又はジエチル−ｍ−トルイジンを加え反応させる
ことによりＡＴＰ関連化合物の量に比例した色素の発色
がみられる。従って、この色を分光光度計で測定すれば
に値を求めることができる。
この方法は、発色法を利用するため、紫外部の吸光度を
測定する必要がなく、より安価な測定器を利用すること
ができる°利点を有する。また、ＡＴＰ関連化合物以外
に紫外部吸収化合物が存在する場合には鮮度判定に誤差
を生ずる点を考えると可視部吸光度法は鮮度判定法とし
て優れた方法である。
〔発明が解決しようとする課題〕
しかしながら、上述の可視部吸光度法においては、すべ
ての試薬が用時調製であり、作業能率等の面に多くの問
題があった。また、上記可視部吸光度法を簡便に実施す
るために、発色剤を試験片に含浸せしめ、ドライ化する
ことも考えられるが、従来用いられている発色剤である
フェノール、ジメチルアニリン、ジエチル−ｍ−トルイ
ジン等はいずれも油状物質であるため、現実には困難で
あり、また試験片を用いた場合の感度は溶液を用いた場
合に比べ劣っていた。
（課題を解決するための手段） 本発明者らは、魚介類及び食肉類の鮮度判定を、用時調
製の煩わしさがなく、現場において小型の装置を用い簡
便かつ迅速におこなうことのできる方法を開発すべく鋭
意研究をおこなった。そして、その結果、可視部吸光度
法においてＮ−エチル−Ｎ−スルホブチル−ｍ−トルイ
ジンを発色剤とし、これをカップラーである４−アミノ
アンチピリンと組み合せれば、従来の発色剤であるフェ
ノール、ジメチルアニリン、ジエチル−ｍ−トルイジン
に比べより鋭敏にＡＴＰ関連化合物を検出できること及
びこのＮ−エチル−Ｎ−スルホブチル−ｍ−トルイジン
は容易に試験片に含浸、ドライ化することができ、しか
も試験片で使用した場合でも検出感度が良好であること
を見出した。
すなわち、本発明は（ｉ）Ａｒｐ関連化合物を含む被検
試料を中和する工程と、（ｉ１）工程（ｉ）で中和され
た被検試料の一定量に、ＡＴＰ関連化合物を過酸化水素
と尿酸に分解する酵素を反応させ、この反応液をＮ−エ
チル−Ｎ−スルホブチル−ｍ−トルイジンを含浸させた
試験片と接触させて試験片を発色させる工程と、（ｉｉ
ｉ　）工程（ｉ）で中和された被検試料の一定量に、イ
ノシン及びヒポキサンチンを過酸化水素と尿酸に分解す
る酵素を反応させ、この反応液にＮ−エチル−Ｎ−スル
ホブチル−ｍ　−トルイジンを含浸させた試験片と接触
させ試験片を発色させる工程と、（ｉｖ）工程（ｉ１）
での試験片の発色と、工程（ｉｉｉ）での試験片の発色
を比較する工程とを含むことを特徴とする鮮度測定法及
び当該方法において用いる測定用キットを提供するもの
である。
本発明方法の工程（ｉ）において用いるＡＴＰ関連化合
物を含む被検試料は、例えば魚介類または食肉類にタン
パク質変性剤を加え粉砕後濾過する公知の方法によって
調製されたものでも、また魚介類または食肉類を単にＮ
１衝液中でホモジナイズしたものでもよい。ここでタン
パク買変性剤としては、トリクロル酢酸、エタノール、
過塩素酸等が用いられ、試料５０〜１００ｍｇに対して
１．２５〜２．５０ｍｇ用いられる。この被検試料は、
工程（ｉ）において中和剤で９８６．５〜８程度に中和
される。中和剤には炭酸緩衝液、水酸化カリウム、リン
酸カリウム、または酢酸カリウム等のｐＨ調節薬が使用
できる。
本発明の工程（ｉ１）で用いられる酵素は、被検試料中
に含まれるＡＴＰ関連化合物全体をＨ７Ｏ２及び尿酸に
分解するものであり、この中にはアルカリホスファター
ゼ、アデノシンデアミナーゼ、ヌクレオチドホスホリラ
ーゼ及びキサンチン酸化酵素が含まれることが必要であ
る。
また、工程（ｉ■）で用いられる酵素は、ＡＴＰ関連化
合物のうちイノシン及びヒボキサンチンをＨ２Ｏ２及び
尿酸に分解するものであり、ヌクレオチドホスホリラー
ゼ及びキサンチン酸化酵素を含み、アルカリホスファタ
ーゼ、アデノシンデアミナーゼを含まないことが必要で
ある。
上記した酵素反応のうち（ｉ１）工程における各酵素の
使用量は、被検試料５０〜１００ｍｇに対し、アルカリ
ホスファターゼ２１８〜４３８Ｕ１アデノシンデアミナ
ーゼ３１〜６３Ｕ１キサンチンオキシダーゼ０．２５〜
０．５Ｕ、ヌクレオチドホスホリラーゼ１．２５〜２．
５Ｕであり、また（　ｉｉｉ　）工程における各酵素の
使用量は、ヌクレオチドホスホリラーゼ１．２５〜２．
５Ｕ、キサンチンオキシダーゼ０．２５〜０，５Ｕであ
る。
これら両工程において用いられる試験片は、発色剤であ
るＮ−エチル−Ｎ−スルホブチル−ｍ−トルイジンを水
に溶解し、これを担体に含浸させた後、乾燥させること
により調製される。担体としては、濾紙のほか、不織布
、ゼラチン膜、コラーゲン膜等を利用することができる
。この試験片調製に当っての好ましい製造方法の例とし
ては、リン酸−カリウム２３０〜４６０　ｍｇ、　　リ
ン酸二ナトリウム４３〜８６ｍｇとＮ−エチル−Ｎ−ス
ルホブチル−ｍ−トルイジンナトリウム１３〜２４ｍｇ
を精製水２．５〜３ｆｆｌｌｌに溶解し、該溶液を常法
により担体に含浸させた後乾燥させ、この乾燥させた担
体を適当な大きさに裁断し必要に応じてスティック状の
プラスチック等に接着固定する方法が挙げられる。工程
（ｉ１）及び工程（ｉ１）における試験片の発色は、試
験片を各酵素で処理した中和被検試料に浸漬することに
よりおこなわれる。このうち工程（ｉ１）の発色はＡＴ
Ｐ関連化合物総量を示し、工程（ｉｉ　）の発色は、イ
ノシン及びヒポキサンチン分解生成物■を示すものであ
る。
なお、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホブチル−ｍ−トルイジン
に対するカップラーとしては、４−アミノアンチピリン
が好ましく、該化合物は、工程（ｉ１）及び（ｉｌ）の
酵素反応時に添加することもできるが、工程（ｉ）の中
和時に添加することが安定性の面で望ましい。
工程（ｉｖ）における、工程（ｉ１）及び工程＜　Ｉｎ
　＞の試験片の発色量の比較は、例えば当該発色片の色
相の反射率を調べることによりおこなわれる。すなわち
、工程（ｉ１）及び（ｉｉｉ　）によって得られる試験
片から吸取紙等によって付着水を除去した後反射率を測
定する方法によって行われるが、付着水を除去すること
なく反射率を測定する方法によっても行うこともできる
。そして、この比較の結果から魚介類又は食肉類の鮮度
を判定する。すなわち、ＡＴＰ関連化合物総量（Ａ＋Ｂ
）に対するイノシン及びヒボキサンチン分解生成物量（
Ｂ）の割合（Ｋ値）を求め、Ｋ値が零に近づく程新鮮度
が大であると判断できるし、またに値が１．００％に近
づく程新鮮度が小であると判断される。
ここにおいて、付着水を除去した試験片について反射率
を測定した場合には、その反射率比（（Ｂ）／（Ａ＋Ｂ
））からに値を求めればよい、また付着水を除去しない
試験片について反射率を測定した場合には、その絶対反
射率（ＲＯＯ）をクベルカームンク　（Ｋｕｂｅｉｋａ
−Ｍｕｎｋ）の式〔月刊薬時、　ｖｏＪＺ　、２６．　
Ｎｏ、２．３０１（ｉ９８４））に当てはめてに／Ｓ値
（Ｋ／５−（ｉ−ＲＯＯ）２／２Ｒ００）（式１）を求
め、次式に従ってに値を求める。
（式２） なお、上記中和剤及び酵素製剤を各々試験管等で凍結乾
燥しておくと試薬の安定性も増し、また使用も容易であ
る。これらを凍結乾燥する場合は、例えば中和剤は、ｐ
Ｈ調節試薬を溶解した溶液にフィコールとカップラーと
して４−アミノアンチピリンを溶解し試験管に分注し常
法で凍結乾燥すれば良く、また各酵素製剤も所要酵素及
びフィコール等の任意成分を精製水に溶解し試験管に分
注し同様に凍結乾燥すれば良い。なお、酵素製剤は、所
要酵素をすべて混合したものを製剤化しても、中和剤と
混合したものを製剤化してもまた、いくつかの酵素群を
分包したものであっても良い。
次に本発明方法の態様を、試薬及び測定方法とともに第
１表に示す。
以下余白 本発明第一態様において、Ａは、（ｉ）の中和のために
用いられるものであり、中和剤としては炭酸ナトリウム
１！衝液等が用いられる。また、酵素製剤のうち、Ｂ試
薬は工程（Ｉりにおいて、Ｃ試薬は工程（ｉｉｉ　）に
おいて使用される。
本発明第二態様及び第三態様は、第４図に示すようなＣ
試薬と発色剤を同一の支持体に含浸せしめた複合試験片
を用いるものである。これら態様において用いられる試
験片は、各試験片の末端を介して相互に吸着的接触状態
にあるシート状ゾーンからなり、酵素反応成分（ｃ試薬
）と発色成分が相互に空間的に分離されて存在するよう
に配置されている。そしてそれら試験片は固体支持体に
固定されており、被検試料に浸すと毛細管力により制御
される液体が発色剤を含有する試験片を経由し、最終的
に試薬Ｃの試験片は発色する。
この複合試験片調製に当っての好ましい製造方法の例と
しては、リン酸−カリウム５．０〜１０．５ｍｇ、　リ
ン酸二ナトリウム８．５〜１７．５ｍｇ、　ヘルオキシ
ダーゼ１２５〜２５０　Ｕ、キサンチンオキシダーゼ０
．３〜０．６Ｕ、ヌクレオチドホスホリラーゼ１．５〜
３　Ｕ、　７　イ：７−ル１ｏｏ〜２００　ｍｇ、シａ
　ｌｉ４０〜８５ＩＩ１ｇを精製水ｌ、５〜２．０ｍｊ
２に溶解し、該溶液を常法により担体に含浸させた後乾
燥させ、この乾燥させた担体を適当な大きさに裁断した
試薬Ｃの試験片を、リン酸−カリウム２３０〜４６０　
ｍｇ、　　リン酸二ナトリウム４３〜８６ｍｇ及びＮ−
エチル−Ｎ−スルホブチル−ｍ−トルイジンナトリウム
１２〜２４ｍｇを精製水０．８〜１．０ｍＡに溶解し、
該溶液を常法により担体に含浸させた後乾燥させ、この
乾燥させた担体を適当な大きさに裁断して得た発色剤の
試薬に隣接させて、スティック状のプラスチック等に接
着固定する方法が挙げられる。
この複合試験片を用いれば、被検体中へのＣ試薬の添加
と、発色片の浸漬を同時におこなうことができ、より簡
便に魚介類及び食肉類の鮮度を測定することが可能とな
る。
複合試験片を用いる方法のうち、第三態様の方法によれ
ばＡＴＰ関連化合物を含む被検試料を中和する工程とイ
ノシン及びヒポキサンチンに分解する酵素を反応させる
工程とを合一にし、工程を簡略させることができる。す
なわち、具体的に例を挙げて説明すれば、４−アミノア
ンチピリン２０〜４０．５１１１ｇ、フィコール２００
〜４００ｍｇを０．２Ｍ炭酸緩衝液１６〜２０Ｉ１１１
に溶かし、この溶液を試験管に１００μＬずつ分注し凍
結乾燥してイノシン及びヒポキサンチン分解生成物測定
用とする。一方、４−アミノアンチピリン２０〜４０．
５ｍｇ、フィコール２００〜４００　ｍｇ、アルカリホ
スファターゼ凍乾品５２５〜１０５０ｔＪ　、　アデノ
シンデアミナーゼ凍乾品７５〜１５０Ｕを０．２Ｍ炭酸
緩衝液１６〜２０ｍＪｌに溶かし、この溶液を試験管に
１００μｍずつ分注し凍結乾燥してＡＴＰ関連化合物総
量測定用とする。第６図に示すように、この方法によれ
ば、被検試料を直接、上記ヒポキサンチン分解生成物量
用試験管に注入し、それぞれ複合試験片を同時に浸漬す
ることができ、さらにより簡便に魚介類及び食肉類の鮮
度を測定することが可能となる。
次に本発明の方法の実施に関して第一の態様の凍結乾燥
試薬を例にとりより具体的に説明する。
魚介類若しくは食肉類の肉片少量と、タンパク質変性剤
溶液を加え乳鉢等で肉片を粉砕した後、濾過を行う、該
濾過液を試薬Ａの試験管に入れ、凍結乾燥試薬を溶解す
る。次にこの溶液の一定量を取り、試薬Ｂの試験管に加
え、室温Ｎ３フ℃で数分〜数十分間インキュベートする
。
一方、試薬Ｃの試験管は２本用意しておき、１本の試験
管には前記試薬Ａの試験管中の残液を先と同量分取し加
える。他の１木には先にインキュベートしておいた溶液
を加える。そして各々の試験管に前記記載の方法で作成
した試験片を各々浸漬し室温〜３７℃で数分〜数十分間
インキュベートした後、各々の試験片の色相の反射率を
求めに値を算出する。
斯くすることにより容易に魚介類及び食肉類の鮮度を容
易に判定することができる。
〔発明の効果〕
本発明方法は感度が高くかつドライ化し得るＮ−エチル
−Ｎ−スルホブチル−ｍ−トルイジンを発色剤とし、こ
れを含浸せしめた試験片あるいは試薬Ｃと前記発色剤と
の複合試験片を用いるものであるので、魚介類及び食肉
類の鮮度を、大掛りな装置等を要さずに容易に迅速に測
定することが可能となる。
〔実施例） 実施例１゜ （ｉ）試薬の調製 ■　Ａ試薬（中和剤） ０．２Ｍ炭酸緩衝液４０ｍｊ！に４−アミノアンチピリ
ン８１ｍｇ及びフィコール４００８００ｍ）（を溶かす
。上記溶液を試験管に２００μｍずつ分注し、凍結乾燥
する。乾燥後試験管はＮ２ガス置換して密栓する。
■　Ｂ試薬： アルカリホスファターゼ凍乾品５２５ Ｕ１アデノシンデアミナーゼ凍乾品７５Ｕ及びフィコー
ル４００　２００ｍｇを精製水１０ｍＡに溶かす。上記
溶液を試験管に１００μｍずつ分注し、凍結乾燥する。
乾燥後試験管はＮ２ガス置換して密栓する。
■　Ｃ試薬ニ リン酸−カリウム４２ｍｇ、　　リン酸二ナトリウム７
０　ｍｇ、ペルオキシダーゼ８００Ｕ、キサンチンオキ
シダーゼ２．４Ｕ、ヌクレオチドホスホリラーゼ１２Ｕ
１フイコール８００　ｍｇ、ショ１１３４０１１１ｇを
精製水４０ｖａｌｔに溶かす。上記溶液を試験管に１０
０μβずつ分注し、凍結乾燥する。乾燥後試験管はＮ２
ガス置換して密栓する。
■　試験片： リン酸−カリウム２３０　ｍｇ、　　リン酸二ナトリウ
ム４３Ｉ１８、及びＮ−エチル−ｒｌ−スルホブチル−
ｍ−トルイジンナトリウム１２ｍｇを精製水３　　ｔａ
ｉｌに溶かす、この溶液を６ｘ６ｃｍ（３６ｃｍ２）の
東洋濾紙Ｎｏ、５２６に浸漬した後、これを真空乾燥す
る。乾燥濾紙は６×６０ＩＩ１１の正方形に裁断し、プ
ラスチック製支持体の一端に両面粘着テープ（バイエル
スドルフ製「テサバンド」）で接着固定する。
（２）操作手順 ＡＭＰとイノシンをその合計量で０．４μＭ／ｍＡとな
るように混合して被検体を調製し、その１２０μＡをＡ
試薬に入れ、この内６０μｍをＢ試薬に分注し３７℃１
５分間インキュベートする、Ｃ試薬２本を用意し、上記
Ａ試薬残液６０μｍと先にインキュベートしたＢ試薬の
６０μｍをそれぞれＣ試薬に注入する。そして各試験管
に試験片をそれぞれ浸漬して３７℃１５分間インキュベ
ートする。試験管から試験片を取り出し軽く吸取紙で付
着水を除いた後反射率計で５６０ｒｖの反射率を測定し
、（Ａ＋Ｂ）、（Ｂ）の反射率をそれぞれ求め、（Ｂ）
／　（Ａ＋Ｂ）を反射率比とした。
この操作手順の概要を第１図に示す。
上記の如くして得た反射率比と従来法による吸光度比に
ついてそれらの関係を調べた。この結果を第２図に示す
、なお、吸光度比の求め方は試験片の代わりに下記処方
の発色液２００μｍを試験片を浸漬する時点でＣ試薬凍
乾試験管に注入しインキュベート３フ 吸光度を測定し、（Ａ＋Ｂ）、（Ｂ）をそれぞれ求め、
（Ｂ）／　（Ａ＋Ｂ）を吸光度比とした。
第２図から明らかなように、本発明方法は従来方法と良
い相関関係を示し、Ｋ値測定法として使用で幹ることが
明らかである。
実施例２。
発色剤として、フェノール、ジメチルアニリン、ジエチ
ル−ｍ−トルイジン及びＮ−エチル−Ｎ−スルホブチル
−ｍ−トルイジンを用い、本発明方法と同一な試験片法
及び公知の発色液法を用い、発色剤の相異による感度の
差を比較した．試料としてはイノシン０．２μＭ／ｍｊ
２とＡ　Ｍ　Ｐ　Ｏ．２　ｕ　Ｍ／ｍｌ！等量５ａμｓ
を使用した。
公知方法の発色液の処方は下記の通りで、その操作は下
記処方の発色液を試験片の代わりにＣ試薬・凍結試験管
に２００μｍ注入しインキュベートした後吸光度（５０
０ｎｍ）を測定した。
また、試験片法は、変色を目視で判定（白色（−）←→
紫色（＋Ｉ＋）　）する以外は実施例１に準じておこな
った．この結果を第１表に示す。
以下余白 第１表に示す通り発色液の方法も試験片の方法もフェノ
ール、ジメチルアニリン、ジエチル−ｍ−トルイジンの
感度はＮ−エチル−Ｎ−スルホブチル−ｍ−トルイジン
ナトリウムより明らかに劣ることが判った。
実施例３゜ （ｉ）試薬の調製 ■　Ａ試薬（中和剤） 実施例１．に同じ ■　Ｂ試薬 実施例１．に同じ ■　Ｃ試薬試験片 リン酸−カリウム１０．５ｍｇ、　リン酸二ナトリウム
１７．５ｍｇ、ペルオキシダーゼ２００Ｕ、キサンチン
オキシダーゼ０．６Ｕ、ヌクレオチドホスホリラーゼ３
Ｕ、フィコール４００　　２００　ｌｌ１ｇ、　　ショ
糖８５ｍｇを１青製水１．８ｍＪｌに溶かす。この溶液
を６Ｘ６ｃｍの東洋濾紙Ｎｏ、５２６に浸漬した後、こ
れを真空乾燥する。乾燥濾紙は５Ｘ６１１１１ｎの正方
形に裁断する。
■　発色剤試験片 リン酸−カリウム２３０　ｍｇ、　　リン酸二ナトリウ
ム４３ｍｇ及びＮ−エチル−Ｎ−スルホブチル−ｍ−ト
ルイジンナトリウム１２ＩＩ１ｇを精製水１　　ｔａｌ
ｌに溶かす。この溶液を６　Ｘ　３　ｃｍの東洋濾紙Ｎ
ｏ、５２６に浸漬した後、これを真空乾燥する。乾燥濾
紙は６　ｘ　３　ｍｍの短形に裁断する。
■、■２つの試験片を相前後して接触させながら両面粘
着テープ（バイエルスドルフ製「テサバンド」）により
プラスチック支持体に固定して巾６ｅ＋ｍ長さ９ＩＩＩ
Ｉ１１の複合試験片を形成する。第４図に複合試験片“
の斜視図を示す。
（２）操作手順 ＡＭＰとイノシンをその合計量で０．４μＭ／ｒｎｆＬ
となるように混合して被検体を調製し、その１２０μＬ
をＡ試薬に入れ、この内６０μｌをＢ試薬に分注し３７
℃１５分間インキユベートする。Ｃ試薬と発色剤をそれ
ぞれ含浸した試験片を組合せた複合試験片２本を用意し
、上記Ａ試薬残液と先にインキユベートしたＢ試薬にそ
れぞれ複合試験片を浸漬して３７℃１５分間インキエベ
ートする。試験管から複合試験片を取り出し、軽く吸取
紙で付着水を除いた後反射率計で５６０ｎｍの反射率を
測定し、（Ａ＋Ｂ）、（Ｂ）の反射率をそれぞれ求め（
Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）を反射率比とした。その操作手順の概
要を第３図に示す。上記の如くして得た反射率比を第５
図に示した。
実施例４゜ （ｉ）試薬の調製 ■　Ａ試薬 ０．２Ｍ炭酸緩衝液２０ｎ＋ρに４−アミノアンチピリ
ン４０．５ｍｇ、　フィコール４００４００　ｍｇを溶
かす。上記溶液を試験管に１００Ａ１Ａずつ分注し凍結
乾燥する。乾燥後試験管をＮ２ガス置換して密栓する。
■　Ａ＋Ｂ試薬 ０．２Ｍ炭酸緩衝液１９．４ｍＡに４−アミノアンチピ
リン４０．５ｍｇｘ　フィコール４００４００　ｍｇ、
アルカリホスファターゼ凍乾品１０５００　、アデノシ
ンデアミナーゼ凍乾品１５０Ｕを溶かす、上記溶液を試
験管に１００μＬづつ分注し凍結乾燥する。乾燥後、試
験管をＮ２ガス置換して密栓する。
■　Ｃ試薬試験片 実施例３．に同じ ■　発色剤試験片 実施例３．に同じ （２）操作手順 ＡＭＰとイノシンをその合計量で０．４μＭ／ｍｉとな
るように混合して被検体を調製し、その６０μｍをそれ
ぞれＡ試薬とＡ＋Ｂ試薬に入れる。被検体の入ったＡ＋
Ｂ試薬の試験管は３７℃１５分間インキエベートする。
Ｃ試薬と発色剤をそれぞれ含浸した試験片を組合せた複
合試験片２本を用意し、上記Ａ試薬と先にインキユベー
トしたＡ＋Ｂ試薬に複合試験片を浸漬し３７℃１５分間
インキエベートする。試験管から複合試験片を取り出し
、軽く吸取紙で付着水を除いた後、反射率計で５６　Ｏ
ｎ１ｌｌの反射率を測定しくＡ＋８）、（Ｂ）の反射率
をそれぞれ求め〔Ｂ〕／（Ａ＋Ｂ）を反射率比とした。
その操作手順の概要を第６図に示す。上記の如くして得
た反射率比は実施例３．の反射率比と同様な結果を得た
。
実施例５゜ （ｉ）試薬の調製 Ａ試薬、Ａ＋Ｂ試薬、Ｃ試薬試験片及び発色剤試験片は
総て実施例４．と同様の物を使用した。
（２）操作手順 実施例４．と同様に操作するが、試験管から複合試験片
を取り出し、付着水を除くこと無く、分光色差計（日本
重色工業■シグマ（Σ）−ａＯ）で５６０ｎｍの反射率
を測定し、式（ｉ）によって（Ｋ／Ｓ）Ａ、Ｂ、（Ｋ／
Ｓ）ａ、（Ｋ／Ｓ　）ブランクｌＡ＊！１１　、（Ｋ／
Ｓ　）ブランク（、）　をそれぞれ求め、式（２）によ
ってに値を算出した。その結果を第２表に示す。
第２表 実施例６゜ （ｉ）試薬の調製 ■　Ａ試薬 ０．１ＭトリスＭ衝液２０ｍＪ２に４−アミノアンチピ
リン４０．５ｍｇ、フィコール４００４００ｍｇを溶か
す、上記溶液を試験管に１００μＡずつ分注し凍結乾燥
する。乾燥後試験管をＮ、ガス置換して密栓する。
■　Ａ＋Ｂ試薬 ０．１Ｍ）リス緩衝液１９．４　ｔａｉｌに４−アミノ
アンチピリン４０．５Ｂ、フィコール４００４００　Ｂ
、アルカリホスファターゼ凍乾品１０５０Ｕ　、アデノ
シンデアミナーゼ凍乾品’１５００を溶かす、上記溶液
を試験管に１００μｍずつ分注し凍結乾燥する。乾燥後
、試験管をＮ１ガス置換して密栓する。
■　Ｃ試薬試験片 実施例３．に同じ ■　発色剤試験片 実施例３．に同じ （２）操作手順 ０．１Ｍトリス緩衝液５　　ｔａｆｌに刺身用まぐろ１
００ｍｇを入れ、これをホモジナイズする。
その６０ｕｉをそれぞれＡ試薬とＡ＋Ｂ試薬に入れる。
被検体の入ったＡ＋Ｂ試薬の試験管は３７℃１５分間イ
ンキエベートする。Ｃ試薬と発色剤をそれぞれ含浸した
試験片を組合せた複合試験片２本を用意し、上記Ａ試薬
と先にインキュベートしたＡ＋Ｂ試薬に複合試験片を浸
漬し３７℃１５分間インキエベートする。試験管から複
合試験片を取り出し、濡れた状態で、分光色差計で５６
０ｎｍの反射率を測定し、実施例５と同様にしてに値を
算出した。
尚比較として、刺身用まぐろを０．１Ｍ）リス緩衝液で
ホモジナイズする代りに、トリクロル酢酸で除タンパク
した後ホモジナイズする公知の方法によって調製した検
液について上記と同様に操作してに値を算出した。
その結果は第３表に示すとうりであり、両者の結果はよ
く一致した。
第３表
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明方法の工程の一例を示す図面である。 第２図は、本発明実施例１．の方法による反射率比と従
来法による吸光度比の関係を示す図面である。 第３図は、本発明方法の第２の態様の工程の例を示す図
面である。 第４図は、本発明方法で使用した複合試験片の図面であ
る。 第５図は、本発明実施例３．の方法で得た検量線を示す
図面である。 第６図は、本発明方法の第３の態様の工程の例を示す図
面である。 以上

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、（ｉ）ＡＴＰ関連化合物を含む被検試料を中和する
    工程と、 （ｉｉ）工程（ｉ）で中和された被検試料の一定量に、
    ＡＴＰ関連化合物を過酸化水素と尿酸に分解する酵素を
    反応させ、この反応液をＮ−エチル−Ｎ−スルホブチル
    −ｍ−トルイジンを含浸させた試験片と接触させて試験
    片を発色させる工程と、 （ｉｉｉ）工程（ｉ）で中和された被検試料の一定量に
    、イノシン及びヒポキサンチンを過酸化水素と尿酸に分
    解する酵素を反応させ、この反応液にＮ−エチル−Ｎ−
    スルホブチル−ｍ−トルイジンを含浸させた試験片と接
    触させ試験片を発色させる工程と、 （ｉｖ）工程（ｉｉ）での試験片の発色と、工程（ｉｉ
    ｉ）での試験片の発色を比較する工程とを含むことを特
    徴とする鮮度測定法。 ２、工程（ｉ）の中和を４−アミノアンチピリンを含有
    する中和剤でおこなう特許請求の範囲第１項記載の鮮度
    測定法。 ３、工程（ｉｉ）の酵素がアルカリホスファターゼ、ア
    デノシンデアミナーゼ、ヌクレオチドホスホリラーゼ及
    びキサンチン酸化酵素の混合物である特許請求の範囲第
    １項記載の鮮度測定法。 ４、工程（ｉｉｉ）の酵素がヌクレオチドホスホリラー
    ゼ及びキサンチン酸化酵素の混合物である特許請求の範
    囲第１項記載の鮮度測定法。 ５、ＡＴＰ関連化合物を含有する試料が魚介類及び食肉
    類の肉片にタンパク質変性剤を加えて粉砕し、抽出して
    得たものである特許請求の範囲第１項記載の鮮度測定法
    。 ６、（ａ）４−アミノアンチピリンを含有する中和剤 （ｂ）アルカリホスファターゼ、アデノシンデアミナー
    ゼを含有する酵素試薬 （ｃ）ヌクレオチドホスホリラーゼ、キサンチン酸化酵
    素及びペルオキシダーゼを含有する酵素試薬 （ｄ）Ｎ−エチル−Ｎ−スルホブチル−ｍ−トルイジン
    を含浸した試験片 よりなる鮮度測定用キット。 ７、（ａ）４−アミノアンチピリンを含有する中和剤 （ｂ）アルカリホスファターゼ及びアデノシンデアミナ
    ーゼを含有する酵素試薬 （ｃ）ヌクレオチドホスホリラーゼ、キサンチン酸化酵
    素及びペルオキシダーゼを含浸した試験片とＮ−エチル
    −Ｎ−スルホブチル−ｍ−トルイジンを含浸した試験片
    との複合試験片 よりなるの鮮度測定用キット。 ８、（ａ）４−アミノアンチピリンを含有する中和剤 （ｂ）４−アミノアンチピリン及びアルカリホスファタ
    ーゼ、アデノシンデアミナーゼを含有する中和剤及び酵
    素試薬 （ｃ）ヌクレオチドホスホリラーゼ、キサンチン酸化酵
    素及びペルオキシダーゼを含浸した試験片とＮ−エチル
    −Ｎ−スルホブチル−ｍ−トルイジンを含浸した試験片
    との複合試験片 よりなる鮮度測定用キット。
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