JPH0126679B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
（発明の分野）
この発明は、発酵液からオキシテトラサイク
リン―珪酸カルシウム錯塩を製造するための、鉄
製装置中で実施することができる簡単で工業的な
方法に関する。 （発明の背景） オキシテトラサイクリン（OTC）は蛋白質合
成及び種々の微生物の増殖機構を阻害する抗生物
質であり、病原微生物により生ずる各種の病気の
治療に使用され、そして体重増加促進活性及び病
気予防活性のために農業において飼料添加剤とし
て使用される。大規模製造において、OTCは、
ストレプトマイセス・リモサス（Streptomyces
rimosus）の液体培養による好気発酵、発酵液か
らの抗生物質の分離、及び粗生成物の精製により
製造される。 （従来技術） OTCの分離及び精製のための多くの方法が知
られている。例えば、OTCはアルカリ性溶液か
らブチルアルコールにより抽出される（米国特許
第2516080号明細書）。さらに、OTCはイオン交
換樹脂に結合し（米国特許第2658078号明細書）、
バリウムイオン、カルシウムイオンもしくはマグ
ネシウムイオンにより（J.Am.Chem.Soc.73
（1951）4211；英国特許第718028号明細書）、第四
アンモニウム塩により（米国特許第2873276号明
細書）、又はアリールアゾスルホン酸により（米
国特許第2649480号明細書）沈澱する。ここに引
用した方法は種々の欠点を有し、例えば、抽出
器、交換カラムのごとき高価な装置、高価な薬剤
（イオン交換体、第四アンモニウム塩、アリール
アゾスルホン酸）、又は非常に毒性の高い化合物
（バリウム塩）が使用される。 ベルギー特許第632331号明細書の方法は本質上
より簡単にそしてより容易に実施できるように見
える。この方法においては、カルシウムイオンの
存在下で炭酸イオン又は炭酸水素イオンによつて
OTCを沈澱せしめる。しかしながら、発明者等
は、この方法が再現性に乏しいことを証明した。
この引用公報には収量は示されていない。 同様の方法（ハンガリー特許第173703号明細
書）は55％の最高収率を示す。ハンガリー特許第
172330号明細書に従えば、OTCは85％の収率で
菌体上に沈澱する。従つて当然のことながら生成
粉中の純活性物質含量は非常に低い（約13％）。
非常に大きな容量を取り扱わなければならないか
ら、前記の事実は製造のためにも、その後の精製
のためにもむしろ欠点である。 発酵液が鉄を含有するため、OTCの大規模な
生産、分離及び精製は非常に困難である。鉄は栄
養培地成分と共に、そして鉄製発酵槽の壁から発
酵液に入り、そして酸化剤としてOTC分解を触
媒し、すでに合成された活性物質の量を減少せし
め（ハンガリー特許第143609号明細書）、そして
精製段階における収量を損う（英国特許第718020
号明細書）。鉄含量は純物質の色及び安定性にも
不利な影響を与える。二価金属及び三価金属が
OTCと安定な内部錯体を形成し〔J.Am.Chem.73
（1951）4211〕このものは容易に分解しないこと
が知られている。発酵液中の鉄含量を発酵中に低
レベルに維持する１つの可能性は、特殊鋼製の発
酵槽を使用することである。しかしながらこのよ
うな装置は非常に高価であり、このため鉄製の発
酵槽が発酵工業のほとんどの場所で使用されてい
る。 鉄製発酵槽中で製造されたOTC含有発酵液の
鉄濃度は相当に高い〔約30〜60μｇ）／ml（γ／
ml）、さらに高い可能性もある〕。 種々の方法で鉄を可溶性であるが解離しない錯
体に転換することにより鉄の有害な効果を低下せ
しめる試みが行われている。このための最もよく
知られた錯化剤はエチレンジアミノ四酢酸
（EDTA）である。他の可能性は、三価の鉄を例
えばアスコルビン酸、ナトリウムホルムアルデヒ
ドスルホキシレート、又はナトリウムジチオナイ
トにより二価の鉄に還元することである。これ
は、二価鉄―OTC錯体は相当に不安定であり、
しかも二価の鉄イオンは活性物質の酸化を触媒し
ないからである。鉄は、ナトリウム―〔ヘキサシ
アノフエレート（）〕により、不溶性の鉄（，
）―〔ヘキサシアノフエレート（）〕として
沈澱せしめることができる（英国特許第718020号
明細書）。これらの方法は高価な試薬（EDTA、
アスコルビン酸）を、しかも大量に使うという欠
点を有し、しかもこれにより鉄の有害効果を完全
に除去することはできない。鉄の沈澱のために最
も適当な試薬はカリウム―〔ヘキサシアノフエレ
ート（）であるが、製造においてこれを使用す
る場合、シアン化水素が生成する可能性がある。 （発明の目的） この発明は、今までよりも経済的に、高収量
で、所望により高い純度で、そして簡単な技法及
び簡単な装置を用いてOTCを製造する方法を提
供することを目的とする。 （発明の構成） この発明は、OTCがカルシウムイオンの存在
下で水溶性珪酸塩と共に不溶性で安定な、容易に
過し得る錯塩を形成するという知見に基礎を置
いている。 従つてこの発明は、発酵液からのオキシテトラ
サイクリン―珪酸カルシウム錯塩の製造方法に関
する。この発明においては、場合によつて界面活
性剤により前処理した発酵液を、 (a) 場合によつては水溶性珪酸塩により前処理し
た後PH0.5〜3.0に酸性化し、場合によつては
過助材を用いて、菌体を去し、液のPH値を
アルカリ液を用いて４〜５に調整し、カルシウ
ム塩又はカルシウムイオンの存在下で水溶性珪
酸塩を加え、そして場合によつては水溶性炭酸
塩又は炭酸水素塩を加え、そして長時間撹拌し
た後、形成されたオキシテトラサイクリン―珪
酸カルシウム錯塩を場合によつては過助材の
存在下で取し；あるいは又 (b) カルシウム塩及び水溶性珪酸塩と混合し、所
望によりアルカリ液を用いてPH値を８〜11に調
整し、場合によつては混合物に水溶性珪酸塩又
は炭酸水素塩を加え、そして長時間撹拌した
後、菌体上に沈澱したオキシテトラサイクリン
―珪酸カルシウム錯塩を場合によつては過助
材の存在下で取し；そして (a)又は(b)によつて得られたオキシテトラサイク
リン―珪酸カルシウム錯塩を20℃〜120℃の温度
において乾燥する。 （構成の具体的な説明） 変法(a)においては、酸性化した後に菌体を去
し、そして純液中に珪酸カルシウム錯塩を形成
せしめる。変法(b)においては、錯塩を菌体上に直
接沈澱せしめる。変法(b)はより少ない段階から成
るが、この生成物は飼料添加物としてのみ使用す
ることができる。変法(a)に従えば、鉄を含有しな
い非常に純粋な生成物が得られ、このものは医薬
用としてさらに処理することができる。 この方法を流れ図により詳細に説明する。 場合によつてはこの方法を開始する前に発酵液
を界面活性剤により前処理することができる。例
えばステロゲノール（Sterogenole）（セチルピリ
ジニウムブロミド）が適当である。界面活性剤は
微生物（ストレプトマイセス・リモサス）の細胞
壁を実質上破壊し、そして細胞内に結合している
OTCを遊離せしめる。 原形質溶解と称するこの工程は、細胞が完全に
溶解するまで0.001〜0.03％（発酵液の全重量に
対して）の界面活性剤を加えながら、5.3〜5.6の
PH値、及び約40℃の温度において行う。上記の量
のステロゲノールにより処理された発酵液は、顕
微鏡下で細胞を有しない。 原形質溶解はすべての場合に必要なわけではな
い。この工程は一般に、発酵液が非常に粘稠で、
これを撹拌することが困難な場合に行う。これは
特に発泡を防止するために発酵中に油脂を加えた
場合である。このような発酵液の場合には、これ
を界面活性剤で処理することによりOTCの収量
が非常に増加する。処理しなければ失われたであ
ろう細胞中に含まれている量が影響を受けるから
である。 変法(a)に従えば、発酵液を場合によつては水溶
性珪酸塩により処理する。この段階は鉄を含有し
ない生成物を得る場合に実施する。その重量に対
して0.1〜3.0％、好ましくは1.5〜2.0％の水溶性
珪酸塩、好ましくはナトリウム水ガラスを発酵液
に対して加える。鉄（）及び鉄（）の両者が
珪酸イオンによりその珪酸塩の形で沈澱する。こ
れらは弱酸及び弱塩基中で不溶である。沈殿した
珪酸鉄は、後で過により菌体と一緒に除去され
る。 次の段階で、発酵液をPH0.5〜3.0、好ましくは
1.0〜2.0に酸性化する。このために有機酸及び無
機酸を同様に使用することができる。燐酸及び酢
酸はOTCが生物学的に無効の４―エピマーにエ
ピマー化するのを触媒するため、これらの酸を使
用するのは好ましくない。塩酸は活性物質である
OTCを強く攻撃し過ぎる。蓚酸及び硫酸が最良
の酸であることが証明された。蓚酸のみを使用す
るのは経済的でない。約90％の硫酸と10％の蓚酸
とから成るこれらの混合物を使用するのが最適で
ある。１Kgの発酵液に対して、11重量％の硫酸と
1.5重量％の蓚酸を含有する混合物を30〜120ml、
好ましくは45〜70mlの量で使用する。酸性化の過
程でOTCが幾分分解する〔J.Am.Chem.Soc.75
5455（1953）〕が、条件を適切に選択することによ
り損失を６％未満に維持することができる。 過により酸性発酵液から菌体（珪酸鉄が沈澱
している場合にはこれも一緒に）を分離する。所
望により、過助材、例えばパーライトを使用す
ることができる。材上の菌体を前記の組成の酸
により一度洗浄し、洗浄液を液と一緒にする。
この方法において最高８％の全活性物質が菌体中
に残留する。この量はさらに洗浄することによつ
ても達成されようが、さらに処理することにより
液の体積が大きな問題となろう。 カルシウム塩及び水溶性珪酸塩、好ましくは水
ガラスにより酸性液からOTCを沈澱せしめる。
第一の段階において鉄の沈澱と除去を行わなかつ
た場合には、この段階で錯塩と共に鉄を沈澱せし
め、そしてこの塩の中に残留せしめる。鉄（）
及び鉄（）を分離することができ、しかし
OTCが損傷を受けないPH値が存在する。PH４〜
５が最適であり、塩基性物質、好ましくは水酸化
ナトリウムによりこの調整を行う。 沈澱試薬の添加速度が沈澱の粒子サイズに影響
を与える。一般に、粒子が小さ過ぎる場合には活
性物質が部分的に再溶解し、そして粒子が大き過
ぎる場合には沈澱が完全でないから、中程度の粒
子サイズを得る必要がある。 カルシウム塩として塩化カルシウムを使用する
のが適当である。水溶性珪酸塩として市販の水ガ
ラス（ナトリウム水ガラス＝珪酸ナトリウム）を
使用するのが実際的である。これを、水を用いて
その体積の４倍に稀釈するのが好ましい。この溶
液を、１Kgの発酵液に対して１〜20ml、好ましく
は４〜９ml使用することが必要である。 沈澱を完全にするため、2N水酸化ナトリウム
水溶液を用いてPHを８〜11に調整する。混合物を
30分間〜５時間撹拌する。さらに、炭酸塩又は炭
酸水素塩を加えれば沈澱がさらに急速になる。こ
れはおそらく塩析効果であろう。10％溶液として
使用する炭酸水素ナトリウムが最も適当である。
１Kgの発酵液のために0.5〜10ｇ、好ましくは１
〜３ｇの炭酸水素塩を使用する。 沈澱した錯塩はできるだけ早く母液から分離
し、活性物質が溶解しないようにする。母液の
OTC濃度を測定することにより正確な時間を決
定し、これが最小値に達した場合に過が完成す
る。場合によつては過助材を使用する。このよ
うな条件下で最高0.04〜0.06mg／mlのOTCが母液
に残留し、OTCが母液に残留することによる損
失は１％未満である。 取した湿潤状態のOTC錯塩を大気圧下又は
真空中で乾燥する。乾燥温度は20℃〜120℃、好
ましくは10℃〜110℃とする。錯塩中に含まれて
いるアルカリ性物質（Na，Ca化合物）が活性物
質を攻撃する可能性があるので常に撹拌、分離及
び反転を行うとにより乾燥時間を可能な限り短縮
する。 変法(b)においては、発酵液を沈澱剤、すなわち
カルシウム塩及び水溶性珪酸塩と直接反応せしめ
る。この場合は、水溶性珪酸塩（ナトリウム水ガ
ラス）を水を用いて１：１の比率で稀釈し、そし
て１Kgの発酵液に対して５〜100ml、好ましくは
約10mlの量で使用する。 水ガラスは強塩基性である。沈澱のための最適
PHである８〜10に達しない場合には水溶性塩基を
加えてアルカリ性に調整する。沈澱工程を促進す
るために炭酸塩又は炭酸水素塩を加えることがで
きる。添加する物質の量及び形態は変法(a)におい
て記載したのと同様である。菌体上に直接沈澱し
た錯塩を分離し、そして変法(a)に記載したのと同
様にして乾燥する。 この発明の方法に従えば、希酸により可溶化さ
れる全鉄含量が２〜200μｇ／ｇ（γ／ｇ）であ
る鉄製発酵槽においてもOTC―珪酸カルシウム
錯塩を製造することができる。この生成物は
OTC塩酸塩及びOTC二水和物の製造のために適
当である。この発明の方法の他の利点は公知方法
に比べて収率が高い点にある。発酵液中に含まれ
るOTCの約85％を回収することができる。得ら
れた錯塩は変法(a)においては約50％、変法(b)にお
いては約18〜20％の活性物質を含有する。変法(b)
により得られた生成物は飼料用として直接使用す
ることができる。 次の例によりこの発明をさらに詳細に説明す
る。 例 １ 2132ｇのOTC発酵液（合計15.56ｇのOTCを含
有する）に、１：１の比率で稀釈したナトリウム
水ガラス（ハンガリー標準No.MSZ929，40〜45゜B
のナトリウム水ガラス及び水、比率１：１）40ml
を、室温にて撹拌しながら添加する。次に150ml
の10％塩化カルシウム溶液を加え、そして１：１
の比率で稀釈したナトリウム水ガラスによりPHを
９に調整する。このために稀釈ナトリウム水ガラ
スが約200ml必要である。混合物を２時間撹拌し、
そして過する。157.8ｇの乾燥生成物を得る。
この生成物は14.517ｇ（9.2％）の純活性物質を
含有し、この収量は最初の活性に対して93％に相
当する。 例 ２ 室温において、2076ｇのOTC発酵液（16.320
ｇのOTCを含有）に、１：１の比率で稀釈した
ナトリウム水ガラス45ml及び次に10％CaCl2溶液
を86mlを加える。次に2N水酸化ナトリウム溶液
によりPHを9.2に調整し、そして混合物を75mlの
10％炭酸水素ナトリウム溶液と反応せしめる。混
合物を２時間撹拌し、そして11ｇのパーライトを
加えて過する。乾燥生成物の重量は83.0ｇであ
り、この生成物は15.520ｇ（18.7％）のOTCを含
有し、これは95％の収率に相当にする。 例 ３ 室温にて撹拌しながら、2042ｇのOTC発酵液
（合計19.68ｇのOTCを含有する）に、１：１の
比率で稀釈したナトリウム水ガラス50mlを加え
る。次に、25％硫酸約200mlによりPHを１に調整
する。混合物を30分間撹拌し、６ｇのパーライト
を加えた後過し、そして菌体を800mlの水で洗
浄する。液及び洗浄水を一緒にする。得られた
2700mlの液は17.52ｇのOTCを含有する。撹拌し
ながら、2N水酸化ナトリウム溶液によりPHを4.5
に調整する。160mlの10％塩化カルシウム及び
１：３の比率で稀釈したナトリウム水ガラスから
成る沈澱剤を加える。ナトリウム水ガラスはPHが
6.5に上昇するまで（約29ml）使用する。次に、
2N水酸化ナトリウム溶液によりPHを9.2に調整
し、そして50mlの10％炭酸水素ナトリウム溶液を
加える。３時間後に過し、そして乾燥を行う。
14.96ｇのOTCを含有する39.78ｇの生成物を得
る。この量は76％の収率に相当する。 例 ４ 室温にて撹拌しながら、1704ｇのOTC発酵液
（合計16.040ｇのOTCを含有する）に153mlの10
％蓚酸（90ml／Kg）を加える。PHは２に低下す
る。混合物を過し、そして菌体を426mlの水
（250ml／Kg）で洗浄する。液及び洗浄水を一緒
にする。得られた1970mlの液は13.794ｇのOTC
を含有する。2N水酸化ナトリウム溶液を用いて
溶液のPHを4.5に調整する。次に、52mlの10％
CaCl2溶液、及び次に１：３の比率で水で稀釈し
た水ガラスをPHが6.5になるまで加える。１時間
撹拌した後、2N水酸化ナトリウムを加えてPHを
９に調整する。撹拌を３時間継続し、生成物を
過し、そして乾燥する。13.040ｇ（46.1％）の
OTCを含有する28.29ｇの生成物を得る。この量
は81％の収率に相当する。 例 ５ 室温において、2124ｇのOTC発酵液（合計
18.035ｇのOTCを含有する）に、11重量％の硫
酸及び1.5重量％の蓚酸を含有する硫酸／蓚酸混
合物127mlを加える。PHは２に低下する。混合物
を１時間撹拌し、次に５ｇ／Kgのパーライトを加
え、そして混合物を過する。菌体を530mlの水
で洗浄する。液及び洗浄水を一緒にして得られ
た2390mlの液は16.646ｇのOTCを含有する。2N
水酸化ナトリウム溶液により溶液のPHを4.5に調
整する。１：３の比率で水により稀釈した水ガラ
ス52.4ml及び10％CaCl2溶液160mlを溶液に加え
る。この段階の後約6.5になつたPH値を、2N水酸
化ナトリウム溶液により9.2に調整する。この溶
液に51mlの10％炭酸水素ナトリウム溶液を加え
る。２時間後、過及び乾燥を行う。合計16.033
ｇのOTCを含有する43.69％の錯塩を得る。OTC
の収率は89％である。 例 ６ 例５に記載したのと同様にして、2109ｇの
OTC発酵液（合計20.035ｇのOTCを含有する）
から2373mlの液（18.432ｇのOTCを含有する）
を調製する。2Nの水酸化ナトリウム溶液（約88
ml）により液のPHを4.5に調整し、次に180mlの
10％CaCl2溶液を加えた後、まず、１：３の比率
で稀釈した水ガラスにより（約35ml必要）PHを
6.5に調整し、次に2N水酸化ナトリウム溶液（約
79ml）により9.2に調整する。添加した水ガラス
の容量に相当する容量の10％炭酸水素ナトリウム
（約35ml）を加える。２時間撹拌した後過を行
う。生成物を高温空気（100〜110℃）により乾燥
する。合計17.43ｇのOTCを含有する43.6ｇの錯
塩を得る。この量は87％の収率に相当する。 例 ７ 温水と共に調製した10％溶液の形のステロゲノ
ール（セチルピリジニウムブロミド）0.63ｇを、
撹拌しながら、2065ｇのOTC発酵液（合計
21.578ｇのOTCを含有する）に加える。この混
合物のPHを、例５において使用した酸混合物によ
り5.3〜5.6に調整する。混合物を30分間40℃に加
熱し、そしてこの温度で２時間撹拌する。室温に
冷却した後、前処理した発酵液を例３〜６のいず
れかに従つてさらに処理する。所望の純度に応じ
て80〜90％の収率が得られる。
リン―珪酸カルシウム錯塩を製造するための、鉄
製装置中で実施することができる簡単で工業的な
方法に関する。 （発明の背景） オキシテトラサイクリン（OTC）は蛋白質合
成及び種々の微生物の増殖機構を阻害する抗生物
質であり、病原微生物により生ずる各種の病気の
治療に使用され、そして体重増加促進活性及び病
気予防活性のために農業において飼料添加剤とし
て使用される。大規模製造において、OTCは、
ストレプトマイセス・リモサス（Streptomyces
rimosus）の液体培養による好気発酵、発酵液か
らの抗生物質の分離、及び粗生成物の精製により
製造される。 （従来技術） OTCの分離及び精製のための多くの方法が知
られている。例えば、OTCはアルカリ性溶液か
らブチルアルコールにより抽出される（米国特許
第2516080号明細書）。さらに、OTCはイオン交
換樹脂に結合し（米国特許第2658078号明細書）、
バリウムイオン、カルシウムイオンもしくはマグ
ネシウムイオンにより（J.Am.Chem.Soc.73
（1951）4211；英国特許第718028号明細書）、第四
アンモニウム塩により（米国特許第2873276号明
細書）、又はアリールアゾスルホン酸により（米
国特許第2649480号明細書）沈澱する。ここに引
用した方法は種々の欠点を有し、例えば、抽出
器、交換カラムのごとき高価な装置、高価な薬剤
（イオン交換体、第四アンモニウム塩、アリール
アゾスルホン酸）、又は非常に毒性の高い化合物
（バリウム塩）が使用される。 ベルギー特許第632331号明細書の方法は本質上
より簡単にそしてより容易に実施できるように見
える。この方法においては、カルシウムイオンの
存在下で炭酸イオン又は炭酸水素イオンによつて
OTCを沈澱せしめる。しかしながら、発明者等
は、この方法が再現性に乏しいことを証明した。
この引用公報には収量は示されていない。 同様の方法（ハンガリー特許第173703号明細
書）は55％の最高収率を示す。ハンガリー特許第
172330号明細書に従えば、OTCは85％の収率で
菌体上に沈澱する。従つて当然のことながら生成
粉中の純活性物質含量は非常に低い（約13％）。
非常に大きな容量を取り扱わなければならないか
ら、前記の事実は製造のためにも、その後の精製
のためにもむしろ欠点である。 発酵液が鉄を含有するため、OTCの大規模な
生産、分離及び精製は非常に困難である。鉄は栄
養培地成分と共に、そして鉄製発酵槽の壁から発
酵液に入り、そして酸化剤としてOTC分解を触
媒し、すでに合成された活性物質の量を減少せし
め（ハンガリー特許第143609号明細書）、そして
精製段階における収量を損う（英国特許第718020
号明細書）。鉄含量は純物質の色及び安定性にも
不利な影響を与える。二価金属及び三価金属が
OTCと安定な内部錯体を形成し〔J.Am.Chem.73
（1951）4211〕このものは容易に分解しないこと
が知られている。発酵液中の鉄含量を発酵中に低
レベルに維持する１つの可能性は、特殊鋼製の発
酵槽を使用することである。しかしながらこのよ
うな装置は非常に高価であり、このため鉄製の発
酵槽が発酵工業のほとんどの場所で使用されてい
る。 鉄製発酵槽中で製造されたOTC含有発酵液の
鉄濃度は相当に高い〔約30〜60μｇ）／ml（γ／
ml）、さらに高い可能性もある〕。 種々の方法で鉄を可溶性であるが解離しない錯
体に転換することにより鉄の有害な効果を低下せ
しめる試みが行われている。このための最もよく
知られた錯化剤はエチレンジアミノ四酢酸
（EDTA）である。他の可能性は、三価の鉄を例
えばアスコルビン酸、ナトリウムホルムアルデヒ
ドスルホキシレート、又はナトリウムジチオナイ
トにより二価の鉄に還元することである。これ
は、二価鉄―OTC錯体は相当に不安定であり、
しかも二価の鉄イオンは活性物質の酸化を触媒し
ないからである。鉄は、ナトリウム―〔ヘキサシ
アノフエレート（）〕により、不溶性の鉄（，
）―〔ヘキサシアノフエレート（）〕として
沈澱せしめることができる（英国特許第718020号
明細書）。これらの方法は高価な試薬（EDTA、
アスコルビン酸）を、しかも大量に使うという欠
点を有し、しかもこれにより鉄の有害効果を完全
に除去することはできない。鉄の沈澱のために最
も適当な試薬はカリウム―〔ヘキサシアノフエレ
ート（）であるが、製造においてこれを使用す
る場合、シアン化水素が生成する可能性がある。 （発明の目的） この発明は、今までよりも経済的に、高収量
で、所望により高い純度で、そして簡単な技法及
び簡単な装置を用いてOTCを製造する方法を提
供することを目的とする。 （発明の構成） この発明は、OTCがカルシウムイオンの存在
下で水溶性珪酸塩と共に不溶性で安定な、容易に
過し得る錯塩を形成するという知見に基礎を置
いている。 従つてこの発明は、発酵液からのオキシテトラ
サイクリン―珪酸カルシウム錯塩の製造方法に関
する。この発明においては、場合によつて界面活
性剤により前処理した発酵液を、 (a) 場合によつては水溶性珪酸塩により前処理し
た後PH0.5〜3.0に酸性化し、場合によつては
過助材を用いて、菌体を去し、液のPH値を
アルカリ液を用いて４〜５に調整し、カルシウ
ム塩又はカルシウムイオンの存在下で水溶性珪
酸塩を加え、そして場合によつては水溶性炭酸
塩又は炭酸水素塩を加え、そして長時間撹拌し
た後、形成されたオキシテトラサイクリン―珪
酸カルシウム錯塩を場合によつては過助材の
存在下で取し；あるいは又 (b) カルシウム塩及び水溶性珪酸塩と混合し、所
望によりアルカリ液を用いてPH値を８〜11に調
整し、場合によつては混合物に水溶性珪酸塩又
は炭酸水素塩を加え、そして長時間撹拌した
後、菌体上に沈澱したオキシテトラサイクリン
―珪酸カルシウム錯塩を場合によつては過助
材の存在下で取し；そして (a)又は(b)によつて得られたオキシテトラサイク
リン―珪酸カルシウム錯塩を20℃〜120℃の温度
において乾燥する。 （構成の具体的な説明） 変法(a)においては、酸性化した後に菌体を去
し、そして純液中に珪酸カルシウム錯塩を形成
せしめる。変法(b)においては、錯塩を菌体上に直
接沈澱せしめる。変法(b)はより少ない段階から成
るが、この生成物は飼料添加物としてのみ使用す
ることができる。変法(a)に従えば、鉄を含有しな
い非常に純粋な生成物が得られ、このものは医薬
用としてさらに処理することができる。 この方法を流れ図により詳細に説明する。 場合によつてはこの方法を開始する前に発酵液
を界面活性剤により前処理することができる。例
えばステロゲノール（Sterogenole）（セチルピリ
ジニウムブロミド）が適当である。界面活性剤は
微生物（ストレプトマイセス・リモサス）の細胞
壁を実質上破壊し、そして細胞内に結合している
OTCを遊離せしめる。 原形質溶解と称するこの工程は、細胞が完全に
溶解するまで0.001〜0.03％（発酵液の全重量に
対して）の界面活性剤を加えながら、5.3〜5.6の
PH値、及び約40℃の温度において行う。上記の量
のステロゲノールにより処理された発酵液は、顕
微鏡下で細胞を有しない。 原形質溶解はすべての場合に必要なわけではな
い。この工程は一般に、発酵液が非常に粘稠で、
これを撹拌することが困難な場合に行う。これは
特に発泡を防止するために発酵中に油脂を加えた
場合である。このような発酵液の場合には、これ
を界面活性剤で処理することによりOTCの収量
が非常に増加する。処理しなければ失われたであ
ろう細胞中に含まれている量が影響を受けるから
である。 変法(a)に従えば、発酵液を場合によつては水溶
性珪酸塩により処理する。この段階は鉄を含有し
ない生成物を得る場合に実施する。その重量に対
して0.1〜3.0％、好ましくは1.5〜2.0％の水溶性
珪酸塩、好ましくはナトリウム水ガラスを発酵液
に対して加える。鉄（）及び鉄（）の両者が
珪酸イオンによりその珪酸塩の形で沈澱する。こ
れらは弱酸及び弱塩基中で不溶である。沈殿した
珪酸鉄は、後で過により菌体と一緒に除去され
る。 次の段階で、発酵液をPH0.5〜3.0、好ましくは
1.0〜2.0に酸性化する。このために有機酸及び無
機酸を同様に使用することができる。燐酸及び酢
酸はOTCが生物学的に無効の４―エピマーにエ
ピマー化するのを触媒するため、これらの酸を使
用するのは好ましくない。塩酸は活性物質である
OTCを強く攻撃し過ぎる。蓚酸及び硫酸が最良
の酸であることが証明された。蓚酸のみを使用す
るのは経済的でない。約90％の硫酸と10％の蓚酸
とから成るこれらの混合物を使用するのが最適で
ある。１Kgの発酵液に対して、11重量％の硫酸と
1.5重量％の蓚酸を含有する混合物を30〜120ml、
好ましくは45〜70mlの量で使用する。酸性化の過
程でOTCが幾分分解する〔J.Am.Chem.Soc.75
5455（1953）〕が、条件を適切に選択することによ
り損失を６％未満に維持することができる。 過により酸性発酵液から菌体（珪酸鉄が沈澱
している場合にはこれも一緒に）を分離する。所
望により、過助材、例えばパーライトを使用す
ることができる。材上の菌体を前記の組成の酸
により一度洗浄し、洗浄液を液と一緒にする。
この方法において最高８％の全活性物質が菌体中
に残留する。この量はさらに洗浄することによつ
ても達成されようが、さらに処理することにより
液の体積が大きな問題となろう。 カルシウム塩及び水溶性珪酸塩、好ましくは水
ガラスにより酸性液からOTCを沈澱せしめる。
第一の段階において鉄の沈澱と除去を行わなかつ
た場合には、この段階で錯塩と共に鉄を沈澱せし
め、そしてこの塩の中に残留せしめる。鉄（）
及び鉄（）を分離することができ、しかし
OTCが損傷を受けないPH値が存在する。PH４〜
５が最適であり、塩基性物質、好ましくは水酸化
ナトリウムによりこの調整を行う。 沈澱試薬の添加速度が沈澱の粒子サイズに影響
を与える。一般に、粒子が小さ過ぎる場合には活
性物質が部分的に再溶解し、そして粒子が大き過
ぎる場合には沈澱が完全でないから、中程度の粒
子サイズを得る必要がある。 カルシウム塩として塩化カルシウムを使用する
のが適当である。水溶性珪酸塩として市販の水ガ
ラス（ナトリウム水ガラス＝珪酸ナトリウム）を
使用するのが実際的である。これを、水を用いて
その体積の４倍に稀釈するのが好ましい。この溶
液を、１Kgの発酵液に対して１〜20ml、好ましく
は４〜９ml使用することが必要である。 沈澱を完全にするため、2N水酸化ナトリウム
水溶液を用いてPHを８〜11に調整する。混合物を
30分間〜５時間撹拌する。さらに、炭酸塩又は炭
酸水素塩を加えれば沈澱がさらに急速になる。こ
れはおそらく塩析効果であろう。10％溶液として
使用する炭酸水素ナトリウムが最も適当である。
１Kgの発酵液のために0.5〜10ｇ、好ましくは１
〜３ｇの炭酸水素塩を使用する。 沈澱した錯塩はできるだけ早く母液から分離
し、活性物質が溶解しないようにする。母液の
OTC濃度を測定することにより正確な時間を決
定し、これが最小値に達した場合に過が完成す
る。場合によつては過助材を使用する。このよ
うな条件下で最高0.04〜0.06mg／mlのOTCが母液
に残留し、OTCが母液に残留することによる損
失は１％未満である。 取した湿潤状態のOTC錯塩を大気圧下又は
真空中で乾燥する。乾燥温度は20℃〜120℃、好
ましくは10℃〜110℃とする。錯塩中に含まれて
いるアルカリ性物質（Na，Ca化合物）が活性物
質を攻撃する可能性があるので常に撹拌、分離及
び反転を行うとにより乾燥時間を可能な限り短縮
する。 変法(b)においては、発酵液を沈澱剤、すなわち
カルシウム塩及び水溶性珪酸塩と直接反応せしめ
る。この場合は、水溶性珪酸塩（ナトリウム水ガ
ラス）を水を用いて１：１の比率で稀釈し、そし
て１Kgの発酵液に対して５〜100ml、好ましくは
約10mlの量で使用する。 水ガラスは強塩基性である。沈澱のための最適
PHである８〜10に達しない場合には水溶性塩基を
加えてアルカリ性に調整する。沈澱工程を促進す
るために炭酸塩又は炭酸水素塩を加えることがで
きる。添加する物質の量及び形態は変法(a)におい
て記載したのと同様である。菌体上に直接沈澱し
た錯塩を分離し、そして変法(a)に記載したのと同
様にして乾燥する。 この発明の方法に従えば、希酸により可溶化さ
れる全鉄含量が２〜200μｇ／ｇ（γ／ｇ）であ
る鉄製発酵槽においてもOTC―珪酸カルシウム
錯塩を製造することができる。この生成物は
OTC塩酸塩及びOTC二水和物の製造のために適
当である。この発明の方法の他の利点は公知方法
に比べて収率が高い点にある。発酵液中に含まれ
るOTCの約85％を回収することができる。得ら
れた錯塩は変法(a)においては約50％、変法(b)にお
いては約18〜20％の活性物質を含有する。変法(b)
により得られた生成物は飼料用として直接使用す
ることができる。 次の例によりこの発明をさらに詳細に説明す
る。 例 １ 2132ｇのOTC発酵液（合計15.56ｇのOTCを含
有する）に、１：１の比率で稀釈したナトリウム
水ガラス（ハンガリー標準No.MSZ929，40〜45゜B
のナトリウム水ガラス及び水、比率１：１）40ml
を、室温にて撹拌しながら添加する。次に150ml
の10％塩化カルシウム溶液を加え、そして１：１
の比率で稀釈したナトリウム水ガラスによりPHを
９に調整する。このために稀釈ナトリウム水ガラ
スが約200ml必要である。混合物を２時間撹拌し、
そして過する。157.8ｇの乾燥生成物を得る。
この生成物は14.517ｇ（9.2％）の純活性物質を
含有し、この収量は最初の活性に対して93％に相
当する。 例 ２ 室温において、2076ｇのOTC発酵液（16.320
ｇのOTCを含有）に、１：１の比率で稀釈した
ナトリウム水ガラス45ml及び次に10％CaCl2溶液
を86mlを加える。次に2N水酸化ナトリウム溶液
によりPHを9.2に調整し、そして混合物を75mlの
10％炭酸水素ナトリウム溶液と反応せしめる。混
合物を２時間撹拌し、そして11ｇのパーライトを
加えて過する。乾燥生成物の重量は83.0ｇであ
り、この生成物は15.520ｇ（18.7％）のOTCを含
有し、これは95％の収率に相当にする。 例 ３ 室温にて撹拌しながら、2042ｇのOTC発酵液
（合計19.68ｇのOTCを含有する）に、１：１の
比率で稀釈したナトリウム水ガラス50mlを加え
る。次に、25％硫酸約200mlによりPHを１に調整
する。混合物を30分間撹拌し、６ｇのパーライト
を加えた後過し、そして菌体を800mlの水で洗
浄する。液及び洗浄水を一緒にする。得られた
2700mlの液は17.52ｇのOTCを含有する。撹拌し
ながら、2N水酸化ナトリウム溶液によりPHを4.5
に調整する。160mlの10％塩化カルシウム及び
１：３の比率で稀釈したナトリウム水ガラスから
成る沈澱剤を加える。ナトリウム水ガラスはPHが
6.5に上昇するまで（約29ml）使用する。次に、
2N水酸化ナトリウム溶液によりPHを9.2に調整
し、そして50mlの10％炭酸水素ナトリウム溶液を
加える。３時間後に過し、そして乾燥を行う。
14.96ｇのOTCを含有する39.78ｇの生成物を得
る。この量は76％の収率に相当する。 例 ４ 室温にて撹拌しながら、1704ｇのOTC発酵液
（合計16.040ｇのOTCを含有する）に153mlの10
％蓚酸（90ml／Kg）を加える。PHは２に低下す
る。混合物を過し、そして菌体を426mlの水
（250ml／Kg）で洗浄する。液及び洗浄水を一緒
にする。得られた1970mlの液は13.794ｇのOTC
を含有する。2N水酸化ナトリウム溶液を用いて
溶液のPHを4.5に調整する。次に、52mlの10％
CaCl2溶液、及び次に１：３の比率で水で稀釈し
た水ガラスをPHが6.5になるまで加える。１時間
撹拌した後、2N水酸化ナトリウムを加えてPHを
９に調整する。撹拌を３時間継続し、生成物を
過し、そして乾燥する。13.040ｇ（46.1％）の
OTCを含有する28.29ｇの生成物を得る。この量
は81％の収率に相当する。 例 ５ 室温において、2124ｇのOTC発酵液（合計
18.035ｇのOTCを含有する）に、11重量％の硫
酸及び1.5重量％の蓚酸を含有する硫酸／蓚酸混
合物127mlを加える。PHは２に低下する。混合物
を１時間撹拌し、次に５ｇ／Kgのパーライトを加
え、そして混合物を過する。菌体を530mlの水
で洗浄する。液及び洗浄水を一緒にして得られ
た2390mlの液は16.646ｇのOTCを含有する。2N
水酸化ナトリウム溶液により溶液のPHを4.5に調
整する。１：３の比率で水により稀釈した水ガラ
ス52.4ml及び10％CaCl2溶液160mlを溶液に加え
る。この段階の後約6.5になつたPH値を、2N水酸
化ナトリウム溶液により9.2に調整する。この溶
液に51mlの10％炭酸水素ナトリウム溶液を加え
る。２時間後、過及び乾燥を行う。合計16.033
ｇのOTCを含有する43.69％の錯塩を得る。OTC
の収率は89％である。 例 ６ 例５に記載したのと同様にして、2109ｇの
OTC発酵液（合計20.035ｇのOTCを含有する）
から2373mlの液（18.432ｇのOTCを含有する）
を調製する。2Nの水酸化ナトリウム溶液（約88
ml）により液のPHを4.5に調整し、次に180mlの
10％CaCl2溶液を加えた後、まず、１：３の比率
で稀釈した水ガラスにより（約35ml必要）PHを
6.5に調整し、次に2N水酸化ナトリウム溶液（約
79ml）により9.2に調整する。添加した水ガラス
の容量に相当する容量の10％炭酸水素ナトリウム
（約35ml）を加える。２時間撹拌した後過を行
う。生成物を高温空気（100〜110℃）により乾燥
する。合計17.43ｇのOTCを含有する43.6ｇの錯
塩を得る。この量は87％の収率に相当する。 例 ７ 温水と共に調製した10％溶液の形のステロゲノ
ール（セチルピリジニウムブロミド）0.63ｇを、
撹拌しながら、2065ｇのOTC発酵液（合計
21.578ｇのOTCを含有する）に加える。この混
合物のPHを、例５において使用した酸混合物によ
り5.3〜5.6に調整する。混合物を30分間40℃に加
熱し、そしてこの温度で２時間撹拌する。室温に
冷却した後、前処理した発酵液を例３〜６のいず
れかに従つてさらに処理する。所望の純度に応じ
て80〜90％の収率が得られる。
図はこの発明の方法の流れ図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 発酵液からのオキシテトラサイクリン―珪酸
カルシウム錯塩の製造方法において、場合によつ
ては界面活性剤により前処理した発酵液を、 (a) 場合によつては水溶性珪酸塩により前処理し
た後PH0.5〜3.0に酸性化し、場合によつては
過助材を用いて、菌体を去し、液のPH値を
アルカリ液を用いて４〜５に調整し、カルシウ
ム塩又はカルシウムイオンの存在下で水溶性珪
酸塩を加え、そして場合によつては水溶性炭酸
塩又は炭酸水素塩を加え、そして長時間撹拌し
た後、形成されたオキシテトラサイクリン―珪
酸カルシウム錯塩を場合によつては過助材の
存在下で取し；あるいは又 (b) カルシウム塩及び水溶性珪酸塩と混合し、所
望によりアルカリ液を用いてPH値を８〜11に調
整し、場合によつては混合物に水溶性炭酸塩又
は炭酸水素塩を加え、そして長時間撹拌した
後、菌体上に沈澱したオキシテトラサイクリン
―珪酸カルシウム錯塩を場合によつては過助
材の存在下で取し；そして(a)又は(b)によつて
得られたオキシテトラサイクリン―珪酸カルシ
ウム錯塩を20℃〜120℃の温度において乾燥す
ることを特徴とする方法。 ２ (a)において、PH0.5〜3.0に酸性化するために
蓚酸と硫酸との混合物を使用することを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ (a)において、水溶性珪酸塩として市販のナト
リウム水ガラスを水により１：３の比率で稀釈し
て１Kgの発酵液に対して１〜20ml、好ましくは４
〜９ml使用することを特徴とする特許請求の範囲
第１項記載の方法。 ４ (b)において、水溶性珪酸塩としてナトリウム
水ガラスを水により１：１の比率で稀釈して１Kg
の発酵液に対して５〜100ml、好ましくは８〜12
ml使用することを特徴とする特許請求の範囲第１
項記載の方法。 ５ カルシウム塩として塩化カルシウムを使用す
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
方法。 ６ 水溶性炭酸水素塩として炭酸水素ナトリウム
を使用することを特徴とする特許請求の範囲第１
項記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
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| JP58190007A Granted JPS6083596A (ja) | 1981-08-05 | 1983-10-13 | 発酵液からのオキシテトラサイクリン−珪酸錯塩の製造方法 |
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