JPH01250861A - エリスロポエチンの免疫学的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ・崖】」≦１旧１褒Ｊ 本発明は、エリスロポエチン（以下ＥＰＯと略する）の
測定方法に関するものである。

皿米二役街 ＥＰＯは、未熟な赤血球系前駆細胞に働き、分化増殖を
誘導する造血ホルモンの一つで、赤血球数を恒常的に保
つ上で非常に重要な役割を果たしている。すなわち、Ｅ
ＰＯは通常、組織の酵素需要に応じて主に腎臓で生産さ
れ、体内の赤血球量を調節する役割を担っている。低酸
素状態では、その産生が促進され、逆に高酸素状態では
低くおさえられている。

血中のＥＰＯ量を測定することは、Ｍｉ織における酸素
需要のバランスを知る上で非常に重要である。また、そ
の他臨床上、多数の有用な情報を得ることができる。例
えば、真性多血症及びり成性多血症は、臨床上類似し多
血症状を示すが、その原因が全く異なり、その治療方法
も異なっている。

すなわち、それらの症状における血中ＥＰＯ量は、前者
では非常に低値を示すのに対し、後者では、高値を示す
。したがって、血中ＥＰ○を測定することにより、両者
を容易に区別でき、適切な治療を行うことができる。ま
た、ＥＰＯを貧血患者に投与し、治療を行う場合におい
て、患者自身の血中ＢＰＯ量と外部から与えたＢＰＯ量
を追跡することは、適切な投与を行う上で非常に有用で
ある。

この様に血中ＥＰＯの測定は臨床上非常に重要である。

ＢＰＯの測定には、マウスやラット等の小動物を用いる
バイオアッセイ法〔臨床検査技術全書第３巻血液検査、
小酒井望、阿部裕、林康之、古川俊之編、ｐ２２２．１
９７２　（医学書院）〕が一般的に知られていたが、該
方法は、測定操作が煩雑なうえに、測定感度が悪＜、臨
床応用には至らなかった。また、細胞培養技術の発達に
よって、骨髄細胞や胎児肝細胞の培養が可能となりｉｎ
　ｖｉｔｒ。

バイオアッセイ法（Ｅ、Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ　ａｎｄ
　Ｇｒｏｓｓ、　ｒメソオズオブエンザイモロジーＪ　
（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏ＋、）Ｘ　Ｘ　Ｘ　Ｖ
　ＩＩ　、ｐ１０９　　（１９７５））　　、　（Ｎ、
Ｃ，Ｂｒａｎｄａｎ、Ｐ、Ｍ。

Ｃｏｔｅｓ　ａｎｄ　Ｊ、Ｅｓｐａｄａ、　　ｒブリテ
ィッシュジャーナルオブヘマトロジーＪ　（Ｂｒ、Ｊ、
Ｈａｅｍａｔｏｌ　）４Ｌ４６１　（１９８１）　）が
確立し、測定感度の改善が行われたが、試料中の夾雑物
の影響を受けやすく、煩雑な操作を要するため、やはり
臨床応用には至らなかった。

また、すでに、ＢＰＯと特異的に反応する抗体（以下特
異抗体と呼ぶ）を用いた免疫学的な測定法であるラジオ
イムノアッセイ法（ＲＩＡ法）を確立し［１１，Ｍｉｚ
ｏｇｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ、　ｒアクタヘマトールジャ
バンＪ　（Ａｃｔａ　Ｈａｅｎ＋ａｔｏｌ　Ｊｐｎ、　
５０．１５　（１９８７））正常血中ＥＰＯの測定を可
能とした。しかし、該方法では、放射性同位元素（＋２
５１）を用いなければならず、そのうえ特殊施設を要し
、廃棄物処理上の問題点を有していた。さらには、近年
、酵素免疫測定法が著しく進歩し、血中ＥＰＯを測定し
ようとする試みがなされているが、正常人血中ＢＰＯ量
が１（１−２０ｍ　Ｕ／ｍ　ｊ！　（０，１〜０．２ｎ
ｇ／ｍ　Ｉり　と極めて微量であるため、公知の酵素免
疫測定法で測定するには、検出が困難であると考えられ
ていた。

このため、本発明者らは、さきに、ＥＰＯの特異抗体を
第１抗体として不溶性支持体に結合させた抗体結合不溶
性支持体にＥＰＯを含む被検液及びＥＰＯの特異抗体で
且つ前記第１抗体とは異なる動物種に免役して得られた
第２抗体を反応させた後、さらに、前記第２抗体を作製
した動物種の免疫グロブリンと特異的に反応する第３抗
体に酵素標識を作った標識抗体を反応させ、前記抗体結
合不溶性支持体上に結合した前記標識抗体の量を測定す
るか、もしくは結合しなかった標識抗体の量を測定する
ことにより前記被検液中のＢＰＯ量を測定する免疫学的
測定法を完成し、既に特許出願した（特願昭６２Ｊｌ夛
）。しかし、この技術は、非常に煩雑な操作を有すると
いう欠点があった。さらには、高感度測定が可能な測定
法として、グルコース−６−リン酸脱水素酵素を用いた
標識抗体を作製し、グルコース−６−リン酸脱水素酵素
の活性測定を生物発光法で行う、サンドイッチＥＩＡ法
（エンザイムイムノアツセイ法）を完成し、既に特許出
願した（欅願昭６２−２３５５６６号）。

しかし、該方法においても、生物発光測定というやや特
殊測定装置を要するという欠点を有しており、さらには
、上記ＥＩＡ法においてはポリクローナル抗体を使用す
るために作製したポリクローナル抗体のロフトが変わる
ごとに感度が変わるという不利な点があった。

発註が解決しようとする課題 本発明者らは、畝上の状況に鑑み、使用するモノクロー
ナル抗体としてエピトープの異なる２種の抗体を選択し
することにより、煩雑な操作を必要とせず、或は、特殊
な装置を必要とせず、通常の臨床検査に用いるイムノリ
ーダーを用いて短時間に実施でき、且つ検査感度の高い
ＥＰＯのサンドイッチＥＩＡ法による測定方法を堤供す
ることを課題とする。

本発明の特徴は、ＥＰＯに対するエピトープの異なる２
種のモノクローナル抗体を選択し、ＥＰＯと特異的に反
応する第１抗体を固相担体く例えば、ポリ塩化ビニール
プラスチック製９６穴フレキシブルアセイブレート、フ
ァルコン社製、Ｆａｌｃｏｎ３９１２）に結合させた抗
体結合固相担体に、ＥＰＯを含む被検液を加えて反応さ
せ、抗体結合固相担体にＥＰＯを結合させた後、前記第
１抗体とは異１〆 なる抗体決定部位を有する第２抗体に標識物質（例えば
、アルカリフォスファターゼ、Ｓｉｇｍａ　Ａｌ−ｋａ
ｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　Ｔｙｐｅ　Ｖ　Ｕ
−Ｓウシ小腸由来Ｐ−５５２１）を結合させた標識抗体
を反応させ、前記抗体結合固相担体上に結合した前記標
識抗体の量を測定することにより前記被検液中のＥＰＯ
量を測定することから構成されるＥＰＯの免疫学的測定
法にある。

立朋 本発明は、上述の如く構成されるが、要は、ＥＰＯと特
異的に反応する第１抗体を結合した抗体結合固相担体に
抗原であるＥＰＯを介して、標識物質を結合させた第２
抗体を結合させ、結合した標識物質を測定することによ
り非常に簡便に血中等のｉｔにしか存在しないＥＰＯを
感度よく測定することを可能としたものである。

本発明に使用する特異性の高い抗体を得るには、ＥＰＯ
をできるだけ純化しておくことが好ましい。

例えば、アフィニティクロマトグラフゲル濾過等の公知
の精製手段を組合わせて実施可能である。

この精製ＥＰＯをＢａ１ｂ／ｃマウスに免疫して牌細胞
を得、骨髄腫細胞とポリエチレングリコールにより融合
させ、ＨＡＴ選択培地による選別と限界希釈法によるク
ローニングをくり返すことにより得られる。

次に、この様にして得られた第１抗体を固相担体に結合
させる。固相担体としては、マイクロプレート、ポリス
チレンチューブ、ポリスチレン球、シリコーン片などが
あげられるが、特にポリ塩化ビニールプラスチック製９
６六マイクロプレートが好ましい。これらの固相担体に
結合させる方法は、公知の化学的方法もしくは物理的方
法のいずれの方法でもよい。例えば、物理的方法として
は、抗体を適当な緩衝液に熔解し、前記固相担体を接触
させて、０℃〜室温にて、数時間から一夜、好ましくは
、４℃、−夜或は室温２時間放置した後、Ｔｗｅｅｎを
含むＰＢＳ　（リン酸緩衝生理的食塩水；ｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｄ　５ａｌｉｎｅ）にて洗浄を行
い未吸着抗体を除去した後、牛血清アルブミンを含むＰ
ＢＳとＯ℃〜室温にて、数時間から一夜、好ましくは、
４℃−夜、或は室温２時間接触させることにより、未反
応の固相担体活性基に牛血清アルブミンを吸着させた後
、前述のＴｗｅｅｎを含むＰＢＳ溶液にて再び洗浄する
。この様にして、抗体結合固相担体を作製する。

次に、第２抗体に結合させた標識抗体（以下単に標識抗
体と呼ぶ）を作製する。第２抗体は第１抗体とは抗原決
定部位（抗原の認識結合部位）と異なる抗原決定部を存
する抗体を用いて行う。第２抗体と標識物質の結合は公
知の方法で実施できる。例えば、グルタルアルデヒドを
用いて行い得る。すなわち、第２抗体溶液と標識物質溶
液を混合し、グルタルアルデヒドを加え、室温で１〜２
時間反応させた後、０〜４℃で一晩透析し、未反応のグ
ルタルアルデヒドを除去してのち、トリス緩衝液にて、
さらに、０〜４℃で一晩透析し、未反応のグルタルアル
デヒドを不活性化する。尚、透析は好ましくは、透析外
液を１〜３回途中で取り換える。

以上のようにして調製した標識第２抗体に安定剤である
牛血清アルブミン及び窒化ナトリウムを加え、冷暗所に
保存すれば、少くとも６ケ月は安定である。ここで標識
物質としては、酵素、螢光物質、金属などがあげられる
が特に酵素が好ましい。さらに酵素としては、アルカリ
フォスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−
ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロ
ゲナーゼなどが好適であるが、特にアルカリフォスファ
ターゼが有利である。

以上の様にして得られた抗体結合固相担体及び標識抗体
を用いてＥＰＯを測定するには、次の様にして行う。ま
ず抗体結合固相担体にＥＰＯを含む被検液を加え０〜５
０℃にて１時間〜１夜、好ましくは、１５〜３５℃にて
２〜４時間反応させる。ここでＥＰＯを含む被検液とは
、血清、血漿、尿、ＥＰＯ生産培養液などを示す。この
様にして反応させた抗体結合固相担体上には、被検液中
に含まれるＥＰＯｉに比例してＥＰＯが結合しているの
で、抗体結合固相担体を洗浄後、更に標識抗体を０〜５
０℃にて１時間〜１夜、好ましくは、１５〜３５℃にて
２〜４時間反応させると前記抗体結合固相担体上にはＥ
ＰＯの結合量に比例して標識抗体が結合することになる
。したがって、この標識抗体の標識物質の量を測定し、
予め作成した検量線より被検液中のＥＰＯを測定するこ
とができる。ここで標識物質として酵素を用いた場合は
、その酵素活性を測定すればよい。

また、上記のＥＰＯの測定操作をより筒便に行うには、
標識抗体に使用する第２抗体にモノクローナル抗体を使
用しているため、抗体結合固相担体とＥＰＯ含有の被検
液及び標識抗体を同時に混合し、０〜５０℃にて１時間
〜１夜、好ましくは、１５〜３５℃にて２〜４時間反応
後、前記と同様にして抗体結合固相担体に結合した標識
物質の量を測定し、予め作成した検量線より被検液中の
ＥＰＯをより簡便に測定することができる。

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は、こ
れらの実施例により限定されるものではない。

実施例１ ■抗原ＥＰＯの調製： 特開昭６０−４１６１４号公報に記載の方法に従って、
貧血愚者尿より分離したＥＰＯ（貧血患者尿濃縮物をＳ
ＤＳ処理後、抗体吸着処理及びゲル濾過により取得した
ＥＰＯ標品）のＰＢＳ溶解物を水冷し、−２０°Ｃに冷
却した９９．５％エタノールの９倍量を添加してＥＰＯ
を沈澱させた。この沈澱を一２０℃の９０％エタノール
溶液で洗浄した後、減圧下に乾燥し、０．０１ｍＭ　Ｃ
ａＣＩｚを含む１０ｍＭ　ＮａＰｉバッファー（ｐＨ６
，８）に熔解し、予め同じバッファーで平衡化したハイ
ドロキシアパタイトカラムに通し、非吸着画分にＥＰＯ
を回収した。得られたＥＰＯの純度は９９％であった。

■上記ＥＰＯによる　験Φ　の　　： 前記の方法にて調製した純化ＥＰ○を抗原として使用し
、実験動物としてマウス（Ｂａｌｂ／ｃマウス）を用い
、このマウスに対し、次のとおり２週間間隔で３回免疫
を行った。

第１回免疫： ＰＢＳ中に純化ＥＰＯクンバク質を１ｍｇ／ｍ　ｉｔで
溶解し、これに等量のフロイント完全アジュバントを混
合して得たエマルジョン０．２ｍ７！をマウスに対し腹
腔内注射で投与した。

第２回免疫： ２週間後に同上のエマルジョン液１００μａをマウスに
対し腹腔内注射で投与した。

第３回免疫： ＰＢＳ中に純化ＥＰＯを０．５ｍｇ／ｍ　１！で溶解し
、１００μｌをマウスに対し、２週間後に腹腔的投与し
た。

■抗ＥＰＯ抗体産生ハイプリドーマの調製：ｉ）細胞融
合の作製 前記免疫処理終了から３日後に免疫マウスの肺細胞を無
菌的に摘出し、合成培養液（ＲＰＭ１１６４０液）と１
５％生胎児血清（ＦＣＳ）との混合液で洗浄後、該混合
液中で肺臓細胞をハサミで細断して単細胞化を行い、該
混合液で２回洗浄した後、単細胞化した細胞をＲＰ　Ｍ
　ｒ　１６４０液に分散した。細胞数は８　Ｘ　１０’
個であった。別にマウスのミエローマ細胞（Ｐ３／ＮＳ
Ｉ／１−Ａｇ４−１）を前記ＲＰＭＩ及びＦＣＳの混合
溶液中で培養し、増殖した細胞をＲＰＭ　Ｉ　１６４０
液で洗浄した。細胞数は４　Ｘ　１０”個であった。

次に前記で調製した免疫マウス牌細胞とマウスミエロー
マ細胞とをＲＰ　Ｍ　１１６４０液に分散し、混合した
後、遠心し、上滑を除去した。混合細胞をポリエチレン
グリコール１５００の５０％溶液中で細胞融合させた後
、融合細胞をＨＴ培養液（ヒボキサンチン、チミジン及
び１５％牛脂児血清を含むＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０液）
に混合し、混合液を８枚の９６穴マイクロタイタープレ
ートにまいて２日目以降、ＨＡＴ培養液（ヒボキサンチ
ン、アミノプテリン、チミジン及び１５％牛脂児血清を
含むＲＰＭ１１６４０液）を添加して、各人で２週間培
養してＨＡＴ選択を行った。増殖したハイブリドーマ細
胞を３２６穴において確認した。

ＩＩ）上記ハイブリドーマ細胞のスクリーニングによる
選出 前記で得た３２６種類のハイブリドーマより特定の細胞
、すなわち、ＥＰＯと特異的に結合し得る抗体を産生ず
るハイブリドーマを選び出すために、”’Ｉ−ＥＰＯ（
ヒト尿由来純化ＥＰＯをｌ０Ｄ０−ＧＥＮ法にて１２５
１で標識したも）９８μｃｉ／μｇＥＰ○）を用いて＋
２５ｒ　　ＥＰＯと特異的に結合する抗体が、ハイブリ
ドーマ培養液中に存在することを確認して選出した。

その結果、目的に適合したものとして２２種類の細胞が
選出され、そのうち１２Ｊ−ＥＰＯとの結合値の高かっ
たもの８種についてハイブリドーマの継代培養を続け、
限界希釈法によりモノクローン化を行い、安定的に抗体
産出を行う４種のハイブリドーマ細胞（門Ｃ−Ｒ−２、
ＭＣ−Ｒ−４、肛−Ｒ−６、ＭＣ−１？−１２）、を得
た。

■モノクローナル抗ＥＰＯ抗体の生産：前記のハイブリ
ドーマ細胞ＭＣ−１？−２、ＭＣ−Ｒ−４、ＭＣ−Ｒ−
６、ＭＣ−Ｒ−１２を用いて、抗体産生を行った。

すなわち、常法通りに、マウス腹腔内に、各細胞を移植
し、マウス腹腔内で抗体を生産させ、５０％硫安分画に
付した後、ＤＥ５２（ワットマン社製、ＤＥＡＥ−セル
ロース）充填カラムを通し、０．１Ｍ〜０．２Ｍ　Ｎａ
Ｃｌ画分として精製免疫グロブリン（ＩｇＧ）を得た。

各細胞当りマウス１０匹を用い、それぞれ３００ｍｇ、
　２８０ｍｇ、２５０ｍｇ、２６０ｍｇの精製モノクロ
ーナル抗体を得た。

■抗体結合支持体の作成： ポリ塩化ビニ〜ルプラスチック製９６穴フレキシブルア
ッセイプレート　（ファルコン社製、Ｆａｒｃｏｎ３９
１２）をエタノールで洗浄し、乾燥した後に抗ＥＰＯモ
ノクローナル抗体ＭＣ−Ｒ−６を１０　ｐ　ｇ’／ｌｎ
　ｊ！になるように０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（
ｐｔ＋　９．６）に溶解した抗体液をアッセイプレート
の各ウェルに１００μｌずつ分注し、４℃１晩（或は室
温２時間）静置後、抗体溶液を除去し、Ｐ　Ｂ　Ｓ　−
Ｔｗｅｅｎ溶液（０，０５％Ｔｗｅｅｎ２０．０．０２
％ＮａＮ１含有ＰＢＳ溶液）でウェル内を３回洗浄した
後に、各ウェルに１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液（１％ＢＳＡ
含有ＰＢＳ溶液）を２００μβずつ分注し、室温で２時
間静置後、ウェル内をＰ　Ｂ　Ｓ−Ｔｗｅｅｎ溶液で３
回洗浄し、抗体コートウェル（抗体結合支持体）とした
。

■酵素標識抗体の作成： 抗体として抗ＥＰＯモノクローナル抗体ＭＣ−Ｒ−２を
、酵素としてシグマ社製ウシ小腸由来アルカリフォスフ
ァターゼ（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐ
ｈａｔａｓｅＴｙｐｅ■−８）を用いた。

１．４ｍｇのＭＣ−Ｒ−２と５０００単位のアルカリフ
ォスファターゼを０．０５Ｍ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　（０，１５
？Ｌ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝ｉ
）ｔｍｌに溶解し、４“Ｃで一晩透析する。尚、透析外
液は０．０５Ｍ　ＰＢＳ　ＩＮで、適時２回の外液交換
を行った。次に２５％グルタルアルデヒド溶液を０．２
％（ν／ν）になる様に加え、室温で１〜２時間反応さ
せた後に、４℃で一晩透析を行った。尚、透析外液は０
．０５Ｍ　ＰＢＳ　ＩＮで、適時２回の外液交換を行っ
た。さらに透析外液を５０１１１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ
８，０）、１ｍＭ　ＭｇＣＩｚに交換し、４℃で一晩透
析する（外液は５００ｍβで適時２回交換）。透析終了
後、ＢＳＡ　１％（ｗ／ｖ）、ＮａＮ３０．０２％（ｗ
／ｖ）　　となる様に５％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ、、
１ｍＭ　ＭｇＣＩｇ含有５０ｍＭ　トリス緩衝液を１７
４容量加え、酵素標識抗体溶液とした。尚、本溶液は、
４℃暗所で保存した。

■ＥＰＯの測定： ＥＰＯの測定は、次の様にして行った。抗原コートウェ
ルに被検体液１００μ７！（被検体液は５％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ溶？＆、）で適切濃度に希釈した後、１／１０容
量の１０倍緩衝液（０，５％Ｔｗｅｅｎ２０．１０ｍＭ
　ＥＤＴＡ、０．２％ＮａＮｙ含有ＰＢＳ溶液）を入れ
、室温で２時間反応（放置）した後、Ｐ　Ｂ　Ｓ−Ｔｗ
ｅｅｎ溶液（０，０５％Ｔｉｖｅｅｎ２０．０．０２％
ＮａＮｔ含有ＰＢＳ溶液）で各ウェルを３回洗浄した。

次に各ウェルに１００〜２００倍希釈酵素標識抗体溶液
を１００μρずつ入れ、室温で２時間反応（放置）させ
た後、上述と同様にＰＢ　Ｓ−Ｔｗｅｅｎ溶液で３回ウ
ェルを洗浄し、遊離の酵素標識抗体を除去する。各ウェ
ルに酵素基質液（ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ　ｐｈｏ
ｓｐｈａｔｅ　ｄｉｓｏｄｉｕｍを２ｍｇ／ｍ　ｅにな
る様に、ＬＭ　ｄｉｅｔｈａｎｏｌａ＋ｎ１ｎｅ　、　
０．５Ｍ　Ｍｇｃｔ！、０．０２％ＮａＮ＊　（ｐＨ９
，８）溶液で調製したもの）　１００μβずつを入れ、
室温で３０分間反応させた後、各ウェルに３Ｍ　ＮａＯ
Ｈ溶液５０μβずつを加え、酵素反応を停止させた後、
イムノリーダーを用いて、４０５ｎｍにおける各ウェル
の吸光度を測定する。被検液中のＥＰＯ溶液は、既知濃
度のＥＰＯを含有する被検体溶液を用いて同時に同じ操
作を行ってウェルにおける吸光度の強度（検量線）との
比較を行うことにより行った。検量線は添付の第１図に
示す如くであり、５〜６０ｍＵ／ｍ／のＥＰＯ濃度の測
定が可能な検量線が得られた。

上記ＥＰＯ標準検量曲線を基準とし、各種疾患血清中に
含まれるＥＰＯ量を測定した。表１にその結果を示した
が、従来法のラジオイムノアッセイ法において測定した
結果を比較したところ、本方法が非常に有効であること
が示された。

表　１　（各種血清中のＥＰＯ量の測定）＊　１１．Ｍ
ｉｚｏｇｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ、　Ａｃｔａ　Ｈａｅｍ
ａｔｏｌ　５０，１５　（１９Ｂ？）実施例２ ＥＰＯの測定： 実施例１の■に記載した方法に準じて行ったが、被検体
液と酵素標識抗体溶液を同時に各ウェルに入れて反応す
る方法を行った。すなわち、各ウェルに被検体液５０μ
β及び酵素標識抗体溶液５０μβずつ入れ、室温で２時
間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液（０，０５％
Ｔｗｅｅｎ２０ＸＯ，０２％ＮａＮ３含有ＰＢＳ溶液）
で、各ウェルを３回洗浄し、未反応のＥＰＯ及び酵素標
識抗体を除去した。次に、各ウェルに酵素基質液１００
μｌずつを入れて室温で３０分間反応させた後に、各ウ
ェルに３Ｍ　Ｎａ０Ｉｌ溶液５０μρずつを加え、酵素
反応を停止させた後、イムノリーダーを用いて、４０５
ｎｍにおける各ウェルの吸光度を測定した。被検体液中
のＥ　Ｐ　Ｏ？Ｍ、度に対する４０５ｎｍにおける吸光
度をプロットした標準曲線を第１図に示した。

なお、実施例１の■に記載したと同じ方法に従って被検
体液と酵素標識抗体溶液を別々に反応させた場合を比較
として記載した。両者とも同等の検量曲線が得られ、５
〜６０ｍＵ／／！のＥ　Ｐ　Ｏ９３度の測定が可能であ
った。

実施例３ 本例はＥＰＯの測定におけるモノクローナル抗体の組合
わせの適否を示したものである。

実施例２に記載の方法により、支持体結合抗体、酵素標
識抗体の組合わせの適否を確認した。

支持体結合抗体（−次抗体）、標識抗体（二次抗体）と
して４種の抗体産生ハイブリドーマの適否を、測定感度
、検量曲線の直線性で比較した。

全１２組の組合わせを検討した結果、下記表２に示すと
おり一次抗体ＭＣ−Ｒ−６、門Ｃ−Ｒ−２の組合わせが
最適であることが確認された。

表　　２ ◎　：　検量線、感度ともすくれる ○　：　検量線、感度のいずれかにやや問題あり△　：
　検量線、感度ともやや問題あり×　：　検量線が引け
ない λ呪■涜来 以上述べた如く、本発明によれば、既述の構成を採用す
ることによって、従来法における様な放射性同位元素を
用いたり、特殊実験施設を用いることを必要とせず、或
は、煩雑な操作と特殊測定装置（生物発光測定）を要す
ることなく、非常に筒便にＥＰＯの測定が可能となった
。

【図面の簡単な説明】 第１図は、本発明における反応操作をより簡便化した場
合のＥＰＯ測定の標準曲線を簡便化を行わない場合を比
較したグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）エリスロポエチンに対するエピトープの異なる２
   種のもモノクローナル抗体を選択し、エリスロポエチン
   と特異的に反応する第１抗体を固相担体に結合してなる
   抗体結合固相担体に、エリスロポエチンを含む被検液を
   加えて反応させて該担体に結合させ、次いで、該エリス
   ロポエチン結合抗体結合固相担体に前記第１抗体とは異
   なる抗原決定部位を有する第２抗体に標識物質を結合さ
   せた標識抗体を反応させて上記抗体結合固相担体上に結
   合した該標識抗体の量を測定することを特徴とするエリ
   スロポエチンの免疫学的測定法。（２）標識物質はアル
   カリフォスファターゼである請求項（１）に記載の測定
   法。