JPH01245159A - ニューカッスル病ウィルス抗体の検出用プレート及び抗原ウィルスの可溶化方法 - Google Patents
ニューカッスル病ウィルス抗体の検出用プレート及び抗原ウィルスの可溶化方法Info
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- JPH01245159A JPH01245159A JP7392088A JP7392088A JPH01245159A JP H01245159 A JPH01245159 A JP H01245159A JP 7392088 A JP7392088 A JP 7392088A JP 7392088 A JP7392088 A JP 7392088A JP H01245159 A JPH01245159 A JP H01245159A
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は醇素免疫測定法（以下ＥＬＩＳＡと略称する。
）によるニューカッスル病の診断に使用するニューカッ
スル病ｒクイルス抗体の検出用ブレ、−ト及び抗原ウィ
ルスの可溶化方法に関するものである。
スル病ｒクイルス抗体の検出用ブレ、−ト及び抗原ウィ
ルスの可溶化方法に関するものである。
（従来の技術）
ＥＬＩＳＡは■他の血清反応よりも感度が高い、■迅速
に結果が得られる、■手技が簡単で自動化に適している
、■−度に多数の検体処理が可能である、■抗体の力価
測定に検体の限界希釈の代わりに１点希釈の吸光度（Ｏ
Ｄ値）で代用できる、などの利点から、ウィルス性疾病
、細菌性疾病などの各種疾病についてその診断への応用
が試みられている。そして、一般にＥＬＩＳＡの特異性
及び感度は固相化される抗原によって左右されるので、
抗原作製法はＥＩＩＳΔの最も重要なポイントになる。
に結果が得られる、■手技が簡単で自動化に適している
、■−度に多数の検体処理が可能である、■抗体の力価
測定に検体の限界希釈の代わりに１点希釈の吸光度（Ｏ
Ｄ値）で代用できる、などの利点から、ウィルス性疾病
、細菌性疾病などの各種疾病についてその診断への応用
が試みられている。そして、一般にＥＬＩＳＡの特異性
及び感度は固相化される抗原によって左右されるので、
抗原作製法はＥＩＩＳΔの最も重要なポイントになる。
従来、ニューカッスル病の診断についてもＥｌ−ＩＳＡ
の適用が検討されており、ＥＬＩＳＡの抗原作製法とし
て、ニューカッスル病ウィルス（以下ＮＤＶと略称する
。）を接種した発育鶏卵の尿膜膣液そのものを抗原どす
る方法、これから精製したウィルスを熱又はホルマリン
で不活化して抗原とする方法などがある。（Ｖｅｔ、
Ｂｕｌｌ 、 ５６゜３３７〜３４３ （１９８６）） （発明が解決しようとする課題） ＮＤＶは感染力が強く、ときには人間にも伝染して軽い
結膜炎の症状を現わすので、生きたＮＯＶを抗原として
ＥＬＩＳＡに使用する場合にはその取扱いが面倒になる
。
の適用が検討されており、ＥＬＩＳＡの抗原作製法とし
て、ニューカッスル病ウィルス（以下ＮＤＶと略称する
。）を接種した発育鶏卵の尿膜膣液そのものを抗原どす
る方法、これから精製したウィルスを熱又はホルマリン
で不活化して抗原とする方法などがある。（Ｖｅｔ、
Ｂｕｌｌ 、 ５６゜３３７〜３４３ （１９８６）） （発明が解決しようとする課題） ＮＤＶは感染力が強く、ときには人間にも伝染して軽い
結膜炎の症状を現わすので、生きたＮＯＶを抗原として
ＥＬＩＳＡに使用する場合にはその取扱いが面倒になる
。
一方、ＮＤＶを熱又はホルマリン処理で不活化した場合
には、ウィルスの抗体との結合に関与づる部分が変性し
て抗体との結合性が低下する。従って、ＥＬＩＳＡ用抗
原として使用する際には、固相化するウィルスの量を多
く必要とするという問題がある。
には、ウィルスの抗体との結合に関与づる部分が変性し
て抗体との結合性が低下する。従って、ＥＬＩＳＡ用抗
原として使用する際には、固相化するウィルスの量を多
く必要とするという問題がある。
又、ウィルスの不活化方法としてノニデツ１〜Ｐ−４０
、トライトンＸ−１００（いずれも商品名）などの界面
活性剤を用いてウィルスを可溶化する方法も知られてい
るが、これらを用いて再啓化したＮＯＶをＥＬＩＳＡの
抗原として使用した場合には、その感度が低下するとい
う問題がある。
、トライトンＸ−１００（いずれも商品名）などの界面
活性剤を用いてウィルスを可溶化する方法も知られてい
るが、これらを用いて再啓化したＮＯＶをＥＬＩＳＡの
抗原として使用した場合には、その感度が低下するとい
う問題がある。
又、ＥＬＩＳＡにおいては、固相に対する抗原の結合状
態のバラツキが測定結果の正確性を左右する重要な因子
となる。従って、養鶏場等で多量の検体をＥＬＩＳＡで
処理する場合、固相に対する抗原の結合作業〈コーティ
ング処理）からＥ ＬＩＳＡの術式を行うことは、作業
に１，１間がかかるばかりでなく測定結果にバラツキを
生ずる原因となる。
態のバラツキが測定結果の正確性を左右する重要な因子
となる。従って、養鶏場等で多量の検体をＥＬＩＳＡで
処理する場合、固相に対する抗原の結合作業〈コーティ
ング処理）からＥ ＬＩＳＡの術式を行うことは、作業
に１，１間がかかるばかりでなく測定結果にバラツキを
生ずる原因となる。
本発明は従来技術の有するこのような問題点に鑑みでな
されたものであり、その目的は抗体に対する結合能が低
下Ｊることなく不活化された安全なＮＤＶ抗原が固相化
されたＥＬＩＳＡ用プレートを提供することＣあり、さ
らには、抗体に対ηる結合能を低下させることなくＮＤ
Ｖを不活化ザる方法を提供することである。
されたものであり、その目的は抗体に対する結合能が低
下Ｊることなく不活化された安全なＮＤＶ抗原が固相化
されたＥＬＩＳＡ用プレートを提供することＣあり、さ
らには、抗体に対ηる結合能を低下させることなくＮＤ
Ｖを不活化ザる方法を提供することである。
（課題を解決するための手段及び作用）前記の目的を達
成するため、本発明はＥＬＩＳＡによるニューカッスル
病診断に使用するニューカッスル病ウィルス抗体の検出
用プレートどして、プレートに形成された複数個のつ１
ルを、オクチルグルコシド溶液処理で可溶化したニュー
カッスル病ウィルス粒子溶液でコーティングした。
成するため、本発明はＥＬＩＳＡによるニューカッスル
病診断に使用するニューカッスル病ウィルス抗体の検出
用プレートどして、プレートに形成された複数個のつ１
ルを、オクチルグルコシド溶液処理で可溶化したニュー
カッスル病ウィルス粒子溶液でコーティングした。
又、精製されたニューカッスル病ウィルス粒子をオクチ
ルグルコシド溶液で処理して可溶化することにより、Ｎ
ＤＶの抗体に対する結合能を低下させることなくＮＤＶ
が不活化される。
ルグルコシド溶液で処理して可溶化することにより、Ｎ
ＤＶの抗体に対する結合能を低下させることなくＮＤＶ
が不活化される。
精製ＮＤＶ粒子は、ＮＤＶを接挿した発育鶏卵から採取
した尿膜膣液を遠心分離して得た上清を、ショ糖密度勾
配遠心にかけた後、Ｐｕｓ （リン酸緩衝液）に再浮遊
して超遠心にかけることにより１ｑられる。ＮＤＶ粒子
の可溶化は、ＮＤＶ粒子をＰＢＳに浮遊させた溶液に、
オクチルグルコシドのＰＢＳ溶液を加えることにより室
温で行われる。
した尿膜膣液を遠心分離して得た上清を、ショ糖密度勾
配遠心にかけた後、Ｐｕｓ （リン酸緩衝液）に再浮遊
して超遠心にかけることにより１ｑられる。ＮＤＶ粒子
の可溶化は、ＮＤＶ粒子をＰＢＳに浮遊させた溶液に、
オクチルグルコシドのＰＢＳ溶液を加えることにより室
温で行われる。
可溶化されたＮＤＶのＨＡ活性（赤血球凝集性）は精製
ＮＤＶよりも多くなり、従来の不活化と異なり抗体に対
する結合能の低下はない。これは第１図に示すように、
ＮＤＶはその外膜（エンベロープ〉１に抗原２が多数存
在しており、可溶化していないＮＤＶを固相化した場合
には、第２図に示すようにプレート３と対応する側の抗
原２が抗体との結合に関与できなくなるのに対し、本発
明による可溶化ではＮＯＶの外膜１が第１図のＸ印部性
で切断されることにより、プレート３に固相化された際
、多くの抗原２が抗体との結合に関与できるようになる
ためと考えられる。
ＮＤＶよりも多くなり、従来の不活化と異なり抗体に対
する結合能の低下はない。これは第１図に示すように、
ＮＤＶはその外膜（エンベロープ〉１に抗原２が多数存
在しており、可溶化していないＮＤＶを固相化した場合
には、第２図に示すようにプレート３と対応する側の抗
原２が抗体との結合に関与できなくなるのに対し、本発
明による可溶化ではＮＯＶの外膜１が第１図のＸ印部性
で切断されることにより、プレート３に固相化された際
、多くの抗原２が抗体との結合に関与できるようになる
ためと考えられる。
可溶化されたＮＤＶ粒子溶液をコーティングするプレー
トは、ＥＬＩＳＡで一般に使用されるプレートが使用さ
れる。コーティングに使用する可溶化ＮＤＶ粒子溶液は
、ＨＡ活性（赤血球凝集性）が１＝３０〜５０となるよ
うに緩衝液で希釈調整して使用する（実用化の点では安
定的に反応を促進するため１００ＨＡとする。）。
トは、ＥＬＩＳＡで一般に使用されるプレートが使用さ
れる。コーティングに使用する可溶化ＮＤＶ粒子溶液は
、ＨＡ活性（赤血球凝集性）が１＝３０〜５０となるよ
うに緩衝液で希釈調整して使用する（実用化の点では安
定的に反応を促進するため１００ＨＡとする。）。
（実施例）
以下、本発明についてより具体的に説明する。
（１’）ＮＤＶの精製
ＮＤＶを１０〜１１日齢の発育鶏卵に接種し、２４〜４
８時間後に尿膜膣液を採取した。細胞成分除去のため５
ｏｏｏ〜１００００ｇで２時間遠心し、その上清を１０
０００００で２時間遠心してペレット状の沈澱層を回収
した。この沈澱層をＰＢＳに浮遊し、この浮遊液を２０
％及び５０％の不連続密度勾配を右するショ糖溶液層上
に重層して１０００００ｏで９０分遠心した。２０％と
５０％の間のバンドを採取して５倍♀のＰＢＳに再浮遊
し、さらに連続密度でショ糖密度勾配遠心く２０〜５０
％、１０００００ｇ、１時間）を行なった ５ｏ％領域
に近い部分に生じたバンドを採取し、シヨ砂除去のため
Ｐ［３Ｓに再浮遊して１０００００（］で１１時間心を
行った。ペレット状の沈澱物を回収し、ＰＢＳに浮遊後
液体窒素中に保存した。この精製ウィルスのＨＡ活性は
１：２０００以上、タンパク量は１０００ＨＡ／ｍｌ当
たり１００μ９以下であった。
８時間後に尿膜膣液を採取した。細胞成分除去のため５
ｏｏｏ〜１００００ｇで２時間遠心し、その上清を１０
０００００で２時間遠心してペレット状の沈澱層を回収
した。この沈澱層をＰＢＳに浮遊し、この浮遊液を２０
％及び５０％の不連続密度勾配を右するショ糖溶液層上
に重層して１０００００ｏで９０分遠心した。２０％と
５０％の間のバンドを採取して５倍♀のＰＢＳに再浮遊
し、さらに連続密度でショ糖密度勾配遠心く２０〜５０
％、１０００００ｇ、１時間）を行なった ５ｏ％領域
に近い部分に生じたバンドを採取し、シヨ砂除去のため
Ｐ［３Ｓに再浮遊して１０００００（］で１１時間心を
行った。ペレット状の沈澱物を回収し、ＰＢＳに浮遊後
液体窒素中に保存した。この精製ウィルスのＨＡ活性は
１：２０００以上、タンパク量は１０００ＨＡ／ｍｌ当
たり１００μ９以下であった。
（２）精製ＮＤＶ粒子の可溶化
精ＷＡＮＤＶ粒子を浮遊したＰＦ３５溶液に４％オクヂ
ルグルコシド液を等量加え、室温で１時間放置すること
にＪ：すＮＤＶ粒子を可溶化した。
ルグルコシド液を等量加え、室温で１時間放置すること
にＪ：すＮＤＶ粒子を可溶化した。
比較試験として０．１％のトライトンｘ−ｉ。
Ｏ及びノニデットＰ−４０（いずれも非イオン性界面活
性剤の商品名）で、ＮＤＶ粒子を可溶化した。
性剤の商品名）で、ＮＤＶ粒子を可溶化した。
精’ＩＮＤＶ、オクチルグルコシドによる可溶化ＮＤＶ
、トライトンＸ−１００による可溶化ＮＤ■、ノニデッ
トＰ−４０による可溶化ＮＤＶについて、０．５％鶏赤
血球液を使用して一般的に用いられるｍ１ｃｒｏ法に従
って赤血球凝集（ＨＡ）試験を２倍希釈法で行った。又
、抗原中に残留する可溶化物質の溶血性試験をも行った
。結果を表に示す。
、トライトンＸ−１００による可溶化ＮＤ■、ノニデッ
トＰ−４０による可溶化ＮＤＶについて、０．５％鶏赤
血球液を使用して一般的に用いられるｍ１ｃｒｏ法に従
って赤血球凝集（ＨＡ）試験を２倍希釈法で行った。又
、抗原中に残留する可溶化物質の溶血性試験をも行った
。結果を表に示す。
抗体との結合能を表すＨＡ活性は、オクチルグルコシド
処理ＮＤＶではＩｔ製ＮＤＶより２３高くなったのに対
して、トライトンＸ−１００処理ＮＤＶ及びノニデット
Ｐ−４０処理ＮＤＶでは精製ＮＯＶより２１以上低くな
った。
処理ＮＤＶではＩｔ製ＮＤＶより２３高くなったのに対
して、トライトンＸ−１００処理ＮＤＶ及びノニデット
Ｐ−４０処理ＮＤＶでは精製ＮＯＶより２１以上低くな
った。
（３〉可溶化処理ＮＤＶのコーティングオクチルグルコ
シドで処理した可溶化ＮＯＶを透析ののち溶液（１−Ｉ
Ａ活性１：１６０００以上）を炭酸緩衝液（ｐ Ｈ９
，６，Ｎａ ＮＪ ０．０２％含右）でｌ−Ｉ Ａ活
性１：１００となるように希釈調整したものをコーティ
ング用液とした。一般のＥＬＩＳＡ用プレー上プレート
多数（例えば９６個）のウェルを有するプレートの各ウ
ェルに、前記コーティング用液を１００μｍずつ入れ、
４℃で４８時間放置した。コーティング用液を捨て、１
％アルブミン加ＰＢＳを１００μｍずつ各ウェルに入れ
、３７℃で３０分反応させた。次に０．１％トウィーン
２０加ＰＢＳで各ウェルを２回洗浄した後、プレートを
よく乾燥した。コーテイング後のプレートは４℃では長
期保存後も規準陽性血清に対するＥＬＩＳＡのＯＤ値は
０．５前後を保持したが、３７℃では１週間で０．２ま
で低下した。
シドで処理した可溶化ＮＯＶを透析ののち溶液（１−Ｉ
Ａ活性１：１６０００以上）を炭酸緩衝液（ｐ Ｈ９
，６，Ｎａ ＮＪ ０．０２％含右）でｌ−Ｉ Ａ活
性１：１００となるように希釈調整したものをコーティ
ング用液とした。一般のＥＬＩＳＡ用プレー上プレート
多数（例えば９６個）のウェルを有するプレートの各ウ
ェルに、前記コーティング用液を１００μｍずつ入れ、
４℃で４８時間放置した。コーティング用液を捨て、１
％アルブミン加ＰＢＳを１００μｍずつ各ウェルに入れ
、３７℃で３０分反応させた。次に０．１％トウィーン
２０加ＰＢＳで各ウェルを２回洗浄した後、プレートを
よく乾燥した。コーテイング後のプレートは４℃では長
期保存後も規準陽性血清に対するＥＬＩＳＡのＯＤ値は
０．５前後を保持したが、３７℃では１週間で０．２ま
で低下した。
すなわち、プレートの保存は低温（４℃）で行う必要が
ある。
ある。
（４）ＥＬＩＳＡのＯＤ値と中和抗体価との関係前記の
ようにして可溶化ＮＤＶ抗原をコーティングしたプレー
トを使用するとともに、酵素標識抗体としペルオキシダ
ーゼで標識したウサギ抗ニワトリＩａＧを使用して定法
に従いＥＬＳＩＡを行った。又、定法に従い赤血球凝集
抑制（ト１１）試験及び中和試験を行った。
ようにして可溶化ＮＤＶ抗原をコーティングしたプレー
トを使用するとともに、酵素標識抗体としペルオキシダ
ーゼで標識したウサギ抗ニワトリＩａＧを使用して定法
に従いＥＬＳＩＡを行った。又、定法に従い赤血球凝集
抑制（ト１１）試験及び中和試験を行った。
次式で定義するＳ／Ｐ比とＨ１価及び中和指数の相関性
はいずれもγ＝０．７であった。
はいずれもγ＝０．７であった。
Ｓ／Ｐ 比＝ （Ｓ−Ｎ＞／ （Ｐ−Ｎ＞Ｓ・・・
被検血清ＯＤ値、Ｎ・・・対照陰性血清ＯＤ値、Ｐ・・
・対照陽性血清００１直 （発明の効果） 以上詳述したように本発明のプレートは、ＮＤ■の抗体
に対する結合能が低下することなく不活化されて、各ウ
ェルに抗原として結合されているので安全かつ簡単にＥ
ＬＩＳＡを行うことができ、作業者が異なっても測定結
果のバラツキが小さくなる。又、可溶化処理によりＥＬ
ＩＳＡ抗原として精製ＮＤＶより高感度となるため、結
果的に固相生に必要な抗原の間が少なくて済み′！！Ａ
造コス１〜が低くなる。
被検血清ＯＤ値、Ｎ・・・対照陰性血清ＯＤ値、Ｐ・・
・対照陽性血清００１直 （発明の効果） 以上詳述したように本発明のプレートは、ＮＤ■の抗体
に対する結合能が低下することなく不活化されて、各ウ
ェルに抗原として結合されているので安全かつ簡単にＥ
ＬＩＳＡを行うことができ、作業者が異なっても測定結
果のバラツキが小さくなる。又、可溶化処理によりＥＬ
ＩＳＡ抗原として精製ＮＤＶより高感度となるため、結
果的に固相生に必要な抗原の間が少なくて済み′！！Ａ
造コス１〜が低くなる。
第１図はニューカッスルウィルスの模式図、第２図はニ
ューカッスルウィルスを同相に付性させた状態を示す概
略図である。 外膜〈エンベロープ〉１、抗原２、プレート３゜特許出
願人 株式会社ゲン・〕−ポレーション代 理 人
弁理士 恩１）博宣
ューカッスルウィルスを同相に付性させた状態を示す概
略図である。 外膜〈エンベロープ〉１、抗原２、プレート３゜特許出
願人 株式会社ゲン・〕−ポレーション代 理 人
弁理士 恩１）博宣
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、プレートに形成された複数個のウェルを、オクチル
グルコシド溶液処理で可溶化したニユーカッスル病ウィ
ルス粒子溶液でコーティングしたことを特徴とするニユ
ーカッスル病ウィルス抗体の検出用プレート。 ２、精製されたニユーカッスル病ウィルス粒子をオクチ
ルグルコシド溶液で処理して可溶化することを特徴とす
る抗原ウィルスの可溶化方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7392088A JPH01245159A (ja) | 1988-03-28 | 1988-03-28 | ニューカッスル病ウィルス抗体の検出用プレート及び抗原ウィルスの可溶化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7392088A JPH01245159A (ja) | 1988-03-28 | 1988-03-28 | ニューカッスル病ウィルス抗体の検出用プレート及び抗原ウィルスの可溶化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01245159A true JPH01245159A (ja) | 1989-09-29 |
Family
ID=13532076
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7392088A Pending JPH01245159A (ja) | 1988-03-28 | 1988-03-28 | ニューカッスル病ウィルス抗体の検出用プレート及び抗原ウィルスの可溶化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01245159A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004060303A3 (en) * | 2002-12-26 | 2005-11-24 | Cell Genesys Inc | Methods and reagents for the enhancement of virus transduction in the bladder epithelium |
| WO2017009926A1 (ja) * | 2015-07-13 | 2017-01-19 | 和光純薬工業株式会社 | 特異的結合物質の固定化方法 |
-
1988
- 1988-03-28 JP JP7392088A patent/JPH01245159A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004060303A3 (en) * | 2002-12-26 | 2005-11-24 | Cell Genesys Inc | Methods and reagents for the enhancement of virus transduction in the bladder epithelium |
| US7267815B2 (en) | 2002-12-26 | 2007-09-11 | Cell Genesys, Inc. | Methods and reagents for the enhancement of virus transduction in the bladder epithelium |
| US7459154B2 (en) * | 2002-12-26 | 2008-12-02 | Cell Genesys, Inc. | Methods and reagents for the enhancement of virus transduction in the bladder epithelium |
| WO2017009926A1 (ja) * | 2015-07-13 | 2017-01-19 | 和光純薬工業株式会社 | 特異的結合物質の固定化方法 |
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