JPH01228498A - 微生物濃度の迅速測定法及びその装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、バイオテクノロジー、食品、水処理。

電子機器、医療機器等の各種の産業分野で有効に利用さ
れる微生物濃度の迅速測定法及びその装置に関するもの
である。

〔従来技術とその問題点］ 上記各産業において、原材料の品質、製造工程や製品品
質等の管理上、微生物濃度の測定を要することが少くな
い。また医療分野では細菌性疾患の診断に微生物の濃度
測定が必要である。

こうした目的に一般的に用いられている方法は、平板培
養によるコロニーカウント法である。

この方法は、ペトリ皿内の平板培地に数段階に希釈した
試料を加え、暫く培養を行い、平板培地上に肉眼的に認
められるまでに増殖した時の微生物のコロニー数を数え
て、試料中の微生物濃度を求めるものである。

したがって、この方法は、培養の準備や後始末に多大の
労力を要する上に、１〜数日の長い培養期間を必要とし
、迅速性に乏しく、緊急のニーズに応じられないという
大きな欠点がある。

そのため、近年各種の計測技術を応用した微生物検査の
簡易化、迅速化に関する技術開発が活溌化している。〔
森地二日本食品衛生学会誌、第２７巻、４２８〜４３０
ページ、　（１９８６）参照］これらの方法のうち、微
粒子のホトカウンティング装置を応用する方法や、透過
光量、チンダル光量の測定等の光学測定法は、迅速では
あるが、純物理的方法のため、微生物粒子を特定できな
いという基本的欠点が認められる。

また、微生物の増殖に伴う、培地のインピーダンスやコ
ンダクタンス等の電気的特性の変化を測定し、微生物濃
度を測定する方法もあるが一般食品の微生物濃度は１０
３〜１０’　ｃｅｌｌｓ／ｍ１であるに対し、この種の
方法の濃度検出限界は１０ｂｃｅｌｌｓ／ｄ以上である
ため、検出可能な濃度に微生物を増殖させるための数時
間の前培養を要する難点が認められる。

最近、山中らは、微生物の酵素活性を蛍光法で測定する
ことにより、微生物濃度を測定する方法を開発したが、
この方法は１０’　ｃｅｌｌｓ／ｍｌの検出感度を有し
、従前の方法より高感度だが検出酵素（デヒドロゲナー
ゼ等）を増量するための選択培養に数時間を要するもの
である（特公昭５８−１７５９８号参照）。

前培養を全く必要としない生物化学的方法としテ注目さ
れるものに、野田らの発明したカタラーゼ活性の測定に
基づく方法（特公昭５５−１５９９９号公報）がある。

これは微生物のガス代謝測定に常用されるワールブルグ
検圧計やアインホルン管等を用い、Ｈ２０□の添加によ
り生じる酸素ガスの容積から微生物濃度を求めるもので
ある。しかし、この方法は、先ず■微生物菌体を検液か
ら分離する必要があること、■酸素発生量と微生物濃度
の間に正の相関は認められるが、正比例関係が示されな
いこと（後述）、■酸素ガス発生量の測定には３０分〜
６０分の長時間を必要とすること等の問題点があって、
操作の簡易化、迅速化と共に精度向上の余地を残した方
法である。

同じく、カタラーゼ活性を指標とする方法として、クラ
ーク酸素電極を用いてＨ２０□の分解反応による溶存酸
素（以下ＤＯと略記）′ａ度の増加を測定して微生物濃
度を測定する装置がグローブス〔米国特許筒３．８３８
．０３４号（１９７４）　）によって開示されている。

この装置による微生物濃度測定方法は、前記の野田らの
方法よりかなり迅速簡易なものであるが、ＤＯの過飽和
域で測定を行なうものであるため、Ｄｏの一部がガス化
して検液がら気相中に逸散する虞れがあり、第３図を用
いて後述するように満足な定量性が期待できない。

また、前記グローブスの装置は、酸素電極を検出セルの
底部にＤＯ検出面を上向きに装着するようになっている
が、このように電極をさがさに配置しては電極隔膜とカ
ソードの間に存在しなければならない電解液相に気泡が
入り込み、ＤＯ計測を円滑に行なうことができないもの
であることは、酸素センサ利用者のよく知るところであ
る。

なお、この米国特許明細書には実例データは全く示され
ていない。

〔発明の目的］ 本発明の目的は、前記した各産業において必要とされて
いる微生物の濃度を簡易、迅速、且つ正確に測定する方
法及び装置を提供することにある。

本発明のその他の目的は、上記方法及び装置の前記各産
業や医学領域への実用を通じて製品の品質向上、省力化
、保健、医療技術間上等に貢献することにある。

更に本発明の他の目的は、微生物汚染９食品の早期発見
に用いることにより食品の安全性を確保することにある
。

本発明は、特にグローブスの酸素電極による微生物濃度
測定方法と装置の構造および用法上の問題点を解決して
上記目的を達成したものである。

〔問題点を解決するための手段］ 本発明は上記の問題点を解決するためになされたもので
、微生物懸濁試料液にＮ２ガス等を添加して溶存酸素を
除いた後、過酸化水素液を加えて完全混合し、微生物カ
タラーゼによる過酸化水素の分解反応で生成する酸素に
由来する溶存酸素濃度の増加速度を酸素センサで計測し
、その計測値を基にして微生物濃度を測定する方法を採
るようにしたものである。

以下、本発明にか−るバッチ式および連続式装置の実施
例について図面を参照し乍ら詳しく説明する。

丈夫」［−上 第１　図ハハッチ弐の測定装置のブロック図で、１は検
出反応セル（５ｄＬ２は酸素センサ、３は増巾器、４は
ペン記録装置、５はＡ／Ｄ変換器、６はマイクロコンピ
ュータ、７は記録又は表示装置である。

検出反応セル１は栓８で密閉され、試料液導入管９、Ｎ
Ｚ、０２　ノガス導入管１０．ガス排出管１１、反応液
排出管１２　ＨｚＯｚ液注入器１２’及びカタラーゼ阻
害剤注入器１２″が接続され、内部には撹拌モータ１３
によって駆動される強力なマグネチックスクーラー１４
が設けられ試料液１５が完全混合されるように構成され
ている。

第２図は上記測定装置を使って測定する操作のフローチ
ャートを示すもので、以下に測定の手順を説明する。

１）ス杜辰ｑ週１ 本発明の方法は前記野田らのワールブルグ法とは異なり
、液状の試料を微生物を分離することなく、そのま−用
いるものである。

しかし、試料液の微生物濃度が著るしく高濃度の場合は
、センサの応答おくれや、生成酸素量が多いため、一部
が気体となり液から分離することによる測定誤差を生じ
る虞れがある。

一方、著るしく低濃度の試料はＤＯの微小変化の正確な
測定が困難になる。したがって、試料液を適宜希釈、濃
縮して検液の濃度調整を行なうことが望ましい。

ｐＨ緩衝液からなる試料液は、無菌水で単に希釈して用
いてもよいが、−船釣には中性緩衝液、例えば酵母や、
大腸菌では０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６〜７）を用い
る。又酢酸菌にはｐＨ３の酸性の緩衝液が望ましい。

なお、セルフリーのカタラーゼが同時に溶存する試料液
では、菌体と液をメンブレンフィルター等で溶存酵素を
除いた後に測定する必要がある・また、微生物菌体の濃
縮には、セラミックフィルター、メンブレンフィルター
、ホローファイバーチューブ、遠心分離器等が用いられ
る。

菌種にもよるが、試料液の細胞濃度は１０３〜１０’　
ｃｅ１１ｓ７ｍｌの範囲において約３０秒の短時間で測
定を終ることができる。

なお、この濃度調整操作、とくに希釈操作は反応セルに
試料液を入れる前に行う方法、反応セルに予め緩衝液を
入れておき、これに少量の試料液を注入して反応セル内
で希釈する方法や、連続測定方式においては、比例配合
ポンプを用いて行なう等の各種の方法が用いられる。

しかし、酸素センサにｐｐｂオーダーの超高感度のオル
ビスフェア・ラボラトリ−のモデル２１１３型酸素計、
あるいは本発明者が先に提案した酸素センサ（実願昭６
１−１９８７８８号、実願昭６２−４９１４号）等を用
いれば、上記濃縮は必らずしも必要ではない。

２）渭　　　およびパ１　品 本発明にか＼る測定法は、任意の室温で実施できる。し
かし、反応液の温度は反応セルのジャケット（図示せず
）に３０〜３７°Ｃの恒温水を循環する等任意の方法で
一定温度に保つことが望ましい。

本発明の測定原理は、微生物細胞中に含まれる過酸化水
素（ｕｚｏｚ）分解酵素つまりカタラーゼの作用で８２
０□が次式のように分解する際、分子状酸素が酵素活性
に比例する速度で生成することを利用したものである。

しかし、この反応の問題点は、基質のｔｈｏ□が高濃度
の時、及び測定に長い時間をかけるときは、酵素失活の
虞れがあることである。

したがって、カタラーゼ活性の測定は、できるだけ低基
質濃度下にごく短時間に行なうことが望ましい。

このような見地から、末法ではＨ，０□は反応開始時の
濃度が１０ｍＨ（０，ＯＩＭ）以下であるように、また
反応時間は約１分程度の短時間で終るように条件を設定
することがよい。

因に、前記野田らの方法では、生成酸素ガスの容積を測
定する都合上基質１１□ｏ２は０．１　Ｍ　（１００ｍ
Ｍ　）・即ち末法の１０倍の高濃度のものを用い、測定
時間は３０分を要するものであるから、末法の約３０倍
の時間を要している。

なお、本発明の測定法では第２図に示すようにＨ，０□
添加前に、ＤＯを除去する操作を行なうことが前記グロ
ーブスの装置による測定と明確に異なる。このＤＯの除
去操作の顕著な効果を第３図を用いて説明する。

第３図の曲線は、８．０□の酵素分解反応によるＤＯの
経時変化を示すもので、曲線（１）はグローブスの装置
により得られたＤＯ上昇曲線である。

グローブスの装置では試料液のＤｏを予め除去しないの
で、試料液は反応開始前にはは〜飽和のレベルにある。

したがって、Ｈ２０□の分解が始まると、ＤＯの濃度は
直ちに過飽和となるため、生成酸素は気泡となって外気
相に逸散するようになる。そのため、このような状態下
でのＤＯ上昇曲線（Ｉ）は正確な０２発発生度を示さな
い。

また、この方式における第２の問題点は、曲線〔ビ〕で
示したように、菌のＨ２０□分解活性が低い場合には、
既存のＤＯに対しての生成酸素量が微少なため、ＤＯの
上昇分のみを分離増巾し、正確に計測することが困難な
ことである。

これに対し、第３図における曲線（Ｉ［）は、本発明に
よるＤＯの経時変化を例示したものであるが、反応液に
不活性ガスのＮ２ガスを第１図のガス導入管１０から通
じる等の方法で大部分のＤＯを除いてから、はじめてＨ
，Ｏ□の添加をＨ，Ｏ□注大器１２′で行うようにした
ので、このような不飽和のＤＯ域では生成した酸素は反
応液に定量的に溶解する。そして、数秒のラグタイムの
後、Ｄｏの直線的上昇がみられ、飽和度に近接するにつ
れて直線性が次第に失なわれる。

この直線部分（ＨｚＯｚ添加後数１０秒〜数分間）に示
される勾配から１ｈＯｚ分解速度を迅速且つ正確にとら
えることができる。

なお・このように短時間の反応を定量的に計測するため
には、反応液は強力な撹拌により完全混合状態を確保し
、添加された８２０２は瞬時に均一分散されることが必
要である。

更に、実施例装置によると、試料液の■２０２分解活性
が低く、〔■′〕の曲線で例示するように、低勾配の場
合には、第１図に示される酸素計の増巾器３を操作して
増巾率を上げ、勾配を拡大して測定することができる利
点がある。

なお、通常の酸素電極で増巾率を大巾に上げることは、
残余電流（暗電流）の増大を招く問題があるが、残余電
流の少ない前記した超高感度の酸素計により通常の溶存
酸素計を用いる場合の５（３０〜ｔｏｏｏ倍の感度（１
ｐｐｂ単位〕で微少なりＯ上昇が正確に測定できる。

ところでＤｏ除去に使用するＨ２Ｏ□は上記したＨ２０
□分解酵素の作用以外の原因（例えば金属イオン、機械
的撹拌、有機物との接触等）によっても分解をおこし、
０□を放出する傾向を持つ物質である。

したがって微生物濃度が高＜Ｈ２０分解活性が高い試料
の場合は非酵素的原因による０□放出からくるＤＯの上
昇は一般無視できるが、微生物濃度が極めて希薄な場合
には、無視できないものとなる故に測定された全ＤＯ上
昇速度のうち酵素反応に由来する部分を選択的に把握す
る必要を生じる。

そこで、第２の発明では、カタラーゼ阻害剤を反応の途
中で添加する手段を用いて酵素反応による正味のＤｏ増
加速度を求めるようにしたもので、これによって希河な
微生物濃度を正確に測定することができる。

酵素カタラーゼに対する強力な阻害剤としては、シアン
化合物、銀イオン、水銀イオ（Ａｇ”　）　、フェノー
ル類イオン、尿素、アルカリ過マンガン酸カリウム等が
あるが、ナトリウムアザイド（ＮａＮ：＋）は微量で最
も有効にカタラーゼ活性を選択的に失活する薬剤であり
、反応液に対する濃度として１μｍｏｌ／Ｉｒｒ１とな
る量を添加すれば１００％の確実な失活効果を生じる。

第５図はＮａＮｚを回分式測定に用いた場合のＤｏの経
過曲線である。

初めに、ＮａＮ、を加えないでＤＯ増加速度ΔＤ／ΔＬ
（＝　（０２−ＤＩ）　／　（ｔｚ−ｔ＋）　）測定し
た後、Ｄ。

が飽和レベルに達しないうちにＮａＮ３を添加し、引続
きＤＯ記録を行なう。

ＮａＮ３添加後にみられるＤｏ増加速度（（Ｄ、−Ｄ。

／　（１４１：＋）　）は、カタラーゼの作用以外の原
因によるものであるから、この分を前の測定値から差引
くことにより、微生物活性による正味のり。

上昇速度を求めることができる。

なお、上記したＤＯ増加速度のバックグランド値の確認
の操作は、ＮａＮ３添加前後に、ＤＯ除去を再度行い、
測定初期とばず同一レベルまでＤＯを低下して行なうこ
とが望ましい。その理由は反応セル内のＤＯが低くなる
と外界の酸素ガス圧２反応容器材料中の溶存酸素、酸素
電極の電解液中の溶存酸素等が反応液との酸素圧勾配に
より、反応液中にぎわめて僅かながら拡散溶解すること
があり、初期ＤＯ濃度と同じレベルでバックグラウンド
補正を行えばこうした物理的原因によるＤｏの上昇の補
正も自らできることになるからである。

本発明に用いる酸素センサは、特に限定はなく、公知の
ポーラログラフ式又はガルバニ電池式の隔膜酸素電極の
外、本発明者の一人による光フアイバー式酸素センサ（
特開昭６２−８７８３３号公報参照）や半導体素子を用
いた酸素センサ等任意のものを用いることができる。

また、酸素センサ出力の酸素濃度測定例への校正は、空
気飽和水を標準液に用いる公知の方法で行なえばよい。

（測定例１．（３）計器の校正の項参照） そして、菌濃度の計算は、ペン記録計４で求めたＤＯの
アナログ記録曲線の勾配から手計算で求めることができ
るが、第１図に示したように、（３）式をインプットし
たマイクロコンピュータ６を用いて自動演算させること
により、更に高速度の測定表示、記録、及びデータ保存
ができる。

第４図は血球計で予め菌濃度を測定したパン酵母菌の懸
濁液について１（２０□の分解によるＤＯの増加を酸素
電極をセンサ２に用い、ペン記録計４で実際に記録して
得た曲線を示すものであって、Ｈ２Ｏ，添加直後の１０
〜４０秒間はほぼ直線的となる。

この部分の勾配からＨ，Ｏ□の分解初速度Ｒ（μｍｏｌ
Ｏ２／ｓｅｃ／・戚）を求めると、この値は次式に示す
ように、微生物（この場合は酵母＞ａ度ｎ　（ｃｅｌｌ
ｓ／ｄ）に比例する。

Ｒ＝　　Ｋ−ｎ　　　−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−（２）但し、Ｋは、パン酵母菌ｌ細胞に
ついての１１□０□分解活性を示すものである。

したがって、予め濃度既知液を用いて一度にの値を求め
れば、濃度未知の同種微生物試料のＲを測定することに
より、微生物濃度を次式によって求めることができる。

ｎ　　”　　−−−−−−−−−−一・−・−−−−−
−−−−（３）こうしたＨ、Ｏ□の分解活性は、酵母に
限らず、各種の細菌、線状菌が有するものであるため、
本性は、各種の微生物に広く適用できるものである。

本性の応用範囲は液状の試料に限られるものではなく、
固型試料を水洗し、その洗液について上記測定を適用す
ることにより、付着あるいは混入菌数を測定することが
できる。

酵母、細菌等が混在する試料については、メンブレンフ
ィルターのポアサイズや遠心力の差を利用してこれらを
分離した後、各区分を測定する方法により夫々分別測定
できる。

末法は試料の着色や濁り等に影響なく正確に行なうこと
ができる。

先ずパン酵母〔申越酵母工業（株）製）約０．７ｇを５
０−のビーカーに秤取し、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、　
ｐＨ，７，０）　２５ｍを加え、マグネチックスタイラ
ーで撹拌して均一に分散させ、５０ｍ１のメスフラスコ
に移し、上記緩衝液を加え５０ｍ２にフィルアップして
酵母懸濁液を調製した。

この液を更に２５倍に希釈し、トーマの血球計を用い顕
微鏡下に細胞数を数えて原液についての細胞数を求めた
結果、１１．５Ｘ１０９／ｍ１の結果を得た。

なお・このように調製した酵母液を希釈し分光光度計で
各法の透過光の光学密度（０，０，）を測定した結果、
直線関係が得られたので、以後酵母液の調整は０．０値
を細胞数におきかえて用いた。

波長９００ｎｍ　、光路長１０ｍｍの測定条件でＯ，［
１Ｏ１１に対応する酵母濃度ｎは２．９Ｘ１０６Ｃｅｌ
ｌｓ／ｍｊ！であった。

２）　カタラーゼ活性測Ｊ条件 反応温度：３０°Ｃ 酵母液量７２．４５ｍ１ ｆｉｚ（ｈ　（４００ｍＭ　）液ｉｔ　：　０．０５ｍ
ｊ！ｐＨニア、０　（０，１Ｍリン酸緩衝液）３）肚器
■校正 ３０°Ｃで小型エアポンプで５分以上通気して空気を飽
和した蒸留水５゜Ｏｄを反応セルに入れ、−定速度で撹
拌しながらクラーク型酸素センサの出力が記録計のフル
スケールの７０〜８０％に位置するよう増巾器の感度調
整を行なう。

次にＮ２ガスボンベより２０　／　４０　ｄ／ｍｉｎの
流速で反応セルにＮ２ガスを導入して溶存酸素を除き、
Ｄｏのゼロ点を確認する。

ＤＯの飽和点とゼロ点のスパン（第３図のｄ。）は下記
第１表に従いＤＯｏ、２３５μｍｏｌ・　０□／雁に対
応するとして校正した。

第１表　各温度における飽和ＤＯ？ａ度（μｍｏｌ　　
ｌＯｚ／ｍｌ） 〔合葉修−編：発酵プロセスの最適計測制御ｐ、２０６
　　（昭和５７年）株式会社サイエンス　フホラム刊よ
り引用〕 ４）夏一定 上記のように各種濃度に調製した酵母試料液を第１図の
装置の試料液導入管９から導入し、記録計４の指示がＤ
ｏ飽和レベルの約１７１０の位置に低下したとき、Ｎ２
の導入を止め、ガス排出管１０のコックを閉じ記録速度
を２４０　ｍ／ｍｉｎとし、直ちに５０ｍＭの濃度のＨ
，Ｏ□液をＨｚＯ□液注入器１２′から注入し、約４０
〜５０秒間Ｄｏを記録し、第４図の曲線を得た。

Ｎ２０．液注入後の約１０秒の記録は、センサの応答遅
れが認められたが、その後の２０〜３０秒間に直線的な
りＯの増加が記録された。

なお反応セルの洗浄には２．５　ｍ　−ｍｏｌ／ｍｆｌ
のＮａＮ　３水溶液１ｏｕｐ、を加えカタラーゼの失活
を行った。

５）肚−一算 Ｈｚ（ｈの分解速度はデータ処理装置において次式に基
づき計算した。

但し、Ｒ：　Ｄｏ増加速度（Ｂ　ｍｏｌ　　・０．／ｒ
ｔｄｌ−ｓｅｃ）Ｃ０：測定温度における溶存酸素の飽
和濃度Ｃｔｔｍｏ１・Ｏｘ／ｍｌ）　　３０°Ｃの場合
は０．２３５　（第１表参照） ｄｏ　：空気飽和点とＮ２ガス導入で確認した；ＤＯの
ゼロ点との記録計スパン（ｍｍ）〔第３図参照〕 ｄ　Ｉ：　Ｈｚ（ｈ注入Ｌ　（＝　ｌ　０ｓｅｃ）後の
ＤＯの指示 ｄ２：ｌ＋２０２注入ｔｚ　（＝　４０５ｅｃ）後のＤ
ｏの指示 ■　：検液量（今回２．４５成） Ｖ　：反応法令ｉ！　（２，４５＋０．０５＝　２．５
ｄ）６）時−来 酵母原液の酵母細胞濃度から希釈液の濃度を希釈倍率に
基づいて計算し、これに対して上記方法で測定したＤｏ
増加速度を直交座標上にプロットしたところ、第６図の
ように原点を通る直線関係、つまり（２）式の関係を得
た。

この直線から酵母細胞１ヶ当りの０□生成速度定数Ｋ　
＝１．１５Ｘ１０−８（μｍｏｌ　・Ｏｚ／　ｒｔｄｌ
−ｓｅｃ　ｃｅｌｌ）と決定され、この値を用い（３）
式により濃度・未知の酵母液の濃度を求め得ることがわ
かった。

皿定±−又 測定例１で用いたパン酵母液を１０，０００倍まで稀釈
して＠薄濃度領域における測定を行った。

本測定においては、酵母液５０ｍを先ず容量５０ｄの先
端の尖った遠心沈澱管に入れ、４０００ｒｐｍの回転数
で約１０分間遠心分離を行い、遠心管の先端の突起部に
集った沈澱物を２．４５ｍ１のリン酸緩衝液（０，１Ｍ
、　ｐｆｌ　７．０）に懸濁するようにして濃縮後測定
に用いた。

酸素センサはクラーク型酸素電極を用い増巾感度を通常
感度（フルスケール１０ｐｐｍ）の１０倍のフルスケー
ル１　ｐｐｍの条件でＤｏ上昇を測定した。

次に、チャート紙を戻し、反応液２．５ｍｌに対し、１
０Ｍの濃度のＮａＮ、を１０μｌ添加してカタラーゼを
失活させ、次いで再びＮ２ガスを通してＤｏを除き第４
図の曲線■に示すように約４０秒間り。

を記録し、カタラーゼ失活前のＤｏ上昇曲線との差を求
め、これをカタラーゼ活性の正味の値として細胞濃度の
計算を行なわせた。

このようにして得られたパン酵母濃度とＤＯ上昇速度と
の関係は第７図の曲線■のようであり、測定例１に比し
、稍々バラツキは大きいが、１０２７ｍ１の極めて希薄
なパン酵母菌濃度まで測定が可能であり、食品の雑菌汚
染度を判断する目的には十分な定量性を有することがわ
かった。

因に、同図中の曲線■は野円らのワールブルグ検圧計に
よるデータ（特公昭５５−１５９９９公報の第１表、酵
母群のａ菌株）を本発明の酸素発生速度の単位に換算し
てプロットしたものであるが、酵母濃度と酸素発生量が
正比例しないことがわかる。

その理由は、野田らの方法では基質Ｈ２０□の濃度が本
発明の１０倍（０，１Ｍ）の濃さであり、測定に３０分
の長時間を要しているために、微生物のカタラーゼ活性
が基質阻害を受けたためと本発明者は推定するものであ
る。

測定例　３ センサとして、本発明者の一人が先に提案した光学ファ
イバーを用いた酸素濃度測定装置（特開昭６２−８７８
３３号）を第１図に示した反応セルに装備して測定を行
った。

第８図は２　Ｘｌ０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ！のパン酵母液
について求めたＤＯ増加曲線である。

同図に明らかなように酸素電極に比し、ラグタイムの少
ないきれいな直線的増加曲線が得られていることから、
この計器は本発明の実施に好適なものと判断された。

本実施例に用いた前記センサは、磁界、電界の影響を受
けず、ノイズレスであることから大規模な食品製造工場
の生産現場の各点における食品の微生物的安全性を集中
監視するシステム装置として高度な実用性が期待される
。

皿定五−土 振とう培養法により培養した大腸菌（Ｅ、ＣＣｏ１１Ｉ
Ａ　１２６４）について測定を行った。

なお、原液の細胞濃度は、平板培養法によるカウント法
で求めた。

その結果は第９図に示す通りで、濃縮を行はずに１０３
Ｃｅｌｌｓ／ｍｅまでのオーダーの低濃度測定が可能で
あった。

従って末法によれば、食品の細菌汚染度の重要な指標で
ある大腸菌群の早期判定が極めて短時間に行えることが
わかった。

皿Ｚ炎−工 食酢醸造菌アセトバクターアセチイ−（Ａｃｅｔｏ−ｂ
ａｃｔｏｒ　ａｃｅｔｉＭ　２３　）について同様な測
定を行った。検液の菌濃度は２．５Ｘ　１０８Ｃｅｌｌ
ｓ／ｒｎＩｌ、　Ｄ　Ｏ上昇度は第１Ｏ図のように比較
的緩やかであったが、酵母と同様に測定可能である。

なおｐＨ３，６及び６．２においても同一の速度が認め
られる。

実力ＬＬ−々 第１１図（ａ）は本発明にか＼る連続測定装置のブロッ
ク図を示すもので、試料液は導入パイプ２１及び送液ポ
ンプ２２を経てＤＯ除去装置２３に送り込まれる。

Ｄｏ除去装置２３は疎水性の材料からなる多数のホロー
ファイバーチューブを内蔵しており、その中に試料液を
流し乍らＮ２ガス又はｏ２吸収液等を流して試料液のＤ
Ｏを連続的に除去する。

ＤＯ除去装置２３でＤＯを除去された試料液は、次いで
、Ｈ２０□液貯槽２４より合流点２５において８２０２
の濃度が約１０ｍＭとなる割合でＨ２Ｏ２液を混合され
る。

なおＨ，０□液貯槽２４はＮ２ガス等を流してＤＯを含
まないようにしておくことは勿論である。

このようにしてＤｏを除去し、８．０２を添加された試
料液は、酸素センサＳ、、　Ｓ２を装備した流通セル２
６．２７において、Ｄｏ増加速度が検出され、それらの
検出値はデータ処理装置２８内で増巾器で増巾され、次
いで、Ａ／Ｄ変換器でデジタル信号に変換された後マイ
クロコンピュータに与えられてデータ処理される。

同図（ｂ）は、（ａ）図に示す連続測定装置におけるＤ
Ｏの変化を模式的に示す図で、導入パイプ２１の入口で
飽和レベルにあったＤｏがＤＯ除去装置２３の中を流れ
る間に減少し、ゼロに近く迄低下し、１１□０□の添加
後は直線的に増加することを示している。

この時点のＤｏの変化をセンサＳｌｌ　３２で夫々測定
し、データ処理装置２８において前記次式に基づき菌濃
度ｎを自動連続的に求める。

但し、　　ｎ；試料液菌濃度（ｃｅｌｌｓ／ｒｎｉ！、
）Ｄｚ−Ｄ、：！Ｉ□０□添加後ｔｌ＋　ｔ２における
Ｄｏの濃度（μｍｏｌ　　・Ｏｘ／ｍｆｌ）Ｋ：菌の８
．０□分解速度定数 （７ｚｍｏｌ　Ｏｔ／５ｅｃ−ｃｅｌｌ）なお、上記実
施例２の装置における操作は、前記した理由により、Ｄ
２はＤｏの過飽和域とならぬよう試料流速と流通セル２
６．２７の位置等を設定する。

また、予め希釈、又は濃縮を経た試料液には、その係数
ｆを乗じて原濃度を求める。

実崖炎−主 第１２図（ａ）はＤＯのバックグラウンド値を自動補償
する連続測定システムの実施例を示すものでその特徴は
第１１図（ａ）に示した実施例の試料液の流出側に、更
に阻害剤貯槽２９からの阻害剤を注入する注入部３０、
第２のＤＯ除去装置３１、酸素センサＳ、、　Ｓ４を備
えた流通セル３２．３３を付加した点である。

本システムでは、試料液に阻害剤例えばＮａＮ、が添加
された後はカタラーゼ活性を失っているので、酸素セン
サＳ３→Ｓ４間のＤＯの増加はカタラーゼに無関係なも
のであるから、次式のようにパックグラウンド値を差引
き、ｎを求める。

・−・−・−（５） なお、（ｈ　　ｔ＋）＝　（ｔ４　ｈ）に条件を設定す
れば更に簡略に計算ができる。

２８′はその演算を行うデータ処理装置である。

このシステムによれば、微生物濃度が希薄なために、Ｄ
Ｏ増加速度がきわめて小さい試料に対しても高精度の菌
濃度測定を自動かつ連続的に行なうことができる。

上記連続測定システムにおける試料流速、センサー間隔
等は、適宜決定できるが、例えば内径２〜３ｍｌ１１の
管を用い、１　ｍｌ／＜＝　１．０００μｌ／ｍｉｎの
流速とした場合、試料液線速度Ｖ、　（Ｓｅｃ）　＝２
．３５（ｍｍ／５ｅｃ）となる。

実施例２．３のような複数の酸素センサを用いる測定で
は両前に予め管路にＤＯを除いた液を通し、ゼロ調整ダ
イヤルを操作して何れのセンサもゼロを示すように調節
し、次に空気飽和水を流し何れも同一濃度を指示するよ
う調節する必要がある。

したがって、試料液が３１から８２に達する時間を４０
Ｓｅｃにしようとすると、Ｓ、、　Ｓ２間の距離は２．
３５Ｘ　４０　＝　９４ｍｍと決定される。

このようなセンサの配置のもとて試料流速を２．０００
　ａ　ＪＲｍｉｎとすればΔｔ＝２０ｓｅｃに設定でき
る。このような関係に基づき（Ｄｚ　　Ｄ＋）がり。

の直線上昇部において測定できるよう試料の濃度に応じ
適宜ΔＬを調節する。

本連続測定装置パン酵母製造工程における菌の増殖状況
の連続測定や、各種液体食品に対する汚染細菌の自動モ
ニターリング等に有効に利用できる。

脱気を完全に行なう条件ではセンサは１個でもよい。

〔発明の効果〕

上記説明及び実施例から明らかなように、本発明は、前
培養操作を全く必要とせず、は−°１分以内の短時間に
カタラーゼ活性を有する各種微生物の濃度を極めて低濃
度（Ｉ　Ｑ２ｃｅｌｌｓ　／ｍｌ　）から高濃度に及ぶ
広範囲な濃度範囲における測定を可能にしたもので１使
用する装置も簡易かつ経済的なものであるため、前述し
た本発明の目的を・十分に達成するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のバッチ式実施例装置のブロック図、第
２図は操作手順を示すフローチャート、第３図は従来法
（グローブス装置による）と本発明とのＤＯの消長の比
較説明図、第４図は本発明にか−る方法で測定したパン
酵母菌についてのＤＯの増加曲線実測図、第５図は酵素
阻害剤の添加効果の説明図、第６図はパン酵母菌の検量
線（高濃度域）、第７図はパン酵母菌の低濃度域の検量
線。第８図は光ファイバセンサによるＤＯ増加曲線、第
９図は大腸菌の検量線、第１０は酢酸菌のＤＯ増加曲線
図、第１１図は本発明にか＼る連続式実施装置のブロッ
ク図、第１２図は阻害剤を用いる本発明の連続式実施装
置のブロック図である。 Ｉ・・・検出反応セル ２・・・酸素センサ ３・・・増巾器 ４・・・ペン記録装置 ５・・・Ａ／Ｄ変換器 ６・・・マイクロコンピュータ ７・・・記録又は表示装置 ８・・・栓 ９・・・試料液導入管 １０・・・ガス導入管 １１・・・ガス排出管 １２・・・反応液排出管 １２′・・・Ｈ２Ｏ２液注入器 １２″・・・ＮａＨ、液注入器 １３・・・撹拌モータ １４・・・マグネチックスクーラー １５・・・試料液 ２１・・・導入パイプ ２２・・・送液ポンプ ２３・・・Ｄｏ除去装置 ２４・・・Ｈ２Ｏ２液貯槽 ２５・・・合流点 Ｓ＋、Ｓｚ・・・酸素センサ ２６．２７・・・流通セル ２８・・・データ処理装置 ２９・・・阻害剤貯槽 ３０・・・注入部 ３１・・・Ｄｏ除去装置 ３２．３３・・・流通センサ Ｓｓ、　Ｓａ・・・酸素センサ ２８′・・・データ処理装置 第６図 Ｍ（）　’ｔ’ｌｔ度匁（１０７ＣＬ１１４７．Ｊ第　
　　５　　　７ 第　　　９　　　図 第８図 一叶ＦＩＩ（酬ｉす ｉｉｇＺ図 第　　１０　　　図 一片七反Ｒ・駄（（ｅｃ）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）微生物懸濁試料液にＮ＿２ガス等を添加して溶存
   酸素を除いた後、過酸化水素液を加えて完全混合し、微
   生物カタラーゼによる過酸化水素の分解反応で生成する
   酸素に由来する溶存酸素の増加速度を酸素センサで計測
   し、その計測値を基にして微生物濃度を測定することを
   特徴とする微生物濃度の迅速測定法。
2. （２）微生物懸濁試料液にＮ＿２ガス等を添加して溶存
   酸素を除いた後、過酸化水素液を加えて完全混合し、微
   生物カタラーゼによる過酸化水素の分解反応で生成する
   酸素に由来する溶存酸素濃度の増加速度を酸素センサで
   計測し、更にカタラーゼ阻害剤を添加してカタラーゼ活
   性を阻害後の溶存酸素上昇のバックグウランド値を計測
   してこれを前記計測値から差引いて正味のカタラーゼ活
   性を求めることを特徴とする希薄微生物濃度の迅速測定
   法。
3. （３）微生物懸濁試料液の流通路に順次溶存酸素連続除
   去装置、過酸化水素注入装置及び複数の溶存酸素測定器
   を設けると共に前記溶存酸素測定器の検出値に基づき微
   生物濃度を演算する自動演算装置を具備したことを特徴
   とする微生物濃度の自動連続測定装置。
4. （４）微生物懸濁試料液の流通路に順次溶存酸素連続除
   去装置、過酸化水素注入装置及び複数の溶存酸素測定器
   を設け、且つその延長路に更に酵素阻害剤注入装置、溶
   存酸素連続除去装置及び複数の溶存酸素測定器を設ける
   と共に、前記各溶存酸素測定器の検出値に基づき微生物
   濃度を演算する自動演算装置を具備したことを特徴とす
   る微生物濃度の高精度自動連続測定装置。
5. （５）光学ファイバーを用いた溶存酸素測定器を用いる
   ことを特徴とする請求項３又は４記載の微生物濃度の高
   精度自動連続測定装置。