JPH01228493A - Anti-idiotypic antibody - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To measure the antibodies in the patients with a variety of cancers by screening the antibody against monoclonal antibody(MoAb) which specifically reacts with human glandular cancer-relating antigen. CONSTITUTION:Cell fusion is carried out using mouse spleen cells immunized with purified mouse MoAb YH206 and mouse myeloma cells X63-Ag8.653 to obtain anti-idiotypic antibody-producing hybridoma(HB). The HB is given to BALB/c mouse intraperitoneally, and the ascites is purified with DE52 ion exchange chromatography to obtain polyclonal and MoAb anti-idiotypic antibody which has a strong specificity to MoAb YH206 antibody as an antigen, and inhibits the reaction of YH206 antigen-antibody reaction. Then, this anti-idiotypic antibody is used to determine the YH206 antibody in the blood of patients with cancers to diagnose the antibody values of the patients with stomach or pancreas cancer.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト腺癌関連抗原に特異的に反応するモノク
ローナル抗体ＹＨ２０６に対する抗イディオタイプ抗体
、該イディオタイプ抗体を産生ずるハイブリドーマ、お
よびこれらの製造方法に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to an anti-idiotypic antibody against monoclonal antibody YH206 that specifically reacts with a human adenocarcinoma-related antigen, a hybridoma producing the idiotypic antibody, and a method for producing the same.

発明の代数 これまで、癌関連抗原に対して多数のモノクローナル抗
体（ＭｏＡｂ）が作製されており、それらのいくつかは
実際に臨床的に応用されている（後記文献１−８、以下
単に文献番号のみを記す）。−方、Ｊ　ｅｒｎｅのイデ
ィオタイプネットワーク理論（９）によれば、生体内で
は抗体固有のイディオタイプに対して抗イディオタイプ
抗体が産生され、−連のイディオタイプ・抗イディオタ
イプ抗体のネットワークによって免疫応答が調節されて
いると考えられており、癌関連抗原に対する生体内の免
疫応答に関しても、抗イディオタイプ抗体は重要な役割
りを担っている可能性がある。従って癌関連抗原に対す
るモノクローナル抗体の抗イディオタイプ抗体は、腫瘍
免疫を研究する上で有力な手段であり、かつ、モノクロ
ーナル抗体による癌治療の点からも注目されている（Ｉ
　Ｏ）。すでに本発明者らは肺腺癌細胞株Ａ３４９を免
疫原としてマウスモノクローナル抗体、即ちＭｏＡｂ　
ＹＨ２０６を樹立し、これを特許出願した（特開昭６１
−２５８１７３、尚、後記文献（１１）参照）。ＭｏＡ
ｂＹｌ（２０６の対応抗原は主として腺癌組織に分布す
る。また、血中遊離抗原としても存在し、特に胃癌、膵
癌患者で高率に検出される（１２）。Algebra of the Invention Until now, a large number of monoclonal antibodies (MoAbs) have been produced against cancer-related antigens, and some of them have actually been applied clinically (References 1-8, hereinafter referred to simply as reference numbers). ). On the other hand, according to Jerne's idiotype network theory (9), anti-idiotype antibodies are produced in vivo against the antibody-specific idiotype, and immunity is generated by a network of idiotype and anti-idiotype antibodies. It is thought that the response is regulated, and anti-idiotypic antibodies may play an important role in the in vivo immune response to cancer-related antigens. Therefore, anti-idiotype antibodies, which are monoclonal antibodies against cancer-related antigens, are a powerful tool for studying tumor immunity, and are also attracting attention from the perspective of cancer treatment using monoclonal antibodies (I
O). The present inventors have already developed a mouse monoclonal antibody, ie, MoAb, using lung adenocarcinoma cell line A349 as an immunogen.
YH206 was established and a patent application was filed for it (Japanese Unexamined Patent Publication No. 1983
-258173, see Document (11) below). MoA
The corresponding antigen of bYl (206) is mainly distributed in adenocarcinoma tissues. It also exists as a free antigen in the blood, and is detected at a high rate especially in patients with gastric cancer and pancreatic cancer (12).

本発明者らは、ＭｏＡｂ　　ＹＨ２０６を家兎及び同系
のマウスに免疫することにより、ＭｏＡｂ　　ＹＨ２０
６に対するポリクローナル及びモノクローナル抗イディ
オタイプ抗体を作製することに成功し、また、それらの
抗イディオタイプ抗体を利用した血中のＹＨ２０６抗体
の測定法を開発し、各種癌也者血中のＹＨ２０６抗体の
測定に成功した結果、本発明を完成した。The present inventors immunized MoAb YH206 with MoAb YH206 by immunizing rabbits and syngeneic mice.
We succeeded in producing polyclonal and monoclonal anti-idiotype antibodies against 6, and developed a method for measuring YH206 antibodies in blood using these anti-idiotype antibodies, and investigated YH206 antibodies in the blood of various cancer patients. As a result of the successful measurement, the present invention was completed.

以下本発明を実施例に従って詳細に説明する。The present invention will be explained in detail below according to examples.

実滝形− モノクローナル抗本によび培養細胞 本発明において用いられたＭｏＡｂはすべてＢＡＬ　Ｂ
　／　ｃマウス牌細胞とマウスミエローマ細胞Ｘ６３−
Ａｇ３．６５３とを細胞融合して作製されたものであり
、ＭｏＡｂ　　ＹＨ２０６（ＩｇＭ）は肺腺癌細胞株Ａ
３４９を免疫原として作製され、ヒト腺癌関連抗原を認
識する（１１）。ＭｏＡｂ　　Ａ　ＨＨ７（Ｉ　ｇＭ）
、ＭｏＡｂＳ　Ｉ　（ｒ　ｇＧ　２　ａ）およびＭｏＡ
　ｂ３Ａ５（ＩｇＧ１）は肝癌細胞株Ｈａ−４を免疫原
として作製されたもので、これらは肝癌組織と反応し、
とくにＭｏＡｂＳｌはＨ型糖蛋白質（Ｔｙｐｅ２）を認
識する（１３）。ＭｏＡｂ　ＭＵＳＥ　ｌ　１（ＩｇＧ
ｌ）は胃癌弘者腹水を免疫原として作製され、膵癌を中
心とした癌関連抗原を認識する。ＭｏＡｂ５　Ａ　３　
ＣＩ　ｇＭ）は免疫組織学的に結合組織と反応する。こ
れらのいずれの抗体もＭｏＡｂ　　ＹＨ２０６とは特異
性を異にし、かつ各抗体間には交叉反応性は認められな
い。各抗体産生ハイブリドーマおよび肺腺癌細胞株Ａ３
４９は１０％牛脂仔血清（Ｆｅ２）加ＲＰＭ１１６４０
培養液（ＧＩＢＣＯ。Monoclonal antibodies and cultured cells All MoAbs used in the present invention are BAL B
/c Mouse tile cells and mouse myeloma cells X63-
MoAb YH206 (IgM) was created by cell fusion with Ag3.653, and MoAb YH206 (IgM) was derived from lung adenocarcinoma cell line A.
349 as an immunogen and recognizes human adenocarcinoma-related antigens (11). MoAb A HH7 (IgM)
, MoAbS I (r gG 2 a) and MoA
b3A5 (IgG1) was created using the liver cancer cell line Ha-4 as an immunogen, and these react with liver cancer tissues.
In particular, MoAbSl recognizes H-type glycoprotein (Type 2) (13). MoAb MUSE 1 (IgG
1) was produced using ascites from a patient with gastric cancer as an immunogen, and recognizes cancer-related antigens, mainly pancreatic cancer. MoAb5 A3
CI gM) reacts with connective tissue immunohistologically. All of these antibodies have different specificities from MoAb YH206, and no cross-reactivity is observed between the antibodies. Each antibody-producing hybridoma and lung adenocarcinoma cell line A3
49 is RPM11640 with 10% beef tallow serum (Fe2)
Culture solution (GIBCO.

ＵＳＡ）により、３７°Ｃ５％ＣＯ□インキュベータ内
で培養した。USA) and cultured in a 37°C 5% CO□ incubator.

ポリクローナル抗イディオタイプ抗体の作製ＭｏＡｂ　
ＹＨ２０６産生能を有するハイブリドーマＹＨ２０６（
昭和６３年３月１日、工業技術院微生物工業研究所に寄
託。ＦＥＲＭ　Ｐ−９９０２）を培養して得た精製Ｍｏ
Ａｂ　ＹＨ２０６（ＩｇＭ）３００μｇを、フロイント
完全アジュバント２００μＱとともに家兎（２羽）に１
４４日目とに皮下注射することにより４回免疫し、最終
免疫後１００日目家兎より採血した（５０ｍＱ）。血清
を遠心（３０００ｒｐｍ、３０分間）により分離し、そ
れを３３％飽和硫安で塩析後、遠心（１０，００Ｏｒｐ
ｍ。Production of polyclonal anti-idiotype antibodies MoAb
Hybridoma YH206 (
Deposited on March 1, 1986 at the Institute of Microbiology, Agency of Industrial Science and Technology. Purified Mo obtained by culturing FERM P-9902)
300 μg of Ab YH206 (IgM) was administered to 2 rabbits (2 rabbits) together with 200 μQ of complete Freund's adjuvant.
The rabbit was immunized four times by subcutaneous injection on the 44th day, and blood was collected from the rabbit on the 100th day after the final immunization (50 mQ). Serum was separated by centrifugation (3000 rpm, 30 minutes), salted out with 33% saturated ammonium sulfate, and then centrifuged (10,00 rpm).
m.

６０分間）にて沈澱物を得、これを生理食塩水に溶解後
、ＤＥ５２イオン交換クロマトグラフィ（Ｗｈａｔｍａ
ｎ、　Ｅ　ｎｇｌａｎｄ）を用いてＩｇＧ分画を分離し
た。After dissolving the precipitate in physiological saline, it was subjected to DE52 ion exchange chromatography (Whatma
The IgG fraction was separated using the following methods (England, England).

分離したＩｇＧ分画は、ＭｏＡｂ　　ＹＨ２０６とは異
なる特異性を有するマウスＭＯ△ｂ　　Ａ）（Ｔ（７（
ＩｇＭ）または５　Ａ　３　（Ｉ　ｇＭ）２０巧をセフ
ァロース４　Ｂ　（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ、　Ｓ　ｗｅ
ｄｅｎ）に固相化したアフイニティクロマトグラフイ（
径０　、８　ｍｍ、高さ６　ｃｍｓ溶媒：Ｐ　Ｂ　Ｓ）
を２度行い、十分吸収操作を施し、マウスＩｇＭに反応
する成分を除去した。The isolated IgG fraction was isolated from mouse MOΔb A)(T(7(
IgM) or 5A (IgM) or Sepharose 4B (Pharmacia, Swe
Affinity chromatography (den) immobilized on
Diameter 0, 8 mm, height 6 cm Solvent: PBS)
was carried out twice, and the absorption operation was performed sufficiently to remove components that react with mouse IgM.

モノクローナル抗イディオタイプ抗体の作製精製マウス
ＭｏＡｂ　　ＹＨ２０６を、文献記載の方法（１４）に
従い、０．２５％グルタルアルデヒドの存在下で同重量
のキーホール・リムペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌ
ｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｍｉｎ）（Ｓ　ｉｇ
ｍａ。Preparation of monoclonal anti-idiotypic antibodies Purified mouse MoAb YH206 was mixed with an equal weight of keyhole limpet hemocyanin (keyhole limpet hemocyanin) in the presence of 0.25% glutaraldehyde according to the method described in the literature (14).
e limpet hemocyamine) (Sig
ma.

ＵＳＡ）と結合させ（室温、１時間、ＰＢＳで透析）、
ＭｏＡｂ　　Ｙ８２０６　２００μｇ相当を、１回目は
フロイント完全アジュバントｌＯＯμＱとともに、２回
目以後はフロイント不完全アジュバン）１００μｃとと
もにＢＡＬＢ／Ｃマウス３匹に７目間隔で皮下投与する
ことにより４回免疫し、最終免疫より３日目に、牌より
牌細胞を得、マウスミエローマ細胞Ｘ　６３−Ａｇ３．
６５３と、９谷、合邦の方法（１５）に従い細胞融合し
た。得られたハイブリドーマの上清を用いて、後述する
ＭｏＡｂＹＨ２０６を固相化したサンドイッチ酵素免疫
法、および抗原ＹＨ２０６を固相化した抗原抗体反応阻
止試験により、抗イディオタイプ抗体産生ハイブリドー
マをスクリーニングしな。そのハイブリドーマは、限界
希釈法によるクローニングを２度行い、安定したクロー
ンを確立した。このハイブリドーマをＡＴ　２０６と命
名し昭和６３年３月１日、工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託した（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９９０１）。つぎに
ハイブリドーマＡｌ２０６をＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマ
ウス腹腔内に投与しくブリスタン２００ｍＱの腹腔的投
与４日後）、得られた腹水４ｍＱをＤＥ５２イオン交換
クロマトグラフィ（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｅｎｇｌａｎｄ）
（径２　ｃｍ、高さ４０ｃｍ。USA) (dialyzed against PBS for 1 hour at room temperature),
The equivalent of 200 μg of MoAb Y8206 was immunized four times by subcutaneously administering the equivalent of 200 μg of MoAb Y8206 (first time with complete Freund's adjuvant lOOμQ, and subsequent times with 100 μc of Freund's incomplete adjuvant) at 7-day intervals, and from the final immunization. On the third day, tile cells were obtained from the tiles, and mouse myeloma cells X63-Ag3.
Cell fusion was performed according to the method of 653, Kutani, and Goho (15). The supernatant of the obtained hybridoma was used to screen for anti-idiotype antibody producing hybridomas by the sandwich enzyme immunoassay using MoAb YH206 immobilized as described below and the antigen-antibody reaction inhibition test using immobilized antigen YH206. The hybridoma was cloned twice by limiting dilution method to establish stable clones. This hybridoma was named AT 206 and deposited with the Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology on March 1, 1985 (FERM P-9901). Next, hybridoma Al206 was intraperitoneally administered to BAL B/c mice (4 days after intraperitoneal administration of Bristane 200 mQ), and 4 mQ of the obtained ascites was subjected to DE52 ion exchange chromatography (Whatman, England).
(Diameter 2 cm, height 40 cm.

溶出液：０．０４Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）より精
製した。またウサギ抗マウスＩｇＣＩ　、ＩｇＧ２ａ。Eluate: Purified from 0.04M phosphate buffer (pH 8,0). Also rabbit anti-mouse IgGCI, IgG2a.

ＩｇＧ２ｂ、１ｇＧ３．ＩｇＡ、ＩｇＭ（Ｍｉｌｅｓ、
ＵＳＡ）を用いたオフタロニー法により、免疫グロブリ
ンサブクラスを決定１５た。IgG2b, 1gG3. IgA, IgM (Miles,
Immunoglobulin subclasses were determined by the Ophthalony method using the USA).

抗イディオタイプ抗体の特異性の検討 作製した抗イディオタイプ抗体の特異性を検討するため
、酵素抗体法（ＥＩＡ）を行なった。精製ポリクローナ
ルあるいはモノクローナル抗イディオタイプ抗体（２０
μｇ／ｍ□　Ｉ　５０　ｔｔＱ、を９６穴マイクロタイ
タープレート（Ｆ、Ａ、Ｓ、Ｔ、　ｓｙｓｔｅｍ。Examination of specificity of anti-idiotype antibodies In order to examine the specificity of the anti-idiotype antibodies produced, enzyme immunoassay (EIA) was performed. Purified polyclonal or monoclonal anti-idiotype antibodies (20
μg/m□ I 50 ttQ, in a 96-well microtiter plate (F, A, S, T, system.

Ｂ　ｅｃｔｏｎ　Ｄ　１ｃｋｉｎｓｏｎ、　Ｕ　Ｓ　Ａ
　）に４℃で一夜インキユベートしてビーズに固相化し
た後、非特異反応を防止するために、３％ＢＳＡ加ＰＢ
Ｓ中に３７℃で、２時間インキュベートした（以下ブロ
ッキングと略す）。ポリクローナル抗体を固相化した系
では、次にＭｏＡｂ　　Ｙｌ（２０６、Ａ　ＨＨ７ある
いはＳ＋と室温で２時間反応後、１％ＢＳＡ加ＰＢＳに
より１０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗
マウスＩｇＧ＋Ａ＋Ｍ（ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ）と
室温で１時間反応させた。モノクローナル抗イディオタ
イプ抗体を固相化した系では、ブロッキング後ビオチン
化したＭｏＡｂ　　ＹＨ２０６，３Ａ５、Ａ　Ｉ−１１
−１７、あるいはＭＵＳＥＩＩと室温で２時間反応後、
０．５Ｍ　　ＮａＣＲ加０．５Ｍ　　ＰＢＳ　、１）Ｈ
８、Ｏで１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ア
ビジン（ＶＥＣＴＯＲ，ＵＳＡ）と室温で１時間反応さ
せた。なお、ＥＩＡの各ステップ間で００５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０加ＰＢＳにて５分間３回洗浄した。発色は０．０
４％０−フェニレンジアミン（片山化学工業）で行い、
４９２ｎｍにおいて吸光度を測定した。Becton D 1ckinson, USA
) at 4°C overnight to immobilize the beads, and then incubate with PB supplemented with 3% BSA to prevent non-specific reactions.
The cells were incubated in S at 37°C for 2 hours (hereinafter abbreviated as blocking). In the system in which the polyclonal antibody was immobilized, next, after reacting with MoAb Yl (206, A HH7 or S+ for 2 hours at room temperature, peroxidase-labeled rabbit anti-mouse IgG + A + M (DAKO, Denmark) diluted 1000 times with PBS containing 1% BSA). In the system in which monoclonal anti-idiotype antibodies were immobilized, biotinylated MoAbs YH206, 3A5 and A I-11 were used after blocking.
-17, or after reacting with MUSEII for 2 hours at room temperature,
0.5M NaCR plus 0.5M PBS, 1)H
8. The mixture was reacted with peroxidase-labeled avidin (VECTOR, USA) diluted 1000 times with O for 1 hour at room temperature. In addition, 005% Twee between each step of EIA
Washed 3 times for 5 minutes with PBS containing n20. Color development is 0.0
Performed with 4% 0-phenylenediamine (Katayama Chemical Industry),
Absorbance was measured at 492 nm.

ＹＨ２０６鳳虱迄供叉Ａ匪卯致！ 精製されたハイブリドーマ産生モノクローナル抗体のヌ
クリーニングならびに、抗イディオタイプ抗体がＹ　Ｈ
２０６抗原抗体反応を阻止するか否かを検討するため、
阻止試験を行なった。YH206 Otori is also available! Nuclear cleaning of purified hybridoma-produced monoclonal antibodies and anti-idiotype antibodies were carried out by YH
In order to examine whether or not to block the 206 antigen-antibody reaction,
An inhibition test was conducted.

Ａ３４９細胞の培養上清より、文献記載の方法（１１）
に従い分離精製した抗原ＹＨ２０６を、４°Ｃで９６穴
マイクロタイタープレートのビーズに固相化しく一夜）
、３％ＢＳＡ加ＰＢＳにて３７℃、２時間ブロッキング
した。つぎにビオチン標識ＭｏＡｂ　　ＹＨ２０６５０
μＱ（２μｇ／ｍｆ２）と、同量のハイブリドーマ上清
あるいは種々の濃度（１，２，４，８，１６倍）に希釈
した抗イディオタイプ抗体を同時に加え、１時間反応後
、ペルオキシダーゼ標識アビノン及び０−フェニレンジ
アミンを用いて発色した。抗イディオタイプ抗体のコン
トロールとして、ポリクローナル抗体の場合はウサギ抗
マウスｒ　ｇＭ　（Ｄ　Ａ　Ｋ　Ｏ、Ｄ　ｅｎｍａｒｋ
）を、またモノクローナル抗体の場合は各種精製ＭｏＡ
ｂ　　ＡＨＨ７，３Ａ５を用いた。また、精製ＭｏＡｂ
　　ＹＨ２０６（２μｇ／ｍρ）に上述の精製モノクロ
ーナル抗体を加え、室温で１時間インキュベートした後
、Ａ３４９細胞と４℃、１時間反応させた。つぎに１％
ｒ３ｓＡ加ＰＢＳにて４０倍希釈したＦＩＴＣ標識ウサ
ギつマウスｒｇＧ＋Ａ＋Ｍ（ＤＡＫＯ。From the culture supernatant of A349 cells, the method described in the literature (11)
The isolated and purified antigen YH206 was immobilized on beads in a 96-well microtiter plate at 4°C overnight).
, and blocked with PBS containing 3% BSA at 37°C for 2 hours. Next, biotin-labeled MoAb YH20650
μQ (2 μg/mf2) and the same amount of hybridoma supernatant or anti-idiotype antibodies diluted to various concentrations (1, 2, 4, 8, 16 times) were added simultaneously, and after reacting for 1 hour, peroxidase-labeled avinone and Color was developed using 0-phenylenediamine. As a control for anti-idiotypic antibodies, rabbit anti-mouse r gM (DAKO, Denmark) was used for polyclonal antibodies.
), or in the case of monoclonal antibodies, various purified MoA
b AHH7,3A5 was used. In addition, purified MoAb
The purified monoclonal antibody described above was added to YH206 (2 μg/mρ), incubated at room temperature for 1 hour, and then reacted with A349 cells at 4° C. for 1 hour. Next 1%
FITC-labeled rabbit and mouse rgG+A+M (DAKO) diluted 40 times with r3sA-added PBS.

Ｄ　ｅｎｍａｒｋ）を加え、４℃で３０分間インキュベ
ートし、フローサイトメトリー（ＥＰ　Ｉ　Ｃ３−Ｃ，
Ｃ０ＵＬＴＥＲ，ＥＬＥＣＴＲＯＮ　Ｉ　Ｃ９，ＵＳＡ
）により陽性細胞の比率を測定した。D enmark) was added, incubated at 4°C for 30 minutes, and subjected to flow cytometry (EP I C3-C,
C0ULTER, ELECTRON I C9, USA
) was used to measure the percentage of positive cells.

文献記載の方法（１２）に従い、ＭｏＡｂ　　Ｙ　８２
０６を２０μｇ／ｍＱの濃度で４℃、−夜の条件でビー
ズに同相化し、３％　ＵＳＡ加ＰＢＳにて３７℃で、２
時間ブロッキングした後、ハイブリドーマ上清、精製Ｙ
）（２０６抗原、抗イディオタイプ抗体、あるいはヒト
血清（１％　Ｂ　Ｓ　ＡｊＪＤＰ　ＢＳにより３倍希釈
）を室温下１時間反応させた。MoAb Y 82 according to the method described in the literature (12)
06 at a concentration of 20 μg/mQ at 4°C overnight, and incubated with PBS containing 3% USA at 37°C for 2 hours.
After blocking for time, hybridoma supernatant, purified Y
) (206 antigen, anti-idiotype antibody, or human serum (3-fold diluted with 1% BS AjJDP BS) was reacted at room temperature for 1 hour.

つぎにビオチン標識ＭｏＡｂ　　ＹＨ２０６抗体（ｌＯ
μｇ／ｍＱ）を加え、以下、前記の抗イディオタイプ抗
体の特異性の検討の場合と同様にペルオキシダーゼ標識
アビジンおよび０−フェニレンジアミンにて発色させ、
４９２ｎｍの吸光度を測定した。Next, biotin-labeled MoAb YH206 antibody (lO
μg/mQ) was added, and the color was developed with peroxidase-labeled avidin and 0-phenylenediamine in the same manner as in the case of examining the specificity of the anti-idiotype antibody described above.
Absorbance at 492 nm was measured.

血中ＹＨ２０６抗体の測定 ポリクローナルおよびモノクローナル抗イディオタイプ
抗体（２０μｇ／＋ｎ＋２）を４°Ｃ１−夜の条件下で
ビーズに固相化し、３％　ＢＳＡ加ＰＢＳにて３７℃で
、２時間ブロッキングした。つぎに１％　ＢＳＡ加ＰＢ
Ｓにて１６倍希釈した血清と共に室温で２時間インキュ
ベートした後、１％　ＢＳＡ加ＰＢＳにて１０００倍希
釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ＋Ａ＋
Ｍ（ＤＡＫＯ。Measurement of YH206 antibody in blood Polyclonal and monoclonal anti-idiotype antibodies (20 μg/+n+2) were immobilized on beads at 4° C. overnight, and blocked with PBS containing 3% BSA at 37° C. for 2 hours. Next 1% BSA plus PB
After incubation for 2 hours at room temperature with serum diluted 16 times in S, peroxidase-labeled rabbit anti-human IgG+A+ diluted 1000 times in PBS with 1% BSA.
M (DAKO.

Ｄ　ｅｎｍａｒｋ）と室温下２時間反応させ、次いで、
〇−フェニレンジアミンにて発色させ、４９２ｎｍの吸
光度を測定した。一部の患者血清については希釈試験を
行った。また、抗体が高値を示した患者血ｌＮを５０％
飽和硫安にて塩析し、沈澱をＰＢＳにて十分透析後、セ
ファクリルＳ　−３００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｓ　
ｗｅｄｅｎ）によりＡｍＱずつ分画し、各分画について
ＹＨ２０６抗体を測定した。同時に、各分画について、
ウサギ抗ヒトＩｇＭおよびＩ　ｇＧ　（Ｄ　ＡＫ　Ｏ、
Ｄ　ｅｎｍａｒｋ）を用いてオフタロニー法によりＩｇ
ＭならびにＩｇＧの局在を決定した。(enmark) for 2 hours at room temperature, and then
Color was developed with 〇-phenylenediamine, and absorbance at 492 nm was measured. Dilution tests were performed on some patient sera. In addition, 50% of the blood of patients with high antibody levels was
After salting out with saturated ammonium sulfate and thoroughly dialyzing the precipitate with PBS, Sephacryl S-300 (Pharmacia, S
(weden), and the YH206 antibody was measured for each fraction. At the same time, for each fraction,
Rabbit anti-human IgM and IgG (DAKO,
Ig was extracted by the Ophthalony method using
The localization of M and IgG was determined.

試験結果 （＋）ポリクローナル抗イディオタイプ抗体の反応特異
性 作製したポリクローナル抗イディオタイプ抗体を固相化
し、各種ＭＯＡｂｓと反応させた成績を第１図に示す。Test results (+) Reaction specificity of polyclonal anti-idiotype antibodies The prepared polyclonal anti-idiotype antibodies were immobilized on a solid phase and reacted with various MOAbs. The results are shown in FIG. 1.

本抗イディオタイプ抗体は、免疫原のＭｏＡｂ　　Ｙｌ
２０６（ＩｇＭ）とは、用量に比例する強い反応性を示
したが、ＭｏＡｂ　　ＹＨ２０６と特異性の異なるＭｏ
Ａｂ　　Ａ　ＨＨ７（ｒ　ｇＭ）にはごく弱い反応、ま
たＭｏＡｂ　　Ｓ　１　（Ｉ　ｇＧ　２　ａ）ではほと
んど反応は認められなかった。This anti-idiotypic antibody is based on the immunogen MoAb Yl
206 (IgM) showed strong reactivity proportional to the dose, but MoAb YH206 had a different specificity.
A very weak reaction was observed with Ab A HH7 (r gM), and almost no reaction was observed with MoAb S 1 (IgG 2 a).

つぎに抗原ＹＨ２０６を固相化して、それとＭｏＡｂ　
　Ｙ）ｉ２０６との反応を、本抗イディオタイプ抗体が
阻止し得るか否かを検討した（第２図）。Next, antigen YH206 was immobilized, and it was combined with MoAb.
Y) We examined whether this anti-idiotype antibody could block the reaction with i206 (Figure 2).

ポリクローナル抗イディオタイプ抗体は、１μｇ／ｍ（
ｌまではＭｏＡｂ　　Ｙ　Ｈ２０６の抗原ヘノ結合をほ
とんど阻止しなかったが、ＩＯμｇ／ｍＱ以上の濃度で
はＹｌ２０　Ｂ抗原への結合を強く阻止した。Polyclonal anti-idiotypic antibodies were used at 1 μg/m (
The binding of MoAb Y H206 to the antigen was hardly inhibited at concentrations up to IO μg/mQ, but the binding to the Yl20 B antigen was strongly inhibited at concentrations of IO μg/mQ or higher.

これに対して、対照として用いたウサギ抗マウス［ｇＭ
抗体では阻止効果は１０μｇ／ｍｆｆ以上の濃度におい
ても明瞭ではなかった。従って、ポリクローナル抗イデ
ィオタイプ抗体中には、抗原ＹＨ２０６とＭｏＡｂ　　
Ｙ　Ｈ２０６の結合を阻止する抗イディオタイプ抗体が
含まれていることが強く示唆された。In contrast, rabbit anti-mouse [gM
The inhibitory effect of the antibody was not obvious even at concentrations of 10 μg/mff or higher. Therefore, in polyclonal anti-idiotypic antibodies, antigen YH206 and MoAb
It was strongly suggested that anti-idiotypic antibodies that block the binding of Y H206 were included.

（２）ポリクローナル抗イディオタイプ抗体を用いた血
中ＹＨ２０６抗体の測定 癌患者血清中に抗原ＹＨ２０６と反応する抗体（Ｙｌ（
２０６抗体）が存在するか否かを、既述したポリクロー
ナル抗イディオタイプ抗体を用いたＥＩＡにより実施し
た（第３図）。その結果、健常者の吸光度は全体に低く
、１２例で平均値０．１２±０．０４を示した。平均値
＋２×標準偏差より正常上限を０．２０と設定すると、
良性疾患１５症例では金側０．２０以下であったのに対
し、胃癌、膵癌でそれぞれ１３例中５例、７例中４例に
Ｙｌ２０６抗体陽性が認められた。また、癌患者全体で
３４例中１３例（３７％）の陽性率を示した。(2) Measurement of blood YH206 antibodies using polyclonal anti-idiotype antibodies Antibodies (Yl(
206 antibody) was carried out by EIA using the polyclonal anti-idiotype antibody described above (Fig. 3). As a result, the absorbance of healthy subjects was low overall, with an average value of 0.12±0.04 in 12 cases. If the normal upper limit is set to 0.20 from the average value + 2 x standard deviation,
In 15 cases of benign disease, the gold side was 0.20 or less, whereas Yl206 antibody positivity was observed in 5 out of 13 cases and 4 out of 7 cases of gastric cancer and pancreatic cancer, respectively. Additionally, 13 out of 34 cancer patients (37%) showed a positive rate.

つぎに第４図に患者血清の希釈試験結果を示す。Next, FIG. 4 shows the results of a dilution test of patient serum.

血中抗体が高値を示した胃癌症例では３２倍まで高値を
持続し、以後次第に減少を示すが、２５６倍までは陽性
と判定された。これに対して正常血清は高濃度の血清を
使用した場合にもほとんど反応は認められなかった。In gastric cancer cases with high levels of blood antibodies, the levels remained high up to 32 times, and then gradually decreased, but up to 256 times the antibody was determined to be positive. In contrast, almost no reaction was observed with normal serum even when high concentration serum was used.

（３）モノクローナル抗イディオタイプ抗体の反応性 １２０クローンのハイプリドーマより５−ＥＩＡおよび
固相化ＹＨ２０６抗原を用いた抗原抗体反応阻止試験に
より１種のクローンをスクリーニングした。選びだしｔ
こＭｏＡｂはＩｇＧ１てあり、Ａｌ２０６と名付けた。(3) Reactivity of monoclonal anti-idiotype antibodies One type of clone was screened from 120 hybridoma clones by an antigen-antibody reaction inhibition test using 5-EIA and immobilized YH206 antigen. Select t
This MoAb is IgG1 and was named Al206.

精製ＭｏＡｂ　　Ａｌ２０６を固相化した系による、免
疫原（ＭｏＡｂ　Ｙ　Ｈ２０６）あるいは他のＭｏＡｂ
ｓとの反応性をＥＩＡにより検討した成績を第５図に示
す。各種ビチオン標識抗体の中で免疫原のＭｏＡｂ　　
ＹＨ２０６のみが強く反応し、他の抗体との交叉反応性
は認められなかった。モノクローナル抗イディオタイプ
抗体Ａｌ２０６による抗原ＹＨ２０６−ＭｏＡｂ　ＹＨ
２０６反応阻止試験の結果を第６図に示す。第６図（Ａ
）は固相化抗原を用いたＥＩＡの結果であるが、コント
ロールとして用いたＭｏＡｂ　ＡｌＨ３（１ｇ　Ｍ　）
、３Ａ５（ＩｇＧｌ）では抗原ＹＨ２０６へのＭｏＡｂ
　Ｙ　Ｈ２０６の結合をまっｔこく阻止出来なかった。Immunogen (MoAb Y H206) or other MoAb using a system immobilized with purified MoAb Al206
Figure 5 shows the results of examining the reactivity with s by EIA. Among various biotinylated antibodies, MoAb is an immunogen.
Only YH206 reacted strongly, and no cross-reactivity with other antibodies was observed. Antigen YH206-MoAb YH with monoclonal anti-idiotypic antibody Al206
The results of the 206 reaction inhibition test are shown in FIG. Figure 6 (A
) are the results of EIA using immobilized antigen, but MoAb AlH3 (1 g M ) used as a control
, 3A5 (IgGl), MoAb to antigen YH206
The binding of YH206 could not be completely prevented.

一方、ＭｏＡｂ　　Ａ１２０６は濃度依存性に強く反応
を阻止した。第６図（Ｂ）にＡ３４９細胞表面上の抗原
Ｙ　Ｈ２０６に対するＭｏＡｂＹＨ２０６の反応阻止試
験の結果を示す。ＭｏＡｂＹＨ２０６に各種ＭｏＡｂを
加えるとＭｏＡｂ３Ａ５、あるいけＡｌＨ３では阻止反
応は認められないが、ＭｏＡｂ　　Ａｌ２０６では濃度
に依存して強い阻止反応が見られた。第７図にそのヒス
トグラムを示した。すなわちＭｏＡｂ　　Ｙ８２０６単
独の場合に比較して、ＭｏＡｂ　　Ｙ　Ｈ２０６（２ｔ
ｔｇ／ｍＱ）と同量の他のＭｏＡｂ（３Ａ５あるいはＡ
　ＨＨ７）を同時に加えた場合には、その陽性率及びパ
ターンに変化は認められなかったが、ＭｏＡｂ　　Ａｌ
２０６を加えた場合にはほぼ完全にＭｏＡｂ　　ＹＨ２
０６のＡ３４９細胞への結合が阻止された。On the other hand, MoAb A1206 strongly inhibited the reaction in a concentration-dependent manner. FIG. 6(B) shows the results of a reaction inhibition test of MoAb YH206 against antigen YH206 on the surface of A349 cells. When various MoAbs were added to MoAb YH206, no blocking reaction was observed with MoAb3A5 or AlH3, but a strong blocking reaction was observed with MoAb Al206 depending on the concentration. FIG. 7 shows the histogram. That is, compared to MoAb Y8206 alone, MoAb Y H206 (2t
tg/mQ) and the same amount of other MoAb (3A5 or A
When MoAb Al HH7) was added simultaneously, no change was observed in the positive rate and pattern;
When adding 206, almost completely MoAb YH2
Binding of 06 to A349 cells was blocked.

ＭｏＡｂ　Ｙ８２０６に対する、抗原ＹＨ２０６とＭＯ
Ａ）ｌ　Ａ　Ｉ　２０６の反応性を比較するために、Ｍ
ｏＡ　ｂ　Ｙ　ｆ＋　２０６を固相化した５−ＥＩＡに
より、同一プレートで精製抗原ＹＨ２０６とＭｏＡ　ｂ
Ａ＋２０６の反応性を測定した結果を第８図に示す。抗
原ＹＨ２０６と同様に、ＭｏＡｂ　Ａ　Ｉ　２０６にお
いても濃度に依存して吸光度の増加が認められた。ココ
で抗原ＹＨ２０６２００（Ｊ／ｍｃ（０２μｓ／ｍＱ相
当）での吸光度は約０．９であり、同じ吸光度はＭｏＡ
ｂ　　Ａ　Ｉ　２０６ではほぼ１７ｚｇ／ｍＱの濃度に
相当した。Antigen YH206 and MO against MoAb Y8206
A) To compare the reactivity of l A I 206, M
Purified antigen YH206 and MoAb
The results of measuring the reactivity of A+206 are shown in FIG. Similar to the antigen YH206, a concentration-dependent increase in absorbance was observed for MoAb A I 206 as well. Here, the absorbance of antigen YH206200 (J/mc (equivalent to 02 μs/mQ) is about 0.9, and the same absorbance is MoA
b A I 206 corresponded to a concentration of approximately 17 zg/mQ.

（４）モノクローナル抗イディオタイプ抗体Ａ１２０６
を用いた血中ＹＨ２０６抗体の測定ＭｏＡｂ　　Ａ　Ｉ
　２０６を固相化し、既述したＥＩＡにより患者血清中
のＹＨ２０６抗体を測定した（第９図）。(4) Monoclonal anti-idiotype antibody A1206
Measurement of YH206 antibody in blood using MoAb A I
206 was immobilized on a solid phase, and the YH206 antibody in the patient's serum was measured by the EIA described above (FIG. 9).

その結果、健常者１０例は金利低値を示したが、その平
均値＋２×標準偏差より吸光度０．２０（４９２ｎｍ）
を正常上限と設定すると、胃癌では１１例中４例、膵癌
では１３例中５例がそれぞれ陽性を示し、胃癌、膵癌を
合わせると２４例中９例（３８％）が陽性であった。As a result, 10 healthy subjects showed a low interest rate, but from the average value + 2 × standard deviation, the absorbance was 0.20 (492 nm).
When set as the normal upper limit, 4 out of 11 cases of gastric cancer and 5 out of 13 cases of pancreatic cancer were positive, and 9 out of 24 cases (38%) were positive for gastric cancer and pancreatic cancer combined.

第１Ｏ図にＹＨ２０６抗体高値を示した血清及び低値を
示した血清の希釈試験の結果を示した。Figure 1O shows the results of a dilution test of serum that showed high YH206 antibody levels and serum that showed low levels.

図中のＡおよびＢに示す胃癌および膵癌売者血清では、
１６倍希釈で吸光度０３０以上を示し、希釈とともに次
第に吸光度は減少した。ＤおよびＦはいずれも健常者血
清であるが、１６倍希釈ですでに吸光度０．２０以下を
示した。なお、Ｅは抗原Ｙ　Ｉ−！　２０６が異常高値
（１２００ｕ／ｍＱ）を示した胃癌患者血清であるが、
健常者血清と同じ傾向を示し、少なくとも本庄によって
はＹＩ（２０６抗体の存在は否定的であった。In the gastric cancer and pancreatic cancer seller serum shown in A and B in the figure,
It showed an absorbance of 0.30 or more when diluted 16 times, and the absorbance gradually decreased with dilution. D and F are both sera from healthy individuals, but they already showed an absorbance of 0.20 or less at 16-fold dilution. In addition, E is antigen Y I-! The serum of a gastric cancer patient showed an abnormally high level of 206 (1200u/mQ).
It showed the same tendency as the serum of healthy subjects, and the presence of YI (206 antibody) was negative at least in Honjo.

つぎに、ポリクローナル抗イディオタイプ抗体を用いた
系と、モノクローナル抗イディオタイプ抗体を用いた系
の測定成績を比較検討した（第１１図）。両者間の相関
係数は０．８０（ｎ＝１６）であり存意な相関（ｐ＜０
．０１）を示した。Next, the measurement results of a system using a polyclonal anti-idiotype antibody and a system using a monoclonal anti-idiotype antibody were compared (Figure 11). The correlation coefficient between the two is 0.80 (n=16), which is a significant correlation (p<0
．． 01) was shown.

（５）血清分画の検討 上に述べたように、抗イディオタイプ抗体を用いること
により、癌患者血清中にＹＨ２０６抗体が存在すること
を明らかにし得た。そこで、本抗体の免疫グロブリンク
ラスを明らかにするため以下の検討を行なった。すなわ
ち、ＹＨ２０６抗体高値、抗原ＹＨ２０６低値を示した
胃癌患者血清および健常者血清をセファクリルＳ−３０
０により分画し、各分画についてオフタロニー法を用い
てＩｇＧ、及び［ｇＭの検出を行なった（第１２図）。(5) Examination of serum fractionation As mentioned above, by using an anti-idiotype antibody, we were able to demonstrate the presence of YH206 antibody in cancer patient serum. Therefore, the following study was conducted to clarify the immunoglobulin class of this antibody. That is, the serum of gastric cancer patients and healthy subjects who showed high YH206 antibody level and low antigen YH206 level were treated with Sephacryl S-30.
0, and each fraction was subjected to detection of IgG and [gM using the Ophthalony method (Fig. 12).

図中、破線はモノクローナル抗イディオタイプ抗体Ａｌ
２０６を固相化しりＥ　Ｉ　Ａ１．：テＹＨ２０６抗体
を測定した結果であり、（Ａ）で胃癌患者血清の１ｇＭ
領域に一致して活性部位が存在したが、（Ｂ）の健常者
では活性部位は検出できなかった。In the figure, the dashed line is the monoclonal anti-idiotype antibody Al.
206 was solidified into a solid phase E I A1. :Results of measuring the YH206 antibody;
Although an active site was present corresponding to the region, no active site could be detected in the healthy subject (B).

（６）癌患者血清中に存在する抗原ＹＨ２０６とＹＨ２
０６抗体との関連性 癌叡者の同一血清に対して抗原ＹＨ２０６とＹＨ２０６
抗体を測定した結果を第１３図に示す。(6) Antigens YH206 and YH2 present in cancer patient serum
Association with 06 antibodies Antigens YH206 and YH206 against the same serum of cancer patients
The results of antibody measurement are shown in FIG.

ＹＨ２０６抗体高値を示した６例は金側、抗原ＹＨ２０
６が５０Ｕ／ｍＱ以下の低値を示す症例にみられ、抗原
ＹＨ２０６が５００Ｕ／ｍｆ２以上ノ異常高値を示した
２症例ではいずれら抗体レベルが低値を示した。Six cases with high YH206 antibody values were on the gold side, antigen YH20
Antibody levels were found to be low in two cases in which antigen YH206 showed abnormally high values of 500 U/mf2 or more.

現在まで抗イディオタイプ抗体の研究は主として自己免
疫疾患における免疫異常の解明に関して進められている
（１６−１９）、一方、Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉら（２０）
は、消化器癌患者１こモノクローナル抗体を単独投与し
、生体内でモノクローナル抗体に対する抗イディオタイ
プ抗体が誘導された症例で治療成績が良好であるという
成績を報告しており、このことは癌関連抗原に対する免
疫応答にも抗イディオタイプ抗体が、重要な役割を担っ
ている可能性を示唆する。To date, research on anti-idiotypic antibodies has mainly focused on elucidating immune abnormalities in autoimmune diseases (16-19), while Koprowski et al. (20)
reported that the monoclonal antibody was administered alone to a patient with gastrointestinal cancer, and the treatment results were good in cases where anti-idiotypic antibodies against the monoclonal antibody were induced in vivo. This suggests that anti-idiotypic antibodies may also play an important role in the immune response to antigens.

今回作製されたＭｏＡｂ　　Ｙ８２０６に対するポリク
ローナル抗イディオタイプ抗体およびモノクローナル抗
イディオタイプ抗体はそれぞれ、第１図および第５図に
示すように、ともに免疫原のＭｏＡｂ　　ＹＨ２０６の
みと強く反応し、他のモノクローナル抗体とほとんど反
応しないことより、ＭｏＡｂ　　ＹＨ２０６のイディオ
タイプに強い特異性を有していた。ポリクローナル抗イ
ディオタイプ抗体の特異性について、Ｔａｕｓｓｉｇら
（２１）は数種のプロゲステロンに対するマウスＭｏＡ
ｂをウサギとラットに免疫し、動物の種類と無関係にポ
リクローナル抗イディオタイプ抗体の作製に成功してお
り、かつ、免疫原の抗体と強い特異性を持っていること
を報告している。また、Ｔ　ｓｕｊ　１ｓａｋｉら（２
２）はマウスＭ　ｏ　Ａ　ｂを同系マウスに免疫して作
製した抗血？ｎが免疫原のＭｏＡｂとのみ強く反応する
ことを報告している。これらの実験結果は適当な条件下
においては動物種に無関係に抗イディオタイプ抗体は作
製されうろことを示している。今回の実験においても、
ウサギおよび同系マウスで抗イディオタイプ抗体が成功
裡に作製され、彼らの実験結果と一致する。さらに、本
研究においてはＭｏＡｂ　　Ｙ　Ｈ２０６に対するモノ
クローナル抗イディオタイプ抗体の作製に成功したが、
これまで腫瘍免疫の分野でのモノクローナル抗イディオ
タイプ抗体の報告は、本出願人の知る限りまれであり、
本発明のひとつの特色といえよう。As shown in Figures 1 and 5, the polyclonal anti-idiotype antibody and monoclonal anti-idiotype antibody against MoAb Y8206 that were created this time strongly reacted only with the immunogen MoAb YH206, and reacted strongly with other monoclonal antibodies. MoAb YH206 had strong specificity for the idiotype, as there was almost no reaction. Regarding the specificity of polyclonal anti-idiotypic antibodies, Taussig et al.
They have successfully produced polyclonal anti-idiotypic antibodies regardless of the type of animal by immunizing rabbits and rats with B.b, and have reported that they have strong specificity with the immunogenic antibody. In addition, T suj Isaki et al. (2
2) Is anti-blood produced by immunizing syngeneic mice with mouse Mo Ab? It has been reported that n reacts strongly only with the immunogen MoAb. These experimental results indicate that under appropriate conditions, anti-idiotypic antibodies can be produced regardless of the animal species. In this experiment as well,
Anti-idiotypic antibodies were successfully generated in rabbits and syngeneic mice, consistent with their experimental results. Furthermore, in this study, we succeeded in producing a monoclonal anti-idiotypic antibody against MoAb Y H206;
To date, reports of monoclonal anti-idiotypic antibodies in the field of tumor immunity have been rare to the best of the applicant's knowledge.
This can be said to be one of the features of the present invention.

ある特定の抗体のイディオタイプに対する抗イディオタ
イプ抗体は多種存在すると考えられている（２３．２４
）。本発明者らが作製した抗イディオタイプ抗体は、第
２図および第６図に示すように、ＹＨ２０６抗原抗体反
応を強く阻止した。このことは、ポリクロナール抗イデ
ィオタイプ抗体内には抗原結合部位に対する抗イディオ
タイプ抗体が含まれていること、また、ＭｏＡｂＡ１２
０６は、ＭｏＡｂ　　ＹＨ２０６の抗原結合部位に対す
る抗イディオタイプ抗体である可能性が強く示唆された
。It is thought that there are many types of anti-idiotypic antibodies for a specific antibody idiotype (23.24
). As shown in FIGS. 2 and 6, the anti-idiotype antibody produced by the present inventors strongly inhibited the YH206 antigen-antibody reaction. This indicates that polyclonal anti-idiotype antibodies contain anti-idiotype antibodies directed against the antigen-binding site, and that MoAbA12
It was strongly suggested that 06 is an anti-idiotypic antibody directed against the antigen-binding site of MoAb YH206.

ＭｏＡｂ　　ＹＨ２０６と作製された抗イディオタイプ
抗体が特異的に反応するということは、本抗イディオタ
イプ抗体が、免疫学的に抗原ＹＨ２０６としての性格を
有していることを意味する。事実、第８図に示すように
ＭｏＡｂ　　ＹＨ２０６を用いた抗原ＹＨ２０６測定系
（Ｓ−ＥＩＡ）により、本発明に係るモノクローナル抗
イディオタイプ抗体Ａｌ２０６が、抗原ＹＨ２０６と同
様に測定出来ることが確認された。抗原と抗イディオタ
イプ抗体の相同性に関して最近、Ｂ　ｒｕｃｋら（２５
）は蛋白抗原レオウィルス・タイプ３赤血球凝集素のア
ミノ酸配列と、モノクローナル抗イディオタイプ抗体の
それを比較し、免疫グロブリン可変部分のアミノ酸配列
の一部が一致していることを明らかにした。この点、抗
原ＹＨ２０６のエピトープは糖鎖と考えられており（Ｉ
Ｉ）、従って現時点では、モノクローナル抗イディオタ
イプ抗体Ａｌ２０６がどのような構造で抗原としての性
格を形成しているのかは、抗体Ａｌ２０６の可変部分の
アミノ酸配列の決定のみでは明らかにし得ないものと考
えられる。この点は抗原Ｙ　Ｈ２０６の糖鎖エピトープ
の立体構造との関連で、今後さらに明らかにされるべき
であろう。一方、現在、抗イディオタイプ抗体の抗原と
しての性格を利用し、安全で大債入手可能なワクチンと
して応用が検討されており（２６〜２８）、この点から
も、抗原と抗イディオタイプ抗体との立体構造上の相同
性は、今後の研究課題と思われる。The fact that the anti-idiotype antibody produced specifically reacts with MoAb YH206 means that the anti-idiotype antibody has immunological characteristics as the antigen YH206. In fact, as shown in FIG. 8, it was confirmed that monoclonal anti-idiotype antibody Al206 according to the present invention can be measured in the same manner as antigen YH206 using the antigen YH206 measurement system (S-EIA) using MoAb YH206. Regarding the homology between antigens and anti-idiotypic antibodies, Bruck et al. (25
) compared the amino acid sequence of the protein antigen reovirus type 3 hemagglutinin with that of a monoclonal anti-idiotypic antibody, and revealed that the amino acid sequences of the immunoglobulin variable region were partially identical. In this regard, the epitope of antigen YH206 is considered to be a sugar chain (I
I), Therefore, at present, we believe that the structure of monoclonal anti-idiotypic antibody Al206 that forms its characteristics as an antigen cannot be clarified solely by determining the amino acid sequence of the variable region of antibody Al206. It will be done. This point should be further clarified in the future in relation to the three-dimensional structure of the sugar chain epitope of antigen YH206. On the other hand, the use of anti-idiotypic antibodies as antigens is currently being considered for application as a safe and readily available vaccine (26-28), and from this point of view, the relationship between antigens and anti-idiotypic antibodies is being considered. The three-dimensional structural homology of this is considered to be a topic for future research.

抗イディオタイプ抗体を利用した血中抗体の測定は自己
免疫疾患に対して試みがなされている（２９−３１）が
、癌関連抗体に対する報告はほとんどない。ポリクロナ
ール抗イディオタイプ抗体を用いた場合とモノクローナ
ル抗イディオタイプ抗体を用いた場合の結果は第１１図
に示すように良好な相関関係を示した。しかし、ポリク
ロナール抗イディオタイプ抗体と比較し、モノクローナ
ル抗イディオタイプ抗体の場合は全体に吸光度はやや低
く、ポリクロナール抗イディオタイプ抗体内には多種の
抗イディオタイプ抗体が含まれるため、やや感度が高い
可能性が示唆された。モノクローナル抗体の特異性を利
用し、今後さらに血中抗体を定量的に検出する試みを進
めるとともに、感度を上昇させるべく、改善の余地が残
されている。Attempts have been made to measure blood antibodies using anti-idiotypic antibodies for autoimmune diseases (29-31), but there are few reports on cancer-related antibodies. The results when using polyclonal anti-idiotype antibodies and when using monoclonal anti-idiotype antibodies showed a good correlation as shown in FIG. 11. However, compared to polyclonal anti-idiotype antibodies, monoclonal anti-idiotype antibodies have slightly lower absorbance overall, and polyclonal anti-idiotype antibodies contain many different types of anti-idiotype antibodies, so they may have slightly higher sensitivity. sex was suggested. In the future, we will continue to attempt to quantitatively detect antibodies in blood by utilizing the specificity of monoclonal antibodies, and there is still room for improvement in order to increase sensitivity.

両者ともに血中ＹＨ２０６抗体高値を示した症例は胃癌
、膵癌に多く、この成績より、Ｙ　Ｈ２０６抗原が、こ
れらの癌に、より多い頻度で発現されていると推定され
る。事実、免疫ペルオキシダーゼ法による組織染色結果
によると、抗原ＹＨ２０６が同定される頻度（よ胃癌１
２例中６例、膵癌４例中３例であり、これらの癌で高率
に発現されることが確認されている（１１）。Many cases of gastric cancer and pancreatic cancer showed high levels of YH206 antibodies in the blood, and based on these results, it is estimated that YH206 antigen is expressed more frequently in these cancers. In fact, according to tissue staining results using the immunoperoxidase method, the frequency with which the antigen YH206 is identified (as compared to gastric cancer 1)
It has been confirmed that it is expressed in 6 out of 2 cases and in 3 out of 4 cases of pancreatic cancer, and is expressed at a high rate in these cancers (11).

癌患者同一血清を用いて抗原ＹＨ２０６とＹＨ２０６抗
体レベルの相関を示した（第１３図）。−部層例では血
中抗原と血中抗体が同時に検出された。川原用ら（３２
，３３）およびＫａｐｓｏｐｏｕｌｏｕ　−Ｄｏｍｉｎ
ｏｓら（３４）は、癌患者よりＣＥＡの免疫複合体を分
離することに成功しており、Ｙ）（２０６抗原抗体系に
おいても免疫複合体の存在の可能性があると考えられる
。今回用いた測定法は抗イディオタイプ抗体を固相化し
たＥＩＡであり、抗原と結合した抗体であっても抗体に
結合部位が残存していれば原理的に検出されうる系であ
る。しかしながら抗原ＹＨ２０６が高値を示す症例では
抗体は低値を示しており、抗原が過剰な条件下では免疫
複合体が存在するとしても相対的に抗体の結合部位が減
少し、本測定系では抗体の測定は難しいと考えられる。Using the same serum from a cancer patient, the correlation between antigen YH206 and YH206 antibody levels was shown (Fig. 13). - In partial cases, blood antigens and blood antibodies were detected at the same time. Yo Kawahara et al. (32
, 33) and Kapsopoulou-Domin
os et al. (34) succeeded in isolating CEA immune complexes from cancer patients, and it is thought that immune complexes may also exist in the Y)(206 antigen-antibody system. The measurement method used is EIA, which immobilizes an anti-idiotype antibody, and is a system that can, in principle, detect antibodies that have bound to antigens as long as the binding site remains on the antibodies.However, when the antigen YH206 Cases with high antibody levels show low antibody levels, and even if immune complexes exist under conditions where antigen is excessive, the number of antibody binding sites decreases relatively, making it difficult to measure antibodies with this measurement system. Conceivable.

また、ＹＨ２０６抗原が低値を示すにもかかわらず、血
中抗体が高値を示す例が存在した。このような血中抗原
陰性、血中抗体高値を示した胃癌患者血清をセファクリ
ルＳ−３００にて分画し、各分画に対して血中抗体を測
定した結果１ｇＭ分画に相当して活性が認められ、抗原
ＹＨ２０６は分子１２０００にダルトン以上の糖蛋白と
考えられており（１１，１２）、もし免疫複合体を形成
していれば活性部位は空容量にあると予想されることに
より、本症例ではＩｇＭ型遊離抗体として存在している
と考えられた。５−ＥＩＡにより血中抗原が検出される
頻度は胃癌で３０％（５６例中１９例）、膵癌で４４％
（３４例中１４例）でちり（１２）、いずれも組織発現
頻度より低率を示している。この事実は一部癌患者にお
いては組織レベルでＹＨ２０６抗原が発現されていても
、血中抗原として検出されない場合があると考えられる
。今回抗原、抗体を同時に測定しえた１４症例中４例（
２９％）に抗原ＹＨ２０６が陰性であるのにＹＨ２０６
抗体が陽性を示す症例が存在した。このことは間接的に
抗原ＹＨ２０６の存在を推定するものであり、血中ＹＨ
２０６抗体測定が血清診断に応用される可能性を示唆す
るものである。また、抗イディオタイプ抗体による抗体
測定は他の血中へ遊離しない腫瘍抗原に対する抗体にも
応用可能であると考えられる。In addition, there were cases in which blood antibody levels were high even though YH206 antigen was low. The serum of gastric cancer patients, which was negative for blood antigens and had high blood antibody levels, was fractionated using Sephacryl S-300, and blood antibodies were measured for each fraction. As a result, the activity was equivalent to 1 gM fraction. The antigen YH206 is considered to be a glycoprotein with a molecular size of 12,000 Daltons or more (11, 12), and if an immune complex is formed, the active site is expected to be in an empty capacity. In this case, it was thought that the antibody existed as an IgM type free antibody. 5-The frequency of blood antigen detection by EIA is 30% (19 out of 56 cases) in gastric cancer and 44% in pancreatic cancer.
(14 out of 34 cases) and dust (12), all of which showed a lower frequency than the tissue expression frequency. This fact is considered to be due to the fact that in some cancer patients, even if the YH206 antigen is expressed at the tissue level, it may not be detected as a blood antigen. This time, 4 out of 14 cases were able to measure antigen and antibody simultaneously (
29%) were negative for the antigen YH206;
There were cases in which antibodies were positive. This indirectly infers the presence of antigen YH206, and the presence of YH206 in the blood.
This suggests the possibility that 206 antibody measurement may be applied to serum diagnosis. In addition, antibody measurement using anti-idiotypic antibodies may also be applicable to antibodies against other tumor antigens that are not released into the blood.

以上、モノクローナル抗イディオタイプ抗体を用いて癌
患者血清中にＹＨ２０６抗体が存在することを明らかに
したが、この成績は少な（とも−部局患者においてはＹ
）（２０６抗原に対して、生体内の免疫応答の存在を示
唆するものと考えられる。従って、本発明に係る抗イデ
ィオタイプ抗体は、腫瘍免疫応答の調節、即ち治療への
応用に使用することができる。As mentioned above, we revealed the presence of YH206 antibody in the serum of cancer patients using a monoclonal anti-idiotype antibody, but the results are small (both in local patients and YH206 antibody).
) (This is considered to suggest the existence of an immune response in vivo against the 206 antigen. Therefore, the anti-idiotypic antibody according to the present invention can be used for modulation of tumor immune response, that is, for therapeutic application. Can be done.

以上、本発明を要約すると以下の通りである。The present invention can be summarized as follows.

１）腺癌関連モノクローナル抗体ＹＨ２０６を家兎およ
びマウスに免疫することにより、ＭｏＡ　ｂＹＨ２０６
に対するポリクロナール及びモノクローナル抗イディオ
タイプ抗体を作製した。1) By immunizing rabbits and mice with adenocarcinoma-related monoclonal antibody YH206, MoA bYH206
We generated polyclonal and monoclonal anti-idiotypic antibodies against.

２）抗イディオタイプ抗体は両者とも免疫原のＭｏＡｂ
　　ＹＨ２０６抗体と強い特異性を有し、かつ、ＹＨ２
０６抗原抗体反応を阻止した。このことにより結合部位
に対する抗イディオタイプ抗体と推定された。2) Both anti-idiotypic antibodies are MoAb immunogens.
Has strong specificity with YH206 antibody and YH2
06 antigen-antibody reaction was blocked. This suggests that it is an anti-idiotypic antibody directed against the binding site.

３）抗イディオタイプ抗体を用いて癌患者血中のＹＨ２
０６抗体の測定を行った結果、胃癌、膵癌患者内に抗体
高値を示すものが存在した。3) YH2 in cancer patient blood using anti-idiotype antibodies
As a result of measuring 06 antibodies, some patients with gastric cancer and pancreatic cancer showed high levels of antibodies.

４）抗原ＹＨ２０６低値を示す患者の一部に抗体高値を
示す例があり、そのような例では新しい血清診断応用へ
の可能性が示唆された。4) Some patients with low antigen YH206 levels also showed high antibody levels, suggesting the possibility of new serological diagnostic applications in such cases.

５）以上の成績は一部癌患者においては抗原ＹＨ２０６
に対する免疫応答が存在していることを示唆する。5) The above results may be due to antigen YH206 in some cancer patients.
This suggests that there is an immune response to

腹 本明細書に於いて引用した文献を以下に列記する。stomach The documents cited in this specification are listed below.

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Ｊ、　　Ｊ、、　　Ｉｒ１ｂｅ、　Ｈ，Ｆｕｊｉ、　Ｈ
，：　Ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　１ｄｉｏｔｙｐ
ｅ　ｖａｃｃｉｎｅｓ、　　Ｉｌ、　Ａｎａ１′、＋ｓ
ｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｕｍｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｎ
ｅｔｗｏｒｋ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　１ｎｄｕｃｅｄ　ｂ
ｙ　ｔｈｅ　ｔｕｍｏｒ　ａｎｄ　ｂｙ　１ｎｔｅｒｎ
ａｌ　ｉｍａｇｅｓ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　（Ａｂ２β）
、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３９，２７１−２７８（１９
８７）。J., J., Ir1be, H., Fuji, H.
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is of the tomorrow-related
etwork response 1nduced b
y the tumor and by 1ntern
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２９）　Ａｂｄｏｕ、　Ｎ、　Ｉ　、、　Ｗａｌｌ、　
Ｈ，Ｌｉｎｄｓｌｅｙ。29) Abdou, N. I., Wall.
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ｓｅｒｕｍ　ａｎｔｉ　−ＤＮ、Ａ　　ａｎｔｉｂｏｄ
ｙ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｏ　ＤＮＡ　　ｂｙ　ａｎｔｉ
−ミｄｉｏｔｙＰｉｃ　　ａｎｔｉｂｏｄｙ　　ｉｎ　
　ｓｙｓｔｅｍｉｃ　　　１ｕｐｕｓｅｒＨＩｔｈｅｎ
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-MidiotyPic antibody in
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nvest, 67.1297-1304 (1981
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３０）　　Ｍａｌ＜ｎｕｓｓｏｎ、　　Ｃ，Ｇ、　　Ｍ
、　ａｎｄ　Ｖａｅｒｍａｎ。30) Mal<nusson, C, G, M
, and Vaerman.

Ｊ　、　　Ｐ　、　　：　　Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　　Ｉ　ｇＭＣ！ａｓｓ　ａｇａｉ
ｎｔ　ａ　ｈｕｍａｎ　ｍｙｅｌｏｍａ　ｐｒｏｔｅｉ
ｎｌ（ＨＥ　　（ＤＥＳ）、　　１．　０ｃｃｕｒｒｅ
ｎｃｅ、　　Ｉｎｔ。J, P,: Autoantibody
es of the IgMC! ass agai
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３１）　　Ｕｃｈｉｇａｔａ、　　Ｙ、、　　Ｐｒａｂ
ｈａｋａｒ、　　Ｂ、　　Ｓ、、　　５ａｌａｔａ、　
　Ｋ、　　Ｆ、、　　Ｇｉｎｓｂｅｒｇ−Ｆｅｌｌｎｅ
ｒ、　　Ｆ。31) Uchigata, Y., Prab.
hakar, B, S,, 5alata,
K., F., Ginsberg-Fellne
r, F.

ａｎｃｌ　　Ｎｏｔｋｉｎｓ、　　Ａ、　　Ｌ、　　：
　　Ｈｕｍａｎ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ｍｕｌｔｉｐ
ｌｅ　ｏｒｇａｎ−ｒｅａｃｔｉｖｅ　ａｕｔｏａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ　　ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｄ　　ｂ
ｙ　　ｍｏｕｓｅ　　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　ａｎｔ
ｉ　−１ｄｉｏｔｙｐｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　
　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ　１ｄｉｏｔｏｐｅｓ　ｉ
ｎ　ｈｕｍａｎｓ　ｗｉｔｈ　ａｎｄ　ｗｉｔｈｏｕｔ
ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　ｄｉｓｅａ　ｓｅｓ、　Ｊ　、
　　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、　　１３８．４２１８−４２２
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le organ-reactive autoant
ibodies distinguished b
y mouse monoclonal ant
i-1diotypic antibodies:
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３２）川原１）信、宵崎栄泰、荒木明夫、谷内　昭：胸
・腹水中ＣＥＡの免疫化学的分析、消化器と免疫７，１
３５−１３９（１９８１）。32) Kawahara 1) Makoto, Hideyasu Yoizaki, Akio Araki, Akira Taniuchi: Immunochemical analysis of CEA in thoracic and ascitic fluid, Gastrointestinal System and Immunology 7, 1
35-139 (1981).

３３）谷内　昭、川原１）信：癌と免疫複合体、臨床免
疫１５．３９−４６（１９８３）。33) Akira Taniuchi, Shin Kawahara 1) Shin: Cancer and immune complexes, Clinical Immunology 15.39-46 (1983).

３４）　　Ｋａｐｓｏｐｏｕｌｏｕ−Ｄｏｍｉｎｏｓ、
　Ｋ、　ａｎｄ　Ａｎｄｅｒｅｒ、Ｅ、　Ａ、　：　Ｃ
ｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙ。34) Kapsopoulou-Dominos,
K, and Anderer, E, A, :C
irculating carcinoembry.

ｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｉｍｍｕｎｅ　ｃｏｍｐｌｅ
ｘｅｓ　ｉｎ　５ｅｒａ　ｏｆｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉ
ｔｈ　ｃａｒｃｉｎｏｍａｔａ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇａｓ
ｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｔｒａｃｔ、　ＣＬｉｎ
、　ｅｘｐ、　３５　、　Ｌ９０−１９５（＋　９７９
）。nic antigen immune complete
xes in 5era ofpatients wi
th carcinomata of the gas
trointestinal tract, CLin
, exp, 35, L90-195 (+979
).

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

第１図はポリクローナル抗イディオタイプ抗体とＭｏＡ
ｂＹＨ２０６およびその他のモノクローナル抗体との反
応性を示すグラフ、第２図はポリクローナル抗イディオ
タイプ抗体によるＹＨ２０６抗原−抗体反応の阻止を示
すグラフ、第３図はポリクローナル抗イディオタイプ抗
体により検出される癌患者の血清中のＹ）１２０６抗体
濃度を示すグラフ（Ｃａ：癌）、第４図はポリクローナ
ル抗イディオタイプ抗体により検出される血清中のＹＨ
２０６抗体の希釈試験を示すグラフ、第５図はＭ　ｏ　
Ａ　ｂＹＨ２０６に対する抗イディオタイプＭｏＡｂＡ
Ｉ２０６のＭｏＡｂＹＨ２０６およびその他のモノクロ
ーナル抗体との反応性を示すグラフ、第６図はＭｏＡｂ
Ａ　ｌ　２０６によるＹ　Ｈ２０６抗原−抗体反応阻止
を示すグラフ、第７図はＭｏＡｂＡ　Ｉ　２０６による
、Ａ３４９細胞へのＭｏＡｂＹＨ２０６の結合阻止を示
すグラフ、第８図は＋４ｏＡｂＹ　Ｈ２０６に対するＹ
）１２０６抗原およびＭｏＡｂＡ　１２０６の反応性パ
ターンを示すグラフ、第９図はＭｏＡｂＡＩ２０６によ
り検出される癌患者血清中のＹ　Ｈ２Ｏ６抗体濃度を示
すグラフ（Ｃａ：癌）、第１０図はＭｏＡ　ｂＡ　１２
０６により検出される血清中のＹＨ２０６抗体の希釈試
験の結果を示すグラフ、第１１図はモノクローナル抗体
Ａｌ２０６およびポリクローナル抗イディオタイプ抗体
を用いた２つの方式に於ける患者面清中のＹＩ２０６抗
体濃度の関係を示すグラフ、第１２図は胃癌患者（Ａ）
および健常者（Ｂ）の血清のセファクリルＳ−３００カ
ラムクロマトグラムを示すグラフ（点線はＹ）（２０６
抗体の活性を示し、実線はタンパク濃度を示す）、第１
３図は癌患者血清中のＹＩ２０６抗原層度とＹＩ（２０
６抗体濃度の関係を示すグラフである。Figure 1 shows polyclonal anti-idiotypic antibodies and MoA
bGraph showing reactivity with YH206 and other monoclonal antibodies. Figure 2 is a graph showing inhibition of YH206 antigen-antibody reaction by polyclonal anti-idiotype antibodies. Figure 3 is cancer patients detected by polyclonal anti-idiotype antibodies. Graph showing the concentration of Y)1206 antibody in serum (Ca: cancer), Figure 4 shows YH in serum detected by polyclonal anti-idiotype antibody.
Graph showing the dilution test of 206 antibody, FIG.
Anti-idiotypic MoAbA against A bYH206
Graph showing the reactivity of I206 with MoAb YH206 and other monoclonal antibodies, FIG.
Graph showing inhibition of Y H206 antigen-antibody reaction by A I 206, Figure 7 is a graph showing inhibition of MoAb YH206 binding to A349 cells by MoAb A I 206, Figure 8 is a graph showing inhibition of Y H206 antigen-antibody reaction by MoAb A I 206,
) 1206 antigen and MoAbA 1206, Fig. 9 is a graph showing the Y H2O6 antibody concentration in cancer patient serum detected by MoAb AI206 (Ca: cancer), Fig. 10 is MoA bA 12
Figure 11 is a graph showing the results of a dilution test of YH206 antibody in serum detected by Al206. Graph showing the relationship, Figure 12 is for a gastric cancer patient (A)
Graph showing Sephacryl S-300 column chromatograms of serum from healthy subjects (B) (dotted line is Y) (206
(indicates the activity of the antibody, and the solid line indicates the protein concentration), the first
Figure 3 shows the YI206 antigen stratification in cancer patient serum and YI(20
6 is a graph showing the relationship between antibody concentrations.

Claims (5)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）ヒト腺癌関連抗原に特異的に反応するモノクロー
ナル抗体に対する抗イディオタイプ抗体。(1) Anti-idiotypic antibodies against monoclonal antibodies that specifically react with human adenocarcinoma-related antigens. （２）モノクローナル抗体がＹＨ２０６である請求項（
１）に記載の抗イディオタイプ抗体。(2) Claim in which the monoclonal antibody is YH206 (
The anti-idiotype antibody described in 1). （３）モノクローナル抗体である請求項（２）に記載の
抗イディオタイプ抗体。(3) The anti-idiotype antibody according to claim (2), which is a monoclonal antibody. （４）請求項（３）に記載のモノクローナル抗イディオ
タイプ抗体を産生するハイブリドーマ。(4) A hybridoma producing the monoclonal anti-idiotype antibody according to claim (3). （５）請求項（３）に記載の抗イディオタイプ抗体を使
用する癌診断法。(5) A cancer diagnostic method using the anti-idiotype antibody according to claim (3).