JPH01211498A - Human igg monoclonal antibody and production thereof and drug composition containing same as active ingredient - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To produce the title monoclonal antibody highly protective against infection, by culture of animal cells transformed with a tissue containing genes coding H-chain, with a subclass at the stationary site changed to another subclass. CONSTITUTION:Animal cells are transformed by (A) a tissue containing genes coding the L-chain of human-type antibody, (B) a second tissue containing genes coding the H-chain, with a subclass at the stationary site changed to another subclass by the H-chain of human-type antibody, or (C) a third tissue containing genes coding the L-chain of human-type antibody and other genes coding H- chain, with a subclass at the stationary site changed to another subclass by the H-chain of human-type antibody. The resulting transformed product is then put to culture to secrete human-type antibody which is then recovered, thus obtaining the objective human IgG monoclonal antibody with a subclass of human-type antibody changed to another subclass using genetic engineering technique.

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は遺伝子工学的手法によるサブクラス変換抗体お
よびその製造法ならびにこれらの抗体を有効成分とする
医薬組成物に関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial Application Field] The present invention relates to subclass-converted antibodies using genetic engineering techniques, methods for producing the same, and pharmaceutical compositions containing these antibodies as active ingredients.

〔従来の技術〕[Conventional technology]

抗体は、各種の抗原物質の測定のための試薬として使用
されている他、モノクローナル抗体を投与して腫瘍を直
接攻撃する方法、モノクローナル抗体に抗癌剤を結合さ
せてモノクローナル抗体の特異性を利用して抗癌剤を腫
瘍に集中せしめる方法等への使用が検討されている他、
ウィルス、細菌、真菌などの感染症の治療、予防のため
に抗体を人体に投与する方法等にヒト血清、血漿から調
製したＩｇＧを主成分とする抗体製剤が使用されている
。しかし、これらはその中に含まれるＩｇＧのサブクラ
スについては考慮されておらず、特定化もされていない
のが現状である。他方、このような用途において、各々
の目的に応じて、より有効でかつ適したＩｇＧサブクラ
スの抗体を使用することが望まれている。Antibodies are used as reagents for measuring various antigenic substances, as well as methods that directly attack tumors by administering monoclonal antibodies, and methods that utilize the specificity of monoclonal antibodies by binding anticancer drugs to monoclonal antibodies. In addition to being considered for use in methods to concentrate anticancer drugs in tumors,
BACKGROUND OF THE INVENTION Antibody preparations containing IgG prepared from human serum and plasma as a main component are used in methods for administering antibodies to the human body for the treatment and prevention of infectious diseases such as viruses, bacteria, and fungi. However, at present, the subclasses of IgG contained therein have not been considered nor specified. On the other hand, in such uses, it is desired to use antibodies of more effective and suitable IgG subclasses depending on each purpose.

一般的に抗体はそのＩｇＧのサブクラスによりその性質
及び生物活性が異なることが知られており　〔底置　：
Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
　　　５　　ｐｌＢ７；Ｐｒｅｎｕ＋＋＋　Ｍｅｄｉｃ
ａｌ　Ｂｏｏｋ　Ｃｏ＋ｗｐａｎｙ、Ｎ、Ｙ、ａｎｄ　
Ｌｏｎｄｏｎ（１９Ｂ？）　）　、その利用目的に応じ
て最も適したＩｇＧサブクラスの使用が望まれる。例え
ば、細菌感染症の予防や治療の目的には、補体活性化能
および食細胞との親和性の高いＩｇＧ１　、　ＩｇＧ＋
などのサブクラスが望ましい、しかも、抗原（細菌等）
に対する特異性の高いものでなくてはならない。It is generally known that the properties and biological activities of antibodies differ depending on their IgG subclass.
Comprehensive Immunology
5 plB7; Prenu+++ Medic
al Book Co+wpany, N, Y, and
London (19B?)), it is desirable to use the most suitable IgG subclass depending on the purpose of use. For example, for the purpose of preventing and treating bacterial infections, IgG1 and IgG+, which have a high complement activation ability and a high affinity for phagocytes, are used.
subclasses such as antigens (bacteria, etc.) are desirable.
It must be highly specific.

そこで、モノクローナル抗体の作製法が検討されている
が、これらの方法では得られるＩｇＧ抗体のサブクラス
を自由に選択することはできないし、どのサブクラスの
抗体が最も感染防御に対し効果的であるかは明らかでは
なかった。また、ヒト−ヒトハイブリドーマを、その抗
体産生能を維持しながら、長期間継代維持することが困
難である。このようなヒト−ヒトハイブリドーマ法の欠
点を除去する方法として、特定の抗体を産生ずる能力を
有するヒト細胞をエプスタインパールウィルスで形質転
換することにより不滅化する方法が知られている。しか
しながら、この方法によって所望の特定の特異性を有す
る任意のＩｇＧサブクラスの抗体を得ることは容易なこ
とではない。Therefore, methods for producing monoclonal antibodies are being considered, but these methods do not allow the free selection of the subclass of the IgG antibody obtained, and it is unclear which subclass of antibody is most effective in preventing infection. It wasn't obvious. Furthermore, it is difficult to subculture human-human hybridomas for a long period of time while maintaining their antibody-producing ability. As a method for eliminating such drawbacks of the human-human hybridoma method, a method is known in which human cells capable of producing a specific antibody are transformed with Epstein-Parr virus and thereby immortalized. However, it is not easy to obtain antibodies of any IgG subclass with the desired specificity by this method.

このため、遺伝子工学的手法による抗体の製造方法が検
討されている。For this reason, methods for producing antibodies using genetic engineering techniques are being considered.

特開昭６１−１３４３２４号にはヒト抗体Ｈ鎖のみの不
完全抗体の発現について記載されている。JP-A-61-134324 describes the expression of incomplete antibodies containing only human antibody H chains.

特開昭６１−４７５００号及び特開昭６１−１３４３２
５号にはＨ鎖とＬ鎖とから成るヒト−マウス・キメラ抗
体の発現が記載されている。しかしながら、これらの明
細書にはヒト型抗体の発現・分泌については記載されて
いない。また、ヒトＩｇＧ抗体のサブクラス変換抗体の
作製法についての記載もない。JP-A-61-47500 and JP-A-61-13432
No. 5 describes the expression of a human-mouse chimeric antibody consisting of an H chain and an L chain. However, these specifications do not describe the expression and secretion of human antibodies. Furthermore, there is no description of a method for producing a subclass-converted human IgG antibody.

一方、可変部位が同一で、定常部位が異るヒト抗体の免
疫活性に関し、ヒト抗体について比較検討された事例は
ない、従って、どの様な抗体が感染防御に対し有効であ
るか明確に示されていない。On the other hand, there has been no comparative study of the immune activity of human antibodies that have the same variable region but different constant regions.Therefore, it has not been clearly shown what kind of antibodies are effective in preventing infection. Not yet.

〔発明が解決しようとする課題〕[Problem to be solved by the invention]

従って、この発明は、目的とする特定の特異性を有する
任意のサブクラスのヒト型抗体を製造することができる
方法を提供することを目的とする。Therefore, an object of the present invention is to provide a method capable of producing a human antibody of any subclass having a specific specificity of interest.

又、サブクラスの異る抗体を比較検討することより、医
薬組成物特に感染防御に最もふされしいＩｇＧサブクラ
スの抗体を提供することを目的とする。Furthermore, by comparing and examining antibodies of different subclasses, the present invention aims to provide antibodies of the IgG subclass that are most suitable for pharmaceutical compositions, particularly for protection against infection.

〔課題を解決するための方法〕[Method to solve the problem]

上記の目的を達成するため、本発明は、ヒト型抗体のサ
ブクラスを遺伝子工学的に他のサブクラスに変換したヒ
トＩｇＧモノクローナル抗体；ヒト型抗体のし鎖をコー
ドする遺伝子を含有する組換体、及びヒト型抗体の■］
鎖において定常部位のサブクラスを他のサブクラスに変
換したμ鎖をコードする遺伝子を含有する組換体により
、又はヒト型抗体のし鎖をコードする遺伝子とヒト型抗
体のμ鎖において定常部位のサブクラスを他のサブクラ
スに変換したμ鎖をコードする遺伝子とを含有する組換
体により形質転換された動物細胞を培養することによっ
てヒト型抗体を分泌せしめ、該抗体を回収することを特
徴とするヒト化抗体のサブクラスが遺伝子工学的に変換
されたヒ）ＩｇＧモノクローナル抗体の製造方法；並び
にヒｌ−ＩｇＧモノクローナル抗体のサブクラス変換体
を有効成分とする感染症治療用医薬組成物を堤供するも
のである。In order to achieve the above object, the present invention provides a human IgG monoclonal antibody in which a human antibody subclass is genetically engineered into another subclass; a recombinant antibody containing a gene encoding a human antibody short chain; ■ of human antibodies]
A recombinant containing a gene encoding a μ chain in which the subclass of the constant region in the chain has been changed to another subclass, or a gene encoding the second chain of a human antibody and a subclass of the constant region in the μ chain of a human antibody. A humanized antibody characterized in that a humanized antibody is secreted by culturing an animal cell transformed with a recombinant containing a gene encoding a μ chain converted to another subclass, and the antibody is recovered. The present invention provides a method for producing a human IgG monoclonal antibody whose subclass has been genetically modified; and a pharmaceutical composition for treating infectious diseases containing the subclass transformed human IgG monoclonal antibody as an active ingredient.

〔具体的な説明〕[Specific explanation]

ａ）遺伝王皇血来 抗体の基本単位は２本の重鎮（μ鎖）と２本の軽鎖（Ｌ
ＩＫ）である。そして各々の鎖は可変領域（■領域）お
よび定常領域（ＣｅＩ域）よりなる。a) The basic units of genetic antibodies are two heavy chains (μ chains) and two light chains (L
IK). Each chain consists of a variable region (■ region) and a constant region (Cel region).

このようなヒト型抗体の遺伝子は、その塩基配列又はア
ミノ酸配列が公知のものについては化学的に合成するこ
とができる。また、その一部しか解明されていないもの
や、化学的合成に不向きなものについては各種ヒト臓器
由来細胞より公知の常法に従って取得することができる
。例えば染色体ＤＮＡより直接取得する方法や、まずｍ
ＲＮＡを得たのちｃＤＮＡを調製するという方法等があ
る。Such human antibody genes can be chemically synthesized if their nucleotide sequences or amino acid sequences are known. In addition, those for which only a portion of them has been elucidated or those that are unsuitable for chemical synthesis can be obtained from cells derived from various human organs according to known conventional methods. For example, there are methods to obtain directly from chromosomal DNA, and
There are methods such as obtaining RNA and then preparing cDNA.

ここでヒト抗体遺伝子の供給源は、ヒト臓器由来細胞で
あればよいが、リンパ系細胞由来のものが好ましい。Here, the source of the human antibody gene may be any cell derived from a human organ, but preferably one derived from lymphoid cells.

特定の抗原に対して特異性を存する可変領域をコードす
る遺伝子を調製するには、抗体遺伝子の再配列が完了し
た遺伝子を具備する特異抗体を産生ずるハイブリドーマ
、形質転喚法により樹立された細胞、抗原がわかってい
るミエローマ細胞等が好ましい、一般に、未分化の抗体
遺伝子においてはμ鎖可変領域をコードする遺伝子を構
成するＶ、遺伝子、Ｄ遺伝子及びＪ□遺伝子、並びに定
常領域をコードするＣ工遺伝子が離れて配列されており
、これらがＤ−Ｊ結合、次にＶ−Ｄ−Ｊ結合を経てＶＨ
−ＤＨ−Ｊ　ＩＩ　−ＣＨの形になり発現型の遺伝子が
確立される。これに続き、μ鎖をコードする遺伝子につ
いても、μ鎖可変領域をコードするｖＬ遺伝子とＪＬ遺
伝子のＶ−Ｊ結合が起こり、最終的にに型又はλ型り鎖
の発現型遺伝子が確立される。従って、前記の可変領域
をコードする遺伝子の調製は、このような発現型抗体遺
伝子が確立された後の細胞から得る。In order to prepare a gene encoding a variable region that has specificity for a specific antigen, hybridomas that produce specific antibodies and cells that have been established by transformation methods that have genes in which the antibody gene has been rearranged are used. , myeloma cells whose antigens are known are preferred. Generally, undifferentiated antibody genes include the V, D, and J genes that constitute the gene encoding the μ chain variable region, and the C gene that encodes the constant region. The engineered genes are arranged separately, and these form VH through D-J bonds and then V-D-J bonds.
-DH-J II -CH, and the expressed gene is established. Following this, V-J coupling of the vL gene encoding the μ chain variable region and the JL gene occurs for the gene encoding the μ chain, and finally the expression type gene of the type or lambda type chain is established. Ru. Therefore, the preparation of genes encoding the variable regions described above is obtained from cells after such expressed antibody genes have been established.

他方、定常領域をコードする遺伝子（μ鎖についてはＣ
Ｈ遺伝子と称し、μ鎖についてはＣ１遺伝子と称する）
を取得する場合の供給源は、ヒト由来細胞ならいずれで
もよく、又樹立リンパ系培養細胞株であってもよい。こ
の場合、特定特異抗体を産生ずる細胞株を使用すること
は必ずしも必要ではない。On the other hand, the gene encoding the constant region (for the μ chain, C
(referred to as the H gene, and the μ chain as the C1 gene)
The source for obtaining may be any human-derived cells, or may be an established lymphoid cultured cell line. In this case, it is not necessarily necessary to use a cell line that produces a specific specific antibody.

ＣＬ遺伝子にはに型及びλ型ＬｕｉをコードするＣに遺
伝子とＣλ遺伝子がそれぞれあり、またＣＨ遺伝子には
抗体クラスを決定するμ鎖、δ鎖、γ鎖、μ鎖及びα鎖
をコードするＣμ遺伝子、ＣａＪ伝子、Ｃｒ遺伝子、Ｃ
ε遺伝子及びＣα遺伝子がある。従って本発明において
は、前記のＣｒ遺伝子又はＣに遺伝子のいずれかと目的
とする可変領域遺伝子とを連結して任意のタイプのμ鎖
遺伝子を造成することができ、他方、前記のＣμ遺伝子
〜Ｃα遺伝子のいずれかと目的とする可変領域遺伝子と
を連結して任意のタイプのＨｒＡ遺伝子を得ることがで
きる。The CL gene has a C gene and a Cλ gene that encode the type and λ type Lui, respectively, and the CH gene encodes the μ chain, δ chain, γ chain, μ chain, and α chain that determine the antibody class. Cμ gene, CaJ gene, Cr gene, C
There is an ε gene and a Cα gene. Therefore, in the present invention, any type of μ chain gene can be constructed by linking either the Cr gene or the C gene with a variable region gene of interest, and on the other hand, the Cμ gene to Cα Any type of HrA gene can be obtained by linking any of the genes with a variable region gene of interest.

ＩｇＧクラスの抗体即ちＴ免疫遺伝子はヒトではｒ＋　
　＋Ｔｚ　＋７＊　　＊ｒｓの４種が知られており、可
変領域遺伝子が連結することにより、それぞれＩｇＧ＋
　、　ＩｇＧｔ　、　ＩｇＧｓ、及びＩｇＧ４の定常部
位の異なる抗体が存在する。これら定常部位が異なる事
よりＩｇＧとしての性質も異にすることが知られている
〔底置：Ｃｏ＋！Ｉｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｉｎ＋ｓ＋
ｕｎｏｌｏｇｙ＋　　５＋ＰＰ１８７＋ＰＬ諏ｔ１Ｍ　
ＭＥ（）ＩＣＡＬ　ＢＯＯＫ　ＣＯＭＰＡＮＹ、Ｎ、Ｙ
、ＡＮＩ）　ＬＯＮＤＯＮ（１９Ｂ？）、　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　ＰＰ５０．　
（１９８３）Ｇｒｎｅ　ａｎｄ　５ｔｒａｔｔｏｎ、Ｌ
ｏｎｄｏｎ）　１１例えば、補体結合能ではＩｇＧ、や
ＩｇＧ、が強＜　ＩｇＧｔは弱（ＩｇＧａでは見られな
い、又単核球や好中球に対する親和性はＩｇＧ。IgG class antibodies, or T immune genes, are r+ in humans.
+Tz +7* *rs are known, and each one produces IgG+ by linking the variable region genes.
, IgGt, IgGs, and IgG4 constant regions exist. It is known that because these constant sites are different, the properties as IgG are also different [base position: Co+! Iprehensive In+s+
unology+ 5+PP187+PL Sui t1M
ME()ICAL BOOK COMPANY, N, Y
, ANI) LONDON (19B?), Immun
ology in Medicine, PP50.
(1983) Grne and 5tratton, L.
11 For example, in terms of complement fixation ability, IgG and IgG have strong < IgGt has weak (not observed in IgG, and IgG has an affinity for mononuclear cells and neutrophils.

やＩ［Ｇ、には見られ、他のにはほとんど見られない等
である。従って特定のサブクラス抗体を作ることで治療
等に合目的に特定サブクラス抗体を供給出来る。and I[G, and is rarely seen in others. Therefore, by producing a specific subclass antibody, it is possible to supply the specific subclass antibody for therapeutic purposes.

さらに、これらの種々の１４Ｍ遺伝子とＨ鎖遺伝子の組
合わせを選択して、同一細胞内に発現せしめ、抗体を分
泌せしめることができる。次に、発現し得られた抗体を
用い各々を比較することより、治療目的に最もふされし
い抗体、例えばサブクラスｔｇｃ、、を供給できる。又
、一般血清よりｒｇｃ、サブクラス抗体をアフィニティ
ーカラムクロマトグラフィー等により濃縮することも可
能となり、より感染防御能のすぐれたポリクローナル抗
体をも供給できる。Furthermore, combinations of these various 14M genes and H chain genes can be selected and expressed within the same cell to secrete antibodies. Next, by comparing each of the expressed antibodies, it is possible to provide the antibody most suitable for therapeutic purposes, for example, subclass TGC. Furthermore, it becomes possible to concentrate RGC and subclass antibodies from general serum by affinity column chromatography, etc., and it is also possible to supply polyclonal antibodies with better ability to protect against infection.

ｂ）　クローニング 前記のＬＩＪｆ遺伝子とＨ鎖遺伝子は通常、別々のクロ
ーニングベクターに挿入してクローニングするのが便利
である０例えば、所望の抗体を産生ずる細胞からゲノム
ＤＮＡを抽出し、これを制限酵素、剪断力等常用の手段
により切断し、これを常法に従ってクローニング用ベク
ター、例えばプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵｃ１３等に
挿入し、これらのプラスミドにより常用の宿主、例えば
大腸菌を形質転換して遺伝子ライブラリーを造成する。b) Cloning It is usually convenient to clone the LIJf gene and the H chain gene by inserting them into separate cloning vectors. , cut by a conventional means such as shearing force, insert this into a cloning vector such as plasmid pBR322, pUc13, etc. according to a conventional method, and transform a conventional host such as E. coli with these plasmids to construct a gene library. do.

次に、このライブラリーを、常用の手段、例えばコロニ
ーハイブリダイゼーションによりスクリーニングする。This library is then screened by conventional means, such as colony hybridization.

他の方法においては、所望の抗体を産生ずる細胞からＲ
ＮＡを抽出し、この抽出物をオリゴｄＴカラムで処理す
ることによりポリＡ”’ＲＮＡを濃縮する。次に、常法
に従って、このポリＡ（°）ＲＮＡを鋳型として、これ
に相補的な第一のｃＤＮＡを合成し、次に鋳型ＲＮＡを
分解除去した後前記第−のｃＤＮＡを鋳型として第二の
ｃ　ＤＮＡを合成し、さらにこれをベクターに挿入し２
本鎖ｃＤＮＡを含有する組換ＤＮＡを得る。このプラス
ミドにより、例えば大腸菌を形質転換することによって
遺伝子ライブラリーを作成する。次に、前記の様にして
このライブラリーをスクリーニングすることにより所望
のｃＤＮＡ挿入部を含有するプラスミドを選択すること
ができる。In other methods, R
NA is extracted and the extract is treated with an oligo dT column to concentrate polyA"'RNA. Next, using this polyA(°)RNA as a template, a complementary RNA is extracted using a conventional method. After synthesizing one cDNA and then decomposing and removing the template RNA, a second cDNA is synthesized using the first cDNA as a template, and this is further inserted into a vector.
Obtain recombinant DNA containing full-stranded cDNA. A gene library is created by transforming E. coli with this plasmid, for example. Plasmids containing the desired cDNA insert can then be selected by screening this library as described above.

Ｃ）　　　ベクターの富、′ 前記のようにしてクローニングされたＨ鎖遺伝子及びＬ
鎖遺伝子は別個の発現ベクターに挿入し、２種類の発現
ベクターにより宿主細胞を形質転換してもよく、又はＨ
鎖遺伝子とＬｔＭ遺伝子の両者を同一の発現ベクターに
挿入して、この１種類の組換体により宿主を形質転換し
てもよい。C) Vector enrichment, 'H chain gene and L cloned as above
The chain genes may be inserted into separate expression vectors, the two expression vectors may transform host cells, or the H
Both the LtM gene and the LtM gene may be inserted into the same expression vector, and a host may be transformed with this one type of recombinant.

いずれの場合には、ベクターは、次の点を満足するもの
ならいずれも使用可能なものとなる。In either case, any vector that satisfies the following points can be used.

ｉ）目的とする抗体遺伝子ＤＮＡと組換え体を作成可能
であること。i) It is possible to create a recombinant with the desired antibody gene DNA.

ｉｉ　）目的とする宿主細胞内で増殖可能もしくは宿主
染色体へ組込み可能であること。ii) Able to proliferate within the target host cell or integrate into the host chromosome.

ｉｉｉ　）目的とする宿主細胞内へ導入可能であること
。iii) It can be introduced into the target host cell.

ｉｖ）組み換え体ＤＮＡを持つ細胞を特異的に検出、又
は選択できること。iv) Being able to specifically detect or select cells containing recombinant DNA.

これらの点を満足するものとしては、多種多様なベクタ
ーがあるがその例としてはＳＶ４０系として、ｐＳＶ２
ｎｅｏ　、　　ｐＳＶ２ｇｐｔ　、　　ｐＳＶ３ｎｅｏ
　。There are a wide variety of vectors that satisfy these points, examples of which include the SV40 series, pSV2
neo, pSV2gpt, pSV3neo
.

ｐｓＶａｇＰｔ　　、　　Ｉ）ＳＶ５ｎｅｏＰ　、　Ｓ
Ｖ５ｇｐｔ　　、　　ｐＣＤ−にＰ。psVagPt, I) SV5neoP, S
V5gpt, pCD-P.

５Ｌ−ＴＫ　、　ＢＫＶ系として、ｐＢＫＴＫ−１Ｓ　
ＢＰＶ系として、ｐＢＰＶａｗＴ（５２−１）　　、　
ｐＢＰＬｌ、＊Ｔ−ＳＶｔｇｐｔ。5L-TK, pBKTK-1S as BKV system
As a BPV system, pBPVawT(52-1),
pBPLl, *T-SVtgpt.

ｐＭＬＢＰＵ−ＨＴＫ　　：　７テ／系として、ｄ−５
ＶＲ１〜２６゜ΔＥｌ／ａ３０９：Ｅ、Ｂウィルス系と
して、ｐＨＢＢＯ；Ｈ３Ｖ系とＬｒ、ｐＰ２−１０３　
、　ｐＧＸ５８　；　”７クシニアウイルス系として、
ｐＨＢｓ４；レトロウィルス系として、ｐＺＩＰ−Ｎｅ
ｏＳＶ（Ｂ）　、　　ｐＴＫ−ＳＮＶ：　ｐＭｕＳＶ−
ｇｐＬ及びレトロウィルス利用ベクターなどがある。　
　組換えＤＮＡの作製法は公知であり例えば■制限酵素
による方法詳しくは、二本鎖ＤＴＡの切断によって生じ
る付着末端または平滑末端をＤＮＡリガーゼで結合させ
る方法と、■ターミナルトランスフェラーゼによる方法
、詳しくは、ベクターのＤＮＡと外来性ＤＮＡと末端に
それぞれ互いに相補的なヌクレオチドの一本鎖の尾を付
加し、（例えばベクターにポリＡ鎖、外来性ＤＮＡにポ
リＴ鎖）両者をその一本鎖同士の相補鎖形成によって結
合させる方法等が一般的である。本発明の一実施例にお
いてはＨ鎖遺伝子を含む組換ＤＮＡとＬ鎖遺伝子を含む
組換体を構築した。より具体的には実施例において記載
する。pMLBPU-HTK: d-5 as a 7te/system
VR1-26゜ΔEl/a309: E, B virus system, pHBBO; H3V system and Lr, pP2-103
, pGX58; ``7 As a Cuccinia virus system,
pHBs4; pZIP-Ne as a retrovirus system
oSV(B), pTK-SNV: pMuSV-
Examples include gpL and retrovirus-based vectors.
Methods for producing recombinant DNA are well known, and include, for example, 1) a method using restriction enzymes; in detail, a method in which cohesive ends or blunt ends generated by cutting double-stranded DTA are ligated with DNA ligase; and 2) a method using terminal transferase, in particular, Single-stranded nucleotide tails that are complementary to each other are added to the ends of the vector DNA and foreign DNA, respectively (for example, poly A chain to the vector, poly T chain to the foreign DNA), and the two strands are bonded to each other. Common methods include binding by forming complementary strands. In one example of the present invention, a recombinant DNA containing an H chain gene and a recombinant containing an L chain gene were constructed. More specifically, it will be described in Examples.

ｄ）彫１に換生傅■盟 動物細胞中で発現可能なベクターに目的遺伝子を組換え
たものを動物細胞中に導入する方法６二Ｇま次のような
数種の方法が知られている。しかし・実際には、宿主側
およびベクター側の条件が一致しなければいけないので
、各々の組み合わせに依存して適切な導入方法を選択す
る必要がある。d) A method of introducing into animal cells a vector with a target gene recombined with it that can be expressed in animal cells.Several methods are known, including the following: There is. However, in reality, the conditions on the host side and the vector side must match, so it is necessary to select an appropriate introduction method depending on each combination.

ｉ）リン酸カルシウム−ＤＮＡ複合体法（リン酸カルシ
ウム法）　　ＣＭ、Ｗｉｇｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ、ｃｅｌ
ｌ。i) Calcium phosphate-DNA complex method (calcium phosphate method) CM, Wiglin et al, cel
l.

１９７２５　（１９７８）　）、 ｉｉ　）プロトプラスト融合法（Ｗ、５ｃｈａｔｆｒｅ
ｒ、Ｐｒｏｃ。19725 (1978)), ii) Protoplast fusion method (W, 5chatfre
r, Proc.

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７７　、１９８
０）、１ｉｉ）　ＤＥＡＲ−デキストラン法ＣＧ、Ｍｉ
１ｍａｎ＋Ｍ、）ｌｅｒｚ−ｂｅｒｇ、Ｓｏｍａｔｉｃ
　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉ、、　７１６Ｈ１９８１））
、１ｖ）ａ小注入法（マイクロインジェクション法）（
Ａ、Ｇｒａｅｓｓｍａｎ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｆ
ｉｎｚｙｍｏｌ、。Natl, Acad, Sci, USA, 77, 198
0), 1ii) DEAR-dextran method CG, Mi
1man+M,)lerz-berg, Somatic
Ce1l Geneti, 716H1981))
, 1v)a Small injection method (microinjection method) (
A. Graessman et al., Methods in f.
inzymol.

皿、　８１６　（１９８０））、 ■）赤血球ゴースト融合法（Ｔ、　Ｉ　ｉｎｏ等、Ｅｘ
ｐ。Dish, 816 (1980)), ■) Red blood cell ghost fusion method (T, Iino et al., Ex
p.

Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、、１４８　；４’７５（１９８５）
）、ｖｉ）ブリンキング法（Ｆ、Ｙａｍａｍｏｔｏ等、
Ｅｘｐ、Ｃｅ１ｌＲｅｓ、１４２．７９　（１９８２）
　）、ｖｉ）電気パルス法［Ｈ，Ｎｅｗｍａｎｎ等、Ｔ
ｈｅ　ＥＭＢＯＪ。Ce1l Res, 148; 4'75 (1985)
), vi) Blinking method (F, Yamamoto et al.,
Exp, Ce1lRes, 142.79 (1982)
), vi) electric pulse method [H, Newmann et al., T
he EMBOJ.

１．８４１　（１９８２）　）、 ｖｉ）リポゾーム融合法（Ｒ，Ｆｒａｌｅｙ等、Ｊ、Ｂ
ｉｏｌ。1.841 (1982) ), vi) liposome fusion method (R, Fraley et al., J, B
iol.

Ｃｈｅｍ、、２５５．１０４３１　（１９８０）　）、
などが適応可能な方法としてあげられる。Chem, 255.10431 (1980)),
Examples of applicable methods include:

目的遺伝子が導入された細胞（形質転換細胞）をその全
処理細胞から選択する手段は一般的番こ番よすべて、ベ
クターＤＮＡに、検出・選択容易なマーカーを付加させ
る方法がとられており、前項に挙げたベクターもすべて
種々のマーカーを含むＤＮＡである。動物細胞で使用可
能なベクターには薬剤耐性マーカーをもつもの、ＨＡ　
Ｔ培地によるもの、Ｅｃｏｇｐｔによるものなどがあげ
られる。薬剤耐性マーカーとしては、ネオマイシン（Ｇ
４１Ｂ）耐性があり、その耐性遺伝子としては、トラン
スボゾンＴｎ５のアミノグリコシド３′−ホスホトラン
スフェラーゼがある。又、メトトレキセート耐性につい
ては、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子がこの耐性に関与し
ている。いずれの場合もこの耐性遺伝子を含むベクター
を導入された細胞は、これらの薬剤に対して耐性を発揮
することにより、これらの薬剤中で生育可能となり選択
可能となる。The general method for selecting cells into which the target gene has been introduced (transformed cells) from all treated cells is to add a marker to the vector DNA that is easy to detect and select. All of the vectors listed in the previous section are DNA containing various markers. Vectors that can be used in animal cells include those with drug resistance markers and HA.
Examples include those using T medium and those using Ecogpt. As a drug resistance marker, neomycin (G
41B) is resistant, and the resistance gene includes aminoglycoside 3'-phosphotransferase of transboson Tn5. Regarding methotrexate resistance, the dihydrofolate reductase gene is involved in this resistance. In either case, cells into which a vector containing this resistance gene has been introduced exhibit resistance to these drugs, thereby being able to grow in these drugs and becoming selectable.

ＨＡＴ培地によるものでは、ＨＧＰＲＴ−又はＴＫ−細
胞を宿主とした場合これらはＨＡＴ培地中では生存増殖
できない。これに、マーカーとしてＩＩＧＰＲＴ又はＴ
Ｋ遺伝子を含むベクターをし導入することで、形質転換
細胞はＨＡＴ培地中で増殖可能となり選択できることに
なる。Ｅｃｏｇｐｔを用いるものについては、ミコフェ
ノール酸が核酸前駆体合成のうちＩＭＰ−ＸＭＰを阻害
するためにグアニンかキサンチンが供給されないと細胞
は増殖できない。In the HAT medium, when HGPRT- or TK- cells are used as hosts, they cannot survive and proliferate in the HAT medium. This was combined with IIGPRT or T as a marker.
By introducing a vector containing the K gene, transformed cells can be grown in HAT medium and can be selected. For those using Ecogpt, cells cannot proliferate unless guanine or xanthine is supplied because mycophenolic acid inhibits IMP-XMP in nucleic acid precursor synthesis.

動物細胞のｇ　ｐ　ｔ　（ＩＩＧＰＲＴ）がグアニン、
ヒボキサンチンを基質にするのに対し、Ｅ、コリのＥｃ
ｏｇｐｔはキサンチンを用いる。この違いを利用し、キ
サンチンを含む培地中で、Ｅ、コリ由来のＥｃｏｇｐｔ
を含むベクターを導入した動物細胞のみを選択できるこ
とになる０以上、いずれかの宿主−ベクター系を選択し
、上記した適当な導入方法を用Ｇ）て、目的とする抗体
遺伝子を含む発現ベクターを動物細胞内に導入して常法
より所望の形質転換体を得ることができる。このような
遺伝子を含む発現ベクターを動物細胞に導入するに際し
、ＨｊＭ遺（公子あるいはＬ鎖遺伝子を含むベクター各
々を細胞に導入し、発現させてもよいが、予め両方の遺
伝子を含むベクターを調製してこれを細胞内に導入して
もよい。g p t (IIGPRT) in animal cells is guanine,
Hyboxanthin is used as a substrate, whereas E. coli Ec
ogpt uses xanthine. Taking advantage of this difference, in a medium containing xanthine, Ecogpt derived from E. coli was
Select one of the host-vector systems (0 or more) that allows selection of only animal cells into which the vector containing the vector has been introduced, and use the appropriate introduction method described above to generate the expression vector containing the antibody gene of interest. Desired transformants can be obtained by introducing into animal cells by conventional methods. When introducing an expression vector containing such a gene into animal cells, each vector containing the HjM gene (or L chain gene) may be introduced into the cell and expressed, but vectors containing both genes may be prepared in advance. This may then be introduced into cells.

本発明の一実施例においては、まず、ＬＨ遺伝子を含む
ベクターｐＧ３１Ｖｋ　−ｎｅｏを動物細胞Ｐ３Ｕｌ、
又はＳＰ２１０−Ａｇ１４に導入して形質転換体２６−
１０３又はＧ３ＬＳＰ−５を得る。この細胞においては
、遺伝子は発現されておりその培養上清中にＬ鎖の存在
を確認する。ついで、この２６−１０３又番まＧ３ＬＳ
Ｐ−５ニ、Ａｕ１Ｊ伝子を含ムヘクターｐＧ３１Ｏ１（
Ｔ１）、ｐＧ３１０２　（γり、ｐＧ３１０３　（Ｔ　
３）を導入しそれぞれ形質転換体Ｇ３１０１−　Ｆ　、
　Ｇ３１０２−　Ｂ、Ｇ３１０３−Ｂ又はＧ３１０１Ａ
　６、Ｇ３１０２Ｄ２、Ｇ３１０３Ｆ８を得る。これら
の細胞を常法に従って培養し、その培養上清を分析した
ことろ、緑膿菌のフィッシャー型の血清分類４型（Ｆ４
）に対するヒト型抗体ＩｇＧ＋（Ｇ３１０１　Ｆ　、　
Ｇ３１０１Ａ　６　）　、ＩｇＧｔ（Ｇ３１０２−　Ｂ
　、　Ｇ３１０２Ｄ　２　）、ＩｇＧｉ（０３１０３Ｂ
　、　Ｇ３１０３Ｆ８）をそれぞれ分泌していることが
確認できた。In one embodiment of the present invention, first, the vector pG31Vk-neo containing the LH gene was injected into animal cells P3Ul,
Or transformant 26- by introducing it into SP210-Ag14
103 or G3LSP-5. In these cells, the gene is expressed, and the presence of the L chain is confirmed in the culture supernatant. Next, this 26-103 Matabanma G3LS
P-5, muhector pG31O1 containing Au1J gene (
T1), pG3102 (γri, pG3103 (T
3) and transformants G3101-F,
G3102-B, G3103-B or G3101A
6, G3102D2 and G3103F8 are obtained. These cells were cultured according to a conventional method, and the culture supernatant was analyzed.
) against human antibody IgG+ (G3101 F,
G3101A6), IgGt(G3102-B
, G3102D 2 ), IgGi (03103B
, G3103F8) were confirmed to be secreted.

従って、本発明の一態様においては、予め調製しておい
た各々の遺伝子を含むベクターのうちの１つを用いて、
宿主を形質転換したのち、他方のベクターを用いて、さ
らに形質転換を行い所望抗体を産生ずる形質転換体をえ
ることができる。Therefore, in one aspect of the present invention, one of the vectors containing each gene prepared in advance is used to
After the host has been transformed, the other vector can be used for further transformation to obtain a transformant that produces the desired antibody.

ｅ）所望汎生葛皇得 形質転換体が得られた場合、この細胞は宿主自体を培養
可能な通常の細胞培養条件（必要ならばさらに選択用薬
剤を含む条件）下で培養可能である。従って、宿主細胞
の培養条件に準じて、形質転換細胞を培養し、この培養
上清から目的とする発現分泌されたヒト抗体又は、その
フラグメントを得ることが可能である。例えば、ＲＰＭ
Ｉ　−１６４０培地に１０％に牛胎児血清を含む完全培
地を用いることができる。又、必要ならば、この培養条
件は、無血清培養化することが可能で、後の生産物（ヒ
ト抗体そのフラグメント）の回収、精製を容易にするこ
とが可能となる。この無血清培地としては、ＫＣ社、Ｋ
　Ｃ２０００＠　／富士レヒ、ｔ）（［３ｔｏｔｏ。e) When the desired pan-genetically active transformant is obtained, this cell can be cultured under normal cell culture conditions that allow culturing of the host itself (if necessary, conditions that further include a selection agent). Therefore, it is possible to culture the transformed cells according to the culture conditions of the host cells, and to obtain the desired expressed and secreted human antibody or fragment thereof from the culture supernatant. For example, RPM
A complete medium containing 10% fetal bovine serum in I-1640 medium can be used. In addition, if necessary, the culture conditions can be changed to serum-free culture, which facilitates the subsequent recovery and purification of the product (human antibody fragment thereof). This serum-free medium is manufactured by KC Co., Ltd.
C2000@/Fujirehi, t) ([3toto.

ＨＢ　１０２９　、　ＨＢ　１０３０、ＨＢ１０４９、
三光純薬ハイブリティー１ｏ、フナコシＨＬ−１０，Ｌ
ＫＢ社、ＵＬＴＲＯＳＥＲ−Ｇ＠、ベーリンガーマハイ
ム山之内社、Ｎｕｔｒｉｄｏｍｏ−１１０９、Ｎｕｔｒ
ｉｄｏｍａ−３Ｐｆ９、などが使用可能である。分泌生
産された抗体の検出確認にはラジオイムノアッセイ　（
ＲＩＡ）、エンザイムリンクドイムノソルベントア・ソ
セイ　（ＥＬＩＳ八）を用いるとかできる。HB 1029, HB 1030, HB1049,
Sanko Junyaku Hybrid 1o, Funakoshi HL-10,L
KB, ULTROSER-G@, Boehringer Mahaim Yamanouchi, Nutridomo-1109, Nutr
idoma-3Pf9, etc. can be used. Radioimmunoassay (
It can be done by using enzyme-linked immunosorbent acid (RIA) or enzyme-linked immunosorbent agent (ELIS 8).

また、培地中からの抗体ないしそのフラグメントの回収
は、通常の抗体精製の過程と同様に行うことができる。Furthermore, the antibody or its fragment can be recovered from the medium in the same manner as in the usual antibody purification process.

すなわち、培養上清の適当な硫酸アンモニウム飽和度４
０〜６０％（好ましくは５０％）又はポリエチレングリ
コール６０００　（１２〜１５％Ｗ／ｖ）、による抗体
のタンパクの沈澱回収、イオン交換体による精製、ゲル
ろ過による精製が可能である。この他、ＤＥＡＥ−Ａｆ
ｆｉＧｅｌ　Ｂｌｕｅ＠、高速液体クロマトグラフなど
を用いて精製することが可能である。That is, the appropriate ammonium sulfate saturation level of the culture supernatant is 4.
Precipitation recovery of the antibody protein using 0-60% (preferably 50%) or polyethylene glycol 6000 (12-15% W/v), purification using an ion exchanger, and purification using gel filtration are possible. In addition, DEAE-Af
It is possible to purify using fiGel Blue@, high performance liquid chromatography, etc.

〔発明の効果〕〔Effect of the invention〕

本発明の方法によれば、目的とする特異性を有する■鎖
をコードする遺伝子と任意のＩｇＧサブクラスを決定す
る定常領域をコードする遺伝子とを連結することができ
るから、所望の特異性を有する任意のサブクラスのヒト
型抗体を製造することができる。According to the method of the present invention, it is possible to link the gene encoding the chain having the desired specificity with the gene encoding the constant region that determines any IgG subclass. Humanized antibodies of any subclass can be produced.

生体防御の点からは体内へ抗体を導入する場合には、製
剤的観点及び体内での使用勝手の良い点よりＩｇＧクラ
スの抗体が良いことが一般に知られている。先に述べた
方法で製造された抗体を用い試験管内及び生体を用いて
各サブクラス抗体の比較評価ができる。その結果とＩｇ
Ｇ、抗体が強い感染防御作用を示し、特に、ＴｇＧ、抗
体が顕著な感染防御作用を示すことが明らかとなった。From the viewpoint of biological defense, it is generally known that when introducing antibodies into the body, IgG class antibodies are preferable from the standpoint of formulation and ease of use within the body. Using antibodies produced by the method described above, each subclass antibody can be comparatively evaluated in vitro and in vivo. The results and Ig
It has become clear that TgG and antibodies exhibit a strong infection-protective effect, and in particular, TgG and antibodies exhibit a remarkable infection-protective effect.

分離されたＩｇＧ、サブクラス抗体を感染防御目的に使
用すればより一層の治療効果が期待される。Further therapeutic effects are expected if the isolated IgG and subclass antibodies are used for the purpose of preventing infection.

現在、免疫グロブリン製剤は一般血清より全ｒｇＧ分画
等を回収し作ることが通常で特定のＩｇＧサブクラスを
集めたものはない。そこで−般血清よりＩｇＧ、又はＩ
ｇＧ、サブクラス抗体を濃縮し、臨床目的に使用するこ
とで治療効果を一層あげることができる。一般血清より
ＩｇＧサブクラスＩｇＧい又はＩｇＧ、を濃縮回収する
には抗ヒ）ＩｇＧ＋又はＩｇＧ２抗体を利用したアフィ
ニティークロマトグラフィー等が用いられ、このための
抗ヒトＩｇＧ、又はＩｇＧ、抗体を調製するための抗原
として本発明の抗体を用いることができる。Currently, immunoglobulin preparations are usually made by collecting the entire rgG fraction etc. from general serum, and there are no preparations that collect specific IgG subclasses. Therefore, IgG or I
By concentrating gG and subclass antibodies and using them for clinical purposes, therapeutic effects can be further enhanced. Affinity chromatography using anti-human IgG+ or IgG2 antibodies is used to concentrate and recover IgG subclass IgG or IgG from general serum. The antibody of the present invention can be used as an antigen.

〔実施例〕〔Example〕

次に、実施例により、この発明をさらに具体的に説明す
る。Next, the present invention will be explained in more detail with reference to Examples.

抗緑膿菌ヒト型モノクローナル抗体のＩ、鎖遺伝子を調
製し、これを遺伝子工学的手法によって分泌発現させた
。The I chain gene of an anti-Pseudomonas aeruginosa human monoclonal antibody was prepared and secreted and expressed using genetic engineering techniques.

特開昭６１−９１１３４号公報に開示された方法に従っ
て緑膿菌Ｆ４に対するモノクローナル抗体産生細胞Ｇ３
　１　　（ＩｇＧｚ／に）を得た。Monoclonal antibody-producing cells G3 against Pseudomonas aeruginosa F4 according to the method disclosed in JP-A-61-91134.
1 (IgGz/to) was obtained.

Ｇ３−１細胞１×１０′１個を１０−の緩衝液中（０，
５Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）、１００ｇ／−プロテア
ーゼＫ（ベーリンガーマンハイム社）、０．５％ザルコ
シル５０″Ｃにて３時間処理した後、等量の水飽和フェ
ノールを加えた。ついで遠心（８０００ｘ　ｇ、１０分
間）により水相を分離し、これを５０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（Ｔｒｉｓ−１ｆ（Ｊ！　）（ｐＨ８，０＞　、１
０ｍＭＥＤＴ＾、１０　ｍＭ　ＮａＣ１に対して透析し
た。One G3-1 cell (1 x 10') was placed in a 10-buffer (0,
After treatment for 3 hours with 5M EDTA (pH 8,0), 100g/- Protease K (Boehringer Mannheim), and 0.5% Sarcosyl 50"C, an equal volume of water-saturated phenol was added. Then, centrifugation (8000 x g , for 10 minutes), and this was mixed with 50 mM Tris-HCl buffer (Tris-1f (J!) (pH 8,0>, 1
Dialyzed against 0mM ED T^, 10mM NaCl.

これに加熱処理したりボヌクレアーゼＡ（ベーリンガー
マンハイム社）が終濃度が１００ｇ／−になるように加
え、３７℃で３時間処理したのち、再度上記と同様にフ
ェノール抽出、透析を行って７１２ｕｇ／ａ！の染色体
ＤＮＡ　（Ｇ３−１−ＤＮＡ）を得た。This was heated and bonuclease A (Boehringer Mannheim) was added to the final concentration of 100 g/- and treated at 37°C for 3 hours, followed by phenol extraction and dialysis in the same manner as above. a! Chromosomal DNA (G3-1-DNA) was obtained.

（２）Ｌｔ”ＤＮＡの　１ 上記Ｇ３−１−ＤＮＡ１０ＪＩｔを、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ、又はＢａｍ１ｌ　　Ｉ　　にソポンジーン社）のい
ずれかを用いて３７℃で２時間消化を行った。消化後、
０．８％アガロースゲル電気泳動を行いＤＮＡ断片を分
離した。ついでここで得られたゲルを０．２５Ｎ＋１（
Ｊで１５分間、０．５　Ｎ　　ＮａＯＨ−１，５Ｍ　Ｎ
ａＣｌ３０分間、０．５　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ｔｌｃｊ！　
（ｐＨ７，４）　−１，５ＭＮａＣｌで３０分間処理し
た。ついで２０ＸＳＳＣ（０，３Ｍクエン酸ナトリウム
Ｊ　３　Ｍ　ＮａＣｊ！　）を用い、ニトロセルロース
フィルター（Ｓ＆Ｓ社）へＤＮＡをトランスファーした
。(2) The above G3-1-DNA10JIt of Lt” DNA was digested with the restriction enzyme EcoR.
Digestion was performed at 37° C. for 2 hours using either Bam1l I or Bam1l I (Sopon Gene). After digestion,
DNA fragments were separated by 0.8% agarose gel electrophoresis. Next, the gel obtained here was heated to 0.25N+1 (
J for 15 min in 0.5 N NaOH-1,5M N
aCl 30 min, 0.5 M Tris-tlcj!
(pH 7,4) - Treated with 1,5M NaCl for 30 minutes. The DNA was then transferred to a nitrocellulose filter (S&S) using 20XSSC (0.3M sodium citrate J3M NaCj!).

一方、染色体ＤＮＡ上のヒトに鎖の定常領域（Ｃに）を
コードするコード領域についは、塩基配列および制限酵
素ＥｃｏＲＩで消化した場合、約２．５ｋｂの断片にＣ
にコード領域が含まれていることが知られている（Ｃｅ
１１．２２．１９７−２０７（１９８０））。On the other hand, when the coding region encoding the human chain constant region (C) on chromosomal DNA is digested with the nucleotide sequence and the restriction enzyme EcoRI, a fragment of approximately 2.5 kb is obtained.
is known to contain a coding region (Ce
11.22.197-207 (1980)).

従って、このＣにコード領域を含むＥｃｏＲＩ消化ＤＮ
Ａ断片を得、２．５ｋｂ断片０．５　ｎをプローブとし
て使用するために二ックトランスレーションキフト（Ｂ
ＲＬ社）で３！Ｐ標識化した。Therefore, EcoRI-digested DN containing the coding region in this C
A fragment was obtained and a double translation kit (B
RL company) 3! P-labeled.

そして、これと上記フィルターとのサザンハイプリダイ
ゼーションを行った。このときの結果を第１図に示す。Then, Southern hybridization was performed between this and the above filter. The results at this time are shown in FIG.

同図中、数値は、塩基対の長さを示し、ＥｃｏＲＩおよ
びＢａｍＦＩ　Ｉは、この制限酵素を用いて消化したこ
とを意味する。この結果よりに■Ｉ及びＢａｍＨＩで消
化したＤＮＡ遺伝子については各々、約２．５ｋｂｐお
よび８．５　ｋｂｐにバンドが確認゛できた。なお、Ｖ
Ｊ再構成していない場合の染色体ＤＮＡはＢａｍ）Ｉ　
Ｉ消化によれば約１０ｋｂｐにバンドを与えることが知
られている（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ　Ｃｈｅ＋ｍ１ｓｔｒｙ、２５７．１５１６
−１５２２（１９８２））。In the figure, the numbers indicate the length of base pairs, and EcoRI and BamFI I mean that these restriction enzymes were used for digestion. From this result, bands were confirmed at approximately 2.5 kbp and 8.5 kbp for the DNA genes digested with I and BamHI, respectively. In addition, V
Chromosomal DNA without J rearrangement is Bam) I
It is known that I digestion gives a band at approximately 10 kbp (The Journal of Biolo
gical Che+m1stry, 257.1516
-1522 (1982)).

従って、ＢａｍＨＩ処理により得られた８、　５　ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片は再構成されたＶＪ−コード領域を含む
Ｌ鎖コード領域を含有するＤＮＡ断片であることが確認
された。Therefore, the 8.5 kb obtained by BamHI treatment
The p DNA fragment was confirmed to be a DNA fragment containing the L chain coding region including the rearranged VJ-coding region.

（３）伝　ライブラリーの調＋１ Ｇ３−ＩＤＮＡ２０■をハ熊■で消化したのち、１０−
４０％シ５Ｉ糖密度勾配遠心（日立ＲＰＳ　４０Ｔ３５
ｋｒｐｍ、１４時間）によりサイズ分画を行った。つい
でアガロースゲル電気泳動および。ＤＮＡドットパイプ
リダイゼーションによって目的とするＤＮＡ画分（Ｂａ
ｍＨＩ消化した７〜９ｋｂ断片）を回収した（４〜／ｄ
＞。(3) Den Library key +1 After digesting G3-IDNA20■ with Hakuma■, 10-
40% 5I sugar density gradient centrifugation (Hitachi RPS 40T35
size fractionation was carried out using the following methods: krpm, 14 hours). Then agarose gel electrophoresis and. The desired DNA fraction (Ba
mHI-digested 7-9 kb fragment) was recovered (4-/d
>.

他方、プラスミドｐｔｌｃ１３（ファルマシア社から市
販されている）をＢａｍＨＩで消化し、アルカリ性ホス
ファターゼで処理して線状プラスミドを調製した。On the other hand, plasmid ptlc13 (commercially available from Pharmacia) was digested with BamHI and treated with alkaline phosphatase to prepare a linear plasmid.

次に、これと、上記ＤＮＡ画分との反応をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（宝酒造）を用い、４℃、−晩行い、得られた組
換えＤＮＡを用いて大腸菌に１２Ｃ６００の形質転換を
行ってＧ３−１遺伝子ライブラリー（２Ｘ　１０’ＣＦ
Ｕ／遁ＤＮＡ）を作成した。Next, a reaction between this and the above DNA fraction was carried out at 4°C overnight using T4 DNA ligase (Takara Shuzo), and the obtained recombinant DNA was used to transform E. coli with 12C600 to transform G3-1. Gene library (2X 10'CF
U/ton DNA) was created.

（４）Ｌｔ”ＤＮＡの７！、りＩＪ−、ニー：／グ形質
転換された上記大腸菌５Ｘ１０’個をコロニーハイブリ
ダイゼーション法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎ−ｉ
ｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ）に
従って、前記の３ｚＰ標識化ヒトＣに遺伝子をプローブ
として用いて、Ｌ鎖をコードするＤＮＡ断片が挿入され
たプラスミドを選択し、このプラスミドをｐＧ３１Ｖに
と命名した。(4) 5 x 10' of the above Escherichia coli transformed with Lt'' DNA 7!, RiIJ-, Ni:/G were subjected to colony hybridization method (Molecular C1on-i
ng-A Laboratory Manual), the 3zP-labeled human C gene was used as a probe to select a plasmid into which a DNA fragment encoding the L chain had been inserted, and this plasmid was named pG31V.

（５）制限酵素　　点１図の乍 上記プラスミドｐＧ３１ＶにをＥｃｏＲＩ　、　Ｄａす
■および１１ｉｎｄｌ［Ｉ　にッポンジーン社）で、消
化し、切断パターンの解析を行った。また、可変領域（
ＶＪ）を含む肛ｍｌ■断片（約２．９ｋｂ）をプラスミ
ドｐ［Ｊｃ１３（ファルマシア社）のｆｌｉｎｄｌｆｆ
サイトにクローニングした（以下ここで得られたプラス
ミドはｐＧ３１ＶＫ−＋１２とする）　−ｐＧ３１ＶＫ
−１１２を５ｓｔｌ　、Ｐｓｔｌ又はＮ９！にッポンジ
ーン社）で消化し、制限酵素切断地図を作成した。その
ときの結果を第２図に示す、この図中、ＶＪは可変領域
をコードするコード領域を示し、Ｃには定常領域をコー
ドするコード領域を示す。最上段の数値はＤＮＡ断片の
長さを示す。(5) Restriction enzymes The above-mentioned plasmid pG31V shown in Figure 1 was digested with EcoRI, Dasu and 11indl (Nippon Gene), and the cleavage pattern was analyzed. In addition, the variable region (
The anal ml fragment (approximately 2.9 kb) containing plasmid p [flindlff of Jc13 (Pharmacia)
(The plasmid obtained hereafter will be referred to as pG31VK-+12) -pG31VK
-112 for 5stl, Pstl or N9! Nippon Gene Co., Ltd.) to create a restriction enzyme cleavage map. The results are shown in FIG. 2. In this figure, VJ indicates the code region encoding the variable region, and C indicates the code region encoding the constant region. The number at the top indicates the length of the DNA fragment.

この図から明らかな様に、このＤＮＡ断片は完全なＶＪ
コード領域およびＣにコード領域を含んで成る。As is clear from this figure, this DNA fragment is a complete VJ
A code region and a code region are included in C.

卦Ｌ１已Ｉお引友定 ｐＧ３１Ｖに−Ｈ２をＰｓｔｌで消化して得られる断片
を、プラスミドｐＵｃ１３のＰｓｔ１部位ヘリクローニ
ングした。このリクローニングで得られるプラスミドの
回Ｉおよび肛閃■部位、またｐＧ３１ＶＫ−Ｈ２のΣｃ
ｏ１部位を３２Ｐ標識したのち、マキサム・ギルバート
法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　［ｉｎｚｙｍｏ１ｇｙ＋　
６５４９９−５６０（１９８０）　）により、塩基配列
の決定を行った。The fragment obtained by digesting -H2 with Pstl was helicloned into Pst1 site of plasmid pUc13 into pG31V. The round I and anal flash region of the plasmid obtained by this recloning, and the Σc site of pG31VK-H2.
After 32P labeling of the o1 site, the Maxam-Gilbert method (Methods in [inzymo1gy+
65499-560 (1980)), the base sequence was determined.

塩基配列決定の結果を第３−１図及び第３−２図に示す
。これらの図はＶＪ−コード領域及びその近傍の塩基配
列を示す。この配列は５′非コード領域、リーダー配列
（して示す）、■−コード領域（Ｖで示す）、Ｊ−コー
ド領域（Ｊで示す）、及びそれに続く３′非コ一ドＭ３
Ａを含む。The results of base sequencing are shown in Figures 3-1 and 3-2. These figures show the base sequence of the VJ-coding region and its vicinity. This sequence consists of a 5' non-coding region, a leader sequence (denoted as
Contains A.

塩基配列下段の一文字のアルファベットは、アミノ酸の
略号であって下記を意味する。Each letter of the alphabet at the bottom of the base sequence is an abbreviation for an amino acid and has the following meanings.

Ｎ　：　Ａｓｎ　　　　　Ｓ　：　５ｅｒＤ　：　Ａｓ
ｐ　　　　　Ｅ　：　ＧｌｕＣ：Ｃｙｓ　　　　　Ｐ：
Ｐｒ。N: Asn S: 5erD: As
pE: GluC:CysP:
Pr.

Ｌ：Ｌｅｕ　　　　　　　　Ｈ：ＨｉｓＧ　：　Ｇｌｙ
　　　　　Ｙ　：　ＴｙｒＶ　：　Ｖａｌ　　　　　Ｍ
　：　Ｍｅｔｌ：Ｉｌｅ　　　　　　Ａ：Ａｌａ Ｋ：Ｌｙｓ　　　　　　Ｑ：Ｇｌｎ Ｒ：Ａｒｇ　　　　　Ｗ：Ｔｒｐ Ｆ：Ｐｈｅ また、アミノ酸配列中、二重下線を付された部分は、抗
原の結合に必要とされる領域である。L:Leu H:HisG: Gly
Y: TyrV: Val M
: Metl:Ile A:Ala K:Lys Q:Gln R:Arg W:Trp F:Phe The double underlined portion in the amino acid sequence is a region required for antigen binding.

ヒト免疫グロブリンに鎖のＶｗ４域は、大きく４つのサ
ブグループに分類されている〔たとえば、日本生化学全
編、生化学データブックＩ［ｐＩ０２２　］　。The Vw4 region of the human immunoglobulin chain is broadly classified into four subgroups [for example, Nippon Biochemical Complete Edition, Biochemical Data Book I [pI022].

そして、本発明により決定された領域は、サブグループ
■に属することが示唆される。なお、塩基配列第３図に
おいて上に示した塩基隘で、８２１位のＳｅｒは、本来
のサブグループ■ではＰｈｅであること以外は全てサブ
グループ■と同一である。そして塩基配列の下のアルフ
ァベット中口で囲んでいるものは、サブグループｍに特
徴的なアミノ酸である。It is suggested that the region determined according to the present invention belongs to subgroup (2). In addition, in the base sequence shown above in FIG. 3, Ser at position 821 is the same as in the original subgroup (■) except that it is Phe. The amino acids that are enclosed in the middle part of the alphabet below the base sequence are amino acids that are characteristic of subgroup m.

ＳＶ　２−ｎｅｏ　（Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅ
ｔ、　、上、３２７　（１９８２）：ボールバーブ氏よ
り入手〕をＢａｍＨＩで消化した断片と、ｐＧ３１ＶＫ
をＢａｍ１ｌ　Ｉで消化した断片とを常法に従って連結
し、Ｌ鎖遺伝子を含むプラスミドｐＧ３１ＶＫ　　ｎｅ
ｏのを得た。してこのプラスミドについてＬ鎖遺伝子が
入っていることを確認した。このプラスミドを含有する
大腸菌ニジエリシャ・コリ　　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　　ｃｏｌｉ）Ｋ１２Ｃ６００／ｐＧ３１ＶＫ−ｇｐ
ｔは工業技術院微生物工業技術研究所に徽工研菌寄第８
９０５号（Ｆｌ！ＲＭＰ−８９０５）として寄託されて
いる。SV 2-neo (J, Mo1. Appl, Gene
t, , top, 327 (1982): obtained from Mr. Ballbarb] and a fragment digested with BamHI, and pG31VK.
was ligated with the fragment digested with Bam1l I according to a conventional method to create a plasmid pG31VK ne containing the L chain gene.
I got o's. It was confirmed that this plasmid contained the L chain gene. Escherichia coli containing this plasmid
a coli) K12C600/pG31VK-gp
T is the Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology,
No. 905 (Fl!RMP-8905).

上記プラスミドｐＧ３１ＶＫ−ｎｅｏのＤＮＡ２０ｎを
エタノール沈澱後、１　ｍＭＴｒｉｓ　、　０．１　ｍ
ＭＥＤＴＡ　１００ｄに溶解した。これに５００　ｍ　
Ｍ　ＣａＣｌ　ｚ　　１００　ｕｌを添加し、８０　ｍ
Ｍ　ＣａＣ１，５０ｍＭＨ［１ＰＥｓ　　、　１．５ｍ
　Ｍ　　ＮａｚＨＰＯｎ（ｐＨ７，０５）を含む液２０
０Ｉを撹拌しながら２分間かけて滴下した。その後３７
℃５分間静置し、ＤＮＡ−Ｃａ−リン酸の微細沈澱を形
成した。一方、宿主としてＰ、ＩＪＩ細胞（２ＸｌＯ’
個）をＲＰＭｒ−１６４０培地で洗浄した後ベレットと
し、これに上記微細沈澱液を添加しゆっ（り撹拌した。After ethanol precipitation of the DNA 20n of the above plasmid pG31VK-neo, 1 mM Tris, 0.1 m
Dissolved in MEDTA 100d. 500 m to this
Add 100 ul of M CaCl z and 80 m
M CaCl, 50mMH [1PEs, 1.5m
Liquid 20 containing M NazHPOn (pH 7,05)
0I was added dropwise over 2 minutes with stirring. Then 37
C. for 5 minutes to form a fine precipitate of DNA-Ca-phosphoric acid. On the other hand, P and IJI cells (2XlO'
After washing the pellet with RPMr-1640 medium, the pellet was made into a pellet, and the above-mentioned fine precipitate was added thereto and gently stirred.

３７℃、１０分間静置した後ｌＯ％生胎児血清を含む完
全培地２０−を添加し、９６ウ工ルプレート２枚にまき
、２日間インキュベートした。次いでこれにＧｅｎｅｔ
ｉｃｉｎＱ　Ｇ４１Ｂを８００Ｊｔｇ／ｍＺになるよう
に各ウェルに添加し選択した。約３週間後に良好に増殖
する形質転換細胞を得た（第１表）。After standing at 37°C for 10 minutes, complete medium 20-ml containing 10% live fetal serum was added, plated on two 96-well plates, and incubated for 2 days. Then add Genet to this
IcinQ G41B was added to each well at 800 Jtg/mZ for selection. After about 3 weeks, transformed cells that proliferated well were obtained (Table 1).

ｐＧ３１ＶＫ−ｎｅｏのＤＮＡ２０ｆｆを、２−１　、
　　（Ｐ３ｔｌｌを宿主とした場合）と同様の操作で５
Ｐ２１０−Ａ　ｇ１４細胞（Ｉ　Ｘ　１０’個）に対し
て導入する操作を行なった。ＧｅｎｅｔｉｃｉｎＱ　Ｇ
４１Ｂを５００ｕ／ａ！になるように添加して選択し、
約２−３週間後に形質転換細胞を得た（第２表）。pG31VK-neo DNA20ff, 2-1,
(When P3tll is used as host)
An operation was performed to introduce the cells into P210-A g14 cells (I x 10' cells). Geneticin Q G
41B at 500u/a! Add and select so that
Transformed cells were obtained after about 2-3 weeks (Table 2).

Ｕ　　云　　　の値号沁 Ｌｔｄ（に型）についてＥＬＩＳ＾の方法を用いて確認
した。すなわち、ポリスチレン製ＮＩＩＮＣ社イムノプ
レート０の各−ウェルに５００倍希釈したヤギ抗ヒトに
（カッパー）鎖抗体を固相化し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで
洗浄後これに、に鎖に含むサンプル５０ｍを添加反応さ
せた。２時間後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、Ｈ
ＰＯ結合抗ヒトに鎖抗体（ＴＡＧＯ社）　Ｘ５０００倍
希釈液と反応させた。２時間後、ＰＢＳ−Ｔｓｍｅｅｎ
で洗浄後、ＡＢＴＳ基質液（０，１Ｍクエン酸緩衝液（
ｐ１１４．２）　、ＡＢＴＳ　（２，５ｍＭ）　、Ｈ，
（ｈ　（５ｍＭ）　）１００　ｄを各ウェルに添加し、
５−１５分間室温で反応させた。　２ｍＩ（ＮａＮ３で
反応停止した後、タイターチック・マルチスキャンＯ（
フロー社）により００．。Ｓｏを測定してに鎖の測定と
した。得られた形質転換細胞のうち、増殖性のよいもの
を選別し、培養上清中のし鎖に型の分泌量を上記方法よ
り算出した。それを第１表および第２表に示す。The value of U Yun was confirmed using the ELIS^ method. That is, a 500-fold diluted goat anti-human (kappa) chain antibody was immobilized on each well of a polystyrene NIINC immunoplate 0, and after washing with PBS-Tween, 50 m of a sample containing the chain was added for reaction. I let it happen. After 2 hours, after washing with PBS-Tween, H
The PO-conjugated anti-human was reacted with a 5000-fold dilution of chain antibody (TAGO). 2 hours later, PBS-Tsmeen
After washing with ABTS substrate solution (0.1M citrate buffer (
p114.2), ABTS (2,5mM), H,
Add 100 d (h (5mM)) to each well;
The reaction was allowed to proceed for 5-15 minutes at room temperature. After stopping the reaction with 2 mI (NaN3, titertic multiscan O (
00. . The chain was measured by measuring So. Among the obtained transformed cells, those with good proliferative properties were selected, and the amount of secreted cells in the culture supernatant was calculated using the method described above. It is shown in Tables 1 and 2.

表中の産生量（ｇ／ｍｊ）はＢｅｎｃｅ−Ｊｏｎｅｓ　
ｇ蛋白を標準物質として算出したものである。Production amounts (g/mj) in the table are Bence-Jones
Calculated using g protein as a standard substance.

星−上一表 ｐＧ３１ＶＫ−ｎｅｏによる形質転換細胞この２６−１
０３について、細胞濃度５Ｘ１０’ｃｅｌｌｓ／、Ｊ、
２４時間培養の条件で再測定した結果３５■／−のに鎖
の分泌が認められた。Star - Table 1 Transformed cells with pG31VK-neo 26-1
For 03, cell concentration 5X10'cells/, J,
As a result of re-measurement under 24-hour culture conditions, secretion of chains was observed at 35 μ/-.

第一１−表 細胞濃度Ｉ　Ｘ　１０　’ｃｅｌｌｓ／ａｔ、２４時間
培養の条件でのに産生量 特開昭６１−９１１３４号公報に開示された方法に従っ
て緑膿菌Ｆ４に対するモノクローナル抗体産生細胞Ｇ３
　１　　（ＩｇＧｇ／に）を得た。11 - Surface cell concentration I x 10' cells/at, production amount under 24 hour culture conditions Monoclonal antibody producing cells G3 against Pseudomonas aeruginosa F4 according to the method disclosed in JP-A-61-91134.
1 (IgGg/to) was obtained.

Ｇ３−１細胞２．５ＸＩＯ’個を１０−の緩衝液中（０
，５Ｍ　　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）、１００ｇ／−プ
ロテアーゼＫ（ベーリンガーマンハイム社）、０．５％
サルコシル５０℃にて３時間処理した後、等量の水飽和
フェノールを加えた。ついで遠心（８０００ｘｇ、１０
分間）により水相を分離し、これを５０ｍＭトリス塩酸
緩衝液（Ｔｒｉｓ　−ｌＩＣ１’　）　（ｐＨ８，Ｏ）
、１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ、１０　ｍＭ　ＮａＣ１に対し
て透析した。これに加熱処理したりポヌクレアーゼＡ（
ヘーリンガーマンハイム社）を終濃度が１１００Ｉ１／
ｒｒｉになるように加え、３７℃で３時間処理したのち
、再度上記と同様にフェノール抽出、透析を行って２、
１■の染色体ＤＮＡ　（Ｇ３−　Ｉ　ＤＮＡ）を得た。2.5XIO' G3-1 cells were cultured in 10-
, 5M EDTA (pH 8.0), 100g/-Protease K (Boehringer Mannheim), 0.5%
After treatment with Sarkosyl at 50° C. for 3 hours, an equal volume of water-saturated phenol was added. Then centrifuge (8000xg, 10
The aqueous phase was separated by 50 mM Tris-HCl buffer (Tris-lIC1') (pH 8,0).
, 10mM EDTA, 10mM NaCl. This can be heated or treated with ponuclease A (
Heringer Mannheim) to a final concentration of 1100I1/
After processing at 37°C for 3 hours, phenol extraction and dialysis were performed again in the same manner as above.
1 chromosomal DNA (G3-I DNA) was obtained.

（）Ｈ”ＤＮＡの　１ 上記Ｇ３−ＩＤＮＡｌｏｕｇを、制限酵素ＥｃｏＲＩ（
タカラ酒造）又はＢａｎ＋Ｆ１１　　にッポンジーン社
）又は旧ｎｄｌ［［にッポンジーン社）を用いて３７℃
で５時間消化を行った。消化後、０．６％アガロースゲ
ル電気泳動を行いＤＮＡ断片を分離した。ついでここで
得られたゲル０．２５Ｎ　　ＨＣｌで１５分間、０、５
　Ｍ　　ＮａＯＨ１，５Ｍ　Ｎａ（Ｊ！で３θ分間、０
．５ＭＴｒｉｓ−１１ｃｆ　（ｐＨ７、４）　　１．５
　Ｍ　ＮａＣｊ！で３０分間処理した。ついで２０ＸＳ
ＳＣ（０，３Ｍクエン酸ナトリウム、３　Ｍ　Ｎａ（Ｊ
’　）を用い、ニトロセルロースフィルター（ＳＡＳ社
）へＤＮＡをトランスファーした。1 of the ()H” DNA.
Takara Sake Brewery) or Ban+F11 Nippon Gene Co.) or old ndl [[Nippon Gene Co., Ltd.] at 37°C.
Digestion was performed for 5 hours. After digestion, 0.6% agarose gel electrophoresis was performed to separate DNA fragments. The gel obtained here was then incubated with 0.25N HCl for 15 minutes at 0,5
M NaOH1,5M Na (3θ min at J!, 0
．． 5MTris-11cf (pH7, 4) 1.5
M NaCj! for 30 minutes. Then 20XS
SC (0,3M sodium citrate, 3M Na(J
), DNA was transferred to a nitrocellulose filter (SAS).

プローブを調製するため、微工研菌寄第８９０６号（Ｆ
ＥＲＭ　Ｐ−８９０６）として工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託されている大腸菌からプラスミドを調製
し、このプラスミド中Ｃ６Ｕ域をコードするＤＮＡのＰ
ｖｕＩＩ　−Ｓｍａ　Ｉ断片をニックトランスレーショ
ンキット（ＢＲＬ社）により３ｔＰ−標識した。このプ
ローブと上記フィルターとのサザンハイプリダイゼーシ
ョンを行った。このときの結果を第５図に示す。同図中
、数値は塩基対の長さを示し、ＥｃｏＲＩ−、旧ｎｄｌ
ｌｌは、これらの制限酵素を用いてＧ３−１のＤＮＡを
消化したことを意味する。In order to prepare the probe,
A plasmid was prepared from E. coli deposited with the Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology as ERM P-8906), and the P of the DNA encoding the C6U region in this plasmid was
The vuII-SmaI fragment was 3tP-labeled using a nick translation kit (BRL). Southern hybridization was performed between this probe and the above filter. The results at this time are shown in FIG. In the figure, the numbers indicate the length of base pairs, EcoRI-, old ndl
ll means that the G3-1 DNA was digested using these restriction enzymes.

この結果よりＥＣＯＲＩ及び旧ｎｄＩ［ｌで消化したＤ
ＮＡ遺伝子については各々１８．５ｋｂρ　、６．２ｋ
ｂｐの位置にバンドが確認された。This result shows that D digested with ECORI and old ndI[l]
18.5kbρ and 6.2k for the NA gene, respectively.
A band was confirmed at the bp position.

（３）゛　　云　ライブラリー Ｇ　３−　Ｉ　ＤＮＡ　１００ｇをＥｃｏＲＩで消化し
たのち、０．６％アガロースゲル電気泳動によりサイズ
分画を行った。２０ｋｂｐ付近のゲルを切り出しＤＮＡ
を回収した（１２ｊ１ｇ）、他方、ＥＭＢＬ４　（フナ
コシ社、ＥＭＢＬ　４キツト）をＢａｍＨＩ　、　Ｂｃ
ｏＲＩで消化し常法に従ってスタッファ一部分を除いた
。(3) After digesting 100 g of Library G3-I DNA with EcoRI, size fractionation was performed by 0.6% agarose gel electrophoresis. Cut out the gel around 20kbp and DNA
was collected (12j1 g), and on the other hand, EMBL4 (Funakoshi Co., Ltd., EMBL 4 kit) was mixed with BamHI, Bc
It was digested with oRI and a portion of the stuffer was removed according to a conventional method.

次に、これと、上記ＤＮＡ画分との反応をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（宝酒造）を用い、４℃、−晩行い得られた組換
えＤＮＡを用いて、ファージコートタンパク中にパフケ
ージングした（ＰｒｏｍｅｇａＬｏｔｅｃ社製キットを
使用）。Next, this was reacted with the above DNA fraction using T4 DNA ligase (Takara Shuzo) at 4°C overnight, and the resulting recombinant DNA was puff-cased into phage coat protein (Promega Lotec). kit).

この結果２．６　Ｘ　１０　’ｐｆｕ／　ｇＵＭＢＬ　
４　Ｄ　Ｎ　Ａのライブラリーを得た。This results in 2.6 x 10' pfu/gUMBL
A library of 4 DNA was obtained.

（４）Ｈｌ”ＤＮＡのスクリーニング パフケージングされた組換ファージを用い、プラークハ
イブリダイゲイジョン法〔底置ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ１
ｏｎｉｎｇ　％　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎ
ｕａｌ）に従って前記（７）”ＰＦＩＩ！Ｉｉ化ｃ　３
−　ｔ、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片ラフ”０−７’として用い
て、Ｈ鎖をコードするＤＮＡ断片が挿入されたファージ
を選択し、このファージを＃３８３と命名した。(4) Screening of Hl'' DNA using the puff-caged recombinant phage and plaque hybridization method [bottom-mounted Molecular C1
oning % A Laboratory Mann
According to the above (7) “PFII! Ii c 3
-t, c DNA fragment rough "0-7' was used to select a phage into which a DNA fragment encoding the H chain was inserted, and this phage was named #383.

Ｂ、　　　　　＋　　　占１　″のイ 上記のファージ＃３８３を制限酵素ＥｃｏＲ１゜Ｂａｍ
ＨＩ　、および旧ｎｄｎ！にッポンジーン社）で消化し
、切断パターンの解析を行った。また、可変領域（ＶＤ
Ｊ）を含むＥｃｏＲｌ−Ｈ１ｎｄｌｌＩ断片（約４．８
ｋｂ）をプラスミドｐＵｃ１３（ファルマシア社）のＥ
ｃｏＲＩ　、　ＨｉｎｄｌＩ［サイトへクローニングし
た（以下ここで得られたプラスミドはｐＧＶｌとする）
。ｐＧＶｌを制限酵素Ｄｒａｌ　、　Ｐｓｔｌ　　（ベ
ーリンガーマンハイム社）、Ｘｈｏｌ（タカラ酒造）、
Ｓｍａｌにソボンジーン社）で消化し、制限酵素切断点
地図を作成した。その結果を第６図に示す。この図中、
ＶＤＪは可変領域をコードするコード領域を示し、Ｃ１
０は定常領域をコードするコード領域を示す。B. + Bam1'' A above phage #383 was digested with restriction enzyme EcoR1゜Bam.
HI, and old ndn! Nippon Gene Co.) was used to analyze the cleavage pattern. In addition, the variable region (VD
EcoRl-H1ndllI fragment (approximately 4.8
kb) of plasmid pUc13 (Pharmacia)
coRI, HindlI [cloned into the site (the plasmid obtained hereafter will be referred to as pGVl)
. pGVl was used with restriction enzymes Dral, Pstl (Boehringer Mannheim), Xhol (Takara Shuzo),
Smal and Sobon Gene) to create a restriction enzyme breakpoint map. The results are shown in FIG. In this figure,
VDJ indicates a code region encoding a variable region, and C1
0 indicates a code region encoding a constant region.

最上段の数値はＤＮＡ断片な長さを示す、また、実施例
１と同様にして、Ｇ　３−　Ｉ　Ｈ鎖をコードするＤＮ
Ａを含むＤＮＡ断片の構造及び一部の塩基配列を第７図
に示す。The number on the top row indicates the length of the DNA fragment. Also, in the same manner as in Example 1, the DNA encoding the G3-I H chain was
The structure and partial base sequence of the DNA fragment containing A are shown in FIG.

これらの図から明らかな様に、このＤＮＡ断片は完全な
ＶＤＪコード領域及びＣγ８コード領域を含んで成る。As is clear from these figures, this DNA fragment comprises the complete VDJ and Cγ8 coding regions.

高欄等の方法（Ｃｅ１１　、２９　、６７１−６７９（
１９８２）　）によりヒト染色体よりヒト抗体γ１．γ
２及びＴ。The method of Takaran et al. (Ce11, 29, 671-679 (
Human antibody γ1. γ
2 and T.

遺伝子を得た。これらの遺伝予約１ｎを更に制限酵素旧
ｎｄｌ［Ｉ及びＢａｍＨＩを用いて切断し、これをベク
ターｐＵｃ１３の同制限酵素切断点へ挿入しそれぞれＣ
ＴＩ含有プラスミドｐＧ１０１　　、　Ｃｒ　２含有プ
ラスミドｐＧ１０２及びＣγ３含有プラスミドｐＧ１０
３を作成した。これらプラスミドは常法通り制限酵素Ｓ
ｍａ　Ｔ　、　Ｂｇｌ　ＩＩ　、　１ｌｉｎｄｌ１１等
を用いてその構造の正しい事を確認した。I got the gene. These genetic reservations 1n were further cut using the restriction enzymes old ndl[I and BamHI, and inserted into the same restriction enzyme cutting points of the vector pUc13, respectively.
TI-containing plasmid pG101, Cr2-containing plasmid pG102 and Cγ3-containing plasmid pG10
3 was created. These plasmids were prepared with restriction enzyme S as usual.
The correctness of the structure was confirmed using ma T , Bgl II, 1lindl11, etc.

次に、先に得ているプラスミドｐＧＶＩ（Ｇ３−ＬＨ鎖
遺伝子を含むプラスミド）を制限酵素旧ｎｄ■及びＥｃ
ｏＲＩで切断し０．８アガロースゲル電気泳動によりＶ
　Ｄ　Ｊ　領域を含むＤＮＡフラグメント３題を回収し
た。一方、先に述べたプラスミドｐＧ１０１゜ｐＧ１０
２及びｐＧ１０３よりそれぞれ制限酵素旧ｎｄＤＩ及び
ＢａｍＨＴで切断し０．８％アガロースゲル電気泳動に
よりＣｒｔ　　、Ｃｒ２及びＣｒ、を含むＤＮＡをそれ
ぞれ３題ずつ回収した。次に、発現用ベクターｐＳＶ２
−ｇｐｔ　（ボールバーブ氏より供与された）を制限酵
素ＥｃｏＲＴ及びＢａｍＨＩで切断したものに、先（７
）ｐＧＶｌ由来ＶＤＪ　［ｌＮＡ及びｐＧ１０１山来Ｃ
ｒ　＋あるいは、ｐＧ１０２由来Ｃｒ　ｚ　、あルイは
ｐＧ１０３由来Ｃｙ＝ＤＮＡを重量比で２：ｌ：２に成
る様にそれぞれ合せ、Ｔ４ライゲースを用いて常法通り
反応を行いＨ鎖発現プラスミドｐＧ３１０１−ｇｐｔ　
、　ｐＧ３１０２−ｇｐｔ及びｐＧ３１０３−　ｇｐ　
ｔを得た。ここで得られたρＧ３１Ｇ３１０ｌ−はＶ　
Ｄ　Ｊ　領域ＤＮＡとＣｒ　を遺伝子を含有し、ｐＧ３
１０２−ｇ＋）ｔはＶＤＪ領域Ｄ　Ｎ　Ａ　ｈ　Ｃｒ　
！遺伝子を含有し、そしてｐＧ３１０３−ｇｐｔはＶ　
Ｄ　Ｊ　ＳＩ域ＤＮＡとＣｒ３遺伝子を含有しているこ
とを制限酵素Ｓｍａ１．旧ｎｄｌｌ［、ＢｃｏＲＩ　、
及びＢａｍＨＩを用いて確認した（第８図、第９図、第
１Ｏ図）。Next, the previously obtained plasmid pGVI (plasmid containing the G3-LH chain gene) was used with restriction enzymes old nd■ and Ec
V by cutting with oRI and electrophoresing on a 0.8 agarose gel.
Three DNA fragments containing the DJ region were recovered. On the other hand, the previously mentioned plasmid pG101゜pG10
2 and pG103 were each digested with the restriction enzymes old ndDI and BamHT, and three DNAs each containing Crt, Cr2, and Cr were recovered by 0.8% agarose gel electrophoresis. Next, the expression vector pSV2
-gpt (donated by Mr. Ballbarb) was digested with the restriction enzymes EcoRT and BamHI, and the
) pGVl-derived VDJ [lNA and pG101 Yamaki C
r + or Cr z derived from pG102 and Cy = DNA derived from pG103 were combined at a weight ratio of 2:l:2, and a reaction was performed in a conventional manner using T4 ligase to create the H chain expression plasmid pG3101- gpt
, pG3102-gpt and pG3103-gp
I got t. The ρG31G310l- obtained here is V
Contains D J region DNA and Cr gene, pG3
102-g+)t is VDJ area D N A h Cr
! contains the gene and pG3103-gpt is V
The restriction enzyme Sma1. Old ndll [, BcoRI,
and BamHI (Fig. 8, Fig. 9, Fig. 1O).

ＸＭＪＭＡエ　−緑啼　サフリラス゛　ヒト　　　の型
造 ２０ＲのｐＧ３１０１−ｇｐｔ　、　ｐＧ３１０２−ｇ
ｐｔあるいはｐＧ３１０３−ｇｐｔをそれぞれ２６−１
０３（１，５ｘ　１０　’個）に導入した。２日後に、
ミコフェノール酸を１Ｏｎ／ｄ、キサンチンを２５０ｘ
／−になる様に添加して選択した。約２週間後に形質転
換細胞を得た。XMJMA E-Green Sapphire human model 20R pG3101-gpt, pG3102-g
pt or pG3103-gpt at 26-1, respectively.
03 (1.5 x 10' pieces). Two days later,
Mycophenolic acid 1On/d, xanthine 250x
/-. Transformed cells were obtained about 2 weeks later.

（第３表） 同様に、２０遁のｐＧ３１０１−ｇｐｔ　、　ｐＧ３１
０２−ｇｐｔあるいは、ｐＧ３１０３−ｇｐｔをそれぞ
れＧ３ＬＳＰ−５（８，５Ｘ　Ｉ　Ｏ”個）に導入した
。２日後に、ミコフェノール酸を３５ｘ／ｍＺ、キサン
チンを２５０ｘ／−になる様に添加して選択した。約２
週間後に形質転換細胞を得た（第４表）。(Table 3) Similarly, 20ton pG3101-gpt, pG31
02-gpt or pG3103-gpt were each introduced into G3LSP-5 (8,5X I O'' cells). Two days later, mycophenolic acid was added at 35x/mZ and xanthine at 250x/-. Selected. Approximately 2
Transformed cells were obtained after a week (Table 4).

プラスミドｐＧ３１０１−ｇｐｔを含有する大腸菌ニジ
エリシャ・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
）（ｐＧ３１０１−ｐｇｔ）は微工研菌寄第９２８９号
（ＦＥＲＭ　Ｐ−９２８９）として、そしてプラスミド
ｐＧ３１０３−ｇｐｔを含有する大腸菌ニジエリシャ・
コリ　（ＩＩ！５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）（ｐ
Ｇ３１０３−ｐｇ　ｔ）は微工研菌寄第９２８８号（Ｆ
ＥＲＭ　Ｐ−９２８８）として、工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託されている。Escherichia coli containing plasmid pG3101-gpt
) (pG3101-pgt) as FERM P-9289 and E. coli N. Elisha containing plasmid pG3103-gpt.
Cori (II!5 cherichia colt) (p
G3103-pg t) is a microtechnical laboratory No. 9288 (F
ERM P-9288) and has been deposited with the Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology.

Ｂ、　　　　ヒト　　　　の 緑膿菌フィッシャーの血清型４（Ｆ４）に対する抗体の
反応性をＥＬＩＳＡの方法を用いて確認した。B. The reactivity of antibodies against human Pseudomonas aeruginosa Fisher serotype 4 (F4) was confirmed using the ELISA method.

抗緑膿菌抗体の検出法については、特開昭６１−９１１
３４号公報に記載の方法によった。Regarding the detection method of anti-Pseudomonas aeruginosa antibodies, please refer to JP-A-61-911.
The method described in Publication No. 34 was used.

ポリスチレン製ＮＵＮＣ社イムノプレート０の各ウェル
にボリーレーリジン（１０■／−）をコートし、洗浄後
ホルムアルデヒド処理したＦ４型菌液（５Ｘ１０’個／
＋ｎＺ）５０＃を添加し３５００回転、１５分間遠心し
てウェル表面に菌体を集めた。これに、グルタルアルデ
ヒド（０，５％）５０Ｉをさらに添加し室温で１５分間
反応させた後、洗浄した。このウェルを１％ＢＳＡ、１
００ｍＭグリシンを含むＰＢＳ　（−）でブロックして
抗緑膿菌抗体検出用プレートとした。Each well of a polystyrene NUNC immunoplate 0 was coated with voryleyridine (10/-), washed, and treated with formaldehyde to form an F4 type bacterial solution (5 x 10//-).
+nZ) 50# was added and centrifuged at 3500 rpm for 15 minutes to collect bacterial cells on the well surface. To this, 50 I of glutaraldehyde (0.5%) was further added, reacted at room temperature for 15 minutes, and then washed. This well was mixed with 1% BSA, 1
The plate was blocked with PBS (-) containing 00 mM glycine to prepare an anti-Pseudomonas aeruginosa antibody detection plate.

このプレートの各ウェルに抗緑膿菌抗体を含むサンプル
を５０１１１添加し、２時間反応させた０次いで、プレ
ートをＰＢＳ　−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、ＨＰＯ
結合抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ社）　５０００倍希釈
液５０ｔｔｌあるいはこの代りに抗ヒトＩｇＧ、抗体、
抗ヒ目ｇＧｔ抗体、抗ヒ目ｇｃ３抗体（ｂｉｏ−ｙｅｄ
ａ社）次いでＨＰＯ結合抗マウス抗体（ＫＰＬ社）５０
Ｉを入れて反応させた。２時間後、ＰＢＳ　−Ｔｗｅｅ
ｎで５回洗浄後、ＡＢＴＳ基質液１００μｌを各ウェル
に添加し、５−１５分間室温で反応させた。’ｌ　ｍ　
Ｍ　ＮａＮ＋で反応停止した後タイターチック・マルチ
スキャン０　（フロー社）によりＯＤ、。５７．を測定
した。A sample containing an anti-Pseudomonas aeruginosa antibody was added to each well of this plate and reacted for 2 hours.Then, the plate was washed three times with PBS-Tween, and then HPO
Conjugated anti-human IgG antibody (TAGO) 50 ttl of 5000-fold dilution or alternatively anti-human IgG, antibody,
Anti-lemon gGt antibody, anti-lemon gc3 antibody (bio-yed
Company a) Then HPO-conjugated anti-mouse antibody (KPL Company) 50
I was added and reacted. 2 hours later, PBS-Twee
After washing with n for 5 times, 100 μl of ABTS substrate solution was added to each well and reacted for 5-15 minutes at room temperature. 'l m
After stopping the reaction with M NaN+, OD was performed using Titertic Multiscan 0 (Flow Co., Ltd.). 57. was measured.

各形質転換細胞の培養上清について、上記ＥＬＩＳＡを
用いて抗緑膿菌ヒト型ＩｇＧの検出を行なった。Anti-Pseudomonas aeruginosa human IgG was detected in the culture supernatant of each transformed cell using the above ELISA.

その内のいくつかを第３表及び第４表に示す。表中の測
定値は４０５れ−におけるＯＤ値である。この測定に於
て、対照値はすべて０．０３〜０．１７の範囲であった
。従って形質転換細胞の培養上清では、０．２４〜０．
８５　（第１表）、０．５２〜＞２．００　（第１表）
とＦ４型録膿菌に対するサブクラスの異るヒト型抗体が
検出され、抗緑膿菌ヒト型抗体を分泌生産する方法が確
立された。Some of them are shown in Tables 3 and 4. The measured values in the table are the OD values at level 405. In this measurement, all control values ranged from 0.03 to 0.17. Therefore, in the culture supernatant of transformed cells, 0.24 to 0.
85 (Table 1), 0.52~>2.00 (Table 1)
Human antibodies of different subclasses against P. aeruginosa and type F4 P. aeruginosa were detected, and a method for secretory production of anti-P. aeruginosa human antibodies was established.

第−主一表 ｐＧ３１０１−ｇｐｔ　、　ｐＧ３１０２−ｇｐｔ及び
ｐＧ３１０３−ｇｐＬによる形質転換細胞（宿主２６−
１０３）部−」し−表 ｐＧ３１０１−ｇｐｔ　、　ｐＧ３１０２−ｇｐｔ及び
ｐＧ３１０３−ｇｐｔによる形質転換細胞（宿主Ｇ３Ｌ
ＳＰ−５）産生されているＩ　ｇ　Ｇ　（ＩｇＧ、　、
　Ｉｇｈ　、　ＩｇＧ３）についてＩ！ＬＩＳＡの方法
を用いて測定した。すなわち、ポリスチレン製ＮＵＮＣ
社イムノプレート０の各ウェルに５００倍希釈したヤギ
抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ社）を固相化し、ＰＢＳ−
Ｔｗｅｅｎで洗浄後、これにＧ３１０１−Ｆ　　、Ｇ３
１０２−Ｂ及びＧ３１０３−８の培養上清５０ｐｌを添
加反応させた。一方、検量線作成の為同プレートに培養
上清の代りに標準ヒトＩｇＧ＋　、　ｔｇに、もしくは
１ｇｃ、　（各５ＥＲＯＴｆｉＣ社）を１ｎ／−より順
次希釈したちの５０Ｊ１１を添加反応させた。２時間後
、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、ＨＰＯ結合抗ヒト
ＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ社）の２５００倍希釈液と反応さ
せた。Main Table 1 Transformed cells with pG3101-gpt, pG3102-gpt and pG3103-gpL (host 26-gpt)
103) Section - Table 1. Transformed cells with pG3101-gpt, pG3102-gpt and pG3103-gpt (host G3L
SP-5) Produced IgG (IgG, ,
About Igh, IgG3) I! It was measured using the LISA method. That is, polystyrene NUNC
A 500-fold diluted goat anti-human IgG antibody (TAGO) was immobilized on each well of a PBS-
After washing with Tween, add G3101-F and G3 to this.
50 pl of culture supernatants of 102-B and G3103-8 were added and reacted. On the other hand, to prepare a standard curve, standard human IgG+, tg, or 50J11 (each from 5EROTfiC) diluted sequentially from 1n/- was added to the same plate instead of the culture supernatant and reacted. After 2 hours, the plate was washed with PBS-Tween, and then reacted with a 2500-fold dilution of HPO-conjugated anti-human IgG antibody (TAGO).

２時間後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄後、ＡＢＴＳ基質
液（０，１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，２）、＾ＢＴＳ
（２，５ｍＭ）　、Ｈｚ（ｈ　（５ｍＭ）　）　　１０
０ａ７を各ウェルに添加し、５〜１５分間室温で反応さ
せた。２ｍＭＮａ）Ｊ＋で反応停止した後、５ＬＴ２１
０　（ＳＬＴ−ＬＡＢＩＮＳＴＲＬＩＭＥＮＴＳ社）に
よりＯＤ、。２、を測定してＩｇＧ、　、　ＩｇＧｔ及
びＩｇＧ、の算出をした。それを第５表に示す。After 2 hours, after washing with PBS-Tween, ABTS substrate solution (0.1M citrate buffer (pH 4.2), ^BTS
(2,5mM) , Hz (h (5mM) ) 10
0a7 was added to each well and allowed to react for 5-15 minutes at room temperature. After stopping the reaction with 2mM Na) J+, 5LT21
OD by 0 (SLT-LABINSTR LIMENTS). 2 was measured and IgG, IgGt, and IgG were calculated. It is shown in Table 5.

蚤−ニー表 各サブクラス形質転換細胞の抗体産生量同様にして、Ｇ
３１０１Ａ６　　、　Ｇ３１０２Ｄ２　、及びＧ３１０
３ＦＢの抗体産生量を測定した。（第６表） Ｇ３１０１Ａ６　、　Ｇ３１０２Ｄ２　、及びＧ３１０
３Ｆ８を培養して得られた上清から各々の抗体を４５％
飽和硫酸アンモニウム沈殿によって回収し、これらの抗
体の緑膿菌Ｆ４に対する抗菌活性を比較した。G
3101A6, G3102D2, and G310
The amount of antibody produced by 3FB was measured. (Table 6) G3101A6, G3102D2, and G310
45% of each antibody was extracted from the supernatant obtained by culturing 3F8.
These antibodies were recovered by saturated ammonium sulfate precipitation and compared for their antibacterial activity against Pseudomonas aeruginosa F4.

Ａ−劫」ｎ皿五遺五性 緑膿菌（Ｆ４）生菌ノＰＢＳ（−）懸濁液１００ｍニ各
サブクラスの抗体のＰＢＳ（−）溶液５０ｄを加え室温
で３０分間反応させた。緑膿菌Ｆ４菌体によりあらかじ
め吸収処理をした新鮮ヒト血清５０ｍをこの反応液に加
え、全量をＨＥＰＥＳ及びゼラチンを含むハンクス緩衝
液で５００ｐ７にし３７℃で６０分間、ゆるやかに振と
う（約１０１００ｒｐ　Ｌ、て反応させた。この液の一
部をハートインフュージョン寒天培地上に広げ、−夜３
７℃で培養後生じる緑膿菌コロニー数を数えて、反応液
中の残存生菌数を見積った。対照としては、抗体液のか
わりにＰＢＳ（−）を用いたものを行ない、この実験か
ら得られた生菌数を１００％として第り表にその結果を
示した。To 100 ml of a PBS (-) suspension of live Pseudomonas aeruginosa (F4) in an A-plate, 50 d of a PBS (-) solution of each subclass antibody was added and allowed to react at room temperature for 30 minutes. Add 50ml of fresh human serum that has been previously absorbed by Pseudomonas aeruginosa F4 cells to this reaction solution, adjust the total volume to 500p7 with Hanks buffer containing HEPES and gelatin, and gently shake at 37°C for 60 minutes (approximately 10,100 rpm L). A portion of this solution was spread on a heart infusion agar medium and incubated at night 3.
The number of Pseudomonas aeruginosa colonies produced after culturing at 7°C was counted to estimate the number of viable bacteria remaining in the reaction solution. As a control, PBS (-) was used instead of the antibody solution, and the results are shown in Table 1, taking the number of viable bacteria obtained from this experiment as 100%.

次に、この反応系に食細胞としてヒト多形核白血球を加
えた系も行なった。白血球はプラズマゲル法によって調
製した。ヘパリン加末梢血２０Ｗｄを１２０ｏｒｐｍ　
１０分間遠心分離し血漿部分を除いた後、残部に対し１
：１の容量のＲＰ旧・１６４０培地を加えゆるやかに撹
拌し、これに対してｌ：ｌ容量のプラズマゲル（ゼラチ
ン３　ｇ　、　　ＣａＣｌ１ｔ　Ｏ，２ｇ。Next, we also performed a system in which human polymorphonuclear leukocytes were added as phagocytes to this reaction system. Leukocytes were prepared by the plasma gel method. Heparinized peripheral blood 20Wd at 120orpm
After centrifuging for 10 minutes to remove the plasma part, add 1
Add 1:1 volume of RP old 1640 medium and gently stir, to which 1:1 volume of plasma gel (gelatin 3 g, CaCl 1t O, 2 g).

ＮａＣ１Ｏ，７ｇを蒸留水１００−に溶解後、０．２２
Ｊｌｌｌフイルターで滅菌する）を加えゆるやかに撹拌
した。After dissolving 7g of NaC1O in 100% of distilled water, 0.22
Sterilize with Jll filter) and stir gently.

その液を新しい容器に移し、３７℃で３０分間静置した
。上層部分を回収しＲＰＭ１１６４０培地で２回遠心洗
浄（１２００ｒｐ−５分〜１０分間）し、チュルク氏液
で有核細胞を数えＩ　Ｘ　ｌ　Ｏ”個／−に調整した。The liquid was transferred to a new container and allowed to stand at 37°C for 30 minutes. The upper layer was collected and centrifugally washed twice with RPM11640 medium (1200 rpm for 5 to 10 minutes), and the number of nucleated cells was counted with Turk's solution and adjusted to IXlO'' cells/-.

この細胞懸濁液（５０ｊ１１）を緑膿菌生菌（１００Ｊ
ＩＩ）、抗体液（５０μり及びヒト血清（５０μりの混
液に添加し全量をＨＥＰＥＳ　、ゼラチンを含むバンク
スス緩衝液で５００μｌに調整後、同様に反応させた。This cell suspension (50j11) was mixed with live Pseudomonas aeruginosa (100J
II), antibody solution (50 µl) and human serum (50 µl) were added to a mixed solution, the total volume was adjusted to 500 µl with Bankus buffer containing HEPES and gelatin, and the reaction was carried out in the same manner.

この結果を第７表に示した 抗体と血清の系では、明らかにＩｇＧ、の制菌効果が認
められた。又、抗体と血清及び食細胞の系でもＩｇＧ、
　、　ＩｇＧ、に制菌効果が認められ、特にＩｇＧ１に
は強い効果が認められた。In the antibody and serum system whose results are shown in Table 7, the bactericidal effect of IgG was clearly observed. In addition, in the system of antibodies, serum, and phagocytes, IgG,
A bacteriostatic effect was observed on IgG1, and a particularly strong effect was observed on IgG1.

玉−１−ス サブクラス変換抗体の抗菌活性の比較 Ｂ、ｉｎｓ匡副ｎ固１ ７退会ｄｄＹマウス（雄、−群８匹）に、各サブクラス
変換抗体（Ｇ３１０１Ａ６　　、Ｇ３１０２Ｄ２　　、
Ｇ３１０３ＦＢ）（７）３０．１０．３．３　、１．１
及び０．３７ｇを含む液（５％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−
）　ニより温度調整）を０．５ｄずつ腹腔的投与した。Comparison of antibacterial activity of G-1-S subclass-converted antibodies.
G3103FB) (7) 30.10.3.3, 1.1
and 0.37 g (PBS containing 5% BSA (-
) was administered intraperitoneally for 0.5 d each.

その１時間３０分後に、５．６　ｘ　１０’ＣＦＵの緑
膿菌Ｆ４を含むＰＢＳ（−）緩衝液０．５　＋ｎＺを腹
腔内へ投与感染させた。対照としては、５％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ（−）を同量用いた。６日間観察後のマウス生存
数（第８表）からＥＤ５゜を算出したことろ、ＩｇＧ＋
　、　１２　ｔａｒ／ｍｏｕｓｅ　−、ＴｇＧｔ＋３２
　ｇ／ｍｏｕｓｅ　、　ｒｇＧａ　、　９　ｔａｒ／ｍ
ｏｕｓｅとなり、ＩｇＧ、に最も強い感染防御活性が認
められた。One hour and 30 minutes later, 0.5 + nZ of PBS(-) buffer containing 5.6 x 10'CFU of Pseudomonas aeruginosa F4 was administered intraperitoneally to cause infection. As a control, the same amount of PBS(-) containing 5% BSA was used. ED5° was calculated from the number of surviving mice after 6 days of observation (Table 8).
, 12 tar/mouse −, TgGt+32
g/mouse, rgGa, 9 tar/m
The strongest infection-preventing activity was observed in IgG.

以下＃白 芽−」し−人 ＊供試数６匹中、生存０匹Below #white sprout *Out of 6 tested, 0 survived.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

第１図は、抗緑膿菌Ｆ４抗体の遺伝子のスクリーニング
におけるサザンハイプリダイゼーションのオートラジオ
ダラム結果を示す。 第２図は、プラスミドｐＧ３１ＶにおよびＬ　ｔｉ　Ｄ
　ＮＡ遺伝子の制限酵素切断地図を示す。 第３−１図及び第３−２図は、抗緑膿菌Ｆ４抗体のＬ鎖
可変領域の塩基配列を示す。 第４図は、ｐＧ３１Ｖに−ｎｅｏの構造を示す。 第５図は、抗緑膿菌Ｆ４抗体のＨ鎖遺伝子検出のための
サザンハイブリダイゼーションのオートラジオグラム結
果を示す。 第６図は、抗緑膿菌Ｆ４抗体のＨｌｌをコードするＤＮ
Ａを含むＤＮＡ断片の制限酵素切断地図を示す。 第７図は、抗緑膿菌Ｆ４抗体のＨ鎖をコードするＤＮＡ
を含むＤＮＡ断片の構造及び一部の塩基配列を示す。数
値はＥｃｏＲＩからの塩基対の長さを示す。 第８図、第９図及び第１０図は、それぞれ、ｐＧ３１０
１−ｇｐｔ　、　ｐＧ３１０２−ｇｐｔ及びｐＧ３１０
３−ｇｐｔの構造を示す。 第１図 ′＄２ｒＲ 第４回 第５図 ００ｂｐ 第６回 ５Ｖ４００ｒｉ 第８回 ５Ｖ４０ｏｒｉ ＠９＠ 第１０回FIG. 1 shows the autoradiodram results of Southern hybridization in screening for the gene of anti-Pseudomonas aeruginosa F4 antibody. Figure 2 shows plasmid pG31V and L ti D
A restriction enzyme cleavage map of the NA gene is shown. Figures 3-1 and 3-2 show the base sequence of the L chain variable region of the anti-Pseudomonas aeruginosa F4 antibody. FIG. 4 shows the structure of -neo in pG31V. FIG. 5 shows the autoradiogram results of Southern hybridization for detecting the H chain gene of anti-Pseudomonas aeruginosa F4 antibody. Figure 6 shows the DN encoding Hll of anti-Pseudomonas aeruginosa F4 antibody.
A restriction enzyme cleavage map of a DNA fragment containing A is shown. Figure 7 shows the DNA encoding the H chain of anti-Pseudomonas aeruginosa F4 antibody.
The structure and partial base sequence of a DNA fragment containing the following are shown. Numbers indicate length in base pairs from EcoRI. Figures 8, 9 and 10 respectively show pG310
1-gpt, pG3102-gpt and pG310
The structure of 3-gpt is shown. Figure 1'$2rR 4th Figure 5 00bp 6th 5V400ri 8th 5V40ori @9@10th

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １、ヒト型抗体のサブクラスを遺伝子工学的に他のサブ
クラスに変換したヒトＩｇＧモノクローナル抗体。 ２、前記他のサブクラスがＩｇＧ＿１、ＩｇＧ＿２又は
ＩｇＧ＿３である請求項１に記載のヒトＩｇＧモノクロ
ーナル抗体。 ３、前記他のサブクラスがＩｇＧ＿３である請求項１に
記載のヒトＩｇＧモノクローナル抗体。 ４、前記ヒトＩｇＧモノクローナル抗体が緑膿菌に対す
るものである請求項１〜３のいづれか１項に記載の抗体
。 ５、ヒト型抗体のＬ鎖をコードする遺伝子を含有する組
換体、及びヒト型抗体のＨ鎖において定常部位のサブク
ラスを他のサブクラスに変換したＨ鎖をコードする遺伝
子を含有する組換体により、又はヒト型抗体のＬ鎖をコ
ードする遺伝子とヒト型抗体のＨ鎖において定常部位の
サブクラスを他のサブクラスに変換したＨ鎖をコードす
る遺伝子とを含有する組換体により形質転換された動物
細胞を培養することによってヒト型抗体を分泌せしめ、
該抗体を回収することを特徴とするヒト型抗体のサブク
ラスが遺伝子工学的に変換されたヒトＩｇＧモノクロー
ナル抗体の製造方法。 ６、前記他のサブクラスがＩｇＧ＿１、ＩｇＧ＿２又は
ＩｇＧ＿３である請求項５に記載の製造法。 ７、前記他のサブクラスがＩｇＧ＿３である請求項５に
記載の製造法。 ８、前記ヒト型抗体が緑膿菌に対するものである請求項
５〜７のいづれか１項記載の製造法。 ９、ヒトＩｇＧモノクローナル抗体のサブクラス変換体
を有効成分とする感染症治療用医薬組成物。 １０、前記サブクラス変換体のサブクラスがＩｇＧ＿１
、ＩｇＧ＿２又はＩｇＧ＿３である請求項９に記載の医
薬組成物。 １１、前記サブクラス変換体のサブクラスがＩｇＧ＿３
である請求項９に記載の医薬組成物。 １２、前記ヒトＩｇＧモノクローナル抗体が緑膿菌に対
するものである請求項９〜１１のいづれか１項に記載の
医薬組成物。[Scope of Claims] 1. A human IgG monoclonal antibody obtained by converting a human antibody subclass into another subclass by genetic engineering. 2. The human IgG monoclonal antibody according to claim 1, wherein the other subclass is IgG_1, IgG_2, or IgG_3. 3. The human IgG monoclonal antibody according to claim 1, wherein the other subclass is IgG_3. 4. The antibody according to any one of claims 1 to 3, wherein the human IgG monoclonal antibody is directed against Pseudomonas aeruginosa. 5. A recombinant containing a gene encoding the L chain of a human antibody, and a recombinant containing a gene encoding a H chain in which the subclass of the constant region in the H chain of a human antibody is converted to another subclass, or an animal cell transformed with a recombinant containing a gene encoding the L chain of a human antibody and a gene encoding the H chain in which the subclass of the constant region in the H chain of the human antibody has been changed to another subclass. By culturing, human antibodies are secreted,
1. A method for producing a human IgG monoclonal antibody in which a subclass of a human antibody has been genetically modified, the method comprising recovering the antibody. 6. The manufacturing method according to claim 5, wherein the other subclass is IgG_1, IgG_2, or IgG_3. 7. The manufacturing method according to claim 5, wherein the other subclass is IgG_3. 8. The production method according to any one of claims 5 to 7, wherein the human antibody is directed against Pseudomonas aeruginosa. 9. A pharmaceutical composition for treating infectious diseases containing a subclass converted human IgG monoclonal antibody as an active ingredient. 10. The subclass of the subclass converter is IgG_1
, IgG_2 or IgG_3. 11. The subclass of the subclass converter is IgG_3
The pharmaceutical composition according to claim 9. 12. The pharmaceutical composition according to any one of claims 9 to 11, wherein the human IgG monoclonal antibody is directed against Pseudomonas aeruginosa.