JPH0118920B2 - - Google Patents
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Classifications
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Description
本発明は界面での蛋白質の変性に対して安定で
ある蛋白水溶液、かかる溶液の製法および蛋白溶
液に対して変性作用を有する表面を処理する方法
に関する。
溶解された蛋白質が疎水性界面（水溶液／空気
の界面も包含する）で吸着されることは知られて
いる（「Trans.Faraday Soc.」第46巻第235頁
（1950）参照〕。蛋白質は両親媒性であり、すなわ
ちこれらは親水性基および疎水性基の両方を有し
ている。疎水性基が疎水性界面との接触を確立す
る。
種々の二次反応が界面での蛋白質の吸着の結果
として観察されるが、これらの反応は一般に「変
性」なる用語により包括される。吸着された蛋白
分子の形態の変化が起る（第三次および／または
第二次構造の変化）。加えて吸着された蛋白分子
は可溶性もしくは不溶性重合体形態に集合しよ
う。多くの蛋白質が表面で集合し、それにより溶
液が混濁してくるかあるいは蛋白質が生物学的に
不活性化（これは水溶液を撹拌もしくは振盪する
場合に観察されうる）されたことは知られている
〔「J.Colloid.Interface Sci.」第32巻第162頁
（1970）参照〕。この表面吸着および集合（アグレ
ゲーシヨン）は蛋白溶液の移送用装置例えば医薬
剤のための自動投薬装置において特に不都合であ
る。ある場合には吸着された蛋白質と溶解された
物質との間に化学反応すら起る〔「J.Macromol.
Sci.Chem.」第４巻第1169頁（1970）参照〕。
これは牛、豚および人間のインシユリンあるい
はそれらの脱―B1―フエニルアラニン誘導体の
場合に特にそうである。インシユリンの重量基準
で0.8％までの亜鉛含量でこれらは水性媒質中に
溶解してPH4.3以下およびPH6.5以上で透明な溶液
を生じる。該インシユリンは水溶液状態において
集合物を形成してその結果その溶液は単量体、二
量体、四量体、六量体およびオリゴマー性インシ
ユリン分子の平衡状態を表わす。インシユリンが
溶液／空気界面をも包含する疎水性表面で強く吸
着されることは知られている〔「Diabetes」第17
巻第766頁（1968）「Europ.J.Biochem.」第33巻
第233頁（1973）参照〕。我々の実験では吸着され
たインシユリンが表面で変性される可能性のある
ことが示された。この過程は温度および溶液の運
動により影響される。変性された生成物は再び重
合体状集合物として脱着され、そして溶液中充分
に高い濃度では沈殿として分離するかあるいはチ
キソトロピー（揺変）性ゲルを形成する。変性さ
れたインシユリンは生物学的に不活性であり、そ
して例えば人工的なベータ細胞中に使用されるよ
うに継続的あるいは間欠的に操作する例えばイン
シユリン注入ポンプ中の供給管を閉塞することが
ある。
さらに、変性されたインシユリンは免疫学的な
非認容性を惹起しうる。インシユリンの物理的形
態がインシユリンに対する抗体の形成の原因であ
るとする研究報告が発表されている〔「Hormon
Metab.Res.」第６巻第175頁（1974）参照〕。さ
らに、人間のインシユリンですらも、人間に投与
された場合に免疫学的反応を生じることは知られ
ている〔「Diabetologia」第13巻第435頁（1977）
参照〕。
従来技術により調製された治療目的のためのイ
ンシユリン水溶液は、活性物質すなわち牛インシ
ユリンあるいは豚インシユリンあるいはこれらイ
ンシユリンの脱―B1―フエニルアラニン誘導体
に加えてインシユリンの重量に基づいて0.8％ま
での量の溶解亜鉛、例えば塩化ナトリウム、グリ
セリンあるいはグルコースのようなこれら溶液を
等張となす試薬、例えばフエノール、クレゾール
あるいはｐ―ヒドロキシ安息香酸メチルのような
防腐剤、および例えばりん酸ナトリウム、酢酸ナ
トリウムあるいはクエン酸ナトリウムのようなPH
値を緩衝する塩を含有しうる。プロタミンあるい
はスルフエン（Surfen）のようなデポ助剤もま
た遅延したインシユリン作用を得るために添加さ
れうるし、あるいはこれら溶液はインシユリンの
結晶状もしくは無定形のデポ形態と混合される。
溶解されたインシユリンはこれら製剤のすべてに
おいて界面で変性されることが見出された。我々
の実験ではまた変性の割合は温度の上昇と共に、
溶液の運動の増大と共に、そして溶液中のPH値上
昇と共に増大することが示されている。人間のイ
ンシユリンも水溶液中で変性される。例えばグア
ニジン、尿素、ピリジンあるいは単量体状洗浄剤
のような水溶液中のインシユリンの集合平衡を単
量体分子の方向へ移行させる添加剤は変性を促進
する。亜鉛あるいはその他の二価の金属イオンの
ような平衡を反対方向へ移動させる物質は変性を
遅らせる。しかしながら、好ましい条件すべての
組合せですらもインシユリンの変性を防止できな
い。この変性は、溶液が静止して貯蔵されている
場合ですらも（この場合は変性が比較的遅いが）
観察される。
水溶液が例えば蛋白質の凍結乾燥において凍結
される場合には疎水性の界面の特別な形態が生ず
る。これらの界面でも上記の蛋白質の変性が観察
される〔「Acta Chem.Scand.」第22巻第483頁
（1968）参照〕。
変性は蛋白質に免疫原性質（すなわち、有機体
における免疫学的防禦反応を誘起する能力）を与
えたり、あるいはすでに存在している免疫原性質
を強化することがある。加うるに、例えば酵素
的、血清学的あるいはホルモン様活性のような生
物学的性質が変形したり消失することもある。
水溶液および液体疎水相の間を形成する界面で
の蛋白質の吸着は、その系に例えばアルキルアル
コールのような単量体状界面活性物質を添加する
ことにより防止されることも知られている
〔「Biochem.J.」第117巻第147頁（1970）参照〕。
これらの物質はそれ自体疎水性界面で可逆的に吸
着され、そして従つて蛋白質と置換する。この方
法の欠点は、界面活性物質の濃度が界面の最適充
填を確保するためには水溶液中でのそれらの飽和
限界点近くでなければならないことにある。多く
の場合、界面の大きさは一定ではなくて変動し
（例えば、蛋白溶液を撹拌あるいは振盪する場合
の溶液／空気界面）、従つてその水溶液は上記界
面活性物質の分子を交互に補給および摂取せねば
ならない。すなわちこれは緩衝液ストツクを含有
していなければならない。飽和限界に近い必要な
適用濃度ではこれは限定された程度にのみ可能で
ある。
この方法のもう一つの欠点は、上記単量体状界
面活性物質が疎水性界面においてのみでなく溶解
された蛋白質の疎水性部域においても吸着され、
そこで大抵の場合不可逆的でしかも回避されねば
ならない溶解蛋白質の変性をもたらすことであ
る。
疎水性界面および溶解された蛋白質の疎水性部
域に対する単量体状界面活性物質の結合の強さは
その物質の疎水度、すなわち例えばアルキル鎖長
の如何による。アルキル鎖が長ければ長い程結合
は強固である。界面活性物質との界面の可能な限
り実質的な充填（物質の高い疎水度あるいは使用
される高濃度により得られる）と溶解された蛋白
質の疎水性部域への可能な限り弱い結合との間の
矛盾は解決できないように思われる。
今や交互に配置された疎水性および親水性部域
を有する重合体状物質が界面を変化させその結果
界面での蛋白質の吸着および従つて例えば界面集
合のような上記二次反応が効果的に回避できるこ
とが見出された。
従つて本発明の目的は、その構成員が交互配置
において弱い疎水性部域および弱い親水性部域を
有しているような基本的鎖構造を有する界面活性
物質を含有することを特徴とする蛋白水溶液を提
供することである。更に詳細には、本発明は、所
望ならば等張度の調整、防腐および／またはデポ
効果を生じるための通常の添加剤を含有している
インシユリン水溶液を提供するものであり、而し
てこの溶液はさらに前記した界面活性物質を含有
している。
本発明の意味における好ましい界面活性物質は
式
R2Y−Xo−R3
〔式中Xoは式および
The present invention relates to aqueous protein solutions that are stable against denaturation of proteins at interfaces, methods for preparing such solutions, and methods for treating surfaces that have a denaturing effect on protein solutions. It is known that dissolved proteins are adsorbed at hydrophobic interfaces (including the aqueous solution/air interface) (see Trans. Faraday Soc., Vol. 46, p. 235 (1950)). They are amphiphilic, i.e. they have both hydrophilic and hydrophobic groups. The hydrophobic groups establish contact with the hydrophobic interface. Various secondary reactions lead to the adsorption of proteins at the interface. These reactions are generally subsumed by the term "denaturation." A change in the morphology of the adsorbed protein molecule occurs (changes in tertiary and/or secondary structure). In addition, adsorbed protein molecules may aggregate into soluble or insoluble polymeric forms. Many proteins may aggregate on the surface, making the solution cloudy, or the protein may become biologically inactive (this may occur in aqueous solutions). It is known that the surface adsorption and aggregation ) are particularly disadvantageous in devices for the transfer of protein solutions, such as automatic dosing devices for pharmaceutical drugs. In some cases even chemical reactions occur between the adsorbed proteins and the dissolved substances [J. Macromol .
Sci. Chem., Vol. 4, p. 1169 (1970)]. This is particularly the case with bovine, porcine and human insulin or their de-B1-phenylalanine derivatives. With a zinc content of up to 0.8% based on the weight of insulin, they dissolve in aqueous media to give clear solutions below PH 4.3 and above 6.5. The insulin forms aggregates in aqueous solution so that the solution represents an equilibrium of monomeric, dimeric, tetrameric, hexameric and oligomeric insulin molecules. It is known that insulin is strongly adsorbed on hydrophobic surfaces, including the solution/air interface [Diabetes, No. 17]
vol. 766 (1968), ``Europ.J.Biochem.'' vol. 33, p. 233 (1973)]. Our experiments showed that adsorbed insulin can be denatured on the surface. This process is influenced by temperature and solution movement. The modified products are again desorbed as polymeric aggregates and, at sufficiently high concentrations in solution, separate as precipitates or form thixotropic gels. Modified insulin is biologically inert and can occlude supply lines, e.g. in insulin infusion pumps, which are operated continuously or intermittently, e.g. as used in artificial beta cells. . Furthermore, modified insulin can cause immunological intolerance. A research report has been published stating that the physical form of insulin is responsible for the formation of antibodies against insulin.
Metab. Res., Vol. 6, p. 175 (1974)]. Furthermore, even human insulin is known to produce an immunological reaction when administered to humans [Diabetologia, Vol. 13, p. 435 (1977).
reference〕. Aqueous insulin solutions for therapeutic purposes prepared according to the prior art contain in addition to the active substance, namely bovine or porcine insulin or de-B1-phenylalanine derivatives of these insulins, an amount of up to 0.8%, based on the weight of insulin. Dissolved zinc, reagents to make these solutions isotonic such as sodium chloride, glycerin or glucose, preservatives such as phenol, cresol or methyl p-hydroxybenzoate, and sodium phosphate, sodium acetate or citric acid. pH like sodium
It may contain value buffering salts. Depot aids such as protamine or Surfen may also be added to obtain delayed insulin action, or these solutions may be mixed with crystalline or amorphous depot forms of insulin.
It was found that dissolved insulin was denatured at the interface in all of these formulations. In our experiments, the rate of denaturation also increases with increasing temperature.
It has been shown to increase with increasing movement of the solution and with increasing PH value in the solution. Human insulin is also denatured in aqueous solution. Additives that shift the collective equilibrium of insulin in aqueous solution towards monomeric molecules, such as guanidine, urea, pyridine or monomeric detergents, promote denaturation. Substances that shift the equilibrium in the opposite direction, such as zinc or other divalent metal ions, retard denaturation. However, even the combination of all favorable conditions cannot prevent the denaturation of insulin. This denaturation occurs even when the solution is stored quiescently (although in this case denaturation is relatively slow).
be observed. A special morphology of hydrophobic interfaces occurs when aqueous solutions are frozen, for example in the freeze-drying of proteins. Denaturation of the above proteins is also observed at these interfaces [see "Acta Chem. Scand." Vol. 22, p. 483 (1968)]. Modification may impart immunogenic properties to a protein (ie, the ability to elicit a protective immunological response in an organism) or may enhance already existing immunogenic properties. In addition, biological properties such as enzymatic, serological or hormonal activity may be altered or lost. It is also known that the adsorption of proteins at the interfaces forming between the aqueous solution and the liquid hydrophobic phase can be prevented by adding to the system monomeric surfactants, such as alkyl alcohols [" Biochem. J., Vol. 117, p. 147 (1970)].
These substances are themselves reversibly adsorbed at hydrophobic interfaces and thus displace proteins. A disadvantage of this method is that the concentration of surfactants must be close to their saturation limit in aqueous solution to ensure optimal filling of the interface. In many cases, the size of the interface is not constant but varies (e.g. the solution/air interface when stirring or shaking a protein solution), so that the aqueous solution alternately replenishes and uptakes molecules of the surfactant. I have to do it. That is, it must contain a buffer stock. At the required applied concentrations close to the saturation limit, this is only possible to a limited extent. Another drawback of this method is that the monomeric surfactants are adsorbed not only at the hydrophobic interface but also at the hydrophobic regions of the dissolved protein.
This results in a denaturation of the lytic proteins, which in most cases is irreversible and must be avoided. The strength of the binding of a monomeric surfactant to the hydrophobic interface and to the hydrophobic regions of dissolved proteins depends on the hydrophobicity of the substance, ie the length of the alkyl chain, for example. The longer the alkyl chain, the stronger the bond. between the most substantial possible filling of the interface with surfactant (obtained by the high hydrophobicity of the substance or the high concentration used) and the weakest possible binding of the dissolved protein to the hydrophobic regions. The contradiction seems irresolvable. Now the polymeric material with alternating hydrophobic and hydrophilic regions modifies the interface so that protein adsorption at the interface and thus the secondary reactions mentioned above, such as interfacial assembly, are effectively avoided. It was discovered that something could be done. It is therefore an object of the present invention to contain surface-active substances characterized in that their members have a basic chain structure such that they have weakly hydrophobic and weakly hydrophilic regions in an alternating arrangement. The purpose is to provide an aqueous protein solution. More particularly, the present invention provides an aqueous insulin solution containing, if desired, customary additives for isotonicity adjustment, preservative and/or depot effects; The solution further contains the surfactants described above. Preferred surface-active substances within the meaning of the invention have the formula R 2 Y−X o −R 3 , where X o is of the formula and
【式】
を有するｎ個の構成員からなる任意の所望の順序
の鎖を表わし、ｎは２〜80好ましくは８〜45であ
り、Ｙは―Ｏ―あるいは―NH―であり、R1は
Ｈ、―CH3あるいは―C2H5であつて、基R1は同
じかまたは相異なつているが鎖構成員Ｘの少くと
も1/2は―CH3あるいは―C2H5を有しており、そ
してR2およびR3は相互に独立して水素あるいは
有機基である〕を有するホモポリマー、コポリマ
ーあるいはブロツクポリマーである。
特に好ましくはR3が１〜20個の炭素原子を有
するアルキル、２〜20個の炭素原子を有するカル
ボキシアルキルあるいは１〜10個のアルキル炭素
原子を有するアルキルフエニルであり、R2が１
〜20個の炭素原子を有するアルキルであり、そし
てＹが―Ｏ―である場合はまた２〜20個の炭素原
子を有するカルボキシアルキルあるいは１〜10個
のアルキル炭素原子を有するアルキルフエニルで
もある式を有する化合物である。
適当な基R2およびR3はメチル、エチル、プロ
ピル、ブチルであるかあるいはラウリルアルコー
ルもしくはミリスチルアルコールから誘導される
基であるか、酢酸、プロピオン酸、酪酸、パルミ
チン酸あるいはステアリン酸から誘導されるカル
ボキシアルキル基であるか、ノニルフエノキシ、
オレイルアミノあるいはステアリルアミノであ
る。
R2およびR3はグリセリンあるいはペンタエリ
スリトールのような多価アルコールからか、ある
いはクエン酸のような多塩基性カルボン酸から
か、あるいはエチレンジアミンのような多価アミ
ンからも誘導されうる。多官能性の構成員R2あ
るいはR3は上記した型のポリアルコキシ鎖の２
個もしくはそれ以上と結合されていてよく、それ
により分岐した生成物が得られる。
本発明により使用される界面活性物質はアルキ
レンジグリコール（あるいは、ペンタエリスリト
ールのような多価アルコールあるいはアミンある
いは分岐した生成物が所望されるならばエチレン
ジアミン）にアルキレンオキサイドを制御して附
加することにより既知方法で製造される。末端ヒ
ドロキシ官能基は続いてエステル化あるいはエー
テル化される。適当なブロツクポリマーの製造の
ための一般的記載は実施例1aに示されている。
本発明により使用される界面活性物質はそれら
が水性媒質中で２〜200ppmの濃度ですらも有効
であることを特徴とする。該物質の界面は疎水性
基が疎水相中に突出しそして親水性基が交互の配
置で水相中に突出しているような形を有している
と考えられる。個々の疎水性基の疎水度は比較的
弱いので、これら個々の疎水基の他の疎水性構造
（例えば溶解蛋白）の疎水性部域への結合は非常
に弱いので本発明により使用される低濃度では無
視できると考えられる。低濃度でも界面の最適被
覆を保証するのは、比較的大きい疎水性表面への
個々の疎水性基のすべての結合の総和のみである
（界面に関して溶解された蛋白質の疎水性部域は
非常に小さい）。
水溶液中において本発明により使用されるべき
界面活性物質の分子形態はそれらが表面上で取得
する形態とは異なると考えられる。水溶液中では
重合体鎖は個々の疎水性部域が相互に飽和しそし
て親水性部域が水性周囲環境中に外側に向けて突
出するような様式で形成される。このことは水性
媒質への充分に高い溶解度を生じ、従つて充分量
の蓄積緩衝液が存在し、このことは界面の大きさ
が絶えず変化しても該物質での界面の最適充填を
保証する。
本発明による添加剤による吸着および変性の防
止はなおさら驚くべきことである。何故ならば上
述したように蛋白質溶液特にインシユリン溶液の
変性を促進するのはまさに単量体状界面活性物質
（洗浄剤）の添加であるからである。
上述の重合体状界面活性物質は蛋白質溶液に添
加されることもできるし、あるいはまた、蛋白溶
液との接触が意図されている表面がこれら界面活
性物質で前処理されうる。
蛋白質溶液にこれら重合体状界面活性物質を添
加することは治療目的ための溶液に限定されるわ
けではない。これらの物質はまた、特にゲルクロ
マトグラフイーおよび限外過中の界面での吸着
および変性を防止するために、蛋白質の製造およ
び精製過程中に蛋白溶液に添加されうる。
インシユリンの変性は可逆的過程である。変性
したインシユリンを易溶性洗浄剤（例えばドデシ
ル硫酸ナトリウム）あるいは水性アルカリ性媒質
でPH10.5以上で処理するかあるいは濃厚トリフル
オル酢酸で処理することにより変性生成物をもと
に再生することが可能である。従つて、これら生
成物の溶液が本発明による界面活性物質と接触さ
れる前に、慣用の製法で得られるインシユリン中
の少量の変性インシユリンを前記条件下において
もとに再生することが可能である。
治療目的のためのインシユリン溶液は以下の一
般的製法により製造され得る。
0.8重量％までの亜鉛を含有している牛、豚あ
るいは人間のインシユリン、あるいはこれらイン
シユリンの脱―B1―フエニルアラニン誘導体の
1500000IUまでを1N塩酸を添加して水400ml中に
溶解させる。この溶液を、防腐剤（例えばフエノ
ール、クレゾールあるいはｐ―ヒドロキシ安息香
酸メチル）、溶液を等張となす試薬（例えば塩化
ナトリウム、グリセリン、グルコース、あるいは
同様の炭水化物）およびPH値を緩衝するための塩
（例えばりん酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ク
エン酸ナトリウム、ナトリウムベロナールあるい
はトリ―（ヒドロキシメチル）―アミノメタン）
を含有している溶液500mlと混合する。さらに、
遅延インシユリン作用を得るためにこの溶液はス
ルフエン（Surfen）のようなデポ助剤をも含有
してよい。PH値は1N塩酸を用いてPH3.0〜4.0とす
るかあるいは1N水酸化ナトリウム溶液を用いて
6.8〜7.5に調整する。次いで本発明による界面活
性物質２〜200mgを含有している水溶液50mlを加
えそしてこの溶液に水を加えて1000となす。
治療目的のためのこの型のインシユリン溶液を
遅延作用を有する無定形あるいは結晶状インシユ
リンを含有している懸濁液と混合することもでき
る。
以下の実施例により本発明を更に説明する。
実施例 １
ａ 撹拌器、加熱浴、還流冷却器およびアルキレ
ンオキサイドをを計量するための手段を備えた
10のガラスフラスコに窒素気流下にプロピレ
ングリコール152.1ｇおよび40％水酸化カリウ
ム溶液125ｇを加え、そして真空下に水を留去
する。次いでプロピレンオキサイド4141ｇおよ
びエチレンオキサイド476ｇを順次ゆつくりと
120℃で撹拌下に加える。反応終了後、水酸化
カリウムを乳酸を添加することにより中和す
る。易揮発性の成分を減圧蒸留することにより
分離し、そして反応生成物を脱水する。これは
平均分子量2000（Dalton）および分子中に10重
量％のポリオキシエチレン含量を有する。
ｂ PH７の0.01Mりん酸塩緩衝液中の牛血清アル
ブミンおよび人間のアルブミンのそれぞれ0.1
％溶液の各10mlずつの試料２個、および平均分
子量1750（Dalton）を有するそのいずれの側に
も５％のポリエチレングリコールが重合により
付加されている線状ポリプロピレングリコール
鎖からなるブロツクポリマー10ppm（溶液重量
基準で計算）を安定剤として含有する同様の試
料２個を37℃で振盪する。前２者の試料はそれ
ぞれ７日後および30日後に変性蛋白から生ずる
強い混濁を示す。安定剤を有する２個の試料は
数ケ月後でもまだ透明である。
実施例 ２
３×106μU／mlを有する0.01Mりん酸塩緩衝液
（PH７）中の大腸菌からの酵素β―ガラクトシダ
ーゼの0.01％溶液の各10mlの試料10個をシリコー
ン油AK350 10〜100mgと段階的に混合し、そし
てこの懸濁液を48時間５℃で振盪する。乳濁液が
形成されこれは超遠心分離により二相に分離され
うる。（40000ｇ、４℃において30分）。水相中で
酵素活性が測定される。シリコーン油乳濁液は70
％までの酵素を吸着していることが判明した。こ
の試験を溶液の重量に基づいて計算して100ppm
の下記の化合物
の存在下に再度実施してシリコーン油上に何ら酵
素活性が吸着されていないことが判つた。
実施例 ３
平均直径0.481μmを有するポリスチレンビード
（商品名「Dow−Latex」）の水性懸濁液10mlを二
つに分け、その一方は未処理のままとし、そして
他方は平均分子量2.250（Dalton）を有する線状ポ
リプロピレングリコール鎖（そのいずれの側にも
５％のポリエチレングリコールが重合により付加
されている）からなるブロツクポリマー50mgと共
に室温で２日間振盪した。同じ重合体状界面活性
物質の20ppmを含有している水溶液に対して透析
することによりブロツクポリマーの過剰量を除
く。
PH７のりん酸塩緩衝液中の所定濃度における下
記表に示される蛋白質の溶液各３ml×２個ずつを
調製し、そして各溶液を未処理のポリスチレン懸
濁液あるいは前述ののように処理されたポリスチ
レン懸濁液（このものはなお20ppmのブロツクポ
リマーを含有している）の各500μと５℃で振
盪する。次いで各試料を0.2μmフイルターを通し
て過して透明となす。下記表は液中の蛋白濃
度を示す。[Formula] represents a chain of n members in any desired order, where n is 2 to 80, preferably 8 to 45, Y is -O- or -NH-, and R 1 is H, --CH 3 or --C 2 H 5 , in which the radicals R 1 are the same or different but at least 1/2 of the chain members X have --CH 3 or --C 2 H 5 ; and R 2 and R 3 are each independently hydrogen or an organic group. Particularly preferably R 3 is alkyl having 1 to 20 carbon atoms, carboxyalkyl having 2 to 20 carbon atoms or alkylphenyl having 1 to 10 alkyl carbon atoms, and R 2 is 1
alkyl with ~20 carbon atoms and, if Y is -O-, also carboxyalkyl with 2 to 20 carbon atoms or alkylphenyl with 1 to 10 alkyl carbon atoms It is a compound having the formula: Suitable radicals R 2 and R 3 are methyl, ethyl, propyl, butyl or radicals derived from lauryl or myristyl alcohol, or from acetic, propionic, butyric, palmitic or stearic acids. carboxyalkyl group, nonylphenoxy,
Oleylamino or stearyl amino. R 2 and R 3 may be derived from polyhydric alcohols such as glycerin or pentaerythritol, or from polybasic carboxylic acids such as citric acid, or even from polyhydric amines such as ethylenediamine. The polyfunctional member R 2 or R 3 is a polyalkoxy chain of the type described above.
One or more may be combined, thereby giving a branched product. The surfactants used according to the invention are prepared by the controlled addition of an alkylene oxide to an alkylene diglycol (or polyhydric alcohol or amine such as pentaerythritol or ethylene diamine if a branched product is desired). Manufactured by known methods. The terminal hydroxy functionality is subsequently esterified or etherified. A general description for the preparation of a suitable block polymer is given in Example 1a. The surfactants used according to the invention are characterized in that they are effective even at concentrations of 2 to 200 ppm in aqueous media. It is believed that the interface of the material has a shape in which hydrophobic groups project into the hydrophobic phase and hydrophilic groups project into the aqueous phase in an alternating arrangement. Since the hydrophobicity of the individual hydrophobic groups is relatively weak, the binding of these individual hydrophobic groups to the hydrophobic regions of other hydrophobic structures (e.g. lytic proteins) is very weak and therefore It is considered that the concentration can be ignored. It is only the sum of all the binding of individual hydrophobic groups to a relatively large hydrophobic surface that ensures optimal coverage of the interface even at low concentrations (the hydrophobic regions of the dissolved protein with respect to the interface are very small). It is believed that the molecular form of the surfactants to be used according to the invention in aqueous solution is different from the form they obtain on the surface. In aqueous solution, the polymer chains are formed in such a way that the individual hydrophobic regions are mutually saturated and the hydrophilic regions project outward into the aqueous surrounding environment. This results in a sufficiently high solubility in aqueous media, so that a sufficient amount of accumulation buffer is present, which ensures optimal filling of the interface with the substance even if the size of the interface changes constantly. . The prevention of adsorption and modification by the additives according to the invention is all the more surprising. This is because, as mentioned above, it is precisely the addition of monomeric surfactants (detergents) that promotes the denaturation of protein solutions, especially insulin solutions. The polymeric surfactants mentioned above can be added to the protein solution, or alternatively the surfaces intended for contact with the protein solution can be pretreated with these surfactants. The addition of these polymeric surfactants to protein solutions is not limited to solutions for therapeutic purposes. These substances may also be added to protein solutions during protein manufacturing and purification processes, particularly to prevent interfacial adsorption and denaturation during gel chromatography and ultrafiltration. Insulin denaturation is a reversible process. It is possible to regenerate the denatured insulin by treating the denatured insulin with a readily soluble detergent (e.g. sodium dodecyl sulfate) or an aqueous alkaline medium at pH 10.5 or above, or with concentrated trifluoroacetic acid. . It is therefore possible to regenerate small amounts of denatured insulin in the insulin obtained by conventional processes back to normal under the conditions mentioned before the solutions of these products are contacted with the surfactants according to the invention. . Insulin solutions for therapeutic purposes may be manufactured by the following general method. Bovine, porcine or human insulin containing up to 0.8% by weight of zinc, or de-B1-phenylalanine derivatives of these insulins.
Up to 1,500,000 IU are dissolved in 400 ml of water by adding 1N hydrochloric acid. The solution is treated with preservatives (e.g. phenol, cresol or methyl p-hydroxybenzoate), reagents to make the solution isotonic (e.g. sodium chloride, glycerin, glucose or similar carbohydrates) and salts to buffer the pH value. (e.g. sodium phosphate, sodium acetate, sodium citrate, sodium veronal or tri-(hydroxymethyl)-aminomethane)
Mix with 500 ml of solution containing. moreover,
The solution may also contain a depot aid such as Surfen to obtain delayed insulin action. Adjust the pH value to PH3.0-4.0 using 1N hydrochloric acid or 1N sodium hydroxide solution.
Adjust to 6.8-7.5. 50 ml of an aqueous solution containing 2 to 200 mg of the surfactant according to the invention are then added and the solution is made up to 1000 ml with water. Insulin solutions of this type for therapeutic purposes can also be mixed with suspensions containing amorphous or crystalline insulin with delayed action. The invention is further illustrated by the following examples. Example 1 a. Equipped with a stirrer, heating bath, reflux condenser and means for metering alkylene oxide.
152.1 g of propylene glycol and 125 g of 40% potassium hydroxide solution are added to a No. 10 glass flask under a stream of nitrogen, and the water is distilled off under vacuum. Next, 4141 g of propylene oxide and 476 g of ethylene oxide were slowly added in order.
Add under stirring at 120°C. After the reaction is complete, potassium hydroxide is neutralized by adding lactic acid. Easily volatile components are separated by vacuum distillation and the reaction product is dehydrated. It has an average molecular weight of 2000 (Dalton) and a polyoxyethylene content of 10% by weight in the molecule. b 0.1 each of bovine serum albumin and human albumin in 0.01 M phosphate buffer at pH 7.
Two samples of 10 ml each of 10% solution and a block polymer consisting of linear polypropylene glycol chains with 5% polyethylene glycol added by polymerization on either side having an average molecular weight of 1750 (Dalton) (10 ppm solution) Two similar samples containing (calculated on a weight basis) as stabilizer are shaken at 37°C. The first two samples show strong turbidity resulting from denatured protein after 7 and 30 days, respectively. The two samples with stabilizer are still clear even after several months. Example 2 Ten samples of 10 ml each of a 0.01% solution of the enzyme β-galactosidase from E. coli in 0.01 M phosphate buffer (PH 7) with 3×10 6 μU/ml were mixed with 10-100 mg of silicone oil AK350. Mix stepwise and shake the suspension for 48 hours at 5°C. An emulsion is formed which can be separated into two phases by ultracentrifugation. (40000g, 30 minutes at 4°C). Enzyme activity is measured in the aqueous phase. Silicone oil emulsion is 70
It was found that up to % of enzymes were adsorbed. Calculate this test based on the weight of the solution to 100ppm
The following compounds of It was found that no enzyme activity was adsorbed onto the silicone oil. Example 3 10 ml of an aqueous suspension of polystyrene beads (trade name "Dow-Latex") with an average diameter of 0.481 μm are divided into two parts, one of which is left untreated and the other with an average molecular weight of 2.250 (Dalton). was shaken for 2 days at room temperature with 50 mg of a block polymer consisting of linear polypropylene glycol chains having 5% polyethylene glycol added to either side by polymerization. Excess amount of block polymer is removed by dialysis against an aqueous solution containing 20 ppm of the same polymeric surfactant. Two 3 ml solutions of each of the proteins listed in the table below at the indicated concentrations in phosphate buffer, pH 7, were prepared, and each solution was mixed with either an untreated polystyrene suspension or a polystyrene suspension treated as described above. Each 500 μl of the polystyrene suspension (which still contains 20 ppm block polymer) is shaken at 5°C. Each sample is then passed through a 0.2 μm filter to clear it. The table below shows the protein concentration in the liquid.
【表】
グロブリ
ン
[Table] Globulin
【表】
この試験を37℃で再び行う。液をさらにカラ
ム中のゲルクロマトグラフイーにより検査する。
未処理ポリスチレンビードと接触した蛋白溶液は
高分子量の集合物を含有しているが、予め処理さ
れたポリスチレンビードと接触した蛋白溶液中に
はかかる集合物は観察されない。
実施例 ４
PH８の0.05Mトリス／HCl緩衝液中のグルカゴ
ン0.1％溶液各10mlの試料５個、および溶液の重
量に基づいて計算して各50ppmの下記化合物
を含有している同様の試料５個を室温で振盪す
る。前記５個の試料は変性蛋白の沈殿の結果とし
て４日後に混濁する。界面活性物質を含有してい
る試料は数週間も透明のままである。
実施例 ５
以下のペプチドホルモンすなわちセクレチン、
カルシトニン、グルカゴン、ガストリン、副腎皮
質刺激ホルモン（ACTH）、ブラジキニン、コレ
シストキニン（CCK）、ガストリン抑制性ポリペ
プチド（GIP）、バソアクチブ腸管性ポリペプチ
ド（VIP）および黄体化放出ホルモン（LRH）
のPH7.5の0.05Mトリス／HCl緩衝液中の0.1％溶
液各１〜５ml、および平均分子量2000（Dalton）
を有する線状ポリプロピレングリコール鎖（おの
おのの側に５％のポリエチレングリコールが重合
により付加されている）からなるブロツクポリマ
ーの、溶液の重量に基づき計算して10ppmを含有
している同様の試料を37℃で振盪する。２〜３日
後、安定剤を含有していない試料は変性蛋白のた
めに混濁するが安定化された試料は数ケ月後でも
透明なままである。
実施例 ６
PH７の0.01Mりん酸塩緩衝液中の卵アルブミ
ン、人間の免疫グロブリン―Ｇおよび鯨のミオグ
ロブリンのそれぞれ0.1％溶液、および溶液の重
量に基づいて計算して0.1％の下記化合物
（式中ｎおよびｍはエチレンオキサイド割合40
％を有する平均合計分子量12500ドルトンを有す
る化合物が得られるように選択される）を含有す
る同様の溶液を超遠心分離（例えば100000ｇ／90
分）することにより集合物を除去する。各10mlの
溶液を有するアンプルを37℃で振盪する。安定剤
を有しない試料は変性蛋白質の沈殿の結果２〜３
時間後には強く混濁してくる。界面活性物質を含
有している試料は数ケ月間透明なままである。分
析用の超遠心分離器中で検査すると何ら新たな集
合物は見出されない。
実施例 ７
0.5重量％の亜鉛を含有している結晶状牛イン
シユリン（40000IU）を1N塩酸３mlを添加して
水200ml中に溶解させる。ｐ―ヒドロキシ安息香
酸メチル１ｇ、グリセリン16ｇおよび酢酸ナトリ
ウム3H2O1.4ｇからなる溶液700mlをこの溶液中
に加える。この溶液のPHを1N水酸化ナトリウム
溶液を用いて6.9〜7.4に調整する。平均分子量
2000（Dalton）を有する線状ポリプロピレングリ
コールの0.1％水溶液５mlを添加したのちこの混
合物に水を加えて1000とし、この溶液を滅菌
過する。
実施例 ８
0.6重量％の亜鉛を含有している牛の結晶状脱
―B1―フエニルアラニン―インシユリン
（100000IU）を1N塩酸３mlを添加して水200ml中
に溶解させる。フエノール２ｇ、グリセリン17ｇ
およびトリ―（ヒドロキシメチル）―アミノメタ
ン6.057ｇからなる溶液（1N塩酸35mlを用いてPH
7.6に調整）700mlをこの溶液中に加える。この溶
液のPHを7.2〜7.6に調整する。下記式
の化合物の１％水溶液10mlを添加したのち、この
混合物を水を加えて1000となしこの溶液を滅菌
過する。
実施例 ９
0.8重量％の亜鉛を含有している無定形の牛イ
ンシユリン（1000000IU）を1N塩酸５mlを添加
して水400ml中に溶解する。フエノール2.5ｇ、グ
リセリン16ｇおよびNa2HPO4・2H2O1.78ｇから
なる溶液500mlをこの溶液中に加える。この溶液
のPHを7.2〜7.5に調整する。平均分子量1.750
（Dalton）を有する線状ポリプロピレングリコー
ルの0.1％水溶液５mlを添加したのち、水を加え
てこの混合物を1000となしこの溶液を滅菌過
する。
実施例 10
平均分子量1.750（Dalton）を有するポリプロピ
レングリコールの線状鎖（そのいずれの側にも５
％のポリエチレングリコールが共重合されてい
る）からなるブロツクポリマーの存在下にクロマ
トグラフイー精製されそして0.6重量％の亜鉛を
含有して牛インシユリン（40000IU）を1N塩酸
３mlを添加して水200ml中に溶解させる。ｍ―ク
レゾール2.5ｇ、グルコース50ｇ、酢酸ナトリウ
ム3H2O1.4ｇおよび上記ブロツクポリマー10mgの
溶液700mlをこの溶液中に加える。この溶液のPH
を1N水酸化ナトリウム溶液を用いて6.9〜7.4に調
整し、この溶液を水を加えて1000となし、そし
て滅菌過する。
実施例 11
0.6重量％の亜鉛を含有している結晶状豚イン
シユリン（40000IU）を1N HCl3mlを添加して水
200ml中に溶解させる。ｐ―ヒドロキシ安息香酸
メチル１ｇ、グリセリン17ｇ、酢酸ナトリウム
3H2O1.4ｇおよび平均分子量1.750（Dalton）を有
する線状ポリプロピレングリコール10mgからなる
溶液700mlをこの溶液中に加える。この溶液のPH
を6.9〜7.4に調整する。水を加えてこの溶液を
1000となしそして滅菌過する。
実施例 12
平均分子量1.750（Dalton）を有するポリプロピ
レングリコールの線状鎖（そのいずれの側も５％
のポリエチレングリコールが共重合している）か
らなるブロツクポリマーの存在下に慣用のクロマ
トグラフイー方法の一つにより精製されそして
0.5重量％の亜鉛を含有している結晶状の牛イン
シユリン（450000IU）を0.03N塩酸400ml中に溶
解し、0.03NHCl100ml中のZnCl2150mgおよびク
ロマトグラフイーに使用されるブロツクポリマー
５mgからなる溶液をこの溶液に加える。この溶液
を滅菌過しNaCl70ｇ、酢酸ナトリウム3H2O14
ｇ、クロマトグラフイーに使用されるブロツクポ
リマー５mgおよび1N NaOH水溶液10mlからなる
同様に滅菌過された溶液500mlと混合する。こ
の混合物のPHを5.4に調整しそしてこの混合物を
室温で48時間撹拌する。その期間中にインシユリ
ンは菱面体状に晶出する。NaCl20ｇ、酢酸ナト
リウム3H2O1.75ｇへ、ｐ―ヒドロキシ安息香酸
メチル11.25ｇおよびクロマトグラフイーに使用
されるブロツクポリマー102.5mgからなる滅菌溶
液10.25を結晶性懸濁液中に加える。1N
NaOHを滴下することによりPHを6.9〜7.3に調整
する。
実施例 13
次式
の化合物の存在下に慣用のクロマトグラフイー方
法の一つにより精製され且つ0.5重量％の亜鉛を
含有している結晶状牛インシユリン（40000IU）
を1N HCl ３mlを添加して水200ml中に溶解させ
る。ｐ―ヒドロキシ安息香酸メチル１ｇ、グルコ
ース50ｇへ、ズルフエン0.175ｇおよびクロマト
グラフイーに使用される物質100mgからなる溶液
700mlをこの溶液中に加える。この溶液のPHをも
し必要ならば1N HClあるいは1N NaOHを使用
して3.3〜3.5に調整し、この溶液を水を加えて
1000となし、そして滅菌過する。
実施例７〜13における界面活性物質の濃度はそ
れぞれ次のとおりであり、いずれの実施例におい
ても界面活性物質を含有している試料は数週間透
明なままで、蛋白質の変性や分解は認められなか
つた。
実施例７： 5ppm
実施例８： 100ppm
実施例９： 5ppm
実施例10： 10ppm
実施例11： 10ppm
実施例12： 約100ppm
実施例13： 100ppm[Table] The test is repeated at 37°C. The liquid is further examined by gel chromatography in a column.
Protein solutions contacted with untreated polystyrene beads contain high molecular weight aggregates, whereas no such aggregates are observed in protein solutions contacted with pretreated polystyrene beads. Example 4 Five samples of 10 ml each of glucagon 0.1% solution in 0.05 M Tris/HCl buffer at pH 8 and the following compounds at 50 ppm each calculated based on the weight of the solution: Shake 5 similar samples containing . The five samples become cloudy after 4 days as a result of precipitation of denatured proteins. Samples containing surfactants remain clear for several weeks. Example 5 The following peptide hormones, namely secretin,
Calcitonin, glucagon, gastrin, adrenocorticotropic hormone (ACTH), bradykinin, cholecystokinin (CCK), gastrin inhibitory polypeptide (GIP), vasoactive intestinal polypeptide (VIP) and luteinizing releasing hormone (LRH)
1-5 ml each of a 0.1% solution in 0.05 M Tris/HCl buffer with a pH of 7.5 and an average molecular weight of 2000 (Dalton)
A similar sample containing 10 ppm, calculated based on the weight of the solution, of a block polymer consisting of linear polypropylene glycol chains (with 5% polyethylene glycol added by polymerization to each side) having 37 Shake at °C. After a few days, samples without stabilizer become cloudy due to denatured proteins, whereas stabilized samples remain clear even after several months. Example 6 A 0.1% solution each of egg albumin, human immunoglobulin-G and whale myoglobulin in 0.01M phosphate buffer at PH 7, and 0.1% of the following compounds calculated based on the weight of the solution: (In the formula, n and m are ethylene oxide ratio 40
% (selected to yield a compound with an average total molecular weight of 12,500 daltons) by ultracentrifugation (e.g. 100,000 g/90
(minutes) to remove aggregates. Shake the ampoules with each 10 ml of solution at 37°C. Samples without stabilizers result in precipitation of denatured proteins 2-3
After a while, it becomes very cloudy. Samples containing surfactants remain clear for several months. No new aggregates are found when examined in an analytical ultracentrifuge. Example 7 Crystalline bovine insulin (40000 IU) containing 0.5% by weight of zinc is dissolved in 200 ml of water by adding 3 ml of 1N hydrochloric acid. 700 ml of a solution consisting of 1 g of methyl p-hydroxybenzoate, 16 g of glycerin and 1.4 g of sodium acetate 3H 2 O are added to this solution. Adjust the pH of this solution to 6.9-7.4 using 1N sodium hydroxide solution. average molecular weight
After adding 5 ml of a 0.1% aqueous solution of linear polypropylene glycol having a Dalton of 2000, the mixture is made up to 1000 with water and the solution is sterilized. Example 8 Bovine crystalline de-B1-phenylalanine-insulin (100,000 IU) containing 0.6% by weight of zinc is dissolved in 200 ml of water by adding 3 ml of 1N hydrochloric acid. 2 g of phenol, 17 g of glycerin
and 6.057 g of tri-(hydroxymethyl)-aminomethane (PH
7.6) into this solution. Adjust the pH of this solution to 7.2-7.6. The following formula After adding 10 ml of a 1% aqueous solution of the compound, the mixture is made up to 1000 with water and the solution is sterilized. Example 9 Amorphous bovine insulin (1,000,000 IU) containing 0.8% by weight of zinc is dissolved in 400 ml of water by adding 5 ml of 1N hydrochloric acid. 500 ml of a solution consisting of 2.5 g of phenol, 16 g of glycerin and 1.78 g of Na 2 HPO 4.2H 2 O are added to this solution. Adjust the PH of this solution to 7.2-7.5. Average molecular weight 1.750
After adding 5 ml of a 0.1% aqueous solution of linear polypropylene glycol (Dalton), the mixture is made up to 1000 by adding water and the solution is sterilized. Example 10 A linear chain of polypropylene glycol having an average molecular weight of 1.750 (Dalton) with 5
Bovine insulin (40,000 IU) was purified by chromatography in the presence of a block polymer consisting of 1% polyethylene glycol (copolymerized) and containing 0.6% by weight of zinc in 200 ml of water with the addition of 3 ml of 1N hydrochloric acid. Dissolve in. 700 ml of a solution of 2.5 g of m-cresol, 50 g of glucose, 1.4 g of sodium acetate 3H 2 O and 10 mg of the above block polymer are added to this solution. PH of this solution
is adjusted to 6.9-7.4 using 1N sodium hydroxide solution, the solution is made up to 1000 with water and sterilized. Example 11 Crystalline porcine insulin (40,000 IU) containing 0.6% by weight of zinc was added with 3 ml of 1N HCl and mixed with water.
Dissolve in 200ml. Methyl p-hydroxybenzoate 1g, glycerin 17g, sodium acetate
700 ml of a solution consisting of 1.4 g of 3H 2 O and 10 mg of linear polypropylene glycol with an average molecular weight of 1.750 (Dalton) are added to this solution. PH of this solution
Adjust from 6.9 to 7.4. Add water to this solution
1000 and then sterilized. Example 12 A linear chain of polypropylene glycol having an average molecular weight of 1.750 (Dalton) with 5%
(copolymerized with polyethylene glycol) by one of the conventional chromatographic methods and
Crystalline bovine insulin (450,000 IU) containing 0.5% by weight of zinc is dissolved in 400 ml of 0.03N hydrochloric acid, and a solution consisting of 150 mg of ZnCl2 and 5 mg of block polymer used for chromatography in 100 ml of 0.03NHCl is prepared. Add to this solution. Sterilize this solution, add 70 g of NaCl, sodium acetate 3H 2 O14
g. Mix with 500 ml of a similarly sterilized solution consisting of 5 mg of the block polymer used for chromatography and 10 ml of 1N NaOH aqueous solution. The PH of the mixture is adjusted to 5.4 and the mixture is stirred at room temperature for 48 hours. During this period, insulin crystallizes in rhombohedral shapes. 10.25 g of a sterile solution consisting of 20 g of NaCl, 1.75 g of sodium acetate 3 H 2 O, 11.25 g of methyl p-hydroxybenzoate and 102.5 mg of the block polymer used for chromatography are added to the crystalline suspension. 1N
Adjust the PH to 6.9-7.3 by adding NaOH dropwise. Example 13 Equation Crystalline bovine insulin (40000 IU) purified by one of the conventional chromatographic methods and containing 0.5% by weight of zinc in the presence of the compound
is dissolved in 200 ml of water by adding 3 ml of 1N HCl. A solution consisting of 1 g of methyl p-hydroxybenzoate, 50 g of glucose, 0.175 g of dulfen and 100 mg of the substance used for chromatography.
Add 700ml into this solution. Adjust the pH of this solution to 3.3-3.5 using 1N HCl or 1N NaOH if necessary, and add water to the solution.
1000 and then sterilize. The concentrations of surfactants in Examples 7 to 13 are as follows, and in all Examples, the samples containing surfactants remained transparent for several weeks, with no protein denaturation or decomposition observed. Nakatsuta. Example 7: 5ppm Example 8: 100ppm Example 9: 5ppm Example 10: 10ppm Example 11: 10ppm Example 12: About 100ppm Example 13: 100ppm
Claims (1)
表わし、ｎは２〜80であり、Ｙは―Ｏ―または―
NH―であり、R1はＨ、―CH3または―C2H5で
あり、基R1は同じかまたは相異なつていて鎖構
成員Ｘの少なくとも半分は―CH3または―C2H5
を含むものとし、そしてR2およびR3は相互に独
立して水素あるいは有機基である〕を有するホモ
ポリマー、コポリマーまたはブロツクポリマーで
ある界面活性物質を２〜200ppm含有しているこ
とを特徴とする蛋白水溶液。 ２ ｎが８〜45である前記第１項記載の蛋白水溶
液。 ３ R2およびR3がおのおの１〜20個の炭素原子
を有するアルキル、２〜20個の炭素原子を有する
カルボキシアルキルまたは１〜10個のアルキル炭
素原子を有するアルキルフエニルであるがただし
Ｙが―NH―である場合にはR2は１〜20個の炭素
原子を有するアルキルのみである前記第１項記載
の蛋白水溶液。 ４ R2および／またはR3が多価でありそして２
個もしくはそれ以上のポリアルコキシ鎖―Xoと
結合されて分岐生成物を生じる有機基である、前
記第１項記載の蛋白水溶液。 ５ 式 R2Y―Xo−R3 〔式中Xoは式および 【式】【式】 のｎ個の構成員の任意の所望の順序における鎖を
表わし、ｎは２〜80であり、Ｙは―Ｏ―または―
NH―であり、R1はＨ、―CH3または―C2H5で
あり、基R1は同じかまたは相異なつていて鎖構
成員Ｘの少なくとも半分は―CH3または―C2H5
を含むものとし、そしてR2およびR3は相互に独
立して水素あるいは有機基である〕を有するホモ
ポリマー、コポリマーまたはブロツクポリマーで
ある界面活性物質を２〜200ppm含有し、さらに
等張性の調整、防腐、PH緩衝および／またはデポ
効果の達成のための通常の添加剤を含有している
ことを特徴とする前記第１項記載の蛋白水溶液。 ６ 蛋白がインシユリンである前記第５項記載の
蛋白水溶液。 ７ 蛋白水溶液に式 R2Y−Xo―R3 〔式中Xoは式および 【式】【式】 のｎ個の構成員の任意の所望の順序における鎖を
表わし、ｎは２〜80であり、Ｙは―Ｏ―または―
NH―であり、R1はＨ、―CH3または―C2H5で
あり、基R1は同じかまたは相異なつていて鎖構
成員Ｘの少なくとも半分は―CH3または―C2H5
を含むものとし、そしてR2およびR3は相互に独
立して水素あるいは有機基である〕を有するホモ
ポリマー、コポリマーまたはブロツクポリマーで
ある界面活性物質を２〜200ppmの濃度となるよ
うに添加することを特徴とする蛋白水溶液の製
法。 ８ 蛋白水溶液に式 R2Y―Xo―R3 〔式中、Xoは式および 【式】【式】 のｎ個の構成員の任意の所望の順序における鎖を
表わし、ｎは２〜80であり、Ｙは―Ｏ―または―
NH―であり、R1はＨ、―CH3または―C2H5で
あり、基R1は同じかまたは相異なつていて鎖構
成員Ｘの少なくとも半分は―CH3または―C2H5
を含むものとし、そしてR2およびR3は相互に独
立して水素あるいは有機基である〕を有するホモ
ポリマー、コポリマーまたはブロツクポリマーで
ある界面活性物質を２〜200ppmの濃度となるよ
うに添加し、さらに等張性の調整、防腐、PH緩衝
および／またはデポ効果の達成のための通常の添
加剤を添加することを特徴とする前記第７項記載
の蛋白水溶液の製法。 ９ 蛋白水溶液がインシユリンの重量に基づいて
0.8％までの亜鉛を含有している牛インシユリン、
豚インシユリンあるいは人間インシユリンの水溶
液、あるいはこれらインシユリンの脱―Bl―フ
エニルアラニン誘導体の水溶液である前記第８項
記載の製法。 １０ 等張剤がグリセリン、塩化ナトリウム、グ
ルコースまたは同様の炭水化物であり、防腐剤が
フエノール、クレゾールまたはｐ―ヒドロキシ安
息香酸メチルであり、そしてPH緩衝剤がりん酸ナ
トリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウ
ム、ナトリウムベロナールまたはトリス―（ヒド
ロキシメチル）―アミノメタンである前記第８項
または第９項記載の製法。[Claims] 1 Formula R 2 Y—X o —R 3 [wherein X o represents a chain of the n members of the formula and the formula [Formula] [Formula] in any desired order, and n is 2 to 80, and Y is -O- or -
NH-, R 1 is H, -CH 3 or -C 2 H 5 , the groups R 1 are the same or different and at least half of the chain members X are -CH 3 or -C 2 H Five
and R 2 and R 3 are each independently hydrogen or an organic group. Aqueous protein solution. 2. The aqueous protein solution according to item 1 above, wherein n is 8 to 45. 3 R 2 and R 3 are each alkyl having 1 to 20 carbon atoms, carboxyalkyl having 2 to 20 carbon atoms, or alkyl phenyl having 1 to 10 carbon atoms, provided that Y is 2. The aqueous protein solution according to item 1 above, wherein when -NH-, R 2 is only alkyl having 1 to 20 carbon atoms. 4 R 2 and/or R 3 are polyvalent and 2
2. The aqueous protein solution according to item 1 above, which is an organic group that is bonded to one or more polyalkoxy chains -X o to produce a branched product. 5 Formula R 2 Y―X o -R 3 [wherein X o represents a chain of n members of formula and [formula] [formula] in any desired order, n is 2 to 80, Y is -O- or-
NH-, R 1 is H, -CH 3 or -C 2 H 5 , the groups R 1 are the same or different and at least half of the chain members X are -CH 3 or -C 2 H Five
and R 2 and R 3 are each independently hydrogen or an organic group. 2. The aqueous protein solution according to claim 1, characterized in that it contains customary additives for achieving preservative, PH buffering and/or depot effect. 6. The aqueous protein solution according to item 5 above, wherein the protein is insulin. 7 Protein aqueous solution with the formula R 2 Y−X o −R 3 [where X o represents the formula and a chain of n members of [formula] [formula] in any desired order, and n is 2 to 80 and Y is -O- or-
NH-, R 1 is H, -CH 3 or -C 2 H 5 , the groups R 1 are the same or different and at least half of the chain members X are -CH 3 or -C 2 H Five
and R 2 and R 3 are each independently hydrogen or an organic group] at a concentration of 2 to 200 ppm. A method for producing an aqueous protein solution characterized by: 8 Protein aqueous solution containing the formula R 2 Y―X o ―R 3 [wherein X o represents the formula and a chain of n members of [formula] [formula] in any desired order, and n is 2 to 80 and Y is -O- or-
NH-, R 1 is H, -CH 3 or -C 2 H 5 , the groups R 1 are the same or different and at least half of the chain members X are -CH 3 or -C 2 H Five
and R 2 and R 3 are each independently hydrogen or an organic group] is added to a concentration of 2 to 200 ppm, and 8. The method for producing an aqueous protein solution according to item 7, further comprising adding conventional additives for adjusting isotonicity, preservatives, PH buffering, and/or achieving a depot effect. 9 The protein aqueous solution is based on the weight of insulin.
Bovine insulin, containing up to 0.8% zinc
9. The method according to item 8, which is an aqueous solution of porcine insulin or human insulin, or an aqueous solution of de-Bl-phenylalanine derivatives of these insulins. 10. Isotonic agents are glycerin, sodium chloride, glucose or similar carbohydrates, preservatives are phenol, cresol or methyl p-hydroxybenzoate, and PH buffers are sodium phosphate, sodium acetate, sodium citrate, The method according to the above item 8 or 9, which is sodium veronal or tris-(hydroxymethyl)-aminomethane.
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