JPH01187067A - Oral intake composition - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To form an oral intake composition useful as a healthy food for preventing hypertension and alleviating hypertensive tendency, by using inhibitory peptide of angiotensin converting enzyme derived from casein and egg yolk. CONSTITUTION:An oral intake composition containing a peptide inhibiting angiotensin converting enzyme(ACE for short) obtained by decomposing casein with protease and egg yolk. The peptide inhibiting ACE is usually isolated in the form of powder, blended with egg yolk and used as it is or preferably as a composition in any shape or configuration together with a proper nontoxic carrier for oral administration. Egg yolk of egg of chicken, quail, ostrich, etc., sold in the market can be used as the egg yolk. Total content of the inhibitory peptide of ACE and egg yolk is generally about 1-100wt%. and the ratio of the above-mentioned peptide and the egg yolk is generally about 1:10-3:1.

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、高血圧予防のための健康食品として用いて有
用な経口摂食組成物に関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial Field of Application] The present invention relates to an oral composition useful as a health food for preventing hypertension.

〔従来の技術〕[Conventional technology]

今日、高血圧症は我が国において死亡率の上位を占める
疾病の一つであり、その治療あるいは予防は緊急かつ重
要な課題となっている。Today, hypertension is one of the diseases with a high mortality rate in Japan, and its treatment or prevention has become an urgent and important issue.

高血圧症には二次性高血圧症と本悪性高血圧症とがある
が、前者のうち腎性高血圧症あるいは内分泌性高血圧症
等とさらに後者の本態性高血圧症の発疹、病態に、いず
れも血中活性ペプチド産生系、特にレニン・アンジオテ
ンシン系が深いかかわりを持っていることはよく知られ
ている。このレニン・アンジオテンシン系には、血圧調
節に関与するアンジオテンシンａｍ酵素（＾ｎｇｉｏｔ
ｅｎｓｉｎＣｏｎｖｅｒｔｉｎｇ　Ｅｎｚｙｍｅ、以下
ＡＣＥということがある）が存在しており、該酵素によ
って血管壁平滑筋収縮作用を有するペプチド（アンジオ
テンシン■）が産生されることにより、強い血圧上昇が
もたらされる。There are two types of hypertension: secondary hypertension and malignant hypertension.The former is characterized by renal hypertension or endocrine hypertension, and the latter is essential hypertension. It is well known that active peptide production systems, especially the renin-angiotensin system, are deeply involved. The renin-angiotensin system contains the angiotensin am enzyme (^ngiot), which is involved in blood pressure regulation.
Converting Enzyme (hereinafter sometimes referred to as ACE) exists, and this enzyme produces a peptide (angiotensin) that has a smooth muscle contraction effect on blood vessel walls, resulting in a strong increase in blood pressure.

従って、この酵素活性を阻害すれば、血圧上昇を抑圧す
ること（降圧）が可能となることが考えられ、現にかか
る観点から種々の天然物および合成物について阻害物質
の探索が進めら些、既に合成物についてはプロリン誘導
体化合物のある種のものがその有効性を認められて降圧
剤として実用に供されている。Therefore, if this enzyme activity is inhibited, it may be possible to suppress the increase in blood pressure (lower blood pressure), and from this point of view, the search for inhibitors of various natural and synthetic substances is progressing, and there have already been some studies. Regarding synthetic compounds, certain types of proline derivative compounds have been recognized for their effectiveness and are put into practical use as antihypertensive agents.

一方、天然物からのＡＣＥ阻害物質として最近、牛由来
のカゼインのトリプシン分解物中に阻害ペプチドが存在
することが確認され、単離・精製されている（特開昭５
８−１０９４２５号公報参照）。On the other hand, as an ACE inhibitor derived from natural products, it has recently been confirmed that an inhibitory peptide exists in the tryptic decomposition product of bovine casein, and it has been isolated and purified (Japanese Patent Application Laid-Open No.
8-109425).

これら天然物由来のＡＣＥ阻害物質は、食品あるいは、
食品原料から得られるものであるので、低毒性で安全性
の高い降圧剤となることが期待できるが、なかでもカゼ
イン由来の阻害ペプチドは、安全性、有効性に加えて、
製造面に於いても比較的容易かつ低コストで量産化が可
能と見込まれるところから、その降圧剤としての実用化
が検討されている。These natural product-derived ACE inhibitors can be found in foods or
Since it is obtained from food raw materials, it can be expected to be a low-toxicity and highly safe antihypertensive agent. Among these, casein-derived inhibitory peptides have a high level of safety and efficacy.
In terms of manufacturing, it is expected to be mass-produced relatively easily and at low cost, and its practical use as an antihypertensive agent is being considered.

しかして、生理活性ペプチド類は、−船釣に親水性で比
較的高分子量である為、消化管からの吸収が悪く、また
場合によっては消化管液により分解を受けてその活性を
失うことがあるため、投与経路は多くの場合、注射によ
る静脈内投与に限定されており、上記のカゼイン由来の
ＡＣＥ阻害ペプチドにあってもその例にもれず、従来は
もっばら静脈内投与時の有効性が検討され、その際の血
圧降下作用が確認されているに過ぎない。However, since physiologically active peptides are hydrophilic and have a relatively high molecular weight, they are poorly absorbed from the gastrointestinal tract, and in some cases, they may be degraded by gastrointestinal fluids and lose their activity. Therefore, in many cases, the route of administration is limited to intravenous administration by injection, and this is the case with the casein-derived ACE inhibitory peptides mentioned above. has been investigated, and its blood pressure lowering effect has only been confirmed.

〔発明の解決課題〕 本発明者らは予てより、高血圧症、特に本態性高血圧症
の根本的治癒の困難性に鑑み、血圧の日常的、継続的な
調節（例えば血圧降下作用を有する健康食品の摂取等）
とそれに基づく高血圧症の発症予防、あるいは高血圧傾
向の緩和の重要性に着目し、かかる目的に適用可能な低
毒性でしかも経口投与（摂取）により有効性を発揮する
降圧物質について探索を進めて来たが、前述のカゼイン
由来のＡＣＥ阻害ペプチドのすぐれた特性、特にその低
毒性からしてこれを上記の目的に使用することの可能性
について検討を行ったところ、意外なことに該ペプチド
の経口投与で降圧作用が見られ、更にまた卵黄を併用し
、経口投与することにより更に降圧作用が増強される事
を見い出した。[Problem to be solved by the invention] In view of the difficulty in fundamentally curing hypertension, especially essential hypertension, the present inventors have long been aware of the difficulty of fundamentally curing hypertension. food intake, etc.)
Focusing on the importance of preventing the onset of hypertension or alleviating hypertensive tendencies based on this, we have been searching for antihypertensive substances that can be used for such purposes, have low toxicity, and are effective when administered (ingested) orally. However, when we investigated the possibility of using the above-mentioned casein-derived ACE inhibitory peptide for the above purpose due to its excellent properties, especially its low toxicity, we found that it was unexpectedly possible to use this peptide orally. It was found that a hypotensive effect was observed upon administration, and that the antihypertensive effect was further enhanced by oral administration in combination with egg yolk.

この併用投与は、適度な降圧作用を示し、その低毒性、
高い安全性と相俟ってここに高血圧予防、高血圧傾向緩
和のための健康食品等として有用な経口摂食物の提供が
可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。This combination administration showed moderate hypotensive effect, low toxicity,
The present inventors have discovered that, in combination with high safety, it is possible to provide an oral food that is useful as a health food for preventing hypertension and alleviating hypertension tendencies, and has completed the present invention.

〔発明の構成〕[Structure of the invention]

即ち、本発明はカゼインを蛋白質分解酵素により分解し
て得られるアンジオテンシン転換酵素を阻害するペプチ
ドと卵黄を含存することを特徴とする経口摂食組成物で
ある。That is, the present invention is an orally ingestible composition characterized by containing an egg yolk and a peptide that inhibits angiotensin converting enzyme obtained by decomposing casein with a protease.

本発明に云うカゼイン由来のＡＣＥ阻害ペプチドとして
は、例えば以下に示す如きアミノ酸配列からなるＣＥＩ
＋ｔ、ｃＥＩｓ、あるいはｃＥＩｓ等があり、それらは
単独で、もしくは混合物として用いられる。The casein-derived ACE-inhibiting peptide according to the present invention includes, for example, CEI having the amino acid sequence shown below.
+t, cEIs, cEIs, etc., and these are used alone or as a mixture.

Ｇ　Ｅ　Ｔ　＋ｘ　　：　Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａ
ｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｈ
ｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ ｃＥＩｓｔ　　：　Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−
Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−ＡｒｇＣＥＩ　５　　　：　Ｐｈｅ−
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒ。G E T +x: Phe-Phe-Val-A
la-Pro-Phe-Pro-Glu-Val-Ph
e-Gly-Lys cEIst: Ala-Val-Pro-Tyr-
Pro-Gin-ArgCEI 5: Phe-
Phe-Val-Ala-Pr.

これらＡＣＥ阻害ペプチドのうち、ＣＥＩ＋＊およびｃ
ＥＩｓ、は、牛由来カゼイン（特に後者はβ−カゼイン
）のトリプシン加水分解物から得られ、またＣＥｌ、は
、ＧＥＴ＋ｔのプロリン特異的エンドペプチダーゼ処理
によって得られる。Among these ACE inhibitory peptides, CEI+* and c
EIs are obtained from the tryptic hydrolyzate of bovine casein (particularly the latter β-casein), and CEl is obtained by treatment of GET+t with a proline-specific endopeptidase.

ＣＥＩ＋ｔの調製は、特開昭５８−１０９４２５号公報
等によって公知の方法に準じて例えば以下のようにして
行われる。The preparation of CEI+t is carried out, for example, as follows according to the method known in Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-109425.

生由来カゼイン（α−カゼインまたはβ−カゼイン）を
、Ｐ　Ｈ５，０〜９．０の条件下トリプシンにより分解
し、分解物から加熱処理あるいは酸処理によりトリプシ
ンおよび未分解カゼインを沈降・除去せしめる０次に、
母液を、要すればアルカリで中和し、減圧下に２〜３倍
に濃縮した上、セファデックスＧ−２５等を充填したカ
ラムに添加し、蒸留水で溶出させてＡＣＥ阻害活性を示
す両分を集め、さらに必要に応じて同様の精製を繰返し
た後、活性画分から、例えば減圧濃縮あるいは有機溶媒
添加等の方法によりＣＥＩ＋ｔを取得する。Raw casein (α-casein or β-casein) is decomposed with trypsin under conditions of pH 5,0 to 9.0, and trypsin and undegraded casein are precipitated and removed from the decomposed product by heat treatment or acid treatment. next,
The mother liquor is neutralized with an alkali if necessary, concentrated 2 to 3 times under reduced pressure, and then added to a column packed with Sephadex G-25, etc., and eluted with distilled water. After collecting the fractions and repeating the same purification as necessary, CEI+t is obtained from the active fraction by, for example, vacuum concentration or addition of an organic solvent.

また、ｃＥＩｓ、は、その出発原料がβ−カゼインに限
定されることを除けば、上記のＣＥＩ＋ｚと全く同様に
してこれを調製することができる。Furthermore, cEIs can be prepared in exactly the same manner as CEI+z described above, except that the starting material is limited to β-casein.

この場合、トリプシン分解物中にはｃＥＩｓ７とＣＥＩ
＋＊とが同時に生成してくることになるが、それらはセ
ファデックスカラムクロマトグラフィーにより容易に分
別が可能である。In this case, the tryptic digest contains cEIs7 and CEI.
+* will be produced at the same time, but they can be easily separated by Sephadex column chromatography.

ＣＥ　Ｉｓ　は、ＣＥＫＩ！を原料として例えばアグリ
カルチユラル　アンド　バイオロジカル　ケミス　ト　
リ　−　（＾ｇｒｌｃ、　　　　Ｂｉｏｌ、　　　　Ｃ
ｈｅｗ、）　　、−ゴ１９　　　（５）　　。CE is CEKI! For example, agricultural and biological chemist
Lee - (^grlc, Biol, C
hew,), -go19 (5).

１４０５　（１９８５年）に記載の方法に従って調製す
ることができる。即ち、ＣＥＩ＋ｔを燐酸緩衝液（Ｐ　
Ｈ７，０）中でプロリン特異的エンドペプチダーゼによ
り加水分解し、該ペプチダーゼを除去した後、分解物を
例えばラブイアルーパツク（Ｒａｄｉａｌ−ＰＡＮ　）
　Ｃ−１８カラム（ウォーターズ社製）を用いた高速液
体クロマトグラフィー（溶出液：ｔ４酸緩衝液（ＰＨ３
，０）　／Ｃ１１ｓＣＮ　−６０／４０（ｖ／ｖ））に
付し、活性画分（２１０ｎｍに吸収をもつ両分）を分取
することにより、ＣＥ　Ｉｓが得られる。1405 (1985). That is, CEI+t was mixed with phosphate buffer (P
After hydrolyzing with a proline-specific endopeptidase in H7,0) and removing the peptidase, the decomposition product is processed,
High performance liquid chromatography using a C-18 column (manufactured by Waters) (eluent: t4 acid buffer (PH3)
,0)/C11sCN-60/40 (v/v)) and separating the active fractions (both fractions having absorption at 210 nm), CE Is is obtained.

又、より有利には有機化学的な合成手法を用いることが
できる。Moreover, organic chemical synthesis techniques can be used more advantageously.

以下にＣＥＩ＋ｔの合成法の一例を示す、ここでは、不
溶性担体としてポリスチレン樹脂を用いる固相対称酸無
水物法を利用し、ペプチド合成を行う、なお、ここでは
、アミノ酸はすべてＬ体を意味し、アミノ酸の保護基の
略号はそれぞれ次の残基を表す。An example of the synthesis method for CEI+t is shown below. Here, peptide synthesis is performed using a solid-phase symmetric acid anhydride method using polystyrene resin as an insoluble carrier. Note that all amino acids here mean the L-form. , the abbreviations for amino acid protecting groups represent the following residues, respectively.

Ｂｏｃ　：　ｔａｒｔ、　Ｂｕｔｙｌｏｘｙ−ｃａｒｂ
ｏｎｙｌ基ＰＡＭ　　：　　ｐ−ｍｅｔｈｏｘｙ　　　
ｐｈｅｎｙｌ　　　ａｃｅｔａｓｉｄｏｍａｔｈｌ　　
ｒｅｓｉｎＢ２１：ベンジル基 ２　　：ペンジルオキシカルボニル基 Ｔｏｓ：ｐ−）リルスルホニル基 ＡＡ”：ｎ番目のアミノ酸 ポリスチレン樹脂に架橋されたＡＡ’　（ＡＡ’−ＰＡ
Ｍ）をＴＦＡにより、脱保護基反応により、Ｈ−ＡＡ’
−ＰＡＭを合成し、それにＢｏｃ−Ａ　Ａ”−ＯＨをジ
クロルメタン中でＤＣＣを用いをジメチルホルムアミド
中で縮合させ、Ｂｏｃ−ＡＡ”−ＡＡ’−ＰＡＭを合成
し、未反応のＡＡ’−ＰＡＭを無水酢酸を用い、キャン
ピングする。Boc: tart, Butyloxy-carb
onyl group PAM: p-methoxy
phenyl acetasidomathl
resinB21: benzyl group 2: penzyloxycarbonyl group Tos: p-)lylsulfonyl group AA": n-th amino acid AA'(AA'-PA
M) was converted to H-AA' by deprotection reaction with TFA.
-PAM was synthesized, and Boc-A A''-OH was condensed with DCC in dichloromethane in dimethylformamide to synthesize Boc-AA''-AA'-PAM, and unreacted AA'-PAM was synthesized. Camping using acetic anhydride.

得られたＢｏ　ｃ−ＡＡ”−ＡＡ’−ＰＡＭを再びＴＦ
Ａを用い、脱保護基反応を行ない、同様にしてＢＯｅ−
ＡＡ３−ＯＨを縮合し、以下同様にしてＡ　Ａ　１　ｇ
まで縮合反応を行なう、なお、用いるアミノ酸側鎖の官
能基は以下の様に封鎖してお（。The obtained Boc-AA''-AA'-PAM was transferred to TF again.
A was used to carry out the deprotection reaction, and BOe-
AA3-OH is condensed and A A 1 g is obtained in the same manner.
The condensation reaction is carried out up to the point where the functional groups of the amino acid side chains used are blocked as shown below (.

Ａｒｇ　（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ　（０−Ｂｚｌ）。Arg (Tos), Asp (0-Bzl).

Ｃｙｓ（４−Ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｙｌ）、Ｇ１　ｕ　
（０−Ｂｚ　１）　。Cys(4-Methylbenzyl), G1 u
(0-Bz 1).

Ｌ　ｙ　ｓ　（２−Ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｏｘｙ　
　ｃａｒｂｏｎｙｌ　）　。Lys (2-Chlorophenyloxy
carbonyl).

Ｓｅｒ　　（Ｂｚ　１）、Ｔｈｒ　（Ｂ２１）、Ｔｒｙ
（２−Ｂｒｏｓｏｐｈｅｎｙｌｏｘｙ　　ｃａｒｂｏｎ
ｙｌ）＋　Ｈｉ　ｓ　（Ｔ　ｏ　ｓ　）縮合反応終了後
、ＨＦを用い脱保護基反応を行ない、Ｂｏｃ及びＰＡＭ
、側鎖の保護基を除き、Ｈ−ＡＡ”・・・・−・−・・
・・−・・−・−・・−・−・・・・ＡＡ’−ＯＨを得
る。Ser (Bz 1), Thr (B21), Try
(2-Brosophenyloxy carbon
yl)+His(Tos) After the condensation reaction, a deprotection reaction is performed using HF, and Boc and PAM
, excluding the side chain protecting group, H-AA"...--...
・・・・・−・−・・−・−・・ Obtain AA'-OH.

ここでＡＡ’−Ｌｙｓ、ＡＡ”−Ｇｌｙ、ＡＡ”ｗＰｈ
ｅ、ＡＡ’−Ｖａ　ｌ、ＡＡ’−Ｇｌ　ｕ。Here AA'-Lys, AA"-Gly, AA"wPh
e, AA'-Val, AA'-Glu.

ＡＡ’−Ｐｒｏ、ＡＡ’−Ｐｈｅ、ＡＡ”＝Ｐｒｏ。AA'-Pro, AA'-Phe, AA''=Pro.

ＡＡ’＝Ａ　Ｉ　ａ、ＡＡ’・−Ｖａ　１．ＡＡ”−Ｐ
ｈ　ｅ。AA'=AI a, AA'・-Va 1. AA”-P
h e.

ＡＡ”ｗＰｈｅを示す。AA”wPhe is shown.

また、これらを混合物として大量の試料を得る為には、
トリプシン分解後、その分解液をポアサイズＭＷ−８，
０００以下の透析膜により透析し、透析液をそのままあ
るいは、濃縮・凍結乾燥等の操作を行えばよい。In addition, in order to obtain a large amount of samples as a mixture of these,
After trypsin digestion, the decomposition solution was diluted with pore size MW-8,
Dialysis may be performed using a dialysis membrane of 000 or less, and the dialysate may be used as it is or subjected to operations such as concentration and freeze-drying.

卵黄は、市販の鶏あるいはウズラ（ｎ）、だちょう等の
卵の黄身を用いればよい。As the egg yolk, commercially available chicken, quail (n), ostrich, or other egg yolk may be used.

以上の如きカゼイン由来のＡＣＥ阻害ペプチド類は、通
常粉末の形で単離・取得した上、卵黄と共にこれを混合
したものをそのまま、もしくはより好適には適当な無毒
性の経口投与（摂取）用担体と共に適宜の形状、形態か
らなる組成物として経口摂食用に供する。The above-mentioned casein-derived ACE inhibitory peptides are usually isolated and obtained in powder form, and mixed with egg yolk as is, or more preferably, for oral administration (ingestion) in an appropriate non-toxic form. It is provided for oral consumption as a composition in an appropriate shape and form together with a carrier.

組成物の例としては、ＡＣＥ阻害ペプチドと卵黄を、薬
学的に許容される担体（賦形剤、滑沢剤、結合剤、着色
剤、矯味剤、賦香剤等）と共に、経口投与用の製薬製剤
の形態、例えば錠剤（糖衣錠、発泡錠、フィルムコート
錠、咀明錠等）、カプセル剤、トローチ剤、粉末側、細
粒剤、顆粒剤等としたものが挙げられる。Examples of compositions include ACE inhibitory peptides and egg yolk, together with pharmaceutically acceptable carriers (excipients, lubricants, binders, colorants, flavoring agents, flavoring agents, etc.) for oral administration. Pharmaceutical formulations include, for example, tablets (sugar-coated tablets, effervescent tablets, film-coated tablets, chewable tablets, etc.), capsules, troches, powders, fine granules, granules, and the like.

また、固形あるいは液状の食品ないしは嗜好品、例えば
菓子類、粉末茶、アイスクリーム、ヨーグルト、アルコ
ール飲料、スポーツ飲料等の形態としてもよい。It may also be in the form of solid or liquid foods or luxury goods, such as confectionery, powdered tea, ice cream, yogurt, alcoholic beverages, sports drinks, and the like.

経口摂食物中に於けるＡＣＥ阻害ペプチドと卵黄との合
計の含有量は剤型により適宜選択が可能であるが一般に
は１〜１００重量％の範囲である。The total content of the ACE inhibitory peptide and egg yolk in the oral food can be appropriately selected depending on the dosage form, but is generally in the range of 1 to 100% by weight.

又、上記ペプチドと卵黄との含有比率は一般的にはｌ：
１０〜３：１の範囲にある。In addition, the content ratio of the above peptide and egg yolk is generally l:
It is in the range of 10-3:1.

以上の如き構成からなる本発明の経口摂食物は、後に試
験例で示す通り、その有効成分たるカゼイン由来のＡＣ
Ｅ阻害ペプチドと卵黄が、経口投与によってもかなりの
降圧作用を示し、しかも著しく低毒性であることから、
それを高血圧傾向緩和あるいは血圧調節を目的として、
継続的に経口投与（摂取）することが可能であり、高血
圧予防のための健康食品等として用いてその有効性が期
待できる。As shown in test examples later, the oral food of the present invention having the above-mentioned structure has AC derived from casein as its active ingredient.
E-inhibiting peptide and egg yolk exhibit considerable antihypertensive effects even when administered orally, and their toxicity is extremely low.
For the purpose of alleviating hypertension tendency or regulating blood pressure,
It can be orally administered (ingested) continuously and is expected to be effective when used as a health food for preventing hypertension.

かかる目的に本発明の経口摂食物を用いる場合、その摂
取量は、活性成分のＡＣＥ阻害ペプチドがＣＥｌｌｔＣ
後に示す通り、そのＡＣＥ阻害活性（ＩＤｓ。）は７７
μＭである〕である時には、該ペプチドの重量に換算し
て成人男子１日当たり０．０５〜３０　ｍ　ｇ　／　Ｋ
　ｇ体重の範囲が適当であり、ＣＥ１＋富以外のペプチ
ドについては、上記のＣＥＩ＋ｘの摂取量を基準として
、各々の阻害活性（１０ｓ。）ないしは純度、あるいは
腸管吸収性等に応じて適宜の範囲が選択される。一方、
卵黄は０、０　Ｏ５ｇ〜２ｇ／Ｋｇ体重の範囲が好まし
い。When the oral food of the present invention is used for such purposes, the intake amount is such that the active ingredient ACE inhibitory peptide is CElltC.
As shown later, its ACE inhibitory activity (IDs) is 77
[mu]M], when the weight of the peptide is converted to 0.05 to 30 mg/K per adult male per day.
g body weight is appropriate, and for peptides other than CE1 + rich, an appropriate range is determined based on the above intake of CEI + selected. on the other hand,
The egg yolk is preferably in the range of 0.0 O5g to 2g/Kg body weight.

以下に本発明経口摂食物の活性成分たるカゼイン由来の
ＡＣＥ阻害ペプチドの製造例とそれらペプチド及び卵黄
との併用投与が有効であることを示す動物実験（血圧降
下試験および急性毒性試験）の結果を挙げる。Below are examples of the production of casein-derived ACE inhibitory peptides, which are the active ingredients of the oral food of the present invention, and the results of animal experiments (hypertension lowering test and acute toxicity test) showing that the combined administration of these peptides and egg yolk is effective. List.

なお、ＡＣＥ阻害ペプチドの活性（ＩＤｓｏ）は、以下
の方法によって測定したものである。Note that the activity (IDso) of the ACE inhibitory peptide was measured by the following method.

（ＡＣＥ阻害ペプチドのＡＣＥ阻害活性の測定〕ｉ）ア
ンジオテンシン転換酵素液（ＡＣＥ液）の調製 ５ｇのラビットラング７セントパウダー（シグマ社製）
を５０ｍｊ！の０．１　Ｍホウ酸緩衝液（ＰＨ８，８）
に溶解し、４０．　０００　ｘ　ｇ、　　４０分の条件
下で遠心処理し、その上清液をさらに、上記緩衝液で、
１０倍に稀釈し、アンジオテンシン転換酵素液を得た。(Measurement of ACE inhibitory activity of ACE inhibitory peptide) i) Preparation of angiotensin converting enzyme solution (ACE solution) 5 g of Rabbit Lang 7 cent powder (manufactured by Sigma)
50mj! 0.1 M borate buffer (PH8,8)
Dissolve in 40. Centrifugation was performed at 000 x g for 40 minutes, and the supernatant was further diluted with the above buffer.
It was diluted 10 times to obtain an angiotensin converting enzyme solution.

ｉｉ）活性の測定 試料を試験管に０．０３　ｍ　ｌ入れ、これに基質とし
て、２５０μｍのヒプリルーし一ヒスチジルーし一ロイ
シン（シグマ社（Ｓｌｇｍａ、　　Ｃｏ、）製、最終濃
度５　ｍＭ、　ＮａＣ１３００ｍＭを含む、〕を添加し
、３７℃で１０分間保温後、上記酵素液を０、１　ｍ　
ｊ添加し、３７℃で３０分間反応させた。ii) Place 0.03 ml of the activity measurement sample into a test tube, and add 250 μm of Hyplylu, Histidyl, Leucine (manufactured by Sigma, Co., Ltd., final concentration 5 mM, containing 1300 mM NaC) as a substrate. ,] was added and kept at 37°C for 10 minutes.
j was added, and the reaction was carried out at 37°C for 30 minutes.

その後、ＩＮ塩酸０．２５　ｍ　ｊを添加して反応を停
止させた後、ｉ、　ｓ　ｍ　ｓの酢酸エチルを加え、１
５秒間激しく攪拌した。その後、３．５０Ｏｒｐｍで１
５分間遠心して、酢酸エチル層１ｍＡを採取した。その
酢酸エチル層を１２０ｔで３０分間加熱し、溶媒を除去
した。溶媒除去後、蒸留水１ｍｊを添加し、抽出された
ヒプリル酸の吸収（２２８ｎｍの吸光度）を測定し、こ
れを酵素活性とした。Then, the reaction was stopped by adding 0.25 m j of IN hydrochloric acid, and then i, s m s of ethyl acetate was added, and 1
Stir vigorously for 5 seconds. After that, 1 at 3.50Orpm
After centrifugation for 5 minutes, 1 mA of ethyl acetate layer was collected. The ethyl acetate layer was heated at 120t for 30 minutes to remove the solvent. After removing the solvent, 1 mj of distilled water was added, and the absorption of the extracted hyperlic acid (absorbance at 228 nm) was measured, which was taken as the enzyme activity.

阻害率は、次式より算出した。The inhibition rate was calculated using the following formula.

阻害率−Ａ−Ｂ／ＡｘｌＯＯ％ Ａ：阻害剤を含まない場合の２２８ｎｍの吸光度 Ｂ；阻害剤添加の場合の２２８ｎｍの吸光度　・そして
、阻害率５０％の時の阻害濃度をＩｎ５ｏとする。Inhibition rate-A-B/AxlOO% A: Absorbance at 228 nm when no inhibitor is included B; Absorbance at 228 nm when inhibitor is added - And the inhibitory concentration when the inhibition rate is 50% is In5o.

製造例１ ５０リフトルジャーファメンタ−（ミツワ製）に牛由来
カゼイン（和光純薬製、生化学用）２．５Ｋｇを３５リ
ツトルのＨｌＯに懸濁し、アンモニア水（和光製、２５
％ＮＨ，ＯＨ）によってＰＨを７．６に調整する。３７
℃に保温しトリプシン（シグマ製トリプシンＥＣ３，４
，２１，４牛膵臓由来Ｔｙｐｅｌ１１）　６．２５　ｇ
を加え、攪拌しながら１８時間消化を行った。Production Example 1 2.5 kg of bovine-derived casein (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., for biochemical use) was suspended in 35 liters of H1O in a 50-liter jar fermenter (manufactured by Mitsuwa), and aqueous ammonia (manufactured by Wako, 25
%NH,OH) to 7.6. 37
Incubate at ℃ and trypsin (Sigma Trypsin EC3, 4)
,21,4 bovine pancreas-derived Type11) 6.25 g
was added, and digestion was carried out for 18 hours while stirring.

消化液にｃｏｎｃＨＣ１を加え、Ｐ　Ｈ１，０とし、未
反応Ｃａ５ｅｉｎ等を沈澱させた。これを１０．００Ｏ
ｒｐｍ、４℃で連続遠心分離を行い、沈澱物を除いた後
、上澄液を透析チューブ（スペクトラ、ボア６　分画分
子量１．０００）を用いて流水下にて室温で透析を行っ
た。チューブのシールは、スペクトラ製のクローサーで
行った。透析の終点は、透析チューブ内液の伝導度が４
　ｍ　ｓ　／　ｃ　ｍ以下に低下した時とした。（通常
３〜４ｈｒ必要）透析液を１０．００Ｏｒｐｍ、ｆｏｒ
　　１５ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、不溶物を除いた後
、凍結乾燥を行いペプチド９４０ｇを得た。ConcHC1 was added to the digestive fluid to adjust the pH to 1.0 to precipitate unreacted Ca5ein and the like. This is 10.00O
After continuous centrifugation at rpm and 4°C to remove the precipitate, the supernatant was dialyzed at room temperature under running water using a dialysis tube (Spectra, bore 6, molecular weight cut off 1.000). The tube was sealed with a Spectra closer. The end point of dialysis is when the conductivity of the fluid inside the dialysis tube is 4.
It was defined as when it decreased to below m s/cm. (Usually 3 to 4 hours are required) The dialysate is heated to 10.00 Orpm for
After centrifugation at 4° C. for 15 minutes to remove insoluble matter, lyophilization was performed to obtain 940 g of peptide.

透析前後におけるＡＣＥ阻害活性成分の回収率は９５％
と良好であり、また脱塩も９０％以上達成できた０本ペ
プチドはＣＥＩ＋ｔとＣＥＩβ、を主体とするＡＣＥ阻
害ペプチドであり、ＩＤ５ｓ−２、５ｍ　ｇ　／　ｍ　
ｊである。Recovery rate of ACE inhibitory active ingredient before and after dialysis is 95%
The peptide that achieved 90% or more desalination was an ACE inhibitory peptide mainly consisting of CEI+t and CEIβ, ID5s-2, 5mg/m
It is j.

次に製造例１で得たペプチドの降圧作用について試験し
た。Next, the antihypertensive effect of the peptide obtained in Production Example 1 was tested.

試験例１ 製造例１で得たペプチドと卵黄を併用経口投与させ、４
週間飼育した時の降圧作用 ＋１）試験方法 １２週齢の自然発症高血圧ラット（日本チャールズ・リ
バー社）２０匹を温度２３±２℃、湿度５５±５％の動
物室に収容し、水および飼料（オリエンタル酵母社製、
ＭＦ）を自由に摂食させた。Test Example 1 The peptide obtained in Production Example 1 and egg yolk were orally administered together.
Antihypertensive effect when kept for a week + 1) Test method Twenty 12-week-old spontaneously hypertensive rats (Charles River Japan) were housed in an animal room with a temperature of 23 ± 2°C and a humidity of 55 ± 5%, and were provided with water and feed. (manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.,
MF) were fed ad libitum.

ラットは、週に一度血圧を測定しながら２週間にわたっ
て馴化飼育したのち、高血圧を発症したところで実験に
供した。The rats were acclimatized for two weeks while having their blood pressure measured once a week, and then subjected to the experiment when they developed hypertension.

即ち、製造例−１で得られたペプチドの投与量が２．４
　ｇ−／　Ｋ　ｇ体重／　ｄ　ａ　ｙになるように被験
試料を生理食塩水に溶解したちの約６　ｍ　ｌを胃ゾン
デにて毎日強制経口投与した（ペプチド溶液群）同様に
、製造例−１で得られたペプチドの投与量が２．４　ｇ
　／　Ｋ　ｇ体重／　ｄ　ａ　ｙ　、鶏卵黄の投与量が
７．２　ｇ　／　Ｋ　ｇ体重／　ｄ　ａ　ｙになるよう
にペプチドを３０％卵黄液（卵黄を生理食塩水中に畦濁
させたもの）に溶解したちの約６ｍｌを胃ゾンテにて毎
日強制経口投与した（ペプチド溶液・卵黄群）。That is, the dose of the peptide obtained in Production Example-1 was 2.4
The test sample was dissolved in physiological saline at a concentration of g-/Kg body weight/day, and approximately 6 ml of the solution was forcibly administered orally every day using a stomach tube (peptide solution group). The dose of peptide obtained in step 1 was 2.4 g.
/ Kg body weight/day, and the peptide was added to 30% egg yolk solution (egg yolk suspended in physiological saline) so that the dose of chicken egg yolk was 7.2 g/Kg body weight/day. Approximately 6 ml of the solution was forcibly administered daily through a gastric tube (peptide solution/egg yolk group).

また、鶏卵黄の投与量が７．２　ｇ　／　Ｋ　ｇ体重／
ｄａｙになるように３０％卵黄液（卵黄を生理食塩水中
に懸濁させたもの）約６ｍｊｌを胃ゾンテにて毎日強制
経口投与した（卵黄液群）。Also, the dosage of chicken egg yolk is 7.2 g/Kg body weight/
Approximately 6 mjl of 30% egg yolk solution (egg yolk suspended in physiological saline) was forcibly administered orally every day using a gastric tube (egg yolk solution group).

その他は馴化飼育と同じ条件で４週間飼育した。The animals were otherwise reared for 4 weeks under the same conditions as the acclimatization rearing.

血圧測定は、１週間に一度行った。Blood pressure measurements were performed once a week.

血圧測定は、それぞれ無加温・非観血的ラット血圧形（
トーイデン製、ＤＳＲ８０１Ａ＞を用い、ｔａｉｌ−ｃ
ｕｆｆ法で各ラットの最高血圧値を連続１０回測定し、
その平均値を求めることにより行った。Blood pressure measurement was performed using a non-heated, non-invasive rat blood pressure type (
Tail-c using Toiden DSR801A>
The systolic blood pressure value of each rat was measured 10 times in a row using the uff method,
This was done by finding the average value.

結果は１群５匹の平均値で示した。The results are shown as the average value of 5 animals per group.

（２）試験結果 第１図に血圧測定結果を示す。(2) Test results Figure 1 shows the blood pressure measurement results.

第１図から明らかな通り、本発明方法のＡＣＥＩ阻害ペ
プチドは、卵黄とともに併用投与することによって単独
で投与するよりも降圧効果が優れていることがわかる。As is clear from FIG. 1, it can be seen that the ACEI-inhibiting peptide of the present invention has a better antihypertensive effect when administered together with egg yolk than when administered alone.

又、体重変化や臓器重量の変化は、コントロールと同等
であり安全面でも良好である事を確認した。In addition, the changes in body weight and organ weights were the same as in the control, confirming safety.

試験例２　急性毒性試験 （１１試料 各ＡＣＥ阻害ペプチドの１０％水溶液を試料とした。（
卵黄は安全性が確認されているので記載を省略する。） ［２）実験動物 動物：ＩＣＲ系マウス（日本タレア） 供試数：雌雄各２０匹 試験開始時の体重：雄２４〜２６ｇ 雌２２〜２４ｇ 期間中の飼育条件：温度２２±２℃ 湿度５０±５％ 固型試料 （ＣＥ　−２、日本タレア） 水道水を自由摂取 （３）試験方法 動物は１週間予備飼育した後に、１群１０匹として実験
に供した。投与前１６時時間量させ実験群には試料３ｇ
／Ｋｇ胃ゾンデを使って強制的に経口投与した。Test Example 2 Acute toxicity test (11 samples A 10% aqueous solution of each ACE inhibitory peptide was used as the sample. (
Egg yolk is omitted because its safety has been confirmed. ) [2) Experimental animals Animals: ICR mice (Nippon Talea) Number of samples: 20 males and 20 females Weight at start of test: Males 24-26g Females 22-24g Breeding conditions during the period: Temperature 22±2℃ Humidity 50 ±5% Solid sample (CE-2, Nippon Talea) Ad libitum intake of tap water (3) Test method After preliminarily rearing the animals for one week, they were subjected to experiments in groups of 10 animals. The experimental group received 3 g of sample at 16 hours before administration.
/Kg was forcibly administered orally using a gastric tube.

投与後７日間、動物の生死と一般症状について毎日観察
を行った。For 7 days after administration, the animals were observed daily for survival and general symptoms.

（４）試験結果 試験結果を第３表に示す、第３表に示した通り、動物の
死亡は全く無かった。一般症状として衰弱、るいそう、
虚脱、うずくまり、腹這い、横臥、体色変化、皮膚温変
化、発汗、立毛、脱毛、毛の汚染、呼吸数増減、不整呼
吸、喘鳴等についても観察したが、まった（変化は無か
った。(4) Test results The test results are shown in Table 3. As shown in Table 3, there was no death of any animals. General symptoms include weakness, fatigue,
We also observed collapse, crouching, crawling on stomach, lying down, change in body color, change in skin temperature, sweating, piloerection, hair loss, contamination of hair, increase/decrease in respiratory rate, arrhythmia, wheezing, etc., but no changes were found.

第　　３　　表 あることからして、本発明のＡＣＥ阻害ペプチドが掻め
て安全性の高いものであることが明らかである。From Table 3, it is clear that the ACE inhibitory peptide of the present invention is highly safe.

（発明の効果） 本発明により安全性が高く、有効性の高い降圧用の経口
摂食組成物の提供が可能となった。(Effects of the Invention) The present invention has made it possible to provide a highly safe and highly effective oral feeding composition for lowering blood pressure.

以下実施例を示す。Examples are shown below.

なお実施例中の部とは、すべて重量部を意味する。Note that all parts in the examples mean parts by weight.

実施例１　アイスクリーム 脱脂粉乳　　　　　　　　　　８．０％植物脂肪　　　
　　　　　　１０．０ 砂１ｉ　　　　　　　　　　　　１３．０安定剤　　　
　　　　　　　　０．３ 乳化剤　　　　　　　　　　　０．３ バニラフレーバー　　　　　　０．１ 製造例１のペプチド　　　　　５．０ 卵黄　　　　　　　　　　　　７．５ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５．８
通常の製造法にて作成した。（１０，０ｇ／カップ）実
施例２　ヨーグルト 牛乳　　　　　　　　　　　６４．０ 全乳　　　　　　　　　　　　４・Ｏ 脱脂粉乳　　　　　　　　　　５．０ グラニュー＄１７．０ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０
通常の製造法にて作成した。　　（１０，０ｇ　／　ｃ
　ｕ　ｐ　）週 第１図 手続補正書（方式） ％式％ ２、発明の名称 経口摂食組成物 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　東京都墨田区墨田五丁目１７番４号名称　（０９
５）鐘紡株式会社 〒５３４　　大阪市部島区友淵町１丁目５番９０号鐘紡
株式会社特許部 ４、補正命令の日付 平成　１年　３月　７日（発送臼） ５、補正により増加する発明の数　　　な　し６、補正
の対象 明細書「図面の簡単な説明」の欄 ７、補正の内容 （１）明細書第２０頁実施例２の記載後に、次の「４、
図面の簡単な説明」の項を追加挿入する。Example 1 Ice cream skim milk powder 8.0% vegetable fat
10.0 Sand 1i 13.0 Stabilizer
0.3 Emulsifier 0.3 Vanilla flavor 0.1 Peptide of Production Example 1 5.0 Egg yolk 7.5 Water 55.8
It was created using a normal manufacturing method. (10.0g/cup) Example 2 Yogurt milk 64.0 Whole milk 4.0 Skimmed milk powder 5.0 Granulated $17.0 Water 10.0
It was created using a normal manufacturing method. (10,0g/c
u p ) Weekly Figure 1 Procedural Amendment (Method) % Formula % 2. Name of the invention Oral ingestion composition 3. Relationship with the person making the amendment Patent applicant address 17-4 Sumida 5-chome, Sumida-ku, Tokyo Issue name (09
5) Kanebo Co., Ltd. 1-5-90 Tomobuchi-cho, Bejima-ku, Osaka 534, Patent Department 4, Date of amendment order: March 7, 1999 (Shipping mortar) 5. Inventions increased by amendment No. 6, Column 7 of "Brief explanation of drawings" in the specification to be amended, Contents of amendment (1) After the description of Example 2 on page 20 of the specification, the following "4.
Insert additional section "Brief explanation of drawings".

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

第１図は試験例１の血圧測定結果を示す図である。 FIG. 1 is a diagram showing the blood pressure measurement results of Test Example 1.

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）カゼインを蛋白質分解酵素により分解して得られ
るアンジオテンシン転換酵素を阻害するペプチドと卵黄
を含有することを特徴とする経口摂食組成物(1) An orally ingestible composition characterized by containing an egg yolk and a peptide that inhibits angiotensin converting enzyme obtained by decomposing casein with a protease.