JPH01165964A - 腫瘍関連抗原の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、生物学的流体中の潜在腫瘍関連（ＣＴＡ）抗
原の検出のためのイムノアッセイ法に関する。さらに詳
しくは、本発明は、ＣＴ　Ａ抗原を試験する前に試料を
ノイラミニダーゼで処理して腫瘍関連エビ！・−プを露
出（ｕｎｍａｓｋ）さぜることを特徴とする、体液中の
ＣＴ　Ａ抗原の検出のためのイムノアッセイ法に関する
。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）腫瘍
関連抗原の診断的イムノアッセイ法は技術の分野でよく
知られている。たとえば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、α
−フェトプロティン（ＡＦＰ）、ＣＡ　１．２５、ＣＡ
］、９−９およびＣＡ１．５−３などの種々の腫瘍関連
抗原の検出のためのイムノアラセイ法か商業的に利用さ
れている。これらのイムノアッセイ法では、血清、血漿
または尿などの生物学的流体中の腫瘍関連抗原の存在を
検出する。

現在入手可能なアッセイ法に関連する問題点の一つは、
これらのアッセイ法では疾患の非常に初期の段階におい
て腫瘍関連抗原を検出することができないということで
ある。他の問題点は、イムノアッセイ法の多くが、すべ
ての試料中の特定の抗原を検出するに充分なほど感受性
がなくまた特異的でないということである。従って、入
手可能なアッセイ法の多くは、患者管理のための手段と
してまたは調査に使用するために、知られた癌患者にお
いて特定の抗原レベルをモニターするためにのみ用いら
れている。それゆえ、疾患の初期の段階で腫瘍関連抗原
を検出することができる新規なアッセイ手順を開発する
こと、およびこれらのイムノアッセイ法の特異性および
感受性を向上させることが強く望まれている。

ダルボウ（Ｄａｌｂｏｗ）らの米国特許第４．１１６．
７７６号明細書には、悪性新生細胞がヒト絨毛性性腺刺
激ホルモン（ｂＣＧ）を合成し循環器系に分泌すること
が教示されており、糖タンパク質は宿主のリンパ球によ
り捕集され吸着されている。ダルボウらは、従来技術で
は血液の間違ったフラクション、すなわちリンパ球では
なく血清を試験していたので感受性が充分でなかったと
述べている。ダルボウらは、血液試料から白血球を単離
し、ノイラミニダーゼで前処理したあとｈＣＧの存在に
ついで試験することを特徴とするｈＣＧの検出の改良法
を開示している。

同様に、クルター・コーポレーション（Ｃｏｕｌｔｅｒ
　　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のＰＣＴ特許出願第Ｗ○
８７１０１３９２号明細書には、ノイラミニダーゼを用
いて抗原決定基部位からシアル酸を除くことにより病原
試料中のヒト癌腫腫瘍抗原の検出が性能が向上すること
が開示されている。タルポウらの特許の場合のように、
クルターは腫瘍抗原の存在のアッセイの前に細胞または
組織調製物をノイラミニダーゼで処理することを教示し
ている。

（課題を解決するだめの手段） 本発明は、血清、血漿、胸膜浸出液、痰、尿、乳頭分ｄ
・物、糞便などの体液中の潜在腫瘍関連（ＣＴＡ）抗原
の検出のための改良法に関する。本発明の方法では、細
胞を前辺て調製する必要なく試料をノイラミニダーゼ処
理する。ノイラミニダーゼ処理によりシアル酸が除かれ
てＣＴＡエピ！・−プが露出し、抗体試薬との反応のた
めにＣＴＡ抗原を遊離させるので高感受性で高特異性の
イムノアッセイ法か提供される。

さらに詳しくは、本発明は、（ａ）体液試料をノイラミ
ニダーゼで処理することによって潜在腫瘍関連抗原に特
異的な抗体との反応のために該潜在腫瘍関連抗原を完全
に遊離させ、ついで（ｂ）潜在腫瘍関連抗原のためのイ
ムノアッセイにより上記ノイラミニダーゼ処理試料を試
験する ことを特徴とする、体液試料中の潜在腫瘍関連抗原の検
出方法である。

本発明はまた、体液試料中の潜在腫瘍関連抗原の検出方
法であって、 （ａ）１在腫瘍関連抗原に特異的な抗体を固相」二に吸
着させ、 （ｂ）試料をノイラミニダーゼで処理し、（ｃ）抗体コ
ーティング固相に上記試料を加えてインキュベートし、 （ｃｌ）固相を洗浄して未反応の試料を除き、（ｅ’）
潜在腫瘍関連抗原に特異的な標識抗体を加えてインキュ
ベートし、 （ｆ）固相を洗浄して未反応の標識抗体を除き、ついで （ｇ）標識を検出して試料中の腫瘍関連抗原の存在また
は量を測定する ことを特徴とする方法に関する。

本発明はさらに、体液試料中の潜在腫瘍関連抗原の検出
方法であって、 （ａ）試料をノイラミニダーゼで処理し、（ｂ）腫瘍関
連抗原に特異的な標識抗体を試料に加えてインキュベー
トし、 （ｃ）腫瘍関連抗原をコーティングした固相を試料に加
えてインキュベートし、 （ｄ）固相を液相から分離し、ついで （ｅ）固相」−の標識を検出して試料中の腫瘍関連抗原
を測定する ことを特徴とする方法に関する。

（発明の構成および効果） 本発明によるＣＴＡ抗原の検出の改良法において、ＣＴ
Ａ抗原を露出させるために血清、血漿、全血、尿または
胸腺浸出液などの体液をノイラミニダーゼで処理する。

本明細書において「潜在腫瘍関連抗原」またはｒＣＴＡ
抗原」とは、シアル酸による妨害のために該抗原に特異
的な抗体と完全に反応することが妨げられているような
腫瘍関連抗原を意味する。この場合、シアル酸は、ＣＴ
Ａ抗原に付着しているか、または該抗原とある種の抗体
との結合を妨害するように特異的なＣＴＡエピトープに
空間的に極めて近接して位置している。

−担シアル酸がノイラミニダーゼ処理により除かれると
、ＣＴＡ抗原はイムノアッセイ手順において抗体と自由
に反応することができる。アッセイは同種または異種の
形態であってよい。すなわち、腫瘍関連抗原を検出する
ために、固相および標識相上に同種または異種の抗体を
用いてよい。さらに、アッセイは直接アッセイまたは競
合アッセイの形にすることもできるし、１工程アツセイ
または好ましくは２もしくはそれ以上の工程のアッセイ
にすることもできる。

１工程アツセイにおいては、腫瘍関連抗原に特異的な抗
体（ポリクローナルまたはモノクローナル）を、当業者
にはよく知られているようにポリスチレンビーズ、微細
粒子、ウェル、ストリップ、プレートまたは他の適当な
プラスチックまたは紙の固体支持体などの固相上に吸着
させるかまたは共有結合的に結合させる。固相抗体は、
以下、アンカー抗体と称する。第一のインキュベーショ
ンにおいて、アンカー抗体は体液試料中の特定の腫瘍関
連抗原を結合させるために用いる。試料は第一のインキ
ュベーションと同時にノイラミニダーゼで処理すること
ができる。たとえは、試料をアンカー抗体に加え、第一
の工程でノイラミニダーゼで処理する。別の方法として
は、アンカー抗体とインキュベートする前に試料をノイ
ラミニダーセで前以て処理する。

つきに、アンカー抗体により結合しなかった試料中の抗
原および残留している血清成分およびノイラミニダーゼ
を洗浄により除く。ついで試料中の腫瘍関連抗原を標識
プローブ抗体ととの第二のインキュベーションで反応さ
せる。標識プローブ抗体は、アンカー抗体と同じであっ
ても異なるものであってもよい。本発明のアッセイに有
用な標識としては、酵素標識、放射性同位元素標識、蛍
光標識、および検出可能なジグプールを生成することが
でき当業者にはよく知られた他の化学的もしくは生物学
的に存在するものが挙げられる。標識プローブは、抗体
−西洋ワサビペルオキシダーゼのような抗体−酵素結合
体が好ましい。

未結合の標識プローブ抗体は洗浄して除き、ついで標識
を固相中で検出して腫瘍関連抗原の存在または量を測定
する。標識として酵素を用いた場合には、基質を加える
と酵素標識の存在下で発色生成物を生成する。たとえば
西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた場合には、０＝フ
エニレンジアミンを基質として加えると発色生成物を生
成し、これは視覚で、または４９２　ｎｍでの吸光度に
より分光光学的に測定することができる。

アッセイの第二の態様においては、腫瘍関連抗原に特異
的な標識抗体を、腫瘍関連抗原を含有すると思われる体
液試料と混合する。試料はノイラミニダーゼで前以て処
理するか、または第一のインキュベーションでノイラミ
ニダーゼおよび標識抗体で同時に処理する。インキュベ
ートした後、腫瘍関連抗原コーティング微細粒子のよう
な固相をノイラミニダーゼ処理混合物に加え、固相上の
抗原を消化して試料により結合しなかった標識抗体が固
相抗原に結合することができるようにする。

固相抗原の消化は抗原と標識抗体との免疫反応性を高め
るので、固相抗原をノイラミニダーゼで処理することは
本アッセイにとって重要である。ついで試料抗原−標識
抗体複合体を除き固相結合標識抗体のみを残留させるた
めに、遠心分離、洗浄、濾過またはこれらの組合わせに
より固相をアッセイの他の成分から分離する。ついで標
識のための基質を固相に加えて蛍光や色などの検出可能
な／グナルを生成させる。試料抗原−抗体複合体が多く
生成すればするほど、固相に結合した標識抗体の量は小
さ（なり、反応で生成した蛍光や色は少なくなる。

試料を処理するのに用いたノイラミニダーゼは、技術の
分野で知られたいかなるところから入手してもよい。好
ましい入手先としては、クロストリジウム・パーフリン
ジェンス　タイプＸ（シグマ・ケミカル社、セントルイ
ス、ミズーリ）のようなりロストリジウム・パーフリン
ジェンスからのものがある。

つぎに実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらに限られるものではない。

実施例１ 本実施例では、試料のフイラミニダーゼ処理を利用した
潜在腫瘍関連抗原アッセイを記載する。

（ａ）潜在腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体の
調製 ムチン糖タンパク質免疫原を、３４．００ポリアクリル
アミドゲル浸透クロマトグラフィーおよび高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）により種々の癌タイプの数
人の患者の腹水のプールから単離精製した。精製したム
チン糖タンパク質は、ＲＩＢＩアジュバント［ＲＩ　Ｂ
　Ｔイムノケム・リサーチ（ＲＩ　Ｂ　Ｉ　　Ｉ　ｍｍ
ｕｎｏｃｈｅｍ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｉ　ｎｃ、、）
、ハミルトン、モンタナ］を用いＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　
ｃマウスに３回注射するのに用いた。最後の静脈ブース
ター投与は、ノイラミニダーセ処理糖タンパク質を用い
て行った。マウスを層殺し、肺臓を取り除いてＳ　Ｐ　
２１０のようなミエローマ細胞と融合させた。ハイブリ
ドーマ細胞をヒボキサンチン・アミノプテリン・チミジ
ン含有（ＨＡ　Ｔ　）培地で培養し、ハイブリッドを精
製糖タンパク質およびノイラミニダーセ処理糖タンパク
質、赤血球ゴースト、白血球および胎便グリコスフィン
ゴリピド調製物に対しスクリーニングした。こうして得
られたアボッＩ・・ラポラ１〜リーズ８５／３４と名付
けられた抗体は、マウスＩｇＧモノクローナル抗体であ
ると決定された。この抗体は、パラクロポンド（Ｐａｒ
ａｇｌｏｂｏｓｉｄｅ）（Ｐ　Ｃ）［Ｇａｌβ１．４　
　ＧｌｃＮＡｃβ１．３−Ｇａｌβｌ、４−Ｇｌｃβ１
．１セラミド（ｌＣｅｒａｍｉｄｅ）］および腹水から
調製したムチン糖タンノ々り質と反応性であった。脱ン
アル酸シアロシルα（２，３）ラクト−Ｎ−ノルヘキサ
オシルセラミドおよびシアロシルα（２，３）ラクト−
Ｎ−イソオクタオシルセラミドとの反応は、Ｇａｌβ１
．４−Ｇ　］ｃＮ　Ａ　ｃβ１との特異性を示唆し、Ｒ
配列はＩまたは１抗原決定基と同様であった。

」−記抗体は、Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、Ｕ、ＣＩＬ
、Ａモレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジーシ
ンボシウム（Ｕ、　Ｃ，Ｌ、　Ａ　　Ｓ　ｙｍｐｏｓｉ
ａ　ｏｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ＆　Ｃｅｌ　１ｕｌａｒ
　Ｂ　ｉｏｌｏｇｙ）の第１６回年次総会のアフストラ
クト、補遺、］、］、Ｄ、１５７頁（３月２９日〜５月
１０．１９８７年）に記載されている。他の同様な抗体
は、ヤング（Ｙ　ｏｕＢ）らのＪ。

Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、λ５６（２］、）：１０
９６７−１０９７２（１９８１）に記載されている。オ
リコ糖のＮ−アセチルラクト−スアミンに特異的な上記
抗体と同様の特異性を有する抗体もまた用いることかで
きると思われる。８５／３４抗体は、潜在腫瘍関連抗原
アンセイにアンカー抗体として用いた。

（ｂ）Ｆ３６／２２抗体／酵素結合体の調製ナカネ（Ｎ
　ａｋａｎｅ）およびピアス（Ｐ　１ｅｒｃｅ）のＪＨ
ｉｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　、　２２　
：　１０８４〜１０９１、（１，９７４）に記載の過ヨ
ウ素酸塩法により、Ｆ３６／２２で示されるモノクロー
ナル抗体を西洋ワサビペルオキシターゼに結合させた。

Ｆ３６／２２抗体はヘルス・リサーチ（Ｈｅａｌｔｈ　
Ｒｅｓｅａｒｃｈ。

Ｉ　ｎｃ、　、　）（ロスウエルパータティビション、
バッファロー、ニューヨーク）から人手することができ
、詳細はクローガン（Ｃｒｏｇｂａｎ）らのＣａｎｃｅ
ｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、４３：４９８０〜４９８８（１
９８３）；Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　４３：
１７４］〜］　７４７（１９８３）、およびカナタ特許
第］、、　２＋、５．３３１号明細書（１９８６年１２
月１６０発行）に記載されている。Ｆ３６／２２ハイフ
リド一マ細胞株により産生される抗体は、アメ１ノカン
・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
Ｘロックビル、メリーラント）からＡＴＣＣナンバーＨ
Ｂ８２］５で入手することができる。

（ｃ）潜在腫瘍関連抗原アッセイ手順 ８５／３４抗体（０，１ｚＲ１］、０ｍＭ１−リスｐ’
Ｈ７。

４中に１０〜３０１１ｇ／ｍのを、３７°Ｃての１時間
の受動吸着によりプラスチックマイクロタイタープレー
ト［イムロンＵ　（Ｉ　ｍｍｕｌｏｎｎ　）、タイナテ
ク（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、　Ｉ　ｎｃ、　、　）（アレキ
サンドリア、バージニア）から入手可能］のウェル」二
にコーティングした。

未結合の抗体を吸引および蒸留水での洗浄により除く。

ついでコーティングしたウェルの上にさらにリン酸バッ
ファー食塩水（ＰＢＳ）中の２％ウシ血清アルブミン（
ＢＳＡ）を加えてコーティングした。ついでＰＢＳ中の
００５％ＢＳＡ、チメロサール、ケンタマイシンおよび
タウロチオキシコール酸塩（ＴＤＣナトリウム塩、ング
マ・ケミカル社、セントルイス、ミズーリ）（０，５，
ｖｙ／ｚのを含有する希釈バッファー（５０μのを各ウ
ェルに加えた。

ついで患者の血清（１０μのを各ウェルに加え、−１６
＝ ついでノイラミニターセ（クロストリジウム・パーフリ
ンジェンス、タイプｘ１ングマ・ケミカル社、Ｘｌ、Ｏ
ＯｍＵ／ｚのを含有する希釈液（５０μｉ２）を加えた
。ノイラミニターゼのＩＵは、製造業者の支持した基質
を用いてｐＨ５，０，３７°Ｃで１分間当たりに１０マ
イクロモルのＮ−アセチルノイラミン酸を放出し得る風
として定義される。コーティングしたウェルは、血清、
バッファーおよびノイラミニダーゼ′とともに３７°Ｃ
で１時間インキュベー１・する。未結合の血清成分は、
吸引および蒸留水での洗浄によりウェルから除く。Ｆ３
６／２２抗体／Ｔ（ＲＰＯ結合体の約１．　ＯＯｎｇ／
　ｍＱ溶液（０，１，ｆｆ（２，２０％ウシ胎仔血清、
０．］、Ｍｌ−１ノスハソファ一、０．］、５５Ｍ　Ｎ
ａＣ］およびケンタマイ／ンで希釈）をウェルに加え、
３７°Ｃて１時間インキュへ−１・する。未結合の結合
体を蒸留水で１０　回？５’６　浄して除く。ついで０
−フェニレンンアミン２８Ｃ］（ＯＰＤ）を加え、暗所
にて２０分間インキュへ−１・すると酵素の存在下で黄
色の生成物を生成する。ついで反応を停止させるために
１、ＮＨ２Ｓ○４を加える。試料の反応を分光光度計上
、４９２吸光度（ＯＤ）にて読み取る。

本実施例のアッセイの結果を第１図、第２図および第３
図に示す。すべてのアッセイのカットオフ（ｃｕｔｏｆ
ｆ）（第１図、第２図および第３図）は、血液供給者（
正常）集団の４９０ｎｍでの吸光度（ＯＤ）の平均プラ
スその平均からの２つの標準偏差として（すなわち０８
９００Ｄ）として確立した。

カットオフは、アッセイの最適の特異性のために選枳し
た。第１図は、検査済（ｄｏｃｕｍｅｎｔｅｄ）正常ヒ
ト血清の群からは本実施例のＣＴＡアッセイにより陽性
のものは１例もなかったこと、および４５の正常血液供
給者血清からはわずかに１例のみが陽性と試験されたこ
とを示している。この陽性の試料は、他の市販の研究用
アッセイ［センタカー（Ｃｅｎｔａｃｏｒ）ＣＡ　１５
−３、センタカー、モールパン、ペンシルバニア］で試
験したときも境界線上の陽性を示した。

第２図では、良性の***疾患、初期乳癌およびステージ
■乳癌をヒト血清において、第１図て示した正常血液供
給者群と比較して試験した結果を示す。第２図に示した
結果かられかるように、２９例の良性***疾患血清のう
ぢ３例、６８例の初期乳癌血清のうち２１例、９３例の
ステージ■乳癌血清のうち７２例かＣＴＡアッセイによ
り陽性と試験された。

第３図には、本発明のＣＴＡアッセイとＣＡｌ５−３ア
ツセイとの比較を示す。６７例の試料が、ユニバージテ
ィー・オブ・トロント・メディカル・センター（ｔｈｅ
　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｏｒｏｎｔｏ　Ｍｅ
ｄｉｃａ］　Ｃｅｎｔｅｒ）　（ｌ〜ロンド、カナダ）
およびライスコンシン・クリニカル・キャンサー・セン
ター（ｔｈｅＷｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　
Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｎｔｅｒ）（マシソン、ライスコン
シン）から得られた検査済試料パネルからのものである
。正常な女性は、***の検査、家族歴および正常な月経
周期により検査されタモノである。水平の破線はカット
オフ（バックグラウンドの０２を差し引いである）を表
していて、正常なレベルのＣＴＡマーカーのヒトを癌の
関与する高いレベルのヒトから分けており、血液供給者
群の平均プラスその平均の２つの標準偏差に基づいてい
る。選んだカットオフレベルは、特異性を高めるために
平均プラス第３図の検査済正常婦人群の３つの標準偏差
よりも太きい。ＣＡｌ５−３アツセイで陰性であった試
料は・て、ＣＡ１５−３アツセイで陽性であったムで示
しである。

第３図に示されるように、検査済正常な試料では、ＣＴ
ＡアッセイにおいてもＣＡ］、５−３アツセイにおいて
も２６例のうち陽性の例は見られない。

しかしながら、血液供給者の場合には、ＣＡ１５−３ア
ツセイでは６７例のうち１１例か陽性であるのに対して
、ＣＴＡアッセイではこれら６７例のうちわずかに１例
のみが陽性と示された。また良性の***疾患では、ＣＡ
１５−３アツセイでは３２例の試料のうち１例が陽性の
結果であったのに対し、ＣＴＡアッセイではこれらの試
料のうちで陽性は見られなかった。最後にＣＡ１５−３
アツセイでは６６例のステージ■＆■乳癌試料のうち８
例、９２例のステージ■乳癌試料のうち４９例がそれぞ
れ陽性とされたのに対し、ＣＴＡアッセイでは６６例の
ステージ１．ｌ乳癌試料のうぢ１１例、９２例のステー
ジ■乳癌試料のうち６６例がそれぞれ陽性とされた。

実施例２ 本実施例では、試料をノイラミニダーゼで処理して潜在
腫瘍関連抗原を反応のために遊離させることによる、潜
在腫瘍関連抗原のための競合アッセイ法を記載する。

（ａ）　８５　／　３４抗体／アルカリホスファターゼ
結合体の調製 ８５　／　３４　抗体／アルカリホスファターセ結合体
を以下のようにして調製した。

ＮａＩＯ３（２１４ｍｇ）と０．０１ＭＮａ２Ｃ○３（
２ｘＬｐＨ９，５）を加えることにより５０ｍＭ　　Ｎ
ａ＋０４（２ｚＣ）を調製する。等容量の過ヨウ素酸塩
溶液とアルカリホスファターゼ（１０ｍｑ／　ｉｃ）、
すなわちアルカリホスファターゼ（３００μρ）と過ヨ
ウ素酸塩（３００μのを一緒に加え、室温で２時間イン
キュベートする。９順容Ｇ−２５カラム［ファルマシア
・バイオテクノロジー・プロダクツ（Ｐ　ｈａｒｍａｃ
ｉａ　Ｂ　ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｐ　ｒｏｄｕｃ
ｔｓ）、ビス力タウエー、ニューシャーシー］１．ｏ１
ＭＮａ、Ｃ○ａ（ｐＨ９、５）で平衡化する。ついで活
性化アルカリポスファターセをカラムの」二に通し、約
１ｍρのフラクションを集め、集めた第一のフラクショ
ンについで２８０ｎｍて吸光度を読み取る。

吸光係数を１と仮定して、０　、０１−　Ｍ　　Ｎａ２
Ｃ○４を用いて活性化アルカリホスファターゼの濃度を
１ｍｙ／ｘρに調節する。ついでｌ、　Ｍ　　ＭｇＣ１
２およびＯ，］、　Ｍ　　ＺｎＣｌ、を最終濃度がそれ
ぞれ１ｍＭおよび０．１ｍＭとなるように加える。

活性化アルカリホスファターセをモル比１：］で実施例
１記載の８５／３４抗体に結合さける。

抗体および酵素を暗所、室温にて４〜６時間−緒にイン
キュベーＩ・する。ついでＮａＢＨ，、（１，０１１！
７）およびＯ，Ｏｌ、Ｍ　　ＮａＣ０３（ｐＨ９，５）
（２ｍのを加える。ついで、反応溶液各１駁についでＮ
ａＢＨ４溶液（３５μａ）を加える。これを４°Ｃて一
夜インキュへ−１・する。ついでＮ　ａ　Ｂ　Ｉ−１、
容量の１／１０に等しい量のアセトンを加える。最後に
結合体をＱ、ｉＭトリス、Ｑ、５Ｍ　　ＮａＣ１，２０
％仔ウシ血清および３％トリトンを含む希釈液で希釈し
、抗体濃度を＋−００Ｍｇ／ｍＱにもっていく。他に用
いることのできる希釈液は、ＰＢＳ中のＢ　Ｓ　Ａ（］
２ｍａ／ｍＱ。ｐＨ７，４，）である。抗体−アルカリ
ポスファターセ結合体は一２０°Ｃて貯蔵する。

（ｂ）微細粒子の調製 ラテックス微細粒子［０，２１ミクロン、セラジン（Ｓ
　ｅｒａｄｙｎ）（インデイアナポリス、インデイアナ
）より市販］の２．５％溶液を、微細粒子（４１゜６６
ｕのを蒸留水（４，５８，３４，ｍの中に希釈すること
により調製した。単一サイズの混合床樹脂（ｍｉｘｅｄ
　ｂｅｄ　ｒｅｓｉｎ）を用い、希釈微細粒子ど該樹脂
を２１の比（５００順粒子：２５０ｇ樹脂）で混合する
ことにより、微細粒子をイオン交換媒体中で前以て洗浄
した。粒子／樹脂混合物を室温で１時間回転させ、つい
で州なガラス濾過器で濾過した。

ついで樹脂を蒸留水で２〜３回、しかしわずかに４、０
０　好の水で洗浄する。ついで粒子を１０，０００　ｒ
ｐｍで２０分間遠心分離し、」二澄み液を流し去り、粒
子を最終審！５０ｏｚ＋２まで蒸留水中に再懸濁する。

前以て洗浄した２、５％微細粒子（ｉｆｆρ）を、室温
にてカルボジイミド（ＥＤＡＣＸｏ、２ｘｈ／順、１、
Ｉｏ、）［下記ＭＥＳバッファ＝（５０ｚ（２）中にＥ
ＤＡＣ（シグマ・ケミカル社、セントルイス、ミズーリ
）（０，１ｙ）］および５５ｍＭ　ＭＥＳバッファー（
２屑ρ）と混合する。ＭＥＳバッファーは、５ｍＭＭＥ
Ｓ（シグマ・ケミカル社）（０，８Ｗ）を蒸留水（８０
０ｙｘのと混合し６Ｎ　　ＮａＯＨでｐＨを４．７５に
調節することにより調製する。

（ｃ）微細粒子の抗原コーティング 微細粒子混合物を１０秒間撹拌し、ついでＰＢＳ中のＤ
ＩＪ１４．５抗原調製物（培養物から得られた５３００
ゲル浸透クロマトグラフイー精製フラクシヨン）の１：
５希釈を加える。Ｄ　Ｕ　１．４５細胞株はアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション（ロックビル、メ
リーランＦ）からＡ　Ｔ　ＣＣ＃　ＨＴＢ−８］、Ｅで
入手可能であり、ヒト前立腺癌腫、脳への移転である［
詳細はＴ　ｎｔｅｒｎａｔｌ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、
２１．２７４〜２８］（１，９７８）に記載されている
］。この細胞株は、１０％ウシ胎仔血請を含む９０％イ
ーグル最小必須培地で成育する。

微細粒子とＤＵ１４．５抗原を低速で５秒間撹拌し、室
温で２時間回転させ、ついで１．０．００Ｏｒｐｍで３
０分間遠心分離する。ついで上澄み液を抗原コーティン
グ微細粒子ペレｙ　ｌ・を傷つけないように注意深く除
き、ＰＢＳ／ツイーン溶液（１ｍのを加えて洗浄し、つ
いで撹拌とピペットの先端を用いてペレッＩ・を均一な
懸濁液に破砕する。

この洗浄工程を５回繰り返し、ついで洗浄した微細粒子
を２５ｇ剣を通して引っ張る。ついで微細粒子をＰＢＳ
／ツイーン（１０ｍの中に再懸濁腰１、　Ｏ，ＯＯＯｒ
ｐｍて２０分間遠心分離にかける。

ペレットを上記のようにしてＰＢＳ／ツイーン中で再び
洗浄り、１０．ＯＯＯｒｐｍで１５分間遠心分離にかけ
る。ついでペレットを傷つけないように注意して」二澄
み液を除く。ついで５０　ｍＭ　ｌ−リス、１００ｍＭ
　　ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡＩ）Ｔ（８゜０からなる
オーバーコーティンクハソファ−（１友のを加えてペレ
ットを洗浄し、撹拌およびピペットの先端を用いてペレ
ットを均一な懸濁液に破砕する。撹拌およびピペットで
微細粒子の混合を続けながら、オーバーコーテイングバ
ッファーを１ｍ夕から５靜まて増加させながら加える。

混合物をＰＢＳ／ツイーンで］、０ｚｆｆまでもってい
き、４５°Ｃて一夜貯蔵する。微細粒子混合物を再び１
０゜０００で３０分間遠心分離にかけ、ついで」二記洗
浄工程をもう１度繰り返す。最後に、撹拌およびピペッ
トでペレットを均一なＱ　測／＆に破砕しながら、ＰＢ
Ｓ／ツイーン（１，ｍのを加えて洗浄した微細粒子を再
懸濁し、最終容量を１０１にもっていく。コーティング
微細粒子を２〜８°Ｃで貯蔵する。

（ｄ）潜在腫瘍関連抗原の抑制アッセイトリス（］、２
２．１ｇの、ＥＤＴＡ（０，３３６！ｒ／の、ＮａＣ１
（２９，２２ｑ／のおよびＢ　Ｓ　Ａ（０，５ｙ／ρ）
を含有する希釈ハソファー（５０μの、ならびにノイラ
ミニダーゼ（クロストリジウム・パーフリンシェンス、
タイプＸ５シグマ・ケミカル社）（２５０ｕＵ／ｉのを
含有する蒸留水を患者の血清試料（５０μ夕、希釈パン
ファー中に１．１０で希釈）に加え、５分間インキュー
・−トする。ついで８５／３４抗体−アルカリポスファ
ターセ結合体（１００μのを加えて２５分間インキュベ
ートし、ついでＤ　Ｕ　］、　４．５コ一テイング微細
粒子（８０μのを加える。反応溶液を３４°Ｃにて２０
分間インキユヘートし、ついでアルカリポスファターセ
の存在下で蛍光を発するメチリルウンベリフェロン蛍光
団基質（ＭＵＰ）を加える。蛍光を４４８　ｎｍで測定
する。

上記アッセイを行い蛍光量を測定するのに特に有用な装
置の−っは、アポ、１・・ラボラトリーズ（アボットパ
ーク、イリノイ）から入手可能なＩＭＸＴＭｉ置である
。蛍光の量は試料中の潜在腫瘍関連抗原の量に反比例す
る。すなわぢ、蛍光の量が少ないことは試料中の高い量
の抗原が存在することを示し、逆に蛍光の量が多いと試
料中に低い量の抗原か存在するこ七を示している。

第４図、第５図および第６図に、本実施例のＣＴＡアッ
セイの試験結果を示す。第４図は、本実施例のＣＴＡア
ッセイをＣＡ　ｌ　５−３アツセイと比較して示す。２
６例の検査済正常なヒト血清（疾患なし）を試験したと
ころ、ＣＴＡアッセイではわずかに１例が陽性と認めら
れたが、ＣＡ１５−３アツセイでは２例が陽性であった
。さらに正常群を試験したところ（第５図）、ＣＴＡア
ッセイおよびＣＡ１５−３アツセイはそれぞれ２５例中
１例を陽性と認めた。ステージ■の乳癌試料についでは
（第６図）、ＣＴＡアッセイでは２８例中１７例を陽性
と検出したのに対して、ＣＡ］５−３アツセイでは２８
例中１６例を陽性と検出した。

潜在腫瘍関連抗原のアッセイにおいて試料をノイラミニ
ダーゼで処理することにより多くの利点が得られる。第
一に、反応のために抗原を露出させることにより、従来
は検出されなかったかまたは検出されてもわずかな量し
か検出することができなかった患者試料中の抗原を今や
検出することが可能になったことである。第二に、ノイ
ラミニダーセ処理により抗原を遊離させて、アッセイで
選択した抗体に対して一層特異的な反応に供することが
できる。第三に、従来のアッセイに比べて癌患者におけ
る腫瘍関連抗原の検出量が大きいことからも明らかなよ
うに、本発明の潜在腫瘍関連抗原アッセイは従来のアッ
セイに比べて感度が向上している。第四に、本発明のア
ッセイでは従来のアッセイに比べて偽陽性比が低くなっ
ている。

最後に、本発明のアッセイは便利で操作が簡単である。

以上、本発明を実施例に基づいて説明したか、本発明の
範囲内において当業者か種々の変更を加え得ることは理
解されなければならない。たとえは、他の腫瘍関連抗原
の糖残基を、そのような糖結合を消化するのに適当な酵
素を用いて取り除（ことにより、他の多くの腫瘍関連抗
原の検出能を高めるであろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は、検査済正常ヒト血清および正常血液供給者に
ついで本発明の実施例１のＣＴＡアッセイを行った結果
を示すグラフ、第２図は、良性の***疾患、初期乳癌、
ステージ■乳癌および第１図の正常血液供給者についで
本発明の実施例１のＣＴＡアッセイを行った結果を示す
グラフ、第３図は、血液供給者、良性の***疾患、ステ
ージ１ｖ乳癌、ステージＩ＆ｎ乳癌および正常な婦人に
ついで本発明の実施例１のＣＴＡアッセイと市販のＣＡ
１５−３アツセイとを比較して示すグラフ、第４図は、
検査済の疾患のない正常な試料についで本発明の実施例
２のＣＴＡアッセイと市販のＣＡ１５−３アツセイとを
比較して示すグラフ、第５図は、正常な血液供給者につ
いで本発明の実施例２のＣＴ　Ａアッセイと市販のＣＡ
１．５−３アツセイとを比較して示すグラフ、第６図は
、ステーン■の乳癌患者試料についで本発明の実施例２
のＣＴＡアッセイと市販のＣＡ、　１．５−３アツセイ
とを比較して示すグラフである。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）体液試料をノイラミニダーゼで処理するこ
   とによって潜在腫瘍関連抗原に特異的な抗体との反応の
   ために該潜在腫瘍関連抗原を完全に遊離させ、ついで （ｂ）潜在腫瘍関連抗原のためのイムノアッセイにより
   上記ノイラミニダーゼ処理試料を試験することを特徴と
   する、体液試料中の潜在腫瘍関連抗原の検出方法。
2. （２）工程（ａ）と工程（ｂ）を同時に行う特許請求の
   範囲第（１）項記載の方法。
3. （３）体液試料中の潜在腫瘍関連抗原の検出方法であっ
   て、 （ａ）潜在腫瘍関連抗原に特異的な抗体を固相上に吸着
   させ、 （ｂ）試料をノイラミニダーゼで処理し、 （ｃ）抗体コーティング固相に上記試料を加えてインキ
   ュベートし、 （ｄ）固相を洗浄して未反応の試料を除き、 （ｅ）潜在腫瘍関連抗原に特異的な標識抗体を加えてイ
   ンキュベートし、 （ｆ）固相を洗浄して未反応の標識抗体を除き、ついで （ｇ）標識を検出して試料中の腫瘍関連抗原の存在また
   は量を測定する ことを特徴とする方法。
4. （４）工程（ｂ）と工程（ｃ）を同時に行う特許請求の
   範囲第（３）項記載の方法。
5. （５）固相抗体が、パラグロボシド（ＰＧ）（Ｇａｌβ
   １、４−ＧｌｃＮＡｃβ１、３−Ｇａｌβ１、４−Ｇｌ
   ｃβ１、１セラミド）およびオリゴ糖のＮ−アセチルラ
   クトースアミンに反応性のモノクローナル抗体である特
   許請求の範囲第（３）項記載の方法。
6. （６）標識抗体が、アメリカン・タイプ・カルチャー・
   コレクションにＡＴＣＣナンバーＨＢ８２１５で寄託さ
   れているＦ３６／２２ハイブリドーマ細胞株により産生
   されたＦ３６／２２モノクローナル抗体である特許請求
   の範囲第（３）項記載の方法。
7. （７）体液試料中の潜在腫瘍関連抗原の検出方法であっ
   て、 （ａ）試料をノイラミニダーゼで処理し、 （ｂ）腫瘍関連抗原に特異的な標識抗体を試料に加えて
   インキュベートし、 （ｃ）腫瘍関連抗原をコーティングした固相を試料に加
   えてインキュベートし、 （ｄ）固相を液相から分離し、ついで （ｅ）固相上の標識を検出して試料中の腫瘍関連抗原を
   測定する ことを特徴とする方法。
8. （８）工程（ａ）と工程（ｂ）を同時に行う特許請求の
   範囲第（７）項記載の方法。
9. （９）標識抗体が、パラグロボシド（ＰＧ）（Ｇａｌβ
   １、４−ＧｌｃＮＡｃβ１、３−Ｇａｌβ１、４−Ｇｌ
   ｃβ１、１セラミド）およびオリゴ糖のＮ−アセチルラ
   クトースアミンに反応性のモノクローナル抗体である特
   許請求の範囲第（７）項記載の方法。
10. （１０）固相抗原が、アメリカン・タイプ・カルチャー
    ・コレクションよりＡＴＣＣ♯ＨＴＢ−８１Ｅで入手可
    能なＤＵ１４５細胞株から得られたＤＵ１４５抗原調製
    物である特許請求の範囲第（７）項記載の方法。