JPH01165964A - 腫瘍関連抗原の検出方法 - Google Patents
腫瘍関連抗原の検出方法Info
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(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
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Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は、生物学的流体中の潜在腫瘍関連(CTA)抗
原の検出のためのイムノアッセイ法に関する。さらに詳
しくは、本発明は、CT A抗原を試験する前に試料を
ノイラミニダーゼで処理して腫瘍関連エビ!・−プを露
出(unmask)さぜることを特徴とする、体液中の
CT A抗原の検出のためのイムノアッセイ法に関する
。
原の検出のためのイムノアッセイ法に関する。さらに詳
しくは、本発明は、CT A抗原を試験する前に試料を
ノイラミニダーゼで処理して腫瘍関連エビ!・−プを露
出(unmask)さぜることを特徴とする、体液中の
CT A抗原の検出のためのイムノアッセイ法に関する
。
(従来の技術および発明が解決しようとする課題)腫瘍
関連抗原の診断的イムノアッセイ法は技術の分野でよく
知られている。たとえば、癌胎児性抗原(CEA)、α
−フェトプロティン(AFP)、CA 1.25、CA
]、9−9およびCA1.5−3などの種々の腫瘍関連
抗原の検出のためのイムノアラセイ法か商業的に利用さ
れている。これらのイムノアッセイ法では、血清、血漿
または尿などの生物学的流体中の腫瘍関連抗原の存在を
検出する。
関連抗原の診断的イムノアッセイ法は技術の分野でよく
知られている。たとえば、癌胎児性抗原(CEA)、α
−フェトプロティン(AFP)、CA 1.25、CA
]、9−9およびCA1.5−3などの種々の腫瘍関連
抗原の検出のためのイムノアラセイ法か商業的に利用さ
れている。これらのイムノアッセイ法では、血清、血漿
または尿などの生物学的流体中の腫瘍関連抗原の存在を
検出する。
現在入手可能なアッセイ法に関連する問題点の一つは、
これらのアッセイ法では疾患の非常に初期の段階におい
て腫瘍関連抗原を検出することができないということで
ある。他の問題点は、イムノアッセイ法の多くが、すべ
ての試料中の特定の抗原を検出するに充分なほど感受性
がなくまた特異的でないということである。従って、入
手可能なアッセイ法の多くは、患者管理のための手段と
してまたは調査に使用するために、知られた癌患者にお
いて特定の抗原レベルをモニターするためにのみ用いら
れている。それゆえ、疾患の初期の段階で腫瘍関連抗原
を検出することができる新規なアッセイ手順を開発する
こと、およびこれらのイムノアッセイ法の特異性および
感受性を向上させることが強く望まれている。
これらのアッセイ法では疾患の非常に初期の段階におい
て腫瘍関連抗原を検出することができないということで
ある。他の問題点は、イムノアッセイ法の多くが、すべ
ての試料中の特定の抗原を検出するに充分なほど感受性
がなくまた特異的でないということである。従って、入
手可能なアッセイ法の多くは、患者管理のための手段と
してまたは調査に使用するために、知られた癌患者にお
いて特定の抗原レベルをモニターするためにのみ用いら
れている。それゆえ、疾患の初期の段階で腫瘍関連抗原
を検出することができる新規なアッセイ手順を開発する
こと、およびこれらのイムノアッセイ法の特異性および
感受性を向上させることが強く望まれている。
ダルボウ(Dalbow)らの米国特許第4.116.
776号明細書には、悪性新生細胞がヒト絨毛性性腺刺
激ホルモン(bCG)を合成し循環器系に分泌すること
が教示されており、糖タンパク質は宿主のリンパ球によ
り捕集され吸着されている。ダルボウらは、従来技術で
は血液の間違ったフラクション、すなわちリンパ球では
なく血清を試験していたので感受性が充分でなかったと
述べている。ダルボウらは、血液試料から白血球を単離
し、ノイラミニダーゼで前処理したあとhCGの存在に
ついで試験することを特徴とするhCGの検出の改良法
を開示している。
776号明細書には、悪性新生細胞がヒト絨毛性性腺刺
激ホルモン(bCG)を合成し循環器系に分泌すること
が教示されており、糖タンパク質は宿主のリンパ球によ
り捕集され吸着されている。ダルボウらは、従来技術で
は血液の間違ったフラクション、すなわちリンパ球では
なく血清を試験していたので感受性が充分でなかったと
述べている。ダルボウらは、血液試料から白血球を単離
し、ノイラミニダーゼで前処理したあとhCGの存在に
ついで試験することを特徴とするhCGの検出の改良法
を開示している。
同様に、クルター・コーポレーション(Coulter
Corporation)のPCT特許出願第W○
87101392号明細書には、ノイラミニダーゼを用
いて抗原決定基部位からシアル酸を除くことにより病原
試料中のヒト癌腫腫瘍抗原の検出が性能が向上すること
が開示されている。タルポウらの特許の場合のように、
クルターは腫瘍抗原の存在のアッセイの前に細胞または
組織調製物をノイラミニダーゼで処理することを教示し
ている。
Corporation)のPCT特許出願第W○
87101392号明細書には、ノイラミニダーゼを用
いて抗原決定基部位からシアル酸を除くことにより病原
試料中のヒト癌腫腫瘍抗原の検出が性能が向上すること
が開示されている。タルポウらの特許の場合のように、
クルターは腫瘍抗原の存在のアッセイの前に細胞または
組織調製物をノイラミニダーゼで処理することを教示し
ている。
(課題を解決するだめの手段)
本発明は、血清、血漿、胸膜浸出液、痰、尿、乳頭分d
・物、糞便などの体液中の潜在腫瘍関連(CTA)抗原
の検出のための改良法に関する。本発明の方法では、細
胞を前辺て調製する必要なく試料をノイラミニダーゼ処
理する。ノイラミニダーゼ処理によりシアル酸が除かれ
てCTAエピ!・−プが露出し、抗体試薬との反応のた
めにCTA抗原を遊離させるので高感受性で高特異性の
イムノアッセイ法か提供される。
・物、糞便などの体液中の潜在腫瘍関連(CTA)抗原
の検出のための改良法に関する。本発明の方法では、細
胞を前辺て調製する必要なく試料をノイラミニダーゼ処
理する。ノイラミニダーゼ処理によりシアル酸が除かれ
てCTAエピ!・−プが露出し、抗体試薬との反応のた
めにCTA抗原を遊離させるので高感受性で高特異性の
イムノアッセイ法か提供される。
さらに詳しくは、本発明は、(a)体液試料をノイラミ
ニダーゼで処理することによって潜在腫瘍関連抗原に特
異的な抗体との反応のために該潜在腫瘍関連抗原を完全
に遊離させ、ついで(b)潜在腫瘍関連抗原のためのイ
ムノアッセイにより上記ノイラミニダーゼ処理試料を試
験する ことを特徴とする、体液試料中の潜在腫瘍関連抗原の検
出方法である。
ニダーゼで処理することによって潜在腫瘍関連抗原に特
異的な抗体との反応のために該潜在腫瘍関連抗原を完全
に遊離させ、ついで(b)潜在腫瘍関連抗原のためのイ
ムノアッセイにより上記ノイラミニダーゼ処理試料を試
験する ことを特徴とする、体液試料中の潜在腫瘍関連抗原の検
出方法である。
本発明はまた、体液試料中の潜在腫瘍関連抗原の検出方
法であって、 (a)1在腫瘍関連抗原に特異的な抗体を固相」二に吸
着させ、 (b)試料をノイラミニダーゼで処理し、(c)抗体コ
ーティング固相に上記試料を加えてインキュベートし、 (cl)固相を洗浄して未反応の試料を除き、(e’)
潜在腫瘍関連抗原に特異的な標識抗体を加えてインキュ
ベートし、 (f)固相を洗浄して未反応の標識抗体を除き、ついで (g)標識を検出して試料中の腫瘍関連抗原の存在また
は量を測定する ことを特徴とする方法に関する。
法であって、 (a)1在腫瘍関連抗原に特異的な抗体を固相」二に吸
着させ、 (b)試料をノイラミニダーゼで処理し、(c)抗体コ
ーティング固相に上記試料を加えてインキュベートし、 (cl)固相を洗浄して未反応の試料を除き、(e’)
潜在腫瘍関連抗原に特異的な標識抗体を加えてインキュ
ベートし、 (f)固相を洗浄して未反応の標識抗体を除き、ついで (g)標識を検出して試料中の腫瘍関連抗原の存在また
は量を測定する ことを特徴とする方法に関する。
本発明はさらに、体液試料中の潜在腫瘍関連抗原の検出
方法であって、 (a)試料をノイラミニダーゼで処理し、(b)腫瘍関
連抗原に特異的な標識抗体を試料に加えてインキュベー
トし、 (c)腫瘍関連抗原をコーティングした固相を試料に加
えてインキュベートし、 (d)固相を液相から分離し、ついで (e)固相」−の標識を検出して試料中の腫瘍関連抗原
を測定する ことを特徴とする方法に関する。
方法であって、 (a)試料をノイラミニダーゼで処理し、(b)腫瘍関
連抗原に特異的な標識抗体を試料に加えてインキュベー
トし、 (c)腫瘍関連抗原をコーティングした固相を試料に加
えてインキュベートし、 (d)固相を液相から分離し、ついで (e)固相」−の標識を検出して試料中の腫瘍関連抗原
を測定する ことを特徴とする方法に関する。
(発明の構成および効果)
本発明によるCTA抗原の検出の改良法において、CT
A抗原を露出させるために血清、血漿、全血、尿または
胸腺浸出液などの体液をノイラミニダーゼで処理する。
A抗原を露出させるために血清、血漿、全血、尿または
胸腺浸出液などの体液をノイラミニダーゼで処理する。
本明細書において「潜在腫瘍関連抗原」またはrCTA
抗原」とは、シアル酸による妨害のために該抗原に特異
的な抗体と完全に反応することが妨げられているような
腫瘍関連抗原を意味する。この場合、シアル酸は、CT
A抗原に付着しているか、または該抗原とある種の抗体
との結合を妨害するように特異的なCTAエピトープに
空間的に極めて近接して位置している。
抗原」とは、シアル酸による妨害のために該抗原に特異
的な抗体と完全に反応することが妨げられているような
腫瘍関連抗原を意味する。この場合、シアル酸は、CT
A抗原に付着しているか、または該抗原とある種の抗体
との結合を妨害するように特異的なCTAエピトープに
空間的に極めて近接して位置している。
−担シアル酸がノイラミニダーゼ処理により除かれると
、CTA抗原はイムノアッセイ手順において抗体と自由
に反応することができる。アッセイは同種または異種の
形態であってよい。すなわち、腫瘍関連抗原を検出する
ために、固相および標識相上に同種または異種の抗体を
用いてよい。さらに、アッセイは直接アッセイまたは競
合アッセイの形にすることもできるし、1工程アツセイ
または好ましくは2もしくはそれ以上の工程のアッセイ
にすることもできる。
、CTA抗原はイムノアッセイ手順において抗体と自由
に反応することができる。アッセイは同種または異種の
形態であってよい。すなわち、腫瘍関連抗原を検出する
ために、固相および標識相上に同種または異種の抗体を
用いてよい。さらに、アッセイは直接アッセイまたは競
合アッセイの形にすることもできるし、1工程アツセイ
または好ましくは2もしくはそれ以上の工程のアッセイ
にすることもできる。
1工程アツセイにおいては、腫瘍関連抗原に特異的な抗
体(ポリクローナルまたはモノクローナル)を、当業者
にはよく知られているようにポリスチレンビーズ、微細
粒子、ウェル、ストリップ、プレートまたは他の適当な
プラスチックまたは紙の固体支持体などの固相上に吸着
させるかまたは共有結合的に結合させる。固相抗体は、
以下、アンカー抗体と称する。第一のインキュベーショ
ンにおいて、アンカー抗体は体液試料中の特定の腫瘍関
連抗原を結合させるために用いる。試料は第一のインキ
ュベーションと同時にノイラミニダーゼで処理すること
ができる。たとえは、試料をアンカー抗体に加え、第一
の工程でノイラミニダーゼで処理する。別の方法として
は、アンカー抗体とインキュベートする前に試料をノイ
ラミニダーセで前以て処理する。
体(ポリクローナルまたはモノクローナル)を、当業者
にはよく知られているようにポリスチレンビーズ、微細
粒子、ウェル、ストリップ、プレートまたは他の適当な
プラスチックまたは紙の固体支持体などの固相上に吸着
させるかまたは共有結合的に結合させる。固相抗体は、
以下、アンカー抗体と称する。第一のインキュベーショ
ンにおいて、アンカー抗体は体液試料中の特定の腫瘍関
連抗原を結合させるために用いる。試料は第一のインキ
ュベーションと同時にノイラミニダーゼで処理すること
ができる。たとえは、試料をアンカー抗体に加え、第一
の工程でノイラミニダーゼで処理する。別の方法として
は、アンカー抗体とインキュベートする前に試料をノイ
ラミニダーセで前以て処理する。
つきに、アンカー抗体により結合しなかった試料中の抗
原および残留している血清成分およびノイラミニダーゼ
を洗浄により除く。ついで試料中の腫瘍関連抗原を標識
プローブ抗体ととの第二のインキュベーションで反応さ
せる。標識プローブ抗体は、アンカー抗体と同じであっ
ても異なるものであってもよい。本発明のアッセイに有
用な標識としては、酵素標識、放射性同位元素標識、蛍
光標識、および検出可能なジグプールを生成することが
でき当業者にはよく知られた他の化学的もしくは生物学
的に存在するものが挙げられる。標識プローブは、抗体
−西洋ワサビペルオキシダーゼのような抗体−酵素結合
体が好ましい。
原および残留している血清成分およびノイラミニダーゼ
を洗浄により除く。ついで試料中の腫瘍関連抗原を標識
プローブ抗体ととの第二のインキュベーションで反応さ
せる。標識プローブ抗体は、アンカー抗体と同じであっ
ても異なるものであってもよい。本発明のアッセイに有
用な標識としては、酵素標識、放射性同位元素標識、蛍
光標識、および検出可能なジグプールを生成することが
でき当業者にはよく知られた他の化学的もしくは生物学
的に存在するものが挙げられる。標識プローブは、抗体
−西洋ワサビペルオキシダーゼのような抗体−酵素結合
体が好ましい。
未結合の標識プローブ抗体は洗浄して除き、ついで標識
を固相中で検出して腫瘍関連抗原の存在または量を測定
する。標識として酵素を用いた場合には、基質を加える
と酵素標識の存在下で発色生成物を生成する。たとえば
西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた場合には、0=フ
エニレンジアミンを基質として加えると発色生成物を生
成し、これは視覚で、または492 nmでの吸光度に
より分光光学的に測定することができる。
を固相中で検出して腫瘍関連抗原の存在または量を測定
する。標識として酵素を用いた場合には、基質を加える
と酵素標識の存在下で発色生成物を生成する。たとえば
西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた場合には、0=フ
エニレンジアミンを基質として加えると発色生成物を生
成し、これは視覚で、または492 nmでの吸光度に
より分光光学的に測定することができる。
アッセイの第二の態様においては、腫瘍関連抗原に特異
的な標識抗体を、腫瘍関連抗原を含有すると思われる体
液試料と混合する。試料はノイラミニダーゼで前以て処
理するか、または第一のインキュベーションでノイラミ
ニダーゼおよび標識抗体で同時に処理する。インキュベ
ートした後、腫瘍関連抗原コーティング微細粒子のよう
な固相をノイラミニダーゼ処理混合物に加え、固相上の
抗原を消化して試料により結合しなかった標識抗体が固
相抗原に結合することができるようにする。
的な標識抗体を、腫瘍関連抗原を含有すると思われる体
液試料と混合する。試料はノイラミニダーゼで前以て処
理するか、または第一のインキュベーションでノイラミ
ニダーゼおよび標識抗体で同時に処理する。インキュベ
ートした後、腫瘍関連抗原コーティング微細粒子のよう
な固相をノイラミニダーゼ処理混合物に加え、固相上の
抗原を消化して試料により結合しなかった標識抗体が固
相抗原に結合することができるようにする。
固相抗原の消化は抗原と標識抗体との免疫反応性を高め
るので、固相抗原をノイラミニダーゼで処理することは
本アッセイにとって重要である。ついで試料抗原−標識
抗体複合体を除き固相結合標識抗体のみを残留させるた
めに、遠心分離、洗浄、濾過またはこれらの組合わせに
より固相をアッセイの他の成分から分離する。ついで標
識のための基質を固相に加えて蛍光や色などの検出可能
な/グナルを生成させる。試料抗原−抗体複合体が多く
生成すればするほど、固相に結合した標識抗体の量は小
さ(なり、反応で生成した蛍光や色は少なくなる。
るので、固相抗原をノイラミニダーゼで処理することは
本アッセイにとって重要である。ついで試料抗原−標識
抗体複合体を除き固相結合標識抗体のみを残留させるた
めに、遠心分離、洗浄、濾過またはこれらの組合わせに
より固相をアッセイの他の成分から分離する。ついで標
識のための基質を固相に加えて蛍光や色などの検出可能
な/グナルを生成させる。試料抗原−抗体複合体が多く
生成すればするほど、固相に結合した標識抗体の量は小
さ(なり、反応で生成した蛍光や色は少なくなる。
試料を処理するのに用いたノイラミニダーゼは、技術の
分野で知られたいかなるところから入手してもよい。好
ましい入手先としては、クロストリジウム・パーフリン
ジェンス タイプX(シグマ・ケミカル社、セントルイ
ス、ミズーリ)のようなりロストリジウム・パーフリン
ジェンスからのものがある。
分野で知られたいかなるところから入手してもよい。好
ましい入手先としては、クロストリジウム・パーフリン
ジェンス タイプX(シグマ・ケミカル社、セントルイ
ス、ミズーリ)のようなりロストリジウム・パーフリン
ジェンスからのものがある。
つぎに実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらに限られるものではない。
が、本発明はこれらに限られるものではない。
実施例1
本実施例では、試料のフイラミニダーゼ処理を利用した
潜在腫瘍関連抗原アッセイを記載する。
潜在腫瘍関連抗原アッセイを記載する。
(a)潜在腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体の
調製 ムチン糖タンパク質免疫原を、34.00ポリアクリル
アミドゲル浸透クロマトグラフィーおよび高速液体クロ
マトグラフィー(HPLC)により種々の癌タイプの数
人の患者の腹水のプールから単離精製した。精製したム
チン糖タンパク質は、RIBIアジュバント[RI B
Tイムノケム・リサーチ(RI B I I mm
unochem Re5earch、 I nc、、)
、ハミルトン、モンタナ]を用いB A L B /
cマウスに3回注射するのに用いた。最後の静脈ブース
ター投与は、ノイラミニダーセ処理糖タンパク質を用い
て行った。マウスを層殺し、肺臓を取り除いてS P
210のようなミエローマ細胞と融合させた。ハイブリ
ドーマ細胞をヒボキサンチン・アミノプテリン・チミジ
ン含有(HA T )培地で培養し、ハイブリッドを精
製糖タンパク質およびノイラミニダーセ処理糖タンパク
質、赤血球ゴースト、白血球および胎便グリコスフィン
ゴリピド調製物に対しスクリーニングした。こうして得
られたアボッI・・ラポラ1〜リーズ85/34と名付
けられた抗体は、マウスIgGモノクローナル抗体であ
ると決定された。この抗体は、パラクロポンド(Par
agloboside)(P C)[Galβ1.4
GlcNAcβ1.3−Galβl、4−Glcβ1
.1セラミド(lCeramide)]および腹水から
調製したムチン糖タンノ々り質と反応性であった。脱ン
アル酸シアロシルα(2,3)ラクト−N−ノルヘキサ
オシルセラミドおよびシアロシルα(2,3)ラクト−
N−イソオクタオシルセラミドとの反応は、Galβ1
.4−G ]cN A cβ1との特異性を示唆し、R
配列はIまたは1抗原決定基と同様であった。
調製 ムチン糖タンパク質免疫原を、34.00ポリアクリル
アミドゲル浸透クロマトグラフィーおよび高速液体クロ
マトグラフィー(HPLC)により種々の癌タイプの数
人の患者の腹水のプールから単離精製した。精製したム
チン糖タンパク質は、RIBIアジュバント[RI B
Tイムノケム・リサーチ(RI B I I mm
unochem Re5earch、 I nc、、)
、ハミルトン、モンタナ]を用いB A L B /
cマウスに3回注射するのに用いた。最後の静脈ブース
ター投与は、ノイラミニダーセ処理糖タンパク質を用い
て行った。マウスを層殺し、肺臓を取り除いてS P
210のようなミエローマ細胞と融合させた。ハイブリ
ドーマ細胞をヒボキサンチン・アミノプテリン・チミジ
ン含有(HA T )培地で培養し、ハイブリッドを精
製糖タンパク質およびノイラミニダーセ処理糖タンパク
質、赤血球ゴースト、白血球および胎便グリコスフィン
ゴリピド調製物に対しスクリーニングした。こうして得
られたアボッI・・ラポラ1〜リーズ85/34と名付
けられた抗体は、マウスIgGモノクローナル抗体であ
ると決定された。この抗体は、パラクロポンド(Par
agloboside)(P C)[Galβ1.4
GlcNAcβ1.3−Galβl、4−Glcβ1
.1セラミド(lCeramide)]および腹水から
調製したムチン糖タンノ々り質と反応性であった。脱ン
アル酸シアロシルα(2,3)ラクト−N−ノルヘキサ
オシルセラミドおよびシアロシルα(2,3)ラクト−
N−イソオクタオシルセラミドとの反応は、Galβ1
.4−G ]cN A cβ1との特異性を示唆し、R
配列はIまたは1抗原決定基と同様であった。
」−記抗体は、J、Ce11.Biol、、U、CIL
、Aモレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジーシ
ンボシウム(U、 C,L、 A S ymposi
a on Mo1ecular& Cel 1ular
B iology)の第16回年次総会のアフストラ
クト、補遺、]、]、D、157頁(3月29日〜5月
10.1987年)に記載されている。他の同様な抗体
は、ヤング(Y ouB)らのJ。
、Aモレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジーシ
ンボシウム(U、 C,L、 A S ymposi
a on Mo1ecular& Cel 1ular
B iology)の第16回年次総会のアフストラ
クト、補遺、]、]、D、157頁(3月29日〜5月
10.1987年)に記載されている。他の同様な抗体
は、ヤング(Y ouB)らのJ。
B iol、 Chem、 、λ56(2]、):10
967−10972(1981)に記載されている。オ
リコ糖のN−アセチルラクト−スアミンに特異的な上記
抗体と同様の特異性を有する抗体もまた用いることかで
きると思われる。85/34抗体は、潜在腫瘍関連抗原
アンセイにアンカー抗体として用いた。
967−10972(1981)に記載されている。オ
リコ糖のN−アセチルラクト−スアミンに特異的な上記
抗体と同様の特異性を有する抗体もまた用いることかで
きると思われる。85/34抗体は、潜在腫瘍関連抗原
アンセイにアンカー抗体として用いた。
(b)F36/22抗体/酵素結合体の調製ナカネ(N
akane)およびピアス(P 1erce)のJH
istochem、 Cytochem、 、 22
: 1084〜1091、(1,974)に記載の過ヨ
ウ素酸塩法により、F36/22で示されるモノクロー
ナル抗体を西洋ワサビペルオキシターゼに結合させた。
akane)およびピアス(P 1erce)のJH
istochem、 Cytochem、 、 22
: 1084〜1091、(1,974)に記載の過ヨ
ウ素酸塩法により、F36/22で示されるモノクロー
ナル抗体を西洋ワサビペルオキシターゼに結合させた。
F36/22抗体はヘルス・リサーチ(Health
Research。
Research。
I nc、 、 )(ロスウエルパータティビション、
バッファロー、ニューヨーク)から人手することができ
、詳細はクローガン(Crogban)らのCance
r Re5earch、43:4980〜4988(1
983);Cancer Re5earch、 43:
174]〜] 747(1983)、およびカナタ特許
第]、、 2+、5.331号明細書(1986年12
月160発行)に記載されている。F36/22ハイフ
リド一マ細胞株により産生される抗体は、アメ1ノカン
・タイプ・カルチャー・コレクション(America
n Type Cu1ture Co11ection
Xロックビル、メリーラント)からATCCナンバーH
B82]5で入手することができる。
バッファロー、ニューヨーク)から人手することができ
、詳細はクローガン(Crogban)らのCance
r Re5earch、43:4980〜4988(1
983);Cancer Re5earch、 43:
174]〜] 747(1983)、およびカナタ特許
第]、、 2+、5.331号明細書(1986年12
月160発行)に記載されている。F36/22ハイフ
リド一マ細胞株により産生される抗体は、アメ1ノカン
・タイプ・カルチャー・コレクション(America
n Type Cu1ture Co11ection
Xロックビル、メリーラント)からATCCナンバーH
B82]5で入手することができる。
(c)潜在腫瘍関連抗原アッセイ手順
85/34抗体(0,1zR1]、0mM1−リスp’
H7。
H7。
4中に10〜3011g/mのを、37°Cての1時間
の受動吸着によりプラスチックマイクロタイタープレー
ト[イムロンU (I mmulonn )、タイナテ
ク(Dynatech、 I nc、 、 )(アレキ
サンドリア、バージニア)から入手可能]のウェル」二
にコーティングした。
の受動吸着によりプラスチックマイクロタイタープレー
ト[イムロンU (I mmulonn )、タイナテ
ク(Dynatech、 I nc、 、 )(アレキ
サンドリア、バージニア)から入手可能]のウェル」二
にコーティングした。
未結合の抗体を吸引および蒸留水での洗浄により除く。
ついでコーティングしたウェルの上にさらにリン酸バッ
ファー食塩水(PBS)中の2%ウシ血清アルブミン(
BSA)を加えてコーティングした。ついでPBS中の
005%BSA、チメロサール、ケンタマイシンおよび
タウロチオキシコール酸塩(TDCナトリウム塩、ング
マ・ケミカル社、セントルイス、ミズーリ)(0,5,
vy/zのを含有する希釈バッファー(50μのを各ウ
ェルに加えた。
ファー食塩水(PBS)中の2%ウシ血清アルブミン(
BSA)を加えてコーティングした。ついでPBS中の
005%BSA、チメロサール、ケンタマイシンおよび
タウロチオキシコール酸塩(TDCナトリウム塩、ング
マ・ケミカル社、セントルイス、ミズーリ)(0,5,
vy/zのを含有する希釈バッファー(50μのを各ウ
ェルに加えた。
ついで患者の血清(10μのを各ウェルに加え、−16
= ついでノイラミニターセ(クロストリジウム・パーフリ
ンジェンス、タイプx1ングマ・ケミカル社、Xl、O
OmU/zのを含有する希釈液(50μi2)を加えた
。ノイラミニターゼのIUは、製造業者の支持した基質
を用いてpH5,0,37°Cで1分間当たりに10マ
イクロモルのN−アセチルノイラミン酸を放出し得る風
として定義される。コーティングしたウェルは、血清、
バッファーおよびノイラミニダーゼ′とともに37°C
で1時間インキュベー1・する。未結合の血清成分は、
吸引および蒸留水での洗浄によりウェルから除く。F3
6/22抗体/T(RPO結合体の約1. OOng/
mQ溶液(0,1,ff(2,20%ウシ胎仔血清、
0.]、Ml−1ノスハソファ一、0.]、55M N
aC]およびケンタマイ/ンで希釈)をウェルに加え、
37°Cて1時間インキュへ−1・する。未結合の結合
体を蒸留水で10 回?5’6 浄して除く。ついで0
−フェニレンンアミン28C](OPD)を加え、暗所
にて20分間インキュへ−1・すると酵素の存在下で黄
色の生成物を生成する。ついで反応を停止させるために
1、NH2S○4を加える。試料の反応を分光光度計上
、492吸光度(OD)にて読み取る。
= ついでノイラミニターセ(クロストリジウム・パーフリ
ンジェンス、タイプx1ングマ・ケミカル社、Xl、O
OmU/zのを含有する希釈液(50μi2)を加えた
。ノイラミニターゼのIUは、製造業者の支持した基質
を用いてpH5,0,37°Cで1分間当たりに10マ
イクロモルのN−アセチルノイラミン酸を放出し得る風
として定義される。コーティングしたウェルは、血清、
バッファーおよびノイラミニダーゼ′とともに37°C
で1時間インキュベー1・する。未結合の血清成分は、
吸引および蒸留水での洗浄によりウェルから除く。F3
6/22抗体/T(RPO結合体の約1. OOng/
mQ溶液(0,1,ff(2,20%ウシ胎仔血清、
0.]、Ml−1ノスハソファ一、0.]、55M N
aC]およびケンタマイ/ンで希釈)をウェルに加え、
37°Cて1時間インキュへ−1・する。未結合の結合
体を蒸留水で10 回?5’6 浄して除く。ついで0
−フェニレンンアミン28C](OPD)を加え、暗所
にて20分間インキュへ−1・すると酵素の存在下で黄
色の生成物を生成する。ついで反応を停止させるために
1、NH2S○4を加える。試料の反応を分光光度計上
、492吸光度(OD)にて読み取る。
本実施例のアッセイの結果を第1図、第2図および第3
図に示す。すべてのアッセイのカットオフ(cutof
f)(第1図、第2図および第3図)は、血液供給者(
正常)集団の490nmでの吸光度(OD)の平均プラ
スその平均からの2つの標準偏差として(すなわち08
900D)として確立した。
図に示す。すべてのアッセイのカットオフ(cutof
f)(第1図、第2図および第3図)は、血液供給者(
正常)集団の490nmでの吸光度(OD)の平均プラ
スその平均からの2つの標準偏差として(すなわち08
900D)として確立した。
カットオフは、アッセイの最適の特異性のために選枳し
た。第1図は、検査済(documented)正常ヒ
ト血清の群からは本実施例のCTAアッセイにより陽性
のものは1例もなかったこと、および45の正常血液供
給者血清からはわずかに1例のみが陽性と試験されたこ
とを示している。この陽性の試料は、他の市販の研究用
アッセイ[センタカー(Centacor)CA 15
−3、センタカー、モールパン、ペンシルバニア]で試
験したときも境界線上の陽性を示した。
た。第1図は、検査済(documented)正常ヒ
ト血清の群からは本実施例のCTAアッセイにより陽性
のものは1例もなかったこと、および45の正常血液供
給者血清からはわずかに1例のみが陽性と試験されたこ
とを示している。この陽性の試料は、他の市販の研究用
アッセイ[センタカー(Centacor)CA 15
−3、センタカー、モールパン、ペンシルバニア]で試
験したときも境界線上の陽性を示した。
第2図では、良性の***疾患、初期乳癌およびステージ
■乳癌をヒト血清において、第1図て示した正常血液供
給者群と比較して試験した結果を示す。第2図に示した
結果かられかるように、29例の良性***疾患血清のう
ぢ3例、68例の初期乳癌血清のうち21例、93例の
ステージ■乳癌血清のうち72例かCTAアッセイによ
り陽性と試験された。
■乳癌をヒト血清において、第1図て示した正常血液供
給者群と比較して試験した結果を示す。第2図に示した
結果かられかるように、29例の良性***疾患血清のう
ぢ3例、68例の初期乳癌血清のうち21例、93例の
ステージ■乳癌血清のうち72例かCTAアッセイによ
り陽性と試験された。
第3図には、本発明のCTAアッセイとCAl5−3ア
ツセイとの比較を示す。67例の試料が、ユニバージテ
ィー・オブ・トロント・メディカル・センター(the
University of Toronto Me
dica] Center) (l〜ロンド、カナダ)
およびライスコンシン・クリニカル・キャンサー・セン
ター(theWisconsin C11nical
Cancer Center)(マシソン、ライスコン
シン)から得られた検査済試料パネルからのものである
。正常な女性は、***の検査、家族歴および正常な月経
周期により検査されタモノである。水平の破線はカット
オフ(バックグラウンドの02を差し引いである)を表
していて、正常なレベルのCTAマーカーのヒトを癌の
関与する高いレベルのヒトから分けており、血液供給者
群の平均プラスその平均の2つの標準偏差に基づいてい
る。選んだカットオフレベルは、特異性を高めるために
平均プラス第3図の検査済正常婦人群の3つの標準偏差
よりも太きい。CAl5−3アツセイで陰性であった試
料は・て、CA15−3アツセイで陽性であったムで示
しである。
ツセイとの比較を示す。67例の試料が、ユニバージテ
ィー・オブ・トロント・メディカル・センター(the
University of Toronto Me
dica] Center) (l〜ロンド、カナダ)
およびライスコンシン・クリニカル・キャンサー・セン
ター(theWisconsin C11nical
Cancer Center)(マシソン、ライスコン
シン)から得られた検査済試料パネルからのものである
。正常な女性は、***の検査、家族歴および正常な月経
周期により検査されタモノである。水平の破線はカット
オフ(バックグラウンドの02を差し引いである)を表
していて、正常なレベルのCTAマーカーのヒトを癌の
関与する高いレベルのヒトから分けており、血液供給者
群の平均プラスその平均の2つの標準偏差に基づいてい
る。選んだカットオフレベルは、特異性を高めるために
平均プラス第3図の検査済正常婦人群の3つの標準偏差
よりも太きい。CAl5−3アツセイで陰性であった試
料は・て、CA15−3アツセイで陽性であったムで示
しである。
第3図に示されるように、検査済正常な試料では、CT
AアッセイにおいてもCA]、5−3アツセイにおいて
も26例のうち陽性の例は見られない。
AアッセイにおいてもCA]、5−3アツセイにおいて
も26例のうち陽性の例は見られない。
しかしながら、血液供給者の場合には、CA15−3ア
ツセイでは67例のうち11例か陽性であるのに対して
、CTAアッセイではこれら67例のうちわずかに1例
のみが陽性と示された。また良性の***疾患では、CA
15−3アツセイでは32例の試料のうち1例が陽性の
結果であったのに対し、CTAアッセイではこれらの試
料のうちで陽性は見られなかった。最後にCA15−3
アツセイでは66例のステージ■&■乳癌試料のうち8
例、92例のステージ■乳癌試料のうち49例がそれぞ
れ陽性とされたのに対し、CTAアッセイでは66例の
ステージ1.l乳癌試料のうぢ11例、92例のステー
ジ■乳癌試料のうち66例がそれぞれ陽性とされた。
ツセイでは67例のうち11例か陽性であるのに対して
、CTAアッセイではこれら67例のうちわずかに1例
のみが陽性と示された。また良性の***疾患では、CA
15−3アツセイでは32例の試料のうち1例が陽性の
結果であったのに対し、CTAアッセイではこれらの試
料のうちで陽性は見られなかった。最後にCA15−3
アツセイでは66例のステージ■&■乳癌試料のうち8
例、92例のステージ■乳癌試料のうち49例がそれぞ
れ陽性とされたのに対し、CTAアッセイでは66例の
ステージ1.l乳癌試料のうぢ11例、92例のステー
ジ■乳癌試料のうち66例がそれぞれ陽性とされた。
実施例2
本実施例では、試料をノイラミニダーゼで処理して潜在
腫瘍関連抗原を反応のために遊離させることによる、潜
在腫瘍関連抗原のための競合アッセイ法を記載する。
腫瘍関連抗原を反応のために遊離させることによる、潜
在腫瘍関連抗原のための競合アッセイ法を記載する。
(a) 85 / 34抗体/アルカリホスファターゼ
結合体の調製 85 / 34 抗体/アルカリホスファターセ結合体
を以下のようにして調製した。
結合体の調製 85 / 34 抗体/アルカリホスファターセ結合体
を以下のようにして調製した。
NaIO3(214mg)と0.01MNa2C○3(
2xLpH9,5)を加えることにより50mM N
a+04(2zC)を調製する。等容量の過ヨウ素酸塩
溶液とアルカリホスファターゼ(10mq/ ic)、
すなわちアルカリホスファターゼ(300μρ)と過ヨ
ウ素酸塩(300μのを一緒に加え、室温で2時間イン
キュベートする。9順容G−25カラム[ファルマシア
・バイオテクノロジー・プロダクツ(P harmac
ia B iotechnology P roduc
ts)、ビス力タウエー、ニューシャーシー]1.o1
MNa、C○a(pH9、5)で平衡化する。ついで活
性化アルカリポスファターセをカラムの」二に通し、約
1mρのフラクションを集め、集めた第一のフラクショ
ンについで280nmて吸光度を読み取る。
2xLpH9,5)を加えることにより50mM N
a+04(2zC)を調製する。等容量の過ヨウ素酸塩
溶液とアルカリホスファターゼ(10mq/ ic)、
すなわちアルカリホスファターゼ(300μρ)と過ヨ
ウ素酸塩(300μのを一緒に加え、室温で2時間イン
キュベートする。9順容G−25カラム[ファルマシア
・バイオテクノロジー・プロダクツ(P harmac
ia B iotechnology P roduc
ts)、ビス力タウエー、ニューシャーシー]1.o1
MNa、C○a(pH9、5)で平衡化する。ついで活
性化アルカリポスファターセをカラムの」二に通し、約
1mρのフラクションを集め、集めた第一のフラクショ
ンについで280nmて吸光度を読み取る。
吸光係数を1と仮定して、0 、01− M Na2
C○4を用いて活性化アルカリホスファターゼの濃度を
1my/xρに調節する。ついでl、 M MgC1
2およびO,]、 M ZnCl、を最終濃度がそれ
ぞれ1mMおよび0.1mMとなるように加える。
C○4を用いて活性化アルカリホスファターゼの濃度を
1my/xρに調節する。ついでl、 M MgC1
2およびO,]、 M ZnCl、を最終濃度がそれ
ぞれ1mMおよび0.1mMとなるように加える。
活性化アルカリホスファターセをモル比1:]で実施例
1記載の85/34抗体に結合さける。
1記載の85/34抗体に結合さける。
抗体および酵素を暗所、室温にて4〜6時間−緒にイン
キュベーI・する。ついでNaBH,、(1,011!
7)およびO,Ol、M NaC03(pH9,5)
(2mのを加える。ついで、反応溶液各1駁についでN
aBH4溶液(35μa)を加える。これを4°Cて一
夜インキュへ−1・する。ついでN a B I−1、
容量の1/10に等しい量のアセトンを加える。最後に
結合体をQ、iMトリス、Q、5M NaC1,20
%仔ウシ血清および3%トリトンを含む希釈液で希釈し
、抗体濃度を+−00Mg/mQにもっていく。他に用
いることのできる希釈液は、PBS中のB S A(]
2ma/mQ。pH7,4,)である。抗体−アルカリ
ポスファターセ結合体は一20°Cて貯蔵する。
キュベーI・する。ついでNaBH,、(1,011!
7)およびO,Ol、M NaC03(pH9,5)
(2mのを加える。ついで、反応溶液各1駁についでN
aBH4溶液(35μa)を加える。これを4°Cて一
夜インキュへ−1・する。ついでN a B I−1、
容量の1/10に等しい量のアセトンを加える。最後に
結合体をQ、iMトリス、Q、5M NaC1,20
%仔ウシ血清および3%トリトンを含む希釈液で希釈し
、抗体濃度を+−00Mg/mQにもっていく。他に用
いることのできる希釈液は、PBS中のB S A(]
2ma/mQ。pH7,4,)である。抗体−アルカリ
ポスファターセ結合体は一20°Cて貯蔵する。
(b)微細粒子の調製
ラテックス微細粒子[0,21ミクロン、セラジン(S
eradyn)(インデイアナポリス、インデイアナ
)より市販]の2.5%溶液を、微細粒子(41゜66
uのを蒸留水(4,58,34,mの中に希釈すること
により調製した。単一サイズの混合床樹脂(mixed
bed resin)を用い、希釈微細粒子ど該樹脂
を21の比(500順粒子:250g樹脂)で混合する
ことにより、微細粒子をイオン交換媒体中で前以て洗浄
した。粒子/樹脂混合物を室温で1時間回転させ、つい
で州なガラス濾過器で濾過した。
eradyn)(インデイアナポリス、インデイアナ
)より市販]の2.5%溶液を、微細粒子(41゜66
uのを蒸留水(4,58,34,mの中に希釈すること
により調製した。単一サイズの混合床樹脂(mixed
bed resin)を用い、希釈微細粒子ど該樹脂
を21の比(500順粒子:250g樹脂)で混合する
ことにより、微細粒子をイオン交換媒体中で前以て洗浄
した。粒子/樹脂混合物を室温で1時間回転させ、つい
で州なガラス濾過器で濾過した。
ついで樹脂を蒸留水で2〜3回、しかしわずかに4、0
0 好の水で洗浄する。ついで粒子を10,000 r
pmで20分間遠心分離し、」二澄み液を流し去り、粒
子を最終審!50oz+2まで蒸留水中に再懸濁する。
0 好の水で洗浄する。ついで粒子を10,000 r
pmで20分間遠心分離し、」二澄み液を流し去り、粒
子を最終審!50oz+2まで蒸留水中に再懸濁する。
前以て洗浄した2、5%微細粒子(iffρ)を、室温
にてカルボジイミド(EDACXo、2xh/順、1、
Io、)[下記MESバッファ=(50z(2)中にE
DAC(シグマ・ケミカル社、セントルイス、ミズーリ
)(0,1y)]および55mM MESバッファー(
2屑ρ)と混合する。MESバッファーは、5mMME
S(シグマ・ケミカル社)(0,8W)を蒸留水(80
0yxのと混合し6N NaOHでpHを4.75に
調節することにより調製する。
にてカルボジイミド(EDACXo、2xh/順、1、
Io、)[下記MESバッファ=(50z(2)中にE
DAC(シグマ・ケミカル社、セントルイス、ミズーリ
)(0,1y)]および55mM MESバッファー(
2屑ρ)と混合する。MESバッファーは、5mMME
S(シグマ・ケミカル社)(0,8W)を蒸留水(80
0yxのと混合し6N NaOHでpHを4.75に
調節することにより調製する。
(c)微細粒子の抗原コーティング
微細粒子混合物を10秒間撹拌し、ついでPBS中のD
IJ14.5抗原調製物(培養物から得られた5300
ゲル浸透クロマトグラフイー精製フラクシヨン)の1:
5希釈を加える。D U 1.45細胞株はアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション(ロックビル、メ
リーランF)からA T CC# HTB−8]、Eで
入手可能であり、ヒト前立腺癌腫、脳への移転である[
詳細はT nternatl、 J、 Cancer、
21.274〜28](1,978)に記載されている
]。この細胞株は、10%ウシ胎仔血請を含む90%イ
ーグル最小必須培地で成育する。
IJ14.5抗原調製物(培養物から得られた5300
ゲル浸透クロマトグラフイー精製フラクシヨン)の1:
5希釈を加える。D U 1.45細胞株はアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション(ロックビル、メ
リーランF)からA T CC# HTB−8]、Eで
入手可能であり、ヒト前立腺癌腫、脳への移転である[
詳細はT nternatl、 J、 Cancer、
21.274〜28](1,978)に記載されている
]。この細胞株は、10%ウシ胎仔血請を含む90%イ
ーグル最小必須培地で成育する。
微細粒子とDU14.5抗原を低速で5秒間撹拌し、室
温で2時間回転させ、ついで1.0.00Orpmで3
0分間遠心分離する。ついで上澄み液を抗原コーティン
グ微細粒子ペレy l・を傷つけないように注意深く除
き、PBS/ツイーン溶液(1mのを加えて洗浄し、つ
いで撹拌とピペットの先端を用いてペレッI・を均一な
懸濁液に破砕する。
温で2時間回転させ、ついで1.0.00Orpmで3
0分間遠心分離する。ついで上澄み液を抗原コーティン
グ微細粒子ペレy l・を傷つけないように注意深く除
き、PBS/ツイーン溶液(1mのを加えて洗浄し、つ
いで撹拌とピペットの先端を用いてペレッI・を均一な
懸濁液に破砕する。
この洗浄工程を5回繰り返し、ついで洗浄した微細粒子
を25g剣を通して引っ張る。ついで微細粒子をPBS
/ツイーン(10mの中に再懸濁腰1、 O,OOOr
pmて20分間遠心分離にかける。
を25g剣を通して引っ張る。ついで微細粒子をPBS
/ツイーン(10mの中に再懸濁腰1、 O,OOOr
pmて20分間遠心分離にかける。
ペレットを上記のようにしてPBS/ツイーン中で再び
洗浄り、10.OOOrpmで15分間遠心分離にかけ
る。ついでペレットを傷つけないように注意して」二澄
み液を除く。ついで50 mM l−リス、100mM
NaCl、0.1%BSAI)T(8゜0からなる
オーバーコーティンクハソファ−(1友のを加えてペレ
ットを洗浄し、撹拌およびピペットの先端を用いてペレ
ットを均一な懸濁液に破砕する。撹拌およびピペットで
微細粒子の混合を続けながら、オーバーコーテイングバ
ッファーを1m夕から5靜まて増加させながら加える。
洗浄り、10.OOOrpmで15分間遠心分離にかけ
る。ついでペレットを傷つけないように注意して」二澄
み液を除く。ついで50 mM l−リス、100mM
NaCl、0.1%BSAI)T(8゜0からなる
オーバーコーティンクハソファ−(1友のを加えてペレ
ットを洗浄し、撹拌およびピペットの先端を用いてペレ
ットを均一な懸濁液に破砕する。撹拌およびピペットで
微細粒子の混合を続けながら、オーバーコーテイングバ
ッファーを1m夕から5靜まて増加させながら加える。
混合物をPBS/ツイーンで]、0zffまでもってい
き、45°Cて一夜貯蔵する。微細粒子混合物を再び1
0゜000で30分間遠心分離にかけ、ついで」二記洗
浄工程をもう1度繰り返す。最後に、撹拌およびピペッ
トでペレットを均一なQ 測/&に破砕しながら、PB
S/ツイーン(1,mのを加えて洗浄した微細粒子を再
懸濁し、最終容量を101にもっていく。コーティング
微細粒子を2〜8°Cで貯蔵する。
き、45°Cて一夜貯蔵する。微細粒子混合物を再び1
0゜000で30分間遠心分離にかけ、ついで」二記洗
浄工程をもう1度繰り返す。最後に、撹拌およびピペッ
トでペレットを均一なQ 測/&に破砕しながら、PB
S/ツイーン(1,mのを加えて洗浄した微細粒子を再
懸濁し、最終容量を101にもっていく。コーティング
微細粒子を2〜8°Cで貯蔵する。
(d)潜在腫瘍関連抗原の抑制アッセイトリス(]、2
2.1gの、EDTA(0,336!r/の、NaC1
(29,22q/のおよびB S A(0,5y/ρ)
を含有する希釈ハソファー(50μの、ならびにノイラ
ミニダーゼ(クロストリジウム・パーフリンシェンス、
タイプX5シグマ・ケミカル社)(250uU/iのを
含有する蒸留水を患者の血清試料(50μ夕、希釈パン
ファー中に1.10で希釈)に加え、5分間インキュー
・−トする。ついで85/34抗体−アルカリポスファ
ターセ結合体(100μのを加えて25分間インキュベ
ートし、ついでD U ]、 4.5コ一テイング微細
粒子(80μのを加える。反応溶液を34°Cにて20
分間インキユヘートし、ついでアルカリポスファターセ
の存在下で蛍光を発するメチリルウンベリフェロン蛍光
団基質(MUP)を加える。蛍光を448 nmで測定
する。
2.1gの、EDTA(0,336!r/の、NaC1
(29,22q/のおよびB S A(0,5y/ρ)
を含有する希釈ハソファー(50μの、ならびにノイラ
ミニダーゼ(クロストリジウム・パーフリンシェンス、
タイプX5シグマ・ケミカル社)(250uU/iのを
含有する蒸留水を患者の血清試料(50μ夕、希釈パン
ファー中に1.10で希釈)に加え、5分間インキュー
・−トする。ついで85/34抗体−アルカリポスファ
ターセ結合体(100μのを加えて25分間インキュベ
ートし、ついでD U ]、 4.5コ一テイング微細
粒子(80μのを加える。反応溶液を34°Cにて20
分間インキユヘートし、ついでアルカリポスファターセ
の存在下で蛍光を発するメチリルウンベリフェロン蛍光
団基質(MUP)を加える。蛍光を448 nmで測定
する。
上記アッセイを行い蛍光量を測定するのに特に有用な装
置の−っは、アポ、1・・ラボラトリーズ(アボットパ
ーク、イリノイ)から入手可能なIMXTMi置である
。蛍光の量は試料中の潜在腫瘍関連抗原の量に反比例す
る。すなわぢ、蛍光の量が少ないことは試料中の高い量
の抗原が存在することを示し、逆に蛍光の量が多いと試
料中に低い量の抗原か存在するこ七を示している。
置の−っは、アポ、1・・ラボラトリーズ(アボットパ
ーク、イリノイ)から入手可能なIMXTMi置である
。蛍光の量は試料中の潜在腫瘍関連抗原の量に反比例す
る。すなわぢ、蛍光の量が少ないことは試料中の高い量
の抗原が存在することを示し、逆に蛍光の量が多いと試
料中に低い量の抗原か存在するこ七を示している。
第4図、第5図および第6図に、本実施例のCTAアッ
セイの試験結果を示す。第4図は、本実施例のCTAア
ッセイをCA l 5−3アツセイと比較して示す。2
6例の検査済正常なヒト血清(疾患なし)を試験したと
ころ、CTAアッセイではわずかに1例が陽性と認めら
れたが、CA15−3アツセイでは2例が陽性であった
。さらに正常群を試験したところ(第5図)、CTAア
ッセイおよびCA15−3アツセイはそれぞれ25例中
1例を陽性と認めた。ステージ■の乳癌試料についでは
(第6図)、CTAアッセイでは28例中17例を陽性
と検出したのに対して、CA]5−3アツセイでは28
例中16例を陽性と検出した。
セイの試験結果を示す。第4図は、本実施例のCTAア
ッセイをCA l 5−3アツセイと比較して示す。2
6例の検査済正常なヒト血清(疾患なし)を試験したと
ころ、CTAアッセイではわずかに1例が陽性と認めら
れたが、CA15−3アツセイでは2例が陽性であった
。さらに正常群を試験したところ(第5図)、CTAア
ッセイおよびCA15−3アツセイはそれぞれ25例中
1例を陽性と認めた。ステージ■の乳癌試料についでは
(第6図)、CTAアッセイでは28例中17例を陽性
と検出したのに対して、CA]5−3アツセイでは28
例中16例を陽性と検出した。
潜在腫瘍関連抗原のアッセイにおいて試料をノイラミニ
ダーゼで処理することにより多くの利点が得られる。第
一に、反応のために抗原を露出させることにより、従来
は検出されなかったかまたは検出されてもわずかな量し
か検出することができなかった患者試料中の抗原を今や
検出することが可能になったことである。第二に、ノイ
ラミニダーセ処理により抗原を遊離させて、アッセイで
選択した抗体に対して一層特異的な反応に供することが
できる。第三に、従来のアッセイに比べて癌患者におけ
る腫瘍関連抗原の検出量が大きいことからも明らかなよ
うに、本発明の潜在腫瘍関連抗原アッセイは従来のアッ
セイに比べて感度が向上している。第四に、本発明のア
ッセイでは従来のアッセイに比べて偽陽性比が低くなっ
ている。
ダーゼで処理することにより多くの利点が得られる。第
一に、反応のために抗原を露出させることにより、従来
は検出されなかったかまたは検出されてもわずかな量し
か検出することができなかった患者試料中の抗原を今や
検出することが可能になったことである。第二に、ノイ
ラミニダーセ処理により抗原を遊離させて、アッセイで
選択した抗体に対して一層特異的な反応に供することが
できる。第三に、従来のアッセイに比べて癌患者におけ
る腫瘍関連抗原の検出量が大きいことからも明らかなよ
うに、本発明の潜在腫瘍関連抗原アッセイは従来のアッ
セイに比べて感度が向上している。第四に、本発明のア
ッセイでは従来のアッセイに比べて偽陽性比が低くなっ
ている。
最後に、本発明のアッセイは便利で操作が簡単である。
以上、本発明を実施例に基づいて説明したか、本発明の
範囲内において当業者か種々の変更を加え得ることは理
解されなければならない。たとえは、他の腫瘍関連抗原
の糖残基を、そのような糖結合を消化するのに適当な酵
素を用いて取り除(ことにより、他の多くの腫瘍関連抗
原の検出能を高めるであろう。
範囲内において当業者か種々の変更を加え得ることは理
解されなければならない。たとえは、他の腫瘍関連抗原
の糖残基を、そのような糖結合を消化するのに適当な酵
素を用いて取り除(ことにより、他の多くの腫瘍関連抗
原の検出能を高めるであろう。
第1図は、検査済正常ヒト血清および正常血液供給者に
ついで本発明の実施例1のCTAアッセイを行った結果
を示すグラフ、第2図は、良性の***疾患、初期乳癌、
ステージ■乳癌および第1図の正常血液供給者についで
本発明の実施例1のCTAアッセイを行った結果を示す
グラフ、第3図は、血液供給者、良性の***疾患、ステ
ージ1v乳癌、ステージI&n乳癌および正常な婦人に
ついで本発明の実施例1のCTAアッセイと市販のCA
15−3アツセイとを比較して示すグラフ、第4図は、
検査済の疾患のない正常な試料についで本発明の実施例
2のCTAアッセイと市販のCA15−3アツセイとを
比較して示すグラフ、第5図は、正常な血液供給者につ
いで本発明の実施例2のCT Aアッセイと市販のCA
1.5−3アツセイとを比較して示すグラフ、第6図は
、ステーン■の乳癌患者試料についで本発明の実施例2
のCTAアッセイと市販のCA、 1.5−3アツセイ
とを比較して示すグラフである。
ついで本発明の実施例1のCTAアッセイを行った結果
を示すグラフ、第2図は、良性の***疾患、初期乳癌、
ステージ■乳癌および第1図の正常血液供給者についで
本発明の実施例1のCTAアッセイを行った結果を示す
グラフ、第3図は、血液供給者、良性の***疾患、ステ
ージ1v乳癌、ステージI&n乳癌および正常な婦人に
ついで本発明の実施例1のCTAアッセイと市販のCA
15−3アツセイとを比較して示すグラフ、第4図は、
検査済の疾患のない正常な試料についで本発明の実施例
2のCTAアッセイと市販のCA15−3アツセイとを
比較して示すグラフ、第5図は、正常な血液供給者につ
いで本発明の実施例2のCT Aアッセイと市販のCA
1.5−3アツセイとを比較して示すグラフ、第6図は
、ステーン■の乳癌患者試料についで本発明の実施例2
のCTAアッセイと市販のCA、 1.5−3アツセイ
とを比較して示すグラフである。
Claims (10)
- (1)(a)体液試料をノイラミニダーゼで処理するこ
とによって潜在腫瘍関連抗原に特異的な抗体との反応の
ために該潜在腫瘍関連抗原を完全に遊離させ、ついで (b)潜在腫瘍関連抗原のためのイムノアッセイにより
上記ノイラミニダーゼ処理試料を試験することを特徴と
する、体液試料中の潜在腫瘍関連抗原の検出方法。 - (2)工程(a)と工程(b)を同時に行う特許請求の
範囲第(1)項記載の方法。 - (3)体液試料中の潜在腫瘍関連抗原の検出方法であっ
て、 (a)潜在腫瘍関連抗原に特異的な抗体を固相上に吸着
させ、 (b)試料をノイラミニダーゼで処理し、 (c)抗体コーティング固相に上記試料を加えてインキ
ュベートし、 (d)固相を洗浄して未反応の試料を除き、 (e)潜在腫瘍関連抗原に特異的な標識抗体を加えてイ
ンキュベートし、 (f)固相を洗浄して未反応の標識抗体を除き、ついで (g)標識を検出して試料中の腫瘍関連抗原の存在また
は量を測定する ことを特徴とする方法。 - (4)工程(b)と工程(c)を同時に行う特許請求の
範囲第(3)項記載の方法。 - (5)固相抗体が、パラグロボシド(PG)(Galβ
1、4−GlcNAcβ1、3−Galβ1、4−Gl
cβ1、1セラミド)およびオリゴ糖のN−アセチルラ
クトースアミンに反応性のモノクローナル抗体である特
許請求の範囲第(3)項記載の方法。 - (6)標識抗体が、アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションにATCCナンバーHB8215で寄託さ
れているF36/22ハイブリドーマ細胞株により産生
されたF36/22モノクローナル抗体である特許請求
の範囲第(3)項記載の方法。 - (7)体液試料中の潜在腫瘍関連抗原の検出方法であっ
て、 (a)試料をノイラミニダーゼで処理し、 (b)腫瘍関連抗原に特異的な標識抗体を試料に加えて
インキュベートし、 (c)腫瘍関連抗原をコーティングした固相を試料に加
えてインキュベートし、 (d)固相を液相から分離し、ついで (e)固相上の標識を検出して試料中の腫瘍関連抗原を
測定する ことを特徴とする方法。 - (8)工程(a)と工程(b)を同時に行う特許請求の
範囲第(7)項記載の方法。 - (9)標識抗体が、パラグロボシド(PG)(Galβ
1、4−GlcNAcβ1、3−Galβ1、4−Gl
cβ1、1セラミド)およびオリゴ糖のN−アセチルラ
クトースアミンに反応性のモノクローナル抗体である特
許請求の範囲第(7)項記載の方法。 - (10)固相抗原が、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクションよりATCC♯HTB−81Eで入手可
能なDU145細胞株から得られたDU145抗原調製
物である特許請求の範囲第(7)項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US12343987A | 1987-11-20 | 1987-11-20 | |
US123439 | 1987-11-20 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01165964A true JPH01165964A (ja) | 1989-06-29 |
Family
ID=22408693
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63293442A Pending JPH01165964A (ja) | 1987-11-20 | 1988-11-19 | 腫瘍関連抗原の検出方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0316764B1 (ja) |
JP (1) | JPH01165964A (ja) |
KR (1) | KR970001318B1 (ja) |
AT (1) | ATE107033T1 (ja) |
AU (1) | AU616919B2 (ja) |
DE (1) | DE3850046D1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7251104B2 (en) | 2003-06-23 | 2007-07-31 | Sony Corporation | Recording medium cartridge |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1340927C (en) * | 1987-10-09 | 2000-03-14 | Peter S. Linsley | Method for increasing the sensitivity of assays for target ligand |
CA2065874C (en) * | 1989-09-15 | 2001-12-11 | Joseph P. Brown | Hybridoma ct43 producing a monoclonal antibody to a mucin epitope of colorectal cancer |
WO2004037272A1 (ja) * | 2002-10-22 | 2004-05-06 | Japan Science And Technology Agency | デング熱ウィルス感染阻害剤 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4743543A (en) * | 1985-09-09 | 1988-05-10 | Coulter Corporation | Method for enhancing and/or accelerating immunoassay detection of human carcinoma tumor associated antigen in a pathology sample |
DE3685483D1 (de) * | 1985-10-22 | 1992-07-02 | Centocor Inc | Immunometrischer test fuer hochmolekulargewichtiges karzinoembryonisches antigen. |
CA1340927C (en) * | 1987-10-09 | 2000-03-14 | Peter S. Linsley | Method for increasing the sensitivity of assays for target ligand |
-
1988
- 1988-11-10 DE DE3850046T patent/DE3850046D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-11-10 EP EP88118727A patent/EP0316764B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-11-10 AT AT88118727T patent/ATE107033T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-11-16 AU AU25620/88A patent/AU616919B2/en not_active Ceased
- 1988-11-18 KR KR1019880015200A patent/KR970001318B1/ko active IP Right Grant
- 1988-11-19 JP JP63293442A patent/JPH01165964A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7251104B2 (en) | 2003-06-23 | 2007-07-31 | Sony Corporation | Recording medium cartridge |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0316764B1 (en) | 1994-06-08 |
KR890008328A (ko) | 1989-07-10 |
AU616919B2 (en) | 1991-11-14 |
KR970001318B1 (ko) | 1997-02-05 |
EP0316764A3 (en) | 1990-07-25 |
EP0316764A2 (en) | 1989-05-24 |
DE3850046D1 (de) | 1994-07-14 |
ATE107033T1 (de) | 1994-06-15 |
AU2562088A (en) | 1989-05-25 |
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