JPH01141596A - Production of alkaline protease - Google Patents
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- JPH01141596A JPH01141596A JP29782487A JP29782487A JPH01141596A JP H01141596 A JPH01141596 A JP H01141596A JP 29782487 A JP29782487 A JP 29782487A JP 29782487 A JP29782487 A JP 29782487A JP H01141596 A JPH01141596 A JP H01141596A
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Classifications
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
Ｃ産業上の利用分野〕
本発明は、遺伝子組換技術を利用した、バチルス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ）属徽生物由来のアルカリプロテアーゼの
工業的に有利な製造方法を提供するものである。[Detailed Description of the Invention] C. Industrial Application Field] The present invention is directed to the production of Bacillus (Ba
The present invention provides an industrially advantageous method for producing alkaline protease derived from organisms of the genus Cillus.
Ｃ従来の技術〕
アルカリプロテアーゼはバチルス属細菌が分泌する菌体
外蛋白の典型的な例であり、その用途は皮革加工用、食
品工業用、洗剤添加用、医薬品など多岐にわたる。C. Prior Art] Alkaline protease is a typical example of an extracellular protein secreted by bacteria of the genus Bacillus, and its uses are wide-ranging, including leather processing, food industry, detergent additives, and pharmaceuticals.
従来、バチルス属微生物由来のアルカリプロテアーゼは
これらの菌からの醗酵法により製造されている。しかし
、従来の醗酵法では菌体量あたりの収量が低く、また他
の菌体外蛋白などの夾雑物が多く回収構造等の工程が複
雑になる。このため、より生産性が高く、製造工程の簡
略化されたプロテアーゼの製造法の開発が望まれる。Conventionally, alkaline protease derived from microorganisms of the genus Bacillus has been produced by fermentation from these bacteria. However, in the conventional fermentation method, the yield per cell mass is low, and there are many contaminants such as other extracellular proteins, which complicates the process such as the recovery structure. Therefore, it is desired to develop a method for producing protease that has higher productivity and a simplified production process.
このため、従来からプロテアーゼ生産菌の改良が行われ
ており、このために一般に人工的突然変異法が利用され
てきたが、プロテアーゼ生産性の観点からはいまだ充分
満足するものは得られていない。さらに人工的突然変異
法では、酵素の特性に変化がおこる可能性もあり、改良
法としては最適とはいえない。For this reason, efforts have been made to improve protease-producing bacteria, and artificial mutation methods have generally been used for this purpose, but none have yet been obtained that are fully satisfactory from the standpoint of protease productivity. Furthermore, the artificial mutation method may cause changes in the properties of the enzyme, so it is not optimal as an improvement method.
また、最近開発された遺伝子組換え技術を利用してアル
カリプロテアーゼの生産性を高める試みもなされている
が工業的に利用可能なものとじては未だ成功の域には達
していない。Furthermore, attempts have been made to increase the productivity of alkaline protease using recently developed genetic recombination techniques, but this has not yet reached the level of success as an industrially applicable method.
従って本発明は、遺伝子組換技術によってアルカリプロ
テアーゼ生産能が向、ヒした微生物を作製し、これを用
いて工業的に有利にアルカリプロテアーゼを製造するこ
とができる方法を提供することを目的とするものである
。Therefore, an object of the present invention is to create a microorganism with improved alkaline protease production ability by genetic recombination technology, and to provide a method for industrially advantageous production of alkaline protease using this microorganism. It is something.
本発明者等は、上記の目的を達成するための鋭意研究を
重ねた結果、アルカリプロテアーゼを生産することが知
られているバチルス属微生物から、アルカリプロテアー
ゼの生産に関与する遺伝子をクローン化することに成功
し、さらにこの遺伝子の構成を解明した。さらにこのク
ローン化された遺伝子を適当な宿主に導入することによ
り、該遺伝子が由来する野性株よりはるかに高いアルカ
リプロテアーゼ生産能を有する形質転換体を得、アルカ
リプロテアーゼの工業的生産性を大幅に向上させること
に成功した。As a result of extensive research to achieve the above objective, the present inventors have cloned a gene involved in the production of alkaline protease from a Bacillus microorganism known to produce alkaline protease. We succeeded in this and further elucidated the composition of this gene. Furthermore, by introducing this cloned gene into a suitable host, a transformant with far higher alkaline protease production ability than the wild strain from which the gene is derived can be obtained, greatly increasing the industrial productivity of alkaline protease. succeeded in improving it.
従って、本発明は、バチルス（Ｂａｃ ｉ １１ ｕｓ
）属微生物由来のアルカリプロテアーゼをコードする構
造遺伝子を含有するＤＮＡ断片であって、（ａ）該ＤＮ
Ａ断片は制限酵素切断点ｆｌｐａｌと１１ａｅｌｕとに
より両端を規定される領域を含んで成り：
（ｂ）前記制限酵素切断点Ｈｐａ Ｉと１ＩａｅｌＴＩ
との間に他の制限酵素切断点Ｈｉｒ＋ｄｌｌｌ 、
Ｓｐｈ Ｉ及びＳａｃ １を含有し；そして
（ｃ）前記制限酵素切断片１１ｐａｌとＨａｅ ｍとの
間に制限酵素切断点Ｃ１ａｌ 、ＢｇｌＩＩ 、Ｂａｍ
ＨＩ 、ＥｃｏＲＩ。Therefore, the present invention is directed to Bacillus (Bacillus 11 us).
) A DNA fragment containing a structural gene encoding an alkaline protease derived from a microorganism of the genus
The A fragment comprises a region defined at both ends by restriction enzyme cleavage points flpal and 11aelu: (b) said restriction enzyme cleavage points Hpa I and 1IaelTI;
There are other restriction enzyme cutting points between Hir+dllll,
contains Sph I and Sac 1; and (c) restriction enzyme cleavage points C1al, BglII, Bam between the restriction enzyme cleavage fragment 11pal and Haem.
HI, EcoRI.
Ｐｓｔｌ 、５ａｌＩ 、５Ｌｌａｌ 、ＸｂａＩ、及
びＸｈｏ Ｉを含有しない；
ことを特徴とするＤＮＡ断片、あるいは前記構造遺伝子
の発現能が破壊されない範囲でこのＤＮＡ断片が短縮さ
れたＤＮＡ断片、あるいはアミノ酸配列を変えることな
く１個又は複数個の塩基が置換されているＤＮＡ断片；
このＤＮＡ断片及び選択マーカー遺伝子を含んで成るＤ
ＮＡ ＨこのＤＮＡ断片の導入により形質転換された細
菌；並びに前記ＤＮＡ断片の導入により形質転換された
微生物を培養し、得られた培養物からアルカリプロテア
ーゼを採取することを特徴とするアルカリプロテアーゼ
の製造方法を提供するものである。A DNA fragment characterized by not containing Pstl, 5alI, 5Llal, XbaI, and XhoI, or a DNA fragment in which this DNA fragment is shortened to the extent that the expression ability of the structural gene is not destroyed, or a DNA fragment in which the amino acid sequence is changed. DNA fragments in which one or more bases are substituted without any
D comprising this DNA fragment and a selection marker gene
NAH A bacterium transformed by the introduction of this DNA fragment; and a microorganism transformed by the introduction of the DNA fragment are cultured, and alkaline protease is collected from the resulting culture. The present invention provides a method.
遺伝子組換え技術による微生物の改良は一般に先ず遺伝
子を、必要により該遺伝子の発現及び発現生成物の分泌
のための遺伝子と共に、その供与細胞から取り出し、試
験管内でベクターＤＮＡと結合させ、得られた組換え体
ＤＮＡを宿主細胞に取り込ませる。そして目的とする組
換え体ＤＮＡを有する宿主細胞を増殖せしめ、導入遺伝
子を発現せしめることによって目的の生成物を得る。The improvement of microorganisms by genetic recombination technology generally involves first removing a gene from its donor cell, optionally together with genes for expression of the gene and secretion of the expression product, and combining it with vector DNA in vitro. The recombinant DNA is introduced into host cells. Then, a host cell containing the desired recombinant DNA is grown and the introduced gene is expressed, thereby obtaining the desired product.
本発明においては、形質転換体におけるアルカリプロテ
アーゼの高い生産性を得るため、目的生成物であるアル
カリプロテアーゼの構造遺伝子と共に、該構造遺伝子に
天然に付随している発現・分泌に必要な領域、例えばプ
ロモーター領域、ブレ・プロ配列コード領域、ターミネ
ータ−領域を用いるのが好ましい。従って、本発明にお
いては、前記構造遺伝子とその関連遺伝子領域を一体と
して切り出す。本発明におけるアルカリプロテアーゼの
構造遺伝子およびその関連遺伝子、すなわち発現・分泌
のための領域を含むＤＮＡ断片は、通常アルカリプロテ
アーゼ生産能を有する微生物の染色体ＤＮＡより適当な
制限酵素によって切り出されたものが用いられるが、原
則としてその由来については特別な制限はなく、例えば
土壌や他の天然物から分離されるアルカリプロテアーゼ
生産能を有する野性株は勿論のこと、それらを紫色線照
射や化学物質による処理をして得られる人工的突然変異
株等いずれでもよい。この様な微生物としては、アルカ
リプロテアーゼ生産能を有するバチルス属微生物であれ
ば特に制限はなく、例えばｍ１ｓ）、バチルス・アミロ
リクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｕ幻且■セ
ｅｆａＣ１ｅリー）、バチルス・フルカ０フィラス（ハ
意上り馴 旦兵４．ヒ仲−Ｕリ−）及びバチルス・ステ
アロサーモフィラス（Ｒａｅｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔ
ｈｅｒｍｏ ｈｉｌｕｓ） 、並ヒにその他のへ′チル
ス属に属する微生物があげられる。特にバチルス・リケ
ニホルミスへＴＣＣ−１４５８０、バ′チルス・ズフ゛
チルスＩＦＯ−３０１３、バチルス・アミロリクエファ
シェンス八ＴＣＣ−２３８４２、ノマチルス・ステア１
コサーモフイラスＡＴＣＣ−８００５、バチルスＮＫＳ
−２１（微工研条寄第９３号）等が適している。In the present invention, in order to obtain high productivity of alkaline protease in the transformant, in addition to the structural gene of the target product alkaline protease, the region necessary for expression and secretion that is naturally associated with the structural gene, e.g. It is preferable to use a promoter region, a ble-pro sequence coding region, and a terminator region. Therefore, in the present invention, the structural gene and its related gene region are excised as one unit. In the present invention, the structural gene of alkaline protease and its related genes, that is, DNA fragments containing regions for expression and secretion, are usually cut out using appropriate restriction enzymes from the chromosomal DNA of a microorganism capable of producing alkaline protease. However, in principle, there are no particular restrictions on their origin; for example, they can be wild strains isolated from soil or other natural products that have the ability to produce alkaline protease, or they can be irradiated with violet rays or treated with chemicals. Any artificial mutant strain obtained by doing so may be used. There are no particular restrictions on such microorganisms as long as they are microorganisms belonging to the genus Bacillus that have the ability to produce alkaline protease, such as Bacillus m1s), Bacillus amyloliquefacens, and Bacillus furca0. Raeillus (Raeillus stearot) and Bacillus stearothermophilus (Raeillus stearot)
hermo hilus), as well as other microorganisms belonging to the genus He'chilus. In particular, for Bacillus licheniformis TCC-14580, Bacillus sufutilus IFO-3013, Bacillus amyloliquefaciens 8 TCC-23842, Nomatillus stea 1
Cothermophilus ATCC-8005, Bacillus NKS
-21 (Feikoken Jokyo No. 93) etc. are suitable.
上記の染色体供与微生物から、染色体ＤＮＡ断片を得る
には、公知の方法、例えばＳａｉｔｏ−Ｍｉｕｒａの方
法（１３ｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｔ＋ｙｓ Ａｅｔａ
７２６１９（１９６３））やＭａｒｍａｒの方法（Ｊ、
Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 ３２０８（１９６１））等を
用いることができるが、これらの方法に限らず他の如何
なる方法でもよい。To obtain chromosomal DNA fragments from the above-mentioned chromosome-donating microorganisms, known methods such as the Saito-Miura method (13iochim Biopt+ys Aeta
72619 (1963)) and Marmar's method (J.
Mo1. Biol, 3208 (1961)) and the like can be used, but not limited to these methods, any other method may be used.
これらの染色体ＤＮＡより該ＤＮＡを切出すのに用いら
れる制限酵素は、アルカリプロテアーゼの構造遺伝子お
よびその発現・分泌のための領域に切断部位を有しない
ほうが扱いやすいが、切断部位を有する制限酵素でも部
分切断の条件で用いればよく、如何なるものでも使用可
能である。It is easier to use the restriction enzymes used to excise the DNA from these chromosomal DNAs if they do not have a cutting site in the structural gene of alkaline protease or in the region for its expression and secretion, but restriction enzymes that do have a cutting site can also be used. Any material can be used as long as it is used under the conditions of partial cutting.
この様にして染色体から切り出されたＤＮＡ断片は、そ
れを発現宿主細胞に導入するためのベクターに直接組み
込むこともできるが、−旦クローニングベクターに組み
込むことによってクローニングし、しかる後に導入用ベ
クターに組み込むのが便利である。このようなりローニ
ングベクターとしては、用いる宿主菌中で複製可能なも
のであれば何でもよく、例えば枯草菌を宿主とする場合
はｐＵＢ１＋、０、ｐｃ１９４ 、 ｐＥ１９４ 、
ｐＴＰ４ 、 ｐＴＰ５ 、又はｐｓＤ３０５１ （
特開昭６１−８８８７３）、あるいはそれらの−部又は
全部を含む複合プラスミド等が、また大腸菌を宿主とす
る場合は、ｐＢＲ３２２、ｐＵｃ１８ 、 ｐＨ５Ｇ３
９６゜ｐｓｃｌｏｌ 、 ｐｓＦ２１２４ 、
ｐＪＢ８ 、ｐＡｃＹｃ１８４ 、ｐｃＲｌ 、
ＲＫ６゜ｐＲＲ３２８、又はｐｓＤ３１６５（特開昭６
ｌ−１０４７９０）、あるいはその一部又は全部を含む
複合ブスラミド等があげられる。また、クローニングベ
クターとしてはファージも利用可能であり、枯草菌を宿
主とする場合はρ、ファージ、φ１０５ファージ等を、
大腸菌を宿主とする場合はλファージ、Ｍ１３ファージ
等をあげることができる。The DNA fragment excised from the chromosome in this way can be directly incorporated into a vector for introducing it into an expression host cell; It is convenient. As such, any loning vector may be used as long as it can be replicated in the host bacteria used. For example, when Bacillus subtilis is used as the host, pUB1+, 0, pc194, pE194,
pTP4, pTP5, or psD3051 (
JP-A-61-88873), or complex plasmids containing part or all of them, and when E. coli is used as a host, pBR322, pUc18, pH5G3
96゜psclol, psF2124,
pJB8, pAcYc184, pcRl,
RK6゜pRR328 or psD3165 (Unexamined Japanese Patent Publication No. 6
1-104790), or a composite busramide containing part or all thereof. In addition, phages can also be used as cloning vectors, and when using Bacillus subtilis as a host, ρ, phage, φ105 phage, etc.
When using Escherichia coli as a host, examples include λ phage and M13 phage.
クローニング用宿主としては、上記クローニングベクタ
ーを複製することができるものであれば何でもよいが、
形質転換能が高いほうが望ましく、例えば枯草菌、大腸
菌等があげられる。Any host for cloning may be used as long as it is capable of replicating the above-mentioned cloning vector, but
It is desirable that the transformation ability is high, and examples thereof include Bacillus subtilis and Escherichia coli.
形質転換の方法は通常用いられる方法で実施可能であり
、例えば枯草菌の場合にはコンビ−テントセル法（Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ８１７４Ｈ１９６１）） 、ブロ
トフ１ラスト法 （Ｍｏ１．Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ、二Ｉ
Ｑ １１１（１９７Ｂ）） 、またはレスキュー法（
Ｍｏ１．Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ、 １７７４５９（１９８
０） ）等を用いることができ、大腸菌の場合にはカル
シウム法（Ｊ、 Ｍｏ１．５３１５９（１９７０））ま
たはルビジウム法（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｈｎｚｙｓ＋
ｏｌｏｇｙ ６８ ｐ２５３Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ（１９７９））等を用いることができるが、これら
の方法に限らない。Transformation can be carried out by a commonly used method, for example, in the case of Bacillus subtilis, the combinant cell method (J.
Bacteriol 8174H1961)), Brotoff 1 last method (Mo1.Gen Genet, II I
Q 111 (197B)) or the Rescue Act (
Mo1. Gen Genet, 177459 (198
In the case of E. coli, the calcium method (J, Mo 1.53159 (1970)) or the rubidium method (Method in Hnzys+) can be used.
ology 68 p253Academic Pre
ss (1979)) etc., but the method is not limited to these methods.
形質転換株は、枯草菌を宿主とする場合には選択培地と
して、スキムミルクまたはカゼインを含む寒天培地を用
いることでコロニーの回りに生ずるクリヤーゾーンで容
易に選択できる。大腸菌を宿主とする場合にはりゾチー
ム、クロロホルム等で溶菌させた後生じるクリヤーゾー
ンによる方法等で選択可能であるがこれらの方法に限ら
ない。When Bacillus subtilis is used as a host, the transformed strain can be easily selected in the clear zone that forms around the colony by using an agar medium containing skim milk or casein as a selective medium. When using Escherichia coli as a host, a method using a clear zone generated after lysis with lysozyme, chloroform, etc. can be selected, but the method is not limited to these methods.
上記により得られた形質転換株により、常法により組換
体ＤＮＡを調製し、目的のアルカリプロテアーゼの構造
遺伝子並びにその発現・分泌に必要な領域を有するＤＮ
Ａ断片を含む組換体ＤＮＡを得ることができる。Using the transformant obtained above, a recombinant DNA is prepared by a conventional method, and a DNA containing the structural gene of the target alkaline protease and the region necessary for its expression and secretion is prepared.
Recombinant DNA containing the A fragment can be obtained.
上記のＤＮＡ断片は必ずしもその天然の形態である必要
はなく、そのＤＮＡ断片の一部または全部を含む誘導体
としても用いることができる。誘導体ＤＮＡとしては、
例えば該ＤＮＡ断片を適当な制限酵素や、Ｂａ１３１
、エキソヌクレアーゼ■。The above-mentioned DNA fragments do not necessarily have to be in their natural form, and can also be used as derivatives containing part or all of the DNA fragments. As derivative DNA,
For example, the DNA fragment may be digested with an appropriate restriction enzyme or Ba131.
, exonuclease■.
Ｓｔヌクレアーゼなどの酵素等を用いて短小化したＤＮ
Ａ断片や末端にリンカ−等の合成りＮＡを結合したＤＮ
Ａ断片、またアルカリプロテアーゼの構造遺伝子部分に
他の遺伝子のプロモーター領域、シグナル配列、ターミ
ネータ−等を結合したＤＮＡ、等があげられるが、これ
らに限らず他のものでもかまわない、また、アルカリプ
ロテアーゼのアミノ酸配列を変えることなく、１個又は
複数個の塩基を置換したＤＮＡや、酵素活性を破壊しな
い範囲でアミノ酸の欠失、付加又は置換が行われている
蛋白質をコードするＤＮＡを使用することもできる。DN shortened using enzymes such as St nuclease
A fragment or DNA with synthetic NA such as a linker attached to the end
A fragment, and DNA in which the structural gene portion of alkaline protease is linked with the promoter region, signal sequence, terminator, etc. of other genes, etc., but are not limited to these, and other types may be used.Also, alkaline protease Use DNA in which one or more bases have been substituted without changing the amino acid sequence, or DNA encoding a protein in which amino acids have been deleted, added, or substituted within a range that does not destroy enzyme activity. You can also do it.
本発明はまた、前記のごとき、°？ルカリプロテアーゼ
の構造遺伝子とその関連遺伝子を含むＤＮＡｌｔＪｉ片
に加えて、これらが宿主細胞に導入された場合にその宿
主細胞の選択を容易にする選択マーカー遺伝子を含有す
るＤＮＡにも関する。このることができる。これには線
状ＤＮＡ、！化されたＤＮＡが含まれる。選択可能な遺
伝子マーカーとは宿主菌内で発現するものであれば特に
制限はなく、例えば薬剤耐性遺伝ｒ、アミノ酸生合成遺
伝子、核酸生合成遺伝子、ビタミン生合成遺伝子。The present invention also provides the above-mentioned features. In addition to DNAAltJi pieces containing the structural gene of Lucarii protease and its related genes, it also relates to DNA containing selectable marker genes that facilitate the selection of host cells when they are introduced into the host cell. This can be done. This includes linear DNA! Contains converted DNA. The selectable genetic marker is not particularly limited as long as it is expressed within the host bacterium, and includes, for example, drug resistance genes, amino acid biosynthetic genes, nucleic acid biosynthetic genes, and vitamin biosynthetic genes.
その他生体内物質の生合成遺伝子などがあげられる。薬
剤耐性遺伝子としては、例えばテトラサイクリン耐性遺
伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイ
シン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等が挙げられ
る。Other examples include genes for biosynthesis of substances in living organisms. Examples of drug resistance genes include tetracycline resistance genes, chloramphenicol resistance genes, erythromycin resistance genes, kanamycin resistance genes, and the like.
以上の様にしてり１コーニングされたＤＮＡ断片は、前
記り１コーニングベクターに組込まれたままで発現宿主
微生物に導入される（すなわち、クローニング・ベクタ
ーがそのまま、発現宿主へＤＮＡ断片の導入のためのベ
クターとして使用される）か、又は他の導入用ベクター
に移された後、あるいはヘクターを用いないＤＮＡ断片
のみで発現用宿主に導入される。The DNA fragment that has been cloned in the above manner is introduced into an expression host microorganism while still being incorporated into the corning vector as described above (i.e., the cloning vector is used as it is for the introduction of the DNA fragment into the expression host. (used as a vector), or after being transferred to another introduction vector, or introduced into an expression host only as a DNA fragment without using a hector.
導入用ベクターの種類は発現用宿主の種類に依存して選
択される。本発明の方法において使用する発現用宿主と
しては、例えば大腸菌やバチルス属に属する細菌が挙げ
られる。導入用ベクターの選択はまた、導入された遺伝
子の発現宿主中での存在形態をいかにするか、すなわち
、導入された遺伝子を宿主の染色体に組み込むか、ベク
ター中に維持するかによっても異る。発現用宿主として
腸閉を使用する場合には、そのための導入及び発現用ベ
クターとしてＣｏ１Ｅ１ 、 ｐｓｃｌｏｌ 、 ｐｓ
ｃ１０５ 、 ｐＳＦ２１２４ 、 ｐＪＢ８ 、
ｐＡｃＹｃ１８４ 、 ｐｃＲｌ 、 Ｒ６Ｋ 、
ｐＢＲ３２２゜ｐＢＲ３２５，ｐＢＲ３２８，ｐＵｃ１
８． ｐＨ５Ｇ３９６． ｐｓ０３１６５等のプラ
スミドが使用される。他方、バチルス属細菌を発現用宿
主として用い、導入した遺伝子をプラスミド上に維持し
ようとする場合には、導入・発現用ベクターとして、例
えば、ｐＵｌｌｌｌｏ 、 ｐｃ１９４゜ｐＥ１９４
、 ｐＴＰ５ 、 ｐｓＤ３０５１ （特開昭６１−
１６２１８７）等のプラスミドを使用するのが好ましい
。また、発現用宿主としてバチルス属細菌を使用し、導
入された遺伝子を宿主の染色体に組み込もうとする場合
には、導入用ベクターは宿主細胞中で複製しないことが
好ましく、この場合にはバチル属発現用宿主に遺伝子を
導入するためのベクターとして、大腸菌用ベクター、例
えばＣｏ！Ｅｌ 、 ｐｓｃｌｏｌ 。The type of introduction vector is selected depending on the type of expression host. Expression hosts used in the method of the present invention include, for example, Escherichia coli and bacteria belonging to the genus Bacillus. The selection of a vector for introduction also depends on how the introduced gene is to be expressed in the host, that is, whether the introduced gene is integrated into the chromosome of the host or maintained in the vector. When using intestinal occlusion as a host for expression, Co1E1, psclol, ps can be used as a vector for introduction and expression.
c105, pSF2124, pJB8,
pAcYc184, pcRl, R6K,
pBR322゜pBR325, pBR328, pUc1
8. pH5G396. A plasmid such as ps03165 is used. On the other hand, when using a Bacillus bacterium as an expression host and maintaining the introduced gene on a plasmid, the introduction/expression vector may be, for example, pUlllo, pc194゜pE194.
, pTP5, psD3051 (Japanese Patent Application Laid-open No. 1983-
It is preferable to use a plasmid such as 162187). In addition, when using Bacillus bacteria as an expression host and attempting to integrate the introduced gene into the chromosome of the host, it is preferable that the introduction vector does not replicate in the host cells. Vectors for E. coli, such as Co! El, pscroll.
ｐｓＦ２１２４ 、 ｐＪ８８ 、 ｐＡｃＹｃ１８４
、 ｐｃＲｌ 、 Ｒ６Ｋ 、 ｐＢＲ３２２゜ｐ
ＢＲ３２５、ｐＢＲ３２８、ｐＬＩｃ１８ 、 ｐＨ５
Ｇ３９６ 、 ｐｓＤ３１６５（特開昭６ｌ−１０４
７９０）等のプラスミドを用いるか、あるいはベクター
を用いないでＤＮＡ断片のみを用いるのが好ましい。psF2124, pJ88, pAcYc184
, pcRl, R6K, pBR322゜p
BR325, pBR328, pLIc18, pH5
G396, psD3165 (JP-A-6L-104
It is preferable to use a plasmid such as 790) or to use only a DNA fragment without using a vector.
前記のごとく、本発明においては、大腸菌やバチルス属
に属する微生物のごとき細菌を用いることができるが、
大腸菌は培養管理が容易であるが、菌体内で生産された
目的生成物を菌体内に分泌せしめることが困難であると
いう問題点を有し、これに対して、バチルス属細菌は生
産された蛋白を菌体外に分泌するので工業的見地から有
利である。As mentioned above, in the present invention, bacteria such as Escherichia coli and microorganisms belonging to the genus Bacillus can be used.
Although Escherichia coli is easy to culture and manage, it has the problem that it is difficult to secrete the target product produced within the bacterium. It is advantageous from an industrial standpoint because it secretes it outside the bacterial body.
そこでバチルス属細菌を発現用宿主として用いる場合に
ついて詳細に説明する。Therefore, the case where Bacillus bacteria are used as an expression host will be explained in detail.
バチルス属の発現用宿主としては、最初に遺伝子が切り
出された細菌株と同じ株を用いる（すなわち、遺伝子供
４株と発現宿主株を同一にする）こともでき、又は異る
こともできる。As the expression host for the genus Bacillus, the same strain as the bacterial strain from which the gene was originally excised can be used (that is, the four gene offspring and the expression host strain can be the same), or they can be different.
遺伝子供４株と発現宿主株とが同一である場合、宿主株
が本来その染色体上に有するアルカリプロテアーゼ遺伝
子に加えてさらにアルカリプロテアーゼ遺伝子が人為的
に導入されるため遺伝子のコピー数が増加し、アルカリ
プロテアーゼの生産性の向上が保証されること、宿主株
が本来生産するプロテアーゼと導入された遺伝子により
生産される目的プロテアーゼとが同一であるから、種類
の異るプロテアーゼやその他の蛋白質が夾雑することが
なく、「１的ブロテ？−ゼの精製が容易であること、等
の利点を有する。他方、アルカリプロテアーゼ生産株は
通常アルカリ性条件下で培養しなければならないため、
培養・醗酵管理が幾分厄介である。If the four gene offspring and the expression host strain are the same, an alkaline protease gene is artificially introduced in addition to the alkaline protease gene that the host strain originally has on its chromosome, so the number of copies of the gene increases; Improved productivity of alkaline protease is guaranteed, and since the protease originally produced by the host strain and the target protease produced by the introduced gene are the same, there is no possibility of contamination with different types of proteases or other proteins. It has advantages such as ease of purification of monoprotease.On the other hand, since alkaline protease producing strains usually have to be cultured under alkaline conditions,
Culture and fermentation management is somewhat complicated.
これに対して、バチルス・ズブチリス等、通常の条件下
で培養することができる株を発現用宿主として用いれば
、その培養・醗酵管理が極めて容易になり、工業的見地
から有利であるが、他方、宿主が本来生産するプロテア
ーゼと導入された遺伝子が生産するプロテアーゼとが異
るため、目的プロテアーゼの精製に困難が伴う等、別途
解決しなければならない問題点が存在する。On the other hand, if a strain such as Bacillus subtilis that can be cultured under normal conditions is used as an expression host, the culture and fermentation management will be extremely easy, which is advantageous from an industrial standpoint. However, since the protease originally produced by the host is different from the protease produced by the introduced gene, there are problems that must be solved separately, such as difficulty in purifying the target protease.
本発明に用いられる宿主菌として代表的なものを列挙す
れば、バチルス・ズブチルス、バチルス・リケニホルミ
ス、バチルス・アミロリクエファシェンス、バチルス・
アルカロフィラス、バチルス・ステアロサーモフィラス
、バチルス・セレウス、バチルス・プレビス、バチルス
・チューリンゲンシス、バチルスＮＫＳ−２１等がある
。Typical host bacteria used in the present invention include Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefacens, and Bacillus subtilis.
Examples include Alcalophilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus cereus, Bacillus plebis, Bacillus thuringiensis, and Bacillus NKS-21.
宿主が本来生産するプＬλテア・−ゼがト１的プロテア
ーゼに夾雑するとい・う前記の問題点を解決するだめの
１つの方法として、発現宿主としてプロテアーゼ非生産
性株を用いる方法がある。この様な菌株は前記のバチル
ス属の株を人為的に変異処理して得ることができる。One way to solve the above-mentioned problem of contamination of the protease originally produced by the host with the primary protease is to use a non-protease producing strain as the expression host. Such strains can be obtained by artificially mutating the above-mentioned strains of the genus Bacillus.
尚、本発明においてＤＮＡを染色体に挿入する場合には
、導入されるＤＮＡ、！：宿宿主の染色体Ｉ） Ｎ Ａ
の一部とが相同であることが必要であるが、導入される
ＤＮＡの他の部５トこ宿主菌の染色体Ｉ） Ｎ Ａとの
相同性があれば、アルカリプロテアーゼの構造遺伝子お
よびその発現・分泌のための領域を含むＤＮＡ断片が宿
主菌の染色体１１ Ｎ Ａと相同性を有することは必ず
しも必要ではない。In addition, in the case of inserting DNA into a chromosome in the present invention, the introduced DNA, ! : host chromosome I) NA
However, if there is homology with other parts of the introduced DNA, the structural gene of alkaline protease and its expression may be homologous with the chromosome of the host bacterium. - It is not necessarily necessary that the DNA fragment containing the region for secretion has homology to chromosome 11NA of the host bacterium.
該ＤＮＡの一１ユ記宿主菌への形質転換は、公知の方法
、例えばコンピーテンｌ−セル法（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ。Transformation of the DNA into the host bacterium can be carried out using known methods, such as the Competen l-cell method (J. Bacteri.
ol.
８１７４Ｎ１９６１））或いはプロトプラスト法（Ｍｏ
ｌｅｅ。8174N1961)) or the protoplast method (Mo
lee.
Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ １６町、 １１１ （１９７９）
３等で実施可能であるが、これらの方法に限らず、如何
なる方法でも可能である。尚、形質転換にあたり、導入
ＤＮＡが環状でない場合は、形質転換頻度の向」二のた
め、Ｔ４ファージＤＮＡリガーゼ等の酵素を用いて環状
にしておくことが望ましい。Gen Genet 16 Town, 111 (1979)
3, etc., but it is not limited to these methods, and any other method can be used. In addition, when the introduced DNA is not circular, it is preferable to make it circular using an enzyme such as T4 phage DNA ligase in order to reduce the frequency of transformation.
形質転換の選択は、スキムミルクあるいはカゼインを加
えた寒天培地上でのクリアーゾーン形成や導入ＤＮＡに
結合した遺伝子マーカーの発現により行なうことができ
るが、他の方法でも可能である。Selection for transformation can be performed by forming a clear zone on an agar medium supplemented with skim milk or casein, or by expressing a genetic marker bound to the introduced DNA, but other methods are also possible.
上記のようにして得た形質転換株を培養する培地として
は特に制限はなく、該形質転換株がタト育すれば用いる
ことが可能である。There are no particular restrictions on the medium for culturing the transformed strain obtained as described above, and it can be used as long as the transformed strain grows well.
以下に本発明のプロテアーゼの製造法について代表的な
例を示し、更に具体的に説明する。但しこれらは単なる
例示であり、本発明はこれらのみに限られない。Typical examples of the method for producing the protease of the present invention will be shown below and explained in more detail. However, these are merely examples, and the present invention is not limited to these.
実土桝上
プラスミドｐＨ５Ｇ３９６ （宝酒造株式会社）ＤＮＡ
を制限酵素ｔ！ｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、同
様にＥｃｏＲＩおよびＢａｍ１ｌ Ｉで切断し、大腸菌
アルカリフォスファターゼにより末端リン酸エステル結
合を加水分解したプラスミドｐＵＢ１１０ （Ｐｒｏ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。Jitsudo Masue plasmid pH5G396 (Takara Shuzo Co., Ltd.) DNA
Restriction enzyme t! Plasmid pUB110 (Pro,
Natl, Acad.
Ｓｃｉ、ＵＳＡ ７５．１４２８（１９７８）） ＤＮ
Ａとそれら生したＤＮＡ末端の数が同じになるように混
合し、Ｔ４ファージＤＮＡリガーゼを用いて結合反応を
行った。このＤＮＡを用い、バチルス・ズブチルスＢＤ
２２４（ｔｒｐＣ２ｔｈｒ５ ｒｅｃＥ４）をプロトプ
ラスト法により形質転換し、カナマイシン耐性の形質転
換株を選択した。これらの形質転換株より、常法により
プラスミドＤＮＡを抽出・精製し、分析した結果ｐＵＢ
１１０のＥｃｏＲＩ 、 Ｂａｍｆｌ Ｉ切断点の間に
、ｐＨ５Ｇ３９６のポリリンカーのＥｃｏＲＩ −Ｒａ
ｍ１ｌ １間の部分が挿入された約３．８ ｋｂｐＯ組
換体プラスミドｐｓＤＴ８００（第１図）を得た。Sci, USA 75.1428 (1978)) DN
A and the resulting DNA ends were mixed so that the numbers were the same, and a ligation reaction was performed using T4 phage DNA ligase. Using this DNA, Bacillus subtilis BD
224 (trpC2thr5 recE4) was transformed by the protoplast method, and a transformed strain resistant to kanamycin was selected. From these transformed strains, plasmid DNA was extracted and purified using conventional methods, and as a result of analysis, pUB
Between EcoRI of 110, Bamfl I cleavage point, EcoRI-Ra of polylinker of pH5G396
An approximately 3.8 kbpO recombinant plasmid psDT800 (Fig. 1) into which a portion between m1l1 and m11 was inserted was obtained.
他方、Ｓａｉｔｏ−Ｍｉｕｒａの方法により得たバチル
スＮＫＳ−２１の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｃ１ａ Ｉで
切断し、同じ＜Ｃ１ａｌで切断し、大腸菌アルカリフォ
スターゼにより末端リン酸エステル結合を加水分解した
ｐｓＤＴ８００と混合し、Ｔ４ファージＤＮＡリガーゼ
を用いて結合反応を行なう。このＤＮＡを用いバチルス
・ズブチルスＢ Ｉ）２２４をプロトプラスト法で形質
転換し、カナマイシン耐性の形質転換株を選択する。得
られたカナマイシン耐性の形質転換株をカナマイシン７
０ｐｐｍ 、スキムミルク２％を含む！、寒天培地（１
％１−リブトン、０．５％酵母工４−ス、０．５％塩化
すトリウム、１゜５％寒天）に植え継き３７℃で１８時
間保温し、クリアーゾーン形成ヲ、ｉｌａべた。約２０
０００株のカナマイシン耐性形質転換株に一ついて調べ
た結果３株が、コロニーのまわりに大きなりリアーゾー
ンを形成する、ことを見出した。、これら３株より、常
法に従いプラスミドｒ、） Ｎ Ａを抽出精製し、分析
したところいずれもｐｓＤＴ８００（７） Ｃｌａ Ｉ
切断部位に約３．２ｋｂｐのＤＮＡを挿入した組換体Ｉ
） Ｎ Ａが得られた。このＤＮＡをｐｓＤ７２８２と
命名した（第２図）。On the other hand, the chromosomal DNA of Bacillus NKS-21 obtained by Saito-Miura's method was cut with the restriction enzyme C1a I, and mixed with psDT800, which was cut with the same <C1al and the terminal phosphate ester bond was hydrolyzed with E. coli alkaline forsterase. Then, a ligation reaction is performed using T4 phage DNA ligase. This DNA is used to transform Bacillus subtilis B I) 224 by the protoplast method, and a transformed strain resistant to kanamycin is selected. The obtained kanamycin-resistant transformant was treated with kanamycin 7.
Contains 0ppm and 2% skim milk! , agar medium (1
%1-Ribton, 0.5% yeast extract, 0.5% thorium chloride, 1.5% agar) and kept warm at 37°C for 18 hours to form a clear zone. Approximately 20
As a result of examining one of the 000 kanamycin-resistant transformed strains, it was found that 3 strains formed a large rear zone around the colony. From these three strains, plasmid r, ) NA was extracted and purified according to a conventional method and analyzed.
Recombinant I with approximately 3.2 kbp of DNA inserted into the cleavage site
) NA was obtained. This DNA was named psD7282 (Figure 2).
ｐｓＩＩＴ２８２を用いてバチルス・ズブチルスＲＤ２
２４をコンピーテン１−セル法により形質転換し、カナ
マイシン耐性の形質転換株を選択した。得られたカナマ
・イシン耐性形質転換株はスキムミルク２％を加えたＬ
寒天培地で１００％大きなりリアーゾーンを形成した。Bacillus subtilis RD2 using psIIT282
No. 24 was transformed by the Competen 1-cell method, and a kanamycin-resistant transformant was selected. The obtained Kanama isin-resistant transformant was prepared by adding 2% skim milk to L.
A 100% large rear zone was formed on the agar medium.
この形質転換株を１２液体培地で２１時間培養し、その
培養を清のグロテアーゼ活性を測定したところこの形質
転換株はアルカリプロテアーゼを大量に分泌生産してい
ることが示された。This transformed strain was cultured in a 12 liquid medium for 21 hours, and the grotease activity of the culture supernatant was measured, which showed that this transformed strain secreted and produced a large amount of alkaline protease.
プロテア−・ゼの活性は次の様にして測定した。Protease activity was measured as follows.
培養」二重を０．１ Ｍ炭酸ソー・ダＯ０ＩＭホウ酸−
塩化カリウム緩衝液（ｐＨ１０，０）で適当に希釈した
液Ｑ、’５ ｍ ｉｌ！にｐＨ１０，０の２％ミルクカ
ゼイン溶液０．５ｍｌを加えて、３０℃で１０〜３０分
酵素反応をさせた。酵素反応の終了は０．２Ｍ酢酸−０
，２Ｍ酢酸ソーダ緩衝液を含む０．１ Ｍ ｌ−リクロ
ル酢酸２鋼ｌを加えて反応を停止させた。３０℃、１０
分以上放置後濾紙を用いて濾過した６濾液１ｒｎｅに０
．４Ｍ炭酸ソーダ５ｍｆｆ、６倍希釈のフェノール試薬
１ｍｌを添加し、３０℃、２０分間放４して発色させた
のち６６０ｎｍにおける吸光度を測定する。なお、酵素
単位は国際酵素委員会の「エンザイムノーメンクレイチ
ャー」に従がい、３０℃でｐＨ１０，０の１％カゼイン
を基質とし１秒間チロシン１モル相当量の６６０ｎａ＋
の発色を示すトリクロル酢酸可溶性物質を遊離するアル
カリプロテアーゼ量を１カタール（ｋａｔａｌ）とする
。Cultured with 0.1 M sodium carbonate and boric acid
Solution Q appropriately diluted with potassium chloride buffer (pH 10,0), '5 mil! 0.5 ml of a 2% milk casein solution with a pH of 10.0 was added to the solution, and an enzyme reaction was carried out at 30° C. for 10 to 30 minutes. The enzymatic reaction is terminated with 0.2M acetic acid-0.
, 2 liters of 0.1 M l-lichloroacetic acid containing 2 M sodium acetate buffer was added to stop the reaction. 30℃, 10
6 filtrate 1 rne filtered using filter paper after standing for more than 0 minutes
．． Add 5 mff of 4M soda carbonate and 1 ml of a 6-fold diluted phenol reagent, leave to stand at 30°C for 20 minutes to develop color, and then measure the absorbance at 660 nm. In addition, the enzyme unit follows the "Enzyme Nomen Nature" of the International Enzyme Committee, and the enzyme unit is 660 na + equivalent to 1 mole of tyrosine for 1 second using 1% casein at pH 10.0 as a substrate at 30 ° C.
The amount of alkaline protease that liberates a trichloroacetic acid-soluble substance that shows color development is 1 katal.
また、この培養上清を抗原とし、枯草菌およびバチルス
ＮＫＳ−２１のアルカリプロテアーゼに対する抗血清を
用いた免疫二重拡散法の結果該形質転換株の分泌するア
ルカリプロテアーゼはバチルスＮＫＳ−２１型のもので
あることも判明した。In addition, as a result of the double immunodiffusion method using this culture supernatant as an antigen and antiserum against alkaline protease of Bacillus subtilis and Bacillus NKS-21, the alkaline protease secreted by the transformed strain was found to be of the Bacillus NKS-21 type. It was also found that
ｐｓＤＴ２８２中の挿入ＤＮＡ断片の制限酵素切断点（
下方）、と、塩基配列の決定に基いて推定される遺伝子
中の各機能領域（上方）の関連を第３図に示す。約３．
２ ｋｂｐから成るＣ１ａ ［断片は、制限酵素切断点
Ｂａｍ１ｌｌ 、 ＥｃｏＲＩ 、 Ｐｓｔｌ 、Ｓａ
ｌ Ｉ 、 Ｓｍａ■。The restriction enzyme cleavage point of the inserted DNA fragment in psDT282 (
Figure 3 shows the relationship between the functional regions in the gene (upper part) estimated based on the determination of the base sequence. Approximately 3.
C1a consisting of 2 kbp [The fragment was cut with restriction enzymes Bam1ll, EcoRI, Pstl, Sa
l I, Sma■.
Ｘｂａ Ｉ及びＸｈｏＩを含有していなかった。アルカ
リプロテアーゼ関連遺伝子、すなわち、約２００〜３０
０ｂｐのプロモーター領域、約ｑｏｂｐのＰｒｅ体コー
ド領域、約２７０ｂｐのＰｒｏ体コード領域、約８２０
ｂｐのアルカリプロテアーゼ構造遺伝子及び約１００ｂ
ｐのターミネータ−領域がＨｐａ Ｉ −１１ａｅｌｌ
１間の約２３００ｂｐの範囲に含まれる。It did not contain Xba I and Xho I. alkaline protease related genes, i.e. about 200-30
0bp promoter region, approximately qobp Pre body coding region, approximately 270bp Pro body coding region, approximately 820
bp alkaline protease structural gene and approximately 100 b
The terminator region of p is Hpa I-11aell
It is included in the range of about 2300 bp between 1 and 1.
実ＪＩｉＪＬ入
ｐＳＤＴ２８２を用いバチルスＮＫＳ−２１をプロトプ
ラスト法により形質転換し、カナマイシン耐性の形質転
換株を取得した。該形質転換株をカゼイン１％、ミート
エキス１％、ポリペプトン１％、及び炭酸水素ナトリウ
ム１％を含有し、水酸化ナトリウムでｐｌ＋を９．５に
調整した培地３００ｍ ｌ中で６６時間振とう培養し、
培養上清の酵素活性を測定したところ２３．１マイクロ
カタール／ｌの酵素活性を示した。Bacillus NKS-21 was transformed by the protoplast method using pSDT282 containing fruit JIiJL, and a transformed strain resistant to kanamycin was obtained. The transformed strain was cultured with shaking for 66 hours in 300 ml of a medium containing 1% casein, 1% meat extract, 1% polypeptone, and 1% sodium bicarbonate and adjusted to pl+ of 9.5 with sodium hydroxide. death,
When the enzyme activity of the culture supernatant was measured, it was found to be 23.1 microcatal/l.
これは平行して培養したバチルスＮＫＳ−２１の約５．
１倍であった。This is approximately 5.5% for Bacillus NKS-21 cultured in parallel.
It was 1x.
裏施拠１
プラスミドｐＨ５Ｇ３９６のＤＮＡを制限酵素Ｃ１ａ
Ｉで切断し、大腸菌アルカリフォスファターゼにより末
端リン酸エステル結合を加水分解し、同様にＣ１ａ Ｉ
で切断したｐｓＤ７２８２と混合し、Ｔ４ファージＤＮ
Ａリガーゼで結合させる。このＤＮＡを用い大腸菌ＪＭ
１０５（ｔｈｉ ｒｐｓＬ ｅｎｄＡ ５ｂｃＢ１５
ｈｓｐＲ４。Background 1 DNA of plasmid pH5G396 was digested with restriction enzyme C1a.
The terminal phosphate ester bond was hydrolyzed with E. coli alkaline phosphatase, and C1a I was cleaved in the same manner.
Mix with psD7282 cut with T4 phage DNA.
Join with A ligase. Using this DNA, E. coli JM
105(thi rpsL endA 5bcB15
hspR4.
Δ （ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ） 、 ＣＦ ’
、 ｔｒａＤ３６ 、ｐｒｏ／ＩＢ 。Δ(lac-proAB), CF'
, traD36, pro/IB.
ｌａｃ”２６Ｍ１５ ） ）をカルシウム法により形質
転換し、クロラムフエニコー・ル耐性でかつ、イソプロ
ピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）
および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドール−β−
ガラクトシド（Ｘ−Ｇａｌ）添加により白色コロニーを
形成する形質転換株を取得した。該形質転換株より組換
体ＤＮＡを抽出精製し、分析した結果、ｐｉ（ＳＧ３９
６のＣ１ａｌ切断部位に約３．２ ｋｂｐのｐＳＤＴ
２８２のＣ１ａｌ切断断片が挿入された組換体Ｄ Ｎ
Ａ ｐｓＤＴ８１２が得られた（第４図）。lac"26M15)) was transformed by the calcium method, and was resistant to chloramphenicol and isopropyl-β-D-thio-galactopyranoside (IPTG).
and 5-bromo-4-chloro-3-indole-β-
A transformed strain forming white colonies was obtained by addition of galactoside (X-Gal). Recombinant DNA was extracted and purified from the transformed strain, and as a result of analysis, pi (SG39
Approximately 3.2 kbp of pSDT at the C1al cleavage site of 6
Recombinant DN in which the C1al cleavage fragment of 282 was inserted
A psDT812 was obtained (Figure 4).
夫施勇土
プラスミドｐｓＤ３１６５（特開昭６ｌ−１０４７９０
）のＤＮＡを制限酵素Ｃ１ａ＋で切断し、大腸菌アルカ
リフォスファターゼにより末端リン酸エステル結合を加
水分解し、同様にＣ１ａ Ｉで切断したｐＳＤＴ２Ｂ２
と混合し、Ｔ４ファージＤＮＡリガーゼで結合さゼる。Fuse Yudo plasmid psD3165 (JP-A-6L-104790
) DNA was cut with restriction enzyme C1a+, the terminal phosphate ester bond was hydrolyzed with E. coli alkaline phosphatase, and pSDT2B2 was similarly cut with C1a I.
and ligated with T4 phage DNA ligase.
このＤＮＡを用い大腸菌ＪＭ１０５をカルシウム法によ
り形質転換し、アンピシリン、テトラサイクリン、クロ
ラムフェニコールにいずれも耐性を有する形質転換株を
取得する。該形質転換株より組換体ＤＮＡを抽出精製し
、分析した結果ｐｓＤＹ３１６５のＣ１ａ Ｉ切断部位
に、約３゜２ｋｂｐのｐＳＤＴ２８２のＣ１ａ Ｉ切断
断片が挿入された組換体ＤＮＡｐＳＤＴ８３１が得られ
た（第５図）。Using this DNA, E. coli JM105 is transformed by the calcium method to obtain a transformed strain that is resistant to ampicillin, tetracycline, and chloramphenicol. Recombinant DNA was extracted and purified from the transformed strain and analyzed. As a result, a recombinant DNA pSDT831 was obtained in which an approximately 3.2 kbp C1a I fragment of pSDT282 was inserted into the C1a I cleavage site of psDY3165 (Fig. 5). ).
人差１
実施例４において作製したプラスミドｐｓＤＴ８３１を
用い、バチルスＮＫＳ−２１をプロ］・プラスト法で形
質転換し、クロラムフェニコール耐性の形質転換体を得
た。この形質転換株をカゼイン１％、ミートエキス１％
、ポリペプトン１％、炭酸水素すＩ・リウム１％を含有
し、水酸化ナトリウムでｐ＋＋を９゜５に調整した培地
３００ｍ ｅ中で６６時間振と・う培養し、培養上清の
酵素活性を測定したところ８．６マイクロカタール／ｌ
の酵素活性を示した。これは平行して培養したバチルス
ＮＫＳ−２１の約１．９倍であった。Interindividual Difference 1 Using the plasmid psDT831 prepared in Example 4, Bacillus NKS-21 was transformed by the pro]-plast method to obtain a chloramphenicol-resistant transformant. This transformed strain was mixed with 1% casein and 1% meat extract.
The enzyme activity of the culture supernatant was determined by shaking and culturing for 66 hours in a 300mE medium containing 1% polypeptone, 1% Lithium bicarbonate, and adjusting p++ to 9°5 with sodium hydroxide. Measured: 8.6 microcatalysts/l
showed the enzyme activity of This was about 1.9 times that of Bacillus NKS-21 cultured in parallel.
ス斯ｌＷ斑
実施例１において作製したブラスミｌ’ ｐＳＤＴ２Ｂ
２ヲＨａｅ［ＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動法
により各断片を分離する。アルカリプロテアーゼの構造
遺伝子およびその発現分泌のための領域を含む約２．６
ｋｂのＤＮＡ断片を含むアガロースゲル部分を切りとり
、常法によりＤＮＡを分離、精製した。このＤＮＡ断片
にＴ４−ファージＤＮＡリガーゼを作用させ環状のＤＮ
Ａにした。このＤＮＡを用い、バチルスＮＫＳ−２１に
プロトプラスト法で形質転換する。得られた形質転換体
を２％スキムミルクを含んだし寒天培地に移し、大きな
りリーンゾーンを形成する株を選択した。該形質転換株
をカゼイン１％、ミートエキス１％、ポリペプトン１％
、及び炭酸水素ナトリウム１％を含有し、水酸化ナトリ
ウムでｐｌ＋を９．５に調整した培地３００ｍ１で６６
時間振とう培養し、培養−１−清の酵素活性を測定した
ところ、７．７マイクロカタール／ｌの酵素活性を示し
た。これは平行して培養したバチルスＮＫＳ−２１の約
１．７倍であった人止拠１
バチルス・ズブチルスυ０ＴＯ５３１（ＴｒｐＣ２、Ｌ
ｅｕ Ａ８）（東京大学応用微生物研究所）をＬ寒天培
地で３０℃−晩生前させ、その−白金耳量を０．５％酵
母エキスを含むスビザイゼン培地（（Ｎｌ１４） ｚｓ
Ｏ４０，２％、Ｋ２ＨＰＯ４１，４％、Ｋｌｌ□ｐｏ、
０．６％、クエン酸ナトリウム２１１□００．１％、Ｍ
ｇ５Ｏｎ７１１□００．０２％、グルコース０．５％〕
で対数増殖期中期まで培養した。Blasmi l' pSDT2B produced in Example 1
2 was cut with Hae[II, and each fragment was separated by agarose gel electrophoresis. Approximately 2.6 cells containing the structural gene of alkaline protease and the region for its expression and secretion
The agarose gel portion containing the kb DNA fragment was cut out, and the DNA was separated and purified using a conventional method. This DNA fragment is treated with T4-phage DNA ligase to form a circular DNA.
I gave it an A. Using this DNA, Bacillus NKS-21 is transformed by the protoplast method. The obtained transformants were transferred to an agar medium containing 2% skim milk, and strains that formed large lean zones were selected. The transformed strain was treated with 1% casein, 1% meat extract, and 1% polypeptone.
66 in 300 ml of medium containing , and 1% sodium bicarbonate, adjusted to pl+ of 9.5 with sodium hydroxide.
When cultured with shaking for hours and the enzyme activity of the culture-1 supernatant was measured, it showed an enzyme activity of 7.7 microcatalysts/l. This was about 1.7 times that of Bacillus NKS-21 cultured in parallel.
eu A8) (Institute of Applied Microbiology, University of Tokyo) was grown late at 30°C on L agar medium, and a loopful of it was added to Subizaisen medium ((Nl14) zs containing 0.5% yeast extract).
O40.2%, K2HPO41.4%, Kll□po,
0.6%, sodium citrate 211□00.1%, M
g5On711□00.02%, glucose 0.5%]
The cells were cultured until the mid-logarithmic growth phase.
培養液を１００ＯＯＧＩＯ分間遠心分離して菌体を築め
、ＴＭＮＩＩ衝液（０，１５％Ｎａ（１、１０ｍＭ Ｍ
ｇＣＡ’ ｚ 、 １０ｎ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ
、 ｐＨ７，０）で２回洗浄した。次に菌体を５ｍ６Ｔ
Ｍ緩衝液（１０ｍＭ ＭｇＣ（！ 、 、 １０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−１１Ｃｌ 、 ｐＨ７，０）に懸濁し、０．
５■のＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジンを添加し、３７℃で１５分間振とうした。１００Ｏ
ＯＧＩＯ分間遠心分離して菌体を集め”１’ Ｍ Ｎ緩
衝液で２回洗浄後、２％スキムミルクを含む■、寒天培
地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％Ｎ
ａＣ６，，１，５％寒天）に広げた。約１００００個の
コロニーの中から１株クリアーゾーンを形成しない株を
取得した。The culture solution was centrifuged for 100 OOGIO minutes to establish bacterial cells, and TMNII solution (0.15% Na (1.1, 10 mM M
gCA'z, 10n+M Tris-HCf
, pH 7,0) twice. Next, add 5m6T of bacterial cells.
M buffer (10mM MgC (!, , 10mM
Tris-11Cl, pH 7.0) and
5μ of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine was added and shaken at 37°C for 15 minutes. 100O
Centrifuge for OGIO minutes to collect the bacterial cells. After washing twice with 1'M N buffer, add to agar medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% N) containing 2% skim milk.
aC6, 1.5% agar). One strain that did not form a clear zone was obtained from approximately 10,000 colonies.
該菌株をＬ液体培地で３７℃２１時間培養し、培養上清
のプロテアーゼ活性をアンソン・ヘモグロビン法（Ｊ、
Ｇｅｎ、 Ｉ’ｈｙｓｉｏ１．２２７９（１９３８）
）によりｐＨ７、０、ｐＨ１０，０で測定したところ、
０．１ナノカタール／ ｍ （！以下であった。本菌株
をバチルスＳｌｌ−８００と命名した。The strain was cultured in L liquid medium at 37°C for 21 hours, and the protease activity of the culture supernatant was measured using the Anson hemoglobin method (J.
Gen, I'hysio 1.2279 (1938)
) when measured at pH 7.0 and pH 10.0,
The bacterial strain was named Bacillus Sll-800.
実瀦−例−失
ｐＳＤ７２８２を用いバチルス５０８００をプロトプラ
スｉ・法により形質転換し、カナマイシン耐性の形質転
換体を選択した。該形質転換株を、カゼイン１％、ミー
トエキス１％及びポリペプトン１％を含有し、炭酸すト
リウムでｐＨ７，５に誹Ｉ整した培地３００ｍ ｌ！中
で６６時間振とう培養し、培養上清の酵素活性を測定し
たところ１８．６マイクロカタール／ｒの酵素活性を示
した。Actual Example - Bacillus 50800 was transformed using the lost pSD7282 by the Protoplast i method, and transformants resistant to kanamycin were selected. The transformed strain was placed in 300 ml of a medium containing 1% casein, 1% meat extract, and 1% polypeptone, adjusted to pH 7.5 with sodium carbonate. The culture was cultured with shaking for 66 hours, and the enzyme activity of the culture supernatant was measured, and the enzyme activity was found to be 18.6 microcatalysts/r.
Ｘ−ｈＬ例−９゜
ｐｓｒｌＴ２８２をＩｆ ａ ｅ Ｉｌｌで切断し、ア
ガ０ ’；ｌ ’）’ ルミ気泳動法により各断片を
分離する。アルカリプロテアーゼの構造遺伝子およびそ
の発現分泌のための領域を含む約２．６ｋｂｐのＤＮＡ
断片を含むアガロースゲル部分を切りとり、常法により
ＤＮＡを分離、精製した。このＤＮＡ断片にＴ４ファー
ジ１） Ｎ Ａリガーゼを作用させ環状のＤＮＡにした
。X-hL Example-9゜psrlT282 is cut with Ifa e Ill, and each fragment is separated by Aga0';l')' lumi electrophoresis. Approximately 2.6 kbp DNA containing the structural gene of alkaline protease and a region for its expression and secretion
The agarose gel portion containing the fragment was cut out, and the DNA was separated and purified using a conventional method. This DNA fragment was treated with T4 phage 1) NA ligase to form circular DNA.
このＤＮＡを用い、バチルスＳＤ ８００をプロトプラ
スト法により形質転換した。得られた形質転換株を２％
スキムミルクを含んだｌ、寒天培地に移し大きなりリア
ーゾーンを形成する株を選択した。該形質転換株（バチ
ルス５ｏ−２００１） （ｍ工研条寄第９７０６号）を
カゼイン１％、ミートエキス１％及びポリペプトン１％
を含有し、炭酸す１−リウムでｐＨ７，５に調整した培
地３００ｍ１中で６６時間振とう培養し、培養上清の酵
素活性を測定したところ７．９マイクロカタール／ｌの
酵素活性を示した。Using this DNA, Bacillus SD 800 was transformed by the protoplast method. 2% of the obtained transformed strain
The strains were transferred to an agar medium containing skim milk and strains that formed a large rear zone were selected. The transformed strain (Bacillus 5o-2001) (M Koken Joyori No. 9706) was mixed with 1% casein, 1% meat extract, and 1% polypeptone.
The enzyme activity of the culture supernatant was measured after shaking culture for 66 hours in 300 ml of a medium containing 1-lium carbonate and adjusted to pH 7.5, which showed an enzyme activity of 7.9 microcatals/l .
第１図は、クローニング用ベクターｐｓＤＴ８００の制
限酵素切断点地図を示す。
第２図は、第１図に示すｐｓｏＴ８００のＣ１ａ １部
位に、染色体由来のアルカリプロテアーゼ遺伝子を含む
約３．２１ｃｂｐのＣ１ａＩ −ＤＮＡ断片が挿入され
たバチルス川プラスミドｐＳＤ７２８２の制限酵素切断
点地図を示す。
第３図は、染色体由来の前記約３．２ｋｂｐのＣ１ａ
ｌ−ＤＮＡ断片の制限酵素切断片地図（Ｂ）、並びにア
ルカリプロテアーゼ構造遺伝子及びそれに関連する領域
の推定される位置（Ａ）を示す、（Ｂ）における数値は
各制限酵素切断点間のおよその塩基対の数を示す。（Ａ
）において、ｐは推定されるプロモーター領域、Ｐｒｏ
は推定されるプレ体コード領域、Ｐｒｏは推定される１
０体コード領域、Ｍは成熟アルカリプロテアーゼのコー
ド領域（構造遺伝子）、そしてＴは推定されるターミネ
ータ−領域を示し、数字は各領域のおよその塩基対数を
示す。
第４図は、プラスミドｐＳＤ７２８２山来のアルカリプ
ロテアーセ遺伝子を含有する約３．２ｋｂのＣ１ａ ｌ
−ＤＮＡ断片を含有する大腸菌プラスミドｐｓｏ’ｒ８
１２の制限酵素切断点地図を示す。
第５図は、プラスミドｐＳＤＴ２８２由来のアルカリプ
ロテアーゼ遺伝子を含有する約３．２ｋｂのＣ１ａ ｌ
−ＤＮＡ断片を含有する大腸菌プラスミドｐＳＤＴ８３
１の制限酵素切断片地図を示す。
第１図
第２図
（Ｂ）
第３図FIG. 1 shows a restriction enzyme cleavage point map of the cloning vector psDT800. Figure 2 shows a restriction enzyme breakpoint map of Bacillus river plasmid pSD7282, in which an approximately 3.21 cbp C1aI-DNA fragment containing a chromosome-derived alkaline protease gene was inserted into the C1a1 site of psoT800 shown in Figure 1. . Figure 3 shows the approximately 3.2 kbp C1a derived from the chromosome.
The restriction fragment map (B) of the l-DNA fragment and the estimated position of the alkaline protease structural gene and its related regions (A) are shown. The numbers in (B) are the approximate distances between each restriction enzyme cleavage point. Indicates the number of base pairs. (A
), p is the predicted promoter region, Pro
is the estimated prebody code region, Pro is the estimated 1
0 coding region, M is the mature alkaline protease coding region (structural gene), T is the presumed terminator region, and the numbers indicate the approximate number of base pairs of each region. Figure 4 shows the approximately 3.2 kb C1a l gene containing the alkaline protease gene from plasmid pSD7282.
- E. coli plasmid pso'r8 containing the DNA fragment
A map of 12 restriction enzyme breakpoints is shown. Figure 5 shows an approximately 3.2 kb C1a l gene containing the alkaline protease gene derived from plasmid pSDT282.
- Escherichia coli plasmid pSDT83 containing the DNA fragment
1 shows a restriction enzyme cleavage fragment map of No. 1. Figure 1 Figure 2 (B) Figure 3
Claims (1)
カリプロテアーゼをコードする構造遺伝子を含有するＤ
ＮＡ断片であって、 （ａ）該ＤＮＡ断片は制限酵素切断点Ｈｐａ I とＨａ
ｅIIIとにより両端を規定される領域を含んで成り； （ｂ）前記制限酵素切断点Ｈｐａ I とＨａｅIIIとの間
に他の制限酵素切断点ＨｉｎｄIII、Ｓｐｈ I 及びＳａ
ｃ I を含有し；そして （ｃ）前記制限酵素切断片Ｈｐａ I とＨａｅIIIとの間
に制限酵素切断点Ｃｌａ I 、ＢｇｌII、ＢａｍＨ I 、
ＥｃｏＲ I 、Ｐｓｔ I 、Ｓａｌ I 、Ｓｍａ I 、Ｘｂ
ａ I 、及びＸｈｏ I を含有しない； ことを特徴とするＤＮＡ断片、あるいは前記構造遺伝子
の発現能が破壊されない範囲でこのＤＮＡ断片が短縮さ
れたＤＮＡ断片、あるいはアミノ酸配列を変えることな
く１個又は複数個の塩基が置換されているＤＮＡ断片。 ２、前記制限酵素切断片Ｈｐａ I とＨｌａｅIIIとによ
り両端を規定される領域に加えて、さらにＨａｅIIIと
前記Ｈｐａ I とにより両端を規定される追加の領域を
含んで成る、特許請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ断片
。 ３、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物由来のアル
カリプロテアーゼをコードする構造遺伝子を含有するＤ
ＮＡ断片であって、 （ａ）該ＤＮＡ断片は制限酵素切断点Ｈｐａ I とＨａ
ｅIIIとにより両端を規定される領域を含んで成り； （ｂ）前記制限酵素切断点Ｈｐａ I とＨａｅIIIとの間
に他の制限酵素切断点ＨｉｎｄIII、Ｓｐｈ I 及びＳａ
ｃ I を含有し；そして （ｃ）前記制限酵素切断片Ｈｐａ I とＨａｅIIIとの間
に制限酵素切断点Ｃｌａ I 、ＢｇｌII、ＢａｍＨ I 、
ＥｃｏＲ I 、Ｐｓｔ I 、Ｓａｌ I 、Ｓｍａ I 、Ｘｂ
ａ I 、及びＸｈｏ I を含有しない； ことを特徴とするＤＮＡ断片、あるいは前記構造遺伝子
の発現能が破壊されない範囲でこのＤＮＡ断片が短縮さ
れたＤＮＡ断片、あるいはアミノ酸配列を変えることな
く１個又は複数個の塩基が置換されているＤＮＡ断片、
並びに選択マーカー遺伝子を含んでなるＤＮＡ。 ４、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物由来のアル
カリプロテアーゼをコードする構造遺伝子を含有するＤ
ＮＡ断片であって、 （ａ）該ＤＮＡ断片は制限酵素切断点Ｈｐａ I とＨａ
ｅIIIとにより両端を規定される領域を含んで成り； （ｂ）前記制限酵素切断点Ｈｐａ I とＨａｅIIIとの間
に他の制限酵素切断点ＨｉｎｄIII、Ｓｐｈ I 及びＳａ
ｃ I を含有し；そして （ｃ）前記制限酵素切断片Ｈｐａ I とＨａｅIIIとの間
に制限酵素切断点Ｃｌａ I 、ＢｇｌII、ＢａｍＨ I 、
ＥｃｏＲ I 、Ｐｓｔ I 、Ｓａｌ I 、Ｓｍａ I 、Ｘｂ
ａ I 、及びＸｈｏ I を含有しない； ことを特徴とするＤＮＡ断片、あるいは前記構造遺伝子
の発現能が破壊されない範囲でこのＤＮＡ断片が短縮さ
れたＤＮＡ断片、あるいはアミノ酸配列を変えることな
く１個又は複数個の塩基が置換されているＤＮＡ断片の
導入により形質転換された細菌。 ５、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物由来のアル
カリプロテアーゼをコードする構造遺伝子を含有するＤ
ＮＡ断片であって、 （ａ）該ＤＮＡ断片は制限酵素切断点Ｈｐａ I とＨａ
ｅIIIとにより両端を規定される領域を含んで成り； （ｂ）前記制限酵素切断点Ｈｐａ I とＨａｅIIIとの間
に他の制限酵素切断点ＨｉｎｄIII、Ｓｐｈ I 及びＳａ
ｃ I を含有し；そして （ｃ）前記制限酵素切断片Ｈｐａ I とＨａｅIIIとの間
に制限酵素切断点Ｃｌａ I 、ＢｇｌII、ＢａｍＨ I 、
ＥｃｏＲ I 、Ｐｓｔ I 、Ｓａｌ I 、Ｓｍａ I 、Ｘｂ
ａ I 、及びＸｈｏ I を含有しない； ことを特徴とするＤＮＡ断片、あるいは前記構造遺伝子
の発現能が破壊されない範囲でこのＤＮＡ断片が短縮さ
れたＤＮＡ断片、あるいはアミノ酸配列を変えることな
く１個又は複数個の塩基が置換されているＤＮＡ断片の
導入により形質転換された微生物を培養し、得られた培
養物からアルカリプロテアーゼを採取することを特徴と
するアルカリプロテアーゼの製造方法。 ６、前記形質転換された微生物がバチルス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌であり、そして生
産されたアルカリプロテアーゼを菌体外培養液から採取
することを特徴とする、特許請求の範囲第５項に記載の
方法。[Scope of Claims] 1. D containing a structural gene encoding alkaline protease derived from a microorganism of the genus Bacillus
an NA fragment, (a) the DNA fragment has restriction enzyme cleavage points Hpa I and Ha
(b) between the restriction enzyme cleavage points Hpa I and HaeIII, other restriction enzyme cleavage points HindIII, Sph I and Sa
and (c) between the restriction enzyme cleavage fragments Hpa I and HaeIII, restriction enzyme cleavage points Cla I, Bgl II, BamH I,
EcoR I , Pst I , Sal I , Sma I , Xb
A DNA fragment characterized by not containing a I and A DNA fragment with multiple base substitutions. 2. In addition to the region defined at both ends by the restriction enzyme cleavage fragments Hpa I and HlaeIII, claim 1 further comprises an additional region defined at both ends by HaeIII and the Hpa I. DNA fragments described in section. 3. D containing a structural gene encoding alkaline protease derived from a microorganism of the genus Bacillus
an NA fragment, (a) the DNA fragment has restriction enzyme cleavage points Hpa I and Ha
(b) between the restriction enzyme cleavage points Hpa I and HaeIII, other restriction enzyme cleavage points HindIII, Sph I and Sa
and (c) between the restriction enzyme cleavage fragments Hpa I and HaeIII, restriction enzyme cleavage points Cla I, Bgl II, BamH I,
EcoR I , Pst I , Sal I , Sma I , Xb
A DNA fragment characterized by not containing a I and DNA fragment in which multiple bases are substituted,
and a DNA comprising a selection marker gene. 4. D containing a structural gene encoding alkaline protease derived from a microorganism of the genus Bacillus
an NA fragment, (a) the DNA fragment has restriction enzyme cleavage points Hpa I and Ha
(b) between the restriction enzyme cleavage points Hpa I and HaeIII, other restriction enzyme cleavage points HindIII, Sph I and Sa
and (c) between the restriction enzyme cleavage fragments Hpa I and HaeIII, restriction enzyme cleavage points Cla I, Bgl II, BamH I,
EcoR I , Pst I , Sal I , Sma I , Xb
A DNA fragment characterized by not containing a I and A bacterium transformed by introducing a DNA fragment in which multiple bases have been substituted. 5. D containing a structural gene encoding alkaline protease derived from a microorganism of the genus Bacillus
an NA fragment, (a) the DNA fragment has restriction enzyme cleavage points Hpa I and Ha
(b) between the restriction enzyme cleavage points Hpa I and HaeIII, other restriction enzyme cleavage points HindIII, Sph I and Sa
and (c) between the restriction enzyme cleavage fragments Hpa I and HaeIII, restriction enzyme cleavage points Cla I, Bgl II, BamH I,
EcoR I , Pst I , Sal I , Sma I , Xb
A DNA fragment characterized by not containing a I and 1. A method for producing alkaline protease, which comprises culturing a microorganism transformed by introducing a DNA fragment in which a plurality of bases have been substituted, and collecting alkaline protease from the resulting culture. 6. Claim 5, wherein the transformed microorganism is a bacterium belonging to the genus Bacillus, and the alkaline protease produced is collected from an extracellular culture solution. the method of.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62297824A JPH0783716B2 (en) | 1987-11-27 | 1987-11-27 | Gene system encoding alkaline protease |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62297824A JPH0783716B2 (en) | 1987-11-27 | 1987-11-27 | Gene system encoding alkaline protease |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8272595A Division JP2501779B2 (en) | 1995-04-07 | 1995-04-07 | Method for producing alkaline protease |
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|---|---|
| JPH01141596A true JPH01141596A (en) | 1989-06-02 |
| JPH0783716B2 JPH0783716B2 (en) | 1995-09-13 |
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ID=17851633
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62297824A Expired - Fee Related JPH0783716B2 (en) | 1987-11-27 | 1987-11-27 | Gene system encoding alkaline protease |
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| Country | Link |
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| JP (1) | JPH0783716B2 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6112287A (en) * | 1984-06-26 | 1986-01-20 | Lion Corp | Recombinant dna, its preparation, bacterial strain containing same, preparation of exocytic secretion enzyme using same, and dna for promoting secretion of exocytic enzyme |
| JPS6232888A (en) * | 1985-08-03 | 1987-02-12 | ヘンケル・コマンデイツトゲゼルシヤフト・アウフ・アクチエン | Preparation of alkaline protease, hybrid vector and form converting bacteria |
-
1987
- 1987-11-27 JP JP62297824A patent/JPH0783716B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6112287A (en) * | 1984-06-26 | 1986-01-20 | Lion Corp | Recombinant dna, its preparation, bacterial strain containing same, preparation of exocytic secretion enzyme using same, and dna for promoting secretion of exocytic enzyme |
| JPS6232888A (en) * | 1985-08-03 | 1987-02-12 | ヘンケル・コマンデイツトゲゼルシヤフト・アウフ・アクチエン | Preparation of alkaline protease, hybrid vector and form converting bacteria |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0783716B2 (en) | 1995-09-13 |
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