JPH01137973A - Acylamino acid racemase, its production and use - Google Patents

Abstract

NEW MATERIAL:An enzyme capable of converting D-N-acyl-alpha-aminocarboxylic acid (abbreviated as D-N<alpha>-acylamino acid) and L-N<alpha>-aminocarboxylic acid into corresponding L-N<alpha>-aminocarboxylic acid and D-N<alpha>-amino acid and unable to convert a D-alpha-amino acid and L-alpha-amino acid into corresponding L-alpha-amino acid and D-alpha-amino acid. USE:Useful for the production of an optically active alpha-amino acid from DL-N<alpha>- acylamino acid. PREPARATION:A microbial strain capable of producing an acylamino acid racemase [e.g., Streptomyces sp. Y-53 (FERM P-9518)] is cultured and the enzyme produced and accumulated in the cultured product is separated therefrom.

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、アシルアミノ酸ラセマーゼ、その製造法およ
び用途に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial Field of Application] The present invention relates to an acylamino acid racemase, its production method and uses.

〔従来の技術〕[Conventional technology]

光学活性なＮ−アシル−α−アミノカルボン酸（以下Ｎ
ａ−アシルアミノ酸と称する）を対応する光学不活性な
り　Ｌ　−Ｎ−アシルアミノ酸にラセミ化する反応は、
光学活性アミノ酸の製造に利用されている重要な反応で
ある。Optically active N-acyl-α-aminocarboxylic acid (hereinafter referred to as N
The reaction of racemizing a-acylamino acid (referred to as a-acylamino acid) to the corresponding optically inactive L-N-acylamino acid is
This is an important reaction used in the production of optically active amino acids.

光学活性なＮ（１−アシルアミノ酸をラセミ化し、Ｄ　
Ｌ−Ｎ　″−アンルアミノ酸を製造する方法としては、
例えば、酢酸中で当量以下の無水酢酸と加熱する方法〔
ビオヒエミッシェ・ツァイトシュリフト（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ　Ｚ、）、２０３，２８０（１９２９））　。Optically active N (racemized 1-acyl amino acid, D
As a method for producing L-N″-anluamino acid,
For example, a method of heating with less than an equivalent amount of acetic anhydride in acetic acid [
Bioche Mische Zeitschrift
m Z, ), 203, 280 (1929)).

多量の無水酢酸と室温で処理する方法〔ジャーナル・オ
ブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊ、　Ａｍ
、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、）、５４．１６３０（１９３
２））、燐酸トリエステル、低級脂肪酸等の溶媒中で加
熱する方法〔特公昭５１−＋８４０２）、窒素気流下に
光学活性Ｎａ−アシルアミノ酸を約１６０’Ｃにて直接
加熱する方法〔特開昭６１−１２６０５８〕、触媒量の
脱水剤を加え芳香族炭化水素の存在下１３０℃以」二で
加熱する方法〔特開昭６１−１６５３５４　）など、物
理的あるいは化学的ラセミ化法については古くより今日
に至るまで枚挙に暇がない程発表されている。Method of treatment with a large amount of acetic anhydride at room temperature [Journal of American Chemical Society (J, Am
, Chem, Soc, ), 54.1630 (193
2)), a method of heating in a solvent such as a phosphoric triester or a lower fatty acid (Japanese Patent Publication No. 51-8402), a method of directly heating an optically active Na-acylamino acid at about 160'C under a nitrogen stream [JP-A Physical or chemical racemization methods are old, such as the method of adding a catalytic amount of dehydrating agent and heating at 130°C or higher in the presence of aromatic hydrocarbons [Japanese Patent Application Laid-open No. 165354/1982]. To this day, there have been so many publications published that there is too much time to list them.

〔発明が解決しようとする課題〕[Problem to be solved by the invention]

Ｄ−Ｎ　　−アシルアミノ酸のラセミ化法は、光学活性
α−アミノ酸を製造するためにアミノアシラーゼと組み
合わせて使用される。すなわち原料である安価なりＬ−
Ｎａ−アシルアミノ酸にアミノアシラーゼを作用せしめ
、Ｌ−Ｎ“−アシルアミノ酸のみを加水分解してＬ−α
−アミノ酸に変換したのち、物理的性質の違いを利用し
てＬ−α−アミノ酸とＤ−Ｎａ−アシルアミノ酸を相互
に分離し、それぞれを単離する。ついてＤ−Ｎａ−アシ
ルアミノ酸に上記のラセミ化法のいずれかを適用して原
料であるＤＬ−Ｎａ−アシルアミノ酸に変換し、再度ア
ミノアシラーゼを作用させる。The D-N-acyl amino acid racemization process is used in combination with aminoacylases to produce optically active α-amino acids. In other words, the raw material is cheap L-
Aminoacylase is applied to Na-acylamino acids, and only L-N"-acylamino acids are hydrolyzed to form L-α.
- After converting into amino acids, L-α-amino acids and D-Na-acyl amino acids are separated from each other by utilizing the difference in physical properties, and each is isolated. The D-Na-acylamino acid is then converted to the raw material DL-Na-acylamino acid by applying any of the racemization methods described above, and then treated with aminoacylase again.

これを繰り返すことにより原料であるＤＬ−Ｎ”−アシ
ルアミノ酸を光学活性なＬ−α−アミノ酸に１００％変
換することができる。しかし、この方法には大きな欠点
がある。それはアミノアノラーゼを作用させた後にＬ−
α−アミノ酸とＮａ−アシルアミノ酸とを相互に分離す
るための分離操作が必要であること、およびＤ−Ｎ“−
アンルアミノ酸についてはこれを固体状に単離したのち
化学的にあるいは物理的に厳しい条件に曝してラセミ化
操作を施さねばならないことである。By repeating this process, it is possible to convert 100% of the raw material DL-N"-acyl amino acid into optically active L-α-amino acid. However, this method has a major drawback. After letting L-
The necessity of a separation operation to separate α-amino acids and Na-acyl amino acids from each other, and the fact that D-N”-
The problem with anluamino acids is that they must be isolated in solid form and then exposed to harsh chemical or physical conditions for racemization.

もし、このラセミ化反応がアミノアシラーゼの　゛失活
しない条件（常温、常圧、中性付近の水溶液中という条
件）下で、しかもＬ−α−アミノ酸とＤ−Ｎａ−アシル
アミノ酸を分離することなく、光学活性アミノ酸の共存
下に、Ｄ−Ｎ　−アンルアミノ酸についてだけ選択的に
実施することができるならば、この選択的ラセミ化とア
ミノアシラーゼとの共同作業により、原料であるＤＬ−
Ｎａ−アシルアミノ酸を一段階で目的のＬ−α−アミノ
酸に１００％変換することが可能となり、従来技術に不
可欠な分離操作とラセミ化操作を省略することができ、
光学活性アミノ酸の製造プロセスを飛躍的に効率化する
ことが可能となる。If this racemization reaction is carried out under conditions that do not deactivate aminoacylase (normal temperature, normal pressure, and in a near neutral aqueous solution), it is possible to separate L-α-amino acids and D-Na-acylamino acids. If it is possible to perform selective racemization only for DN-amino acids in the coexistence of optically active amino acids, this selective racemization and collaboration with aminoacylase can reduce the raw material DL-
It becomes possible to convert 100% of the Na-acyl amino acid into the target L-α-amino acid in one step, and the separation and racemization operations essential to conventional techniques can be omitted.
It becomes possible to dramatically improve the efficiency of the production process of optically active amino acids.

しかし温和な条件下で選択的にラセミ化を行うことは従
来技術では不可能である。この目的を達成するための一
つの手段として考えられるのは、−光学活性なＮ“−ア
ンルアミノ酸に作用してこれをラセミ化するが、しかし
対応する光学活性なα一アミノ酸には作用しないという
選択性をもつ酵素またはラセミ化剤を入手することであ
る。しかしながらこのような触媒作用を示す酵素または
ラセミ化剤は、今日に至るまで全く知られていない。However, selective racemization under mild conditions is not possible with conventional techniques. One possible means to achieve this goal is to act on the optically active N''-amino acid to racemize it, but not on the corresponding optically active α-amino acid. The objective is to obtain selective enzymes or racemizing agents.However, to date, no enzymes or racemizing agents exhibiting such catalytic activity are known.

なおＮ　−アンルアミノ酸には作用しないが光学活性α
−アミノ酸に作用してこれをラセミ化する酵素いわゆる
アミノ酸ラセマーゼの存在することはよく知られている
〔例えばバイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・
リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　Ｒｅｓ、　　Ｃｏｍｍ、）。Note that it does not act on N-anluamino acids, but optically active α
- It is well known that there is an enzyme called amino acid racemase that acts on amino acids to racemize them [for example, biochemical and biophysical research].
Research Communications (Biochem)
Biophys, Res, Comm,).

川、３６３（１９６９））。しかし、この目的に使用し
得ないことは明らかである。Kawa, 363 (1969)). However, it is clear that it cannot be used for this purpose.

〔課題を解決するための手段〕[Means to solve the problem]

本発明者らは鋭意探索研究を続けた結果、光学活性アミ
ノ酸には作用せず、光学活性Ｎ１２−アシルアミノ酸に
作用してこれをラセミ化する酵素が自然界に存在するこ
とを初めて明らかにし、本酵素をアシルアミノ酸ラセマ
ーゼと命名した。さらに、アシルアミノ酸ラセマーゼを
用いてＤＬ−Ｎｏ−アンルアミノ酸から光学活性のα−
アミノ酸を製造する方法を確立した。As a result of intensive research, the present inventors revealed for the first time that an enzyme exists in nature that does not act on optically active amino acids, but acts on optically active N12-acyl amino acids to racemize them. The enzyme was named acylamino acid racemase. Furthermore, using acylamino acid racemase, optically active α-
We have established a method for producing amino acids.

すなわち本発明は、 （１）下記性状を有する酵素、アシルアミノ酸ラセマー
ゼ。That is, the present invention provides: (1) An enzyme, acylamino acid racemase, having the following properties.

１）Ｄ−Ｎ−アシル−α−アミノカルボン酸を、対応す
るＬ−Ｎ−アシル−α−アミノカルボン酸に変換する。1) Converting D-N-acyl-α-aminocarboxylic acid to the corresponding L-N-acyl-α-aminocarboxylic acid.

１ｉ）Ｌ−Ｎ−アシル−α−アミノカルボン酸を、対応
するＤ−Ｎ−アシル−α−アミノカルボン酸に変換する
。1i) Converting L-N-acyl-α-aminocarboxylic acids to the corresponding D-N-acyl-α-aminocarboxylic acids.

ｉｉｉ）Ｄ−α−アミノ酸を、対応するＬ−α−アミノ
酸に変換しない。iii) Do not convert D-α-amino acids to the corresponding L-α-amino acids.

ｉｖ）Ｌ−α−アミノ酸を、対応するＤ−α−アミノ酸
に変換しない。iv) Do not convert L-α-amino acids to the corresponding D-α-amino acids.

（２）アシルアミノ酸ラセマーゼ生産能を有する微生物
を培地に培養し、該酵素を培養物中に生成。(2) Cultivating a microorganism capable of producing acylamino acid racemase in a medium, and producing the enzyme in the culture.

蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする上記アシ
ルアミノ酸ラセマーゼの製造法、および（３）　　ＤＬ
−Ｎ−アシル−α−アシルアミノ酸に、り−またはＬ−
アミノアシラーゼの共存下請求項（１）記載のアシルア
ミノ酸ラセマーゼを作用させることを特徴とする光学活
性のＤ−またはＬ−α−アミノ酸の製造法を提供するも
のである。DL
-N-acyl-α-acylamino acid, ri- or L-
The present invention provides a method for producing optically active D- or L-α-amino acids, which comprises allowing the acylamino acid racemase according to claim (1) to act in the presence of aminoacylase.

上記Ｎ“−アシルアミノ酸およびα−アミノ酸に関し、
α−アミノ酸は天然型、非天然型のいずれでもよい。ま
た中性、塩基性、酸性のいずれのα−アミノ酸でもよい
。Regarding the above N"-acylamino acids and α-amino acids,
The α-amino acid may be either natural or non-natural. Moreover, any neutral, basic, or acidic α-amino acid may be used.

上記Ｎ　−アシルアミノ酸として、例えば一般式 ％式％（１） ［式中、Ｘは置換基を有していてもよいカルボン酸由来
のアシルを、Ｒは置換基を有していてもよい炭素数１〜
２０のアルキルを示す］で表わされる化合物が挙げられ
る。The above-mentioned N-acylamino acid is, for example, the general formula % formula % (1) [wherein, Number 1~
20 alkyl].

Ｎａ−アシルアミノ酸のアシル基（Ｘ）に関し、アルカ
ノイル、ベンゾイル、アリールアルカノイルなどのカル
ホン酸アシルが挙げられ、これらのアンル基は置換基（
例、ハロゲン、Ｃｌ−３アルキル。Regarding the acyl group (X) of Na-acylamino acids, examples include carphonic acid acyl such as alkanoyl, benzoyl, and arylalkanoyl, and these anlu groups have a substituent (
Examples, halogen, Cl-3 alkyl.

Ｃ８−３アルコキシなど）を有していてもよい。上記ア
ルカノイルとして例えばホルミル、アセチル、プロピオ
ニル、クロロアセチルなどＣ１−３のアルカノイルが挙
げられ、ベンゾイルとして例えばベンゾイル、ｐ−クロ
ロベンゾイルなどが、アリールアルカノイルとして例え
ばフェニルアセチル、フェニルプロピオニルなどフェニ
ル−０１−３アルカノイルが挙げられる。C8-3 alkoxy, etc.). Examples of the alkanoyl include C1-3 alkanoyl such as formyl, acetyl, propionyl, and chloroacetyl; examples of benzoyl include benzoyl and p-chlorobenzoyl; and examples of arylalkanoyl include phenyl-01-3 alkanoyl such as phenylacetyl and phenylpropionyl. can be mentioned.

また、Ｒで表わされるアルキルとして、直鎖状または分
枝状のアルキル、ヒドロキシ、Ｃｌ−３アルキルチオ、
チオール、フェニル、ヒドロキシフェニルもしくはイン
ドリルで置換されたＣｌ−３アルキルおよびアミノ、カ
ルボキシ、グアニジルもしくはイミダゾリルなどで置換
されたＣ１−４アルキルなどが挙げられる。Further, as the alkyl represented by R, linear or branched alkyl, hydroxy, Cl-3 alkylthio,
Examples include Cl-3 alkyl substituted with thiol, phenyl, hydroxyphenyl or indolyl, and C1-4 alkyl substituted with amino, carboxy, guanidyl or imidazolyl.

アシルアミノ酸ラセマーゼの生産菌は、例えば次の手順
で見い出すことができる。すなわち、天然界から分離し
た微生物あるいは菌株保存センターから入手し得る微生
物を常法（必要に応じ、培地に該酵素を誘導するあるい
は該酵素の生産を促進する化合物例えば該酵素の基質等
あるいは金属塩等を添加する）にしたがって培養し、得
られた培養物から菌体を集め、必要があれば緩衝液など
で洗浄したのち、Ｎ−アセチル−Ｄ−メチオニンおよび
硫酸マグネシウムの適当量を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７
）中にこの菌体を懸澗し、３０℃で一夜振盪して反応さ
せる。反応液から菌体を除いたのち、反応上清にＬ−ア
ミノアシラーゼおよび必要があれば塩化コバルトを一定
量添加し、３７°Ｃで数時間反応させたのち、Ｔ　Ｌ　
Ｃ（ｎ−ブタノール、酢酸・水−３・１・１）にかけ、
ニンヒドリン発色によりメチオニンのスポットを与える
反応液を選び、ついでニンヒドリン反応および／または
高速液体クロマトグラフィにより反応液中のメチオニン
量を測定する。メチオニン陽性の反応液についてはさら
にＤ−アミノ酸オキシダーゼ溶液を添加し３０°Ｃで２
０時間反応させてＤ−メチオニンを分解したのち再びニ
ンヒドリン反応、高速液体クロマトグラフィおよび／ま
たはペディオコッカス・アシディラクヂＡＴＣＣ８０４
２を用いるバイオアッセー〔ジャーヤル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリ（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、
）、上７７．５３３（１９４９））にかけて反応液中の
残存メチオニンすなわちＬ−メチオニンの量を測定する
。こうしてＬ−メチオニン陽性の反応液を与えた菌株は
、Ｎ−アセデル＝Ｄ−メチオニンからＬ−メヂオニンを
生成する能力を有するのであるから、この菌株はアソル
アミノ酸ラセマーゼあるいはアミノ酸ラセマーゼのいず
れかまたは両方を生産するけずである。Bacteria producing acylamino acid racemase can be found, for example, by the following procedure. That is, microorganisms isolated from the natural world or microorganisms obtainable from strain preservation centers are prepared using conventional methods (if necessary, compounds that induce the enzyme or promote the production of the enzyme, such as substrates for the enzyme, or metal salts) are added to the culture medium. Collect cells from the resulting culture, wash with buffer if necessary, and add phosphoric acid containing appropriate amounts of N-acetyl-D-methionine and magnesium sulfate. Buffer solution (pH 7
) and allow the cells to react by shaking overnight at 30°C. After removing the bacterial cells from the reaction solution, L-aminoacylase and, if necessary, a certain amount of cobalt chloride were added to the reaction supernatant, and after reacting at 37°C for several hours, T L
Pour into C (n-butanol, acetic acid/water-3/1/1),
A reaction solution that gives a methionine spot by ninhydrin coloring is selected, and then the amount of methionine in the reaction solution is measured by ninhydrin reaction and/or high performance liquid chromatography. For methionine-positive reaction solutions, add D-amino acid oxidase solution and incubate at 30°C for 2 hours.
After 0 hour reaction to decompose D-methionine, ninhydrin reaction, high performance liquid chromatography and/or Pediococcus acidilakuchi ATCC804
Bioassay using 2 [J, Biol, Chem,
), supra 77.533 (1949)) to measure the amount of residual methionine, that is, L-methionine, in the reaction solution. In this way, the strain that gave the L-methionine positive reaction solution has the ability to produce L-methionine from N-acedel=D-methionine, so this strain can produce either asol amino acid racemase or amino acid racemase, or both. It is the waste that is produced.

そこで次にＬ−メチオニン陽性株を再度同条件で培養し
て菌体懸澗液を調製し、これにＮ−アセデル−Ｄ−メチ
オニンの代りにＬ−メチオニンを添加し、同様に反応さ
せる。除菌後反応液中のＩ）−メチオニンの量をＤ−ア
ミノ酸オギンダーゼ、ペロオキシダーゼ、フェノールお
よび４−アミノアンチピリンを用いる比色法〔クリニカ
ル・ケミストリー（ＣＩｉｎ、　Ｃｈｅｍ、）且、４．
７０（１９７４））　。Therefore, the L-methionine-positive strain is then cultured again under the same conditions to prepare a cell suspension, to which L-methionine is added instead of N-acedel-D-methionine and reacted in the same manner. After sterilization, the amount of I)-methionine in the reaction solution was determined by a colorimetric method using D-amino acid ogindase, peroxidase, phenol, and 4-aminoantipyrine [Clinical Chemistry (CIin, Chem)] and 4.
70 (1974)).

で定量し、Ｄ−メチオニン陰性の菌株を選択する。D-methionine negative strains are selected.

ここに用いたＮ−アセチル−Ｄ−メチオニンの代りに他
のＩ）−Ｎｃｌ−アシルアミノ酸を用いてもよい。こう
して、アミノ酸ラセマーゼ活性を示さず、Ｄ−Ｎｃｔ−
アシルアミノ酸から対応するＬ−α−アミノ酸を生成す
る株を選択すれば、アシルアミノ酸ラセマーゼ生産菌を
取得することができる。Other I)-Ncl-acylamino acids may be used in place of the N-acetyl-D-methionine used here. Thus, D-Nct-
By selecting a strain that produces the corresponding L-α-amino acid from an acylamino acid, an acylamino acid racemase producing bacterium can be obtained.

次にこの方法によって見い出されたＮ−アシルアミノ酸
ラセマーゼ生産菌を表１に示す。Next, Table 1 shows N-acylamino acid racemase producing bacteria found by this method.

（以下余白） 表Ｉ ＝１２− 表１に例示したアノルアミノ酸ラセマーゼ生産菌はたま
たま放線菌に属しているが、」二記の方法で見出し得る
アシルアミノ酸ラセマーゼ生産菌であれば、それらが放
線菌、細菌、かび、酵母、きのこのいずれに属する微生
物であっても本発明に使用し得る。(Leaving space below) Table I = 12 - The anol amino acid racemase-producing bacteria listed in Table 1 happen to belong to actinobacteria, but if the acylamino acid racemase-producing bacteria can be found by the method described in ``2'', they are actinobacteria. Any microorganism belonging to fungi, bacteria, mold, yeast, or mushrooms can be used in the present invention.

次に京都嵐山の土壌から分離したアシルアミノ酸ラセマ
ーゼ生産菌（表１にストレプトミセス・スピーシーズＹ
−５３として表示）の菌学的性質を示すと、下記の通り
である。Next, acylamino acid racemase producing bacteria isolated from the soil of Arashiyama, Kyoto (Table 1 shows Streptomyces sp.
-53) is as follows.

（ａ）形態 胞子形成菌糸は単純分枝を示し、その形態はフック状、
ループ状、まれに２−３巻の緩いコイル状（Ｒｅｔｉｎ
ａｃｕｌｕｍ−Ａｐｅｒｔｕｍ（ＲＡ））を呈する。胞
子は１０個以上鎖状に連らなり、円柱状（０，’ｌ−０
．９Ｘ１．ｌ−１．５μｍ）を呈し、その表面は平滑で
ある。胞子の運動性は観察されない。特殊構造体も観察
されない。細胞壁成分のジアミノピメリン酸はＬＬ型で
、糖については特徴的な糖は検出されない。細胞壁組成
はタイプＩに属する。(a) Morphology The spore-forming hyphae show simple branching, and the morphology is hook-shaped.
Loop shape, rarely loose coil shape with 2-3 turns (Retin
aculum-Apertum (RA)). More than 10 spores are connected in a chain, cylindrical (0,'l-0
．． 9X1. 1-1.5 μm), and its surface is smooth. No spore motility is observed. No special structures are observed. Diaminopimelic acid, a cell wall component, is of the LL type, and no characteristic sugars are detected. The cell wall composition belongs to type I.

（ｂ）各種培地における生育状態 Ｙ−５３株の各種培地上の生育状態は表２に示す通りで
ある。括弧内に示す色の記号はコンテナー・コーポレー
シヨン・オブ・アメリカ社製のカラー・ハーモニー・マ
ニュアル第４版に記載のものを用いた。(b) Growth status on various media The growth status of strain Y-53 on various media is as shown in Table 2. The color symbols shown in parentheses were those described in the Color Harmony Manual, 4th Edition, manufactured by Container Corporation of America.

（以下余白） ＝１６− （Ｃ）生理的性質 ■生育温度範囲、イースト・麦芽寒天培地上。(Margin below) =16- (C) Physiological properties ■Growth temperature range, on yeast/malt agar medium.

１４−３７°Ｃ（最適生育温度２０−３０’Ｃ）■ゼラ
チンの液化：陽性 ■スターチの加水分解：陽性 ■脱脂牛乳の凝固：陰性 脱脂牛乳のペプトン化、陽性 ■メラニン様色素の生成、陰性 （ｄ）炭素源の同化性 陽性：クルコース、キノロース、ラムノース擬陽性：フ
ラクトース 陰　性アラビノース、シュクロース、ラフィノース、マ
ンニトール、イノシトール 以上の菌学的性状から、Ｙ−５３株はストレプトミセス
属に属する菌株であるので、本発明者らはＹ−５３株を
ストレプトミセス・スピーシーズＹ−５３と称すること
とした。同Ｙ−５３株は財団法人発酵研究所にＴＰＯ−
１４５９６として寄託され、また昭和６２年８月１３日
に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に受託番
号ＦＥＲＭ−Ｐ９５１８として寄託され、ブタベスト条
約に基づきＦＥＲＭ　　ＢＰ−１８８９として同所に保
管されている。14-37°C (optimal growth temperature 20-30'C) ■ Liquefaction of gelatin: positive ■ Hydrolysis of starch: positive ■ Coagulation of skim milk: negative Peptonization of skim milk, positive ■ Production of melanin-like pigment, negative (d) Carbon source assimilation positive: Cucrose, quinolose, rhamnose False positive: Fructose negative Based on the mycological properties of arabinose, sucrose, raffinose, mannitol, and inositol, strain Y-53 is a strain belonging to the genus Streptomyces. Therefore, the present inventors decided to refer to the Y-53 strain as Streptomyces sp. Y-53. The Y-53 strain is TPO-
14596, and on August 13, 1985, it was deposited with the Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, with the accession number FERM-P9518, and is kept there as FERM BP-1889 based on the Butapest Treaty. There is.

なお、Ｙ−５３株もしくは表１に例示されたアシルアミ
ノ酸ラセマーゼ生産菌に由来する突然変異株、形質接合
体、あるいはこれらの菌株の遺伝子の一部（アシルアミ
ノ酸ラセマーゼをコードする部分を含む）を適当な宿主
微生物に組み込んで得られる遺伝子組換え体であっても
、アシルアミノ酸ラセマーゼを生産するものはすべて本
発明に使用できる。In addition, mutant strains or phenoconjugates derived from strain Y-53 or the acylamino acid racemase-producing bacteria listed in Table 1, or a portion of the gene of these strains (including the portion encoding acylamino acid racemase) Any genetically recombinant product that produces acylamino acid racemase can be used in the present invention, even if it is obtained by integrating it into a suitable host microorganism.

前記の微生物の培養に用いられる培地は該菌株が利用し
うる栄養源を含み、アシルアミノ酸ラセマーゼの生成を
促進するようなものならば、液体状でも固体状でもよい
。大量に培養するときは液体培地が便利である。The medium used for culturing the above-mentioned microorganisms may be in liquid or solid form as long as it contains a nutrient source that can be used by the strain and promotes the production of acylamino acid racemase. Liquid media are convenient when culturing in large quantities.

該培地には、微生物の培養に通常用いられる炭素源、窒
素源、無機塩類などが用いられる。炭素源としては、例
えばグルコース、グリセリン、デキストリン、スターチ
、糖蜜、動植物油などを、また窒素源としては、例えば
大豆粉、コーンスチープリカー、綿実かす、肉エキス、
ペプトン、酵母エキス。The medium includes carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, etc. that are commonly used for culturing microorganisms. Examples of carbon sources include glucose, glycerin, dextrin, starch, molasses, animal and vegetable oils, and examples of nitrogen sources include soybean flour, corn steep liquor, cottonseed meal, meat extract, etc.
Peptone, yeast extract.

硫酸アンモニウム、硝酸ソーダ、尿素等を使用できる。Ammonium sulfate, sodium nitrate, urea, etc. can be used.

その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム１カルシウム
、マグネシウム、マンカン、鉄、コバルト。In addition, sodium, potassium, calcium, magnesium, mankan, iron, and cobalt as necessary.

亜鉛、リン酸などの塩類が用いられることがある。Salts such as zinc and phosphoric acid may be used.

培養法としては、静置培養でも振盪培養または通気攪拌
培養でもよいが、大量の処理には通気攪拌培養が便利で
ある。培養温度は１５−３７°Ｃの範囲、好ましくは２
０−３７℃程度がよく、培地のｐ）（は５−９程度が望
ましい。培養時間は１８時間−４日間程度で、アシルア
ミノ酸ラセマーゼの蓄積量が最高になったときに培養を
停止する。The culture method may be static culture, shaking culture, or aerated agitation culture, but aerated agitation culture is convenient for large-scale processing. The culture temperature is in the range 15-37°C, preferably 2
The temperature is preferably about 0-37°C, and the p)( of the medium is preferably about 5-9. The culture time is about 18 hours to 4 days, and the culture is stopped when the amount of acylamino acid racemase accumulated reaches the maximum.

培養物からアシルアミノ酸ラセマーゼを採取するには、
まず培養物を遠心分離その他の操作により菌体と培養ろ
液に分け、該酵素が菌体内に存在するときは菌体を溶菌
酵素処理、超音波処理、フレンヂプレス処理、ダイノミ
ル処理などの種々の菌体破砕方法の単独使用または組合
せ使用により菌体を破砕し、該酵素を可溶化する。該酵
素が培養ろ液中に存在するときは培養ろ液をそのまま次
の精製プロセスに付することかできる。To obtain acylamino acid racemase from a culture,
First, the culture is separated into bacterial cells and culture filtrate by centrifugation or other operations, and if the enzyme is present in the bacterial cells, the bacterial cells are subjected to various treatments such as lytic enzyme treatment, ultrasonication, frenzy press treatment, Dyno Mill treatment, etc. The enzyme is solubilized by disrupting the microbial cells by using one or a combination of methods for disrupting the microbial cells. When the enzyme is present in the culture filtrate, the culture filtrate can be directly subjected to the next purification process.

可溶化された該酵素および培養ろ液中の該酵素の精製に
は、公知の酵素精製手段、例えば硫酸アンモニウムなど
による塩析法、ジエチルアミノエチルセルロースなどを
用いる陰イオン交換クロマトグラフィ、カルボキシメチ
ルセルロースなどを用いる陽イオン交換クロマトグラフ
ィ、デキストランゲルなどを用いるゲルろ過、疎水性樹
脂を用いる疎水性クロマトグラフィ、およびアフィニテ
ィクロマトグラフィなどを適宜組み合わせて使用すれば
よく、これにより目的に応じた精製度のアシルアミノ酸
ラセマーゼ標品を得ることができる。The solubilized enzyme and the enzyme in the culture filtrate can be purified by known enzyme purification methods, such as salting out using ammonium sulfate, anion exchange chromatography using diethylaminoethyl cellulose, and cation using carboxymethyl cellulose. Exchange chromatography, gel filtration using dextran gel, etc., hydrophobic chromatography using hydrophobic resin, affinity chromatography, etc. may be used in combination as appropriate, and by doing so, it is possible to obtain an acylamino acid racemase sample with a degree of purity appropriate for the purpose. Can be done.

〔作用〕[Effect]

本発明によって得られるアノルアミノ酸ラセマーゼは以
下に述べる理化学的性質を有する。The anol amino acid racemase obtained by the present invention has the following physicochemical properties.

■作用 該酵素はＬ　−Ｎ　ａ−アシルアミノ酸に作用して対応
するＩ）−Ｎ“−アンルアミノ酸に変換し、Ｄ＝２０＝ −Ｎａ−アシルアミノ酸に作用して対応するＬ−Ｎ“−
アシルアミノ酸に変換する。すなわち下式に示す可逆反
応を触媒とする。(2) Action The enzyme acts on L-Na-acylamino acid to convert it into the corresponding I)-N"-anluamino acid, and acts on D=20=-Na-acylamino acid to convert it into the corresponding L-N"-
Converts to acyl amino acid. That is, the reversible reaction shown in the following formula is used as a catalyst.

Ｌ−Ｎｃｌ−アンルアミノ酸＝ Ｄ−Ｎ“−アンルアミノ酸 ■基質特異性 下記表３に示すように、光学活性Ｎ“−アシルアミノ酸
には作用するが、対応する光学活性α−アミノ酸には作
用しない。L-Ncl-anluamino acid = D-N"-anluamino acid ■Substrate specificity As shown in Table 3 below, it acts on optically active N"-acylamino acids but does not act on the corresponding optically active α-amino acids. .

なお表３中の相対活性は、基質としてＮ　−アシルアミ
ノ酸を用いた場合は、■に記載した活性測定法に準じて
測定し、実測された各基質に対応するα−アミノ酸の生
成ｍ（ｍＭ）をメチオニンのそれを１００として表わし
たものである。また基質がＬ−Ｎａ−アシルアミノ酸の
場合は、Ｌ−アミノアシラーゼの代りにＹ−５３株が産
生ずるＤ−アミノアシラーゼを使用した。また基質とし
て光学活性アミノ酸を用いた場合はＤ−またはＬ−アミ
ノ酸オキシダーゼ（いずれもシグマ社製）で反応液を処
理した後高速液体クロマトグラフィにかけ、基質の光学
対掌体が生成したか否かを確認しノこ。In addition, when N-acyl amino acids are used as substrates, the relative activities in Table 3 are measured according to the activity measurement method described in ①, and the relative activities are determined based on the production m (mM ) is expressed as that of methionine as 100. When the substrate was L-Na-acylamino acid, D-aminoacylase produced by strain Y-53 was used instead of L-aminoacylase. When an optically active amino acid is used as a substrate, the reaction solution is treated with D- or L-amino acid oxidase (both manufactured by Sigma) and then subjected to high performance liquid chromatography to determine whether the optical antipode of the substrate has been produced. Check it out.

表３ 表３　（続き） ＮＤ測測定ず ■酵素活性測定法 アンルアミノ酸ラセマーゼは可逆反応を触媒する。ずな
イつちＤ−Ｎ　　−アンルアミノ酸を基質とした場合、
反応の進行につれて生成蓄積するＬ−Ｎ“−アンルアミ
ノ酸もまた該酵素の基質となるためその作用を受け、Ｄ
−Ｎａ−アシルアミノ酸すなわち基質に変換される。真
の反応速度を求めるためには生成物を直ちに他の化合物
に変換して反応系外に追い出すことが必要である。Table 3 Table 3 (Continued) ND measurement Measurement ■ Enzyme activity measurement method Anluamino acid racemase catalyzes a reversible reaction. When Zunaitsuchi DN-anluamino acid is used as a substrate,
L-N"-anluamino acid, which is produced and accumulated as the reaction progresses, also serves as a substrate for the enzyme and is therefore affected by the D
-Na- is converted into an acyl amino acid, i.e., a substrate. In order to determine the true reaction rate, it is necessary to immediately convert the product into another compound and expel it from the reaction system.

本発明者らはこの目的で、該酵素の活性測定用の反応系
に、生成物がＬ−（またはＤ−）Ｎａ−アシルアミノ酸
の場合はＬ−（またはＤ−）アミノアシラーゼを大過剰
に添加して生成物の脱アシル化反応を同時に行わせ、最
終的に蓄積するり、−（またはＤ−）アミノ酸の量を測
定し、この値（μＭ）が１−（またはＤ−）Ｎａ−アシ
ルアミノ酸の生成量に等しいとみなした。For this purpose, the present inventors added a large excess of L-(or D-)aminoacylase to the reaction system for measuring the activity of the enzyme when the product is an L-(or D-)Na-acylamino acid. The deacylation reaction of the product is carried out at the same time, and the amount of - (or D-) amino acid is measured, and this value (μM) is 1- (or D-) Na- It was considered to be equal to the amount of acyl amino acid produced.

酵素活性の測定は、酵素溶液５０μｇ、基質溶液４０μ
＆、Ｌ−アミノアシラーゼ溶液ＩＯμσおよび５０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）４００μρから成る
混合反応系を用いて行う。基質溶液としてはＮ＝アセチ
ル−Ｄ−メチオニン２５０ｍＭおよび塩化コバルト１２
．５ｍＭを含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７、５）を、
酵素溶液としてはア−２５＝ シルアミノ酸うセマーセ標品を１〜０．２ユニツト／滅
になるようにトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７５）に溶解し
た溶液を、モしてＬ−アミノアシラーゼ溶液としてはＬ
−アミノアンラーゼ標品（市販品例えばシグマ社製でも
良いが、本発明においてはＹ−５３株から抽出精製した
Ｌ−アミノアシラーゼを使用した）を４０〜８ユニツト
／滅になるようにトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に
溶解した溶液をそれぞれ使用する。To measure enzyme activity, use 50 μg of enzyme solution and 40 μg of substrate solution.
&, L-aminoacylase solution IOμσ and 50mM
A mixed reaction system consisting of 400 μρ of Tris-HCl buffer (pH 7.5) is used. Substrate solution: N=acetyl-D-methionine 250mM and cobalt chloride 12
．． Tris-HCl buffer (pH 7,5) containing 5mM
As an enzyme solution, a solution prepared by dissolving 1 to 0.2 units of the A-25 cylaminoacidase preparation in Tris-HCl buffer (pH 75) was used as an L-aminoacylase solution. is L
- Aminoanlase specimen (commercially available products, such as those manufactured by Sigma, may be used, but in the present invention, L-aminoacylase extracted and purified from strain Y-53 was used) in Tris-aminoacylase at 40 to 8 units/lack. A solution dissolved in a hydrochloric acid buffer (pH 7, 5) is used.

以」二の各溶液を、トリス−塩酸緩衝液、基質溶液、Ｌ
−アミノアソラーセ溶液、酵素溶液の順に混合し、酵素
溶液の添加と同時に３０℃で反応を開始する。反応時間
は該酵素溶液の活性が低いときは１２０分、高いときは
１０分行い、１００°Ｃ３分間の熱処理で反応を停止す
る。Each of the following solutions was mixed with Tris-HCl buffer, substrate solution, and L
- Mix the aminoasolase solution and the enzyme solution in this order, and start the reaction at 30°C simultaneously with the addition of the enzyme solution. The reaction time is 120 minutes when the activity of the enzyme solution is low, and 10 minutes when it is high, and the reaction is stopped by heat treatment at 100°C for 3 minutes.

酵素活性は、反応系中に生成したメチオニンの量を高速
液体クロマトグラフィで測定し、１分間に１μモルのメ
チオニンを生成する酵素活性を１ユニツトとして表イっ
す。反応時間Ｘ分で、反応系中にｙｍＭ濃度のメチオニ
ンが生成したときは、５０μρ中に含まれる酵素の活性
（αユニット）は、次式で求められる。Enzyme activity is determined by measuring the amount of methionine produced in the reaction system using high-performance liquid chromatography, and is expressed as one unit, which is the enzyme activity that produces 1 μmol of methionine per minute. When the reaction time is X minutes and ymM concentration of methionine is produced in the reaction system, the activity of the enzyme (α unit) contained in 50μρ can be determined by the following formula.

一 α−２Ｘ ■至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 上記酵素活性測定法においてトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７，５）の代りに、酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液（ｐＨ
４，０，５，０）、第一リン酸カリウム−第ニリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ６，０，７，０，８゜０）、第一
リン酸カリウム−ホウ酸ナトリウム（ｐＩ（６，３，７
，８，８，３，９，０）、炭酸ナトリウム−ホウ酸ナト
リウム（ｐＨ９，２，１０，０，１０，９）をそれぞれ
用い、反応は２時間または４時間行い、生成したメチオ
ニンの量比から相対活性を求めた。-α-2X ■Optimal pH and stable pH range In the above enzyme activity measurement method, Tris-HCl buffer (pH
7,5), use sodium acetate-hydrochloric acid buffer (pH
4,0,5,0), potassium monophosphate-sodium diphosphate buffer (pH 6,0,7,0,8°0), potassium monophosphate-sodium borate (pI (6,3 ,7
, 8, 8, 3, 9, 0) and sodium carbonate-sodium borate (pH 9, 2, 10, 0, 10, 9), the reaction was carried out for 2 or 4 hours, and the ratio of the amount of methionine produced was The relative activity was determined from

図１は、各１）Ｈ溶液中ての２時間反応の場合の相対酵
素活性を示ずが、至適ｐＨは８付近であることがわかる
。Although FIG. 1 does not show the relative enzyme activity in the case of 2-hour reaction in each 1) H solution, it can be seen that the optimum pH is around 8.

図２は、反応時間が２時間から４時間に延長されたとき
に、メチオニンの生成量がどの程度増加したかを示す。FIG. 2 shows how much methionine production increased when the reaction time was extended from 2 hours to 4 hours.

４時間反応で２時間反応の２倍近くメチオニンが生成し
た条件では該酵素は安定であるといえる。図２からアノ
ルアミノ酸ラセマーゼはｐＨ６〜９付近において安定で
あることかイつかる。It can be said that the enzyme is stable under conditions where nearly twice as much methionine is produced in a 4-hour reaction as in a 2-hour reaction. From FIG. 2, it can be seen that anol amino acid racemase is stable around pH 6 to 9.

■作用適温の、範囲 標準酵素活性測定法（■に記述）における反応温度（３
０８Ｃ）を２５．３０，３５．４０，５０，６０．また
は７０°Ｃに変えて、Ｎ−アシル−Ｄ−メチオニンから
のＬ−メヂオニンの生成量を測定した。使用酵素量を増
やし反応時間を５分とした。得られた結果を図３に示す
。図３から明らかなように、作用適温の範囲は３０°〜
５０°Ｃ付近である。■The reaction temperature in the standard enzyme activity measurement method (described in ■), which is the appropriate temperature for action (3
08C) to 25.30, 35.40, 50, 60. Alternatively, the temperature was changed to 70°C, and the amount of L-medionine produced from N-acyl-D-methionine was measured. The amount of enzyme used was increased and the reaction time was set to 5 minutes. The results obtained are shown in FIG. As is clear from Figure 3, the range of suitable temperature for action is 30°~
It is around 50°C.

■温度による失活の条件 該酵素溶液を３０°、３５°、４０°、５０°。■Conditions for inactivation due to temperature The enzyme solution was heated at 30°, 35°, 40°, and 50°.

６０°または７０°Ｃで３０分間加熱処理したのち、残
存する活性を標準活性測定法に従って測定した。After heat treatment at 60° or 70°C for 30 minutes, residual activity was measured according to standard activity assays.

その結果を図４の黒丸曲線で示す。The results are shown by the black circle curve in FIG.

この曲線から明らかなように、該酵素は４０℃までは安
定であるが、５０’Ｃを超えると失活する　、ようであ
る。なお該酵素溶液に１ｍＭのコバルトイオンを添加し
たうえで、上記と同条件で加熱処理を行い、残存活性を
測定したところ、Ｃｏ　　無添加の場合と異なる結果が
得られた。Ｃｏ　　添加時の結果を図４の白丸曲線で示
す。該酵素はＣＯ″＋共存下では５０°Ｃまで安定で、
６０°Ｃから失活を始めることがわかる。As is clear from this curve, the enzyme is stable up to 40°C, but appears to be inactivated at temperatures exceeding 50'C. Note that when 1 mM of cobalt ions were added to the enzyme solution, heat treatment was performed under the same conditions as above, and residual activity was measured, results different from those obtained when Co was not added were obtained. The results when Co was added are shown by the white circle curve in FIG. The enzyme is stable up to 50°C in the presence of CO″+,
It can be seen that deactivation begins at 60°C.

■金属イオンの影響 ■に記述した酵素活性測定法において、基質溶液中に添
加された塩化コバルト１２．５ｍＭ（反応液中の最終濃
度１ｍＭ）を除き、その代わりに各種金属塩あるいはＥ
ＤＴＡの１２．５ｍＭまたは１２５ｍＭ（反応液中の最
終濃度はそれぞれ１ｍＭまたはＩＯｍＭ）を加え、無添
加の場合をコントロールとして反応を行い、該酵素活性
に対する金属イオンの影響を調べた。なおこの実験に使
用したＬ−アミノアシラーゼの活性にはこれらの添加物
の影響がないことを確認済みである。その結果を表４に
示す。酵素活性は添加物無添加の場合を１００として相
対活性で示しである。■Influence of metal ions In the enzyme activity measurement method described in ■, 12.5mM of cobalt chloride (final concentration in the reaction solution of 1mM) added to the substrate solution was removed, and instead various metal salts or E
12.5mM or 125mM of DTA (final concentration in the reaction solution was 1mM or IOmM, respectively) was added, and the reaction was carried out using the case without addition as a control to examine the influence of metal ions on the enzyme activity. It has been confirmed that these additives have no effect on the activity of L-aminoacylase used in this experiment. The results are shown in Table 4. Enzyme activity is expressed as relative activity, with the case without additives being set as 100.

表４から明らかなように、該酵素は数種の金属イオンの
ある限られた濃度範囲において著しく活性化される。す
なわちコバルトイオンは低濃度（１ｍＭ付近）で活性化
効果が顕著であるが、ｌ０ｍＭでは該酵素をほとんど活
性化しない。亜鉛イオンやニッケルイオンも同様な傾向
をもつ。マグネンウムイオンはＩｍＭよりもｌ０ｍＭで
活性化効果が一層大きくなる。マンガンイオン、二価鉄
イオンも同様な傾向をもつ。阻害効果を顕著に示したの
は、供試金属イオンの中では銅イオンである。アルミニ
ウムイオンやモリブデン酸イオンも１０ｍＭでは阻害を
示ず。ＥＤＴＡはｌｏｍＭで阻害効果が顕著である。As is clear from Table 4, the enzyme is significantly activated in a certain limited concentration range of several metal ions. That is, cobalt ions have a significant activating effect at low concentrations (around 1 mM), but at 10 mM they hardly activate the enzyme. Zinc ions and nickel ions also have a similar tendency. Magnenium ions have a greater activation effect at 10 mM than at ImM. Manganese ions and divalent iron ions have similar tendencies. Among the metal ions tested, copper ion showed a remarkable inhibitory effect. Aluminum ions and molybdate ions also showed no inhibition at 10 mM. EDTA has a significant inhibitory effect at lomM.

■分子量 約２００，０００（実施例２の表５のステップ５で得ら
れた電気泳動的に単一蛋白となった標品について、デイ
ビス法〔アナルス・オブ・ザ・ニコーヨーク・アカデミ
−・オブ・ザイエンシーズ（Ａｎｎ、　Ｎ、　Ｙ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、１２１，４０４（１９６４）〕
に従って、第−化学薬品株式会社製のグラジェントゲル
（ＰΔＧプレート４７１５）を用い、３０ｍＡ定電流で
２時間電気泳動させ、同時に泳動させたマーカー蛋白質
の移動度との比較から推定した値である）。また同社製
の５ＤＳ−ＰＡＧプレート４／２０を用いて、上と同じ
酵素標品をＳＤＳの共存下に電気泳動を行ったところ、
その分子量は約４０，０００と推定された。■With a molecular weight of approximately 200,000 (the sample obtained in Step 5 of Table 5 of Example 2, which was electrophoretically a single protein, the Davis method [Annals of the Nikko York Academy of Science (Ann, N, Y, A
cad, Sci.), 121, 404 (1964)]
Accordingly, electrophoresis was performed for 2 hours at a constant current of 30 mA using a gradient gel (PΔG plate 4715) manufactured by Dai-Kagaku Yakuhin Co., Ltd., and the value was estimated from comparison with the mobility of a marker protein that was electrophoresed at the same time.) . In addition, when the same enzyme preparation as above was electrophoresed in the presence of SDS using the company's 5DS-PAG plate 4/20,
Its molecular weight was estimated to be approximately 40,000.

■等電点 ４８（キャリア・アンホライトを用いるアカロース電気
泳動法により測定した。測定にはＬ　Ｋ　Ｂ２１１７型
電気泳動装置とファルマライ１−ｐＨ３〜１０（ファル
マシア製）を用い、定電力（２Ｗ）で２５時間泳動した
）。■ Isoelectric point 48 (Measured by acarose electrophoresis using carrier amphorite. For measurement, an L K B2117 electrophoresis apparatus and Pharmaly 1-pH 3-10 (manufactured by Pharmacia) were used, and the time).

本発明のアシルアミノ酸ラセマーゼは、Ｌ−アミノアシ
ラーゼまたはＤ−アミノアンラーゼと共に用いると、安
価なり　Ｌ　−Ｎ“−アシルアミノ酸から一段階で光学
活性Ｌ−α−アミノ酸または光学活性Ｄ−α−アミノ酸
を製造することができる。The acylamino acid racemase of the present invention is inexpensive when used together with L-aminoacylase or D-aminoanlase. can be manufactured.

Ｌ−アミノアンラーゼは公知の方法で容易に入手し得る
が、市販品を使用することも可能である。Although L-aminoanlase can be easily obtained by a known method, it is also possible to use a commercially available product.

Ｄ＝ニアミノアシラーゼ、ストレプトミセス属菌〔特開
昭６２−１２６９６９および特開昭６２−１２６９７６
）、シュードモナ属菌〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、
１７０，８８８（１９５２）、特公昭６Ｏ−３１４７７
）およびアルカリ土類金属菌〔日本農芸化学会、昭和６
２年度大会の講演要旨集６５９頁〕が生産するとされて
いる。D = Niaminoacylase, Streptomyces sp.
), Pseudomonas [Nature,
170,888 (1952), Special Publication No. 6O-31477
) and alkaline earth metal fungi [Japan Society of Agricultural Chemistry, 1932]
It is said that a 659-page collection of lecture abstracts for the second year's conference will be produced.

またアシルアミノ酸ラセマーゼ生産菌として本発明で分
離選択された菌株の多くはアシルアミノ酸ラセマーゼの
ほかにＤ−アミノアシラーゼおよび／またはＬ−アミノ
アシラーゼをも生産する。Furthermore, many of the strains isolated and selected in the present invention as acylamino acid racemase producing bacteria also produce D-aminoacylase and/or L-aminoacylase in addition to acylamino acid racemase.

したがってＤＬ−Ｎ“−アシルアミノ酸を原料として光
学活性α−アミノ酸を製造する場合には、本発明方法に
よって製造される各種精製度のアシルアミノ酸ラセマー
ゼ標品の中から使用の目的および態様に適した標品を選
び、例えばＬ−α−アミノ酸を製造する場合には、当該
酵素標品と市販のあるいは適当なＬ〜ルアミノアシラー
ゼ産菌から分取したＬ〜ルアミノアシラーゼを同時にま
たは交互にＤＬ−Ｎ“−アシルアミノ酸に作用させ、原
料が実質的に１００％Ｌ−α−アミノ酸に変換したとこ
ろで反応を中止し反応液からＬ−α−アミノ酸を回収す
ればよい。Therefore, when producing an optically active α-amino acid using DL-N"-acylamino acid as a raw material, select one suitable for the purpose and mode of use from among the acylamino acid racemase preparations of various degrees of purification produced by the method of the present invention. When a sample is selected and, for example, L-α-amino acid is produced, the enzyme preparation and L-ruaminoacylase isolated from a commercially available or suitable L-ruaminoacylase-producing bacterium are simultaneously or alternately DL. -N"-acylamino acid, and when the raw material is substantially 100% converted to L-α-amino acid, the reaction may be stopped and the L-α-amino acid may be recovered from the reaction solution.

ここで使用の目的に適した標品とは、使用の目的が１７
−アミノ酸の製造であれば、当該標品中にはＤ−アミノ
アシラーゼが含まれていてはならないという要件を満た
していることを意味し、また使用の態様に適した標品と
は、当該酵素を固定化し５てバイオリアクターとして使
用する場合を例にとれば、包括固定化法では当該酵素を
含む菌体そのものでもあるいは無細胞抽出液でもよいこ
とを意味するのに対し、イオン交換樹脂への吸着法ある
いは不溶性担体への共有結合法では、当該酵素標品の精
製度は若干高めでなければならないことを意味する。Here, a standard specimen suitable for the purpose of use means that the purpose of use is 17.
- In the case of amino acid production, this means that the sample must not contain D-aminoacylase, and a sample that is suitable for the mode of use is defined as the enzyme in question. For example, when using a bioreactor after immobilizing the enzyme, the comprehensive immobilization method means that the bacterial cells themselves containing the enzyme or a cell-free extract can be used, whereas Adsorption methods or covalent bonding methods to insoluble carriers mean that the enzyme preparation must be slightly more purified.

本発明による光学活性アミノ酸の製造法に使用しうるア
シルアミノ酸ラセマーゼ標品としては、当該酵素生産菌
が１７−アミノアシラーゼもＤ−アミノアンラーゼも生
産しない場合は、この生産菌の培養細胞およびその処理
物、その細胞から抽出し各種程度に精製された当該酵素
標品が使用できる。When the enzyme-producing bacterium does not produce 17-aminoacylase or D-aminoanlase, the acylamino acid racemase preparation that can be used in the method for producing optically active amino acids according to the present invention includes cultured cells of the enzyme-producing bacterium and its The processed product and enzyme preparations extracted from the cells and purified to various degrees can be used.

当該酵素生産菌がＬ−アミノアシラーゼまたはＤ−アミ
ノアシラーゼを同時に生産する場合には、Ｌ−α−アミ
ノ酸またはＤ−α−アミノ酸の製造にそれぞれ上記の菌
と全く同様に使用できる。When the enzyme-producing bacterium simultaneously produces L-aminoacylase or D-aminoacylase, it can be used in the production of L-α-amino acids or D-α-amino acids, respectively, in exactly the same manner as the above-mentioned bacteria.

この場合、併産する■７−アミツアノラーゼまたはＤ−
アミノアノラーゼの活性が当該酵素の活性よりもはるか
に強いときは、Ｌ−またはＤ−アミノアンラーゼを別途
追加する必要がない。In this case, co-produced ■ 7-amituanolase or D-
When the activity of aminoanolase is much stronger than that of the enzyme, there is no need to separately add L- or D-aminoanlase.

当該酵素生産菌がＬ−アミノアシラーゼとＤ−アミノア
ンラーゼとを同時に生産するときは、常法に従って、Ｄ
−アミノアシラーゼまたはＬ−アミノアシラーゼの欠損
株を変異誘導したうえで、それぞそれＬ−アミノ酸また
はＤ−アミノ酸の製造に使用することができる。培養細
胞から酵素標品まで各種精製段階のものも適宜使用しう
る。When the enzyme-producing bacterium simultaneously produces L-aminoacylase and D-aminoanlase, D
- A strain deficient in aminoacylase or L-aminoacylase can be mutagenized and then used for the production of L-amino acids or D-amino acids, respectively. Products in various purification stages, ranging from cultured cells to enzyme preparations, can also be used as appropriate.

なお培養細胞あるいは無細胞抽出液のレベルでは目的物
であるアミノ酸を分解する酵素が含まれていることもあ
るので、このようなときはアミノ酸分解活性を欠落させ
るかあるいは除去することが必要である。アミノアノラ
ーゼの欠損株でないときは、細胞のレベルで光学活性α
−アミノ酸の製造に直接使用することは困難であるが、
熱処理あるいは阻害剤等の添加により、当該酵素に影響
を与えずにアミノアシラーゼの一方または両方を失活さ
せて使用することができる。また、■、−およびＤ−ア
ミノアシラーゼを併産する菌株から当該酵素標品を調製
する場合は、培養細胞から当該酵素を抽出した後、目的
のアミノ酸の製造に障害となるアミノアシラーゼをまず
分離除去し、しかる後必要があればさらに適当な精製操
作を加えて当該酵素標品を調製する。Note that cultured cells or cell-free extracts may contain enzymes that decompose the target amino acids, so in such cases it is necessary to eliminate or eliminate the amino acid degrading activity. . When the strain is not deficient in aminoanolase, optical activity α is maintained at the cellular level.
- Although it is difficult to use directly for the production of amino acids,
One or both of the aminoacylases can be inactivated and used without affecting the enzyme by heat treatment or addition of an inhibitor or the like. In addition, when preparing the enzyme preparation from a strain that co-produces -, - and D-aminoacylases, after extracting the enzyme from cultured cells, first isolate the aminoacylase that is an obstacle to the production of the desired amino acid. The enzyme preparation is then removed and, if necessary, further subjected to appropriate purification operations to prepare the enzyme preparation.

当該酵素並びにＩ７−またはＤ−アミノアノラーゼを用
いてＬ−またはＤ−α−アミノ酸を製造する場合、当該
酵素標品と１７−またはＤ−アミノアシラーゼを、原料
であるＤ　Ｌ　−Ｎ“−アシルアミノ酸とＣｏ　　また
はその他の金属イオンの適当量を含むｐＨ６〜９付近の
緩衝液中に溶解し、適当な温度で静置して反応を完結さ
せる方法、当該酵素標品とＬ−またはＤ−アミノアシラ
ーゼを公知の方法で同時にまたは別々に固定化した後反
応容器に一段または多段に充填してバイオリアクターを
調製し、このリアクターにＤ　Ｌ−Ｎ　　−アンルアミ
ノ酸とＣＯまたはその他の適当な金属イオンを含むｐ１
１６〜９付近の緩衝液を通して反応させる方法、あるい
は半透膜で仕切られた反応容器の一方に両酵素を溶解し
、原料溶液を注入して反応を行わせ、半透膜を通過した
生成物を回収する方法などが通常用いられる。いずれの
場合も反応液は滅菌し、可能な限り無菌的に操作するこ
とが望ましい。When producing L- or D-α-amino acids using the enzyme and I7- or D-aminoanolase, the enzyme preparation and 17- or D-aminoacylase are used as raw materials D L -N”- A method in which the reaction is completed by dissolving the acyl amino acid in a buffer solution containing an appropriate amount of Co or other metal ions and having a pH of around 6 to 9, and allowing it to stand at an appropriate temperature. A bioreactor is prepared by immobilizing aminoacylase simultaneously or separately by a known method and then filling it in a reaction vessel in one or more stages, and this reactor is charged with D L-N-amino acid and CO or other suitable metal ions. p1 containing
A method of reacting by passing a buffer solution around 16 to 9, or dissolving both enzymes in one of the reaction containers separated by a semipermeable membrane, injecting the raw material solution and causing the reaction, and the product passing through the semipermeable membrane. Usually, methods such as collecting In either case, it is desirable to sterilize the reaction solution and operate as aseptically as possible.

こうして得られた反応終了液中には、目的の光学活性ア
ミノ酸とアシル基の加水分解によって生成した有機酸が
含まれるだけであるので、目的のアミノ酸は常法によっ
て容易に回収することができる。The reaction-completed liquid thus obtained contains only the desired optically active amino acid and the organic acid produced by hydrolysis of the acyl group, so the desired amino acid can be easily recovered by a conventional method.

〔実施例〕〔Example〕

実施例Ｉ ＢＢＬトリプチケース・ソイ・ブロス（ベクトン・ディ
キンソン社販売）とＮ−アセチル−Ｄ−メチオニン０１
％とを含む培地（１）Ｈ７，０）を２００旋容三角フラ
スコに２０滅ずっ分注し、１２０℃で２０分間滅菌処理
した。一方、ストレプトミセス・スピーシーズＹ−５３
株を予め液体培養した後凍結保存（−８０℃）しておき
、必要に応じ溶解して接種用種菌として使用した。Example I BBL trypticase soy broth (sold by Becton Dickinson) and N-acetyl-D-methionine 01
% (1) H7.0) was dispensed 20 times into a 200-volume Erlenmeyer flask and sterilized at 120° C. for 20 minutes. On the other hand, Streptomyces sp. Y-53
The strain was previously liquid cultured and then stored frozen (-80°C), thawed as needed, and used as a seed for inoculation.

」二記の培地３０本に、溶解した凍結保存菌０゜７旋ず
つを無菌的に接種し、２８℃で２日間振とう培養して種
培養を得た。ついで同じ培地５００本に種培養をＩ滅ず
つ移植し、２８℃で４２時間振盪培養した。フラスコの
内容物を集め、遠心分ＭＣ４°Ｃ，１０，０００ｒｐｍ
、１５分間）により菌体を集め、生理的食塩水で洗浄し
た後２１６ｇの湿菌体を得た。以下の操作はすべて４°
Ｃ以下の低温で行った。0.7 volumes of the lysed cryopreserved bacteria were aseptically inoculated into 30 bottles of the medium described in 2.2, and cultured with shaking at 28°C for 2 days to obtain a seed culture. Then, the seed culture was transplanted one by one into 500 bottles of the same medium, and cultured with shaking at 28°C for 42 hours. Collect the contents of the flask and centrifuge at MC 4°C, 10,000 rpm.
, for 15 minutes), and after washing with physiological saline, 216 g of wet bacterial cells were obtained. All operations below are 4°
The test was carried out at a low temperature below C.

湿菌体２１６ｇを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐｌ−Ｉ７．
０）のＩＱに懸濁し、ダイノミル（ウィリー・ニー・バ
クホーフェン社製細胞破砕機）によって細胞を破砕した
。使用したガラスピーズは直径０゜１〜０　、２　ｍｍ
、流速は６０成／分であった。処理液を４８Ｃ，１０，
０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、無細胞抽出液１７
００滅を得た。この液のアシルアミノ酸ラセマーゼ活性
は４９ユニツト、比活性は０５２ミリユニット／ｍｇ蛋
白であった。総蛋白質量は、バイオラッド・プロティン
・アッセイ法で測定した。216 g of wet bacterial cells were added to 50 mM phosphate buffer (pl-I7.
The cells were suspended in IQ 0) and disrupted using a Dynomill (cell disruptor manufactured by Willy Nie Bakhoven). The glass beads used had a diameter of 0.1 to 0.2 mm.
, the flow rate was 60 components/min. Processing liquid at 48C, 10,
Centrifuge at 000 rpm for 20 minutes to extract cell-free extract 17
I got 00 annihilation. The acylamino acid racemase activity of this solution was 49 units, and the specific activity was 052 milliunits/mg protein. Total protein amount was measured by Bio-Rad protein assay.

実施例２ 実施例１で得た無細胞抽出液＋　７００成に３００ｇの
硫酸アンモニウムを冷却攪拌しながらゆっくりと添加し
た。全量添加後、さらに３０分間攪拌を続け、４°Ｃ，
１０，００Ｏｒｐｍで３０分間遠心分離して澄明な上清
１６６０ｄを得た。Example 2 300 g of ammonium sulfate was slowly added to the cell-free extract obtained in Example 1 with stirring while cooling. After adding the entire amount, continue stirring for another 30 minutes, and heat at 4°C.
A clear supernatant 1660d was obtained by centrifugation at 10,000 rpm for 30 minutes.

予め５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０，３０％飽和硫
酸アンモニウムを含む）で平衡化させた　２ＴＳＫＨＷ
６５　Ｃ（東ソー（株）社製）カラム（４，８ｃｍＸ　
３０　ｃｍ）に上清１６６０旋を吸着させ、１０００戚
の上記リン酸緩衝液で洗浄した後、硫酸アンモニウムを
含まないリン酸緩衝液で蛋白成分を溶出し、溶出液中の
当該酵素活性の認められる両分を集めた。こうして得ら
れた活性画分３３０旋に硫酸アンモニウム１２８ｇを冷
却攪拌しながらゆっくりと加えた。生じた沈澱は１０゜
００　Ｏｒｐｍで３０分間冷却遠心分離することにより
分取した。この沈殿を５０滅の５０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ７，０）に溶解し、セファデックスＧ２５（ファル
マシア製）カラムを通して脱塩した。2TSKHW equilibrated in advance with 50mM phosphate buffer (pH 7.0, containing 30% saturated ammonium sulfate)
65 C (manufactured by Tosoh Corporation) column (4.8 cm
After adsorbing the supernatant (1,660 cm) onto a 30 cm sample and washing with the above phosphate buffer (1,000 cm), the protein component was eluted with a phosphate buffer that did not contain ammonium sulfate, and the enzyme activity in the eluate was detected. I collected both parts. 128 g of ammonium sulfate was slowly added to 330 volumes of the thus obtained active fraction while cooling and stirring. The resulting precipitate was separated by refrigerated centrifugation at 10°00 Orpm for 30 minutes. This precipitate was dissolved in 50mM phosphate buffer (
pH 7.0) and desalted through a Sephadex G25 (manufactured by Pharmacia) column.

こうして得られた粗酵素溶液を、予め５０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）で平衡化させたＤＥＡＥトヨパール
６５０Ｍ（東ソー（株）製）カラム（４１，８ｃｍＸ　
３０　ｃｍ）に吸着させ、１０００滅の同緩衝液で洗浄
し、ついで０．２Ｍ　ＮａＣρを含む同緩衝液で溶出し
て、活性画分３４０滅を得た。この活性画分に硫酸アン
モニウム１３３ｇを常法に従って添加し、生じた沈殿を
遠心分離（４℃、１０，０００ｒｐｍ、３０分）で集め
たのち、３０滅の同緩衝液に溶解し、セファデックスＧ
５のカラムを通して脱＝３９− 塩した後、５９滅の粗酵素溶液を得た。この粗酵素溶液
を、予め同緩衝液で平衡化させたＤＥＡＥ−５ＰＷカラ
ム（東ソー（株）製、径２．１５ｃｍｘ１５ｃｍ）に吸
着させ、ＨＬＣ８３７型分取用高速液体クロマトグラフ
（東ソー（株）製）にかけ、ＮａＣＱ濃度を０−０．５
Ｍまで直線的に増加させて溶出を行った。溶出速度は毎
分４旋であった。３２分から３６分までの溶出画分を回
収して、活性画分＋６ｄを得た。ここに含まれるアシル
アミノ酸ラセマーゼの活性は、約７．２ユニツトで、比
活性は約６３ミリユニツト／ｍｇ蛋白となり、比活性は
無細胞抽出液から約１２２倍に上昇した。The crude enzyme solution thus obtained was applied to a DEAE Toyo Pearl 650M (manufactured by Tosoh Corporation) column (41.8 cm
30 cm), washed with 1000% of the same buffer, and then eluted with the same buffer containing 0.2M NaCρ to obtain an active fraction of 340%. 133 g of ammonium sulfate was added to this active fraction according to a conventional method, and the resulting precipitate was collected by centrifugation (4°C, 10,000 rpm, 30 minutes), then dissolved in the same buffer solution with Sephadex G
After desalting through 5 columns, a 59% crude enzyme solution was obtained. This crude enzyme solution was adsorbed onto a DEAE-5PW column (manufactured by Tosoh Corporation, diameter 2.15 cm x 15 cm) that had been equilibrated in advance with the same buffer solution, and then adsorbed onto a HLC837 preparative high performance liquid chromatograph (manufactured by Tosoh Corporation). ), NaCQ concentration is 0-0.5
Elution was performed in linear increases up to M. The elution rate was 4 revolutions per minute. The elution fraction from 32 minutes to 36 minutes was collected to obtain active fraction +6d. The activity of the acylamino acid racemase contained here was about 7.2 units, and the specific activity was about 63 milliunits/mg protein, which was about 122 times higher than that of the cell-free extract.

さらに、この活性画分を、予め５０ｍＭリン酸緩衝液で
平衡化させたＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷカラム（東ソー（
株）製、径５．５ｃｍＸ　６０ｃｍ）を装着したＨＣＬ
８３７型分取用クロマトグラフにかけ、毎分１滅の流速
でゲルろ過を行い、活性画分を分取した。この両分はポ
リアクリルアミドゲルの電気泳動で１本のバンドを示し
たので、アシルアミノ酸ラセマーゼはほぼ精製されたと
判断した。この画分にはアシルアミノ酸ラセマーゼ活性
が１゜２ユニツト含まれており、比活性は２８ユニット
／ｍｇ蛋白であった。Furthermore, this active fraction was added to a TSK-G3000SW column (Tosoh Co., Ltd.) equilibrated with 50mM phosphate buffer in advance.
Co., Ltd., diameter 5.5cm x 60cm)
The active fraction was collected using a 837 preparative chromatograph and subjected to gel filtration at a flow rate of 1 minute per minute. Since both of these components showed one band in polyacrylamide gel electrophoresis, it was determined that the acylamino acid racemase was almost purified. This fraction contained 1.2 units of acylamino acid racemase activity, and the specific activity was 28 units/mg protein.

上記の各採取工程におけるアシルアミノ酸ラセマーゼの
全活性、全蛋白量および比活性を各標品の容量とともに
表５に示す。The total activity, total protein amount, and specific activity of acylamino acid racemase in each of the above collection steps are shown in Table 5 along with the volume of each sample.

実施例３ 実施例１と同様にして、ストレプトミセス・スピーンー
ズＹ−５３株を１０Ｑ、培養し、４２時間培養の菌体を
遠心分離により集め、０．８％ＮａＣρ溶液で一度洗浄
し、湿菌体３００ｇを取得した。Example 3 In the same manner as in Example 1, Streptomyces speens strain Y-53 was cultured for 10Q, and the bacterial cells cultured for 42 hours were collected by centrifugation, washed once with 0.8% NaCρ solution, and cultured as wet bacteria. A body weighing 300 g was obtained.

この湿菌体を実施例１と同様にダイノミル細胞破砕機で
破砕し、遠心分離（毎分１万回転、２０分）を行い、上
澄液１６８０ｄを得た。この上澄液にはアシルアミノ酸
ラセマーゼが２１ユニツト、Ｌ−アミノアシラーゼが３
１５ユニツト、Ｄ−アミノアシラーゼが７５ユニツト含
まれていた。この上澄液に３０％飽和になるように硫酸
アンモニウムを添加し、生じた沈殿を遠心除去した。遠
心上清画分にはさらに硫酸アンモニウムを加えて６０％
飽和とし、生じた沈殿を遠心分離により回収した。得ら
れた沈殿は、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７０）に溶解
し、同緩衝液で平衡化したセファデックスＧ２５を用い
てゲルろ過による脱塩を行い、得られた溶液をイオン交
換クロマトグラフィにかけた。The wet bacterial cells were disrupted using a Dynomill cell disruptor in the same manner as in Example 1, and centrifuged (10,000 revolutions per minute, 20 minutes) to obtain 1680 d of supernatant. This supernatant contains 21 units of acylaminoacid racemase and 3 units of L-aminoacylase.
It contained 15 units and 75 units of D-aminoacylase. Ammonium sulfate was added to this supernatant to make it 30% saturated, and the resulting precipitate was removed by centrifugation. Ammonium sulfate was further added to the centrifuged supernatant fraction to give a concentration of 60%.
The mixture was saturated and the resulting precipitate was collected by centrifugation. The resulting precipitate was dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 70) and desalted by gel filtration using Sephadex G25 equilibrated with the same buffer, and the resulting solution was subjected to ion exchange chromatography.

５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したＤ
ＥＡＥトヨパール６５０Ｍカラム（樹脂量７００ｄ）に
」二記脱塩処理液（４９０ｄ）をチャージし、２Ｑの同
リン酸緩衝液で洗浄して非吸着成分を洗い流した。この
洗浄液からＤ−アミノアンラーゼ１１４ユニツトが回収
された。このＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍカラムには、
アシルアミノ酸ラセマーゼ（約２０ユニツト）とＬ−ア
ミノアンラーゼ（約９００ユニツト）が比較的強く結合
しており、０．２モル以上の含塩溶液を流さない限り溶
出されてこない。D equilibrated with 50mM phosphate buffer (pH 7,0)
An EAE Toyopearl 650M column (resin amount: 700 d) was charged with the desalting solution (490 d) and washed with 2 Q of the same phosphate buffer to wash away non-adsorbed components. 114 units of D-aminoanlase were recovered from this washing solution. This DEAE Toyopearl 650M column has
Acylamino acid racemase (approximately 20 units) and L-aminoanlase (approximately 900 units) are relatively strongly bound, and will not be eluted unless a solution containing 0.2 molar or more of salt is passed.

上のカラムを３０℃に保ち、これに０．５％のＮ−アセ
チル−ＤＬ−メチオニンとＩｍＭの塩化コバルトを含む
２０ｍＭリン酸緩衝液を毎時間３０轍の流速で流した。The upper column was maintained at 30° C., and a 20 mM phosphate buffer containing 0.5% N-acetyl-DL-methionine and ImM cobalt chloride was passed through it at a flow rate of 30 strokes every hour.

流出液３ρを集め、ｌＲ１２０のカヂオン交換樹脂を通
したのち、減圧濃縮乾固した。得られた残留物を冷無水
アルコール１０ｙｄで２回洗ったのち、熱水約１００ｒ
ｎ１に溶解し、冷時析出する結晶をろ取した。さらにろ
液にアルコールを滴下し、−夜放置後析出した結晶をろ
取した。得られた結晶を乾燥し、９．６ｇのし−メチオ
ニンを取得した。融点２．８Ｆ１２８１°。The effluent 3ρ was collected, passed through a 1R120 cation exchange resin, and then concentrated to dryness under reduced pressure. The resulting residue was washed twice with 10 yd of cold absolute alcohol, and then washed with about 100 yd of hot water.
The crystals dissolved in n1 and precipitated during cooling were collected by filtration. Furthermore, alcohol was added dropwise to the filtrate, and after standing overnight, the precipitated crystals were collected by filtration. The obtained crystals were dried to obtain 9.6 g of methionine. Melting point 2.8F 1281°.

水晶は高速液体クロマトグラフィおよび薄層クロマトグ
ラフィでＬ−メチオニンの標準品と全く同じ挙動を示し
た。また水晶と標準品とを混融したが融点降下を示さな
かった。The crystal showed exactly the same behavior as the standard L-methionine in high performance liquid chromatography and thin layer chromatography. Also, when the crystal and the standard product were mixed and melted, no decrease in the melting point was observed.

実施例４ 実施例１と同様にして調製したストレプトミセス・スピ
シーズＹ−５３株の凍結保存菌の溶解液０７轍を２００
旋三角フラスコに２０轍分注滅菌した種培地（グリセリ
ン１．５％、ポリペプトン１．０％、酵母エキス１．０
％９食塩０．５％、第ニリン酸カリウム０．２５％、硫
酸マグネンウム０．２５％、Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチ
オニン００５％。Example 4 A lysis solution of cryopreserved Streptomyces sp.
Dispense sterilized seed medium (glycerin 1.5%, polypeptone 1.0%, yeast extract 1.0%) into an Erlenmeyer flask for 20 times.
%9 Salt 0.5%, Potassium diphosphate 0.25%, Magnenium sulfate 0.25%, N-acetyl-DL-methionine 005%.

ｐＨ７，０）３０本に接種し、２８℃で１８時間、回転
振盪機（２０Ｏｒｐｍ）上で培養した。It was inoculated into 30 plants (pH 7.0) and cultured on a rotary shaker (20 rpm) at 28°C for 18 hours.

この種培養ｌ鍾を２００滅三角フラスコに２０轍分注滅
菌した生産培地（グリセリン０．５％、ポリペプトン１
．０％９食塩０．５％、第ニリン酸カリウム０．２５％
、Ｎ−アセデル−ＤＬ−メチオニン０゜０５％、ｐＨ７
，０）２５０本に移植し、２８℃で１８時間９回転振盪
機上で培養した。得られた培養液から遠心分離（４°Ｃ
，１０，００Ｏｒｐｍ、１５分間）により菌体を集め生
理的食塩水で２回洗浄し、３８５ｇの洗浄湿菌体を得た
。以後の操作はすべて４°Ｃ以下で行った。湿菌体３８
５ｇを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７、０）の１ρに懸
濁し、ダイノミル（ウィリー・ニー・バクホーフェン社
製、細胞破砕機）を用いて以下の条件で細胞を破砕した
。A production medium (glycerin 0.5%, polypeptone 1%
．． 0%9 salt 0.5%, potassium diphosphate 0.25%
, N-acedel-DL-methionine 0°05%, pH 7
, 0), and cultured at 28° C. for 18 hours on a 9-rpm shaker. The obtained culture solution was centrifuged (4°C
, 10.00 rpm, 15 minutes) and washed twice with physiological saline to obtain 385 g of washed wet bacterial cells. All subsequent operations were performed below 4°C. Wet bacterial body 38
5 g was suspended in 1 ρ of 50 mM phosphate buffer (pH 7, 0), and the cells were disrupted using a Dynomill (manufactured by Willy Nie Bakhoven, cell crusher) under the following conditions.

破砕条件、ガラスピーズ　直径０．１〜０．２ｍｍ流速
６０ｔｄ）、７分 回転数　３，０００ｒｐｍ 得られた破砕液をＩ　０．００　（ｌｒｌ）ｍで２０分
間遠心分離し、無細胞抽出液１２８０社を得た。この抽
出液のアシルアミノ酸ラセマーゼの全活性は、７５ユニ
ツト、Ｌ−アミノアノラーゼのそれは１５００ユニツト
であった。得られた抽出液１２８０７Ｊに５００ｇの硫
酸アンモニウムを冷却攪拌しながら、ゆっくりと添加し
た。添加後さらに２時間攪拌を続けた後、生じた沈澱物
を遠心分Ｍ（］　０．０００ｒｐｍ、３０分）で集めた
。集めた沈澱物を４℃の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
、０’）６００威に溶解し、同緩衝液で１８時間透析、
脱塩を行った。得られた酵素液を、あらかじめ５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化されたＤＥＡＥト
ヨパール６５０Ｍ（東ソー（株）製）カラム（３ｃｍＸ
　３０　ｃｍ）に吸着させ、１０００滅の同緩衝液で洗
浄後、さらに、１ｍＭ塩化コバルトを含む２０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＩ−ｒ　７　、５　）１０００滅で
洗浄した。このカラム中には、アシルアミノ酸ラセマー
ゼ４３ユニツト、Ｌ−アミノアシラーゼ８００ユニツト
が吸着していた。Crushing conditions: Glass beads diameter 0.1-0.2 mm, flow rate 60 td), 7 minute rotation speed 3,000 rpm.The resulting crushed solution was centrifuged at I 0.00 (lrl) m for 20 minutes, and the cell-free extract 1280 I got a company. The total activity of acylamino acid racemase in this extract was 75 units, and that of L-aminoanolase was 1500 units. 500 g of ammonium sulfate was slowly added to the obtained extract 12807J while cooling and stirring. After the addition, stirring was continued for another 2 hours, and the resulting precipitate was collected by centrifugation M (] 0.000 rpm, 30 minutes). The collected precipitate was added to 50mM phosphate buffer (pH 7) at 4°C.
, 0') dissolved in 600mg and dialyzed with the same buffer for 18 hours.
Desalination was performed. The obtained enzyme solution was adjusted to 50mM in advance.
DEAE Toyopearl 650M (manufactured by Tosoh Corporation) column (3 cmX) equilibrated with phosphate buffer (pH 7,0)
30 cm), washed with 1,000 ml of the same buffer, and further washed with 1,000 ml of 20 mM Tris-HCl buffer (pI-r7,5) containing 1 mM cobalt chloride. In this column, 43 units of acylamino acid racemase and 800 units of L-aminoacylase were adsorbed.

このカラムを２８℃に保ちながら、０，５％　Ｎ−クロ
ロアセデル−Ｄ−バリン、１ｍＭ塩化コバルトおよび１
ｇｇ／ｄ硫酸ジヒドロストレプトマイシンを含む２０ｍ
Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）２０００滅を１時
間当り６０滅の流速で流した。While keeping the column at 28°C, add 0.5% N-chloroacedel-D-valine, 1mM cobalt chloride and 1
20m containing gg/d dihydrostreptomycin sulfate
M) Lis-hydrochloric acid buffer (pH 7.5) 2,000 ml was flowed at a flow rate of 60 ml per hour.

反応液を流し終えた後、さらに２０ｍＭ）リス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７，５）５００＋ｎｌで洗浄した。溶出液を
集め、高速液体クロマトグラフィーに付したところ、Ｎ
−クロロアセチル−Ｄ−バリンは全く検出されなかった
。溶出液を減圧下で濃縮後、エタノールを添加すると沈
澱物が析出した。これをろ取し、エタノールで洗浄後、
少量の水に溶解し、これにエタノールを加え４°Ｃに放
置すると、無色の薄片状結晶が析出した。これをろ取し
乾燥させたところ４．５ｇの結晶が得られた。融点３１
５°Ｃ（分解）。After the reaction solution was drained, the plate was further washed with 500+ nl of 20mM Lis-HCl buffer (pH 7,5). When the eluate was collected and subjected to high performance liquid chromatography, N
-Chloroacetyl-D-valine was not detected at all. After concentrating the eluate under reduced pressure, ethanol was added to form a precipitate. After filtering this and washing with ethanol,
When it was dissolved in a small amount of water, ethanol was added thereto, and the mixture was left to stand at 4°C, colorless flaky crystals were precipitated. When this was collected by filtration and dried, 4.5 g of crystals were obtained. Melting point 31
5°C (decomposition).

また本結晶を高速液体クロマトグラフィーおよび薄層ク
ロマトグラフィーに付したところ、標品の１、−バリン
と全く同じ挙動を示した。When this crystal was subjected to high performance liquid chromatography and thin layer chromatography, it showed exactly the same behavior as the standard 1,-valine.

〔発明の効果〕〔Effect of the invention〕

本発明のアシルアミノ酸ラセマーゼは、常温常圧下、中
性付近のｐＨにおいて、光学活性アミノ酸の共存下に、
光学活性Ｎ“−アシルアミノ酸のみをラセミ化し、Ｄ−
またはＬ−アミノアシラーゼと共に用いることにより、
効率よ＜　Ｄ　Ｌ　−Ｎ“−アシルアミノ酸から光学活
性Ｄ−またはＬ−α＝４７＝ 一アミノ酸を製造することができる。The acylamino acid racemase of the present invention is produced in the presence of an optically active amino acid at room temperature and normal pressure at a pH around neutrality.
Only the optically active N"-acylamino acid is racemized, and D-
or by using with L-aminoacylase,
An optically active D- or L-α=47= monoamino acid can be produced from an acylamino acid with high efficiency.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

図１はアシルアミノ酸ラセマーゼのＩ）Ｈ依存性を示す
。 図２は各種１）Ｉ−（におけるアシルアミノ酸ラセマー
ゼによるメチオニンの生成量を、２時間反応の生成量（
二二二）を１としたときの４時間反応の生成量（［）を
相対値として示子。 図３はアシルアミノ酸ラセマーゼの反応温度と酵素活性
との関係を示す。 図４はアシルアミノ酸ラセマーゼの熱安定性を示す。 代理人　　弁理士　　岩　１）　　弘 −４８＝ ％’／ｈ粕ｆ墨＋％ｍ　（’；　） スＬ＋＋Ｉ昼偏−町■）Figure 1 shows the I)H dependence of acylamino acid racemase. Figure 2 shows the amount of methionine produced by acylamino acid racemase in each species 1) I-(
The amount produced in a 4-hour reaction ([) is shown as a relative value when 222) is 1. FIG. 3 shows the relationship between reaction temperature and enzyme activity of acylamino acid racemase. Figure 4 shows the thermostability of acylamino acid racemase. Agent Patent Attorney Iwa 1) Hiro - 48 = %'/h kasu f sumi + %m ('; ) SL++I daytime - town■)

Claims (3)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）下記性状を有する酵素、アシルアミノ酸ラセマー
ゼ： ｉ）Ｄ−Ｎアシル−α−アミノカルボン酸を、対応する
Ｌ−Ｎ−アシル−α−アミノカルボン酸に変換する。 ｉｉ）Ｌ−Ｎ−アシル−α−アミノカルボン酸を、対応
するＤ−Ｎ−アシル−α−アミノカルボン酸に変換する
。 ｉｉｉ）Ｄ−α−アミノ酸を、対応するＬ−α−アミノ
酸に変換しない。 ｉｖ）Ｌ−α−アミノ酸を、対応するＤ−α−アミノ酸
に変換しない。(1) Acyl amino acid racemase, an enzyme having the following properties: i) Converts D-N acyl-α-aminocarboxylic acid to the corresponding L-N-acyl-α-aminocarboxylic acid. ii) Converting the L-N-acyl-α-aminocarboxylic acid to the corresponding D-N-acyl-α-aminocarboxylic acid. iii) Do not convert D-α-amino acids to the corresponding L-α-amino acids. iv) Do not convert L-α-amino acids to the corresponding D-α-amino acids. （２）アシルアミノ酸ラセマーゼ生産能を有する微生物
を培地に培養し、該酵素を培養物中に生成、蓄積せしめ
、これを採取することを特徴とする請求項（１）記載の
アシルアミノ酸ラセマーゼの製造法。(2) The production of acylamino acid racemase according to claim (1), which comprises culturing a microorganism capable of producing acylamino acid racemase in a medium, producing and accumulating the enzyme in the culture, and collecting the enzyme. Law. （３）ＤＬ−Ｎ−アシル−α−アシルアミノ酸に、Ｄ−
またはＬ−アミノアシラーゼの共存下請求項（１）記載
のアシルアミノ酸ラセマーゼを作用させることを特徴と
する光学活性のＤ−またはＬ−α−アミノ酸の製造法。(3) DL-N-acyl-α-acylamino acid, D-
Alternatively, a method for producing optically active D- or L-α-amino acids, which comprises allowing the acylamino acid racemase according to claim 1 to act in the presence of L-aminoacylase.