JPH01131460A - 免疫測定用ビーズおよびこれを用いる免疫測定法 - Google Patents
免疫測定用ビーズおよびこれを用いる免疫測定法Info
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- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
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Landscapes
- Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、特に大きな比重を有するために免疫測定など
に好適に用いられる免疫測定用ビーズに関し、更にはこ
れを用いて抗原又は抗体を測定する免疫測定法に関する
。更に詳細にはビーズによる固相法を用いて抗原又は抗
体を免疫測定法により測定する方法に関する。
に好適に用いられる免疫測定用ビーズに関し、更にはこ
れを用いて抗原又は抗体を測定する免疫測定法に関する
。更に詳細にはビーズによる固相法を用いて抗原又は抗
体を免疫測定法により測定する方法に関する。
本発明のビーズを用いれば安定し、精度よく免疫測定が
できるようになるので1本発明はすぐれた免疫測定法の
確立に大きく貢献するものである。
できるようになるので1本発明はすぐれた免疫測定法の
確立に大きく貢献するものである。
一般に免疫測定法は測定感度および特異性において優れ
ており特に血液、尿、脳を髄液および組織抽出液等の生
体体液中の微量物質の定量に広く用いられる方法であっ
て、この方法は標識物質の種類により放射免疫測定法(
以下、RIAと呼ぶ)、蛍光免疫測定法(以下、 FI
Aと呼ぶ)、酵素免疫測定法(以下、EIAと呼ぶ)等
に分類される。このうち、 RIAは自動分析装置が
開発され広く普及しているが、特殊な施設と技術者ある
いは管理者を必要とし、また標識物質として放射性同位
元素を用いるため測定後の廃棄物の処理に厳重な注意を
要する。また放射性同位元素は比較的不安定であるため
標識抗原又は標識抗体を長時間保存するととが難しい、
これらの問題を解決する目的で、標識物質として蛍光物
質や酵素を用いる免疫測定法、即ちFIAやEIAが研
究、開発されてきた。この2つの免疫測定法において、
FIAは標識に使用する蛍光物質を直接定量するの
に対して、EIAは標識酵素をその酵素の基質に作用さ
せ、酵素反応によって生成した生成物を定量することに
より間接的に標識酵素の量を求める。EIAにおいては
酵素反応を適切な条件の下で行うことによって測定感度
を高くすることができる。例えば、石川、加藤らは標識
酵素としては β−ガラクトシダーゼ、酵素基質として
は4−メチルウンベリフェニルーβ−D−ガラクトシド
を用いてlXl0−”モル以下のオルニチンδ−アミノ
トランスフェラーゼを測定している〔スカンジナビアン
・ジャーナル・オブ・イムノロ ジー(Scand、
J、 Immunol、 8巻、43ページ、1′97
8年〕。標識酵素としてはβ−ガラクトシダーゼの他に
、パーオキシダーゼやアルカリフォスファターゼも汎用
されている。
ており特に血液、尿、脳を髄液および組織抽出液等の生
体体液中の微量物質の定量に広く用いられる方法であっ
て、この方法は標識物質の種類により放射免疫測定法(
以下、RIAと呼ぶ)、蛍光免疫測定法(以下、 FI
Aと呼ぶ)、酵素免疫測定法(以下、EIAと呼ぶ)等
に分類される。このうち、 RIAは自動分析装置が
開発され広く普及しているが、特殊な施設と技術者ある
いは管理者を必要とし、また標識物質として放射性同位
元素を用いるため測定後の廃棄物の処理に厳重な注意を
要する。また放射性同位元素は比較的不安定であるため
標識抗原又は標識抗体を長時間保存するととが難しい、
これらの問題を解決する目的で、標識物質として蛍光物
質や酵素を用いる免疫測定法、即ちFIAやEIAが研
究、開発されてきた。この2つの免疫測定法において、
FIAは標識に使用する蛍光物質を直接定量するの
に対して、EIAは標識酵素をその酵素の基質に作用さ
せ、酵素反応によって生成した生成物を定量することに
より間接的に標識酵素の量を求める。EIAにおいては
酵素反応を適切な条件の下で行うことによって測定感度
を高くすることができる。例えば、石川、加藤らは標識
酵素としては β−ガラクトシダーゼ、酵素基質として
は4−メチルウンベリフェニルーβ−D−ガラクトシド
を用いてlXl0−”モル以下のオルニチンδ−アミノ
トランスフェラーゼを測定している〔スカンジナビアン
・ジャーナル・オブ・イムノロ ジー(Scand、
J、 Immunol、 8巻、43ページ、1′97
8年〕。標識酵素としてはβ−ガラクトシダーゼの他に
、パーオキシダーゼやアルカリフォスファターゼも汎用
されている。
これらの免疫測定法では抗原抗体反応後に抗体又は抗原
と結合した標識物と結合しなかった標識物を分離(以下
、B/F分離と呼ぶ)しなければならない。このB/F
分離に用いられる方法として通常は抗原又は抗体を不溶
性の支持体(以下、担体と呼ぶ)に固定化したもの(以
下、固相と呼ぶ)を用いる同相法が採用されている。特
に酵素免疫測定法では、担体に抗体、第二抗体、プロテ
ィンA等を結合させたものを用いる固相法が一般的であ
る。担体としてはポリスチレン試験管〔バイオチミカ・
バイオフィジカ・アクタ(Biochim。
と結合した標識物と結合しなかった標識物を分離(以下
、B/F分離と呼ぶ)しなければならない。このB/F
分離に用いられる方法として通常は抗原又は抗体を不溶
性の支持体(以下、担体と呼ぶ)に固定化したもの(以
下、固相と呼ぶ)を用いる同相法が採用されている。特
に酵素免疫測定法では、担体に抗体、第二抗体、プロテ
ィンA等を結合させたものを用いる固相法が一般的であ
る。担体としてはポリスチレン試験管〔バイオチミカ・
バイオフィジカ・アクタ(Biochim。
Biophys、 Acta)251巻、427ページ
、1971年〕、ポリスチレン球〔ジャーナル・オブ・
ヒストケミストリイ・アンド・シトケミストリイ(J、
histchem。
、1971年〕、ポリスチレン球〔ジャーナル・オブ・
ヒストケミストリイ・アンド・シトケミストリイ(J、
histchem。
cytochem、L22巻、1084ページ、197
4年〕、シリコン樹脂片〔スカンジナビアン・ジャーナ
ル・オブ・イムノロジー(Scand、 J、 Imm
unol、)、8巻、43ページ、1978年〕等が用
いられている。そのほかに固相法でB/F分離を行う担
体としては、マイクロタイタープレート、プラスチック
ビーズ、ガラスピーズ、チューブ(試験管)の管壁等が
用いられる。
4年〕、シリコン樹脂片〔スカンジナビアン・ジャーナ
ル・オブ・イムノロジー(Scand、 J、 Imm
unol、)、8巻、43ページ、1978年〕等が用
いられている。そのほかに固相法でB/F分離を行う担
体としては、マイクロタイタープレート、プラスチック
ビーズ、ガラスピーズ、チューブ(試験管)の管壁等が
用いられる。
固相法を用いて目的物質(以下、インスリンを例に挙げ
て説明する)を測定する場合には、まずこの上記ビーズ
、プレートなどの担体に抗インスリン抗体を物理吸着、
化学結合などにより担持させて同相を調製する。この固
相にインスリンを含む試料を加えると、固相上の抗体に
インスリンが結合して第1固相系が調製される。別に酵
素標識抗インスリン抗体(例えばβ−ガラクトシダーゼ
標識抗インスリン抗体)を調製し、これを上記第1同相
系に作用させると固相上のインスリンに上記酵素標識抗
インスリン抗体が結合する(第2同相系)。次に、上記
酵素が作用しうる基質を反応させ、該酵素反応の度合を
なんらかの手段によって測定する。例えば、0−ニトロ
フェニル−β−D−ガラクトピラノシドを基質として上
記第2同相系に加えて反応させると、酵素反応により0
−ニトロフェノールが遊離して反応液が着色する。この
反応液の吸光度を測定することにより、酵素反応の度合
、つまり、インシュリンの量が測定される。
て説明する)を測定する場合には、まずこの上記ビーズ
、プレートなどの担体に抗インスリン抗体を物理吸着、
化学結合などにより担持させて同相を調製する。この固
相にインスリンを含む試料を加えると、固相上の抗体に
インスリンが結合して第1固相系が調製される。別に酵
素標識抗インスリン抗体(例えばβ−ガラクトシダーゼ
標識抗インスリン抗体)を調製し、これを上記第1同相
系に作用させると固相上のインスリンに上記酵素標識抗
インスリン抗体が結合する(第2同相系)。次に、上記
酵素が作用しうる基質を反応させ、該酵素反応の度合を
なんらかの手段によって測定する。例えば、0−ニトロ
フェニル−β−D−ガラクトピラノシドを基質として上
記第2同相系に加えて反応させると、酵素反応により0
−ニトロフェノールが遊離して反応液が着色する。この
反応液の吸光度を測定することにより、酵素反応の度合
、つまり、インシュリンの量が測定される。
最近では、上記固相法を利用した免疫測定法、特にEI
A法を自動化した自動免疫測定装置(以下、自動測定装
置とする)が開発され、使用されている。(例えば、オ
リンパス工業(株)製自動酵素免疫分析装[PK−30
0)。このような自動測定装置においては、B/F分離
分離面相としてビーズを用いたものが好適に利用されて
いる。例えば、ガラスピーズ表面に目的とする被測定物
質に対応する抗体もしくは抗原を担持させた抗体(原)
担持ビーズ(上記固相化担体に相当)があらかじめ調製
され、このビーズが装置内にセットされている。このビ
ーズは試験管などの反応容器に所定の個数(通常1個)
ずつ自動供給される。更に、反応容器内への試料溶液の
添加、反応液の除去、洗浄、基質溶液の添加などが上記
用手法と同様の原理で自動的に行われ、最終的に反応液
の吸光度の測定などにより、試料中の被測定物質が測定
される。このような自動測定装置においては1通常、担
体として数nus〜1cm前後のビーズが用いられ、複
数個のビーズがストックされたビーズ供給容器からビー
ズ自身の重さにより、順次反応容器へ供給される。
A法を自動化した自動免疫測定装置(以下、自動測定装
置とする)が開発され、使用されている。(例えば、オ
リンパス工業(株)製自動酵素免疫分析装[PK−30
0)。このような自動測定装置においては、B/F分離
分離面相としてビーズを用いたものが好適に利用されて
いる。例えば、ガラスピーズ表面に目的とする被測定物
質に対応する抗体もしくは抗原を担持させた抗体(原)
担持ビーズ(上記固相化担体に相当)があらかじめ調製
され、このビーズが装置内にセットされている。このビ
ーズは試験管などの反応容器に所定の個数(通常1個)
ずつ自動供給される。更に、反応容器内への試料溶液の
添加、反応液の除去、洗浄、基質溶液の添加などが上記
用手法と同様の原理で自動的に行われ、最終的に反応液
の吸光度の測定などにより、試料中の被測定物質が測定
される。このような自動測定装置においては1通常、担
体として数nus〜1cm前後のビーズが用いられ、複
数個のビーズがストックされたビーズ供給容器からビー
ズ自身の重さにより、順次反応容器へ供給される。
例えば、第1図に示すビーズ供給容器1は、軸心が略鉛
直となった円筒状容器11を有し、その内部にらせん状
スロープ12が軸長方向の略全域に設けられている1円
筒状容器11の下部側面には、該円筒状容器11の内部
と連動し、上方に向って開口するビーズ排出口14が設
けられている。このスロープ12上に複数個のビーズ1
3が配置され、容器11内には、緩衝液が充填されてい
る。ビーズ13はその重みによりらせん状のスロープを
下降し、ビーズ排出ClI4に達する。該ビーズ排出口
14がらビーズ13は1図外のビーズ移送機構により1
個ずつ取り出され、図外の反応容器に導かれる。
直となった円筒状容器11を有し、その内部にらせん状
スロープ12が軸長方向の略全域に設けられている1円
筒状容器11の下部側面には、該円筒状容器11の内部
と連動し、上方に向って開口するビーズ排出口14が設
けられている。このスロープ12上に複数個のビーズ1
3が配置され、容器11内には、緩衝液が充填されてい
る。ビーズ13はその重みによりらせん状のスロープを
下降し、ビーズ排出ClI4に達する。該ビーズ排出口
14がらビーズ13は1図外のビーズ移送機構により1
個ずつ取り出され、図外の反応容器に導かれる。
上記のようにビーズ自身の重みによりビーズが反応容器
に供給されるような自動測定装置においては、ビーズが
正確に1個ずつ供給されることが必要であるため、通常
、比重の大きいガラスピーズを利用している。
に供給されるような自動測定装置においては、ビーズが
正確に1個ずつ供給されることが必要であるため、通常
、比重の大きいガラスピーズを利用している。
ところで、ガラス素材のビーズはいくつかの理由からあ
まり好ましいとは言えない。例えば、所定の大きさのビ
ーズをガラスを用いて調製するのは難しい。ガラスピー
ズは割れやすいという欠点もある。更に、抗体や抗原を
ビーズに担持させる場合、抗原又は抗体の固定化に複雑
な操作を必要とし、つまり物理吸着ではなく化学結合に
よることが必要であるため手間がかがるといった問題点
がある。しかも一定量質の固相化抗体や同相化抗原を再
現性良く調製することが難しい。
まり好ましいとは言えない。例えば、所定の大きさのビ
ーズをガラスを用いて調製するのは難しい。ガラスピー
ズは割れやすいという欠点もある。更に、抗体や抗原を
ビーズに担持させる場合、抗原又は抗体の固定化に複雑
な操作を必要とし、つまり物理吸着ではなく化学結合に
よることが必要であるため手間がかがるといった問題点
がある。しかも一定量質の固相化抗体や同相化抗原を再
現性良く調製することが難しい。
これに対して、ポリスチレンや、アクリルニトリル−ブ
タジェン−スチレン共重合体(ABS)などの樹脂を用
いると射出成形により所定の大きさのビーズを精度良く
調製することが可能であり、かつ成形品は割れにくい。
タジェン−スチレン共重合体(ABS)などの樹脂を用
いると射出成形により所定の大きさのビーズを精度良く
調製することが可能であり、かつ成形品は割れにくい。
さらに抗体や抗原を物理的吸着により比較的簡単にその
表面に固定化する性質を有しており、かつ衝撃に対して
強いといった特徴を有している。物理的吸着とは疎水結
合、水素結合、イオン結合といったものであり、抗原又
は抗体の溶解液に上記のような担体を浸漬する事により
、その表面に抗原又は抗体を結合させることができる。
表面に固定化する性質を有しており、かつ衝撃に対して
強いといった特徴を有している。物理的吸着とは疎水結
合、水素結合、イオン結合といったものであり、抗原又
は抗体の溶解液に上記のような担体を浸漬する事により
、その表面に抗原又は抗体を結合させることができる。
このようにポリスチレンなどの樹脂製ビーズはアッセイ
系に用いられる担体としてはガラスピーズに比べて優れ
た点を有する。そのため、これらを用いたRIAやEI
Aのキットが発売されている。しかし、これらの樹脂製
のビーズはいずれもその比重が小さい(例えばポリス2
チレンの比重は約1.05である)ため、これを上記自
動測定装置に用いると正常に動作しない場合が多い。な
ぜなら、ビーズは通常、緩衝液中に保存されており、ビ
ーズの比重がこの緩衝液の比重と非常に近いため、例え
ば第1図のビーズ供給容器1のスロープ上をビーズ自身
の重さにより下降しない場合があり、その結果、ビーズ
排出口14へビーズ13が正常に排出されないことがあ
るためである。
系に用いられる担体としてはガラスピーズに比べて優れ
た点を有する。そのため、これらを用いたRIAやEI
Aのキットが発売されている。しかし、これらの樹脂製
のビーズはいずれもその比重が小さい(例えばポリス2
チレンの比重は約1.05である)ため、これを上記自
動測定装置に用いると正常に動作しない場合が多い。な
ぜなら、ビーズは通常、緩衝液中に保存されており、ビ
ーズの比重がこの緩衝液の比重と非常に近いため、例え
ば第1図のビーズ供給容器1のスロープ上をビーズ自身
の重さにより下降しない場合があり、その結果、ビーズ
排出口14へビーズ13が正常に排出されないことがあ
るためである。
これに対して、上記欠点を解決するため、発明者らは比
重が大きくかつ高精度で取扱いの容易な免疫測定用ビー
ズを調製すべく、金属球表面をポリカーボネートなどの
樹脂で被覆したビーズの調製を試みた。しかし、金属球
が中心に位置するようなビーズを既存の成形装置を用い
て容易に調製することは困難であった。さらに得られる
ビーズの価格が高価になるという欠点もある。
重が大きくかつ高精度で取扱いの容易な免疫測定用ビー
ズを調製すべく、金属球表面をポリカーボネートなどの
樹脂で被覆したビーズの調製を試みた。しかし、金属球
が中心に位置するようなビーズを既存の成形装置を用い
て容易に調製することは困難であった。さらに得られる
ビーズの価格が高価になるという欠点もある。
更に、血液成分の測定を目的とした免疫測定法では血清
干渉による測定値への影響を防止するために、高濃度の
塩や蛋白質を含んだ免疫反応用試薬が使用されることが
多く、又酵素反応停止液にも硫酸、ラウリル硫酸ナトリ
ウムあるいは尿素等を含んだ高比重の溶液が使用される
ことがある為、比重の比較的小さい樹脂を用いると担体
は完全に浮遊したり、又浮き沈みを行ったりするために
均一な反応が行われず、測定操作に支障を来し、測定値
の誤差や変動が大きくなったりする等の問題点もあった
。
干渉による測定値への影響を防止するために、高濃度の
塩や蛋白質を含んだ免疫反応用試薬が使用されることが
多く、又酵素反応停止液にも硫酸、ラウリル硫酸ナトリ
ウムあるいは尿素等を含んだ高比重の溶液が使用される
ことがある為、比重の比較的小さい樹脂を用いると担体
は完全に浮遊したり、又浮き沈みを行ったりするために
均一な反応が行われず、測定操作に支障を来し、測定値
の誤差や変動が大きくなったりする等の問題点もあった
。
本発明は従来の問題点を解決するものである。
つまり前記で述べたように自動免疫測定装置に適した割
れにくく、かつ高比重のビーズを提供し、さらには高比
重であるが為に自動測定に限らず、測定値の安定化をも
図れるビーズ及びそれを用いた免疫測定法を供給するも
のである。さらに別の観点から見ると、従来より多用さ
れていたスチレン樹脂製の担体はその表面への抗原又は
抗体の吸着は簡単な操作で行うことが可能ではあるが、
吸着を行う場合の抗原又は抗体の溶解液に担体を浸漬す
る条件、すなわち温度や時間の変化により、吸着する抗
原又は抗体量が変動しやすく、このように不均一な固相
を使用した場合、免疫測定法による検体の測定値に大き
な差が生じる等の問題点があった。つまりRIA、 F
IAあるいはEIAによる抗原又は抗体の測定法におい
ては、担体に吸着した抗原または抗体の量が測定精度に
大きく影響する。
れにくく、かつ高比重のビーズを提供し、さらには高比
重であるが為に自動測定に限らず、測定値の安定化をも
図れるビーズ及びそれを用いた免疫測定法を供給するも
のである。さらに別の観点から見ると、従来より多用さ
れていたスチレン樹脂製の担体はその表面への抗原又は
抗体の吸着は簡単な操作で行うことが可能ではあるが、
吸着を行う場合の抗原又は抗体の溶解液に担体を浸漬す
る条件、すなわち温度や時間の変化により、吸着する抗
原又は抗体量が変動しやすく、このように不均一な固相
を使用した場合、免疫測定法による検体の測定値に大き
な差が生じる等の問題点があった。つまりRIA、 F
IAあるいはEIAによる抗原又は抗体の測定法におい
ては、担体に吸着した抗原または抗体の量が測定精度に
大きく影響する。
従ってより安定した抗原又は抗体の不溶化担体を調製す
る為に、厳密な温度や時間の管理下で浸漬して抗原又は
抗体を均一に且つ再現性良く担体に吸着させる必要があ
った。
る為に、厳密な温度や時間の管理下で浸漬して抗原又は
抗体を均一に且つ再現性良く担体に吸着させる必要があ
った。
以上のように近年、普及が著しい免疫自動測定装置への
応用に当たっては割れにくく、かつ高比重を有する免疫
測定用ビーズを提供するとともに、これを用いることに
よってビーズ自身の重量を駆動力の一部とする免疫自動
測定装置に好適に適用される高比重のビーズの開発が望
まれ、更に自動測定に限らず測定値を安定させるために
、高比重の樹脂などを材質としたビーズの開発が望まれ
。
応用に当たっては割れにくく、かつ高比重を有する免疫
測定用ビーズを提供するとともに、これを用いることに
よってビーズ自身の重量を駆動力の一部とする免疫自動
測定装置に好適に適用される高比重のビーズの開発が望
まれ、更に自動測定に限らず測定値を安定させるために
、高比重の樹脂などを材質としたビーズの開発が望まれ
。
さらには、抗原又は抗体の担体への吸着操作をその吸着
条件に厳密な規定を要しない担体の開発が切望されてい
た。本発明はこれらの課題を解決するものである。
条件に厳密な規定を要しない担体の開発が切望されてい
た。本発明はこれらの課題を解決するものである。
本発明の免疫測定用ビーズは、樹脂を主成分とする組成
物でなり、比重が1.4〜2.5の範囲であり、そのこ
とにより上記目的が達成される。本発明のビーズに用い
られる樹脂を主成分とする組成物は、その全体としての
比重が上記範囲であればよく、例えば比重1.4〜2.
5の樹脂のみで構成されていてもよく、比較的高比重の
樹脂と低比重の樹脂との混合物であってもよい。さらに
樹脂と無機物などの充填剤との混合物であってもよい。
物でなり、比重が1.4〜2.5の範囲であり、そのこ
とにより上記目的が達成される。本発明のビーズに用い
られる樹脂を主成分とする組成物は、その全体としての
比重が上記範囲であればよく、例えば比重1.4〜2.
5の樹脂のみで構成されていてもよく、比較的高比重の
樹脂と低比重の樹脂との混合物であってもよい。さらに
樹脂と無機物などの充填剤との混合物であってもよい。
用いられる樹脂は、抗体や抗原の固定化能力が汎用され
ているポリスチレンと同等もしくはそれ以上であるもの
が選択される。さらにビーズの成形性を考慮すると、熱
可塑性樹脂であることが好ましい。
ているポリスチレンと同等もしくはそれ以上であるもの
が選択される。さらにビーズの成形性を考慮すると、熱
可塑性樹脂であることが好ましい。
本発明のビーズに用いられる樹脂組成物に含有される比
較的高比重の樹脂としては、ハロゲンを含有する樹脂が
挙げられる。それには例えば、−フッ化エチレン、ニフ
ッ化エチレン、三フッ化エチレン、四フッ化エチレン、
−フッ化ビニリデン。
較的高比重の樹脂としては、ハロゲンを含有する樹脂が
挙げられる。それには例えば、−フッ化エチレン、ニフ
ッ化エチレン、三フッ化エチレン、四フッ化エチレン、
−フッ化ビニリデン。
ニフッ化ビニリデン、三フッ化ビニリデン、四フッ化ビ
ニリデン、−フッ化プロピレン、ニフッ化プロピレン、
三フフ化プロピレン、四フッ化プロピレンなどの単量体
を(共)重合成分とするフッ素系樹脂が挙げられる。上
記単量体の単独重合体は成形性にやや乏しいものもある
が、これら単量体と、他の重合性単量体(例えばエチレ
ン、プロピレンやビニリデン基を有する単量体)との共
重合体は熱可塑性の性質を有する。そのため射出成形。
ニリデン、−フッ化プロピレン、ニフッ化プロピレン、
三フフ化プロピレン、四フッ化プロピレンなどの単量体
を(共)重合成分とするフッ素系樹脂が挙げられる。上
記単量体の単独重合体は成形性にやや乏しいものもある
が、これら単量体と、他の重合性単量体(例えばエチレ
ン、プロピレンやビニリデン基を有する単量体)との共
重合体は熱可塑性の性質を有する。そのため射出成形。
押出成形など既知の成形方法を利用して高精度に成形す
ることが容易である。
ることが容易である。
比較的低比重の樹脂としては、免疫測定に使用されてい
る汎用の樹脂が、いずれも使用され得る。
る汎用の樹脂が、いずれも使用され得る。
これらは後述の充填剤と組み合わせて用いられるため、
その抗体もしくはその抗原吸着性が例えば汎用のポリス
チレンよりも高いものが好ましい。
その抗体もしくはその抗原吸着性が例えば汎用のポリス
チレンよりも高いものが好ましい。
使用される樹脂としては、ポリスチレン、ABS。
ポリプロピレンなどが挙げられる。
充填剤としては、比較的比重が大きく (約2〜5)、
少量でビーズ自体の見かけの比重を大きくすることがで
き、かつ抗原抗体反応に影響を与えないような材料が用
いられる。それには例えば。
少量でビーズ自体の見かけの比重を大きくすることがで
き、かつ抗原抗体反応に影響を与えないような材料が用
いられる。それには例えば。
硫酸バリウム粉末、炭酸カルシウム粉末、ガラス粉末、
ガラス繊維があり、特に硫酸バリウム粉末が好適である
。これらは必要に応じて2種以上が混合して用いられる
。充填剤は樹脂100重量部に対して20重量部以下、
好ましくは5〜15重量部で組成物に含有され1組成物
全体としての比重が1.4〜2.5の範囲に調製される
。
ガラス繊維があり、特に硫酸バリウム粉末が好適である
。これらは必要に応じて2種以上が混合して用いられる
。充填剤は樹脂100重量部に対して20重量部以下、
好ましくは5〜15重量部で組成物に含有され1組成物
全体としての比重が1.4〜2.5の範囲に調製される
。
上記樹脂及び必要に応じて充填剤を含有する組成物は、
射出成形、押出成形などの通常の方法により球形に成型
される。ビーズの直径は1〜10mm、好ましくは3〜
10mmである。
射出成形、押出成形などの通常の方法により球形に成型
される。ビーズの直径は1〜10mm、好ましくは3〜
10mmである。
このようなビーズの免疫測定における同相としての性質
は、従来の樹脂性ビーズ、例えばポリスチレンビーズと
同等もしくはそれ以上である。これを自動測定装置に用
いると、例えば、ビーズ供給容器からのビーズの供給が
ビーズ自身の重量を利用してなされる場合には、ビーズ
が確実に供給され、測定にエラーを生じることがない。
は、従来の樹脂性ビーズ、例えばポリスチレンビーズと
同等もしくはそれ以上である。これを自動測定装置に用
いると、例えば、ビーズ供給容器からのビーズの供給が
ビーズ自身の重量を利用してなされる場合には、ビーズ
が確実に供給され、測定にエラーを生じることがない。
このように本発明のビーズを用いると自動測定装置を円
滑に稼働させて精度の高い免疫測定を行うことが可能と
なる。さらに、このビーズは高比重を有するため免疫試
験を行う際に反応溶液中に浮遊することがなく、その結
果反応が安定する利点や更に。
滑に稼働させて精度の高い免疫測定を行うことが可能と
なる。さらに、このビーズは高比重を有するため免疫試
験を行う際に反応溶液中に浮遊することがなく、その結
果反応が安定する利点や更に。
例えば吸光度を測定する場合に光路を遮断されて誤差を
生じるおそれがないという利点もある。
生じるおそれがないという利点もある。
また、本発明のビーズを用いた免疫測定法に関して述べ
ると、測定される抗原としては数々の生体成分あるいは
薬剤があるが、特に臨床的には生体体液中に含まれる数
々のホルモン類、蛋白質が重要である。具体的にはペプ
チドホルモン類、サイロキシン等の甲状腺ホルモン、イ
ムノグロブリンあるいはα−フェトプロティン(AFP
) 、癌胎児性抗原(CEA)および神経特異エノラー
ゼ(NSE)等の腫瘍マーカーが含まれる。また測定さ
れる抗体としては数々の感染症によって生体内に生成さ
れる抗体、自己免疫疾患によって生成される抗体あるい
は数々の薬物に対して生成される抗体等が含まれる。
ると、測定される抗原としては数々の生体成分あるいは
薬剤があるが、特に臨床的には生体体液中に含まれる数
々のホルモン類、蛋白質が重要である。具体的にはペプ
チドホルモン類、サイロキシン等の甲状腺ホルモン、イ
ムノグロブリンあるいはα−フェトプロティン(AFP
) 、癌胎児性抗原(CEA)および神経特異エノラー
ゼ(NSE)等の腫瘍マーカーが含まれる。また測定さ
れる抗体としては数々の感染症によって生体内に生成さ
れる抗体、自己免疫疾患によって生成される抗体あるい
は数々の薬物に対して生成される抗体等が含まれる。
別の観点から従来のスチレン製のビーズの問題点を指摘
すると、抗原又は抗体の吸着操作には熟練した技術つま
り厳密に限定した温度や時間の管理下で操作をする必要
がある。本発明者らはこのような免疫測定法における欠
点を改良すべく鋭意検討した結果、担体への吸着操作が
簡単であり、厳密な条件での操作を必要としない担体と
してフッ素系樹脂を見出した。担体表面への抗原又は抗
体の吸着操作はスチレン樹脂と同様に疎水結合、水素結
合、イオン結合といった物理的方法で吸着させることが
できる。つまり、抗原又は抗体を含有した緩衝液に担体
として使用するフッ素含有樹脂製の球形ビーズを浸漬さ
せて吸着操作を行う。
すると、抗原又は抗体の吸着操作には熟練した技術つま
り厳密に限定した温度や時間の管理下で操作をする必要
がある。本発明者らはこのような免疫測定法における欠
点を改良すべく鋭意検討した結果、担体への吸着操作が
簡単であり、厳密な条件での操作を必要としない担体と
してフッ素系樹脂を見出した。担体表面への抗原又は抗
体の吸着操作はスチレン樹脂と同様に疎水結合、水素結
合、イオン結合といった物理的方法で吸着させることが
できる。つまり、抗原又は抗体を含有した緩衝液に担体
として使用するフッ素含有樹脂製の球形ビーズを浸漬さ
せて吸着操作を行う。
吸着条件はo℃〜50℃、1時間〜48時間でより好ま
しくは4℃〜40℃、2時間〜6時間である。但し、厳
密な温度1時間の管理は必要としない。緩衝液としては
抗原又は抗体の吸着に使用できるものであればいずれで
もよいが、好ましくはリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液が使
用される。つまり担体としてフッ素系樹脂を使用するこ
とにより、従来のような厳密な管理の基での固相の製造
を行う必要があるというような問題点を解決することが
できた。同時に従来の材質と比較して比重が大きいこと
によって自動分析機への応用も可能となる。
しくは4℃〜40℃、2時間〜6時間である。但し、厳
密な温度1時間の管理は必要としない。緩衝液としては
抗原又は抗体の吸着に使用できるものであればいずれで
もよいが、好ましくはリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液が使
用される。つまり担体としてフッ素系樹脂を使用するこ
とにより、従来のような厳密な管理の基での固相の製造
を行う必要があるというような問題点を解決することが
できた。同時に従来の材質と比較して比重が大きいこと
によって自動分析機への応用も可能となる。
比重が大きいことに依って自動分析装置での利用ばかり
でなく、用手法分析においても固相が完全に沈んだ状態
で反応が進行するため、反応が安定する利点も備えてい
る。この担体はEIA以外のRIA及びFIAにも応用
が可能であることは言うまでもない。
でなく、用手法分析においても固相が完全に沈んだ状態
で反応が進行するため、反応が安定する利点も備えてい
る。この担体はEIA以外のRIA及びFIAにも応用
が可能であることは言うまでもない。
以下に実施例で具体的に説明するが、本発明はこれらに
限定されるものではない。
限定されるものではない。
大嵐斑上
(A)ビーズの調製二表1に示す組成物を用い、直径6
.70ffi鳳の球形のビーズを得た。但し、ビーズ2
には硫酸バリウム粉末がポリスチレン100重量部に対
して10重量部の割合で含有される。1.2.3および
5のビーズは射出成形により得られ、4のビーズは切削
加工により得られた。それぞれのビーズ100個ずつを
理化学用洗剤5CAT20XN (半井化学薬品(株)
)の5%水溶液に浸漬し、超音波洗浄機を用いて10分
間洗浄を行った。これを精製水により充分洗浄し、風乾
して保存した。
.70ffi鳳の球形のビーズを得た。但し、ビーズ2
には硫酸バリウム粉末がポリスチレン100重量部に対
して10重量部の割合で含有される。1.2.3および
5のビーズは射出成形により得られ、4のビーズは切削
加工により得られた。それぞれのビーズ100個ずつを
理化学用洗剤5CAT20XN (半井化学薬品(株)
)の5%水溶液に浸漬し、超音波洗浄機を用いて10分
間洗浄を行った。これを精製水により充分洗浄し、風乾
して保存した。
(B) IgGに吸着特性のテスト:マウスエgG(M
iles。
iles。
生化学工業)を0.1Mリン酸緩衝液(PH7,0)
(以下0、IM pBとする)に100μg/mQとな
るように溶解させたマウスIgG溶液、およびウシ血清
アルブミンを1%になるように、0.1M PBに溶解
した溶液(以下、1%BSAとする)を準備した。(A
)項で得られたビーズ各20個を試験管に採取し、これ
に上記マウスIgG溶液を20社加え、37℃のインキ
ュベーター中に3時間放置して感作させた。感作後、ア
スピレータ−を用い、0.1M PBによりビーズを吸
着していないIgGを洗浄し、1%BSAを20mfl
加えて。
(以下0、IM pBとする)に100μg/mQとな
るように溶解させたマウスIgG溶液、およびウシ血清
アルブミンを1%になるように、0.1M PBに溶解
した溶液(以下、1%BSAとする)を準備した。(A
)項で得られたビーズ各20個を試験管に採取し、これ
に上記マウスIgG溶液を20社加え、37℃のインキ
ュベーター中に3時間放置して感作させた。感作後、ア
スピレータ−を用い、0.1M PBによりビーズを吸
着していないIgGを洗浄し、1%BSAを20mfl
加えて。
37℃で1時間インキュベートした。インキュベート後
、これを4℃で保存した。別にベルオキシダ−ゼ標識抗
マウスIgG(Milese生化学工業)を1%BSA
で2000倍に希釈したもの(以下、標識抗マウスIg
Gとする)を準備した。次に、上記感作ビーズが浸漬さ
れている1%BSAをアスピレータ−で吸引除去し、上
記標識抗マウスIgGを20mN加え、37℃で1時間
インキュベートした。ビーズを1%B5A20dずつで
10回吸引洗浄し、ピンセットで、外径12mm、長さ
75mmの試験管に1個ずつ移した。
、これを4℃で保存した。別にベルオキシダ−ゼ標識抗
マウスIgG(Milese生化学工業)を1%BSA
で2000倍に希釈したもの(以下、標識抗マウスIg
Gとする)を準備した。次に、上記感作ビーズが浸漬さ
れている1%BSAをアスピレータ−で吸引除去し、上
記標識抗マウスIgGを20mN加え、37℃で1時間
インキュベートした。ビーズを1%B5A20dずつで
10回吸引洗浄し、ピンセットで、外径12mm、長さ
75mmの試験管に1個ずつ移した。
別にオルトフェニレンジアミン・2HC1(基質)が1
mg1社、過酸化水素が0.03%となるようにO,
LMPBに溶解した溶液(以下OPDとする)を調製し
た。
mg1社、過酸化水素が0.03%となるようにO,
LMPBに溶解した溶液(以下OPDとする)を調製し
た。
これを上記ビーズが入れられた試験管に0.5mMずつ
分注し、37℃で正確に15分間インキュベートした。
分注し、37℃で正確に15分間インキュベートした。
別に、ビーズを入れていない試験管を用意し、同様に、
0.5mMのOPDを加えてインキュベーター。
0.5mMのOPDを加えてインキュベーター。
ブランクとした。インキュベート後、IMlfiを2m
M加えて酵素反応を停止させ、基質ブランクを対照とし
て、 492nmの吸光度を測定した。その結果を表
1に示す。
M加えて酵素反応を停止させ、基質ブランクを対照とし
て、 492nmの吸光度を測定した。その結果を表
1に示す。
表1
表1からビーズ2〜4は、いずれもポリスチレンビーズ
とほぼ同様の吸着特性を示すことがわかる。
とほぼ同様の吸着特性を示すことがわかる。
(C) EIA固相としての実用性テスト:(1)モル
モットにブタイスリン(Sigma社)を免疫して得ら
れる抗血清から、硫安画分により抗体を含むIgG画分
(以下、抗インスリン丁gGとする)を精製した。(A
)項で得られたビーズ(ビーズ1〜5の5種)に、この
抗インスリンIgGを(B)項と同様の方法で感作し同
相化抗体を5種類調整した。
モットにブタイスリン(Sigma社)を免疫して得ら
れる抗血清から、硫安画分により抗体を含むIgG画分
(以下、抗インスリン丁gGとする)を精製した。(A
)項で得られたビーズ(ビーズ1〜5の5種)に、この
抗インスリンIgGを(B)項と同様の方法で感作し同
相化抗体を5種類調整した。
(2)上記工程(1)で使用したのと同様の精製抗イン
スリンIgGをβ−ガラクトシダーゼにより標識した。
スリンIgGをβ−ガラクトシダーゼにより標識した。
β−ガラクトシダーゼの標識には。−マレイミド安息香
酸のN−ヒドロキシコハク酸イミドエステルを用い、O
’5ullivan、 M、 J、ら、Anal。
酸のN−ヒドロキシコハク酸イミドエステルを用い、O
’5ullivan、 M、 J、ら、Anal。
Biochem、、100 : 100 (2979)
の方法により行った。
の方法により行った。
これを、1%BSAに1mMの塩化マグネシウムを含む
緩衝液(これを緩衝液Aとする)を用いて100倍に希
釈した(以下、酵素標識抗体と呼ぶ)。
緩衝液(これを緩衝液Aとする)を用いて100倍に希
釈した(以下、酵素標識抗体と呼ぶ)。
(3)酵素基質として、0−ニトロフェニル−β−D−
ガラクトピラノシドを緩衝液Aに0.1%となるように
溶解させた(以下、酵素基質と呼ぶ)。
ガラクトピラノシドを緩衝液Aに0.1%となるように
溶解させた(以下、酵素基質と呼ぶ)。
(4)ブタインスリンを1%BSAにより希釈し。
320μU/mfiの溶液を調製した。1%BSAによ
り倍々希釈を行い、0(1%BSA)、10.20.4
0.80.160.320μU/mQのインスリン希釈
系列を調製した。
り倍々希釈を行い、0(1%BSA)、10.20.4
0.80.160.320μU/mQのインスリン希釈
系列を調製した。
(5)酵素反応の停止液として、0.1M炭酸ナトリウ
ム水溶液(以下、酵素反応停止液とする)を、そして洗
浄液として生理食塩水(0,9%塩化ナトリウム水溶液
)を調製した。
ム水溶液(以下、酵素反応停止液とする)を、そして洗
浄液として生理食塩水(0,9%塩化ナトリウム水溶液
)を調製した。
(6)直径12)、長さ75mmのガラス試験管に、上
記工程(4)で得られたインスリン希釈系列をそれぞれ
100μαずつ分注し、500μQの1%BSAを加え
、よく混合した。これに工8(1)で得られた同相化抗
体5種をそれぞれ1個ずつ加えた。37℃で2時間イン
キュベートした後、アスピレータ−で反応溶液を除去し
、2+nQの生理食塩水により、3回吸引洗浄した。
記工程(4)で得られたインスリン希釈系列をそれぞれ
100μαずつ分注し、500μQの1%BSAを加え
、よく混合した。これに工8(1)で得られた同相化抗
体5種をそれぞれ1個ずつ加えた。37℃で2時間イン
キュベートした後、アスピレータ−で反応溶液を除去し
、2+nQの生理食塩水により、3回吸引洗浄した。
(7)酵素標識抗体を300μQ加え、37℃で2時間
インキュベートした後、アスピレータ−で反応溶液を除
去し、2mMの生理食塩水により、3回吸引洗浄を行っ
た。
インキュベートした後、アスピレータ−で反応溶液を除
去し、2mMの生理食塩水により、3回吸引洗浄を行っ
た。
(8)この試験管を37℃のインキュベーターにセノト
シ、工程(3)で得られた酵素基質を500μQづつ分
注した。別に基質ブランクとして、空の試験管を準備し
、酵素基質を500μα分注した。
シ、工程(3)で得られた酵素基質を500μQづつ分
注した。別に基質ブランクとして、空の試験管を準備し
、酵素基質を500μα分注した。
(9) 37℃でこれを1時間インキュベートした後、
2mΩの酵素反応停止液を加えて、酵素反応を停止させ
た。
2mΩの酵素反応停止液を加えて、酵素反応を停止させ
た。
(10)基質ブランクを対照として、 420nmの
吸光度を測定した。横軸にインスリン濃度を、そして縦
軸に吸光度をプロットしたグラフを第2図に示す。
吸光度を測定した。横軸にインスリン濃度を、そして縦
軸に吸光度をプロットしたグラフを第2図に示す。
第2図から、本発明のビーズ2〜4を用いると従来の樹
脂製ビーズであるポリスチレンビーズ(ビーズ1)の場
合とほぼ同様の検量線が得られることがわかる。このよ
うに、これら本発明のビーズ2〜4は従来の樹脂製ビー
ズと同様に免疫分析の固相として利用できることがわか
る。
脂製ビーズであるポリスチレンビーズ(ビーズ1)の場
合とほぼ同様の検量線が得られることがわかる。このよ
うに、これら本発明のビーズ2〜4は従来の樹脂製ビー
ズと同様に免疫分析の固相として利用できることがわか
る。
(D)自動分析装置への適用テスト:オリンパス工業(
株>gAのEIA用自動分析装置PK−300を用いて
自動分析装置に対する適用性を評価した。PK−300
の取扱い説明書に従って、(A)項に得られた5種のビ
ーズとガラスピーズをそれぞれセットし、ビーズの保存
容器からの送り出し、移送、廃棄までの動作を確認した
。保存容器に入れる緩衝液は1%BSAを用い、それぞ
れ200個のビーズについて、テストを行った。ビーズ
が正常に送り出された個数及び、移送から廃棄まで正常
に行われた個数を表2に示す。
株>gAのEIA用自動分析装置PK−300を用いて
自動分析装置に対する適用性を評価した。PK−300
の取扱い説明書に従って、(A)項に得られた5種のビ
ーズとガラスピーズをそれぞれセットし、ビーズの保存
容器からの送り出し、移送、廃棄までの動作を確認した
。保存容器に入れる緩衝液は1%BSAを用い、それぞ
れ200個のビーズについて、テストを行った。ビーズ
が正常に送り出された個数及び、移送から廃棄まで正常
に行われた個数を表2に示す。
表2から、比重の小さいポリスチレンビーズは、 ;
ビーズ自身の重量により供給容器から送り出され (
てくるタイプの自動分析装置では送り出し操作が −
正常に動作しないことが明らかである。これに対 る
して、本発明のビーズは大きな比重を有するため、
2このような自動分析装置で、これまでのガラスビ
シーズと同等に使用され廃棄操作まで正常に動作し
Fた。
]実施例2 実施例1で使用したビーズの内、表1における 1ビ
ーズ1 (組成がポリスチレン、以下ビーズ1担 −
体と呼ぶ)およびビーズ4(組成がポリ四フッ化工
゛チレン、以下ビーズ4担体と呼ぶ)を使用し、抗
4体を担体表面に結合させるときの抗体溶液中への
・担体の浸漬条件として温度と時間を変えて行った
ノ場合の固相表面に結合する抗体量の変化について
?検討した。実施例1では抗体としてマウスIgGを
4使用した場合、幾分ビーズ1やビーズ2(即ちボ
ポリスチレンを主原料とする担体)の方が吸着され
3る抗体量が多くなる傾向は認められるが、はとんビ
差がないという結果であった。しかし抗体にウナギ抗体
F(ab’)2画分を使用し、抗体溶液へのビーズ浸漬
条件を変化させた場合、以下に示すよう、こ1両ビーズ
における抗体吸着量に大きな差が認められた。抗体溶液
としてはウサギ(抗つシγγリエノラーゼ)抗体を20
0μg/mΩの濃度で溶解した+I+7.0.0.1M
リン酸ナトリウム緩衝液を使用した。
ビーズ自身の重量により供給容器から送り出され (
てくるタイプの自動分析装置では送り出し操作が −
正常に動作しないことが明らかである。これに対 る
して、本発明のビーズは大きな比重を有するため、
2このような自動分析装置で、これまでのガラスビ
シーズと同等に使用され廃棄操作まで正常に動作し
Fた。
]実施例2 実施例1で使用したビーズの内、表1における 1ビ
ーズ1 (組成がポリスチレン、以下ビーズ1担 −
体と呼ぶ)およびビーズ4(組成がポリ四フッ化工
゛チレン、以下ビーズ4担体と呼ぶ)を使用し、抗
4体を担体表面に結合させるときの抗体溶液中への
・担体の浸漬条件として温度と時間を変えて行った
ノ場合の固相表面に結合する抗体量の変化について
?検討した。実施例1では抗体としてマウスIgGを
4使用した場合、幾分ビーズ1やビーズ2(即ちボ
ポリスチレンを主原料とする担体)の方が吸着され
3る抗体量が多くなる傾向は認められるが、はとんビ
差がないという結果であった。しかし抗体にウナギ抗体
F(ab’)2画分を使用し、抗体溶液へのビーズ浸漬
条件を変化させた場合、以下に示すよう、こ1両ビーズ
における抗体吸着量に大きな差が認められた。抗体溶液
としてはウサギ(抗つシγγリエノラーゼ)抗体を20
0μg/mΩの濃度で溶解した+I+7.0.0.1M
リン酸ナトリウム緩衝液を使用した。
六体溶液中への担体の浸漬条件としては温度は4Cと2
5℃と37℃につき、又時間は2時間、6時間、0時間
につき検討した。浸漬終了後の各担体表面とに結合した
抗体量の測定は大腸菌由来の β−ガラクトシダーゼ(
ベーリンガーマンハイム社製)を禦識酵素として結合さ
せた第二抗体、すなわちヤギ(抗ウサギIgG)抗体を
各固相と反応させ、免疫支応により固相上に結合した第
二抗体の標識酵素舌性を測定することにより求めた。結
合した抗体量の表示は2種ビーズの浸漬条件として4℃
、2寺間の場合を100とした相対値で表示し、その結
肢は第3図に示した。
5℃と37℃につき、又時間は2時間、6時間、0時間
につき検討した。浸漬終了後の各担体表面とに結合した
抗体量の測定は大腸菌由来の β−ガラクトシダーゼ(
ベーリンガーマンハイム社製)を禦識酵素として結合さ
せた第二抗体、すなわちヤギ(抗ウサギIgG)抗体を
各固相と反応させ、免疫支応により固相上に結合した第
二抗体の標識酵素舌性を測定することにより求めた。結
合した抗体量の表示は2種ビーズの浸漬条件として4℃
、2寺間の場合を100とした相対値で表示し、その結
肢は第3図に示した。
ビーズ1担体の場合、浸漬条件の差により固相上に結合
する抗体量は著しく変動するのに対し、ビーズ4担体の
場合、抗体量の変化はなく1条件に関係なく一定量の抗
体の結合した固相を調製することができた。
する抗体量は著しく変動するのに対し、ビーズ4担体の
場合、抗体量の変化はなく1条件に関係なく一定量の抗
体の結合した固相を調製することができた。
実施例3
実施例2で調製したそれぞれの固相を抗体結合同相とし
て使用し、血清中のγγ型エノラーゼを酵素標識抗体に
大腸菌由来の β−ガラクトシダーゼ(ベーリンガーマ
ンハイム社製)を標識酵素として結合させた(抗γγ型
エノラーゼ)モノクローナル抗体を使用したサンドイン
チタイプの酵素免疫測定法で測定した時の測定値の変化
につき検討し、測定値の変化を表3に示した。尚、血清
検体は肺小細胞癌患者血清3検体を使用した。
て使用し、血清中のγγ型エノラーゼを酵素標識抗体に
大腸菌由来の β−ガラクトシダーゼ(ベーリンガーマ
ンハイム社製)を標識酵素として結合させた(抗γγ型
エノラーゼ)モノクローナル抗体を使用したサンドイン
チタイプの酵素免疫測定法で測定した時の測定値の変化
につき検討し、測定値の変化を表3に示した。尚、血清
検体は肺小細胞癌患者血清3検体を使用した。
表3
ビーズ1担体を使用した場合、浸漬条件の差による測定
値への影響は著しく、血清中γγ型エノラーゼの測定値
は大きく変動した。ビーズ4担体の場合は測定値の変動
は少なく、条件に関係なく一定の測定値が得られた。
値への影響は著しく、血清中γγ型エノラーゼの測定値
は大きく変動した。ビーズ4担体の場合は測定値の変動
は少なく、条件に関係なく一定の測定値が得られた。
実施例4
血清中のチロキシン結合グロブリン(TBG)の測定系
において、ウサギ(抗ヒトTBG) IgGを実施例2
と同じ条件でビーズ1担体およびビーズ4担体に結合さ
せ、抗体結合担体を調製した。測定は12s工で標識し
た”’l−TBGとサンプル中のTBGと同相上に結合
した抗TBG抗体に対して競合反応を行わせる競合型放
射性免疫測定法を行った。サンプル血清中のTBG[定
結果を表4に示した。
において、ウサギ(抗ヒトTBG) IgGを実施例2
と同じ条件でビーズ1担体およびビーズ4担体に結合さ
せ、抗体結合担体を調製した。測定は12s工で標識し
た”’l−TBGとサンプル中のTBGと同相上に結合
した抗TBG抗体に対して競合反応を行わせる競合型放
射性免疫測定法を行った。サンプル血清中のTBG[定
結果を表4に示した。
表4
スチレン樹脂にみられる担体への抗体の結合条件の差の
測定値の変化への影響が、ビーズ4担体では認められず
、安定した測定値を得ることができた。つまり、実施例
3の血清中γγ型エノラーゼの酵素免疫測定法の場合と
同様、ビーズ1担体を同相として用いた測定系での測定
値は抗体溶液への同相の浸漬条件による影響を著しく受
けるのに対し、ビーズ4担体の固相の場合は影響はなく
、浸漬条件に関係なく一定の測定値が得られた。
測定値の変化への影響が、ビーズ4担体では認められず
、安定した測定値を得ることができた。つまり、実施例
3の血清中γγ型エノラーゼの酵素免疫測定法の場合と
同様、ビーズ1担体を同相として用いた測定系での測定
値は抗体溶液への同相の浸漬条件による影響を著しく受
けるのに対し、ビーズ4担体の固相の場合は影響はなく
、浸漬条件に関係なく一定の測定値が得られた。
実施例5
抗体溶液中への同相の浸漬条件として、浸漬温度25℃
、浸漬時間2時間を採用して調製したビーズ1担体、表
1におけるビーズ2(組成がポリスチレンおよび硫酸バ
リウム、以下、ビーズ2担体と呼ぶ)及びビーズ4担体
を使用して検体測定値の再現性を比較した。抗体は実施
例2と同様の抗つシγγ型エノラーゼ抗体を使用し、実
施例2で示したサンドイッチタイプの酵素免疫測定法で
肺小細胞癌患者のγγ型エノラーゼ高価血清検体3検体
を測定した。但し、標識酵素としてパーオキシダーゼを
使用し、 pH7,0,0,1Mリン酸ナトリウム緩
衝液の代わりに10mg/mQのBSA、 58mg/
mQの塩化ナトリウム、5mg/mρのゼラチン、lf
f1g/mΩの塩化マグネシウム及び10%のエノラー
ゼを除去した血清を含むpH7,0,0,1Mリン酸ナ
トリウム緩衝液の様な比較的に比重の大きい(約1.0
5)緩衝液を使用し、さらに酵素反応停止液として2N
の硫酸を使用した。測定は同時中型測定を行い、それぞ
れの検体測定値の平均値、標識偏差値、変動係数(%)
を算出し比較した。結果を表5に示した。
、浸漬時間2時間を採用して調製したビーズ1担体、表
1におけるビーズ2(組成がポリスチレンおよび硫酸バ
リウム、以下、ビーズ2担体と呼ぶ)及びビーズ4担体
を使用して検体測定値の再現性を比較した。抗体は実施
例2と同様の抗つシγγ型エノラーゼ抗体を使用し、実
施例2で示したサンドイッチタイプの酵素免疫測定法で
肺小細胞癌患者のγγ型エノラーゼ高価血清検体3検体
を測定した。但し、標識酵素としてパーオキシダーゼを
使用し、 pH7,0,0,1Mリン酸ナトリウム緩
衝液の代わりに10mg/mQのBSA、 58mg/
mQの塩化ナトリウム、5mg/mρのゼラチン、lf
f1g/mΩの塩化マグネシウム及び10%のエノラー
ゼを除去した血清を含むpH7,0,0,1Mリン酸ナ
トリウム緩衝液の様な比較的に比重の大きい(約1.0
5)緩衝液を使用し、さらに酵素反応停止液として2N
の硫酸を使用した。測定は同時中型測定を行い、それぞ
れの検体測定値の平均値、標識偏差値、変動係数(%)
を算出し比較した。結果を表5に示した。
ビーズ1担体に比ベビーズ2担体やビーズ4担体を使用
した時の変動係数はいずれも5%以下と小さい。つまり
、担体に比重の比較的低いビーズ1担体を使用すると、
反応中に該担体が浮き沈みしたりするため均一な反応が
阻害される。それに比較してビーズ2担体やビーズ4担
体のような高比重の樹脂を使用することにより、測定の
際に濃度の高い、高比重の反応溶液が使われた場合でも
固相が完全に沈んだ状態で反応が行われるため、測定系
が安定して、得られる測定値も変動係数の小さい結果と
なった。
した時の変動係数はいずれも5%以下と小さい。つまり
、担体に比重の比較的低いビーズ1担体を使用すると、
反応中に該担体が浮き沈みしたりするため均一な反応が
阻害される。それに比較してビーズ2担体やビーズ4担
体のような高比重の樹脂を使用することにより、測定の
際に濃度の高い、高比重の反応溶液が使われた場合でも
固相が完全に沈んだ状態で反応が行われるため、測定系
が安定して、得られる測定値も変動係数の小さい結果と
なった。
これまでのスチレン樹脂では比重が低いために支障をき
たした自動分析装置でのビーズの送り出し、移送、洗浄
、廃棄操作が可能となり、測定時の光路を遮断するよう
なこともなく高精度な測定が可能となった。また比重が
大きいので従来、濃度が高い為に比重が大きくなる反応
系に於いても、担体が完全に沈んだ状態で反応が行われ
、用手法においても精度の高い分析方法を提供すること
ができる。さらに抗原又は抗体の溶液中への同相の浸漬
条件により、固相表面に結合する抗原又は抗体量の変動
の著しいスチレン樹脂に対して、フッ素系樹脂は影響を
うけることなく、結合する抗原又は抗体量は一定で、吸
着条件に関係なく安定した固相を調製することができる
。さらに、このビーズは高比重のため速やかに反応容器
の底に沈むため、精度良く免疫測定ができ、自動分析に
も適用できることは言うまでもない。
たした自動分析装置でのビーズの送り出し、移送、洗浄
、廃棄操作が可能となり、測定時の光路を遮断するよう
なこともなく高精度な測定が可能となった。また比重が
大きいので従来、濃度が高い為に比重が大きくなる反応
系に於いても、担体が完全に沈んだ状態で反応が行われ
、用手法においても精度の高い分析方法を提供すること
ができる。さらに抗原又は抗体の溶液中への同相の浸漬
条件により、固相表面に結合する抗原又は抗体量の変動
の著しいスチレン樹脂に対して、フッ素系樹脂は影響を
うけることなく、結合する抗原又は抗体量は一定で、吸
着条件に関係なく安定した固相を調製することができる
。さらに、このビーズは高比重のため速やかに反応容器
の底に沈むため、精度良く免疫測定ができ、自動分析に
も適用できることは言うまでもない。
第1図は自動免疫分析装置のビーズ供給容器の一例を示
す斜視図、そして第2図は本発明及び従来のビーズを用
いて酵素免疫測定を行ったときの被測定物質濃度と吸光
度との関係を示すグラフである。また第3図はビーズ1
担体とビーズ4担体の固相の浸漬条件の差による抗体結
合量の比較を示すものである。 1・・・ビーズ供給容器、13・・・ビーズ代理人 弁
理士 戸 1)親 男 第 1 図
す斜視図、そして第2図は本発明及び従来のビーズを用
いて酵素免疫測定を行ったときの被測定物質濃度と吸光
度との関係を示すグラフである。また第3図はビーズ1
担体とビーズ4担体の固相の浸漬条件の差による抗体結
合量の比較を示すものである。 1・・・ビーズ供給容器、13・・・ビーズ代理人 弁
理士 戸 1)親 男 第 1 図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、樹脂を主成分とする組成物でなり、比重が1.4〜
2.5の範囲である免疫測定用ビーズ。 2、前記樹脂の比重が1.4〜2.5の範囲である請求
項第1項に記載のビーズ。 3、前記樹脂がフッ素含有樹脂である請求項第1項に記
載のビーズ。 4、ビーズ自身の重量により該ビーズを自動供給しうる
自動免疫測定装置に使用される請求項第1項に記載のビ
ーズ。 5、請求項第1項、第2項、第3項又は第4項に記載の
ビーズを用いる免疫測定法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP21359688A JPH01131460A (ja) | 1987-08-31 | 1988-08-30 | 免疫測定用ビーズおよびこれを用いる免疫測定法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62-218449 | 1987-08-31 | ||
JP21844987 | 1987-08-31 | ||
JP21359688A JPH01131460A (ja) | 1987-08-31 | 1988-08-30 | 免疫測定用ビーズおよびこれを用いる免疫測定法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01131460A true JPH01131460A (ja) | 1989-05-24 |
Family
ID=26519883
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP21359688A Pending JPH01131460A (ja) | 1987-08-31 | 1988-08-30 | 免疫測定用ビーズおよびこれを用いる免疫測定法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH01131460A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH01100455A (ja) * | 1987-10-13 | 1989-04-18 | Olympus Optical Co Ltd | 担体収容器 |
JPH0777528A (ja) * | 1993-08-05 | 1995-03-20 | Boehringer Mannheim Gmbh | 試料液体の分析装置および分析方法 |
WO2001059454A1 (fr) * | 2000-02-07 | 2001-08-16 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Procede de detection d'une substance |
-
1988
- 1988-08-30 JP JP21359688A patent/JPH01131460A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH01100455A (ja) * | 1987-10-13 | 1989-04-18 | Olympus Optical Co Ltd | 担体収容器 |
JPH0777528A (ja) * | 1993-08-05 | 1995-03-20 | Boehringer Mannheim Gmbh | 試料液体の分析装置および分析方法 |
WO2001059454A1 (fr) * | 2000-02-07 | 2001-08-16 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Procede de detection d'une substance |
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