JPH01129000A - 環式ペプチド - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
動物における生長は生物調節分子(bi□ −regu
latory molecules)のカスケード(
cascade)によって調節されると信じられている
。視床下部は生長ホルモン調節因子(GRF)と称する
物質を産生し、この物質はまた下垂体に作用して生長ホ
ルモンの放出を誘発する。下垂体はソマトスタチン(s
omatosutat in)及びインシュリン生長因
子(IGF)によって負のフィードバック制御下に保持
される。GRFははなはだしく活性であり、血液中に生
長ホルモンのμg/mQレベルの放出を刺激し得ること
が知られている。GRFを、例えば下垂体性株儒、生長
ホルモン産生異常による糖尿病の処置、創傷及び骨折の
治癒の促進、火傷の処置及び老化過程の遅延において、
生長ホルモンの適用に対する希望者として考えられる分
野のほとんどに治療的に用いることができる。 GRFの単離成功は、末端巨大症に伴う膵臓腫瘍がGR
Fの多量を正常の場所でない所で産生ずると言う発見に
一部よるものである。相同アミノ酸配列を有するが、し
かし、異なる長さ(44,40及び37個のアミノ酸)
を有するGRFの3つの型が単離されt;。 44個のアミノ酸を有するGRFのアミン化された型は
親分子であるとみなされる。広く種々な合成同族体が製
造された。これらのものは最初の単離されたGRFまた
は生物学的に活性な7ラグメント或いは種々なアミノ酸
置換によるその同族体の1つに相当するアミノ酸配列を
有するポリペプチドからなる。変化を特異的に巧みに処
理し、親分子の特性よりもすぐれた生物学的特性を有す
る合成同族体が度々得られる。従って、例えば効能、有
効性及び安定性の見地から、最大の生物学的活性を示す
GRF同族体を作り出すことが望まれている。 現在まで、全ての公知のGRF同族体は線状立体配置で
ある。一般に、線状ペプチドは柔軟な分子であり、明確
な配座に欠けている。線状ペプチドにおける各アミノ酸
は酵素的及び化学的減成に極めて感受性をもたらす周囲
環境にさらされる。 環式ペプチド(ラクタム)は、酸性アミノ酸(例えばA
spまたはGlu)の側鎖のカルボキシ末端がアミド結
合の発生を介して塩基性アミノ酸(例えば(Lys)の
側鎖のアミノ酸に結合している。 環式ペプチドの生物学的特性は度々その線状同族体の特
性に関連して変わる。環式ペプチドは十分に定義された
形状及び周囲環境から保護された内部アミノ酸残基によ
って堅く固定されている。 この形状がペプチドの生物学的特性に反映される。 環式ペプチドの作用持続期間は、そのコンパクトな構造
が化学的及び酵素的減成に対して敏感性を少なくするた
めに、長いであろう。環式ペプチドのバイオアベイラビ
リティ(bioavailability)は、保護さ
れた内部アミノ酸残基に起因する組織分布における変化
のために、増加するであろう。 更に、環式ペプチドの明確な配座は目標受容体に対して
極めて特異性を示し、かくして、望ましくない生物学的
副作用を減少させる。例えば線状ペプチドの場合、一般
に与えた線状ペプチドに対して中枢及び末梢受容体との
交差反応性(crossreactivity)があり
、そしてまた与えたペプチドと他のペプチドに対する受
容体とのかなりの交差反応性がある。 本発明は、その製薬学的に許容し得る塩も含めて、上記
の特異的なアミノ酸配列のGRFの線状及び環式同族体
に関する。 また、本発明は本発明の化合物の有効量を患者に投与す
ることによって、患者の生長ホルモンの放出を刺激する
方法に関する。 本明細書において用いる次の記号及び用語は次の如く定
義される: 1、環式ペプチドまたはラクタムは酸性アミノ酸(例え
ばAspまたはGlu) の側鎖カルボキシ末端アミ、ド結 合を介して塩基性アミノ酸(例 えばLys)の側鎖アミノ末端 に結合しているペプチド(ラフ タム)を意味する。 L−−、−、、、,1 またはCyclo’・12はペプチド鎖における8番目
のアミノ酸「A」が鎖中の 12番目のアミノ酸r13Jに結 合し、環式ラクタム構造を生ず ることを意味する 3、GRF はアミノ港配列 Tyr−Ala−Asp−Ala−1ie−Phe−
Thr −Asn −Ser −Tyr −Arg −
Lys −Val −Leu −Gly −Gln −
Leu− Ser −Ala −Arg −Lys −
Leu −−Leu −Gin −Asp −lie
−Met −Ser−Arg−Gin−Gln−Gly
−Glu− Ser −Asn −Gln −Glu
−Arg −Gly −Ala −Arg −AJa
−Arg −Leu−NH。 を有するポリペプチドであるヒ トの生長ホルモン放出因子を意 味する。 4 、 ELeu27JGRF は位置27のメチオ
ニン残基がロイシン残基によって置換され たGRFに対応するアミノ酸配 列を肴するポリペプチドを意味 する。一般に、かかるGRFの 同族体を、GRFの前のかっこ 内に置換されたアミノ酸を示す ことによって指示する。 5 、 G[?F(1−29) は全配列の最初の2
9個のアミノ酸を有するGRFペプチドの 7ラグメントを意味する。一般 に、GRFに続く丸かっこは7 ラグメントのN−末端及びC− 末端を示す最初のGRF配列の アミノ酸の位置に対応する。 6 、 des NH2Tyr’はアミノ末端NH,基
が1位置でチロシン残基から除去された ことを意味する。 7.0cHex はシクロヘキシルを意味する。 8、DIEA はジイソプロピルエチルアミンを意
味する。 9、DIE はジチオエタンを意味する。 第1図はラットの下垂体細胞から生長ホルモンの放出に
おける本発明の化合物の効果を説明するものである。2
つの下垂体(“pits” )腺(1:4希釈)をフィ
ルター分析用の各フィルターに含浸させ、評価分析を一
般に生物学的活性について行っt;。次の特定の略号を
用いた: rrGHJは組換え生長ホルモンを意味し、r[A1’
5 cyclo8−12] GRF−(1−29)−
N H、JはCyclo’−目[As p’、A I
als]−GRF−(1−29)−NH!を意味し、r
cyclo (8−12)[D−AJa2 Ala
151 GRF (1−29) NHzJはCycl
o”2[D−A I a”、As p”、A I a
”] −GRF−(1−29)−NH,を意味し、 r
Cycl o (8−12) [DesN)(、Ty
r ] D−AZA15] (1−29)−NH
iはC3’C1o”s” −[d e s NH2Ty
r ’、D−A l a”、A s p”。 A I aI53−GRF (1−29) NH,を
意味し、そしてrcyclo (8−12) [De
sNH2Ty r 1A15] (1−29) NH
2JはCy c l o””−[d e sNH,Ty
r’、As p”。 Al a”] −GRF (1−29) NH2を意
味する。 本発明は式 %式% Va 1−Leu−R3−G In−Leu−5er−
A la−Arg−Lys−Leu−Leu−Gln−
Asp−目e−R’−R”−R’ −X式中、 R’=Tyr、d e s NH,−Ty r、 、A
c−Ty r、Hi s、N−メチル−L−Tyr R2=A I a%D−A I a、 N−メチル−D
−1a R3= Gly、Ala、Leu、Va 1111e
、Nle%NVa1、β− Ala、a−Aib R’ =MetSLeu、Nle、I leR’ =
Se rs Asn R’ =A r g−G I n−G l
n−G l y −G l u−5e
r −A s n−G I n −G l
u −A r g−G l y−A l
a −A r g−A l a −A
r g−L e u ま f−はそのフラグメ
ントからなる群より選 ばれるアミノ酸配列、該フラグメント はカルボキシル末端から1−15個の アミノ酸だけ数が少ない、 X−0H1NH2、N (R’XR’) 、ここで、R
7及びR’=Hまたは低級アルキル、AmAsp、Gl
u、a−アミノピメリン酸、α−アミノアジピン酸、 B=L y s、Or ns ジアミノプロピオン酸、
ジアミノ酪酸、 ただし、Aの側鎖カルボキシ末端はアミド結合を介して
Bの側鎖アミン末端に結合しているものとする、 の環式ペピチド及びその製薬学的に許容し得る塩からな
る。 R’=Tyr、desNH2−Tyrs N−メチル−
L−Ty r ; R’=A I a、 D−A l
a ; R3=AIa;及びX−NH2である式Iのペ
プチドが好ましい。 AmAsp;B=Lys (そしてAspの側鎖カルボ
キシ末端はアミド結合を介してLysの側鎖アミノ末端
に共有的に結合している)、R4−Me t ;R’=
Se r ;及びR’=Argである式Iによるペプチ
ドが更に好ましい。 R’=Ty r% R”=A l a及びR3−Ala
であり、式 %式% を有するペプチドが殊に好ましい。 6、R2=D−A l aであり、式 2式% を有するペプチドが殊に好ましい。 またR’=d e s NH2Ty rである式Iによ
るペプチドも好ましい。 R2−Alaであり、該ペプチドが式 2式% を有するペプチドが殊に好ましい。 また、R2=D−Alaであり、式 2式% を有するペプチドが殊に好ましい。 また、本発明は上記の特定の環式ペプチドの線状同族体
からなる。 ペプチドを適当な方法、例えば完全な固相合成、部分固
相合成、フラグメント縮合または典型的な溶液合成によ
って合成することができる。また、組換えDNA技術を
、天然のアミノ酸残基のみを含む同族体に対して用いる
こともできる。本発明のペプチドは、メリフィールド(
Merrifield)により、ジャーナル・オブ・ジ
・アメリカン・ケミカル・ソサエティー [(J 、
Am、 Chem。 Soc、)85.2149(4963)]に記載されて
いる如き固相ペプチド合成法によって製造することが好
ましい。この合成はα−アミノ末端で保護されたアミノ
酸を用いて行われる。まt;不安定な側鎖を有する三官
能性アミノ酸を、ペプチドのアッセンブリィ中にその部
位で起こる化学反応を防止する適当な基で保護する。α
−アミノ保護基を選択的に除去し、続いてアミノ末端で
起こるカップリング反応に付す。α−アミノ保護基の除
去条件は側鎖の保護基の脱保護を起こさぬ条件である。 a−アミノ保護基はペプチドの逐次合成の分野において
既知であり、アシルタイプ保護基(例えばホルミル、ト
リフルオロアセチル、アセチル)、芳香族ウレタンタイ
プ保護基(例えばベンジルオキシカルボニル(Cbz)
及び置換されたベンジルオキシカルボニル)、脂肪族ウ
レタン保護基(例えばt−ブチルオキシカルボニル(B
oa)、イソプロピルオキシカルボニル、シクロへキシ
ルオキシカルボニル)及びアルキルタイプ保護基(例工
ばベンジル、トリフェニルメチル)等からなる。好まし
い保護基はBocである。Tryに対する側鎖の保護基
にはテトラヒドロピラニル、tert、−ブチル、トリ
チル、ベンジル、Cbz、−4−Br−Cbz及び2.
6−ジクロロベンジルが含まれる。Tyrに対する好ま
しい側鎖保護基は2,6−ジクロロベンジルである。A
spに対する側鎖保護基にはベンジル、2,6−ジクロ
ロベンジル、メチル、エチル及びシクロヘキシルが含ま
れる。Aspに対する好ましい側鎖保護基はシクロヘキ
シルである。Thr及びSetに対する側鎖保護基には
アセチル、ベンゾイル、トリチル、テトラヒドロピラニ
ル、ベンジル、2.6−ジクロロベンジル及びCbzが
含まれる。Thr及びSerに対する好ましい側鎖保護
基はベンジルである。Argに対する保護基にはニトロ
、トシル(To s) 、Cbz、アダマンチルオキシ
カルボニルまたはBocが含まれる。Argに対する好
ましい保護基はTocである。Lysの側鎖アミノ基を
Cb z s 2− CI Cb z ST o
sまたはBocで保護することができる。Lysに対す
る好ましい保護基は2−CI−Cbzである。 側鎖保護基の選択は次に基づく;側鎖保護基がカップリ
ング中不変であり、アミノ−末端保護基の脱保護中また
はカップリング条件中に***しない。 側鎖保護基は、最終ペプチドの合成完了後、該ペプチド
を変化させぬ条件下で除去され得るものでなけれはなら
ない。 固相合或は通常、α−アミノ保護された(側鎖保護され
た)アミノ酸を適当な固相担体にカップリングさせるこ
とにより、合成するペプチドのカルボキシ−末端から行
われる。付着をクロロメチル化したまたはヒドロキシメ
チル樹脂に行った場合、エステル結合を生じ、生ずる標
的ペプチドはC−末端に遊離カルボキシル基をもつであ
ろう。 また、ベンズヒドリルアミンまたはp−メチルベンズヒ
ドリルアミン樹脂を用いる場合、アミド結合を生じ、生
ずる標的ペプチドはC−末端にカルボキシアミド基をも
つであろう。これらの樹脂は市販品であり、その製法は
ステワード(S tewart)等によって、[固相ペ
プチド合成J (”5olidP hase P
eptide S ynLhesis” ) [第
2版、ピアス・ケミカル・カンパニイ(P 1erce
Chemical Co、 ) 、Rockfor
d、 I L、 l 、984]に記載されている。 C−末端アミノ酸としてのArgの場合(側鎖にTos
で、モしてα−アミン官能基にBocで保護された)、
該アミノ酸を、ジシクロへキシルカルボジイミド(DC
C) 、N、N’−ジイソプロピルカルボジイミドまた
はカルボニルジイミダゾールを含めて、種々な活性化剤
を用いてベンズヒドリルアミン樹脂にカップリングさせ
ることができる。樹脂担体への付着に続いて、α−アミ
ノ保護基を0乃至25℃間の温度で、ジオキサン中のト
リフルオロ酢酸(TFA)またはHCIを用いて除去す
る。可能なS−アルキル化を抑制するためにメチオニン
(Met)の導入後、ジメチルスルファイドをTFAに
加える。α−アミノ保護基の除去後、残りの保護された
アミノ酸を、所望のペプチド配列を得るために、必要な
順序で逐次カップリングさせる。カップリング反応に対
して、DCCS N、N’−ジイソプロピルカルボジイ
ミド、(へンソトリアゾル−l−イル−オキシ[トリス
(ジメチルアミン)] ホホスホニラへキサフルオロホ
スフェ−1−(BOP)及びDCC−ヒドロキノベンツ
トリアゾール(HOBt)を含めて、種々な活性化剤を
用いることができる。各保護されたアミノ酸を過剰量(
>2.5当量)で用い12通常、カップリングをジメチ
ルホルムアミドF ) 、C H 2C 12またはそ
の混合物中で行う.。カンプリング反応の完了の程度を
、カイザー(Kaiser)等、アナリティカル・バイ
オケミストリイ(Anal. B iochem.)
、3 4、595 (1970)に記載された如き
ニンヒドリン反応によって各段階で監視する。不完全カ
ップリングの場合、該カップリング反応をくり返し行う
。カップリング反応を例えばベガ( V’ega) 2
5 0、アプライド・バイオ/ステムス・7ンセサイ
ザー( A ppl iedB iosysLems
5ynthesizer)の如きシンセサイザーまた
は他の市販の装置によって自動的に行うことができる。 本発明のペプチドの合成における典型的な合成循環に対
する工程表を第1表に示す。 〉 〉 \ \ 〉〉− = よ l 。 次 次 l 訳 ま 1−ローロ
0 ヘ 合成するペプチドのアッセンブリーが終了した後、ペプ
チド−樹脂を最初にTFA/ジチオエタン、次に試薬、
例えば液体HFとOoCで1〜2時間反応させ、これに
よって樹脂からペプチドを開、裂させ、そして全ての側
鎖保護基を除去する。 固体の支持体上の側鎖対側鎖の環形成は直交保護機構(
orthogonal protection s
cheme)の使用を必要とし、これは酸性アミノ酸(
例えばAsp)及び塩基性アミノ酸(例えばLys)の
側鎖官能基の選択的開裂を可能にする。この目的のため
に、Aspの側鎖に対して9−フルオレニルメチル(O
F m>保護基及びLysの側鎖に対して9−フルオレ
ニルメトキシカルボニル(Fmoc)保護基を用いるこ
とができる。これらの場合、Boc−保護されたペプチ
ド−樹脂の側鎖保護基(OFm及びFmoc)がDMF
中のピペリジンで選択的に除去される。DCC%DCC
/HOB
latory molecules)のカスケード(
cascade)によって調節されると信じられている
。視床下部は生長ホルモン調節因子(GRF)と称する
物質を産生し、この物質はまた下垂体に作用して生長ホ
ルモンの放出を誘発する。下垂体はソマトスタチン(s
omatosutat in)及びインシュリン生長因
子(IGF)によって負のフィードバック制御下に保持
される。GRFははなはだしく活性であり、血液中に生
長ホルモンのμg/mQレベルの放出を刺激し得ること
が知られている。GRFを、例えば下垂体性株儒、生長
ホルモン産生異常による糖尿病の処置、創傷及び骨折の
治癒の促進、火傷の処置及び老化過程の遅延において、
生長ホルモンの適用に対する希望者として考えられる分
野のほとんどに治療的に用いることができる。 GRFの単離成功は、末端巨大症に伴う膵臓腫瘍がGR
Fの多量を正常の場所でない所で産生ずると言う発見に
一部よるものである。相同アミノ酸配列を有するが、し
かし、異なる長さ(44,40及び37個のアミノ酸)
を有するGRFの3つの型が単離されt;。 44個のアミノ酸を有するGRFのアミン化された型は
親分子であるとみなされる。広く種々な合成同族体が製
造された。これらのものは最初の単離されたGRFまた
は生物学的に活性な7ラグメント或いは種々なアミノ酸
置換によるその同族体の1つに相当するアミノ酸配列を
有するポリペプチドからなる。変化を特異的に巧みに処
理し、親分子の特性よりもすぐれた生物学的特性を有す
る合成同族体が度々得られる。従って、例えば効能、有
効性及び安定性の見地から、最大の生物学的活性を示す
GRF同族体を作り出すことが望まれている。 現在まで、全ての公知のGRF同族体は線状立体配置で
ある。一般に、線状ペプチドは柔軟な分子であり、明確
な配座に欠けている。線状ペプチドにおける各アミノ酸
は酵素的及び化学的減成に極めて感受性をもたらす周囲
環境にさらされる。 環式ペプチド(ラクタム)は、酸性アミノ酸(例えばA
spまたはGlu)の側鎖のカルボキシ末端がアミド結
合の発生を介して塩基性アミノ酸(例えば(Lys)の
側鎖のアミノ酸に結合している。 環式ペプチドの生物学的特性は度々その線状同族体の特
性に関連して変わる。環式ペプチドは十分に定義された
形状及び周囲環境から保護された内部アミノ酸残基によ
って堅く固定されている。 この形状がペプチドの生物学的特性に反映される。 環式ペプチドの作用持続期間は、そのコンパクトな構造
が化学的及び酵素的減成に対して敏感性を少なくするた
めに、長いであろう。環式ペプチドのバイオアベイラビ
リティ(bioavailability)は、保護さ
れた内部アミノ酸残基に起因する組織分布における変化
のために、増加するであろう。 更に、環式ペプチドの明確な配座は目標受容体に対して
極めて特異性を示し、かくして、望ましくない生物学的
副作用を減少させる。例えば線状ペプチドの場合、一般
に与えた線状ペプチドに対して中枢及び末梢受容体との
交差反応性(crossreactivity)があり
、そしてまた与えたペプチドと他のペプチドに対する受
容体とのかなりの交差反応性がある。 本発明は、その製薬学的に許容し得る塩も含めて、上記
の特異的なアミノ酸配列のGRFの線状及び環式同族体
に関する。 また、本発明は本発明の化合物の有効量を患者に投与す
ることによって、患者の生長ホルモンの放出を刺激する
方法に関する。 本明細書において用いる次の記号及び用語は次の如く定
義される: 1、環式ペプチドまたはラクタムは酸性アミノ酸(例え
ばAspまたはGlu) の側鎖カルボキシ末端アミ、ド結 合を介して塩基性アミノ酸(例 えばLys)の側鎖アミノ末端 に結合しているペプチド(ラフ タム)を意味する。 L−−、−、、、,1 またはCyclo’・12はペプチド鎖における8番目
のアミノ酸「A」が鎖中の 12番目のアミノ酸r13Jに結 合し、環式ラクタム構造を生ず ることを意味する 3、GRF はアミノ港配列 Tyr−Ala−Asp−Ala−1ie−Phe−
Thr −Asn −Ser −Tyr −Arg −
Lys −Val −Leu −Gly −Gln −
Leu− Ser −Ala −Arg −Lys −
Leu −−Leu −Gin −Asp −lie
−Met −Ser−Arg−Gin−Gln−Gly
−Glu− Ser −Asn −Gln −Glu
−Arg −Gly −Ala −Arg −AJa
−Arg −Leu−NH。 を有するポリペプチドであるヒ トの生長ホルモン放出因子を意 味する。 4 、 ELeu27JGRF は位置27のメチオ
ニン残基がロイシン残基によって置換され たGRFに対応するアミノ酸配 列を肴するポリペプチドを意味 する。一般に、かかるGRFの 同族体を、GRFの前のかっこ 内に置換されたアミノ酸を示す ことによって指示する。 5 、 G[?F(1−29) は全配列の最初の2
9個のアミノ酸を有するGRFペプチドの 7ラグメントを意味する。一般 に、GRFに続く丸かっこは7 ラグメントのN−末端及びC− 末端を示す最初のGRF配列の アミノ酸の位置に対応する。 6 、 des NH2Tyr’はアミノ末端NH,基
が1位置でチロシン残基から除去された ことを意味する。 7.0cHex はシクロヘキシルを意味する。 8、DIEA はジイソプロピルエチルアミンを意
味する。 9、DIE はジチオエタンを意味する。 第1図はラットの下垂体細胞から生長ホルモンの放出に
おける本発明の化合物の効果を説明するものである。2
つの下垂体(“pits” )腺(1:4希釈)をフィ
ルター分析用の各フィルターに含浸させ、評価分析を一
般に生物学的活性について行っt;。次の特定の略号を
用いた: rrGHJは組換え生長ホルモンを意味し、r[A1’
5 cyclo8−12] GRF−(1−29)−
N H、JはCyclo’−目[As p’、A I
als]−GRF−(1−29)−NH!を意味し、r
cyclo (8−12)[D−AJa2 Ala
151 GRF (1−29) NHzJはCycl
o”2[D−A I a”、As p”、A I a
”] −GRF−(1−29)−NH,を意味し、 r
Cycl o (8−12) [DesN)(、Ty
r ] D−AZA15] (1−29)−NH
iはC3’C1o”s” −[d e s NH2Ty
r ’、D−A l a”、A s p”。 A I aI53−GRF (1−29) NH,を
意味し、そしてrcyclo (8−12) [De
sNH2Ty r 1A15] (1−29) NH
2JはCy c l o””−[d e sNH,Ty
r’、As p”。 Al a”] −GRF (1−29) NH2を意
味する。 本発明は式 %式% Va 1−Leu−R3−G In−Leu−5er−
A la−Arg−Lys−Leu−Leu−Gln−
Asp−目e−R’−R”−R’ −X式中、 R’=Tyr、d e s NH,−Ty r、 、A
c−Ty r、Hi s、N−メチル−L−Tyr R2=A I a%D−A I a、 N−メチル−D
−1a R3= Gly、Ala、Leu、Va 1111e
、Nle%NVa1、β− Ala、a−Aib R’ =MetSLeu、Nle、I leR’ =
Se rs Asn R’ =A r g−G I n−G l
n−G l y −G l u−5e
r −A s n−G I n −G l
u −A r g−G l y−A l
a −A r g−A l a −A
r g−L e u ま f−はそのフラグメ
ントからなる群より選 ばれるアミノ酸配列、該フラグメント はカルボキシル末端から1−15個の アミノ酸だけ数が少ない、 X−0H1NH2、N (R’XR’) 、ここで、R
7及びR’=Hまたは低級アルキル、AmAsp、Gl
u、a−アミノピメリン酸、α−アミノアジピン酸、 B=L y s、Or ns ジアミノプロピオン酸、
ジアミノ酪酸、 ただし、Aの側鎖カルボキシ末端はアミド結合を介して
Bの側鎖アミン末端に結合しているものとする、 の環式ペピチド及びその製薬学的に許容し得る塩からな
る。 R’=Tyr、desNH2−Tyrs N−メチル−
L−Ty r ; R’=A I a、 D−A l
a ; R3=AIa;及びX−NH2である式Iのペ
プチドが好ましい。 AmAsp;B=Lys (そしてAspの側鎖カルボ
キシ末端はアミド結合を介してLysの側鎖アミノ末端
に共有的に結合している)、R4−Me t ;R’=
Se r ;及びR’=Argである式Iによるペプチ
ドが更に好ましい。 R’=Ty r% R”=A l a及びR3−Ala
であり、式 %式% を有するペプチドが殊に好ましい。 6、R2=D−A l aであり、式 2式% を有するペプチドが殊に好ましい。 またR’=d e s NH2Ty rである式Iによ
るペプチドも好ましい。 R2−Alaであり、該ペプチドが式 2式% を有するペプチドが殊に好ましい。 また、R2=D−Alaであり、式 2式% を有するペプチドが殊に好ましい。 また、本発明は上記の特定の環式ペプチドの線状同族体
からなる。 ペプチドを適当な方法、例えば完全な固相合成、部分固
相合成、フラグメント縮合または典型的な溶液合成によ
って合成することができる。また、組換えDNA技術を
、天然のアミノ酸残基のみを含む同族体に対して用いる
こともできる。本発明のペプチドは、メリフィールド(
Merrifield)により、ジャーナル・オブ・ジ
・アメリカン・ケミカル・ソサエティー [(J 、
Am、 Chem。 Soc、)85.2149(4963)]に記載されて
いる如き固相ペプチド合成法によって製造することが好
ましい。この合成はα−アミノ末端で保護されたアミノ
酸を用いて行われる。まt;不安定な側鎖を有する三官
能性アミノ酸を、ペプチドのアッセンブリィ中にその部
位で起こる化学反応を防止する適当な基で保護する。α
−アミノ保護基を選択的に除去し、続いてアミノ末端で
起こるカップリング反応に付す。α−アミノ保護基の除
去条件は側鎖の保護基の脱保護を起こさぬ条件である。 a−アミノ保護基はペプチドの逐次合成の分野において
既知であり、アシルタイプ保護基(例えばホルミル、ト
リフルオロアセチル、アセチル)、芳香族ウレタンタイ
プ保護基(例えばベンジルオキシカルボニル(Cbz)
及び置換されたベンジルオキシカルボニル)、脂肪族ウ
レタン保護基(例えばt−ブチルオキシカルボニル(B
oa)、イソプロピルオキシカルボニル、シクロへキシ
ルオキシカルボニル)及びアルキルタイプ保護基(例工
ばベンジル、トリフェニルメチル)等からなる。好まし
い保護基はBocである。Tryに対する側鎖の保護基
にはテトラヒドロピラニル、tert、−ブチル、トリ
チル、ベンジル、Cbz、−4−Br−Cbz及び2.
6−ジクロロベンジルが含まれる。Tyrに対する好ま
しい側鎖保護基は2,6−ジクロロベンジルである。A
spに対する側鎖保護基にはベンジル、2,6−ジクロ
ロベンジル、メチル、エチル及びシクロヘキシルが含ま
れる。Aspに対する好ましい側鎖保護基はシクロヘキ
シルである。Thr及びSetに対する側鎖保護基には
アセチル、ベンゾイル、トリチル、テトラヒドロピラニ
ル、ベンジル、2.6−ジクロロベンジル及びCbzが
含まれる。Thr及びSerに対する好ましい側鎖保護
基はベンジルである。Argに対する保護基にはニトロ
、トシル(To s) 、Cbz、アダマンチルオキシ
カルボニルまたはBocが含まれる。Argに対する好
ましい保護基はTocである。Lysの側鎖アミノ基を
Cb z s 2− CI Cb z ST o
sまたはBocで保護することができる。Lysに対す
る好ましい保護基は2−CI−Cbzである。 側鎖保護基の選択は次に基づく;側鎖保護基がカップリ
ング中不変であり、アミノ−末端保護基の脱保護中また
はカップリング条件中に***しない。 側鎖保護基は、最終ペプチドの合成完了後、該ペプチド
を変化させぬ条件下で除去され得るものでなけれはなら
ない。 固相合或は通常、α−アミノ保護された(側鎖保護され
た)アミノ酸を適当な固相担体にカップリングさせるこ
とにより、合成するペプチドのカルボキシ−末端から行
われる。付着をクロロメチル化したまたはヒドロキシメ
チル樹脂に行った場合、エステル結合を生じ、生ずる標
的ペプチドはC−末端に遊離カルボキシル基をもつであ
ろう。 また、ベンズヒドリルアミンまたはp−メチルベンズヒ
ドリルアミン樹脂を用いる場合、アミド結合を生じ、生
ずる標的ペプチドはC−末端にカルボキシアミド基をも
つであろう。これらの樹脂は市販品であり、その製法は
ステワード(S tewart)等によって、[固相ペ
プチド合成J (”5olidP hase P
eptide S ynLhesis” ) [第
2版、ピアス・ケミカル・カンパニイ(P 1erce
Chemical Co、 ) 、Rockfor
d、 I L、 l 、984]に記載されている。 C−末端アミノ酸としてのArgの場合(側鎖にTos
で、モしてα−アミン官能基にBocで保護された)、
該アミノ酸を、ジシクロへキシルカルボジイミド(DC
C) 、N、N’−ジイソプロピルカルボジイミドまた
はカルボニルジイミダゾールを含めて、種々な活性化剤
を用いてベンズヒドリルアミン樹脂にカップリングさせ
ることができる。樹脂担体への付着に続いて、α−アミ
ノ保護基を0乃至25℃間の温度で、ジオキサン中のト
リフルオロ酢酸(TFA)またはHCIを用いて除去す
る。可能なS−アルキル化を抑制するためにメチオニン
(Met)の導入後、ジメチルスルファイドをTFAに
加える。α−アミノ保護基の除去後、残りの保護された
アミノ酸を、所望のペプチド配列を得るために、必要な
順序で逐次カップリングさせる。カップリング反応に対
して、DCCS N、N’−ジイソプロピルカルボジイ
ミド、(へンソトリアゾル−l−イル−オキシ[トリス
(ジメチルアミン)] ホホスホニラへキサフルオロホ
スフェ−1−(BOP)及びDCC−ヒドロキノベンツ
トリアゾール(HOBt)を含めて、種々な活性化剤を
用いることができる。各保護されたアミノ酸を過剰量(
>2.5当量)で用い12通常、カップリングをジメチ
ルホルムアミドF ) 、C H 2C 12またはそ
の混合物中で行う.。カンプリング反応の完了の程度を
、カイザー(Kaiser)等、アナリティカル・バイ
オケミストリイ(Anal. B iochem.)
、3 4、595 (1970)に記載された如き
ニンヒドリン反応によって各段階で監視する。不完全カ
ップリングの場合、該カップリング反応をくり返し行う
。カップリング反応を例えばベガ( V’ega) 2
5 0、アプライド・バイオ/ステムス・7ンセサイ
ザー( A ppl iedB iosysLems
5ynthesizer)の如きシンセサイザーまた
は他の市販の装置によって自動的に行うことができる。 本発明のペプチドの合成における典型的な合成循環に対
する工程表を第1表に示す。 〉 〉 \ \ 〉〉− = よ l 。 次 次 l 訳 ま 1−ローロ
0 ヘ 合成するペプチドのアッセンブリーが終了した後、ペプ
チド−樹脂を最初にTFA/ジチオエタン、次に試薬、
例えば液体HFとOoCで1〜2時間反応させ、これに
よって樹脂からペプチドを開、裂させ、そして全ての側
鎖保護基を除去する。 固体の支持体上の側鎖対側鎖の環形成は直交保護機構(
orthogonal protection s
cheme)の使用を必要とし、これは酸性アミノ酸(
例えばAsp)及び塩基性アミノ酸(例えばLys)の
側鎖官能基の選択的開裂を可能にする。この目的のため
に、Aspの側鎖に対して9−フルオレニルメチル(O
F m>保護基及びLysの側鎖に対して9−フルオレ
ニルメトキシカルボニル(Fmoc)保護基を用いるこ
とができる。これらの場合、Boc−保護されたペプチ
ド−樹脂の側鎖保護基(OFm及びFmoc)がDMF
中のピペリジンで選択的に除去される。DCC%DCC
/HOB
【またはBOPを含めた種々な活性化剤を用い
て、環形成を固体の支持体上に達成する。HF反応は上
記の如く環形成したペプチド−樹脂において行われる。 本発明のポリペプチドの精製をペプチド化学においてよ
くしられた方法を用いて行うことができる。本発明のポ
リペプチドを分取型HPLCを用いて精製することがで
きる;しかしながら、また他の既知のクロマトグラフ法
、例えばゲル浸透、イオン交換及び分配クロマトグラフ
ィーまたは向流分配を用いることもできる。 また、本発明は、式Iによるペプチドの有効量を患者に
投与することによる該患者における成長ホルモンの放出
を刺激する方法からなる。 本発明のポリペプチドは生長ホルモン放出活性ををする
。本発明による製薬学的組成物には製薬学的または獣医
学的に許容し得る液体または固体の担体に分散させたア
ミノ酸長さ約29〜44個の同族体またはこれらの無毒
性塩が含まれる。かかる製薬学的組成物を医薬及び獣医
薬における治療及び診断に用いることができる。これら
のものは例えば成長遅延障害、例えば下垂体株儒及び異
常な生長ホルモン産生による糖尿病に対して有用である
。更に、また該組成物を肉生産のために飼育する動物の
成長を刺激するか、または飼料効率を高めるため、ミル
ク生産を高めるため、そして非生産を刺激するために用
いることができる。 本発明のペプチドの適当な投薬量は個々の患者並びに更
に特定的には生長ホルモン産生の欠乏の程度及び装置条
件に依存するであろう。当該分野に精通せるものにとっ
ては、正常の生長に伴う生長ホルモンの既知循環レベル
及び本発明のポリペプチドの生長ホルモン放出活性に基
ずく適当な投薬量を決定し得るであろう。更に詳細には
、生長ホルモンの放出を刺激するために、患者の体重に
基ずき0.04μg1kg/日〜約20,0μg/kg
/日範囲の投薬量を用いることが出来る。家畜において
生長活性を刺激するために用いる投薬量は、成長ホルモ
ン欠乏症、例えば人間における下垂体性株儒の場合に生
長を回復するために用いる投薬量よりもかなり多い(患
者体重1kg当り)であろう。一般に家畜の場合、下垂
体生長ホルモンの放出を刺激するために、0.4μg/
kg/日〜約100μg/kg/日範囲の投薬量を皮下
的に用いることができる。 かくして、本発明に従って、正常生長に伴うレベルに生
長ホルモンの産生を刺激するために十分な量の本発明の
同族体を投与することからなる生長ホルモンの不十分産
生に特徴のある生長遅延障害を処置する方法が提供され
る。 生長ホルモンの正常はレベルは個人間でかなり変わりそ
して、−個人にあっても、循環する生長ホルモンのレベ
ルは一日を通してかなり変化する。 成人においては、生長ホルモンの正常血清レベルは約0
〜long/rrlに変化することが報告されている。 子供においては、生長ホルモンの正常血清レベルは約0
〜20ng/m12に変わることが報告されている。 上記の同族体で下垂体機能減退性株儒を効果的に処置す
るために、処置を生長期間中に行う。女性の場合、一般
にこの期間は月経開始前後までである。かくて女性の処
置を、個人に応じて、はぼ12〜16オまで行うべきで
ある。男性においては、生長刺激は思春期を越えてかな
り長期間可能である。かくして、男性の効果的な処置は
通常約18〜19才まで、そしである個人の場合には約
25才まで可能であろう。 また、生長ホルモンの産生を刺激するために、正常生長
に伴うレベルよりも高いレベルで本同族体の有効量を投
与することによって動物の生長を増加させる方法が提供
される。 本発明のポリペプチドをヒトまたは動物用の製薬学的組
成物の形態で投与することができ、該組成物は通常の製
薬学的調製法によって製造することができる。経口、静
脈内、皮下、筋肉内、−腹腔内、鼻内または経皮投与に
適する組成物を用いることかできる。製薬学的用途に適
する投与形態は本発明の化合特約0.O1〜0.5 m
gを含有し、このものを無菌の水または塩水で再構成
するために凍結屹燥することができる。本同族体の安定
性を保持するために、組成物を約5.0以下のpH値に
保持すべきセbる。また処置する種による血清アルブミ
ン(例えば人間の場合にはヒト血清アルビミン、牛の場
合にはウシ血清アルビミン等) 。 が他の公知の製薬学的補助剤と共に存在していてもよい
。 本発明を次の実施例に関連して述べるが、該実施例は単
なる説明のだめのものである。 実施例I Cyclo’y′![Asp’、Ala1s] −GR
F(1−29)−Nl2の合成りoc−Arg(Tos
)−ベンズヒドリルアミン−樹脂の製造ベンズヒドリル
アミン−樹脂(60,?、0.7ミリ当it/L42ミ
リ当fl)をCH,CI、、 MeOH,CH,C1,
。 CH2Cl2中の25%EL3N(3回)、CToC1
2,MeOH及びCJC1i各900 rJで洗浄した
。DMF(80an) −CH。 Cl2(600mlり中のBoa−Arg(Tos)−
0H(35、951゜84ミリモル、2当量)を加え、
5分間振盪し、DCC(17,3jl 、84ミリモル
、2当量)を加え、そして24時間反応させた。生じた
Boc−Arg(Tos)−BHA−樹脂をDMF、
CH2Cl2. MeOH及びCH。 C1□で洗浄した。部分標本のアミノ酸分析は0.38
ミリモル/2の置換を示した。樹脂を25°Cにて2時
間50%Ac40−ピリジン300a+j!でアセチル
化し、CHzClz、 MeOH,co、c+2で洗浄
し、真空下で乾燥し、Boc−Arg(Tos)−Bl
(A−樹脂701を得た(置換: 0 、6 meq/
I”)。 [Asp’、(OFm)、Lys12(Fmoc)、A
la”] −GRF(1−29)−樹脂の製造 ゛ Boc−Arg(Tos)−Bl(A−樹脂<701.
0.6meq/7,42meq)を第1表に示した工程
表に従って脱保護し、そして中和した。三官能性アミノ
酸を次の如くして保護した: Boc−Arg(Tos
)、Boc−Asp(OcHex)、BOC−GILI
−(OBZI)、Boc−Lys(2CI−Z)、Bo
c−5e、r(Bz l)、Boc−Thr(Bz 1
)、Boc−Tyr−(2,6−C1zBzl)、Bo
c−Asp’ (OFm)及びBoa−Lys ’ ”
(Fmoc)。工程表の例外はBoc−Gln−OHの
カップリング(位置24及び16)及び直ちに続いてG
lmとカップリング(位置23及び15)に対してであ
り、この場合′、対称性無水物3当量をDMF中で用い
た(二重カップリング)。第三のカップリングを特徴と
する特別な場合には、DMF (120+nl)中のB
oa−アミノ酸、l−ヒドロキシベンゾアゾール及び前
もって活性化したDCCの各々2.5当量を用いてHO
Btエステルを製造し、濾過しくジシクロへキシルウレ
ア除去)、そしてトルエンで1.2Qに希釈した。カッ
プリングを2時間続け、1.5%ジイソグロビルエチル
アミンを加え、更に15分間反応させた。 中間体[Ala” ]−GRF(13−29)−BHA
−樹脂(1,88,9,0,71439モル)を除去し
、上記の如く逐次固相合成を続けた。Lys ’ ”(
Fmoc)を力aえた後、工程6を0.6%DIEA/
CH2Cl2によって続けた。 Boa −Asn−OH(6当fk)とのカップリング
を、l−ヒドロキシベンゾトリアゾール(6,6当量)
及びDCC(6当fk)で予備活性によって行った。 Cyclo’y ’ 2[Asp’ 、Ala” ]−
GRF(1−29)−NHxの製造Boc−[Asp’
(OFm) 、 Lys ’ ”(Fmoc) 、 A
la ” ]−GRF(1−29)−BHA−樹脂(2
,729,0,714ミリモル)のアチセンブリーに続
いて、この樹脂を20%ピペリジン/ DMFで20分
間脱保護し、Boc [Asp’+Ala” ]−G
RF(l−29)−BHA−樹脂を得た。この一部(1
,40,?、0.40ミリモル)を、EtsN (15
7μL 1.12 ミ!Jモル、2.8当量)を含t
、’ DMF(40m(2)中にてBOP試薬と4時間
反応させて環形成させた。洗浄後、環形成化を更に2回
、11時間及び3時間くり返し行い(負のカイザーニン
ヒドリン試験)、このペプチド−樹脂を洗浄し、乾燥し
、DTE (1mQ/ fl樹脂)含むHF(〜20m
Q)にて0℃で2時間開裂させた。HFの蒸発に続いて
、EtOAcで洗浄し、TFA (6X 5 m(2)
で抽出し、蒸発させ、そしてエーテル2共に砕解した。 Cyclo’s ’ ” [Asp” 、Ala” ]
−GRF(1−29)−Nl2の精製及び同定 粗製の生成物(708mjJ)を820(0,025%
TFA) 20 mQに懸濁させ、撹拌し、遠心分離し
、濾過し、シンクロパック(Synchropak)
RP−Pカラム(2−OX50cm)に加えた[溶離条
件;溶離剤; (A](20(0、025%TFA)
−(B)ACN (0、O25%TFA); l 20
分間で20〜45%(B)の直線勾配溶離、流速4 m
Q/分]。7ラクシヨンを1分間隔で捕集した。フラク
ション82〜89をプールし、凍結乾燥し、半純粋な生
成物84m1を得た。フラクション90〜93からサイ
ド−バンド(side−bandsX33 m2 )が
得られた。半純粋な物質(84m、?)をヌクレオシル
(Nuc 1eos i 1)cpsカラム(1,QX
5QCm;5μ)再精製した[溶離条件;溶離剤: (
A)H2O(0、1%TFA) −(B)ACN(0、
1%TFA)、120分間で20〜40%(B)の直線
勾配溶離;流速3mα/分】。プラクジョンを1分間隔
で捕集した。7ラクシヨン120〜121をプールし、
凍結乾燥し、均質生成物(9mj+)が得られ、フラク
ション122〜138から純度〉97%の生成物42m
:jが得られた。 生成物は分析HPLCによって均質であることがわかっ
た。アミノ酸分析(6MHCI、 110’0,24
時間) ; Asp、 2.72 ; Thr、 0.
96 ; Ser。 2.98 ; Glu、 2.14 ; Ala、 4
.00 ; Va1、 0.96 ; Met。 0.97 ; lie、 1.89 ; Leu、 4
.28 ; Tyr、 2−01 ; Phe。 0.98 ; Lys、 2.06 ; Arg、 3
.04゜実施例2 中間体[Ala” ]−GRF(13−29)−BHA
−樹脂(5,12,1,63ミリモル)を取り出し、逐
次固相合成を第1表にした工程表に従って続けた。Ly
s12(Fmoc)を加えた後、工程6を0.6%DI
EA/CH2Cl2に換えた。合成を続行し、Boc−
[Asp’ (OFm)。 Lys12(Fmoc)、Ala”]−GRF(3−2
9)−Bl(A−樹脂6.42を得た。この生成物io
n (0,255モル)をBoc−D−A 1a−O
Hによって固相合成1循環に付し、Boc−[D−A
la2. Asp’(OFm) 、 Lys ” (F
moc) 、 A la ” ]−GRF(2−29)
−BIIA−樹脂を得た。この0.52部分をdesN
H。 Tyr−OHによって最終循環に付し、 [desNH
2Tyr’ 、D−Ala2. Asp’(OFm)
、 LYs ’ ”(Fmoc) ’、 A la ”
]−GRF(1−29)−BHA−樹脂か得られ、こ
のものを20%ピペリジン/ DMFで20分間脱保護
し、DIEA (0,3mQ、2.2ミリモル)を含む
DMF (20m(2)中のBOP試薬(170m2.
0.384ミリモル、3当量)で2時間環形成させた。 環形成化を新しいBOP試薬でくり返し行い(負のカイ
ザーニンヒドリン試験)、ペプチドを洗浄し、HIT(
〜lom(2)によって0°Cで2時間開裂させた(上
記の如く)。HFを蒸発させ、EtOAcで洗浄し、T
FAで抽出し、蒸発させ、エーテルと共に砕解し、粗製
の生成物229m9を得た。 Cyclo’l ’ 2[Asp’ 、Ala” ]−
GRF(l−29)−NJに対して上に述べた如くして
、精製を分取W HPLCによって行った。 実施例3 咲±と二月■ジ〕已A辻二畳どL二岨田」犯−N)l
2の合成 りoc−[Asp’(OFm)、Lys12−(Fmo
c)、Ala”]−GRF(3−29)−BHA−樹脂
1.0.?(0,255ミリモル)をBoc−L−Al
a−OH,desNH2Tyr−OHと共に固相合成の
2回循環に付し、[desNH2Tyr’ 、Asp@
(OFm)、Lys”(Fmoc)、Ala”]−GR
F(1−29)−BHA−樹脂を得られ、このものを2
0%−ピペリジン/ DMFで20分間脱保護し、DI
EA(0、3mQ、2.2ミリモル)を含むDMF (
20m12)中にてBOP試薬(170m1.0.38
4ミリモル、3当量)で2時間環形成させた。環形成化
を新しいBOP試薬でくり返し行l11(負のカイザー
ニンヒドリン試験)、ペプチドを洗浄し、乾燥し、HF
(〜lomf2)によって0°Cで2時間開裂させた(
上記の如く)。HFを蒸発させ、次にEtOAcで洗浄
し、TFAで抽出し、蒸発させ、エーテルと共に砕解し
、粗製の生成物450m5’を得た。 Cyclo”+ ’ ” [Asp8.Ala” ]−
GRF(1−29)−Nl2に対して上に述べた如くし
て、精製を分取型HPLCによって行った。 実施例4 Cyclo8t’″[D−Ala2.Asp’、Ala
”] −GRF(1−29)−Nl2の合成 実施例2によるBoc−[D−Ala”、 Asp8(
OFm)、Lys12(F+noc)、Ala”]−G
RF(2−29)−BHA−樹脂Q、57Boc−Ty
r[2,6−C1□Bzl]−OHによッテ最終循環ニ
付シ、Boc−[D−A la’ 、 Asp’(OF
m) 、 Lys ’ 2(Fmoc) 、 A la
” ]−GRF(1−29)=BIIA−樹脂を得ら
れ、このものを20%ピペリジン/DMFで20分間脱
保護し、DIEA(0,3mQ、2.2ミリモル)を含
むDMF (20m12)中のBOP試薬(170m9
,0.384ミリモル、3当量)で2時間環形成させた
。環形成化を新しいBOP試薬でくり返し行い(負のカ
イザーニンヒドリン試験)、ペプチドを洗浄し、乾燥し
、HF(〜lom12)によってO′Cで2時間開裂さ
せた(上記の如<)、HFを蒸発させ、次にEtOAc
で洗浄し、TFAで抽出し、蒸発させ、エーテルと共に
砕解し、粗製の生成物198r+Jを得た。 Cyclo’w ”[Asp’、Ala”]−GRF(
1−29)−Nl2に対して上に述べた如くして、精製
を分取型HPLCによって行った。 実施例5 Boa−[D−Ala2. Asp’(OFm)、Ly
s”(Fmoc)、Ala1S]−GRF(2−29)
−BHA−樹脂(上記) 0 、59 Boa−N−M
ethyl−L−Tyr’−(2,6−Cl2Bzl)
−0Hによって最終循環に付し、Boc−[N−Met
hyl−Tyr’(2,6−CIJzl)、D−Ala
2゜Asp’(OFm) 、 Lys ’ ”(Fmo
c) 、 A la ” ]−1ThRF(1−29)
−BHA−樹脂を得られ、このものを20%ピペリジン
/DMFで20分間脱保護し、DIEA(0、103m
Q。 0.765ミリモル、6当量)を含むDMF (5m1
2)BOP試薬(170m1.0.384ミリモル、3
当量)によって2時間環形成させた。環形成化を新しい
BOP試薬によって更に2回くり返し行い(負のカイザ
ーニンヒドリン試験)、ペプチドを洗浄し、乾燥し、H
F (−1Qm12)によって0℃で2時間開裂させた
(上記の如く)。HFを蒸発させ、次にEtOAcで洗
浄し、TFAで抽出し、蒸発させ、エーテルと共に砕解
し、粗製の生成物219mj?を得た。Cyclo’s
12[Asp’、Ala”]−GRF(1−29)−
Nl2に対して上に述べた如くして、精製を分取型HP
LCによって行った。 本発明を好ましい具体例に関連して述べたが、示した特
定の方法に本発明の範囲を限定するものではなく、逆に
、添付の特許請求の範囲によって定義された如く、本発
明の精神及び範囲内に含まれ得る如きかかる選択し得る
方法、改変及び対応する方法を包含するものとする。
て、環形成を固体の支持体上に達成する。HF反応は上
記の如く環形成したペプチド−樹脂において行われる。 本発明のポリペプチドの精製をペプチド化学においてよ
くしられた方法を用いて行うことができる。本発明のポ
リペプチドを分取型HPLCを用いて精製することがで
きる;しかしながら、また他の既知のクロマトグラフ法
、例えばゲル浸透、イオン交換及び分配クロマトグラフ
ィーまたは向流分配を用いることもできる。 また、本発明は、式Iによるペプチドの有効量を患者に
投与することによる該患者における成長ホルモンの放出
を刺激する方法からなる。 本発明のポリペプチドは生長ホルモン放出活性ををする
。本発明による製薬学的組成物には製薬学的または獣医
学的に許容し得る液体または固体の担体に分散させたア
ミノ酸長さ約29〜44個の同族体またはこれらの無毒
性塩が含まれる。かかる製薬学的組成物を医薬及び獣医
薬における治療及び診断に用いることができる。これら
のものは例えば成長遅延障害、例えば下垂体株儒及び異
常な生長ホルモン産生による糖尿病に対して有用である
。更に、また該組成物を肉生産のために飼育する動物の
成長を刺激するか、または飼料効率を高めるため、ミル
ク生産を高めるため、そして非生産を刺激するために用
いることができる。 本発明のペプチドの適当な投薬量は個々の患者並びに更
に特定的には生長ホルモン産生の欠乏の程度及び装置条
件に依存するであろう。当該分野に精通せるものにとっ
ては、正常の生長に伴う生長ホルモンの既知循環レベル
及び本発明のポリペプチドの生長ホルモン放出活性に基
ずく適当な投薬量を決定し得るであろう。更に詳細には
、生長ホルモンの放出を刺激するために、患者の体重に
基ずき0.04μg1kg/日〜約20,0μg/kg
/日範囲の投薬量を用いることが出来る。家畜において
生長活性を刺激するために用いる投薬量は、成長ホルモ
ン欠乏症、例えば人間における下垂体性株儒の場合に生
長を回復するために用いる投薬量よりもかなり多い(患
者体重1kg当り)であろう。一般に家畜の場合、下垂
体生長ホルモンの放出を刺激するために、0.4μg/
kg/日〜約100μg/kg/日範囲の投薬量を皮下
的に用いることができる。 かくして、本発明に従って、正常生長に伴うレベルに生
長ホルモンの産生を刺激するために十分な量の本発明の
同族体を投与することからなる生長ホルモンの不十分産
生に特徴のある生長遅延障害を処置する方法が提供され
る。 生長ホルモンの正常はレベルは個人間でかなり変わりそ
して、−個人にあっても、循環する生長ホルモンのレベ
ルは一日を通してかなり変化する。 成人においては、生長ホルモンの正常血清レベルは約0
〜long/rrlに変化することが報告されている。 子供においては、生長ホルモンの正常血清レベルは約0
〜20ng/m12に変わることが報告されている。 上記の同族体で下垂体機能減退性株儒を効果的に処置す
るために、処置を生長期間中に行う。女性の場合、一般
にこの期間は月経開始前後までである。かくて女性の処
置を、個人に応じて、はぼ12〜16オまで行うべきで
ある。男性においては、生長刺激は思春期を越えてかな
り長期間可能である。かくして、男性の効果的な処置は
通常約18〜19才まで、そしである個人の場合には約
25才まで可能であろう。 また、生長ホルモンの産生を刺激するために、正常生長
に伴うレベルよりも高いレベルで本同族体の有効量を投
与することによって動物の生長を増加させる方法が提供
される。 本発明のポリペプチドをヒトまたは動物用の製薬学的組
成物の形態で投与することができ、該組成物は通常の製
薬学的調製法によって製造することができる。経口、静
脈内、皮下、筋肉内、−腹腔内、鼻内または経皮投与に
適する組成物を用いることかできる。製薬学的用途に適
する投与形態は本発明の化合特約0.O1〜0.5 m
gを含有し、このものを無菌の水または塩水で再構成
するために凍結屹燥することができる。本同族体の安定
性を保持するために、組成物を約5.0以下のpH値に
保持すべきセbる。また処置する種による血清アルブミ
ン(例えば人間の場合にはヒト血清アルビミン、牛の場
合にはウシ血清アルビミン等) 。 が他の公知の製薬学的補助剤と共に存在していてもよい
。 本発明を次の実施例に関連して述べるが、該実施例は単
なる説明のだめのものである。 実施例I Cyclo’y′![Asp’、Ala1s] −GR
F(1−29)−Nl2の合成りoc−Arg(Tos
)−ベンズヒドリルアミン−樹脂の製造ベンズヒドリル
アミン−樹脂(60,?、0.7ミリ当it/L42ミ
リ当fl)をCH,CI、、 MeOH,CH,C1,
。 CH2Cl2中の25%EL3N(3回)、CToC1
2,MeOH及びCJC1i各900 rJで洗浄した
。DMF(80an) −CH。 Cl2(600mlり中のBoa−Arg(Tos)−
0H(35、951゜84ミリモル、2当量)を加え、
5分間振盪し、DCC(17,3jl 、84ミリモル
、2当量)を加え、そして24時間反応させた。生じた
Boc−Arg(Tos)−BHA−樹脂をDMF、
CH2Cl2. MeOH及びCH。 C1□で洗浄した。部分標本のアミノ酸分析は0.38
ミリモル/2の置換を示した。樹脂を25°Cにて2時
間50%Ac40−ピリジン300a+j!でアセチル
化し、CHzClz、 MeOH,co、c+2で洗浄
し、真空下で乾燥し、Boc−Arg(Tos)−Bl
(A−樹脂701を得た(置換: 0 、6 meq/
I”)。 [Asp’、(OFm)、Lys12(Fmoc)、A
la”] −GRF(1−29)−樹脂の製造 ゛ Boc−Arg(Tos)−Bl(A−樹脂<701.
0.6meq/7,42meq)を第1表に示した工程
表に従って脱保護し、そして中和した。三官能性アミノ
酸を次の如くして保護した: Boc−Arg(Tos
)、Boc−Asp(OcHex)、BOC−GILI
−(OBZI)、Boc−Lys(2CI−Z)、Bo
c−5e、r(Bz l)、Boc−Thr(Bz 1
)、Boc−Tyr−(2,6−C1zBzl)、Bo
c−Asp’ (OFm)及びBoa−Lys ’ ”
(Fmoc)。工程表の例外はBoc−Gln−OHの
カップリング(位置24及び16)及び直ちに続いてG
lmとカップリング(位置23及び15)に対してであ
り、この場合′、対称性無水物3当量をDMF中で用い
た(二重カップリング)。第三のカップリングを特徴と
する特別な場合には、DMF (120+nl)中のB
oa−アミノ酸、l−ヒドロキシベンゾアゾール及び前
もって活性化したDCCの各々2.5当量を用いてHO
Btエステルを製造し、濾過しくジシクロへキシルウレ
ア除去)、そしてトルエンで1.2Qに希釈した。カッ
プリングを2時間続け、1.5%ジイソグロビルエチル
アミンを加え、更に15分間反応させた。 中間体[Ala” ]−GRF(13−29)−BHA
−樹脂(1,88,9,0,71439モル)を除去し
、上記の如く逐次固相合成を続けた。Lys ’ ”(
Fmoc)を力aえた後、工程6を0.6%DIEA/
CH2Cl2によって続けた。 Boa −Asn−OH(6当fk)とのカップリング
を、l−ヒドロキシベンゾトリアゾール(6,6当量)
及びDCC(6当fk)で予備活性によって行った。 Cyclo’y ’ 2[Asp’ 、Ala” ]−
GRF(1−29)−NHxの製造Boc−[Asp’
(OFm) 、 Lys ’ ”(Fmoc) 、 A
la ” ]−GRF(1−29)−BHA−樹脂(2
,729,0,714ミリモル)のアチセンブリーに続
いて、この樹脂を20%ピペリジン/ DMFで20分
間脱保護し、Boc [Asp’+Ala” ]−G
RF(l−29)−BHA−樹脂を得た。この一部(1
,40,?、0.40ミリモル)を、EtsN (15
7μL 1.12 ミ!Jモル、2.8当量)を含t
、’ DMF(40m(2)中にてBOP試薬と4時間
反応させて環形成させた。洗浄後、環形成化を更に2回
、11時間及び3時間くり返し行い(負のカイザーニン
ヒドリン試験)、このペプチド−樹脂を洗浄し、乾燥し
、DTE (1mQ/ fl樹脂)含むHF(〜20m
Q)にて0℃で2時間開裂させた。HFの蒸発に続いて
、EtOAcで洗浄し、TFA (6X 5 m(2)
で抽出し、蒸発させ、そしてエーテル2共に砕解した。 Cyclo’s ’ ” [Asp” 、Ala” ]
−GRF(1−29)−Nl2の精製及び同定 粗製の生成物(708mjJ)を820(0,025%
TFA) 20 mQに懸濁させ、撹拌し、遠心分離し
、濾過し、シンクロパック(Synchropak)
RP−Pカラム(2−OX50cm)に加えた[溶離条
件;溶離剤; (A](20(0、025%TFA)
−(B)ACN (0、O25%TFA); l 20
分間で20〜45%(B)の直線勾配溶離、流速4 m
Q/分]。7ラクシヨンを1分間隔で捕集した。フラク
ション82〜89をプールし、凍結乾燥し、半純粋な生
成物84m1を得た。フラクション90〜93からサイ
ド−バンド(side−bandsX33 m2 )が
得られた。半純粋な物質(84m、?)をヌクレオシル
(Nuc 1eos i 1)cpsカラム(1,QX
5QCm;5μ)再精製した[溶離条件;溶離剤: (
A)H2O(0、1%TFA) −(B)ACN(0、
1%TFA)、120分間で20〜40%(B)の直線
勾配溶離;流速3mα/分】。プラクジョンを1分間隔
で捕集した。7ラクシヨン120〜121をプールし、
凍結乾燥し、均質生成物(9mj+)が得られ、フラク
ション122〜138から純度〉97%の生成物42m
:jが得られた。 生成物は分析HPLCによって均質であることがわかっ
た。アミノ酸分析(6MHCI、 110’0,24
時間) ; Asp、 2.72 ; Thr、 0.
96 ; Ser。 2.98 ; Glu、 2.14 ; Ala、 4
.00 ; Va1、 0.96 ; Met。 0.97 ; lie、 1.89 ; Leu、 4
.28 ; Tyr、 2−01 ; Phe。 0.98 ; Lys、 2.06 ; Arg、 3
.04゜実施例2 中間体[Ala” ]−GRF(13−29)−BHA
−樹脂(5,12,1,63ミリモル)を取り出し、逐
次固相合成を第1表にした工程表に従って続けた。Ly
s12(Fmoc)を加えた後、工程6を0.6%DI
EA/CH2Cl2に換えた。合成を続行し、Boc−
[Asp’ (OFm)。 Lys12(Fmoc)、Ala”]−GRF(3−2
9)−Bl(A−樹脂6.42を得た。この生成物io
n (0,255モル)をBoc−D−A 1a−O
Hによって固相合成1循環に付し、Boc−[D−A
la2. Asp’(OFm) 、 Lys ” (F
moc) 、 A la ” ]−GRF(2−29)
−BIIA−樹脂を得た。この0.52部分をdesN
H。 Tyr−OHによって最終循環に付し、 [desNH
2Tyr’ 、D−Ala2. Asp’(OFm)
、 LYs ’ ”(Fmoc) ’、 A la ”
]−GRF(1−29)−BHA−樹脂か得られ、こ
のものを20%ピペリジン/ DMFで20分間脱保護
し、DIEA (0,3mQ、2.2ミリモル)を含む
DMF (20m(2)中のBOP試薬(170m2.
0.384ミリモル、3当量)で2時間環形成させた。 環形成化を新しいBOP試薬でくり返し行い(負のカイ
ザーニンヒドリン試験)、ペプチドを洗浄し、HIT(
〜lom(2)によって0°Cで2時間開裂させた(上
記の如く)。HFを蒸発させ、EtOAcで洗浄し、T
FAで抽出し、蒸発させ、エーテルと共に砕解し、粗製
の生成物229m9を得た。 Cyclo’l ’ 2[Asp’ 、Ala” ]−
GRF(l−29)−NJに対して上に述べた如くして
、精製を分取W HPLCによって行った。 実施例3 咲±と二月■ジ〕已A辻二畳どL二岨田」犯−N)l
2の合成 りoc−[Asp’(OFm)、Lys12−(Fmo
c)、Ala”]−GRF(3−29)−BHA−樹脂
1.0.?(0,255ミリモル)をBoc−L−Al
a−OH,desNH2Tyr−OHと共に固相合成の
2回循環に付し、[desNH2Tyr’ 、Asp@
(OFm)、Lys”(Fmoc)、Ala”]−GR
F(1−29)−BHA−樹脂を得られ、このものを2
0%−ピペリジン/ DMFで20分間脱保護し、DI
EA(0、3mQ、2.2ミリモル)を含むDMF (
20m12)中にてBOP試薬(170m1.0.38
4ミリモル、3当量)で2時間環形成させた。環形成化
を新しいBOP試薬でくり返し行l11(負のカイザー
ニンヒドリン試験)、ペプチドを洗浄し、乾燥し、HF
(〜lomf2)によって0°Cで2時間開裂させた(
上記の如く)。HFを蒸発させ、次にEtOAcで洗浄
し、TFAで抽出し、蒸発させ、エーテルと共に砕解し
、粗製の生成物450m5’を得た。 Cyclo”+ ’ ” [Asp8.Ala” ]−
GRF(1−29)−Nl2に対して上に述べた如くし
て、精製を分取型HPLCによって行った。 実施例4 Cyclo8t’″[D−Ala2.Asp’、Ala
”] −GRF(1−29)−Nl2の合成 実施例2によるBoc−[D−Ala”、 Asp8(
OFm)、Lys12(F+noc)、Ala”]−G
RF(2−29)−BHA−樹脂Q、57Boc−Ty
r[2,6−C1□Bzl]−OHによッテ最終循環ニ
付シ、Boc−[D−A la’ 、 Asp’(OF
m) 、 Lys ’ 2(Fmoc) 、 A la
” ]−GRF(1−29)=BIIA−樹脂を得ら
れ、このものを20%ピペリジン/DMFで20分間脱
保護し、DIEA(0,3mQ、2.2ミリモル)を含
むDMF (20m12)中のBOP試薬(170m9
,0.384ミリモル、3当量)で2時間環形成させた
。環形成化を新しいBOP試薬でくり返し行い(負のカ
イザーニンヒドリン試験)、ペプチドを洗浄し、乾燥し
、HF(〜lom12)によってO′Cで2時間開裂さ
せた(上記の如<)、HFを蒸発させ、次にEtOAc
で洗浄し、TFAで抽出し、蒸発させ、エーテルと共に
砕解し、粗製の生成物198r+Jを得た。 Cyclo’w ”[Asp’、Ala”]−GRF(
1−29)−Nl2に対して上に述べた如くして、精製
を分取型HPLCによって行った。 実施例5 Boa−[D−Ala2. Asp’(OFm)、Ly
s”(Fmoc)、Ala1S]−GRF(2−29)
−BHA−樹脂(上記) 0 、59 Boa−N−M
ethyl−L−Tyr’−(2,6−Cl2Bzl)
−0Hによって最終循環に付し、Boc−[N−Met
hyl−Tyr’(2,6−CIJzl)、D−Ala
2゜Asp’(OFm) 、 Lys ’ ”(Fmo
c) 、 A la ” ]−1ThRF(1−29)
−BHA−樹脂を得られ、このものを20%ピペリジン
/DMFで20分間脱保護し、DIEA(0、103m
Q。 0.765ミリモル、6当量)を含むDMF (5m1
2)BOP試薬(170m1.0.384ミリモル、3
当量)によって2時間環形成させた。環形成化を新しい
BOP試薬によって更に2回くり返し行い(負のカイザ
ーニンヒドリン試験)、ペプチドを洗浄し、乾燥し、H
F (−1Qm12)によって0℃で2時間開裂させた
(上記の如く)。HFを蒸発させ、次にEtOAcで洗
浄し、TFAで抽出し、蒸発させ、エーテルと共に砕解
し、粗製の生成物219mj?を得た。Cyclo’s
12[Asp’、Ala”]−GRF(1−29)−
Nl2に対して上に述べた如くして、精製を分取型HP
LCによって行った。 本発明を好ましい具体例に関連して述べたが、示した特
定の方法に本発明の範囲を限定するものではなく、逆に
、添付の特許請求の範囲によって定義された如く、本発
明の精神及び範囲内に含まれ得る如きかかる選択し得る
方法、改変及び対応する方法を包含するものとする。
第1図はラットの下垂体細胞からの生長ホルモンの放出
における本発明の化合物の効果を示すグラフである。
における本発明の化合物の効果を示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、式 【遺伝子配列があります】 式中、 R^1=Tyr、desNH_2−Tyr、Ac−Ty
r、His、N−メチル−L− Tyr R^2=Ala、D−Ala、N−メチル−D−Ala R^3=Gly、Ala、Leu、Val、Ile、N
le、NVal、β−Ala、α−Aib R^4=Met、Leu、Nle、Ile R^5=Ser、Asn R^6=Arg−Gln−Gln−Gly−Glu−S
er−Asn−Gln−Glu−Arg−Gly−Al
a−Arg−Ala−Arg−Leuまたはそのフラグ
メントからなる群より選ばれるアミノ酸配列、該フラグ
メントはカルボキシル末端から1〜15個のアミノ酸だ
け数が少ない、 X=OH、NH_2、N(R^7)(R^8)、ここで
、R^7及びR^8=Hまたは低級アルキル、A=As
p、Glu、α−アミノピメリン酸、α−アミノアジピ
ン酸、 B=Lys、Orn、ジアミノプロピオン酸、ジアミノ
酪酸、 ただし、Aの側鎖カルボキシ末端はアミド結合を介して
Bの側鎖アミノ末端に結合しているものとする、 の環式ペプチド及びその製薬学的に許容し得る塩。 2、R^1=Tyr、desNH_2−Tyr、N−メ
チル−L−Tyr;R^2=Ala、D−Ala;R^
3=Ala;及びX=NH_2である特許請求の範囲第
1項記載のペプチド。 3、A=Asp;B=Lys(そしてAspの側鎖カル
ボキシ末端はアミド結合としてLysの側鎖アミノ末端
に共有的に結合している);R^4=Met;R^5=
Ser;及びR^6=Argである特許請求の範囲第2
項記載のペプチド。 4、R^1=Tyrである特許請求の範囲第3項記載の
ペプチド。 5、R^2=Alaであり、該化合物が式 【遺伝子配列があります】 を有する特許請求の範囲第4項記載のペプチド。 6、R^2=D−Alaであり、該化合物が式【遺伝子
配列があります】 を有する特許請求の範囲第4項記載の化合物。 7、R^1=desNH_2−Tyrである特許請求の
範囲第3項記載の化合物。 8、R^2=Alaであり、該化合物が式 【遺伝子配列があります】 を有する特許請求の範囲第7項記載の化合物。 9、R^2=D−Alaであり、該化合物が式【遺伝子
配列があります】 を有する特許請求の範囲第7項記載の化合物。 10、R^1=N−メチル−L−Tyrである特許請求
の範囲第3項記載の化合物。 11、R^2=Alaであり、該化合物が式【遺伝子配
列があります】 を有する特許請求の範囲第10項記載の化合物。 12、R^2=D−Alaであり、該化合物が式【遺伝
子配列があります】 を有する特許請求の範囲第10項記載の化合物。 13、式 【遺伝子配列があります】 式中、 R^1=Tyr、desNH_2−Tyr、Ac−Ty
r、His、N−メチル−L− Tyr R^2=Ala、D−Ala、N−メチル−D−Ala R^3=Gly、Ala、Leu、Val、Ile、N
le、NVal、β−Ala、α−Aib R^4=Met、Leu、Nle、Ile R^5=Ser、Asn R^6=Arg−Gln−Gln−Gly−Glu−S
er−Asn−Gln−Glu−Arg−Gly−Al
a−Arg−Ala−Arg−Leuまたはそのフラグ
メントからなる群より選ばれるアミノ酸配列、該フラグ
メントはカルボキシル末端から1〜15個のアミノ酸だ
け数が少ない、 X=OH、NH_2、N(R^7)(R^8)、ここで
、R^7及びR^8=Hまたは低級アルキル、A=As
p、Dlu、α−アミノピメリン酸、α−アミノアジピ
ン酸、 B=Lys、Orn、ジアミノプロピオン酸、ジアミノ
酪酸、 の線状ペプチド及びその製薬学的に許容し得る塩。 14、R^1=Tyr、R^2=Ala;A=Asp;
B=Lys;R^3=Ala;R^4=Met;R^5
=Ser;R^6=Arg;及びX=NH_2であり、
該ペプチドが式 【遺伝子配列があります】 を有する特許請求の範囲第13項記載の線状ペプチド。 15、R^1=Tyr、R^2=D−Ala、A=As
p;B=Lys;R^3=Ala、R^4=Met、R
^5=Ser、R^5=Arg及びX=NH_2であり
、該化合物が式 【遺伝子配列があります】 を有する特許請求の範囲第13項記載の線状ペプチド。 16、R^1=desNH_2Tyr;R^2=Ala
、A=Asp;B=Lys;R^3=Ala;R^4=
Met;R^5=Ser;R^5=Arg及びX=NH
_2であり、該化合物が式 【遺伝子配列があります】 を有する特許請求の範囲第13項記載の線状ペプチド。 17、R^1=desNH_2Tyr;R^2=D−A
la、A=Asp;B=Lys;R^3=Ala;R^
4=Met;R^5=Ser;R^6=Arg及びX=
NH_2であり、該化合物が式 【遺伝子配列があります】 を有する特許請求の範囲第13項記載の線状ペプチド。 18、R^1=N−メチル−L−Tyr;R^2=Al
a、A=Asp;B=Lys;R^3=Ala;R^4
=Met;R^5=Ser;R^6=Arg及びX=N
H_2であり、該化合物が式 【遺伝子配列があります】 を有する特許請求の範囲第13項記載の線状ペプチド。 19、R^1=N−メチル−L−Tyr;R^2=D−
Ala、A=Asp;B=Lys;R^3=Ala;R
^4=Met;R^5=Ser;R^5=Arg及びX
=NH_2であり、該化合物が式 【遺伝子配列があります】 を有する特許請求の範囲第13項記載の線状ペプチド。 20、ヒトにおける生長ホルモン欠乏に特徴ずけられる
生長遅延障害の処置のための特許請求の範囲第1〜19
項のいずれかに記載の化合物。 21、動物の生長を促進させるための動物の処置用の特
許請求の範囲第1〜19項のいずれかに記載の化合物。 22、固相ペプチド合成法によって合成された対応する
アミノ酸配列の適切に側鎖が保護された樹脂結合ポリペ
プチドを液体HFと反応させ、そして必要に応じて、か
かるペプチドを製薬学的に許容し得る塩に転化すること
を特徴とする特許請求の範囲第1〜19項のいずれかに
記載の化合物の製造法。 23、特許請求の範囲第1〜19項のいずれかに記載の
化合物の有効量及び無毒性の製薬学的に許容し得る液体
または固体の担体を含有する製薬学的組成物。 24、ヒトにおける生長ホルモン欠乏に特徴ずけられる
生長遅延障害の処置或いは動物の生長を促進させるため
の動物の処置における特許請求の範囲第1〜19項のい
ずれかに記載の化合物の使用。 25、特許請求の範囲第22項記載の如き方法に従って
製造した特許請求の範囲第1〜19項のいずれかに記載
の化合物。
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