JP7515177B2 - Low amylose rice with SART-1 mutation - Google Patents
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Description
本発明は、イネの種子中の低アミロース形質に関与する変異型タンパク質及び変異型遺伝子を利用した低アミロース形質のイネの作出方法及び低アミロース形質のイネ植物に関する。また本発明は、低アミロース形質のイネを判定又は選別するための方法及びキットに関する。 The present invention relates to a method for producing rice with low amylose traits using mutant proteins and mutant genes involved in the low amylose trait in rice seeds, and to rice plants with low amylose traits. The present invention also relates to a method and kit for determining or selecting rice with low amylose traits.
イネの種子中のアミロース含有率が低くなると、良食味になる傾向が知られている。アミロース含有率が5～15％程度のコメは低アミロース米と呼ばれ、低アミロース特性を有する水稲品種の育成がすすめられている（例えば、ミルキークイーン、ミルキープリンセス、ゆめぴりか、おぼろづき等）。このような低アミロース品種の育成には、アミロース合成を司る酵素タンパク質GBSSIの機能低下型の遺伝子の変異が利用されている。 It is known that the lower the amylose content in rice seeds, the better the taste. Rice with an amylose content of about 5-15% is called low-amylose rice, and efforts are being made to develop rice varieties with low amylose properties (e.g. Milky Queen, Milky Princess, Yumepirika, Oborozuki, etc.). To develop such low-amylose varieties, a reduced-function gene mutation in the enzyme protein GBSSI, which is responsible for amylose synthesis, is used.
一方で、コメの胚乳中のアミロース含有率が低くなりすぎると、胚乳に白濁が生じるとともに炊飯米の粘りが強くなりすぎるといった問題が顕在化する。近年の気候の温暖化に伴い登熟気温が上昇すると、アミロース含有率の低下が顕著になると想定される。 On the other hand, if the amylose content in rice endosperm becomes too low, problems such as the endosperm becoming cloudy and cooked rice becoming too sticky become apparent. If the temperature during ripening rises in line with the recent warming of the climate, it is expected that the drop in amylose content will become more pronounced.
上述したような問題を最小化するためには、登熟気温に影響を受けにくくアミロースの低減効果の小さい遺伝子の利用が効果的であると考えられる。 In order to minimize the problems mentioned above, it is thought that it would be effective to use genes that are less affected by ripening temperatures and have a small effect on reducing amylose.
本発明者を含む研究グループは、アミロース含有率がやや低いイネ系統「空育162号」の有するアミロース含有率を約1％低下させる量的形質遺伝子座（QTL）（qAC2）が第2染色体上の74.9kbの領域内にあり、この領域に7遺伝子が予測されたこと、品種「いただき」の遺伝的背景に「空育162号」のQTL（qAC2）を導入した準同質遺伝子系統（NIL110、NIL121）は、アミロース含有率が低減し、炊飯米の表層の粘りが強いこと、「いただき」の遺伝的背景に「空育162号」のQTL（qAC2）を導入した準同質遺伝子系群では、低温区で顕著にアミロース含有率が低下しており、これは低温条件でGBSSIの発現が抑制されるためであること、またこれらの結果により、qAC2領域はGBSSIの発現を制御する因子の1つであり、その機能は低温条件下でより強調されることが示唆されたこと、を報告している。 The research group, including the present inventor, reported that the quantitative trait locus (QTL) (qAC2) that reduces the amylose content of the rice line "Soraiku 162," which has a slightly low amylose content, by about 1%, is located within a 74.9 kb region on chromosome 2, and that seven genes were predicted to be in this region; that near-isogenic lines (NIL110, NIL121) in which the QTL (qAC2) of "Soraiku 162" was introduced into the genetic background of the cultivar "Itadaki" had a reduced amylose content and the surface layer of cooked rice was sticky; and that in the near-isogenic lines in which the QTL (qAC2) of "Soraiku 162" was introduced into the genetic background of "Itadaki," the amylose content was significantly reduced at low temperatures, which was due to the suppression of GBSSI expression at low temperatures. These results suggested that the qAC2 region is one of the factors that control GBSSI expression, and that its function is more pronounced under low temperatures.
したがって、本発明は、低アミロース形質に関与する変異遺伝子を明らかにし、低アミロース形質のイネ及びその作出方法を提供することを目的とする。また本発明は、かかる変異遺伝子及びそれによりコードされる変異タンパク質を提供することを目的とする。 Therefore, the present invention aims to identify mutant genes involved in low amylose traits and to provide rice with low amylose traits and a method for producing the same. The present invention also aims to provide such mutant genes and mutant proteins encoded thereby.
本発明者らは、上記課題を解決するために検討を行った結果、空育162号では低アミロース形質に関与するSART-1タンパク質に変異があったことから（SART-1タンパク質の56位から63位におけるグルタミン酸及びリジン（EK）の4回反復配列中に、EKの反復数が1回増加する挿入変異、586位におけるメチオニンがスレオニンに置換する変異、及び745位におけるセリンがシステインに置換する変異）、コシヒカリの突然変異系統においてSART-1タンパク質に変異を有する系統を選抜し、そのアミロース含有率を調べたところ、低アミロース形質に関わるSART-1タンパク質の変異を新たに同定した。この変異を含むSART-1タンパク質を有するイネは、低アミロース形質を有すると考えられることから、この変異を利用することにより、低アミロース形質のイネを作出し、また低アミロース形質のイネを判定及び選抜することができるという知見も得た。本発明は上記知見に基づいて完成した。 As a result of investigations conducted by the present inventors to solve the above problems, it was found that there was a mutation in the SART-1 protein involved in the low amylose trait in Soraiku 162 (an insertion mutation in which the number of EK repeats is increased by one in the four-times repeat sequence of glutamic acid and lysine (EK) at positions 56 to 63 of the SART-1 protein, a mutation in which methionine at position 586 is replaced by threonine, and a mutation in which serine at position 745 is replaced by cysteine), and a line having a mutation in the SART-1 protein was selected from mutant lines of Koshihikari and its amylose content was examined, resulting in the identification of a new mutation in the SART-1 protein involved in the low amylose trait. Since rice having a SART-1 protein containing this mutation is considered to have a low amylose trait, it was also found that by utilizing this mutation, rice with a low amylose trait can be produced, and rice with a low amylose trait can be determined and selected. The present invention was completed based on the above findings.
本発明は、例えば以下の実施形態を包含する：
［１］SART-1タンパク質に以下の（a）及び（b）の変異のうち少なくとも1つの変異をホモ接合性又はヘテロ接合性で有することを特徴とするイネ植物又はその植物部分。
（a）配列番号5に示されるアミノ酸配列の562位に相当する位置におけるプロリンの、セリン、スレオニン、アスパラギン、システイン、グルタミン及びチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸への置換、
（b）配列番号5に示されるアミノ酸配列の696位に相当する位置におけるプロリンの、セリン、スレオニン、アスパラギン、システイン、グルタミン及びチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸への置換。
［２］配列番号5に示されるアミノ酸配列の562位に相当する位置におけるプロリンのセリンへの置換を有する、［１］に記載のイネ植物又はその植物部分。
［３］配列番号5に示されるアミノ酸配列の696位に相当する位置におけるプロリンのセリンへの置換を有する、［１］に記載のイネ植物又はその植物部分。
［４］以下の（c）及び（d）の変異：
（c）配列番号6に示される塩基配列の1684番に相当する位置におけるシトシン（C）からチミン（T）への変異、
（d）配列番号6に示される塩基配列の2086番に相当する位置におけるシトシン（C）からチミン（T）への変異
のうち少なくとも1つの変異をホモ接合性又はヘテロ接合性で有する、［１］～［３］のいずれかに記載のイネ植物又はその植物部分。
［５］イネ植物が、うるち米品種のイネである、［１］～［４］のいずれかに記載のイネ植物又はその植物部分。
［６］うるち米品種のイネが、コシヒカリ、ひとめぼれ、ヒノヒカリ、あきたこまち、ななつぼし、はえぬき、まっしぐら、キヌヒカリ、あさひの夢、ゆめぴりか、きぬむすめ、こしいぶき、つや姫、夢つくし、ふさこがね、つがるロマン、あいちのかおり、彩のかがやき、天のつぶ、及びきらら397からなる群より選択される少なくとも1つのうるち米品種のイネである、［５］に記載のイネ植物又はその植物部分。
［７］植物部分が、イネ植物の苗、根、種子、及び植物部分の加工物からなる群より選択される少なくとも1つである、［１］～［６］のいずれかに記載のイネ植物又はその植物部分。
The present invention includes, for example, the following embodiments:
[1] A rice plant or a part thereof, characterized in that it has at least one of the following mutations (a) and (b) in the SART-1 protein in a homozygous or heterozygous state:
(a) substitution of proline at a position corresponding to position 562 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:5 with one amino acid selected from the group consisting of serine, threonine, asparagine, cysteine, glutamine, and tyrosine;
(b) Substitution of proline at a position corresponding to position 696 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:5 with one amino acid selected from the group consisting of serine, threonine, asparagine, cysteine, glutamine and tyrosine.
[2] The rice plant or plant part thereof according to [1], which has a proline to serine substitution at the position corresponding to position 562 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:5.
[3] The rice plant or plant part thereof according to [1], which has a proline to serine substitution at the position corresponding to position 696 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:5.
[4] The following mutations (c) and (d):
(c) a mutation from cytosine (C) to thymine (T) at the position corresponding to base 1684 of the base sequence shown in SEQ ID NO:6;
(d) A rice plant or a plant part thereof according to any one of [1] to [3], which has at least one mutation from cytosine (C) to thymine (T) at the position corresponding to 2086 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 in a homozygous or heterozygous manner.
[5] The rice plant or plant part thereof according to any one of [1] to [4], wherein the rice plant is a non-glutinous rice variety.
[6] The rice plant or plant part thereof according to [5], wherein the rice variety is at least one rice variety selected from the group consisting of Koshihikari, Hitomebore, Hinohikari, Akitakomachi, Nanatsuboshi, Haenuki, Masshigura, Kinuhikari, Asahi no Yume, Yumepirika, Kinumusume, Koshiibuki, Tsuyahime, Yumetsukushi, Fusakogane, Tsugaru Roman, Aichi no Kaori, Irodori no Kagayaki, Amanotsubu, and Kirara 397.
[7] The rice plant or its plant part according to any one of [1] to [6], wherein the plant part is at least one selected from the group consisting of seedlings, roots, seeds, and processed plant parts of rice plants.
［８］低アミロース形質のイネ植物を作出する方法であって、
イネ植物においてSART-1タンパク質をコードする遺伝子に以下の（a）及び（b）：
（a）配列番号5に示されるアミノ酸配列の562位に相当する位置におけるプロリンの、セリン、スレオニン、アスパラギン、システイン、グルタミン及びチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸への置換、
（b）配列番号5に示されるアミノ酸配列の696位に相当する位置におけるプロリンの、セリン、スレオニン、アスパラギン、システイン、グルタミン及びチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸への置換
の少なくとも1つの変異を導入するステップと、
得られたイネ植物の種子におけるアミロース含有率又はアミロース含有量を測定するステップと
を含む方法。
［９］SART-1タンパク質をコードする遺伝子に以下の（c）及び（d）：
（c）配列番号6に示される塩基配列の1684番に相当する位置におけるシトシン（C）からチミン（T）への変異、
（d）配列番号6に示される塩基配列の2086番に相当する位置におけるシトシン（C）からチミン（T）への変異
の少なくとも1つの変異を導入する、［８］に記載の方法。
［１０］イネ植物が、うるち米品種のイネである、［８］又は［９］に記載の方法。
［１１］うるち米品種のイネが、コシヒカリ、ひとめぼれ、ヒノヒカリ、あきたこまち、ななつぼし、はえぬき、まっしぐら、キヌヒカリ、あさひの夢、ゆめぴりか、きぬむすめ、こしいぶき、つや姫、夢つくし、ふさこがね、つがるロマン、あいちのかおり、彩のかがやき、天のつぶ、及びきらら397からなる群より選択される少なくとも1つのうるち米品種のイネである、［１０］に記載の方法。
[8] A method for producing a rice plant having a low amylose trait, comprising the steps of:
In rice plants, the gene encoding the SART-1 protein has the following (a) and (b):
(a) substitution of proline at a position corresponding to position 562 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:5 with one amino acid selected from the group consisting of serine, threonine, asparagine, cysteine, glutamine, and tyrosine;
(b) introducing at least one mutation at a position corresponding to position 696 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:5, substituting a proline with one amino acid selected from the group consisting of serine, threonine, asparagine, cysteine, glutamine, and tyrosine;
and measuring the amylose content or amylose content in seeds of the resulting rice plant.
[9] The gene encoding the SART-1 protein contains the following (c) and (d):
(c) a mutation from cytosine (C) to thymine (T) at the position corresponding to base 1684 of the base sequence shown in SEQ ID NO:6;
(d) the method according to [8], further comprising introducing at least one mutation from cytosine (C) to thymine (T) at the position corresponding to base 2086 of the base sequence shown in SEQ ID NO:6.
[10] The method according to [8] or [9], wherein the rice plant is a non-glutinous rice variety.
[11] The method according to [10], wherein the non-glutinous rice variety is at least one non-glutinous rice variety selected from the group consisting of Koshihikari, Hitomebore, Hinohikari, Akitakomachi, Nanatsuboshi, Haenuki, Masshigura, Kinuhikari, Asahi no Yume, Yumepirika, Kinumusume, Koshiibuki, Tsuyahime, Yumetsukushi, Fusakogane, Tsugaru Roman, Aichi no Kaori, Irodori no Kagayaki, Amanotsubu, and Kirara 397.
［１２］低アミロース形質のイネを判定又は選抜する方法であって、
対象のイネが、変異型SART-1タンパク質をコードする遺伝子を有するか否かを検出するステップを含み、
前記変異型SART-1タンパク質が、以下：
（a）配列番号5に示されるアミノ酸配列の562位に相当する位置におけるプロリンの、セリン、スレオニン、アスパラギン、システイン、グルタミン及びチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸への置換、並びに
（b）配列番号5に示されるアミノ酸配列の696位に相当する位置におけるプロリンの、セリン、スレオニン、アスパラギン、システイン、グルタミン及びチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸への置換
からなる群より選択される少なくとも1つの変異を含むものである、方法。
［１３］前記変異型SART-1タンパク質が、以下の（c）及び（d）の変異：
（c）配列番号6に示される塩基配列の1684番に相当する位置におけるシトシン（C）からチミン（T）への変異、
（d）配列番号6に示される塩基配列の2086番に相当する位置におけるシトシン（C）からチミン（T）への変異
のうち少なくとも1つの変異を含む遺伝子によってコードされる、［１２］に記載の方法。
［１４］前記変異型SART-1タンパク質をコードする遺伝子の検出が、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ハイブリダイゼーション、又は配列決定法を用いて行われる、［１２］又は［１３］に記載の方法。
［１５］前記変異型SART-1タンパク質をコードする遺伝子の検出が、以下のプライマーセット：
（i）配列番号4の1番から3549番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも10塩基からなるGC含量30%以上かつアニーリング温度（Tm値）50℃以上のプライマー、及び配列番号4の3551番から5501番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも10塩基からなるGC含量30%以上かつアニーリング温度（Tm値）50℃以上のプライマーを含むプライマーセット、あるいは
（ii）配列番号4の1番から4195番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも10塩基からなるGC含量30%以上かつアニーリング温度（Tm値）50℃以上のプライマー、及び配列番号4の4197番から5501番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも10塩基からなるGC含量30%以上かつアニーリング温度（Tm値）50℃以上のプライマーを含むプライマーセット
を使用したPCRにより行われる、［１４］に記載の方法。
［１６］前記変異型SART-1タンパク質をコードする遺伝子の検出が、配列番号1又は3に示される塩基配列を有するプライマー及び配列番号2に示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーセットを使用したPCRにより行われる、［１４］に記載の方法。
[12] A method for determining or selecting rice having a low amylose trait, comprising the steps of:
The method includes a step of detecting whether or not a target rice plant has a gene encoding a mutant SART-1 protein,
The mutant SART-1 protein is
The method includes at least one mutation selected from the group consisting of: (a) substitution of proline at a position corresponding to position 562 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:5 with one amino acid selected from the group consisting of serine, threonine, asparagine, cysteine, glutamine, and tyrosine; and (b) substitution of proline at a position corresponding to position 696 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:5 with one amino acid selected from the group consisting of serine, threonine, asparagine, cysteine, glutamine, and tyrosine.
[13] The mutant SART-1 protein has the following mutations (c) and (d):
(c) a mutation from cytosine (C) to thymine (T) at the position corresponding to base 1684 of the base sequence shown in SEQ ID NO:6;
(d) the method according to [12], wherein the nucleic acid sequence is encoded by a gene containing at least one mutation from cytosine (C) to thymine (T) at the position corresponding to 2086 in the base sequence shown in SEQ ID NO:6.
[14] The method according to [12] or [13], wherein the detection of the gene encoding the mutant SART-1 protein is carried out using polymerase chain reaction (PCR), hybridization, or sequencing.
[15] The detection of the gene encoding the mutant SART-1 protein is performed using the following primer set:
The method according to [14], which is carried out by PCR using a primer set including: (i) a primer consisting of at least 10 consecutive bases in the nucleotide sequence from 1 to 3549 of SEQ ID NO: 4 or its complementary sequence, and having a GC content of 30% or more and an annealing temperature (Tm value) of 50°C or more; and a primer consisting of at least 10 consecutive bases in the nucleotide sequence from 3551 to 5501 of SEQ ID NO: 4 or its complementary sequence, and having a GC content of 30% or more and an annealing temperature (Tm value) of 50°C or more; or (ii) a primer set including a primer consisting of at least 10 consecutive bases in the nucleotide sequence from 1 to 4195 of SEQ ID NO: 4 or its complementary sequence, and having a GC content of 30% or more and an annealing temperature (Tm value) of 50°C or more; and a primer consisting of at least 10 consecutive bases in the nucleotide sequence from 4197 to 5501 of SEQ ID NO: 4 or its complementary sequence, and having a GC content of 30% or more and an annealing temperature (Tm value) of 50°C or more.
[16] The method described in [14], in which the detection of the gene encoding the mutant SART-1 protein is carried out by PCR using a primer set including a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3 and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
［１７］以下のプライマーセットを含むことを特徴とする低アミロース形質のイネの判定又は選別用キット。
（i）配列番号4の1番から3549番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも10塩基からなるGC含量30%以上かつアニーリング温度（Tm値）50℃以上のプライマー、及び配列番号4の3551番から5501番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも10塩基からなるGC含量30%以上かつアニーリング温度（Tm値）50℃以上のプライマーを含むプライマーセット、あるいは
（ii）配列番号4の1番から4195番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも10塩基からなるGC含量30%以上かつアニーリング温度（Tm値）50℃以上のプライマー、及び配列番号4の4197番から5501番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも10塩基からなるGC含量30%以上かつアニーリング温度（Tm値）50℃以上のプライマーを含むプライマーセット。
[17] A kit for identifying or selecting rice having a low amylose trait, comprising the following primer set:
(i) a primer set comprising a primer consisting of at least 10 consecutive bases from the nucleotide sequence of 1 to 3549 of SEQ ID NO: 4 or its complementary sequence, having a GC content of 30% or more and an annealing temperature (Tm value) of 50°C or more, and a primer consisting of at least 10 consecutive bases from the nucleotide sequence of 3551 to 5501 of SEQ ID NO: 4 or its complementary sequence, having a GC content of 30% or more and an annealing temperature (Tm value) of 50°C or more; or (ii) a primer set comprising a primer consisting of at least 10 consecutive bases from the nucleotide sequence of 1 to 4195 of SEQ ID NO: 4 or its complementary sequence, having a GC content of 30% or more and an annealing temperature (Tm value) of 50°C or more, and a primer consisting of at least 10 consecutive bases from the nucleotide sequence of 4197 to 5501 of SEQ ID NO: 4 or its complementary sequence, having a GC content of 30% or more and an annealing temperature (Tm value) of 50°C or more.
［１８］配列番号1又は3に示される塩基配列を有するプライマー及び配列番号2に示される塩基配列を有するプライマーを含むことを特徴とする低アミロース形質のイネの判定又は選別用キット。
［１８－２］配列番号1に示される塩基配列を有するプライマー、配列番号2に示される塩基配列を有するプライマー、及び配列番号3に示される塩基配列を有するプライマーを含むことを特徴とする低アミロース形質のイネの判定又は選別用キット。
[18] A kit for identifying or selecting rice having a low amylose trait, comprising a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3 and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
[18-2] A kit for identifying or selecting rice with low amylose traits, comprising a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
本発明により、低アミロース形質のイネ植物及びその植物部分を作出することが可能となる。また本発明により、対象のイネが低アミロース形質を有するか否かを簡便かつ高精度に判定し、選別することが可能となる。本発明に係る変異型SART-1タンパク質及び変異型SART-1遺伝子は炊飯米物性を大きく損ねることなく水稲品種の食味を向上できる可能性があり、今後の良食味品種育成のための有効な遺伝子資源となりうる。 The present invention makes it possible to produce rice plants and plant parts thereof with low amylose traits. Furthermore, the present invention makes it possible to easily and highly accurately determine whether or not a target rice plant has low amylose traits, and to select it. The mutant SART-1 protein and mutant SART-1 gene of the present invention have the potential to improve the eating quality of rice varieties without significantly impairing the physical properties of cooked rice, and may become an effective genetic resource for the future development of varieties with good eating quality.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、イネの種子中のアミロース含有率に関与するタンパク質（SART-1）について、低アミロース形質に関与するSART-1タンパク質中の新たな変異を同定したことに基づく。SART-1は、アミロースを合成するデンプン粒結合型デンプン合成酵素（GBSSI）がDNAからRNAに転写する際に必要となるスプライセオソームの構成成分の1つである。SART-1は既報の低アミロース性遺伝子（GBSSIの機能低下型アリルなど）と比較して、そのアミロース低減効果が緩やかであり、約1～2％程度である。そのため、この低アミロース形質に関わる変異型は炊飯米物性を大きく損ねることなく水稲品種の食味を向上できる可能性がある。また、近年栽培環境の高温化により、アミロース含有率が低下して品質及び食味の低下が懸念されているが、SART-1は登熟気温によるアミロース含有率の変動が小さい効果を持つ。特に、低温条件下において強い遺伝子効果を示し、アミロース含有率を低下させやすい機能を持つ（例えば、実施例１）。このような特徴を示すタンパク質及び遺伝子は、今後の良食味品種育成のための有効な遺伝子資源となりうる。
The present invention will be described in detail below.
The present invention is based on the identification of a new mutation in the SART-1 protein (SART-1) involved in the amylose content in rice seeds, which is involved in the low amylose trait. SART-1 is one of the components of the spliceosome that is required when starch granule-bound starch synthase (GBSSI), which synthesizes amylose, transcribes DNA to RNA. Compared to previously reported low amylose genes (such as GBSSI function-decreasing alleles), SART-1 has a gentle amylose reduction effect of about 1 to 2%. Therefore, this mutant type involved in the low amylose trait may be able to improve the taste of rice varieties without significantly impairing the physical properties of cooked rice. In addition, in recent years, there has been concern about a decrease in amylose content due to the increase in temperature in the cultivation environment, which has led to a decrease in quality and taste, but SART-1 has the effect of reducing the fluctuation in amylose content due to the temperature during ripening. In particular, it exhibits a strong genetic effect under low temperature conditions and has the function of easily reducing the amylose content (for example, Example 1). Proteins and genes exhibiting such characteristics can be effective genetic resources for the future development of varieties with good taste.
したがって、本発明は、低アミロース形質に関与する変異型SART-1タンパク質及びこれをコードする遺伝子、並びにこれらの用途に関する。 Therefore, the present invention relates to a mutant SART-1 protein involved in low amylose traits and a gene encoding the same, as well as uses thereof.
１．変異型SART-1タンパク質及びこれをコードする遺伝子
本発明は、イネの低アミロース形質に関与する変異型SART-1タンパク質及びこれをコードする遺伝子に関する。本発明に係る変異型SART-1タンパク質は、野生型SART-1タンパク質のアミノ酸配列（配列番号5）を基準とした場合に、以下の変異のうちの少なくとも1つを含む：
（a）配列番号5に示されるアミノ酸配列の562位に相当する位置におけるプロリンの、セリン、スレオニン、アスパラギン、システイン、グルタミン及びチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸、特にセリンへの置換、
（b）配列番号5に示されるアミノ酸配列の696位に相当する位置におけるプロリンの、セリン、スレオニン、アスパラギン、システイン、グルタミン及びチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸、特にセリンへの置換。
1. Mutant SART-1 Protein and Gene Encoding the Same The present invention relates to a mutant SART-1 protein involved in the low amylose trait of rice and a gene encoding the same. The mutant SART-1 protein of the present invention contains at least one of the following mutations based on the amino acid sequence of the wild-type SART-1 protein (SEQ ID NO: 5):
(a) substitution of proline at the position corresponding to position 562 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:5 with one amino acid selected from the group consisting of serine, threonine, asparagine, cysteine, glutamine and tyrosine, in particular serine;
(b) Substitution of proline at a position corresponding to position 696 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:5 with one amino acid selected from the group consisting of serine, threonine, asparagine, cysteine, glutamine and tyrosine, particularly serine.
一実施形態において、変異型SART-1タンパク質は、野生型SART-1タンパク質をコードする塩基配列（配列番号6）を基準とした場合に、以下からなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む遺伝子によってコードされる：
（c）配列番号6に示されるSART-1遺伝子の1684番に相当する位置におけるシトシン（C）からチミン（T）への変異（又は、配列番号4に示される塩基配列の3550番に相当する位置におけるCからTへの変異）、
（d）配列番号6に示されるSART-1遺伝子の2086番に相当する位置におけるシトシン（C）からチミン（T）への変異（又は、配列番号4に示される塩基配列の4196番に相当する位置におけるCからTへの変異）。
In one embodiment, the mutant SART-1 protein is encoded by a gene containing at least one mutation selected from the group consisting of the following, based on the base sequence encoding the wild-type SART-1 protein (SEQ ID NO: 6):
(c) a mutation from cytosine (C) to thymine (T) at a position corresponding to base 1684 of the SART-1 gene shown in SEQ ID NO: 6 (or a mutation from C to T at a position corresponding to base 3550 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4),
(d) a mutation from cytosine (C) to thymine (T) at the position corresponding to position 2086 of the SART-1 gene shown in SEQ ID NO: 6 (or a mutation from C to T at the position corresponding to position 4196 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4).
本明細書では、野生型SART-1タンパク質又はSART-1遺伝子として、いただき由来のSART-1タンパク質（配列番号5）又はSART-1遺伝子（配列番号6）を基準として説明しているが、他のイネ品種由来の相同SART-1タンパク質及びSART-1遺伝子が存在することは当技術分野で公知である。例えば、KAF2944985.1、XP_015626546.1、KAF2944986.1、BAS78863.1、BAD23085.1、KAB8096970.1、BAS91044.1、CAJ86132.1、EEC78021.1、XP_015626544.1、EAY86008.1などが公知あり、いずれもGenBank、UniProtなどのデータベースから配列情報を入手することができる。このような相同タンパク質及び相同遺伝子も、本明細書に記載の変異のいずれか1つを有する限り、変異型SART-1タンパク質及びSART-1遺伝子として同等に使用することができる。相同タンパク質及び相同遺伝子は、野生型タンパク質及び遺伝子と配列相同性を有するものであり、本明細書において記載する「相当する位置」とは、野生型タンパク質又は遺伝子のある位置に対応する相同タンパク質又は遺伝子の位置を指し、当技術分野で公知の手法に従って容易に決定することができる。 In this specification, the wild-type SART-1 protein or SART-1 gene is described based on the SART-1 protein (SEQ ID NO: 5) or SART-1 gene (SEQ ID NO: 6) derived from Itadaki, but it is known in the art that there are homologous SART-1 proteins and SART-1 genes derived from other rice varieties. For example, KAF2944985.1, XP_015626546.1, KAF2944986.1, BAS78863.1, BAD23085.1, KAB8096970.1, BAS91044.1, CAJ86132.1, EEC78021.1, XP_015626544.1, EAY86008.1, etc. are known, and sequence information for all of them can be obtained from databases such as GenBank and UniProt. Such homologous proteins and genes can be used equivalently as mutant SART-1 proteins and SART-1 genes, so long as they have any one of the mutations described herein. Homologous proteins and genes have sequence homology with wild-type proteins and genes, and the "corresponding position" described herein refers to the position of the homologous protein or gene that corresponds to a certain position of the wild-type protein or gene, and can be easily determined according to techniques known in the art.
なお、変異型SART-1タンパク質は、上記の変異の少なくとも1つを含み、イネの低アミロース形質に関与する限り、そのアミノ酸配列において複数個、好ましくは1若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。例えば、配列番号5に示されるアミノ酸配列の1～10個、好ましくは1～5個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号5に示されるアミノ酸配列に1～10個、好ましくは1～5個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号5に示されるアミノ酸配列の1～10個、好ましくは1～5個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。上記アミノ酸の欠失、付加及び置換は、上記ポリペプチドをコードするDNAを、当該技術分野で公知の手法によって、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K（TAKARA社製）やMutant-G（TAKARA社製））などを用いて、改変することによって行うことができる。 In addition, as long as the mutant SART-1 protein contains at least one of the above mutations and is involved in the low amylose trait of rice, the amino acid sequence may have multiple, preferably one or several, amino acid deletions, substitutions, additions, or other mutations. For example, 1 to 10, preferably 1 to 5 amino acids may be deleted from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, 1 to 10, preferably 1 to 5 amino acids may be added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, or 1 to 10, preferably 1 to 5 amino acids may be substituted with other amino acids from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5. The above amino acid deletions, additions, and substitutions can be performed by modifying the DNA encoding the polypeptide by a method known in the art, for example, using a mutation introduction kit using site-directed mutagenesis (e.g., Mutant-K (manufactured by TAKARA) or Mutant-G (manufactured by TAKARA)).
また例えば、変異型SART-1タンパク質のアミノ酸配列に対し、少なくとも70％、好ましくは80％、特に好ましくは90％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むタンパク質もまた、上記の変異の少なくとも1つを含み、イネの低アミロース形質に関与する限り、本発明において用いることができる。なお、アミノ酸配列の同一性は、当技術分野で公知の方法により容易に求めることができる。 For example, a protein containing an amino acid sequence that shows at least 70%, preferably 80%, and particularly preferably 90% sequence identity to the amino acid sequence of the mutant SART-1 protein can also be used in the present invention, so long as it contains at least one of the above mutations and is involved in the low amylose trait of rice. Note that the identity of the amino acid sequence can be easily determined by methods known in the art.
ここで、「イネの低アミロース形質に関与する」とは、イネの種子におけるアミロース含有率を低下させる形質に関与することを指し、具体的には、イネの種子におけるアミロース含有率を約5～15％に低下させる形質である。これは、当技術分野で公知の方法により確認することができ、例えば、あるタンパク質又は遺伝子をイネにおいて発現させ、得られるイネの種子のアミロース含有率又は含有量を測定することにより、そのタンパク質又は遺伝子が「イネの低アミロース形質に関与する」か否かを確認することができる。アミロース含有率又はアミロース含有量の測定は、当技術分野で慣用的な方法により実施することができ、そのような方法として、例えばヨウ素呈色反応に基づく2波長測定法が挙げられる。 Here, "involved in the low amylose trait of rice" refers to being involved in a trait that reduces the amylose content in rice seeds, specifically, a trait that reduces the amylose content in rice seeds to about 5-15%. This can be confirmed by methods known in the art, for example, by expressing a certain protein or gene in rice and measuring the amylose content or amount in the resulting rice seeds, it can be confirmed whether the protein or gene is "involved in the low amylose trait of rice." The amylose content or amount can be measured by methods conventional in the art, such as a two-wavelength measurement method based on an iodine color reaction.
上記の変異型SART-1タンパク質は、この変異型SART-1タンパク質を有することがわかっているイネ植物又はその細胞などから単離・精製して入手してもよいし、あるいは対応するタンパク質をコードする核酸を用いて宿主を形質転換し、該宿主において発現されるタンパク質を回収することにより生成することができる。 The mutant SART-1 protein may be obtained by isolating and purifying it from a rice plant or cells thereof that are known to have the mutant SART-1 protein, or may be produced by transforming a host with a nucleic acid encoding the corresponding protein and recovering the protein expressed in the host.
変異型SART-1タンパク質をコードする核酸は、上述した変異型SART-1タンパク質をコードするものである。かかる核酸は、変異型SART-1タンパク質を有することがわかっているイネ植物又はその細胞より抽出したRNAから精製したmRNAを用いて、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）又はcDNAライブラリーからのスクリーニングにより得ることができる。組織又は細胞からのmRNAの抽出及びcDNAライブラリーの作製は常法に従って行うことができる。あるいは、変異型SART-1タンパク質を発現する細胞又は組織から調製したDNAを鋳型として、変異型SART-1タンパク質をコードする核酸の塩基配列に基づいて設計したプライマーセットを用いて核酸増幅反応（例えばPCRなど）を行うことにより、所望の核酸を得ることができる。得られたcDNAが目的の配列を含む核酸であるか否かは、塩基配列を決定することにより確認することができる。 The nucleic acid encoding the mutant SART-1 protein encodes the mutant SART-1 protein described above. Such a nucleic acid can be obtained by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) or screening from a cDNA library using mRNA purified from RNA extracted from a rice plant or its cells that are known to have a mutant SART-1 protein. Extraction of mRNA from tissues or cells and preparation of a cDNA library can be performed according to conventional methods. Alternatively, a desired nucleic acid can be obtained by performing a nucleic acid amplification reaction (e.g., PCR) using a primer set designed based on the base sequence of the nucleic acid encoding the mutant SART-1 protein, using DNA prepared from cells or tissues expressing the mutant SART-1 protein as a template. Whether or not the obtained cDNA is a nucleic acid containing the desired sequence can be confirmed by determining the base sequence.
また本発明においては、変異型SART-1タンパク質をコードする塩基配列からなる核酸の全部又は一部の配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、低アミロース形質に関与するタンパク質をコードする核酸も用いることができる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、高い相同性（相同性が80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上）を有するポリヌクレオチドがハイブリダイズする条件をいい、当業者であれば慣用的に設定することが可能である。 In addition, in the present invention, a nucleic acid can also be used that hybridizes under stringent conditions with a sequence complementary to all or a part of a nucleic acid consisting of a base sequence encoding a mutant SART-1 protein and that encodes a protein involved in low amylose traits. Stringent conditions refer to conditions under which a specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. For example, stringent conditions refer to conditions under which polynucleotides with high homology (homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more) hybridize, and can be routinely set by a person skilled in the art.
また、低アミロース形質に関与するタンパク質をコードする限り、変異型SART-1タンパク質をコードする核酸の断片もまた本発明において使用することができる。例えば、上記変異のうち少なくとも1つの変異を含み、末端切断型の核酸断片が挙げられる。 Fragments of nucleic acids encoding mutant SART-1 proteins can also be used in the present invention, so long as they encode proteins involved in the low amylose trait. For example, nucleic acid fragments that contain at least one of the above mutations and are truncated.
本発明において「核酸」とは、DNA又はRNA（例えばmRNA）のいずれであってもよいし、DNA及びRNAのハイブリッド核酸、人工核酸であってもよい。 In the present invention, "nucleic acid" may be either DNA or RNA (e.g., mRNA), or may be a hybrid nucleic acid of DNA and RNA, or an artificial nucleic acid.
変異型SART-1タンパク質をコードする核酸は、化学合成によって、又はクローニングされたcDNAを鋳型としたPCRによって、あるいはその塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって取得することができる。 Nucleic acids encoding mutant SART-1 proteins can be obtained by chemical synthesis, by PCR using cloned cDNA as a template, or by hybridization of a DNA fragment having the nucleotide sequence as a probe.
２．低アミロース形質のイネ植物及びその作出
上述した変異型SART-1タンパク質又は変異型SART-1遺伝子は、イネの種子における低アミロース形質に関与するものである。したがって、上述した変異型SART-1タンパク質又は変異型SART-1遺伝子の少なくとも1つの変異をイネ植物に導入することによって、低アミロース形質のイネ植物を作出することができる。
2. Rice plants with low amylose content and their production The mutant SART-1 protein or mutant SART-1 gene described above is involved in the low amylose content of rice seeds. Therefore, by introducing at least one mutation of the mutant SART-1 protein or mutant SART-1 gene described above into a rice plant, a rice plant with low amylose content can be produced.
したがって、一態様において、本発明は、低アミロース形質のイネ植物を作出する方法であって、
イネ植物においてSART-1タンパク質をコードする遺伝子に以下の（a）及び（b）：
（a）配列番号5に示されるアミノ酸配列の562位に相当する位置におけるプロリンの、セリン、スレオニン、アスパラギン、システイン、グルタミン及びチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸への置換、
（b）配列番号5に示されるアミノ酸配列の696位に相当する位置におけるプロリンの、セリン、スレオニン、アスパラギン、システイン、グルタミン及びチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸への置換
の少なくとも1つの変異を導入するステップと、
得られたイネ植物の種子におけるアミロース含有率又はアミロース含有量を測定するステップと
を含む方法に関する。
Thus, in one aspect, the present invention provides a method of producing a rice plant with a low amylose trait, comprising the steps of:
In rice plants, the gene encoding the SART-1 protein contains the following (a) and (b):
(a) substitution of proline at a position corresponding to position 562 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:5 with one amino acid selected from the group consisting of serine, threonine, asparagine, cysteine, glutamine, and tyrosine;
(b) introducing at least one mutation at a position corresponding to position 696 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:5, substituting a proline with one amino acid selected from the group consisting of serine, threonine, asparagine, cysteine, glutamine, and tyrosine;
and measuring the amylose content or amylose content in seeds of the resulting rice plant.
好ましい実施形態では、SART-1タンパク質をコードする遺伝子に以下の（c）及び（d）の少なくとも1つの変異を導入する：
（c）配列番号6に示される塩基配列の1684番に相当する位置におけるシトシン（C）からチミン（T）への変異、
（d）配列番号6に示される塩基配列の2086番に相当する位置におけるシトシン（C）からチミン（T）への変異。
In a preferred embodiment, at least one of the following mutations (c) and (d) is introduced into the gene encoding the SART-1 protein:
(c) a mutation from cytosine (C) to thymine (T) at the position corresponding to base 1684 of the base sequence shown in SEQ ID NO:6;
(d) A mutation from cytosine (C) to thymine (T) at the position corresponding to base 2086 in the base sequence shown in SEQ ID NO:6.
イネ植物に特定の変異を導入する方法は、当技術分野で公知の遺伝子組換え方法を利用して行うことができる。例えば、組換えベクターを構築し、その組換えベクターをイネ植物に導入することによって、イネ植物に特定の変異を導入することができる。そのような組換えベクターは、変異型SART-1遺伝子を適当なベクターに挿入することによって構築できる。変異型遺伝子をイネ植物の細胞へ導入し、発現させるためのベクターとしては、pBI系のベクター、pUC系のベクター、pTRA系のベクターが好適に用いられる。pBI系及びpTRA系のベクターは、アグロバクテリウムを介して植物に目的遺伝子を導入することができる。pBI系のバイナリーベクター又は中間ベクター系が好適に用いられ、例えば、pBI121、pBI101、pBI101.2、pBI101.3等が挙げられる。pUC系のベクターは、植物に遺伝子を直接導入することができ、例えば、pUC18、pUC19、pUC9等が挙げられる。 A method for introducing a specific mutation into a rice plant can be carried out by using a gene recombination method known in the art. For example, a specific mutation can be introduced into a rice plant by constructing a recombinant vector and introducing the recombinant vector into the rice plant. Such a recombinant vector can be constructed by inserting a mutant SART-1 gene into an appropriate vector. As vectors for introducing and expressing a mutant gene into rice plant cells, pBI-based vectors, pUC-based vectors, and pTRA-based vectors are preferably used. pBI-based and pTRA-based vectors can introduce a target gene into a plant via Agrobacterium. A pBI-based binary vector or intermediate vector system is preferably used, such as pBI121, pBI101, pBI101.2, and pBI101.3. A pUC-based vector can directly introduce a gene into a plant, such as pUC18, pUC19, and pUC9.
ベクターに変異型SART-1遺伝子を挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。変異型SART-1遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、ベクターには、プロモーターのほか、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、5'-UTR配列、選択マーカー遺伝子などを連結することができる。 To insert a mutant SART-1 gene into a vector, a method is used in which the purified DNA is first cleaved with an appropriate restriction enzyme, and then inserted into a restriction enzyme site or a multicloning site of an appropriate vector DNA and ligated to the vector. The mutant SART-1 gene must be incorporated into the vector so that the gene's functions can be exerted. Therefore, in addition to a promoter, an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a 5'-UTR sequence, a selection marker gene, etc. can be ligated to the vector as desired.
「プロモーター」としては、植物細胞において機能し、植物の特定の組織（特に種子）内あるいは特定の発育段階において発現を導くことのできるDNAであれば、植物由来のものであってもよいし、植物由来のものでなくてもよい。「ターミネーター」は、前記プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であればよい。「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられる。「選択マーカー」は、形質転換体の選抜を容易にするために用いられ、例えばハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。 A "promoter" may be of plant or non-plant origin, so long as it functions in plant cells and is capable of inducing expression in specific plant tissues (particularly seeds) or at a specific developmental stage. A "terminator" may be any sequence capable of terminating the transcription of a gene transcribed by the promoter. An "enhancer" is used to increase the expression efficiency of a target gene. A "selection marker" is used to facilitate the selection of transformants, and examples of such a hygromycin resistance gene and neomycin resistance gene are included.
構築した組換えベクターを、変異型SART-1遺伝子の少なくとも1つの変異が自己の遺伝子中に組み込まれ、発現し得るように植物中に導入する。本発明において対象となるイネ植物としては、イネ科に属する植物、例えばイネ、オオムギ、コムギなどが挙げられるが、これらに限定はされない。イネの品種（例えばうるち米品種）も限定されるものではなく、例えばコシヒカリ、ひとめぼれ、ヒノヒカリ、あきたこまち、ななつぼし、はえぬき、まっしぐら、キヌヒカリ、あさひの夢、ゆめぴりか、きぬむすめ、こしいぶき、つや姫、夢つくし、ふさこがね、つがるロマン、あいちのかおり、彩のかがやき、天のつぶ、きらら397などが挙げられる。 The constructed recombinant vector is introduced into a plant so that at least one mutation of the mutant SART-1 gene is incorporated into the plant's own genes and can be expressed. Examples of rice plants that are the subject of the present invention include, but are not limited to, plants belonging to the Poaceae family, such as rice, barley, and wheat. The rice varieties (e.g., non-glutinous rice varieties) are also not limited, and examples include Koshihikari, Hitomebore, Hinohikari, Akitakomachi, Nanatsuboshi, Haenuki, Masshigura, Kinuhikari, Asahi no Yume, Yumepirika, Kinumusume, Koshiibuki, Tsuyahime, Yumetsukushi, Fusakogane, Tsugaru Roman, Aichi no Kaori, Iro no Kagayaki, Ten no Tsubu, and Kirara 397.
組換えベクターを導入する対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、根、種子等）、植物組織（例えば表皮、篩部、柔組織、木部、維管束等）又は植物培養細胞のいずれをも意味するものである。植物培養細胞を対象とする場合において、得られた形質転換細胞から形質転換体を再生させるためには既知の組織培養法により器官又は個体を再生させればよい。 The plant into which the recombinant vector is introduced refers to any of the whole plant, plant organs (e.g., leaves, roots, seeds, etc.), plant tissues (e.g., epidermis, phloem, parenchyma, xylem, vascular bundles, etc.), or cultured plant cells. When cultured plant cells are the target, in order to regenerate a transformant from the obtained transformed cells, the organ or individual may be regenerated by known tissue culture methods.
変異型SART-1遺伝子又は組換えベクターを植物中に導入する方法としては、アグロバクテリウム法、PEG-リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。例えばアグロバクテリウム法を用いる場合は、プロトプラストを用いる場合と組織片を用いる場合がある。プロトプラストを用いる場合は、Tiプラスミドをもつアグロバクテリウムと共存培養する方法、スフェロプラスト化したアグロバクテリウムと融合する方法（スフェロプラスト法）、組織片を用いる場合は、リーフディスクにより対象植物の無菌培養葉片に感染させる方法（リーフディスク法）やカルス（未分化培養細胞）に感染させる等により行うことができる。 Methods for introducing mutant SART-1 genes or recombinant vectors into plants include the Agrobacterium method, the PEG-calcium phosphate method, electroporation, liposome method, particle gun method, microinjection method, etc. For example, when using the Agrobacterium method, protoplasts or tissue fragments can be used. When using protoplasts, they can be co-cultured with Agrobacterium carrying a Ti plasmid or fused with spheroplasted Agrobacterium (spheroplast method). When using tissue fragments, they can be infected by a leaf disk into a sterile cultured leaf fragment of the target plant (leaf disk method) or by infecting callus (undifferentiated cultured cells).
あるいは、イネにランダム変異誘発を行って、SART-1タンパク質をコードする遺伝子に上記変異のうち少なくとも1つの変異を導入してもよい。そのようなランダム変異誘発として、公知の変異誘発原（例えば、紫外線、放射線、重イオンビーム、化学変異原など）による処理が挙げられる。 Alternatively, at least one of the above mutations may be introduced into the gene encoding the SART-1 protein by random mutagenesis in rice. Such random mutagenesis may be performed by treatment with a known mutagen (e.g., ultraviolet light, radiation, heavy ion beam, chemical mutagen, etc.).
目的の遺伝子が植物に組み込まれたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換植物からDNAを調製し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。PCRを行った後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物を1本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法でもよい。 Whether or not the target gene has been incorporated into the plant can be confirmed by PCR, Southern hybridization, Northern hybridization, etc. For example, DNA is prepared from the transformed plant, DNA-specific primers are designed, and PCR is performed. After PCR, the amplified product is subjected to agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, capillary electrophoresis, etc., and stained with ethidium bromide, SYBR Green solution, etc., and the amplified product is detected as a single band, thereby confirming that the plant has been transformed. PCR can also be performed using primers that have been labeled in advance with a fluorescent dye, etc. to detect the amplified product. Furthermore, the amplified product may be bound to a solid phase such as a microplate, and the amplified product may be confirmed by a fluorescent or enzyme reaction, etc.
続いて、得られたイネ植物が低アミロース形質を有するか否かを確認する。すなわち、得られたイネ植物の種子におけるアミロース含有率又はアミロース含有量を測定する。アミロース含有率又はアミロース含有量の測定は、当技術分野で慣用的な方法により実施することができ、そのような方法として、ヨウ素呈色比色法があり、例えばモーターミル等によって粉砕した精白米粉を水酸化ナトリウム水溶液等により糊化させた後に、ビーエルテック社製の米・麦アミロース測定装置AA3を用いて測定する方法や、糊化したサンプルにヨウ素ヨウ化カリウム液を加え、分光光度計を用いて680nmの呈色度を測定する方法が挙げられる。また、熱DMSO等により完全に糊化させた米粉サンプルより精製したアミロース画分を改良パーク・ジョンソン法で定量する方法や、Megazyme社製のアミロース/アミロペクチン分析キットを用いて定量する方法でもよい。 Next, it is confirmed whether the obtained rice plant has a low amylose trait. In other words, the amylose content or amylose content in the seeds of the obtained rice plant is measured. The amylose content or amylose content can be measured by a method conventional in the art, such as an iodine colorimetric method, in which polished rice flour ground by a motor mill or the like is gelatinized with an aqueous sodium hydroxide solution or the like, and then measured using a rice/wheat amylose measuring device AA3 manufactured by BL Tech Co., Ltd., or a method in which iodine potassium iodide solution is added to the gelatinized sample and the color intensity at 680 nm is measured using a spectrophotometer. In addition, a method in which an amylose fraction purified from a rice flour sample completely gelatinized with hot DMSO or the like is quantified by a modified Park-Johnson method, or a method using an amylose/amylopectin analysis kit manufactured by Megazyme Co., Ltd. may also be used.
上記のようにして得られるイネ植物は、種子における低アミロース形質を獲得する。すなわち、変異型SART-1遺伝子の少なくとも1つの変異を導入することにより、イネ植物に低アミロース形質を付与することができる。したがって、本発明により、従来は低アミロース形質ではなかった米品種、例えばコシヒカリなどにおいて低アミロース形質を付与することが可能となる。 The rice plant obtained as described above acquires a low amylose trait in its seeds. That is, by introducing at least one mutation in the mutant SART-1 gene, it is possible to impart a low amylose trait to a rice plant. Therefore, the present invention makes it possible to impart a low amylose trait to rice varieties that did not previously have a low amylose trait, such as Koshihikari.
一態様において、本発明は、SART-1タンパク質に以下の（a）及び（b）の変異：
（a）配列番号5に示されるアミノ酸配列の562位に相当する位置におけるプロリンの、セリン、スレオニン、アスパラギン、システイン、グルタミン及びチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸、特にセリンへの置換、
（b）配列番号5に示されるアミノ酸配列の696位に相当する位置におけるプロリンの、セリン、スレオニン、アスパラギン、システイン、グルタミン及びチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸、特にセリンへの置換
のうち少なくとも1つの変異をホモ接合性又はヘテロ接合性で有することを特徴とするイネ植物又はその植物部分に関する。
In one aspect, the present invention relates to a SART-1 protein comprising the following mutations (a) and (b):
(a) substitution of proline at the position corresponding to position 562 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:5 with one amino acid selected from the group consisting of serine, threonine, asparagine, cysteine, glutamine and tyrosine, in particular serine;
(b) a rice plant or a part thereof, characterized in that it has at least one mutation, in which proline at the position corresponding to position 696 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:5 is replaced with one amino acid selected from the group consisting of serine, threonine, asparagine, cysteine, glutamine and tyrosine, particularly serine, in a homozygous or heterozygous manner.
一実施形態において、イネ植物又はその植物部分は、以下の（c）及び（d）の変異：
（c）配列番号6に示される塩基配列の1684番に相当する位置におけるシトシン（C）からチミン（T）への変異、
（d）配列番号6に示される塩基配列の2086番に相当する位置におけるシトシン（C）からチミン（T）への変異
のうち少なくとも1つの変異をホモ接合性又はヘテロ接合性で有する。
In one embodiment, the rice plant or plant part thereof has the following mutations (c) and (d):
(c) a mutation from cytosine (C) to thymine (T) at the position corresponding to base 1684 of the base sequence shown in SEQ ID NO:6;
(d) having at least one mutation from cytosine (C) to thymine (T) at the position corresponding to 2086 of the base sequence shown in SEQ ID NO:6, either homozygous or heterozygous.
上述のように、変異型SART-1タンパク質を有するイネ植物又はその植物部分は、種子における低アミロース形質を有するものである。ここで、イネ植物は、低アミロース形質の獲得が望まれるイネ品種（例えばうるち米品種）であれば特に限定されるものではなく、コシヒカリ、ひとめぼれ、ヒノヒカリ、あきたこまち、ななつぼし、はえぬき、まっしぐら、キヌヒカリ、あさひの夢、ゆめぴりか、きぬむすめ、こしいぶき、つや姫、夢つくし、ふさこがね、つがるロマン、あいちのかおり、彩のかがやき、天のつぶ、きらら397などが挙げられる。また、植物部分は、イネ植物の部分であれば特に限定されるものではなく、苗、植物器官（例えば葉、根、種子等）、植物培養細胞、及び植物部分の加工物（例えば、精米、玄米、炊飯米、米粉、米加工品等）などが挙げられる。 As described above, the rice plant or plant part thereof having a mutant SART-1 protein has a low amylose trait in the seeds. Here, the rice plant is not particularly limited as long as it is a rice variety (e.g., a non-glutinous rice variety) for which it is desired to acquire a low amylose trait, and examples thereof include Koshihikari, Hitomebore, Hinohikari, Akitakomachi, Nanatsuboshi, Haenuki, Masshigura, Kinuhikari, Asahi no Yume, Yumepirika, Kinumusume, Koshiibuki, Tsuyahime, Yumetsukushi, Fusakogane, Tsugaru Roman, Aichi no Kaori, Iro no Kagayaki, Ten no Tsubu, and Kirara 397. In addition, the plant part is not particularly limited as long as it is a part of a rice plant, and examples thereof include seedlings, plant organs (e.g., leaves, roots, seeds, etc.), plant culture cells, and processed products of plant parts (e.g., polished rice, brown rice, cooked rice, rice flour, rice processed products, etc.).
３．低アミロース形質のイネの判定又は選抜
上述した変異型SART-1タンパク質又はそれをコードする遺伝子（変異型SART-1遺伝子）の変異を有するイネは、種子中のアミロース含有量が低下していると考えられることから、この変異を検出することにより、低アミロース形質のイネを判定又は選抜することができる。
3. Identification or Selection of Rice with Low Amylose Characteristic Rice having a mutation in the above-mentioned mutant SART-1 protein or the gene encoding it (mutant SART-1 gene) is considered to have a reduced amylose content in its seeds, and therefore, by detecting this mutation, it is possible to identify or select rice with low amylose characteristic trait.
本発明において判定又は選抜の対象となるイネは、低アミロース形質の有無について判定又は選抜しようとするイネ品種（例えばうるち米品種）であれば特に限定されるものではない。低アミロース米品種として公知の品種（例えば空育162号、国宝ローズ、きらら397、ゆきひかり、ほしのゆめ、ななつぼし、あきほ、ほしたろう、吟風、大地の星、ふっくりんこ、上育４４５号、彗星、はくちょうもち、風の子もち、あやひめ、彩、NM391、ミルキークイーン、おぼろづき、スノーパール、キタアケ、上育414号、道北47号、ゆめぴりか、及び北海287号）の低アミロース形質について確認してもよいし、低アミロース形質であるか否か不明のイネ品種について確認してもよい。また、遺伝子組換えイネ、突然変異誘発を行ったイネを、判定又は選抜の対象としてもよい。本発明により、特に緩やかなアミロース低減形質を有し、登熟気温によるアミロース含有率の変動が小さいイネが判定又は選抜される。 In the present invention, the rice to be judged or selected is not particularly limited as long as it is a rice variety (e.g., a non-glutinous rice variety) to be judged or selected for the presence or absence of a low amylose trait. The low amylose trait may be confirmed in varieties known as low amylose rice varieties (e.g., Soraiku 162, Kokuho Rose, Kirara 397, Yukihikari, Hoshino Yume, Nanatsuboshi, Akiho, Hoshitarou, Ginpu, Daichi no Hoshi, Fukkuriinko, Kamiiku 445, Suisei, Hakucho Mochi, Kazenoko Mochi, Ayahime, Irodori, NM391, Milky Queen, Oborozuki, Snow Pearl, Kitaake, Kamiiku 414, Dohoku 47, Yumepirika, and Hokkai 287), or in rice varieties whose low amylose trait is unknown. In addition, genetically modified rice and rice that has been subjected to mutation induction may be the subject of judgment or selection. The present invention allows the identification or selection of rice that has a particularly gradual amylose-reducing trait and has little variation in amylose content due to ripening temperature.
一態様において、本発明は、低アミロース形質のイネを判定又は選抜する方法であって、
対象のイネが、変異型SART-1タンパク質をコードする遺伝子を有するか否かを検出するステップを含み、
前記変異型SART-1タンパク質が、以下：
（a）配列番号5に示されるアミノ酸配列の562位に相当する位置におけるプロリンの、セリン、スレオニン、アスパラギン、システイン、グルタミン及びチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸への置換、並びに
（b）配列番号5に示されるアミノ酸配列の696位に相当する位置におけるプロリンの、セリン、スレオニン、アスパラギン、システイン、グルタミン及びチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸への置換
からなる群より選択される少なくとも1つの変異を含むものである、方法に関する。
In one aspect, the present invention provides a method for identifying or selecting rice for a low amylose trait, comprising the steps of:
The method includes a step of detecting whether or not a target rice plant has a gene encoding a mutant SART-1 protein,
The mutant SART-1 protein is
The present invention relates to a method comprising the step of: (a) substituting a proline at a position corresponding to position 562 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:5 with one amino acid selected from the group consisting of serine, threonine, asparagine, cysteine, glutamine, and tyrosine; and (b) substituting a proline at a position corresponding to position 696 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:5 with one amino acid selected from the group consisting of serine, threonine, asparagine, cysteine, glutamine, and tyrosine.
一実施形態において、前記変異型SART-1タンパク質をコードする遺伝子は、野生型SART-1タンパク質をコードする塩基配列（配列番号4）を基準とした場合に、以下からなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む：
（c）配列番号6に示されるSART-1遺伝子の1684番に相当する位置におけるシトシン（C）からチミン（T）への変異、
（d）配列番号6に示されるSART-1遺伝子の2086番に相当する位置におけるシトシン（C）からチミン（T）への変異。
In one embodiment, the gene encoding the mutant SART-1 protein contains at least one mutation selected from the group consisting of the following, based on the base sequence encoding the wild-type SART-1 protein (SEQ ID NO: 4):
(c) a mutation from cytosine (C) to thymine (T) at a position corresponding to position 1684 of the SART-1 gene as set forth in SEQ ID NO:6;
(d) A mutation from cytosine (C) to thymine (T) at the position corresponding to position 2086 of the SART-1 gene shown in SEQ ID NO:6.
一実施形態では、判定又は選抜しようとするイネからゲノムDNA又はmRNA若しくはmRNAに対応するcDNAを調製する。ゲノムDNAの調製は、公知の方法、例えばフェノール／クロロホルム法などにより調製することができる。mRNAの調製もまた、公知の方法により、例えばグアニジウムチオシアネート-トリフルオロ酢酸セシウム法などにより総RNAを抽出した後、オリゴdT-セルロースやポリU-セファロース等を用いたアフィニティーカラム法により、あるいはバッチ法によりポリ(A)+RNA（mRNA）を得ることができる。cDNAは、公知の逆転写酵素を利用して調製することができる。また、必要であれば、陽性対照及び／又は陰性対照のイネ品種からゲノムDNA又はmRNA若しくはcDNAを調製してもよい。 In one embodiment, genomic DNA, mRNA, or cDNA corresponding to mRNA is prepared from rice to be judged or selected. Genomic DNA can be prepared by a known method, such as the phenol/chloroform method. mRNA can also be prepared by a known method, such as the guanidinium thiocyanate-cesium trifluoroacetate method, after which poly(A)+RNA (mRNA) can be obtained by an affinity column method using oligo dT-cellulose, poly U-Sepharose, or the like, or by a batch method. cDNA can be prepared using a known reverse transcriptase. If necessary, genomic DNA, mRNA, or cDNA may be prepared from a positive control and/or negative control rice variety.
DNA又はmRNA若しくはcDNAを調製する供与源もまた特に限定されるものではなく、イネの植物体のいずれの組織からも抽出できるが、例えば、穂、葉、根、種子、精米、玄米、さらに炊飯米等からも抽出することができる。 The source from which DNA, mRNA or cDNA is prepared is also not particularly limited, and can be extracted from any tissue of the rice plant body, for example, ears, leaves, roots, seeds, polished rice, brown rice, and even cooked rice.
ゲノムDNA又はmRNA若しくはcDNAにおける変異型SART-1遺伝子の検出は、当技術分野で公知の任意の方法により行うことができ、限定するものではないが、増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を利用した方法、ハイブリダイゼーション法、直接配列決定法、制限酵素断片長多型（RFLP）を利用する方法などが挙げられる。これらの方法はいずれも当業者に周知である。以下に代表的な方法の概要を説明する。 Detection of mutant SART-1 genes in genomic DNA or mRNA or cDNA can be performed by any method known in the art, including, but not limited to, amplification reactions such as polymerase chain reaction (PCR), hybridization, direct sequencing, and restriction fragment length polymorphism (RFLP). All of these methods are well known to those skilled in the art. Representative methods are outlined below.
（１）増幅反応を利用した方法（PCR法）
本発明においては、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を利用して変異型SART-1遺伝子を簡便かつ高精度に検出することができる。
(1) Method using amplification reaction (PCR method)
In the present invention, for example, the mutant SART-1 gene can be detected simply and with high accuracy by using the polymerase chain reaction (PCR).
最初に、変異型SART-1タンパク質のアミノ酸配列又は変異型SART-1遺伝子の塩基配列と、野生型SART-1タンパク質のアミノ酸配列又は野生型SART-1遺伝子の塩基配列との比較から、両者を区別して増幅することができるプライマーを設計する。例えば、上記（a）及び（b）のアミノ酸変異又は上記（c）及び（d）の塩基変異のいずれか1つを含む領域が増幅されるようにプライマーセットを設計する。プライマーセットは、野生型SART-1遺伝子のcDNA配列（配列番号6）を基準に設計してもよいし、野生型SART-1遺伝子のゲノム配列（配列番号4）を基準に設計してもよい。配列番号4は、SART-1遺伝子を含む周辺領域のゲノム配列を示している。 First, primers are designed that can distinguish and amplify the amino acid sequence of the mutant SART-1 protein or the nucleotide sequence of the mutant SART-1 gene from the amino acid sequence of the wild-type SART-1 protein or the nucleotide sequence of the wild-type SART-1 gene. For example, a primer set is designed to amplify a region containing either one of the amino acid mutations (a) and (b) above or the nucleotide mutations (c) and (d) above. The primer set may be designed based on the cDNA sequence of the wild-type SART-1 gene (SEQ ID NO: 6) or the genomic sequence of the wild-type SART-1 gene (SEQ ID NO: 4). SEQ ID NO: 4 shows the genomic sequence of the surrounding region containing the SART-1 gene.
プライマーの設計手法は当技術分野で周知であり、本発明において使用可能なプライマーは、特異的なアニーリングが可能な条件を満たす、例えば特異的なアニーリングが可能な長さ及び塩基組成（融解温度）を有するように設計される。例えば、プライマーとしての機能を有する長さとしては、10塩基以上が好ましく、さらに好ましくは15～50塩基であり、さらに好ましくは15～30塩基である。また設計の際には、プライマーのGC含量とプライマーの融解温度（Tm）を確認することが好ましい。Tmとは、任意の核酸鎖の50％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度を意味し、鋳型となるDNAとプライマーとが二本鎖を形成してアニーリングするためには、アニーリングの温度を最適化する必要がある。一方、この温度を下げすぎると非特異的な反応が起こるため、温度は可能な限り高いことが望ましい。Tmの確認には、公知のプライマー設計用ソフトウエアを利用することができる。設計されたプライマーは、公知のオリゴヌクレオチド合成手法により化学合成することができるが、通常は、市販の化学合成装置を使用して合成される。 Primer design methods are well known in the art, and primers that can be used in the present invention are designed to satisfy conditions that allow specific annealing, for example, to have a length and base composition (melting temperature) that allow specific annealing. For example, the length that functions as a primer is preferably 10 bases or more, more preferably 15 to 50 bases, and even more preferably 15 to 30 bases. In addition, when designing, it is preferable to confirm the GC content of the primer and the melting temperature (Tm) of the primer. Tm means the temperature at which 50% of any nucleic acid strand forms a hybrid with its complementary strand, and in order for the template DNA and the primer to form a double strand and anneal, it is necessary to optimize the annealing temperature. On the other hand, if this temperature is lowered too much, non-specific reactions will occur, so it is desirable to keep the temperature as high as possible. Known primer design software can be used to confirm Tm. The designed primer can be chemically synthesized by known oligonucleotide synthesis methods, but is usually synthesized using a commercially available chemical synthesis device.
具体的な実施形態において、本発明において使用可能なプライマーセットとしては、限定するものではないが、例えば以下のプライマーが挙げられる：
（i）配列番号4の1番から3549番（例えば、2897～2916番、3411～3430番）の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも10塩基からなるGC含量30%以上かつアニーリング温度（Tm値）50℃以上のプライマー、及び配列番号4の3551番から5501番（例えば、4436～4455番）の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも10塩基からなるGC含量30%以上かつアニーリング温度（Tm値）50℃以上のプライマー（変異（a）又は変異（c）を検出するため）、あるいは
（ii）配列番号4の1番から4195番（例えば、2897～2916番、3411～3430番）の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも10塩基からなるGC含量30%以上かつアニーリング温度（Tm値）50℃以上のプライマー、及び配列番号4の4197番から5501番（例えば、4436～4455番）の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも10塩基からなるGC含量30%以上かつアニーリング温度（Tm値）50℃以上のプライマー（変異（b）又は変異（d）を検出するため）。
In a specific embodiment, a primer set that can be used in the present invention includes, but is not limited to, the following primers:
(i) a primer consisting of at least 10 consecutive bases from the nucleotide sequence of 1 to 3549 (e.g., 2897 to 2916, 3411 to 3430) of SEQ ID NO: 4 or its complementary sequence, having a GC content of 30% or more and an annealing temperature (Tm value) of 50°C or more, and a primer consisting of at least 10 consecutive bases from the nucleotide sequence of 3551 to 5501 (e.g., 4436 to 4455) of SEQ ID NO: 4 or its complementary sequence, having a GC content of 30% or more and an annealing temperature (Tm value) of 50°C or more (to detect mutation (a) or mutation (c)), or (ii) a primer consisting of at least 10 consecutive bases from the nucleotide sequence of positions 1 to 4195 (e.g., positions 2897 to 2916, 3411 to 3430) of SEQ ID NO: 4 or its complementary sequence, having a GC content of 30% or more and an annealing temperature (Tm value) of 50°C or higher, and a primer consisting of at least 10 consecutive bases from the nucleotide sequence of positions 4197 to 5501 (e.g., positions 4436 to 4455) of SEQ ID NO: 4 or its complementary sequence, having a GC content of 30% or more and an annealing temperature (Tm value) of 50°C or higher (to detect mutation (b) or mutation (d)).
好ましい実施形態では、変異型SART-1遺伝子のそれぞれの変異を検出するためのプライマーセットとして、配列番号1又は3に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号2に示される塩基配列を有するプライマーのセットが挙げられる。これらプライマーセットは、変異型SART-1遺伝子の上記変異を含む領域を増幅できるものである。 In a preferred embodiment, a primer set for detecting each mutation in the mutant SART-1 gene includes a set of a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3 and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. These primer sets are capable of amplifying the region containing the above mutation in the mutant SART-1 gene.
このように設計されたプライマーセットを用いた場合、変異型SART-1遺伝子によって得られる増幅産物と、それ以外のSART-1遺伝子によって得られる増幅産物とは塩基配列が異なる。従って、プライマーセットを用いた増幅反応により得られる増幅産物の配列の相違から、対象のイネがSART-1タンパク質又はSART-1遺伝子に低アミロース形質に関与する変異を有するか否かを判別することができる。 When a primer set designed in this way is used, the amplification product obtained by the mutant SART-1 gene has a different base sequence from the amplification product obtained by other SART-1 genes. Therefore, based on the difference in the sequences of the amplification products obtained by the amplification reaction using the primer set, it is possible to determine whether or not the target rice plant has a mutation in the SART-1 protein or SART-1 gene that is involved in the low amylose trait.
増幅反応は、特に限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法の原理を利用した公知の方法を挙げることができる。増幅は、増幅産物が検出可能なレベルになるまで行う。PCRの最適条件は、当業者であれば容易に決定することができる。またRT-PCR法では、まず、mRNAを鋳型として、逆転写酵素反応によりcDNAを作製し、その後、作製したcDNAを鋳型として一対のプライマーを用いてPCR法を行う。 The amplification reaction is not particularly limited, but examples thereof include known methods that utilize the principles of the polymerase chain reaction (PCR). Amplification is carried out until the amplified product reaches a detectable level. The optimal conditions for PCR can be easily determined by those skilled in the art. In the RT-PCR method, first, cDNA is produced by reverse transcriptase reaction using mRNA as a template, and then PCR is carried out using the produced cDNA as a template and a pair of primers.
上述のようにして、対象のイネに由来するゲノムDNA又はmRNA若しくはcDNAを鋳型として、変異型SART-1遺伝子の変異部分を含む核酸断片を特異的に増幅することができる。 As described above, a nucleic acid fragment containing the mutated portion of the mutant SART-1 gene can be specifically amplified using genomic DNA, mRNA, or cDNA derived from the target rice as a template.
上記増幅反応後に特異的な増幅反応が起こったか否かを検出するには、増幅反応により得られる増幅産物を特異的に認識することができる公知の手段を用いることができる。例えば、アガロースゲル電気泳動法等を利用して、特定のサイズの増幅断片が増幅されているか否かを確認することにより、特異的な増幅反応を検出することができる。増幅産物のサイズは設計したプライマー間の塩基配列に基づいて推測することが可能である。あるいは、得られた増幅断片の塩基配列を決定することにより、目的の変異を含む配列が増幅されているかどうかを判定することができる。 To detect whether a specific amplification reaction has occurred after the above amplification reaction, known means capable of specifically recognizing the amplification product obtained by the amplification reaction can be used. For example, a specific amplification reaction can be detected by using agarose gel electrophoresis or the like to confirm whether an amplified fragment of a specific size has been amplified. The size of the amplified product can be estimated based on the base sequence between the designed primers. Alternatively, by determining the base sequence of the obtained amplified fragment, it can be determined whether a sequence containing the target mutation has been amplified.
好ましい実施形態では、配列番号1に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号2に示される塩基配列を有するプライマーのセットを用いて増幅反応を行った後、配列番号3に示される塩基配列を有するプライマーを使用して配列決定を行う。 In a preferred embodiment, an amplification reaction is carried out using a set of a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO:1 and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO:2, and then sequencing is carried out using a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO:3.
あるいは、プライマー又は基質に標識した標識に基づいて核酸断片の増幅の有無を検出する。例えば、増幅反応の過程で取り込まれるdNTPに、放射性同位体、蛍光物質、発光物質などの標識体を作用させ、この標識体を検出することができる。放射性同位体としては、32P、125I、35Sなどを用いることができる。また蛍光物質としては、例えば、フルオレセン（FITC）、スルホローダミン（TR）、テトラメチルローダミン（TRITC）などを用いることができる。また発光物質としてはルシフェリンなどを用いることができる。これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、特に制限されることはなく、従来公知の各種手段を用いることができる。例えば標識体の導入方法としては、放射性同位体を用いるランダムプライム法が挙げられる。 Alternatively, the presence or absence of amplification of a nucleic acid fragment is detected based on the label attached to the primer or substrate. For example, a label such as a radioisotope, a fluorescent substance, or a luminescent substance can be reacted with the dNTP incorporated during the amplification reaction, and the label can be detected. As the radioisotope, 32 P, 125 I, 35 S, etc. can be used. As the fluorescent substance, for example, fluorescein (FITC), sulforhodamine (TR), tetramethylrhodamine (TRITC), etc. can be used. As the luminescent substance, luciferin, etc. can be used. There is no particular limitation on the type of these labels and the method of introducing the labels, and various conventionally known means can be used. For example, the method of introducing the labels includes the random prime method using a radioisotope.
標識したdNTPを取り込んだ増幅産物を観察する方法としては、上述した標識体を検出するための当技術分野で公知の方法であればいずれの方法でもよい。例えば、標識体として放射性同位体を用いた場合には、放射活性を、例えば液体シンチレーションカウンター、γ-カウンターなどにより計測することができる。また標識体として蛍光を用いた場合には、その蛍光を蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダーなどを用いて検出することができる。 The method for observing the amplification product incorporating the labeled dNTP may be any method known in the art for detecting the above-mentioned label. For example, when a radioisotope is used as the label, the radioactivity can be measured, for example, with a liquid scintillation counter or a γ-counter. When a fluorescent label is used, the fluorescence can be detected with a fluorescent microscope, a fluorescent plate reader, or the like.
これにより、対象のイネが変異型SART-1タンパク質又は変異型SART-1遺伝子の少なくとも1つの変異を有するか否か、すなわち低アミロース形質のイネであるか否かを判定し選別することができる。 This makes it possible to determine and select whether the target rice has at least one mutation in the mutant SART-1 protein or mutant SART-1 gene, i.e., whether it is rice with low amylose traits.
（２）ハイブリダイゼーション法
変異型SART-1遺伝子の変異は、ハイブリダイゼーション法を利用して検出することもできる。ハイブリダイゼーション法は、対象のイネ由来のゲノムDNA又はmRNA若しくはcDNAが、それに対し相補的なDNA分子（例えばオリゴヌクレオチドプローブ）とハイブリダイズする能力に基づいて、変異を有するか否かを決定する方法である。ハイブリダイゼーション及び検出のための種々の技術を利用してこのハイブリダイゼーション法を行うことができる。
(2) Hybridization Method Mutations in mutant SART-1 genes can also be detected using hybridization methods. Hybridization methods are methods that determine whether a target rice-derived genomic DNA, mRNA, or cDNA has a mutation based on its ability to hybridize with a complementary DNA molecule (e.g., an oligonucleotide probe). Various techniques for hybridization and detection can be used to perform this hybridization method.
最初に、変異型SART-1タンパク質のアミノ酸配列又は変異型SART-1遺伝子の塩基配列と、野生型SART-1タンパク質のアミノ酸配列又は野生型SART-1遺伝子の塩基配列との比較から、両者を区別してハイブリダイズすることができるプローブを設計する。例えば、変異型SART-1タンパク質又は変異型SART-1遺伝子の上記変異に基づいて、少なくとも1つの変異部分をまたぐようにプローブを設計することができる。例えば、プローブを、変異型SART-1遺伝子に対してハイブリダイズすることができるが、それ以外のSART-1遺伝子にはハイブリダイズすることができないように設計する。このようなプローブを用いたハイブリダイゼーションの有無により、対象のイネのゲノムDNA又はmRNA若しくはcDNAが変異型SART-1遺伝子を含むかどうかを検出することができる。 First, a probe capable of hybridizing to the mutant SART-1 protein and the wild-type SART-1 protein is designed by comparing the amino acid sequence of the mutant SART-1 gene and the wild-type SART-1 protein and the wild-type SART-1 gene. For example, a probe can be designed to span at least one mutated portion based on the above mutation of the mutant SART-1 protein or the mutant SART-1 gene. For example, a probe is designed to hybridize to the mutant SART-1 gene but not to other SART-1 genes. Whether or not the target rice genomic DNA, mRNA, or cDNA contains the mutant SART-1 gene can be detected based on the presence or absence of hybridization using such a probe.
プローブの設計手法は当技術分野で周知であり、本発明において使用可能なプローブは、特異的なハイブリダイゼーションが可能な条件を満たす、例えば特異的なハイブリダイゼーションが可能な長さ及び塩基組成（融解温度）を有するように設計される。プローブの長さは、10塩基以上が好ましく、さらに好ましくは20～50塩基であり、さらに好ましくは20～30塩基である。 Probe design techniques are well known in the art, and probes that can be used in the present invention are designed to satisfy conditions that allow specific hybridization, for example, to have a length and base composition (melting temperature) that allow specific hybridization. The length of the probe is preferably 10 bases or more, more preferably 20 to 50 bases, and even more preferably 20 to 30 bases.
本方法においては、プローブを用いて対象のイネ由来のゲノムDNA又はmRNA若しくはcDNAに対するハイブリダイゼーション反応を行い、その特異的結合（ハイブリッド）を検出することにより、変異型SART-1遺伝子の存在を検出する。ハイブリダイゼーション反応は、ストリンジェントな条件下で行う必要がある。そのようなストリンジェントな条件は当技術分野で周知であり、特に限定されない。 In this method, a probe is used to carry out a hybridization reaction with genomic DNA, mRNA, or cDNA derived from the target rice plant, and the presence of the mutant SART-1 gene is detected by detecting the specific binding (hybrid). The hybridization reaction must be carried out under stringent conditions. Such stringent conditions are well known in the art and are not particularly limited.
本方法においてハイブリダイゼーションを行う場合には、プローブに蛍光標識（フルオレセイン、ローダミンなど）、放射性標識（32Pなど）、酵素標識（アルカリフォスファターゼ、西洋ワサビパーオキシダーゼ等）、ビオチン標識等の適当な標識を付加することができる。 When hybridization is performed in this method, the probe can be labeled with an appropriate label such as a fluorescent label (fluorescein, rhodamine, etc.), a radioactive label ( 32 P, etc.), an enzyme label (alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, etc.), or a biotin label.
標識化プローブを用いた検出は、対象のイネ由来のゲノムDNA又はmRNA若しくはcDNAとプローブとをハイブリダイズ可能なように接触させることを含む。具体的には、例えば対象のイネ由来のゲノムDNA又はmRNA若しくはcDNAを、必要であれば適宜制限酵素で消化して、スライドグラス、メンブラン、マイクロタイタープレート等の適当な担体に固定し、標識したプローブを添加することにより、プローブとゲノムDNA又はmRNA若しくはcDNAとを接触させてハイブリダイゼーション反応を行い、ハイブリダイズしなかったプローブを除去した後、ゲノムDNA又はmRNA若しくはcDNAとハイブリダイズしているプローブの標識を検出する。標識が検出された場合には、対象のイネが変異型SART-1遺伝子を有していることになる。 Detection using a labeled probe involves contacting the genomic DNA, mRNA, or cDNA derived from the target rice plant with a probe so that they can hybridize. Specifically, for example, the genomic DNA, mRNA, or cDNA derived from the target rice plant is digested with an appropriate restriction enzyme if necessary, immobilized on an appropriate carrier such as a slide glass, membrane, or microtiter plate, and a labeled probe is added to bring the probe into contact with the genomic DNA, mRNA, or cDNA to carry out a hybridization reaction. After removing the unhybridized probe, the label of the probe that has hybridized with the genomic DNA, mRNA, or cDNA is detected. If a label is detected, it means that the target rice plant has a mutant SART-1 gene.
あるいは、ハイブリダイゼーションはDNAチップを利用して検出することもできる。この方法においては、プローブを固相支持体に貼り付ける。対象のイネ由来のゲノムDNA又はmRNA若しくはcDNAサンプルをDNAチップと接触させ、ハイブリダイゼーションを検出する Alternatively, hybridization can be detected using a DNA chip. In this method, the probe is attached to a solid support. Genomic DNA or mRNA or cDNA samples from the target rice plant are contacted with the DNA chip, and hybridization is detected.
（３）直接配列決定法
変異型SART-1遺伝子は、ゲノムDNA又はmRNA若しくはcDNAを用いて直接配列決定法により検出することができる。直接配列決定法においては、最初に、対象のイネからゲノムDNA又はmRNA若しくはcDNAを調製し、検出対象となる変異型SART-1遺伝子の少なくとも1つの変異を含む領域をベクターにクローニングし、宿主細胞（例えば細菌）において増幅させる。あるいは、検出対象のSART-1遺伝子の少なくとも1つの変異を含む領域内のDNAをPCRにより増幅することも可能である。増幅後、検出対象領域内のDNAを配列決定する。配列決定法としては、限定されるものではないが、手動式配列決定法又は自動配列決定法が挙げられる。自動配列決定法としては、ダイターミネーターを使用する方法、次世代シークエンシング（NGS）などが挙げられる。配列決定の結果に基づいて、対象のイネが変異型SART-1遺伝子を有するか否かを判定する。
(3) Direct Sequencing The mutant SART-1 gene can be detected by direct sequencing using genomic DNA, mRNA, or cDNA. In the direct sequencing method, first, genomic DNA, mRNA, or cDNA is prepared from the target rice, and a region containing at least one mutation of the mutant SART-1 gene to be detected is cloned into a vector and amplified in a host cell (e.g., bacteria). Alternatively, DNA in the region containing at least one mutation of the SART-1 gene to be detected can be amplified by PCR. After amplification, DNA in the region to be detected is sequenced. Sequencing methods include, but are not limited to, manual sequencing methods or automatic sequencing methods. Automatic sequencing methods include methods using dye terminators, next-generation sequencing (NGS), and the like. Based on the results of sequencing, it is determined whether the target rice has a mutant SART-1 gene or not.
あるいは、イネが変異型SART-1タンパク質を含むか否かを検出してもよい。変異型SART-1タンパク質の検出は、当技術分野で公知の方法、例えば免疫アッセイの方法を利用して行うことができる。また変異型SART-1タンパク質の検出は、変異型SART-1タンパク質に特有の物理的又は化学的特性を測定するための手段、例えば正確な分子量又はNMRスペクトル等を測定するための手段によって行うことができる。変異型SART-1タンパク質を検出するための手段としては、バイオセンサー、プロテインチップ、免疫アッセイと連結した光学装置、質量分析計、NMR分析計、二次元電気泳動装置又はクロマトグラフィー装置等の分析装置が挙げられる。 Alternatively, it may be possible to detect whether or not rice contains a mutant SART-1 protein. The detection of a mutant SART-1 protein can be carried out using a method known in the art, for example, an immunoassay method. The detection of a mutant SART-1 protein can also be carried out by a means for measuring a physical or chemical property specific to the mutant SART-1 protein, for example, a means for measuring an accurate molecular weight or an NMR spectrum. Examples of a means for detecting a mutant SART-1 protein include a biosensor, a protein chip, an optical device linked to an immunoassay, a mass spectrometer, an NMR spectrometer, a two-dimensional electrophoresis device, a chromatography device, and other analytical devices.
試料を調製する供与源もまた特に限定されるものではなく、イネの植物体のいずれの組織からも調製でき、例えば、穂、葉、根、種子、精米、玄米、さらに炊飯米等からも抽出することができる。 The source from which the sample is prepared is also not particularly limited, and the sample can be prepared from any tissue of the rice plant body, for example, extraction can be performed from ears, leaves, roots, seeds, polished rice, brown rice, and even cooked rice.
例えば、試料中の変異型SART-1タンパク質の検出は、免疫アッセイ（免疫学的測定法）により行うことができる。すなわち試料中の変異型SART-1タンパク質と、該タンパク質に特異的に結合する抗体との反応に基づいて、該タンパク質の発現を測定する。免疫アッセイは、当該分野で汎用されている方法であれば液相系及び固相系のいずれで行ってもよい。また免疫アッセイの形式も限定されるものではなく、直接固相法の他、サンドイッチ法、競合法、ウエスタンブロッティング法、ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）法などであってもよい。 For example, mutant SART-1 protein in a sample can be detected by immunoassay (immunological measurement method). That is, the expression of the protein is measured based on the reaction between the mutant SART-1 protein in the sample and an antibody that specifically binds to the protein. The immunoassay may be performed in either a liquid phase system or a solid phase system as long as it is a method commonly used in the field. The format of the immunoassay is not limited, and may be a direct solid phase method, a sandwich method, a competitive method, a Western blotting method, an ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) method, or the like.
免疫アッセイを採用する場合には、変異型SART-1タンパク質に対する抗体を使用する。変異型SART-1タンパク質に対する抗体はモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれであってもよいし、その抗体断片（Fab、Fvなど）であってもよい。抗体は、当技術分野で公知の方法により調製することができる。 When an immunoassay is employed, an antibody against the mutant SART-1 protein is used. The antibody against the mutant SART-1 protein may be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, or may be an antibody fragment thereof (Fab, Fv, etc.). The antibody may be prepared by a method known in the art.
変異型SART-1タンパク質と抗体との結合（反応）は、周知の方法に従って測定しうる。当業者であれば、採用する免疫アッセイの種類及び形式、使用する標識の種類などに応じて、各アッセイについての有効かつ最適な測定方法を決定することができる。例えば、試料中の変異型SART-1タンパク質と抗体との結合を容易に検出するために、該抗体を標識することにより該結合を直接検出するか、又は標識二次抗体若しくはビオチン－アビジン複合体等を用いることにより間接的に検出する。 The binding (reaction) between the mutant SART-1 protein and the antibody can be measured according to well-known methods. Those skilled in the art can determine an effective and optimal measurement method for each assay depending on the type and format of the immunoassay employed, the type of label used, etc. For example, in order to easily detect the binding between the mutant SART-1 protein and the antibody in a sample, the antibody is labeled to directly detect the binding, or the binding is indirectly detected by using a labeled secondary antibody or a biotin-avidin complex, etc.
免疫アッセイにおいて使用する抗体を標識するための標識としては、酵素、放射性同位体、蛍光色素又はアビジン－ビオチン系を使用することができる。酵素としては、通常の酵素免疫アッセイ（EIA）に用いられる酵素、例えば、パーオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等を用いることができる。放射性同位体としては、125Iや3H等の通常のラジオイムノアッセイ（RIA）で用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。 The label for labeling the antibody used in the immunoassay can be an enzyme, a radioisotope, a fluorescent dye, or an avidin-biotin system. The enzyme can be an enzyme used in a conventional enzyme immunoassay (EIA), such as peroxidase, β-galactosidase, or alkaline phosphatase. The radioisotope can be one used in a conventional radioimmunoassay (RIA), such as 125 I or 3 H. The fluorescent dye can be one used in a conventional fluorescent antibody technique, such as fluorescein isothiocyanate (FITC) or tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC).
標識シグナルの検出もまた、当技術分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、酵素標識を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。基質は、使用する酵素の種類に応じて異なり、例えば酵素としてパーオキシダーゼを使用する場合には、3,3’,5,5’-テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。放射性標識を用いる場合には、放射性標識の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。蛍光標識は、例えば蛍光顕微鏡、プレートリーダー等を用いて検出及び定量することができる。 Detection of the label signal can also be performed according to methods known in the art. For example, when an enzyme label is used, a substrate that is decomposed by the action of the enzyme to produce a color is added, and the amount of decomposition of the substrate is optically measured to determine the enzyme activity, which is converted into the amount of bound antibody, and the amount of antibody is calculated by comparing it with a standard value. The substrate varies depending on the type of enzyme used. For example, when peroxidase is used as the enzyme, 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine can be used, and when alkaline phosphatase is used as the enzyme, paranitrophenol or the like can be used. When a radioactive label is used, the amount of radiation emitted by the radioactive label is measured using a scintillation counter or the like. Fluorescent labels can be detected and quantified using, for example, a fluorescent microscope, a plate reader, or the like.
以上の免疫学的方法では、試料中の変異型SART-1タンパク質と変異型SART-1タンパク質に対する抗体との結合量が多いほど、試料中に変異型SART-1タンパク質が多く存在することとなる。 In the above immunological methods, the greater the amount of mutant SART-1 protein in the sample that binds to the antibody against the mutant SART-1 protein, the more mutant SART-1 protein there is in the sample.
以上の方法により、対象のイネが、変異型SART-1タンパク質又は変異型SART-1遺伝子を有するか否かを検出し、その結果から、対象のイネが低アミロース形質を有するか否かを判定し、選別することが可能となる。本発明の方法は、遺伝的手法を利用するため、簡便かつ高精度に低アミロース形質のイネを判定し選別することができる。 The above method detects whether the target rice has a mutant SART-1 protein or mutant SART-1 gene, and from the results, it is possible to determine whether the target rice has a low amylose trait and select it. Because the method of the present invention utilizes genetic techniques, it is possible to easily and accurately determine and select rice with low amylose traits.
４．キット
上述した低アミロース形質のイネを判定又は選抜する方法は、キットを用いることによりさらに簡便に実施することができる。本キットは、上述したような変異型SART-1タンパク質又は変異型SART-1遺伝子を検出することができる手段、具体的にはプライマー又はプローブを少なくとも含むものである。
The above-mentioned method for identifying or selecting rice with a low amylose content can be carried out more easily by using a kit, which contains at least a means for detecting the mutant SART-1 protein or mutant SART-1 gene as described above, specifically, a primer or a probe.
一実施形態において、本発明は、以下のプライマーセット：
（i）配列番号4の1番から3549番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも10塩基からなるGC含量30%以上かつアニーリング温度（Tm値）50℃以上のプライマー、及び配列番号4の3551番から5501番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも10塩基からなるGC含量30%以上かつアニーリング温度（Tm値）50℃以上のプライマーを含むプライマーセット、あるいは
（ii）配列番号4の1番から4195番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも10塩基からなるGC含量30%以上かつアニーリング温度（Tm値）50℃以上のプライマー、及び配列番号4の4197番から5501番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも10塩基からなるGC含量30%以上かつアニーリング温度（Tm値）50℃以上のプライマーを含むプライマーセット
を含むことを特徴とする低アミロース形質のイネの判定又は選別用キットに関する。
In one embodiment, the present invention provides the following primer set:
The present invention relates to a kit for identifying or selecting rice having a low amylose trait, the kit comprising: (i) a primer set comprising a primer having a GC content of 30% or more and an annealing temperature (Tm value) of 50°C or more, which consists of at least 10 consecutive bases from the base sequence of 1 to 3549 of SEQ ID NO: 4 or its complementary sequence, and a primer having a GC content of 30% or more and an annealing temperature (Tm value) of 50°C or more, which consists of at least 10 consecutive bases from the base sequence of 3551 to 5501 of SEQ ID NO: 4 or its complementary sequence; or (ii) a primer set comprising a primer having a GC content of 30% or more and an annealing temperature (Tm value) of 50°C or more, which consists of at least 10 consecutive bases from the base sequence of 1 to 4195 of SEQ ID NO: 4 or its complementary sequence, and a primer having a GC content of 30% or more and an annealing temperature (Tm value) of 50°C or more, which consists of at least 10 consecutive bases from the base sequence of 4197 to 5501 of SEQ ID NO: 4 or its complementary sequence.
好ましい実施形態において、本キットは、配列番号1又は3に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号2に示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーセットを含む。また別の実施形態において、本キットは、配列番号1に示される塩基配列を有するプライマー、配列番号2に示される塩基配列を有するプライマー、及び配列番号3に示される塩基配列を有するプライマーを含む。 In a preferred embodiment, the kit includes a primer set including a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3 and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. In another embodiment, the kit includes a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
またキットは、プライマーを含む場合には、さらに、反応液を構成するバッファー、dNTP混合物、酵素類（逆転写酵素、RNaseHなど）、校正用の標準試料などを含んでもよい。また、プローブを含む場合には、さらに、ハイブリダイゼーションバッファー、洗浄バッファー、マイクロプレート、ナイロンメンブレンなどを含んでもよい。 When the kit contains a primer, it may further contain a buffer constituting the reaction solution, a dNTP mixture, enzymes (reverse transcriptase, RNase H, etc.), a standard sample for calibration, etc. When the kit contains a probe, it may further contain a hybridization buffer, a washing buffer, a microplate, a nylon membrane, etc.
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
［実施例１］
受精卵法によりENU（エチルニトロソウレア）で処理した水稲品種「コシヒカリ」のM1世代（3,072個体）の全ゲノムDNAをテンプレートとして、PrimeSTAR GXL（タカラバイオ社）により低アミロース形質の原因遺伝子SART-1（Os02g0511500及びLOC_Os02g30730）を含む領域を、プライマーDOT2L-p3-F1（5’- CGCAGCAAAGATGTCATCAG-3’：配列番号1）及びプライマーDOT2L-p3-R1（5’- AAGGCCTTGGAAGACATCAA-3’：配列番号2）を用いたPCR法により増幅した。PrimeSTAR GXL DNA Polymerase（Takara社）、プライマー、テンプレートを混合した反応液を、98℃1分間の後、98℃10秒間、60℃15秒間、72℃90秒間のサイクルを35回反復させ、最後に72℃5分間のPCR反応を行った。98℃により増幅産物の二本鎖DNAを乖離させたのち、再会合させ、セロリより抽出したCel-Iヌクレアーゼを添加して42℃で処理した。3%アガロースゲル電気泳動により、ミスマッチ部位で切断されたPCR産物を検出した。
[Example 1]
The total genomic DNA of the M1 generation (3,072 individuals) of the rice cultivar “Koshihikari” that had been treated with ENU (ethylnitrosourea) by the fertilized egg method was used as a template to amplify the region containing the gene SART-1 (Os02g0511500 and LOC_Os02g30730) responsible for the low amylose trait by PCR using the primers DOT2L-p3-F1 (5'- CGCAGCAAAGATGTCATCAG-3': SEQ ID NO: 1) and DOT2L-p3-R1 (5'- AAGGCCTTGGAAGACATCAA-3': SEQ ID NO: 2) with PrimeSTAR GXL (Takara Bio Inc.). The reaction mixture, which contained PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (Takara), primers, and template, was heated at 98°C for 1 minute, then cycled 35 times at 98°C for 10 seconds, 60°C for 15 seconds, and 72°C for 90 seconds, and finally PCR was performed at 72°C for 5 minutes. The double-stranded DNA of the amplified product was dissociated at 98°C, then reassociated, and treated at 42°C with Cel-I nuclease extracted from celery. PCR products cleaved at the mismatch sites were detected by 3% agarose gel electrophoresis.
さらに、プライマーDOT2L-p1-F1、DOT2L-p1-R1、及びDOT2L-p3-MF1（5’-GAGATGGAAGAGTTTGTGTG-3’：配列番号3）を用いた配列解析により、遺伝子配列の変異箇所を特定した。その結果、低アミロース形質の原因遺伝子のアミノ酸配列に非同義置換が認められた個体は8であった。検出された非同義置換の位置及び種類を図１に示す。図１は、作出した「コシヒカリ」のSART-1遺伝子の突然変異系統を示す図である。SART-1遺伝子のエキソン・イントロン構造と、作出した8つの突然変異系統のアミノ酸置換の位置及び種類を示している。アミノ酸をコードするエキソン領域を黒四角で、アミノ酸をコードしていないイントロン領域を横棒で示している。 Furthermore, the mutation site of the gene sequence was identified by sequence analysis using primers DOT2L-p1-F1, DOT2L-p1-R1, and DOT2L-p3-MF1 (5'-GAGATGGAAGAGTTTGTGTG-3': SEQ ID NO: 3). As a result, nonsynonymous substitutions were found in the amino acid sequence of the gene responsible for the low amylose trait in 8 individuals. The positions and types of nonsynonymous substitutions detected are shown in Figure 1. Figure 1 shows the mutant lines of the SART-1 gene of "Koshihikari" that were created. The exon-intron structure of the SART-1 gene and the positions and types of amino acid substitutions of the 8 mutant lines that were created are shown. Exon regions that code for amino acids are shown as black squares, and intron regions that do not code for amino acids are shown as horizontal bars.
非同義置換が認められた個体について、アミロース含有率を測定した。具体的には、突然変異系統や「コシヒカリ」を、2016年の野外の水田圃場（16圃場（谷和原））と低温栽培条件のグロースチャンバー（16低温チャンバー（昼22℃夜16℃の温度条件））で栽培して収穫米を取得して、ヨウ素呈色比色法によりアミロース含有率を測定した。具体的には、モーターミルによって粉砕した精白米粉100mgを0.5M水酸化ナトリウム水溶液10mLに24時間混合して糊化させた後に、ビーエルテック社製の米・麦アミロース測定装置AA3によりアミロース含有率を測定した。各系統5個体についてアミロース含有率を測定して、その平均値及び標準偏差を算出した。その結果を以下の表１に示す。 The amylose content was measured for individuals with nonsynonymous substitutions. Specifically, the mutant lines and "Koshihikari" were cultivated in an outdoor paddy field (16 field (Taniwahara)) and a growth chamber under low-temperature cultivation conditions (16 low-temperature chamber (temperature conditions of 22°C during the day and 16°C at night)) in 2016, and the harvested rice was measured for amylose content using iodine colorimetry. Specifically, 100 mg of polished rice flour ground using a motor mill was mixed with 10 mL of 0.5 M sodium hydroxide aqueous solution for 24 hours to gelatinize it, and the amylose content was measured using the BL Tech rice/wheat amylose measuring device AA3. The amylose content was measured for five individuals of each line, and the average and standard deviation were calculated. The results are shown in Table 1 below.
表１に示されるように、野生型SART-1タンパク質のアミノ酸配列（配列番号5）の562位のP（プロリン）がS（セリン）に置換する変異、又は696位のP（プロリン）がS（セリン）に置換する変異を持つ系統の2つが、コントロール（原品種）の「コシヒカリ」と比較して、アミロース含有率が低下することが明らかとなった。 As shown in Table 1, it was revealed that the amylose content was reduced in two strains, one with a mutation in which P (proline) at position 562 in the amino acid sequence of the wild-type SART-1 protein (SEQ ID NO: 5) was replaced with S (serine), and the other with a mutation in which P (proline) at position 696 was replaced with S (serine), compared to the control (original variety) "Koshihikari."
［実施例２］
図２に示すように、実施例１で得られた2系統（P696S及びP562S）の戻し勾配を行った。具体的には、実施例１で得られた2系統を原品種「コシヒカリ」に3回又は2回の連続戻し交配を行い、そのBC2F2世代又はBC1F2世代の後代個体の中から、SART-1タンパク質の低アミロース形質に関与する変異をホモ接合体型に持つ系統を作出した。また、1系統を「北陸193号」に2回の連続戻し交配を行い、そのBC1F2世代の後代個体の中から、SART-1タンパク質の低アミロース形質に関与する変異をホモ接合体型に持つ系統を作出した。
[Example 2]
As shown in FIG. 2, the backcrossing gradient of the two lines (P696S and P562S) obtained in Example 1 was performed. Specifically, the two lines obtained in Example 1 were backcrossed three or two times to the original variety "Koshihikari", and from the progeny individuals of the BC 2 F 2 generation or BC 1 F 2 generation, a line having a homozygous mutation involved in the low amylose trait of the SART-1 protein was produced. In addition, one line was backcrossed twice to "
作出した突然変異系統、「コシヒカリ」及び「北陸193号」を、2020年に温室で栽培して収穫米を取得して、ヨウ素呈色比色法によりアミロース含有率を測定した。具体的には、モーターミルによって粉砕した精白米粉100mgを0.5M水酸化ナトリウム水溶液10mLに24時間混合して糊化させた後に、ビーエルテック社製の米・麦アミロース測定装置AA3によりアミロース含有率を測定した。これら3つの戻し交配系統について、各系統5個体のアミロース含有率を測定して、その平均値及び標準偏差を算出した。その結果を以下の表２に示す。
The mutant lines, "Koshihikari" and "
表２に示されるように、戻し勾配により得られた3つの系統は、原品種の「コシヒカリ」や「北陸193号」と比較して、アミロース含有率が低下していた。従って、本発明者らはSART-1遺伝子の2箇所の変異の少なくとも1箇所において変異を有する、低アミロース形質のイネ植物の種子を開発するに至った。
As shown in Table 2, the three lines obtained by back-grading had a reduced amylose content compared to the original varieties "Koshihikari" and "
配列番号1～3：人工（合成オリゴヌクレオチド） Sequence numbers 1 to 3: Artificial (synthetic oligonucleotides)
Claims (18)
（a）配列番号5に示されるアミノ酸配列の562位に相当する位置におけるプロリンの、セリン又はスレオニンへの置換、
（b）配列番号5に示されるアミノ酸配列の696位に相当する位置におけるプロリンの、セリン又はスレオニンへの置換。 A rice plant or a part thereof, characterized in that it has at least one of the following mutations (a) and (b) in a homozygous or heterozygous state in a SART-1 protein having an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO:5, and exhibits a low amylose trait .
(a) a substitution of proline at a position corresponding to position 562 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:5 with serine or threonine ;
(b) Substitution of proline at a position corresponding to position 696 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:5 with serine or threonine .
（c）配列番号6に示される塩基配列の1684番に相当する位置におけるシトシン（C）からチミン（T）への変異、
（d）配列番号6に示される塩基配列の2086番に相当する位置におけるシトシン（C）からチミン（T）への変異
のうち少なくとも1つの変異をホモ接合性又はヘテロ接合性で有する、請求項１～３のいずれか１項に記載のイネ植物又はその植物部分。 Mutations (c) and (d) below:
(c) a mutation from cytosine (C) to thymine (T) at the position corresponding to 1684 in the base sequence shown in SEQ ID NO:6;
(d) a rice plant or a plant part thereof according to any one of claims 1 to 3, which has at least one mutation from cytosine (C) to thymine (T) at a position corresponding to 2086 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 in a homozygous or heterozygous manner.
イネ植物において、配列番号5に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるSART-1タンパク質をコードする遺伝子に以下の（a）及び（b）：
（a）配列番号5に示されるアミノ酸配列の562位に相当する位置におけるプロリンの、セリン又はスレオニンへの置換、
（b）配列番号5に示されるアミノ酸配列の696位に相当する位置におけるプロリンの、セリン又はスレオニンへの置換
の少なくとも1つの変異を導入するステップと、
得られたイネ植物の種子におけるアミロース含有率又はアミロース含有量を測定するステップと
を含む方法。 1. A method for producing a rice plant with a low amylose trait, comprising:
In a rice plant , a gene encoding a SART-1 protein having an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO:5 has the following (a) and (b):
(a) a substitution of proline at a position corresponding to position 562 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:5 with serine or threonine ;
(b) introducing at least one mutation at a position corresponding to position 696 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:5, substituting proline with serine or threonine ;
and measuring the amylose content or amylose content in seeds of the resulting rice plant.
（c）配列番号6に示される塩基配列の1684番に相当する位置におけるシトシン（C）からチミン（T）への変異、
（d）配列番号6に示される塩基配列の2086番に相当する位置におけるシトシン（C）からチミン（T）への変異
の少なくとも1つの変異を導入する、請求項８に記載の方法。 The gene encoding the SART-1 protein contains the following (c) and (d):
(c) a mutation from cytosine (C) to thymine (T) at the position corresponding to base 1684 of the base sequence shown in SEQ ID NO:6;
The method according to claim 8, further comprising: (d) introducing at least one mutation from cytosine (C) to thymine (T) at the position corresponding to 2086 of the base sequence shown in SEQ ID NO:6.
対象のイネが、変異型SART-1タンパク質をコードする遺伝子を有するか否かを検出するステップ、及び前記変異型SART-1タンパク質をコードする遺伝子を有するイネを低アミロース形質のイネとして判定又は選抜するステップを含み、
前記変異型SART-1タンパク質が、配列番号5に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるSART-1タンパク質に対して、以下：
（a）配列番号5に示されるアミノ酸配列の562位に相当する位置におけるプロリンの、セリン又はスレオニンへの置換、並びに
（b）配列番号5に示されるアミノ酸配列の696位に相当する位置におけるプロリンの、セリン又はスレオニンへの置換
からなる群より選択される少なくとも1つの変異を含み、該変異型SART-1タンパク質がイネに存在する場合に該イネが低アミロース形質を示すものである、方法。 A method for determining or selecting rice having a low amylose trait, comprising the steps of:
The method includes the steps of detecting whether a target rice plant has a gene encoding a mutant SART-1 protein , and determining or selecting the rice plant having the gene encoding the mutant SART-1 protein as a rice plant having a low amylose trait ,
The mutant SART-1 protein is a SART-1 protein consisting of an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO:5,
The method comprises at least one mutation selected from the group consisting of (a) a substitution of proline at a position corresponding to position 562 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:5 with serine or threonine , and (b) a substitution of proline at a position corresponding to position 696 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:5 with serine or threonine , wherein when the mutant SART-1 protein is present in rice, the rice exhibits a low amylose trait .
（c）配列番号6に示される塩基配列の1684番に相当する位置におけるシトシン（C）からチミン（T）への変異、
（d）配列番号6に示される塩基配列の2086番に相当する位置におけるシトシン（C）からチミン（T）への変異
のうち少なくとも1つの変異を含む遺伝子によってコードされる、請求項１２に記載の方法。 The mutant SART-1 protein has the following mutations (c) and (d):
(c) a mutation from cytosine (C) to thymine (T) at the position corresponding to 1684 in the base sequence shown in SEQ ID NO:6;
(d) the method of claim 12, encoded by a gene containing at least one mutation from cytosine (C) to thymine (T) at a position corresponding to 2086 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6.
（i）配列番号4の1番から3549番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも10塩基からなるGC含量30%以上かつアニーリング温度（Tm値）50℃以上のプライマー、及び配列番号4の3551番から5501番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも10塩基からなるGC含量30%以上かつアニーリング温度（Tm値）50℃以上のプライマーを含むプライマーセット、あるいは
（ii）配列番号4の1番から4195番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも10塩基からなるGC含量30%以上かつアニーリング温度（Tm値）50℃以上のプライマー、及び配列番号4の4197番から5501番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも10塩基からなるGC含量30%以上かつアニーリング温度（Tm値）50℃以上のプライマーを含むプライマーセット
を使用したPCRにより行われる、請求項１４に記載の方法。 The gene encoding the mutant SART-1 protein is detected using the following primer set:
The method according to claim 14, wherein the PCR is performed using a primer set comprising: (i) a primer having a GC content of 30% or more and an annealing temperature (Tm value) of 50°C or more, which consists of at least 10 consecutive bases in the nucleotide sequence of 1 to 3549 of SEQ ID NO: 4 or its complementary sequence, and a primer having a GC content of 30% or more and an annealing temperature (Tm value) of 50°C or more, which consists of at least 10 consecutive bases in the nucleotide sequence of 3551 to 5501 of SEQ ID NO: 4 or its complementary sequence; or (ii) a primer set comprising a primer having a GC content of 30% or more and an annealing temperature (Tm value) of 50°C or more, which consists of at least 10 consecutive bases in the nucleotide sequence of 1 to 4195 of SEQ ID NO: 4 or its complementary sequence, and a primer having a GC content of 30% or more and an annealing temperature (Tm value) of 50°C or more, which consists of at least 10 consecutive bases in the nucleotide sequence of 4197 to 5501 of SEQ ID NO: 4 or its complementary sequence.
（i）配列番号4の1番から3549番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも10塩基からなるGC含量30%以上かつアニーリング温度（Tm値）50℃以上のプライマー、及び配列番号4の3551番から5501番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも10塩基からなるGC含量30%以上かつアニーリング温度（Tm値）50℃以上のプライマーを含むプライマーセット、あるいは
（ii）配列番号4の1番から4195番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも10塩基からなるGC含量30%以上かつアニーリング温度（Tm値）50℃以上のプライマー、及び配列番号4の4197番から5501番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも10塩基からなるGC含量30%以上かつアニーリング温度（Tm値）50℃以上のプライマーを含むプライマーセット。 A kit for use in a method for determining or selecting rice having a low amylose trait according to any one of claims 12 to 16, comprising the following primer set:
(i) a primer set comprising a primer consisting of at least 10 consecutive bases from the nucleotide sequence of 1 to 3549 of SEQ ID NO: 4 or its complementary sequence, having a GC content of 30% or more and an annealing temperature (Tm value) of 50°C or more, and a primer consisting of at least 10 consecutive bases from the nucleotide sequence of 3551 to 5501 of SEQ ID NO: 4 or its complementary sequence, having a GC content of 30% or more and an annealing temperature (Tm value) of 50°C or more; or (ii) a primer set comprising a primer consisting of at least 10 consecutive bases from the nucleotide sequence of 1 to 4195 of SEQ ID NO: 4 or its complementary sequence, having a GC content of 30% or more and an annealing temperature (Tm value) of 50°C or more, and a primer consisting of at least 10 consecutive bases from the nucleotide sequence of 4197 to 5501 of SEQ ID NO: 4 or its complementary sequence, having a GC content of 30% or more and an annealing temperature (Tm value) of 50°C or more.
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| SART-1 family protein DOT2 isoform X2 [Oryza sativa Japonica Group]，NCBI Protein database [online]，Accession No.XP_015626546，2018年08月07日，P.1-2，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/XP_015626546 |
| 農林水産省農林水産技術会議事務局研究成果，2008年，NO.460，P.35-38 |
| 農林水産省農林水産技術会議事務局研究成果，2014年，NO.512，P.192-195,204-206 |
| 農林水産省農林水産技術会議事務局研究成果，2014年，NO.516，P.18-20 |
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