JP7503384B2 - レジオネラ属菌鑑別用発色培地 - Google Patents
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Description
[1]Aldol 515 phosphateを含有することを特徴とするレジオネラ属菌の鑑別用発色培地。
[2]Aldol 515 phosphateの含有量が0.01g/L以上である[1]に記載の培地。
[3]培地1Lあたり、酵母エキス10g 、α‐ケトグルタル酸カリウム1g 、ACES(緩衝剤)10g、グリシン3g、活性炭2g、可溶性ピロリン酸鉄0.2g、バンコマイシン1~5mg、ポリミキシンB5,000~100,000unit、アムホテリシンB20~80mgおよび寒天15~18gを含有する[1]または[2]に記載のレジオネラ属菌の鑑別用発色培地。
[4]培地1Lあたり、酵母エキス10g、α‐ケトグルタル酸カリウム1g、ACES(緩衝剤)10g、グリシン3g、β-シクロデキストリン1.0~25.0g、可溶性ピロリン酸鉄0.2g、バンコマイシン1~5mg、ポリミキシンB5,000~100,000unit、アムホテリシンB20~80mgおよび寒天15~18gを含有する[1]または[2]に記載のレジオネラ属菌の鑑別用発色培地。
[5]Aldol 515 phosphateを含むレジオネラ属菌鑑別用発色培地を用いるレジオネラ属菌の鑑別方法。
[6]Aldol 515 phosphateの含有量が0.01g/L以上である[5]に記載の鑑別方法。
[7]培地1 L あたり、酵母エキス10g 、α‐ケトグルタル酸カリウム1g 、ACES(緩衝剤)10g、グリシン3g、活性炭2g、可溶性ピロリン酸鉄0.2g、バンコマイシン1~5mg、ポリミキシンB5,000~100,000unit、アムホテリシンB20~80mgおよび寒天15~18gを含有する培地を用いる[5]または[6]に記載の鑑別方法。
[8]培地1 L あたり、酵母エキス10g 、α‐ケトグルタル酸カリウム1g 、ACES(緩衝剤)10g、グリシン3g、β-シクロデキストリン1.0~25.0g、可溶性ピロリン酸鉄0.2g、バンコマイシン1~5mg、ポリミキシンB5,000~100,000unit、アムホテリシンB20~80mgおよび寒天15~18gを含有する培地を用いる[5]または[6]に記載の鑑別方法。
また、Aldol 515 phosphateは、その濃度 0.4g/Lまでは、レジオネラ属菌の発育への影響、すなわち、発育阻害が認められず、レジオネラ属菌のコロニーを明瞭に発色させることができる。
また、非選択培地、選択培地を問わず、レジオネラ属菌用の培養培地において、活性炭を用いる場合(黒色培地)、活性炭の代わりにβ-シクロデキストリンを含む場合(無色透明培地)、いずれの場合においても、レジオネラ属菌のコロニーを明瞭に発色させることができる。
レジオネラ属菌を発色させる各種発色基質を検索するための実験を行った。
表1に示す改良WYOα培地(活性炭の代わりにβ-シクロデキストリン(表中β-CD)を8g/Lで含むWYOα培地)の組成に、細菌の持つ種々の酵素活性を利用してコロニーを発色させる発色基質として知られる各種化合物をX-galactopyranoside、X-glucopyranoside、magenta galactopyranoside(Magenta-Gal、Red-Gal、5-Bromo-6-chloro-3-indoyl β-D-galactopyranosideに同じ)、Salmon phosphate(6-Chloro-3-indoxyl phosphateに同じ)、X-phosphate、ONPC(2-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosideに同じ)、 Aldol 515 phosphate、Aldol 514 inositol phosphate、Aldol 470 choline phosphate、TTC(2,3,5-Triphenyltetrazolium chlorideに同じ)をそれぞれ添加した培地を調製した。これら各種化合物の培地への添加量については、TTCを除く9種類の化合物は0.1g/Lとなるように調製し、TTCのみ0.03g/Lとなるように調製した。また、対照としていずれの発色基質も含まない培地を調製した。
具体的には、表1(A)の各培地成分を精製水990mLに溶解し、121℃で15分間高圧蒸気滅菌した後、55℃の温水浴槽中にて保温し、これに表1(B)の成分であるピロリン酸鉄、バンコマイシン、ポリミキシンB、各種の発色基質は精製水で溶解し、アムホテリシンBは1N NaOH溶液で溶解し、それぞれの濾過滅菌済み溶液を調製して(対照用の培地の場合は、滅菌水を用いた)2mLずつ添加し、よく攪拌した後、各培地をシャーレに20mLずつ分注し、放冷して固化させた。
試験菌としてLegionella pneumophila 5菌株(社内保存株、菌株番号:EKN3677、EKN3678、EKN3679、EKN3680、EKN3682)およびLegionella fraseri 1菌株(社内保存株、菌株番号:EKN3681)を用いた。
それぞれの菌株をBCYEα培地に接種し、37℃、2日間培養した菌体を生理食塩水に懸濁し、McFarland No.1の菌懸濁液を調製した。この菌懸濁液1白金耳を各培地に画線塗抹接種し、37℃、2日間培養した。
表2に示すように、対照用改良WYOα培地、Salmon phosphateおよびX-phosphate以外の発色基質を含む改良WYOα培地では、試験菌6菌株すべてが発育し、これらのうち、Aldol 515 phosphateおよびTTCを含む改良WYOα培地において、試験菌コロニーの発色(赤色)が観察された。Aldol 515 phosphateでは、コロニーが密集している部分(以下、ローン部分)および単独コロニーにおいて発色が観察され、TTCではローン部分においてのみで発色が確認された。
発色基質としてAldol 515 phosphate添加量の検討する実験を行った。
表1に示す改良WYOα培地の組成にAldol 515 phosphateを0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.10、0.15、0.20、0.40g/Lで含む培地を調製した。また、対照としてAldol 515 phosphateを含まない改良WYOα培地とWYOα培地(組成は表1を参照)をそれぞれ調製した。
実施例1と同じ試験菌株を用い、実施例1と同様にそれぞれの菌株の菌懸濁液を調製し、各培地に接種し、37℃、5日間培養した。
表3に示すように、対照用改良WYOα培地およびWYOα培地、発色基質Aldol 515 phosphateを各種濃度で含む改良WYOα培地のすべての培地において、試験菌6菌株すべてが発育した。培養2日目で、対照用改良WYOα培地およびWYOα培地では試験菌6菌株すべてにおいて発色は観察されず、Aldol 515 phosphateを含む改良WYOα培地では試験菌6菌株すべてでAldol 515 phosphate 0.01g/Lで淡桃色、0.02g/Lから0.04g/Lで桃色、0.05g/Lから4.00g/Lで赤色の発色が観察された。また、これらの発色は、2日以上培養を継続しても、発色の程度が培養時間の経過により濃くなるが、変色はみられなかった。
従来用いられているレジオネラ属菌用培地として、活性炭を含むWYOα培地においてAldol 515 phosphateを発色基質としてレジオネラ属菌を発色できるか検討する実験を行った。
表1に示すWYOα培地および改良WYOα培地の組成にAldol 515 phosphateを0.05g/Lで含む培地をそれぞれ調製した。また、対照としてAldol 515 phosphateを含まない培地もWYOα培地および改良WYOα培地のそれぞれで調製した。
実施例1と同じ試験菌株を用い、実施例1と同様にそれぞれの菌株の菌懸濁液を調製し、各培地に接種し、37℃、2日間培養した。
表4に示すように、WYOα培地および改良WYOα培地に対する発色基質Aldol 515 phosphate添加の有無にかかわらず、すべての培地において、試験菌6菌株はすべて発育した。Aldol 515 phosphateを含まないWYOα培地および改良WYOα培地ではすべての試験菌株において発色は観察されず、Aldol 515 phosphateを含むWYOα培地および改良WYOα培地ではすべての試験菌株において赤色の発色が観察された。
実施例1から3までで用いた試験菌株とは異なるレジオネラ属菌種、菌株についてAldol 515 phosphateを発色基質として発色できるかを確認する実験を行った。
表1に示す改良WYOα培地の組成にAldol 515 phosphateを0.05g/Lで含む培地を調製した。
試験菌として、Legionella anisa(社内保存株、菌株番号:EKN5282)、Legionella erythra(社内保存株、菌株番号:EKN5887)、Legionella feeleii(社内保存株、菌株番号:EKN5831)、Legionella fraseri(社内保存株、菌株番号:EKN3683)、Legionella longbeachae(社内保存株、菌株番号:EKN3689)の5菌株を用いた。実施例1と同様にそれぞれの菌株の菌懸濁液を調製し、培地に接種し、37℃、2日間培養した。
表5に示すように、発色基質Aldol 515 phosphateを含む改良WYOα培地で、試験菌5菌株すべてが発育し、赤色の発色が観察された。
Claims (16)
- Aldol 515 phosphate、酵母エキス、α-ケトグルタル酸カリウム、ACES(緩衝剤)、活性炭またはβ-シクロデキストリン、可溶性ピロリン酸鉄、抗菌薬、抗真菌剤、および寒天を含有し、
前記抗菌薬が、グリシン、ポリミキシンB、セファマンドール、バンコマイシン、セファロチン、およびコリスチンからなる群から選択される少なくとも1種であり、
前記抗真菌剤が、アニソマイシン、シクロヘキシミド、およびアムホテリシンBからなる群から選択される少なくとも1種である、
レジオネラ属菌の鑑別用発色培地。 - Aldol 515 phosphateの含有量が0.01g/L以上である請求項1に記載の培地。
- 前記抗菌薬がグリシン、ポリミキシンB、およびバンコマイシンであり、前記抗真菌剤がアムホテリシンBである、請求項1または2に記載のレジオネラ属菌の鑑別用発色培地。
- Aldol 515 phosphateを含有する、BMPAα寒天培地、WYOα寒天培地、PAV寒天培地、CCVC寒天培地、またはMWY寒天培地である、請求項1または2に記載のレジオネラ属菌の鑑別用発色培地。
- 培地1Lあたり、酵母エキス10g、α‐ケトグルタル酸カリウム1g、ACES(緩衝剤)10g、グリシン3g、活性炭2g、可溶性ピロリン酸鉄0.2g、バンコマイシン1~5mg、ポリミキシンB5,000~100,000unit、アムホテリシンB20~80mgおよび寒天15~18gを含有する請求項1~3のうちのいずれか一項に記載のレジオネラ属菌の鑑別用発色培地。
- 培地1Lあたり、酵母エキス10g、α‐ケトグルタル酸カリウム1g、ACES(緩衝剤)10g、グリシン3g、β-シクロデキストリン1.0~25.0g、可溶性ピロリン酸鉄0.2g、バンコマイシン1~5mg、ポリミキシンB5,000~100,000unit、アムホテリシンB20~80mgおよび寒天15~18gを含有する請求項1~3のうちのいずれか一項に記載のレジオネラ属菌の鑑別用発色培地。
- 前記レジオネラ属菌が、Legionella pneumophila、Legionella anisa、Legionella erythra、Legionella feeleii、Legionella fraseri、およびLegionella longbeachaeからなる群から選択される少なくとも1種である、請求項1~6のうちのいずれか一項に記載のレジオネラ属菌の鑑別用発色培地。
- Aldol 515 phosphate、酵母エキス、α-ケトグルタル酸カリウム、ACES(緩衝剤)、活性炭またはβ-シクロデキストリン、可溶性ピロリン酸鉄、抗菌薬、抗真菌剤、および寒天を含有し、
前記抗菌薬が、グリシン、ポリミキシンB、セファマンドール、バンコマイシン、セファロチン、およびコリスチンからなる群から選択される少なくとも1種であり、
前記抗真菌剤が、アニソマイシン、シクロヘキシミド、およびアムホテリシンBからなる群から選択される少なくとも1種であるレジオネラ属菌鑑別用発色培地でレジオネラ属菌を培養する工程を含む、
レジオネラ属菌の鑑別方法。 - 前記培地におけるAldol 515 phosphateの含有量が0.01g/L以上である請求項8に記載の鑑別方法。
- 前記培地における前記抗菌薬がグリシン、ポリミキシンB、およびバンコマイシンであり、前記抗真菌剤がアムホテリシンBである、請求項8または9に記載の鑑別方法。
- 前記培地が、Aldol 515 phosphateを含有する、BMPAα寒天培地、WYOα寒天培地、PAV寒天培地、CCVC寒天培地、またはMWY寒天培地である、請求項8または9に記載の鑑別方法。
- 前記培地が、培地1Lあたり、酵母エキス10g、α‐ケトグルタル酸カリウム1g、ACES(緩衝剤)10g、グリシン3g、活性炭2g、可溶性ピロリン酸鉄0.2g、バンコマイシン1~5mg、ポリミキシンB5,000~100,000unit、アムホテリシンB20~80mgおよび寒天15~18gを含有する培地である、請求項8~10のうちのいずれか一項に記載の鑑別方法。
- 前記培地が、培地1Lあたり、酵母エキス10g、α‐ケトグルタル酸カリウム1g、ACES(緩衝剤)10g、グリシン3g、β-シクロデキストリン1.0~25.0g、可溶性ピロリン酸鉄0.2g、バンコマイシン1~5mg、ポリミキシンB5,000~100,000unit、アムホテリシンB20~80mgおよび寒天15g~18を含有する培地である、請求項8~10のうちのいずれか一項に記載の鑑別方法。
- 前記レジオネラ属菌が、Legionella pneumophila、Legionella anisa、Legionella erythra、Legionella feeleii、Legionella fraseri、およびLegionella longbeachaeからなる群から選択される少なくとも1種である、請求項8~13のうちのいずれか一項に記載の鑑別方法。
- 前記培養の期間が2日間である、請求項8~14のうちのいずれか一項に記載の鑑別方法。
- 請求項1~7のうちのいずれか一項に記載のレジオネラ属菌の鑑別用発色培地でレジオネラ属菌を培養する工程を含む、レジオネラ属菌の発色方法。
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