JP7503384B2 - レジオネラ属菌鑑別用発色培地 - Google Patents
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Description
本発明は、環境検体あるいは臨床検体からレジオネラ症の原因菌であるレジオネラ属菌(Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．)を迅速に鑑別するためのレジオネラ属菌鑑別用発色培地に関する。
レジオネラ属菌は、劇症型肺炎と一過性のポンティアック熱レジオネラ症の二つの病型に分類されるレジオネラ症の原因菌である。
レジオネラ属菌は、本来、土壌や淡水等の環境中に生息する環境細菌であるが、クーリングタワー等の空気調和設備、噴水等の水景施設、公衆浴場の給湯設備やシャワーヘッド、ジャグジー、加湿器等の人工環境水においても発育し、エアロゾルを介した気道感染により肺炎を引き起こすことが知られている。高齢者、新生児や免疫不全の患者等がレジオネラ症のリスクグループとされており、特に免疫不全患者では肺炎の劇症化と多臓器不全の併発の可能性が高い。
臨床検査や環境検査において、レジオネラ属菌の分離は、主要な検査法の一つであるが、レジオネラ属菌の発育条件は一般の細菌に比較して極めて厳しく、レジオネラ属菌用の培養培地として種々の培地が考案されているものの、発育至適ｐＨ は６．９０±０．０５、培養温度は３６±１℃、酸素が十分存在する環境において初代分離に３日以上を要する。このため、分離培養の結果が患者発生時の原因（起炎菌）の特定や治療方針の決定に反映されにくいが、疫学的観点からは依然として重要である。
また、微生物検査の分野においては、人、資源、時間面でのコスト低減が厳しく要求されており、検出対象の細菌の選択分離培養と鑑別培養を同時に行うことのできる選択鑑別培地（又は選択分離鑑別培地ともいう）が求められる傾向が強まっており、レジオネラ属菌においても多分に漏れない。
レジオネラ属菌用の培養培地としては、ＣＹＥ寒天培地、ＢＣＹＥ寒天培地、ＢＣＹＥα寒天培地等の非選択培地、ＧＶＰＣ寒天培地、ＷＹＯα寒天培地、ＰＡＶ寒天培地、ＣＣＶＣ寒天培地等のレジオネラ属菌の選択分離培地（或は単に選択培地、又は、分離培地ともいう）が挙げられるほか、選択分離と同時に、ｐＨ指示薬、発色基質、蛍光基質等の添加剤を利用して検出対象である細菌の生化学的性状を指標として鑑別までを行う選択鑑別培地が挙げられる。
これまでに知られている選択鑑別培地としては、ｐH指示薬を利用したＭＷＹ寒天培地がある（非特許文献１）。ｐH指示薬を利用した鑑別の機構は、検出対象の細菌（菌種）の糖の資化能を利用したｐＨ指示薬の変化によるコロニー色の呈色、すなわち発色であるが、元来、レジオネラ属菌には糖の資化能はない。ＭＷＹ寒天培地においては、レジオネラ属菌に僅かに認められるアミノ酸分解能を利用してｐＨ指示薬を呈色させているのであるが、その発色の程度は非常に弱く、十分な時間（通常３～５日）培養を行ってもコロニー色の視認性が低いことが難点であった。
また、ＭＷＹ寒天培地では、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌ．ｂｏｓｅｍａｎｉｉ、Ｌ．ｍｉｃｄａｄｅｉの3菌種を鑑別するのみであるが、レジオネラ属菌には多数の菌種が知られており、レジオネラ属菌は潜在的に病原性があると考えられていることから、先の3菌種の鑑別だけでは不十分と言わざるを得ない。
他方、発色基質を利用したコロニーの発色による標的細菌の鑑別方法では、細菌の持つ酵素の作用（酵素活性）を利用して発色基質を加水分解することで遊離される発色団化合物および／ または蛍光発色団化合物が発色および／または蛍光を呈すること、すなわち呈色反応（発色反応ともいう）の原理を用いており、この呈色反応がコロニー色として現れることで、標的細菌コロニーの目視による視認性を高めたり、装置による簡易かつ高感度な測定を可能にしたりする。また、呈色反応は、生化学、免疫学、分子生物学、微生物学など幅広い分野においても、酵素活性検出指標として応用されている。特に微生物学分野では、酵素活性を測定することにより微生物を検出または識別する方法に応用されており、コロニー所見の鑑別において検査者の熟練を要さず、煩雑な微生物確認試験を省略できることから、簡易で迅速な方法として汎用されている。
例えば、特許文献１ には、発色基質である５－ブロモ－６－クロロ－３－インドキシルホスフェートを培地に含有させ、スタフィロコッカス・アウレウス（ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、以下、黄色ブドウ球菌という。） のホスファターゼ活性を検出する方法が記載されている。
また、特許文献２ には、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドキシル－β－グルコシドを培地に含有させてエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌のβ－ グルコシダーゼ活性を検出する方法、特許文献３ には、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－Ｎ－アセチル－β－Ｄ－グルコサミニドを培地に含有させてカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）のＮ－アセチル－β－Ｄ－グルコサミニダーゼ活性を検出する方法が記載されている。
さらに特許文献４ には、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルホスファチジルミオイノシトールを培地に含有させてリステリア・モノサイトジェネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ） およびリステリア・イヴァノヴィ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ） のホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ活性を検出する方法が記載されている。
しかし、レジオネラ属菌のコロニーを発色しうる適当な発色基質はこれまで見いだされていない。
病原体検出マニュアル ４類感染症 レジオネラ症 ２０１１年１０月版
本発明の目的は、短い培養期間で、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａおよびその他のレジオネラ属菌のコロニー色を明瞭に発色させ、レジオネラ属菌の鑑別性に優れたレジオネラ属菌の鑑別用発色培地を提供することにある。
本発明者は、前記目的を達成するために鋭意検討を行った結果、レジオネラ属菌用培養培地において、発色基質としてＡｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを用いることで、培養２日目からレジオネラ属菌を特異的且つ明瞭に発色させることができることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明の構成は、以下の［１］から［８］の通りである。
［１］Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを含有することを特徴とするレジオネラ属菌の鑑別用発色培地。
［２］Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅの含有量が０．０１ｇ／Ｌ以上である［１］に記載の培地。
［３］培地１Ｌあたり、酵母エキス１０ｇ 、α‐ケトグルタル酸カリウム１ｇ 、ＡＣＥＳ（緩衝剤）１０ｇ、グリシン３ｇ、活性炭２ｇ、可溶性ピロリン酸鉄０．２ｇ、バンコマイシン１～５ｍｇ、ポリミキシンＢ５，０００～１００，０００ｕｎｉｔ、アムホテリシンＢ２０～８０ｍｇおよび寒天１５～１８ｇを含有する［１］または［２］に記載のレジオネラ属菌の鑑別用発色培地。
［４］培地１Ｌあたり、酵母エキス１０ｇ、α‐ケトグルタル酸カリウム１ｇ、ＡＣＥＳ（緩衝剤）１０ｇ、グリシン３ｇ、β-シクロデキストリン１．０～２５．０ｇ、可溶性ピロリン酸鉄０．２ｇ、バンコマイシン１～５ｍｇ、ポリミキシンＢ５，０００～１００，０００ｕｎｉｔ、アムホテリシンＢ２０～８０ｍｇおよび寒天１５～１８ｇを含有する［１］または［２］に記載のレジオネラ属菌の鑑別用発色培地。
［５］Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを含むレジオネラ属菌鑑別用発色培地を用いるレジオネラ属菌の鑑別方法。
［６］Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅの含有量が０．０１ｇ／Ｌ以上である［５］に記載の鑑別方法。
［７］培地１ Ｌ あたり、酵母エキス１０ｇ 、α‐ケトグルタル酸カリウム１ｇ 、ＡＣＥＳ（緩衝剤）１０ｇ、グリシン３ｇ、活性炭２ｇ、可溶性ピロリン酸鉄０．２ｇ、バンコマイシン１～５ｍｇ、ポリミキシンＢ５，０００～１００，０００ｕｎｉｔ、アムホテリシンＢ２０～８０ｍｇおよび寒天１５～１８ｇを含有する培地を用いる［５］または［６］に記載の鑑別方法。
［８］培地１ Ｌ あたり、酵母エキス１０ｇ 、α‐ケトグルタル酸カリウム１ｇ 、ＡＣＥＳ（緩衝剤）１０ｇ、グリシン３ｇ、β-シクロデキストリン１．０～２５．０ｇ、可溶性ピロリン酸鉄０．２ｇ、バンコマイシン１～５ｍｇ、ポリミキシンＢ５，０００～１００，０００ｕｎｉｔ、アムホテリシンＢ２０～８０ｍｇおよび寒天１５～１８ｇを含有する培地を用いる［５］または［６］に記載の鑑別方法。
［１］Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを含有することを特徴とするレジオネラ属菌の鑑別用発色培地。
［２］Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅの含有量が０．０１ｇ／Ｌ以上である［１］に記載の培地。
［３］培地１Ｌあたり、酵母エキス１０ｇ 、α‐ケトグルタル酸カリウム１ｇ 、ＡＣＥＳ（緩衝剤）１０ｇ、グリシン３ｇ、活性炭２ｇ、可溶性ピロリン酸鉄０．２ｇ、バンコマイシン１～５ｍｇ、ポリミキシンＢ５，０００～１００，０００ｕｎｉｔ、アムホテリシンＢ２０～８０ｍｇおよび寒天１５～１８ｇを含有する［１］または［２］に記載のレジオネラ属菌の鑑別用発色培地。
［４］培地１Ｌあたり、酵母エキス１０ｇ、α‐ケトグルタル酸カリウム１ｇ、ＡＣＥＳ（緩衝剤）１０ｇ、グリシン３ｇ、β-シクロデキストリン１．０～２５．０ｇ、可溶性ピロリン酸鉄０．２ｇ、バンコマイシン１～５ｍｇ、ポリミキシンＢ５，０００～１００，０００ｕｎｉｔ、アムホテリシンＢ２０～８０ｍｇおよび寒天１５～１８ｇを含有する［１］または［２］に記載のレジオネラ属菌の鑑別用発色培地。
［５］Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを含むレジオネラ属菌鑑別用発色培地を用いるレジオネラ属菌の鑑別方法。
［６］Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅの含有量が０．０１ｇ／Ｌ以上である［５］に記載の鑑別方法。
［７］培地１ Ｌ あたり、酵母エキス１０ｇ 、α‐ケトグルタル酸カリウム１ｇ 、ＡＣＥＳ（緩衝剤）１０ｇ、グリシン３ｇ、活性炭２ｇ、可溶性ピロリン酸鉄０．２ｇ、バンコマイシン１～５ｍｇ、ポリミキシンＢ５，０００～１００，０００ｕｎｉｔ、アムホテリシンＢ２０～８０ｍｇおよび寒天１５～１８ｇを含有する培地を用いる［５］または［６］に記載の鑑別方法。
［８］培地１ Ｌ あたり、酵母エキス１０ｇ 、α‐ケトグルタル酸カリウム１ｇ 、ＡＣＥＳ（緩衝剤）１０ｇ、グリシン３ｇ、β-シクロデキストリン１．０～２５．０ｇ、可溶性ピロリン酸鉄０．２ｇ、バンコマイシン１～５ｍｇ、ポリミキシンＢ５，０００～１００，０００ｕｎｉｔ、アムホテリシンＢ２０～８０ｍｇおよび寒天１５～１８ｇを含有する培地を用いる［５］または［６］に記載の鑑別方法。
本発明により、レジオネラ属菌用の培養培地において、Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを用いることで、培養２日目から、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａおよびその他のレジオネラ属菌のコロニー色を明瞭に発色させ、レジオネラ属菌の鑑別性に優れたレジオネラ属菌の鑑別用発色培地が得られる。
「Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ」は、１－（２－（４－ジメチルアミノベンゾイル）フェニル）－１Ｈ－インドール－３－イルリン酸（ＣＡＳ Ｎｏ．１６３０９４０－４６－３）であり、Ｂｉｏｓｙｎｔｈ社製Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅのナトリウム塩として入手可能である。
Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅは、黄色ブドウ球菌や偏性嫌気性菌の発色基質としての使用が推奨されているが、これまでにレジオネラ属菌の鑑別培地に用いられた例はない。
レジオネラ属菌鑑別用発色培地におけるコロニー発色に適したＡｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅの濃度は、０．０１ｇ／Ｌ以上、好ましくは０．０２ｇ／以上、より好ましくは０．０５ｇ／Ｌ以上である。
また、Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅは、その濃度 ０．４ｇ／Ｌまでは、レジオネラ属菌の発育への影響、すなわち、発育阻害が認められず、レジオネラ属菌のコロニーを明瞭に発色させることができる。
また、Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅは、その濃度 ０．４ｇ／Ｌまでは、レジオネラ属菌の発育への影響、すなわち、発育阻害が認められず、レジオネラ属菌のコロニーを明瞭に発色させることができる。
更に、Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを含むレジオネラ属菌用の鑑別培地では、培養２日目からレジオネラ属菌のコロニーに明瞭な発色がみられ、また、２日以上培養を続けても、レジオネラ属菌のコロニーの発色に変化はみられず、安定的に明瞭な発色がみられる。
Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを含むレジオネラ属菌用の鑑別培地における発色は、実体顕微鏡によるコロニー観察、すなわち斜光法によるレジオネラ属菌のカットグラス様あるいはモザイク様とも呼ばれる特徴的外観構造の観察を妨げない。
本発明の鑑別培地によれば、従来は、斜光法によるレジオネラ属菌の特徴的外観構造の観察のみを指標としていたところに、明瞭な発色という指標が加わることで、培地上に発育したコロニーがレジオネラ属菌であるか否かについて、より確度の高い結果が得られる。
本発明の鑑別培地のベースとして使用可能なレジオネラ属菌用の培養培地としては、ＣＹＥ寒天培地、ＢＣＹＥ寒天培地、ＢＣＹＥα寒天培地等の非選択培地、ＧＶＰ寒天培地、ＷＹＯα寒天培地等のレジオネラ属菌の選択分離培地（或は単に選択培地、又は、分離培地ともいう）が挙げられるが、レジオネラの培養を目的とする寒天培地であれば、特に限定されず、本明細書においては、特に断りの無い限り、レジオネラ属菌用の培養培地は、非選択培地と選択分離培地を含む。その他、ＭＷＹ寒天培地等のｐＨ指示薬を用いるレジオネラ属菌用の鑑別培地において、ｐＨ指示薬の代わりに、或いは、ｐＨ指示薬と共にＡｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを用いることができる。つまり、本発明の鑑別培地は、選択分離培養と鑑別培養を同時に行う選択鑑別培地であってもよく、鑑別培養のみを行う鑑別培地であってもよい。
また、非選択培地、選択培地を問わず、レジオネラ属菌用の培養培地において、活性炭を用いる場合（黒色培地）、活性炭の代わりにβ-シクロデキストリンを含む場合（無色透明培地）、いずれの場合においても、レジオネラ属菌のコロニーを明瞭に発色させることができる。
また、非選択培地、選択培地を問わず、レジオネラ属菌用の培養培地において、活性炭を用いる場合（黒色培地）、活性炭の代わりにβ-シクロデキストリンを含む場合（無色透明培地）、いずれの場合においても、レジオネラ属菌のコロニーを明瞭に発色させることができる。
例えば、現在、レジオネラ属菌用の非選択培地のうち、レジオネラ属菌の生育能に最も優れた培地として知られているのがＢＣＹＥα寒天培地であり、ＢＣＹＥα寒天培地は、その組成成分として、酵母エキス、α‐ケトグルタル酸カリウム、ＡＣＥＳ（緩衝剤）、グリシン、活性炭、可溶性ピロリン酸鉄、および寒天を含有する。また、レジオネラ属菌の培養検査においてよく用いられている各種の選択培地（ＢＭＰＡα寒天培地、ＧＶＰＣ寒天培地、ＷＹＯ寒天培地、ＷＹＯα寒天培地、ＰＡＶ寒天培地、ＣＣＶＣ寒天培地、ＭＷＹ寒天培地）は、いずれもＢＣＹＥα寒天培地の組成成分をベースにして、それぞれ種々の抗菌薬と抗真菌剤を含有しており、抗菌薬としては、ポリミキシンＢ、セファマンドール、バンコマイシン、セファロチン、コリスチン、抗真菌剤としては、アニソマイシン、シクロヘキシミド、アムホテリシンＢが、それぞれの選択培地において所定の組合せと所定の濃度で用いられている。本発明の鑑別培地のベースに用いるレジオネラ属菌培養用の培地として、これらの非選択培地や選択培地をベースとする非選択培地の組成成分のまま、選択培地それぞれの抗菌薬および抗真菌剤の組合せと濃度で用いることもできるが、ベースとする非選択培地の各種組成成分の濃度や、選択培地に添加する抗菌薬および抗真菌剤の組合せと濃度を変えた改良培地を用いることもできる。
本発明の実施の形態の一例として、例えば、培地１Ｌあたり、酵母エキス１０ｇ、α‐ケトグルタル酸カリウム１ｇ、ＡＣＥＳ（緩衝剤）１０ｇ、グリシン３ｇ、活性炭２ｇ、可溶性ピロリン酸鉄０．２ｇ、バンコマイシン１～５ｍｇ、ポリミキシンＢ５，０００～１００，０００ｕｎｉｔ、アムホテリシンＢ２０～８０ｍｇおよび寒天１５～１８ｇを含有する請求項１または２に記載のレジオネラ属菌の鑑別用発色培地が挙げられる。
また、別の例としては、例えば、培地１Ｌあたり、酵母エキス１０ｇ、α‐ケトグルタル酸カリウム１ｇ、ＡＣＥＳ（緩衝剤）１０ｇ、グリシン３ｇ、β-シクロデキストリン１．０～２５．０ｇ、可溶性ピロリン酸鉄０．２ｇ、バンコマイシン１～５ｍｇ、ポリミキシンＢ５，０００～１００，０００ｕｎｉｔ、アムホテリシンＢ２０～８０ｍｇおよび寒天１５～１８ｇを含有する請求項１または２に記載のレジオネラ属菌の鑑別用発色培地が挙げられる。
本発明は、上述したＡｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを含むレジオネラ属菌鑑別用発色培地とともに、当該レジオネラ属菌鑑別用発色培地を用いてレジオネラ属菌を鑑別する方法を提供する。
本発明の鑑別培地において培養の対象となる微生物は、鑑別培地に生育し得るＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ属菌であるＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌ．ｂｏｚｅｍａｎｉｉ、Ｌ．ｌｏｎｇｂｅａｃｈａｅ、Ｌ．ｍｉｃｄａｄｅｉ、Ｌ．ｇｏｒｍａｎｉｉ、Ｌ．ｆｅｅｌｅｉｉ、Ｌ．ｊｏｒｄａｎｉｓ、Ｌ．ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉｅｎｓｉｓ、Ｌ．ｏａｋｒｉｄｇｅｎｓｉｓ、Ｌ．ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉｅｎｓｉｓ、Ｌ．ａｎｉｓａ、Ｌ．ｐａｒｉｓｉｅｎｓｉｓ等が具体例として挙げられるが、特にこれらに限定されない。
以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は、実施例に限定されるものではない。
レジオネラ属菌を発色させる化合物の検討
レジオネラ属菌を発色させる各種発色基質を検索するための実験を行った。
レジオネラ属菌を発色させる各種発色基質を検索するための実験を行った。
（１）培地の調製
表１に示す改良ＷＹＯα培地（活性炭の代わりにβ－シクロデキストリン（表中β－ＣＤ）を８ｇ／Ｌで含むＷＹＯα培地）の組成に、細菌の持つ種々の酵素活性を利用してコロニーを発色させる発色基質として知られる各種化合物をＸ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、Ｘ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、ｍａｇｅｎｔａ ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｍａｇｅｎｔａ－Ｇａｌ、Ｒｅｄ－Ｇａｌ、５－Ｂｒｏｍｏ－６－ｃｈｌｏｒｏ－３－ｉｎｄｏｙｌ β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅに同じ）、Ｓａｌｍｏｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（６－Ｃｈｌｏｒｏ－３－ｉｎｄｏｘｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅに同じ）、Ｘ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＯＮＰＣ（２－Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅに同じ）、 Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、Ａｌｄｏｌ ５１４ ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、Ａｌｄｏｌ ４７０ ｃｈｏｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＴＴＣ（２，３，５－Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅに同じ）をそれぞれ添加した培地を調製した。これら各種化合物の培地への添加量については、ＴＴＣを除く9種類の化合物は０．１ｇ／Lとなるように調製し、ＴＴＣのみ０．０３ｇ／Lとなるように調製した。また、対照としていずれの発色基質も含まない培地を調製した。
具体的には、表１（Ａ）の各培地成分を精製水９９０ｍＬに溶解し、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌した後、５５℃の温水浴槽中にて保温し、これに表１（Ｂ）の成分であるピロリン酸鉄、バンコマイシン、ポリミキシンＢ、各種の発色基質は精製水で溶解し、アムホテリシンＢは１Ｎ ＮａＯＨ溶液で溶解し、それぞれの濾過滅菌済み溶液を調製して（対照用の培地の場合は、滅菌水を用いた）２ｍＬずつ添加し、よく攪拌した後、各培地をシャーレに２０ｍＬずつ分注し、放冷して固化させた。
表１に示す改良ＷＹＯα培地（活性炭の代わりにβ－シクロデキストリン（表中β－ＣＤ）を８ｇ／Ｌで含むＷＹＯα培地）の組成に、細菌の持つ種々の酵素活性を利用してコロニーを発色させる発色基質として知られる各種化合物をＸ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、Ｘ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、ｍａｇｅｎｔａ ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｍａｇｅｎｔａ－Ｇａｌ、Ｒｅｄ－Ｇａｌ、５－Ｂｒｏｍｏ－６－ｃｈｌｏｒｏ－３－ｉｎｄｏｙｌ β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅに同じ）、Ｓａｌｍｏｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（６－Ｃｈｌｏｒｏ－３－ｉｎｄｏｘｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅに同じ）、Ｘ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＯＮＰＣ（２－Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅに同じ）、 Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、Ａｌｄｏｌ ５１４ ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、Ａｌｄｏｌ ４７０ ｃｈｏｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＴＴＣ（２，３，５－Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅに同じ）をそれぞれ添加した培地を調製した。これら各種化合物の培地への添加量については、ＴＴＣを除く9種類の化合物は０．１ｇ／Lとなるように調製し、ＴＴＣのみ０．０３ｇ／Lとなるように調製した。また、対照としていずれの発色基質も含まない培地を調製した。
具体的には、表１（Ａ）の各培地成分を精製水９９０ｍＬに溶解し、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌した後、５５℃の温水浴槽中にて保温し、これに表１（Ｂ）の成分であるピロリン酸鉄、バンコマイシン、ポリミキシンＢ、各種の発色基質は精製水で溶解し、アムホテリシンＢは１Ｎ ＮａＯＨ溶液で溶解し、それぞれの濾過滅菌済み溶液を調製して（対照用の培地の場合は、滅菌水を用いた）２ｍＬずつ添加し、よく攪拌した後、各培地をシャーレに２０ｍＬずつ分注し、放冷して固化させた。
（２）実験方法
試験菌としてＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ ５菌株（社内保存株、菌株番号：ＥＫＮ３６７７、ＥＫＮ３６７８、ＥＫＮ３６７９、ＥＫＮ３６８０、ＥＫＮ３６８２）およびＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｆｒａｓｅｒｉ １菌株（社内保存株、菌株番号：ＥＫＮ３６８１）を用いた。
それぞれの菌株をＢＣＹＥα培地に接種し、３７℃、２日間培養した菌体を生理食塩水に懸濁し、ＭｃＦａｒｌａｎｄ Ｎｏ．１の菌懸濁液を調製した。この菌懸濁液１白金耳を各培地に画線塗抹接種し、３７℃、２日間培養した。
試験菌としてＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ ５菌株（社内保存株、菌株番号：ＥＫＮ３６７７、ＥＫＮ３６７８、ＥＫＮ３６７９、ＥＫＮ３６８０、ＥＫＮ３６８２）およびＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｆｒａｓｅｒｉ １菌株（社内保存株、菌株番号：ＥＫＮ３６８１）を用いた。
それぞれの菌株をＢＣＹＥα培地に接種し、３７℃、２日間培養した菌体を生理食塩水に懸濁し、ＭｃＦａｒｌａｎｄ Ｎｏ．１の菌懸濁液を調製した。この菌懸濁液１白金耳を各培地に画線塗抹接種し、３７℃、２日間培養した。
（３）結果
表２に示すように、対照用改良ＷＹＯα培地、Ｓａｌｍｏｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅおよびＸ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ以外の発色基質を含む改良ＷＹＯα培地では、試験菌６菌株すべてが発育し、これらのうち、Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅおよびＴＴＣを含む改良ＷＹＯα培地において、試験菌コロニーの発色（赤色）が観察された。Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅでは、コロニーが密集している部分（以下、ローン部分）および単独コロニーにおいて発色が観察され、ＴＴＣではローン部分においてのみで発色が確認された。
表２に示すように、対照用改良ＷＹＯα培地、Ｓａｌｍｏｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅおよびＸ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ以外の発色基質を含む改良ＷＹＯα培地では、試験菌６菌株すべてが発育し、これらのうち、Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅおよびＴＴＣを含む改良ＷＹＯα培地において、試験菌コロニーの発色（赤色）が観察された。Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅでは、コロニーが密集している部分（以下、ローン部分）および単独コロニーにおいて発色が観察され、ＴＴＣではローン部分においてのみで発色が確認された。
Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ添加量の検討
発色基質としてＡｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ添加量の検討する実験を行った。
発色基質としてＡｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ添加量の検討する実験を行った。
（１）培地の調製
表１に示す改良ＷＹＯα培地の組成にＡｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．１０、０．１５、０．２０、０．４０ｇ／Ｌで含む培地を調製した。また、対照としてＡｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを含まない改良ＷＹＯα培地とＷＹＯα培地（組成は表１を参照）をそれぞれ調製した。
表１に示す改良ＷＹＯα培地の組成にＡｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．１０、０．１５、０．２０、０．４０ｇ／Ｌで含む培地を調製した。また、対照としてＡｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを含まない改良ＷＹＯα培地とＷＹＯα培地（組成は表１を参照）をそれぞれ調製した。
（２）実験方法
実施例１と同じ試験菌株を用い、実施例１と同様にそれぞれの菌株の菌懸濁液を調製し、各培地に接種し、３７℃、５日間培養した。
実施例１と同じ試験菌株を用い、実施例１と同様にそれぞれの菌株の菌懸濁液を調製し、各培地に接種し、３７℃、５日間培養した。
（３）結果
表３に示すように、対照用改良ＷＹＯα培地およびＷＹＯα培地、発色基質Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを各種濃度で含む改良ＷＹＯα培地のすべての培地において、試験菌６菌株すべてが発育した。培養２日目で、対照用改良ＷＹＯα培地およびＷＹＯα培地では試験菌６菌株すべてにおいて発色は観察されず、Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを含む改良ＷＹＯα培地では試験菌６菌株すべてでＡｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ０．０１ｇ／Ｌで淡桃色、０．０２ｇ／Ｌから０．０４ｇ／Ｌで桃色、０．０５ｇ／Ｌから４．００ｇ／Ｌで赤色の発色が観察された。また、これらの発色は、２日以上培養を継続しても、発色の程度が培養時間の経過により濃くなるが、変色はみられなかった。
表３に示すように、対照用改良ＷＹＯα培地およびＷＹＯα培地、発色基質Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを各種濃度で含む改良ＷＹＯα培地のすべての培地において、試験菌６菌株すべてが発育した。培養２日目で、対照用改良ＷＹＯα培地およびＷＹＯα培地では試験菌６菌株すべてにおいて発色は観察されず、Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを含む改良ＷＹＯα培地では試験菌６菌株すべてでＡｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ０．０１ｇ／Ｌで淡桃色、０．０２ｇ／Ｌから０．０４ｇ／Ｌで桃色、０．０５ｇ／Ｌから４．００ｇ／Ｌで赤色の発色が観察された。また、これらの発色は、２日以上培養を継続しても、発色の程度が培養時間の経過により濃くなるが、変色はみられなかった。
異なる培地におけるＡｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅによるレジオネラ属菌の発色の検討
従来用いられているレジオネラ属菌用培地として、活性炭を含むＷＹＯα培地においてＡｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを発色基質としてレジオネラ属菌を発色できるか検討する実験を行った。
従来用いられているレジオネラ属菌用培地として、活性炭を含むＷＹＯα培地においてＡｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを発色基質としてレジオネラ属菌を発色できるか検討する実験を行った。
（１）培地の調製
表１に示すＷＹＯα培地および改良ＷＹＯα培地の組成にＡｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを０．０５ｇ／Ｌで含む培地をそれぞれ調製した。また、対照としてＡｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを含まない培地もＷＹＯα培地および改良ＷＹＯα培地のそれぞれで調製した。
表１に示すＷＹＯα培地および改良ＷＹＯα培地の組成にＡｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを０．０５ｇ／Ｌで含む培地をそれぞれ調製した。また、対照としてＡｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを含まない培地もＷＹＯα培地および改良ＷＹＯα培地のそれぞれで調製した。
（２）実験方法
実施例１と同じ試験菌株を用い、実施例１と同様にそれぞれの菌株の菌懸濁液を調製し、各培地に接種し、３７℃、２日間培養した。
実施例１と同じ試験菌株を用い、実施例１と同様にそれぞれの菌株の菌懸濁液を調製し、各培地に接種し、３７℃、２日間培養した。
（３）結果
表４に示すように、ＷＹＯα培地および改良ＷＹＯα培地に対する発色基質Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ添加の有無にかかわらず、すべての培地において、試験菌６菌株はすべて発育した。Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを含まないＷＹＯα培地および改良ＷＹＯα培地ではすべての試験菌株において発色は観察されず、Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを含むＷＹＯα培地および改良ＷＹＯα培地ではすべての試験菌株において赤色の発色が観察された。
表４に示すように、ＷＹＯα培地および改良ＷＹＯα培地に対する発色基質Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ添加の有無にかかわらず、すべての培地において、試験菌６菌株はすべて発育した。Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを含まないＷＹＯα培地および改良ＷＹＯα培地ではすべての試験菌株において発色は観察されず、Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを含むＷＹＯα培地および改良ＷＹＯα培地ではすべての試験菌株において赤色の発色が観察された。
Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ以外のレジオネラ属菌の発色の確認
実施例１から３までで用いた試験菌株とは異なるレジオネラ属菌種、菌株についてＡｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを発色基質として発色できるかを確認する実験を行った。
実施例１から３までで用いた試験菌株とは異なるレジオネラ属菌種、菌株についてＡｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを発色基質として発色できるかを確認する実験を行った。
（１）培地の調製
表１に示す改良ＷＹＯα培地の組成にＡｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを０．０５ｇ／Ｌで含む培地を調製した。
表１に示す改良ＷＹＯα培地の組成にＡｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを０．０５ｇ／Ｌで含む培地を調製した。
（２）実験方法
試験菌として、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ａｎｉｓａ（社内保存株、菌株番号：ＥＫＮ５２８２）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｅｒｙｔｈｒａ（社内保存株、菌株番号：ＥＫＮ５８８７）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｆｅｅｌｅｉｉ（社内保存株、菌株番号：ＥＫＮ５８３１）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｆｒａｓｅｒｉ（社内保存株、菌株番号：ＥＫＮ３６８３）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｌｏｎｇｂｅａｃｈａｅ（社内保存株、菌株番号：ＥＫＮ３６８９）の５菌株を用いた。実施例１と同様にそれぞれの菌株の菌懸濁液を調製し、培地に接種し、３７℃、２日間培養した。
試験菌として、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ａｎｉｓａ（社内保存株、菌株番号：ＥＫＮ５２８２）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｅｒｙｔｈｒａ（社内保存株、菌株番号：ＥＫＮ５８８７）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｆｅｅｌｅｉｉ（社内保存株、菌株番号：ＥＫＮ５８３１）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｆｒａｓｅｒｉ（社内保存株、菌株番号：ＥＫＮ３６８３）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｌｏｎｇｂｅａｃｈａｅ（社内保存株、菌株番号：ＥＫＮ３６８９）の５菌株を用いた。実施例１と同様にそれぞれの菌株の菌懸濁液を調製し、培地に接種し、３７℃、２日間培養した。
（３）結果
表５に示すように、発色基質Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを含む改良ＷＹＯα培地で、試験菌５菌株すべてが発育し、赤色の発色が観察された。
表５に示すように、発色基質Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを含む改良ＷＹＯα培地で、試験菌５菌株すべてが発育し、赤色の発色が観察された。
本発明は、培養２日目からレジオネラ属菌のコロニーを明瞭に発色させるレジオネラ属菌の鑑別用発色培地を提供できる。レジオネラ症の原因菌を迅速に検出することができるため、臨床検査においては治療方針、浴槽水や温泉水、或いは冷却水等の環境水検査においては各種設備の清掃・消毒等の対応方針の早期決定を可能にする
Claims (16)
- Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、酵母エキス、α－ケトグルタル酸カリウム、ＡＣＥＳ（緩衝剤）、活性炭またはβ－シクロデキストリン、可溶性ピロリン酸鉄、抗菌薬、抗真菌剤、および寒天を含有し、
前記抗菌薬が、グリシン、ポリミキシンＢ、セファマンドール、バンコマイシン、セファロチン、およびコリスチンからなる群から選択される少なくとも１種であり、
前記抗真菌剤が、アニソマイシン、シクロヘキシミド、およびアムホテリシンＢからなる群から選択される少なくとも１種である、
レジオネラ属菌の鑑別用発色培地。 - Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅの含有量が０．０１ｇ／Ｌ以上である請求項１に記載の培地。
- 前記抗菌薬がグリシン、ポリミキシンＢ、およびバンコマイシンであり、前記抗真菌剤がアムホテリシンＢである、請求項１または２に記載のレジオネラ属菌の鑑別用発色培地。
- Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを含有する、ＢＭＰＡα寒天培地、ＷＹＯα寒天培地、ＰＡＶ寒天培地、ＣＣＶＣ寒天培地、またはＭＷＹ寒天培地である、請求項１または２に記載のレジオネラ属菌の鑑別用発色培地。
- 培地１Ｌあたり、酵母エキス１０ｇ、α‐ケトグルタル酸カリウム１ｇ、ＡＣＥＳ（緩衝剤）１０ｇ、グリシン３ｇ、活性炭２ｇ、可溶性ピロリン酸鉄０．２ｇ、バンコマイシン１～５ｍｇ、ポリミキシンＢ５，０００～１００，０００ｕｎｉｔ、アムホテリシンＢ２０～８０ｍｇおよび寒天１５～１８ｇを含有する請求項１～３のうちのいずれか一項に記載のレジオネラ属菌の鑑別用発色培地。
- 培地１Ｌあたり、酵母エキス１０ｇ、α‐ケトグルタル酸カリウム１ｇ、ＡＣＥＳ（緩衝剤）１０ｇ、グリシン３ｇ、β－シクロデキストリン１．０～２５．０ｇ、可溶性ピロリン酸鉄０．２ｇ、バンコマイシン１～５ｍｇ、ポリミキシンＢ５，０００～１００，０００ｕｎｉｔ、アムホテリシンＢ２０～８０ｍｇおよび寒天１５～１８ｇを含有する請求項１～３のうちのいずれか一項に記載のレジオネラ属菌の鑑別用発色培地。
- 前記レジオネラ属菌が、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ａｎｉｓａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｅｒｙｔｈｒａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｆｅｅｌｅｉｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｆｒａｓｅｒｉ、およびＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｌｏｎｇｂｅａｃｈａｅからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１～６のうちのいずれか一項に記載のレジオネラ属菌の鑑別用発色培地。
- Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、酵母エキス、α－ケトグルタル酸カリウム、ＡＣＥＳ（緩衝剤）、活性炭またはβ－シクロデキストリン、可溶性ピロリン酸鉄、抗菌薬、抗真菌剤、および寒天を含有し、
前記抗菌薬が、グリシン、ポリミキシンＢ、セファマンドール、バンコマイシン、セファロチン、およびコリスチンからなる群から選択される少なくとも１種であり、
前記抗真菌剤が、アニソマイシン、シクロヘキシミド、およびアムホテリシンＢからなる群から選択される少なくとも１種であるレジオネラ属菌鑑別用発色培地でレジオネラ属菌を培養する工程を含む、
レジオネラ属菌の鑑別方法。 - 前記培地におけるＡｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅの含有量が０．０１ｇ／Ｌ以上である請求項８に記載の鑑別方法。
- 前記培地における前記抗菌薬がグリシン、ポリミキシンＢ、およびバンコマイシンであり、前記抗真菌剤がアムホテリシンＢである、請求項８または９に記載の鑑別方法。
- 前記培地が、Ａｌｄｏｌ ５１５ ｐｈｏｓｐｈａｔｅを含有する、ＢＭＰＡα寒天培地、ＷＹＯα寒天培地、ＰＡＶ寒天培地、ＣＣＶＣ寒天培地、またはＭＷＹ寒天培地である、請求項８または９に記載の鑑別方法。
- 前記培地が、培地１Ｌあたり、酵母エキス１０ｇ、α‐ケトグルタル酸カリウム１ｇ、ＡＣＥＳ（緩衝剤）１０ｇ、グリシン３ｇ、活性炭２ｇ、可溶性ピロリン酸鉄０．２ｇ、バンコマイシン１～５ｍｇ、ポリミキシンＢ５，０００～１００，０００ｕｎｉｔ、アムホテリシンＢ２０～８０ｍｇおよび寒天１５～１８ｇを含有する培地である、請求項８～１０のうちのいずれか一項に記載の鑑別方法。
- 前記培地が、培地１Ｌあたり、酵母エキス１０ｇ、α‐ケトグルタル酸カリウム１ｇ、ＡＣＥＳ（緩衝剤）１０ｇ、グリシン３ｇ、β－シクロデキストリン１．０～２５．０ｇ、可溶性ピロリン酸鉄０．２ｇ、バンコマイシン１～５ｍｇ、ポリミキシンＢ５，０００～１００，０００ｕｎｉｔ、アムホテリシンＢ２０～８０ｍｇおよび寒天１５ｇ～１８を含有する培地である、請求項８～１０のうちのいずれか一項に記載の鑑別方法。
- 前記レジオネラ属菌が、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ａｎｉｓａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｅｒｙｔｈｒａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｆｅｅｌｅｉｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｆｒａｓｅｒｉ、およびＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｌｏｎｇｂｅａｃｈａｅからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項８～１３のうちのいずれか一項に記載の鑑別方法。
- 前記培養の期間が２日間である、請求項８～１４のうちのいずれか一項に記載の鑑別方法。
- 請求項１～７のうちのいずれか一項に記載のレジオネラ属菌の鑑別用発色培地でレジオネラ属菌を培養する工程を含む、レジオネラ属菌の発色方法。
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|---|
| 日本細菌学雑誌，1995年，vol.50, no.3，p.745-764 |
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