JP7502606B2

JP7502606B2 - 細胞観察装置及び細胞観察方法

Info

Publication number: JP7502606B2
Application number: JP2020060187A
Authority: JP
Inventors: 徹化生; 茂雄西田; 大介荒木
Original assignee: Shibuya Corp
Current assignee: Shibuya Corp
Priority date: 2020-03-30
Filing date: 2020-03-30
Publication date: 2024-06-19
Anticipated expiration: 2040-03-30
Also published as: JP2021157153A

Description

本発明は細胞観察装置及び細胞観察方法に関し、より詳しくは、観察対象となる細胞の良否判定や細胞のカウントの精度を向上させることが可能な細胞観察装置及び細胞観察方法に関する。

従来、顕微鏡などの画像観察装置で細胞を観察する場合には、デジタルカメラなどの撮像手段で細胞を撮像し、該撮像された細胞の画像を画像処理してコントラストを判定することにより、オートフォーカス動作を行う装置が公知である（例えば特許文献１）。

特開２００８－２０４９８号公報

しかしながら、上述したようなコントラストを判定するオートフォーカス動作を行う装置を用いて細胞の観察や細胞のカウントを行う場合には、作業者が目視でピントを合わせた位置とは撮像手段の焦点位置がずれてしまい細胞の良否判定や細胞のカウントに誤りが生じる場合があった。そのため、細胞培養の自動化が進まず、再生医療製品のコスト高を招く要因ともなって再生医療普及の妨げとなっており、適切な焦点位置を設定できる細胞観察装置と細胞観察方法が要望されていたものである。

上述した事情に鑑み、請求項１に記載した本発明は、細胞が収容された容器が載置されるステージと、容器内の細胞を撮像する撮像手段と、上記ステージの高さ位置または上記撮像手段の焦点の高さ位置を変更する昇降手段と、上記撮像手段が撮像した画像における細胞を検出して、該検出された細胞に関する算出値の合計値を求める制御手段とを備え、
上記昇降手段によって上記ステージの高さ位置または上記撮像手段の焦点の高さ位置が変更されながら所定の高さ位置毎に上記撮像手段によって容器内の細胞が撮像され、
上記制御手段は、上記撮像手段が撮像した各高さ位置の画像における細胞の外周の長さ、細胞の外周の近似円の直径、細胞の外接円の直径、または細胞の内接円の直径のいずれかの合計値を算定して、該合計値が減少傾向から増加傾向に切り替わる極小値となる位置を上記撮像手段の合焦点位置と判定し、
上記昇降手段により、上記ステージに載置された容器を合焦点位置に位置させるようにした細胞観察装置であって、
上記制御手段は、先ず、合焦点位置に対応する上記極小値が含まれる高さ領域を粗サーチにより求め、次に、合焦点位置が含まれる高さ領域で上記粗サーチよりも小さい寸法で高さ位置が変更される詳細サーチによって合焦点位置を求めることを特徴とするものである。
また、請求項２に記載した本発明は、細胞が収容された容器の高さ位置または容器を撮像する撮像手段の焦点の高さ位置を変更して、所定の高さ位置毎に撮像手段によって容器内の細胞の画像を取得し、
取得した各細胞の画像内における細胞を検出し、該検出された細胞の外周長さ、細胞の外周の近似円の直径、細胞の外接円の直径、または細胞の内接円の直径のいずれかの合計値を算定し、
該合計値が減少傾向から増加傾向に切り替わる極小値となる高さ位置を上記撮像手段の焦点が容器内の細胞の位置に合った合焦点位置と判定するようにした細胞観察方法であって、
制御手段は、先ず、合焦点位置に対応する上記極小値が含まれる高さ領域を粗サーチにより求め、次に、合焦点位置が含まれる高さ領域で上記粗サーチよりも小さい寸法で高さ位置が変更される詳細サーチによって合焦点位置を求めることを特徴とするものである。

このような構成によれば、適切なオートフォーカス機能を有する細胞観察装置及び細胞観察方法を提供することができ、細胞の良否判定や細胞のカウントの精度を向上させることができる。

本発明の一実施例を示す縦断面図。図１のＺ軸（上下方向）の異なる高さ位置で撮像手段が撮像した細胞の画像における細胞に関する算出値の合計値を示すグラフ。図１の撮像手段が撮影した細胞の画像と細胞に関する算出値との関係を示す図であり、図３（Ａ）は細胞の外周の長さを算出値とする場合、図３（Ｂ）は近似円の直径を算出値とする場合、図３（Ｃ）は外接円の直径を算出値とする場合、図３（Ｄ）は内接円の直径を算出値とする場合、図３（Ｅ）は面積を算出値とする場合を示している。

以下、図示実施例について本発明を説明すると、図１において１は細胞観察装置であり、この細胞観察装置１は実質的に顕微鏡と同じ構成からなり、無菌細胞培養システムとしてのアイソレータ２の隣接位置に配置されている。
細胞観察装置１と対向するアイソレータ２の壁面の一部には、アイソレータ２の内部と連通する観察部２Ａが外方に向けて突設されている。この観察部２Ａの底部にステージ３が水平に配置されており、ステージ３上には、観察対象となる容器４が載置されている。なお、容器４としては、上面が開口した皿状の血球計算盤を用いている。
アイソレータ２内に配置された図示しないロボットハンドまたは作業者がピペットを用いてアイソレータ２内で培養容器から細胞懸濁液を上記容器４内に供給するようになっており、該容器４内に収容された細胞Ｃを細胞観察装置１によって観察するようになっている。観察部２Ａ、ステージ３及び容器４はガラス等の透明な材料からなり、ステージ３に載置された容器４内の細胞Ｃを細胞観察装置１によって観察することができる。
なお、細胞懸濁液を容器４に供給する前に、アイソレータ２内の培養容器にトリプシンなどの試液を加えても良く、また、細胞Ｃのカウントを行いやすくするために細胞懸濁液を容器４に供給する前に該細胞懸濁液に希釈したトリパンブルー液などの試液を加えても良い。

細胞観察装置１は、ステージ３上の容器４に向けて白色光源５から白色光Ｌ１を照射するとともに、白色光Ｌ１が照射された状態において容器４内の細胞Ｃを下方側から撮像手段６で撮像し、撮像手段６によって撮像された画像を基にして制御手段７が細胞Ｃの良否の判定や細胞Ｃの粒子数（個数）をカウントするようになっている。
ここで、細胞観察装置１の観察対象となる細胞Ｃとしては、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の幹細胞、幹細胞から分化した細胞、生検などにより採取された細胞、及び採取された細胞が培養された細胞などを想定している。
細胞観察装置１は、細胞Ｃを収容した容器４が載置される上記ステージ３と、フレーム８と、フレーム８の上部に配置されて、上記ステージ３上の容器４内に向けて白色光Ｌ１を照射する白色光源５と、この白色光源５から照射された白色光Ｌ１をステージ３上の容器４へ案内する第１光学系１１と、フレーム８の下部に配置されて容器４内の細胞Ｃを下方側から撮像する撮像手段６と、ステージ３の下方側の位置から撮像手段６の間に配置された第２光学系１２と、第２光学系１２の対物レンズ１３を昇降させる昇降機構１４と、白色光源５や昇降機構１４等の作動を制御するとともに細胞Ｃの良否の判定や細胞Ｃの粒子数（個数）のカウントを行う制御手段７を備えている。
上記各構成部材が配置されたフレーム８は、図示しない水平移動機構１５に支持されており、該水平移動機構１５によってフレーム８全体が水平面における相互に直交するＸ方向とＹ方向に移動可能となっている。これにより、ステージ３を除いた細胞観察装置１全体が水平面のＸＹ方向に移動可能となっており、撮像手段６がステージ３上の容器４を撮像する際の水平方向の位置の調整や観察領域の変更ができるようになっている。

フレーム８の前面の中央部には上記アイソレータ２内の観察部２Ａの位置に合わせて収容凹部８Ａが形成されており、この収容凹部８Ａに観察部２Ａを収容した状態において、容器４内の細胞の観察を行うようになっている。
白色光源５及び第１光学系１１は、フレーム８の上方側に配置されており、撮像手段６及び第２光学系１２は、フレーム８の下方側に配置されている。
第１光学系１１は、フレーム８の収容凹部８Ａの上方側に配置されており、上方側から順次、第１反射ミラー１７、位相差リング１８及びコンデンサレンズ１９によって構成されている。これら第１光学系１１の構成部材は、フレーム８の所定の高さ位置に固定して配置されている。
白色光源５の作動は制御手段７によって制御されるようになっており、制御手段７が白色光源５を作動させると、該白色光源５から発光された白色光Ｌ１は第１反射ミラー１７によって下方に向けて反射された後に、位相差リング１８及びコンデンサレンズ１９を経由して、ステージ３上の容器４に照射されるようになっている。
一方、第２光学系１２は、フレーム８における収容凹部８Ａの下方側に配置されており、収容凹部８Ａの直下位置に水平に配置された対物レンズ１３と、その下方に配置された第２反射ミラー２１と、この第２反射ミラー２１と撮像手段６の間に順次配置された位相差板２２及び集光レンズ２３を備えている。
第２反射ミラー２１、位相差板２２及び集光レンズ２３は所定の高さ位置に固定して配置されているが、対物レンズ１３は、昇降機構１４に支持されてＺ方向（上下方向）に昇降可能となっている。
昇降機構１４の作動は制御手段７によって制御されるようになっており、制御手段７は、昇降機構１４によって対物レンズ１３を可動可能な上下方向の範囲において昇降させることにより、撮像手段６が容器４内の細胞Ｃを撮像する際に対物レンズ１３の焦点位置を調整できるようになっている。
本実施例は、白色光源５から白色光Ｌ１を発光させて、第１光学系１１を経由してステージ３上の容器４に白色光Ｌ１を照射し、そのように白色光Ｌ１が照射された状態の容器４内の細胞Ｃを下方側から第２光学系１２を介して撮像手段６によって撮像するようにしている。
撮像手段６としてはデジタルカメラを用いており、該撮像手段６が撮像した容器４内の細胞Ｃの画像は、制御手段７に送信されるようになっている。そして、制御手段７は、撮像手段６が撮像した容器４内の細胞Ｃの画像を基にして細胞の良否や細胞の数をカウントするようになっている。
後に詳述するが、本実施例は、撮像手段６が容器４内の細胞Ｃを撮像する際に対物レンズ１３の焦点が容器４内の細胞Ｃの位置に合った合焦点位置にオートフォーカス可能な装置と方法を提案するものであり、合焦点位置を求めたら、その位置で容器４を撮像手段６によって再度、撮像し、その撮像画像を基にして細胞Ｃの良否等を判定するようになっている。

以下、細胞観察装置１による具体的なオートフォーカス方法と判定処理について説明する。
先ず、アイソレータ２内で細胞を培養している図示しない培養容器（ディッシュ、プレート、フラスコなど）内に所要に応じてロボットハンド（または作業者）がトリプシン等の試液を加える。
次に、アイソレータ２内において、上記培養容器からロボットハンド（または作業者）がピペットを用いて細胞懸濁液を取り出した後、ステージ３上の容器４内に供給する。なお、必要に応じて上記アイソレータ２内において上記培養容器内から取り出された細胞懸濁液に、希釈したトリパンブルー液等の試液を加えることで、細胞観察装置１による細胞Ｃの数のカウントを行いやすくなる。
この後、細胞観察装置１においては、先ず粗サーチによって撮像手段６が容器４を撮像する際の対物レンズ１３の合焦点位置がある高さ領域を求め、次に、詳細サーチによって上記高さ領域における合焦点位置を求めるようになっている。
より詳細には、粗サーチは次のようにして行われる。すなわち、先ず、白色光源５から容器４に向けて白色光Ｌ１を照射した状態において、昇降機構１４によって対物レンズ１３を昇降可能な範囲における上昇端の高さ位置から下降端の高さ位置（Ｚ軸における０～Ｘ）まで所定量ずつ（例えば３０μｍずつ）下降させながら、該所定量ずつ下降させる高さ毎に撮像手段６によって容器４内の細胞Ｃを撮像して、撮像する高さ位置が異なる複数の画像を取得する。なお、このように間欠的に下降させるのではなく、連続的に下降させながら所定量下降する毎に撮像手段６で容器４を撮像するようにしても良い。
撮像手段６が撮像した容器４内の細胞Ｃの画像は制御手段７に送信されるので、制御手段７は、撮像手段６が撮像した所定量ずつ下降させた各高さ位置における画像において、各画像内にある全ての細胞Ｃまたは細胞領域の各々の外周の長さを算出値として算出した後、さらにそれら算出値としての外周の長さの合計値を算定する。本実施例では、各画像について求めた細胞Ｃの外周の長さを算出値として用いている（図２、図３（Ａ）参照）。
なお、理解を容易にするために、図３（Ａ）では細胞Ｃを１つだけ示しているが、実際には複数の細胞Ｃまたは細胞領域が検出されるものであって、それら全ての細胞Ｃまたは細胞領域に対して外周の長さを算出した後、合計値を算定するものである。
なお、算出値としては、細胞Ｃまたは細胞領域の外周の長さを用いる代わりに、各画像における各細胞Ｃまたは細胞領域の外周の近似円の直径を算出値として求めて、それら各々の細胞の外周の近似円の直径の合計値を算定しても良い（図３（Ｂ）参照）。また、細胞Ｃの外周の近似円の直径の代わりに、細胞Ｃの外接円の直径（図３（Ｃ））、または細胞Ｃの内接円の直径（図３（Ｄ））、または細胞Ｃの面積（図３（Ｅ））のいずれかを算出値として求めて、それらについての合計値を算定しても良い。
このようにして、対物レンズ１３を上昇端から下降端まで所定量ずつ下降させた際における撮像手段６による各高さでの細胞Ｃの撮像画像を取得すると、制御手段７は、算出された算出値の合計値が極小値Ａ４（山Ａ２と山Ａ３の谷間となる値）となる大まかな高さ領域Ａ１を求める（図２参照）。
ここでいう「極小値Ａ４」は、図２における局所的最小値を意味するものであり、単なる最小値とは異なるものである。つまり、算出値としての細胞Ｃの外周の長さの合計値の変動に着目するが、山Ａ２と山Ａ３の谷の部分Ａ４（減少傾向から増加傾向に切り替わる最小値）を「極小値Ａ４」として制御手段７が認識するようになっている。
このようにして、本実施例では、先ず粗サーチを行うことで、合焦点位置ＡＸに対応する極小値Ａ４が含まれている高さ領域Ａ１を制御手段７が求めるようになっている。

上述した粗サーチの後に詳細サーチが行われる。すなわち、この後、上記極小値Ａ４が含まれる高さ領域Ａ１に関して、上述した粗サーチの場合と比べて小さな寸法となる所定量（例えば６μｍ）毎に、高さ領域Ａ１における上昇端の高さから下降端の高さまで昇降機構１４によって対物レンズ１３を下降させて、その都度、撮像手段６によって容器４内の細胞Ｃの画像を撮像する。
そして、高さ領域Ａ１において撮像手段６によって撮像された各高さ位置における容器４内の細胞Ｃの画像を基にして、上述した粗サーチの場合と同様に、制御手段７は、各高さ位置の画像における細胞Ｃの外周の長さを算出値として求めた後に、それらの合計値を算定する。
なお、ここでも、算出値として細胞Ｃの外周の長さの代わりに、図３（Ｂ）～図３（Ｅ）に示すように、細胞Ｃの外周の近似円の直径、細胞Ｃの外接円の直径、細胞Ｃの内接円の直径、または細胞の面積のいずれかを求めて、それらを検出して用いても良い。
この後、制御手段７は、上記高さ領域Ａ１において算出値の合計値が極小値Ａ４（最小値）となる高さ位置を、撮像手段６が容器４を撮影する際の対物レンズ１３の焦点が合った合焦点位置ＡＸとして判定する。
本実施例では、以上のようにして、制御手段７が昇降機構１４を介して対物レンズ１３を上昇端から下降端まで所定量ずつ下降させ、それに伴って撮像手段６によって容器４内の細胞Ｃの画像を順次、撮像手段６により撮像し、先ず粗サーチにおいて極小値Ａ４がある高さ領域Ａ１を求め、次に、詳細サーチによって極小値Ａ４の位置、つまり、対物レンズ１３の焦点が容器４内の細胞Ｃの高さと合った合焦点位置ＡＸを求める。
そして、この後、合焦点位置ＡＸとして検出された極小値Ａ４の高さ位置まで昇降機構１４によって対物レンズ１３を移動させて、その高さ位置で対物レンズ１３を停止させてから、再度、撮像手段６によって容器４内の細胞Ｃを撮像する。これにより、容器４内の細胞Ｃに対して正確にピントが合った状態で、撮像手段６によって容器４内の細胞Ｃを撮像することができる。
この後、制御手段７は、合焦点位置ＡＸで撮像手段６が撮影した容器４内の細胞Ｃの画像を基にして、細胞の良否の判定を行うとともに細胞粒子のカウントを行うようになっている。

以上のように、本実施例によれば、作業者が目視で対物レンズ１３を昇降させることで撮像手段６のピントが容器４内の細胞に合った合焦点位置を探す場合と同等の精度で合焦点位置ＡＸをオートフォーカスで検出することができる。そのため、容器４内の細胞Ｃを撮像手段６で撮像するにあたって最適なオートフォーカス機能を有する細胞観察装置１を提供することができる。また、細胞Ｃの良否の判定や細胞の数のカウントの精度を向上させることが可能な細胞観察装置１を提供することができる。
さらに、本実施例の細胞観察装置１は細胞自動培養装置に搭載することが可能であり、それによって再生医療の普及に大きく貢献することが可能である。

なお、本実施例においては、観察対象となる細胞Ｃとして、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞といった幹細胞、幹細胞から分化した細胞、生検などにより採取された細胞、採取された細胞が培養された細胞を想定しているが、特にこれらに限定されるものではない。
また、細胞の種類や培養の経過（初期、中期、後期）に応じて、図３（Ａ）～図３（Ｅ）に示した算出値のもとになる対象（細胞の外周の長さ、細胞の外周の近似円の直径、細胞の外接円の直径、細胞の内接円の直径、細胞の面積）を適宜使い分けても良い。
また、上述した実施例においては、粗サーチ及び詳細サーチにおいて昇降機構１４を介して対物レンズ１３を上昇端から下降端まで所定量（寸法）ずつ下降させているが、これとは逆に、対物レンズ１３を下降端から上昇端まで所定量（寸法）ずつ上昇させることで上記算出値を得るようにしても良い。また、必ずしも上昇端から下降端まで下降、または下降端から上昇端まで上昇させなくとも良く、所定の範囲で下降または上昇させるものでも良い。
また、昇降機構１４によって対物レンズ１３を昇降させる代わりに、ステージ３自体を昇降させる構成を採用しても良く、さらには、撮像手段６及び第２光学系１２を一体的に昇降させる構成を採用しても良い。
また、観察部２Ａにおいてステージ３の代わりに、ロボットハンドが容器４を保持し、容器４を水平または上下に移動させるようにしても良い。

１‥細胞観察装置３‥ステージ
４‥容器６‥撮像手段
７‥制御手段１３‥対物レンズ
１４‥昇降機構ＡＸ‥合焦点位置
Ａ４‥極小値Ｃ‥細胞

Claims

細胞が収容された容器が載置されるステージと、容器内の細胞を撮像する撮像手段と、上記ステージの高さ位置または上記撮像手段の焦点の高さ位置を変更する昇降手段と、上記撮像手段が撮像した画像における細胞を検出して、該検出された細胞に関する算出値の合計値を求める制御手段とを備え、
上記昇降手段によって上記ステージの高さ位置または上記撮像手段の焦点の高さ位置が変更されながら所定の高さ位置毎に上記撮像手段によって容器内の細胞が撮像され、
上記制御手段は、上記撮像手段が撮像した各高さ位置の画像における細胞の外周の長さ、細胞の外周の近似円の直径、細胞の外接円の直径、または細胞の内接円の直径のいずれかの合計値を算定して、該合計値が減少傾向から増加傾向に切り替わる極小値となる位置を上記撮像手段の合焦点位置と判定し、
上記昇降手段により、上記ステージに載置された容器を合焦点位置に位置させるようにした細胞観察装置であって、
上記制御手段は、先ず、合焦点位置に対応する上記極小値が含まれる高さ領域を粗サーチにより求め、次に、合焦点位置が含まれる高さ領域で上記粗サーチよりも小さい寸法で高さ位置が変更される詳細サーチによって合焦点位置を求めることを特徴とする細胞観察装置。
細胞が収容された容器の高さ位置または容器を撮像する撮像手段の焦点の高さ位置を変更して、所定の高さ位置毎に撮像手段によって容器内の細胞の画像を取得し、
取得した各細胞の画像内における細胞を検出し、該検出された細胞の外周長さ、細胞の外周の近似円の直径、細胞の外接円の直径、または細胞の内接円の直径のいずれかの合計値を算定し、
該合計値が減少傾向から増加傾向に切り替わる極小値となる高さ位置を上記撮像手段の焦点が容器内の細胞の位置に合った合焦点位置と判定するようにした細胞観察方法であって、
制御手段は、先ず、合焦点位置に対応する上記極小値が含まれる高さ領域を粗サーチにより求め、次に、合焦点位置が含まれる高さ領域で上記粗サーチよりも小さい寸法で高さ位置が変更される詳細サーチによって合焦点位置を求めることを特徴とする細胞観察方法。