JP7498914B2 - 白神山地に生息するキハダ由来の新規乳酸菌 - Google Patents

白神山地に生息するキハダ由来の新規乳酸菌 Download PDF

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Description

NPMD NITE BP-02970
本発明は、白神山地に生息するキハダ由来の新規乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス(Lactococcus lactis subsp. lactis)L8菌株(以下「L8菌株」)に関する。さらに本発明は、同菌株を含む組成物、同菌株を効率的に培養するための培地及び培養法に関する。
昨今の栄養機能食品ブームや保険制度の危機から、医薬品に頼らず病気を未然に防ぐことに注目が集まっている。特に、乳酸菌を含有する機能性食品やサプリメントが製品化されている。
例えば特許文献1には、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcas lactis)JCM5805株等にインターフェロン産生誘導作用があることを見出し、免疫賦活剤やウイルス感染症予防・治療剤として、医薬品や食品の形で使用できることが記載されている。また特許文献2には、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)MCC1375株、これを含む組成物、及び同株の投与によりインターロイキン12の産生促進、NK細胞の活性化、インフルエンザウイルスによる発症を抑制する方法が記載されている。
また乳酸菌は、グルコース等の糖類から多量の乳酸を生成する細菌の総称であり、培養には糖類が必要である。さらに乳酸菌の培養には、ペプトン類などの窒素源といった栄養素が必須であり、培地が高価格になる傾向がある。非特許文献1、2では、乳酸菌培養の培地について検討されている。
乳酸菌の性質や機能は、分離源や菌株により様々であり、より有効な機能を有する食品やサプリメントを提供するため、新たな乳酸菌菌株やそれを効率よくより低コストで培養することが求められている。
WO2012/091081号公報 WO2012/133827号公報
Zhao et al. AMB Expr (2016) 6:65 C. Li et al. / Journal of Biotechnology 93 (2002) 27-34
本発明は、白神山地に生息するキハダ由来の新規乳酸菌L8菌株を提供することを目的とする。本発明はまた、L8菌株を含む、血糖値減少作用、脂質代謝改善作用、抗酸化作用、抗肥満作用、脂肪肝抑制作用、肝炎予防作用、肝機能改善作用、または腸内環境改善作用を有する組成物を提供することを目的とする。さらに本発明は、L8菌株を効率的かつ低コストで培養することが可能な培地、及び培養方法に関する。
すなわち、上記の課題を解決するために、本発明は以下の実施形態を包含する。
(実施形態1)
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス(Lactococcus lactis subsp. lactis)L8菌株。
(実施形態2)
白神山地に生息するキハダから分離したラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス(Lactococcus lactis subsp. lactis)L8菌株。
(実施形態3)
(実施形態1)または(実施形態2)に記載の菌株を含有する組成物。
(実施形態4)
血糖値減少作用、脂質代謝改善作用、抗酸化作用、抗肥満作用、脂肪肝抑制作用、肝炎予防作用、肝機能改善作用、または腸内環境改善作用を有する(実施形態3)に記載の組成物。
(実施形態5)
食品、サプリメント、飲料、医薬品、または飼料である(実施形態3)または(実施形態4)に記載の組成物。
(実施形態6)
(1)グルコース、(2)硫酸アンモニウム、及び(3)牛肉エキス及び酵母エキスから選ばれる一種以上を含み、ペプトン類を含まないラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス(Lactococcus lactis subsp. lactis)L8菌株を効率的に培養するための培地。
(実施形態7)
さらに、クエン酸三アンモニウム及びポリソルベート80を含む、(実施形態6)に記載の培地。
(実施形態8)
(1)グルコース、(2)硫酸アンモニウム、及び(3)牛肉エキス及び酵母エキスから選ばれる一種以上を含み、ペプトン類を含まない培地を用いるラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス(Lactococcus lactis subsp. lactis)L8菌株の培養方法。
(実施形態9)
(実施形態1)または(実施形態2)に記載の菌株を含有する血糖値降下剤、脂質代謝改善剤、抗酸化剤、抗肥満剤、脂肪肝抑制剤、肝炎予防剤、肝機能改善剤、または腸内環境改善剤。
本発明により、白神山地に生息するキハダ由来の新規乳酸菌L8菌株、L8菌株を含む、血糖値減少作用、脂質代謝改善作用、抗酸化作用、抗肥満作用、脂肪肝抑制作用、肝炎予防作用または腸内環境改善作用を有する組成物、並びにL8菌株を効率的かつ低コストで培養するための培地及び培養方法を提供することが可能となる。
以下、本発明について詳細に説明する。
L8菌株の取得
白神山地に生息する植物(キハダ)から採集したサンプル(葉)を10%スキムミルク培地に浸漬し、40℃で保温した。スキムミルクが固化した培養物を5%のCaCOを含むMRS寒天培地に画線し、37℃で嫌気培養した。乳酸生成によってCaCOが溶解し周囲が透明になったコロニーを同培地で再度画線培養することによって分離した。
得られた菌株はラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス(Lactococcus lactis subsp. lactis)L8と名付けられた。
L8菌株の同定
分離源:キハダの葉
系統 :Lactococcus lactis subsp. lactis
形態的特徴 :卵型、サイズは0.5-1.5μm、グラム染色陽性、非運動性
酸素関連酵素:オキシダーゼ・カタラーゼ陰性
増殖温度 :10℃~40℃の範囲で増殖、至適温度は37℃
乳酸生成基質:L-アラビノース、D-リボース、D-キシロース、D-ガラクトース、D-グルコース、D-フルクトース、D-マンノース、D-マンニトール、N-アセチルグルコサミン、アミグダリン、アルブチン、サリシン、D-セロビオース、D-マルトース、D-ラクトース、D-スクロース、D-トレハロース、ゲンチオビオース、グルコネート(中でもD-グルコース、N-アセチルグルコサミンが良好)
乳酸非生成基質:グリセロール、エリスリトール、D-アラビノース、L-キシロース、D-アドニトール、メチル-βD-キシロピラノシド、L-ソルボース、L-ラムノース、ズルシトール、イノシトール、D-ソルビトール、メチル-αD-マンノピラノシド、メチル-αD-グルコピラノシド、エスクリン、D-メリビオース、イヌリン、D-メレジトース、D-ラフィノース、デンプン、グリコーゲン、キシリトール、D-ツラノース、D-リキソース、D-タガトース、D-フコース、L-フコース、D-アラビトール、L-アラビトール、2-ケトグルコネート、5-ケトグルコネート
その他:スキムミルクと豆乳の凝固作用を有する。凝固豆乳の40gあたり、10,000xgの遠心力により23.5mLの発酵液が回収された。
表1に示す通り、L8菌株の16S rRNA遺伝子部分配列を近縁種の基準株と比較したところ、Lactococcus lactis subsp. lactisと100%の相同性を示した。Lactococcus lactis subsp. hordniae、Lactococcus lactis subsp. tructae、及びLactococcus lactis subsp. cremorisとも比較的高い相同性を示したが、いずれもL8やLactococcus lactis subsp. lactisを増殖可能な40℃で増殖出来ないことから、生理学的にL8とは異なる。よってL8をLactococcus lactis subsp. lactisに属する新たな菌株と同定した。
(表1)
白神山地とは、青森県南西部と秋田県北西部にまたがる約13万haに及ぶ広大な山地帯の総称である。白神山地の総面積の約74%は青森県に属する。世界最大級の原生的なブナ林が分布しており、1993年12月に世界遺産(自然遺産)に登録されている。
本発明の組成物は、L8菌株を含む。L8菌株は、生菌体でも死菌体でもよく、液状でも粉末状でもよく、さらに菌株の培養物も含んでもよい。培養物には、菌体の他、菌体の破壊物、凍結乾燥物、培養液、培養液抽出物なども含まれる。
本発明の組成物は、食品、サプリメント、医薬品、飲料、または飼料とすることができる。食品としては、乳、乳製品、調味料、農産・林産加工食品、菓子、パン類、穀粉、麺類、水産加工品、畜産加工品、油脂、油脂加工品、調理冷凍食品、レトルト食品、インスタント食品、及び食品素材等を挙げることができる。
本発明の組成物をサプリメントや医薬品として提供する場合、その形状は、錠剤、カプセル、ゼリー、ペースト、粉末、顆粒、及び液体等の形態とすることができる。
本発明の組成物を飲料として提供する場合、乳酸菌飲料、ヨーグルトドリンク、及び清涼飲料水等の形態とすることができる。
本発明の組成物を飼料として提供する場合、粉状、ペレット状、クランブル状、顆粒状、フレーク状、バルキー状、及び代用乳等の形態とすることができる。
本発明の組成物は、L8菌株の作用を妨げず、かつ食品、サプリメント、飲料、医薬品、または飼料として許容される、賦形剤、崩壊剤、結合剤、または滑沢剤等の添加剤を含んでもよい。このような賦形剤としては、ブドウ糖、乳糖、コーンスターチ、ソルビット等;崩壊剤としては、デンプン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン末、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、デキストリン等;結合剤としては、ジメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等;滑沢剤としては、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、硬化植物油等;をそれぞれ挙げることができる。
本発明の組成物は、上記賦形剤の他、さらにミネラル類、ビタミン類、フラボノイド類、ポリフェノール類、アミノ酸、核酸、必須脂肪酸、清涼剤、甘味料、着色料、香料、安定化剤、防腐剤、徐放調整剤、界面活性剤、溶解剤、または湿潤剤を含んでもよい。
本発明のL8菌株は、血糖値減少作用、脂質代謝改善作用、及び抗酸化作用、さらにこれら作用による抗肥満作用、及び腸内環境改善作用を有する。そのため、L8菌株を含む組成物は、血糖値減少作用、脂質代謝改善作用、抗酸化作用、抗肥満作用、及び腸内環境改善作用の作用を有する。また本発明のL8菌株は、脂肪肝抑制作用、及び肝炎予防作用、さらにこれら作用による肝機能改善作用を有する。そのため、L8菌株を含む組成物は、脂肪肝抑制作用、肝炎予防作用、及び肝機能改善作用を有する。
本発明の組成物において、L8菌株の含有量は特に限定されないが、乳酸菌体の重量換算で、組成物全体の重量に対して、0.01~99重量%、好ましくは0.5~50重量%、より好ましくは1~30重量%とすることができる。
一の態様において本発明は、L8菌株を含む血糖値降下剤、脂質代謝改善剤、抗酸化剤、抗肥満剤、脂肪肝抑制剤、肝炎予防剤、肝機能改善剤、及び腸内環境改善剤を提供する。
本発明のL8菌株を効率的に培養するための培地は、(1)グルコース、(2)硫酸アンモニウム、及び(3)牛肉エキス及び酵母エキスから選ばれる一種以上を含み、ペプトン類を含まない。乳酸菌は、グルコース等の糖類から多量の乳酸を生成する細菌の総称であり、培養には糖類が必要である。さらに、窒素源としてプロテオースペプトン等のペプトン類といった栄養素が必須であるため、培地が高価格になる傾向がある。本発明者らは、ビタミン源である牛肉エキスまたは酵母エキスの存在下に限って、ペプトン類の代わりに窒素源として硫酸アンモニウムを用いることで、ペプトン類を用いた場合と同程度に培養効率の良い培地を提供できることを見出した。
また本発明の培地において、(1)グルコース、(2)硫酸アンモニウム、及び(3)牛肉エキス及び酵母エキスから選ばれる一種以上、の含有比(1):(2):(3)は、0.5~2.0:0~1.0:1~2.5とすることができる。さらに、培養効率とコストの観点から、0.5:0.5:2.0~2.5とすることが好ましい。
本発明の培地は、さらにクエン酸三アンモニウム及びポリソルベート80を含んでもよい。
本発明者らは、一般に乳酸菌の培養に用いられるMRS培地(組成は表2参照)において、酢酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン(II)、及びリン酸水素二カリウムのすべてを含有せずとも、クエン酸三アンモニウム、ポリソルベート80、及び牛肉エキスの含量を、MRS培地で用いられる量の倍にすることで、MRS培地と同程度に培養効率の良い培地を提供できることを見出した。
すなわち、クエン酸三アンモニウムを0.4重量部、ポリソルベート80を0.2重量部、及び牛肉エキスを2重量部添加することで、酢酸ナトリウム、及びリン酸水素二カリウムのうちいずれか一つ以上を0.2~0.5重量部程度含むことにより、MRS培地と同程度に培養効率の良い培地となることを見出した。
さらに本発明の培地において、各成分の含量(重量部)は、例えば
グルコース 0.5
硫酸アンモニウム 0.5
牛肉エキス及び酵母エキスから選ばれる一種以上 2.0~2.5
クエン酸三アンモニウム 0.4
ポリソルベート80 0.2
酢酸ナトリウム、及びリン酸水素二カリウムから選ばれる一種以上 0.2~0.5
とすることができるが、これに限定されない。
本発明はさらに、(1)グルコース、(2)硫酸アンモニウム、及び(3)牛肉エキス及び酵母エキスから選ばれる一種以上を含み、ペプトン類を含まない培地を用いるラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス(Lactococcus lactis subsp. lactis)L8菌株の培養方法に関する。
かかる方法により、効率よく、かつ低コストでL8菌株を培養することができる。
以下に具体的な実施形態を挙げて本発明を説明するが、本発明はその実施形態に限定されるものではなく、それらにおける様々な変更及び改変が当業者によって、添付の特許請求の範囲に規定される本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく実行され得ることが理解される。
試験例1:マウスを用いたL8菌株の機能評価
白神山地のキハダから採取した乳酸菌L8菌株の乾燥粉末を摂取することによる抗肥満や腸内環境の改善効果について検討した。
日本チャールズ・リバー(株)より購入した正常マウスのC57BL/6Jマウス(雄、4週齢、各群6匹、)を準備した。コントロール群には飲料水を、乳酸菌投与群には飲料水に0.35μg/mLの濃度で乳酸菌の乾燥粉末を溶解したものを自由摂取させた。飼料は、20%の脂質を含む高脂肪食を自由摂取させた。15週間飼育を行った後、各群の摂食量、飲水量、体重、血糖値、糞重量、白色脂肪細胞重量、肝臓脂質重量、及び血清GPT(ALT)値を測定した。結果を図1~図7に示す。
各群とも摂食量と飲水量は同量であったが、乳酸菌群はコントロール群と比較して体重、血糖値、並びに白色脂肪細胞重量が減少傾向となった。また肝臓の脂質重量も低下傾向を示し、肝臓炎症の指標である血清GPT(ALT)値が低下した。このことから、乳酸菌L8菌株は、血糖値減少作用、脂質代謝改善作用、抗肥満作用、脂肪肝抑制作用、肝炎予防作用等を有することが示唆された。また、乳酸菌群の糞重量は、コントロール群と比較して増加傾向を示した。このことから、乳酸菌L8菌株は、腸管内の善玉菌の増加を誘導し、抗肥満作用、脂肪肝抑制作用、肝炎予防作用、腸内環境改善作用を有することが示唆された。
試験例2:L8菌株培養用培地の検討
培地の調製
MRS培地(組成は表2に示す)を基本培地として、表3に示す組成の参考例、及び実施例1~7の8種類の培地を調製した。参考例は、MRS培地を改変させたものである。
(表2)MRS培地の組成(単位:重量部)

L8菌株の培養
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス(Lactococcus lactis subsp. lactis)L8菌株をMRS培地(DIFCO製)で37°Cで48時間培養した前培養液(2.5×10cells/mL)を100μLとり、10mLの各培地に接種し、37°Cで48時間静置培養後に細胞数を計数した。結果を表3に示す。
(表3)(単位:g/100mL)
試験例3:培地コストの検討
試験例2で使用した各培地について、参考例を100とした場合の培地コストを算出した。算出にあたり小数点第二位を四捨五入した。結果を表4に示す。
(表4)
以上より、実施例3、4、6が、L8菌株を効率よく、かつ低コストで培養できることがわかる。
本発明により、血糖値減少作用、脂質代謝改善作用、抗酸化作用、抗肥満作用、脂肪肝抑制作用、肝炎抑制作用、肝機能改善作用、または腸内環境改善作用などを有し、健康維持に有効な植物由来の新規乳酸菌、並びにかかる乳酸菌を含む食品、サプリメント、飲料、医薬品、または飼料を提供することが可能となる。
マウスを用いたL8菌株の機能評価における、コントロール群、乳酸菌投与群の摂食量(a)及び飲水量(b)を示すグラフである。 マウスを用いたL8菌株の機能評価における、コントロール群、乳酸菌投与群の体重の測定結果を示すグラフである。 マウスを用いたL8菌株の機能評価における、コントロール群、乳酸菌投与群の血糖値の測定結果を示すグラフである。 マウスを用いたL8菌株の機能評価における、コントロール群、乳酸菌投与群の糞重量の測定結果を示すグラフである。 マウスを用いたL8菌株の機能評価における、コントロール群、乳酸菌投与群の白色脂肪細胞重量の測定結果を示すグラフである。 マウスを用いたL8菌株の機能評価における、コントロール群、乳酸菌投与群の肝臓脂質重量の測定結果を示すグラフである。 マウスを用いたL8菌株の機能評価における、コントロール群、乳酸菌投与群の肝炎の指標となる血清のGPT(ALT)値の測定結果を示すグラフである。
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス(Lactococcus lactis subsp. lactis)L8菌株は、「Lactococcus lactis l8」という識別の表示の下、2019年6月19日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物センター(〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室)に受託番号NITE P-02970として国内寄託された。その後、同菌株について2020年6月19日付けでブタペスト条約に基づく国際寄託への移管申請を行い、2020年6月23日に国際寄託の仮番号NITE ABP-02970が付与された。今後、国際寄託の受託番号(NITE BP-02970)が付与される見込みである。

Claims (7)

  1. 国際寄託番号NITE BP-02970で識別されるラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス(Lactococcus lactis subsp. lactis)L8菌株を含有し、肝炎予防作用、または肝機能改善作用を有する組成物
  2. L8菌株が、白神山地に生息するキハダから分離した菌株である請求項1に記載の組成物
  3. 食品、サプリメント、飲料、医薬品、または飼料である請求項1または2に記載の組成物
  4. 国際寄託番号NITE BP-02970で識別されるラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス(Lactococcus lactis subsp. lactis)L8菌株を含有する肝炎予防剤、または肝機能改善剤
  5. (1)グルコース、(2)硫酸アンモニウム、(3)牛肉エキス及び酵母エキスから選ばれる一種以上のエキス、(4)クエン酸三アンモニウム、及び(5)ポリソルベート80を含み、ペプトン類を含まない培地であって、
    (1):(2):(3)の含有比率(重量)が、0.5~2.0:0.5~1.0:1~2.5である培地を用いる、
    国際寄託番号NITE BP-02970で識別されるラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス(Lactococcus lactis subsp. lactis)L8菌株の培養方法
  6. (1):(2):(3)の含有比率(重量)が、0.5:0.5:2.0~2.5である、請求項5に記載の培養方法
  7. グルコース0.5重量部、硫酸アンモニウム0.5重量部、牛肉エキス及び酵母エキスから選ばれる一種以上のエキス2.0~2.5重量部、クエン酸三アンモニウム0.4重量部、ポリソルベート80 0.2重量部、酢酸ナトリウム、及びリン酸水素二カリウムから選ばれる一種以上を0.2~0.5重量部を含み、ペプトン類を含まない培地を用いる、
    国際寄託番号NITE BP-02970で識別されるラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス(Lactococcus lactis subsp. lactis)L8菌株の培養方法
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