JP7485272B2

JP7485272B2 - 植物生長促進剤

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Publication number: JP7485272B2
Application number: JP2019038319A
Authority: JP
Inventors: 正朗小西; 雄二朗本間; 誠窪之内; 勇太加藤
Original assignee: KANKYO DAIZEN CO., LTD.; NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION HOKKAIDO HIGHER EDUCATION AND RESEARCH SYSTEM
Current assignee: KANKYO DAIZEN CO., LTD.; NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION HOKKAIDO HIGHER EDUCATION AND RESEARCH SYSTEM
Priority date: 2019-03-04
Filing date: 2019-03-04
Publication date: 2024-05-16
Anticipated expiration: 2039-03-04
Also published as: JP2020141564A

Description

本発明は、家畜糞尿を原料とする植物生長促進剤及び植物生長促進剤の製造方法に関する。

家畜糞尿を原料とする堆肥は、地力を維持し且つ作物の生産性を向上させる有機質資材である。化学肥料の普及後は、作物の生産性向上には化学肥料が多用されてきた。しかしながら、近年の減農薬農法、減化学肥料農法又は有機農法の広がりにともない、堆肥の使用量も再び増加している。

牛糞、豚糞、鶏糞等の家畜糞を堆肥化する方法が広く知られている（例えば、特許文献１）。特許文献１の堆肥製造方法では、鶏糞に木片チップと微生物を混入した６０℃以上の混合物を、堆肥舎で６．５日間、その後発酵槽で２３．５日間発酵させる。得られた発酵物から、選別機で木片チップを回収した後、鶏糞堆肥を養生施設に送り、切返しをしながら６０℃以上で３．８日間発酵させて、鶏糞堆肥が完成する。

特開２００８－１３３８０号公報

このような堆肥を製造する際、堆肥の含水率を低くするため、***物から液体成分と固定成分とを分離することがある。この際に分離された液体成分についてはあまり利用されていなかった。

そこで、本発明はこれらの点に鑑みてなされたものであり、家畜糞尿の液体成分を用いて植物の生長を促進することができる植物生長促進剤及び植物生長促進剤の製造方法を提供することを目的とする。

本発明は、以下の［１］～［９］である。
［１］家畜の糞尿を原料とする植物生長促進剤であって、バクテロイデス門に含まれる微生物、クロロフレクサス門に含まれる微生物、ゲンマティモナス門に含まれる微生物、及びウェルコミクロビウム門に含まれる微生物からなる群のうち少なくともいずれか１つ以上を含む、植物生長促進剤。
［２］5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′（配列番号１）で示される塩基配列（該塩基配列中、NはA、T、G又はCであり、WはA又はTである）を含む第１プライマーと5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′（配列番号２）で示される塩基配列（該塩基配列中、HはA、T又はCであり、VはA、C又はGである）を含む第２プライマーとを用いて、該植物生長促進剤中に含まれる微生物を検出したときに、バクテロイデス門に含まれる微生物、クロロフレクサス門に含まれる微生物、ゲンマティモナス門に含まれる微生物、及び、ウェルコミクロビウム門に含まれる微生物からなる群のうち少なくともいずれか１つ以上が検出される、［１］の植物生長促進剤。
［３］全炭素濃度が２，０００ｍｇ／ｋｇ以下である、［１］又は［２］の植物生長促進剤。
［４］ケルダール法で測定した全窒素濃度が５００ｍｇ／ｋｇ以下である、［１］～［３］のいずれかの植物生長促進剤。
［５］全リン濃度が２，０００ｍｇ／ｋｇ以下である、［１］～［４］のいずれかの植物生長促進剤。
［６］全カリウム濃度が５，０００ｍｇ／ｋｇ以下である、［１］～［５］のいずれかの植物生長促進剤。
［７］前記植物生長促進剤は、液体、固形又はスラリーの態様である、［１］～［６］のいずれかの植物生長促進剤。
［８］家畜の糞尿の液体成分を分離するステップと、5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′（配列番号１）の塩基配列を含む第１プライマーと5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′（配列番号２）の塩基配列を含む第２プライマーとを用いて検出される微生物のうち、バクテロイデス門に含まれる微生物を１．５％以上、クロロフレクサス門に含まれる微生物を１．５％以上、ゲンマティモナス門に含まれる微生物を０．５％以上、及び、ウェルコミクロビウム門に含まれる微生物からなる群のうち少なくとも１種以上を０．５％以上含むようになるまで、前記液体成分を曝気させるステップとを含む、植物生長促進剤の製造方法。
［９］前記曝気させるステップにおいて、Ｆ［ｍ／ｓ］を空気流量、Ｖ［ｍ^３］を処理液体積、Ｈ_Ｌ［ｍ］を処理液深度とした場合に、

を満たす状態において前記液体成分を曝気させる、［８］の植物生長促進剤の製造方法。

本発明の植物生長促進剤は、植物の生長を促進することができるという効果を奏する。そして、この植物の生長促進効果は、一般的に肥料に含まれるリンや窒素分の量が少なくても発揮される。

植物生長促進剤中の微生物をリアルタイムＰＣＲで定量した解析結果を示す。植物生長促進剤を製造するための製造装置の一例を示す。播種後１ヶ月の小松菜及びトマトを撮影した様子を示す写真である。

［植物生長促進剤の成分］
本発明者らは、鋭意研究の結果、本実施の形態に係る家畜の糞尿の液体成分を原料とする植物生長促進剤が特定の微生物群を含むことにより、安定的な植物生長効果をもたらすことを見出した。家畜は、例えば、牛、豚、鶏、羊又は山羊であるが、これらの動物に限定されない。

本発明の植物生長促進剤は、バクテロイデス門に含まれる微生物、クロロフレクサス門に含まれる微生物、ゲンマティモナス門に含まれる微生物、及びウェルコミクロビウム門に含まれる微生物からなる群のうち少なくともいずれか１つ以上の微生物を含む。

［バクテロイデス門］
バクテロイデス門は、グラム陰性細菌のグループであり、腸内細菌として知られている微生物が含まれる。下位分類（綱）として、バクテロイデス綱、フラボバクテリア綱、スフィンゴバクテリア綱、キティノファガ綱、キトファガ綱、サプロスピラ綱を含む。バクテロイデス門に含まれる微生物としては、例えば、Bacteroides plebeius、Bacteroides fragilisが挙げられる。
本発明の植物生長促進剤中、バクテロイデス門の微生物の含有割合は、好ましくは１．５％以上（後述する方法により本発明の植物生長促進剤から検出される微生物全体に対する割合。以下、微生物の含有割合については同様である。）であり、より好ましくは、５～１２％である。

［クロロフレクサス門］
クロロフレクサス門は、緑色滑走細菌門とも呼ばれ、下位分類（綱）として、クロロフレクサス綱、アナエロリネア綱、アルデンティカテナ綱、カルディリネア綱、クテドノバクテル綱、テルモフレクスス綱、テルモミクロビウム綱を含む。クロロフレクサス門に含まれる微生物としては、例えば、Thermomicrobium roseum、Sphaerobacter thermophilus、Caldilinea aerophila、Caldilinea tarbellica、Ktedonobacter、Thermosporothrix、Thermogemmatispora onikobensis、Thermogemmatispora foliorumが挙げられる。
本発明の植物生長促進剤中、クロロフレクサス門の微生物の含有割合は、好ましくは１．５％以上であり、より好ましくは、２～１５％である。

［ゲンマティモナス門］
ゲンマティモナス門は、グラム陰性細菌の門である。下位分類（綱）として、ゲンマティモナス綱、ロンギミクロビウム綱が含まれる。ゲンマティモナス門に含まれる微生物としては、例えば、Gemmatimonas aurantiaca、Gemmatimonas phototrophica、Longimicrobium terrae、Gemmatirosa kalamazoonesisが挙げられる。
本発明の植物生長促進剤中、ゲンマティモナス門の微生物の含有割合は、好ましくは１．５％以上であり、より好ましくは、２％～５％である。

［ウェルコミクロビウム門］
ウェルコミクロビウム門は、グラム陰性細菌の門である。下位分類（綱）として、ウェルコミクロビウム綱、オピトゥトゥス綱を含む。ウェルコミクロビウム門に含まれる微生物としては、例えば、Verrucomicrobium Haloferula、Verrucomicrobium Luteolibacter、 Verrucomicrobium Persicirhabdus、Verrucomicrobium Prosthecobacter、Verrucomicrobium Roseibacillus、Verrucomicrobium Roseimicrobium、Prosthecobacter dejongeii、Chthoniobacter flavus、Ellin514株、Puniceicoccus Cerasicoccusが挙げられる。
本発明の植物生長促進剤中、ウェルコミクロビウム門の微生物の含有割合は、好ましくは１．５％以上であり、より好ましくは、２％～５％である。

本発明の植物生長促進剤がこのような微生物を含むことにより、植物生長促進剤に含有されていた有機物が消費されていることに加えて、植物生長促進剤の原料である家畜の糞尿の液体成分に元々含まれていた植物発芽阻害物質が微生物により分解されていると推測される。その結果、本発明の植物生長促進剤は、安定した植物生長効果をもたらすことができると考えられる。

本発明の植物生長促進剤は、さらに、アシドバクテリア門に含まれる微生物、クロロビウム門に属する微生物、及びプロテオバクテリア門に属する微生物からなる群から選ばれる一種以上の微生物を１．５％以上含むことが好ましい。

［リアルタイムＰＣＲとシーケンスによる微生物の検出］
植物生長促進剤中において１６ＳｒＲＮＡをターゲットとする第１プライマー及び第２プライマーを用いたリアルタイムＰＣＲを行うことにより植物生長促進剤に含まれる微生物群を特定することができる。リアルタイムＰＣＲでは、ＰＣＲ増幅産物の増加をリアルタイムに解析することにより、鋳型ＤＮＡを定量する。１６ＳｒＲＮＡは、どの微生物においても配列の相動性が高いことから微生物の定量の指標として用いることができる。

第１プライマー及び第２プライマーは、リアルタイムＰＣＲにおいてＤＮＡポリメラーゼによる鋳型ＤＮＡの複製の開始起点となるオリゴヌクレオチドである。第１プライマーとして、配列番号１：
5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′（配列番号１）
で示される塩基配列を含むＤＮＡ分子を用い、第２プライマーとして、配列番号２：
5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′（配列番号２）
で示される塩基配列を含むＤＮＡ分子を用いることができる。

配列番号１で示される塩基配列中、ＮはＡ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）又はＣ（シトシン）であり、ＷはＡ又はＴである。配列番号２で示される塩基配列中、ＨはＡ、Ｔ又はＣであり、ＶはＡ、Ｃ又はＧである。

第１プライマーは、配列番号１で示される塩基配列の５’側又は３’側に追加的な塩基配列を含んでもよい。このようなプライマーの例としては、５’側に追加的な塩基配列を含む配列番号３：
5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3′のＤＮＡ分子が挙げられる。同様に、第２プライマーは、配列番号２で示される塩基配列の５’側又は３’側に追加的な塩基配列を含んでもよい。このようなプライマーの例としては、５’側に追加的な塩基配列を含む配列番号４：
5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′のＤＮＡ分子が挙げられる。

リアルタイムＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ分子の配列を解読することにより、微生物群の種をそれぞれ特定することができる。解読されたＤＮＡ配列と既知の種のＤＮＡ配列との相同性が９７％以上である場合に、解読されたＤＮＡ配列がこの既知の種由来の１６ＳｒＲＮＡの鋳型ＤＮＡ配列又は鋳型ＤＮＡの相補鎖のＤＮＡ配列であると判定することができる。

図１は、本発明の植物生長促進剤の一例（以下「植物生長促進剤Ａ」という。）中の微生物をリアルタイムＰＣＲで定量した際の解析結果を示す。図１には、リアルタイムＰＣＲにより検出された代表的な微生物のリード数を門ごとに示す。リード数は、リアルタイムＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ分子の塩基配列を解読した結果、図１に示す門に属する微生物由来であると判定されたＤＮＡ分子の数である。図１の全リード数に対する割合は、塩基配列を解読したＤＮＡ分子の総数（全リード数）に対するリード数の割合の百分率である。なお、図１に示す結果を得るための解析方法の詳細については後述する。

植物生長促進剤ＡのリアルタイムＰＣＲによる解析結果では、図１に示すように、全リード数に対するそれぞれの門に属する微生物のリード数の割合は、アシドバクテリア門に含まれる微生物が１４．８８％、バクテロイデス門に含まれる微生物が６．８０４％、クロロビウム門に含まれる微生物が８．６１９％、クロロフレクサス門に含まれる微生物が８．９５２％、ゲンマティモナス門に含まれる微生物が３．１２％、未培養門ＯＤ１に含まれる微生物が２．９２９％、プロテオバクテリア門に含まれる微生物が３６．７９２％、ウェルコミクロビウム門に含まれる微生物が２．８３％であった。

植物生長促進剤Ａに含まれる微生物の割合は、植物生長促進剤Ａの製造場所の地理的条件等により多少ばらつくことがあるが、図１に示す下限値は、このばらつきによらずに検出可能な微生物の割合の下限値である。この下限値は、図１に示す全リード数に対する割合と同様に、それぞれの門に含まれる微生物が植物生長促進剤ＡのリアルタイムＰＣＲにおいて検出されるリード数の全リード数に対する百分率を示す。図１の下限値の欄に示すように、植物生長促進剤Ａは、アシドバクテリア門に含まれる微生物を３．５％以上、バクテロイデス門に含まれる微生物を１．５％以上、クロロビウム門に含まれる微生物を１．５％以上、クロロフレクサス門に含まれる微生物を１．５％以上、ゲンマティモナス門に含まれる微生物を０．５％以上、未培養門ＯＤ１に含まれる微生物を０．５％以上、プロテオバクテリア門に含まれる微生物を８％以上、ウェルコミクロビウム門に含まれる微生物を０．５％以上少なくとも含む。

［炭素分］
本発明の植物生長促進剤は、家畜の糞尿由来であり、炭素分（有機物）を含有していてもよい。ただし、本発明の植物生長促進剤は、炭素分が少ない方が好ましく、好ましくは、全炭素濃度が２，０００ｍｇ／ｋｇ以下である。このように、植物生長促進剤における炭素の濃度が、原料の糞尿に含有される炭素の濃度よりも低いので、植物に植物生長促進剤を与えた場合に、土壌中の有機物の濃度が高くなることを抑制することができる。このため、本発明の植物生長促進剤は、土壌中の酸素の欠乏や植物の根腐れを引き起こすことを抑制することができる。

本発明の植物生長促進剤は、窒素分を含有していてもよいが、窒素分が少なくとも植物生長促進効果を発揮することができる。本発明の植物生長促進剤は、好ましくは、全窒素濃度が５００ｍｇ／ｋｇ以下である。この全窒素濃度は、一般的な肥料に含まれる全窒素濃度と比較すると少ない。

本発明の植物生長促進剤は、リン分を含有していてもよいが、リン分が少なくとも植物生長促進効果を発揮することができる。本発明の植物生長促進剤は、好ましくは、全リン濃度が２，０００ｍｇ／ｋｇ以下である。この全リン濃度は、一般的な肥料に含まれる全リン濃度と比較すると少ない。

本発明の植物生長促進剤は、カリウム（塩であってもよい）を含有していてもよいが、カリウムが少なくとも植物生長促進効果を発揮することができる。本発明の植物生長促進剤は、好ましくは、カリウム濃度が５，０００ｍｇ／ｋｇ以下である。このカリウム濃度は、一般的な肥料に含まれる全リン濃度と比較すると少ない。

本発明の植物生長促進剤は、剤型は限定されず、液体、固形又はスラリー等のいずれであってもよいが、液体であることが好ましい。
また、本発明の植物生長促進剤は、剤型に応じた副成分、例えば、希釈剤、安定剤、増粘剤、造粒剤などを含んでいてもよい。

本発明の植物生長促進剤の好適な態様として、全窒素濃度が５００ｍｇ／ｋｇ以下であり、全リン濃度が２，０００ｍｇ／ｋｇ以下であり、全カリウム濃度が５，０００ｍｇ／ｋｇ以下であり、アンモニア性窒素の濃度が２００ｍｇ／Ｌ以下であり、水溶性リン酸の五酸化リン酸換算の濃度が５質量％以下であり、且つ、水溶性カリウムの二酸化カリウム換算の濃度が５質量％以下である植物生長促進剤が挙げられる。本発明の植物生長促進剤における窒素、リン及び水溶性カリウムの濃度は、一般的な肥料における窒素、リン及び水溶性カリウムの濃度より低い。本発明の植物生長促進剤は、窒素等の濃度が低いにもかかわらず、後述の実施例において確認されているように植物生長促進効果がある。このことから、植物生長促進剤には上記微生物に起因する植物ホルモン様物質が含まれていると推定される。

［植物生長促進剤の好適な製造方法の例］
本発明の植物生長促進剤は、例えば、家畜、好ましくは牛や豚の糞尿を数日間以上曝気させることにより得ることができる。糞尿を曝気させることにより、上記した微生物が増殖し、本発明の植物生長促進剤が得られる。
曝気させる期間は、好ましくは、１ヶ月以上であり、より好ましくは、１０ヶ月以上であり、さらに好ましくは１２ヶ月以上であり、特に好ましくは、１３ヶ月～１８ヶ月である。

［植物生長促進剤の好適な製造方法］
本発明の植物生長促進剤の好適な製造方法を説明する。本発明の植物生長促進剤は、好ましくは、以下の（１）及び（２）のステップを含む方法により製造される。
（１）家畜の糞尿の液体成分を分離するステップ
（２）液体成分を曝気させるステップ
（１）のステップでは、家畜の糞尿を蓄積し、蓄積した糞尿の液体成分を分離する。例えば、家畜の糞尿の上澄み液を液体成分として分離する。

（２）のステップでは、家畜の糞尿の液体成分を曝気処理槽において曝気する。曝気処理槽においては、糞尿の液体成分中へ空気を送り込み、送り込んだ空気に液体を触れさせることにより、糞尿の液体成分を曝気させることができる。曝気処理槽のサイズに特に制限は設けないが、例えば、１Ｌ～１００ｋＬの間である。曝気処理槽のサイズは、望ましくは１０Ｌ～１０ｋＬ、更に望ましくは５００Ｌ～５ｋＬである。処理液の供給形態は制限されるものではないが、曝気処理槽に連続的又は半連続的に家畜の糞尿又はその液体成分が供給されることが望ましい。

図２は、植物生長促進剤Ａを製造するための製造装置１００の一例を示す。製造装置１００は、糞尿貯め１０と、供給部２０と、第１曝気処理槽３０ａ～第４曝気処理槽３０ｄと、コンプレッサ４０ａ～コンプレッサ４０ｄと、回収部５０とを備える。糞尿貯め１０は、牛舎中の牛の糞尿を貯える。供給部２０は、糞尿貯め１０と第１曝気処理槽３０ａとの間に接続されたパイプを介して、糞尿貯め１０に貯えられた糞尿をポンプにより第１曝気処理槽３０ａへ供給する。供給部２０は、自動的且つ断続的に糞尿を供給し、例えば、１ヵ月に１回のペースで糞尿を供給する。

第１曝気処理槽３０ａ～第４曝気処理槽３０ｄは、槽内に貯えている家畜の糞尿の液体成分を曝気させる。図２は、製造装置１００が４つの槽を有する例を示すが、製造装置１００は１槽のみを有してもよく、直列に配置された２～８槽を有してもよい。第１曝気処理槽３０ａのサイズは、一例としては縦３ｍ、横３ｍ、深さ２．５ｍであり、第２曝気処理槽３０ｂ～第４曝気処理槽３０ｄは、第１曝気処理槽３０ａと同じサイズであってもよい。

第１曝気処理槽３０ａ～第４曝気処理槽３０ｄは、糞尿を固体成分と液体成分とに分離する。第１曝気処理槽３０ａ～第４曝気処理槽３０ｄは、槽内の糞尿の固体成分を沈降させる。一方、第１曝気処理槽３０ａからあふれた糞尿の液体成分は、第２曝気処理槽３０ｂへ移動する。液体成分が、第３曝気処理槽３０ｃ、第４曝気処理槽３０ｄへ順次移動し、それぞれの曝気処理層において糞尿の固体成分が沈降することにより、糞尿の固体成分がほぼ除去される。

コンプレッサ４０ａ～コンプレッサ４０ｄは、空気を圧縮して、第１曝気処理槽３０ａ～第４曝気処理槽３０ｄ内において糞尿の液体成分中に圧縮した空気を送り込むための装置である。第１曝気処理槽３０ａ～第４曝気処理槽３０ｄでは、コンプレッサ４０ａ～コンプレッサ４０ｄにより送り込まれた空気に液体成分が触れるので、液体成分を曝気させることができる。第１曝気処理槽３０ａ～第４曝気処理槽３０ｄは、コンプレッサ４０ａ～コンプレッサ４０ｄを用いて液体成分内の微生物の増殖に要する酸素を供給することにより、微生物の増殖を促進させることができる。微生物の増殖を促進させることで、糞尿の液体成分に含まれる植物発芽阻害成分の分解量を増やすことができる。

（２）のステップでは、Ｆ［ｍ／ｓ］を空気流量、Ｖ［ｍ^３］を処理液体積、Ｈ_Ｌ［ｍ］を処理液深度とした場合に、

を満たす状態において家畜の糞尿の液体成分を曝気させる。この式（ａ）は通気塔の酸素移動容量係数と操作条件との関係を示すものとして知られている。酸素移動容量係数は、槽内の酸素供給能を示す指標であり、式（ａ）の数値ｋに比例することが知られている（吉田敏臣著「バイオテクノロジー教科書シリーズ培養工学」コロナ社、１９９８年１２月１８日発行、ｐ．４５－５１）。

曝気が行われている間の糞尿の液体成分の温度は、０℃～４０℃の範囲である。曝気が行われている間の糞尿の液体成分のｐＨは、６．０～８．０の間が好適である。

曝気時間は、糞尿の液体成分の植物発芽阻害成分が十分に除去できるまでの時間であり、好ましくは、１ヶ月以上、さらに好ましくは１２カ月以上である。

また、微生物による植物発芽阻害成分の除去を促進させるため、外部から何らかの従属栄養性好気微生物を添加してもよい。従属栄養性好気微生物は、例えば、酵母、乳酸菌等である。

図２の回収部５０は、例えばポンプを用いて、第４曝気処理槽３０ｄに接続されたパイプを介して、曝気された後の液体成分を植物生長促進剤として回収する。回収された植物生長促進剤では、（２）のステップの処理を実行することにより、含有する微生物が増殖しており、第１プライマー及び第２プライマーを用いて検出される微生物のうち、バクテロイデス門に含まれる微生物を１．５％以上、クロロフレクサス門に含まれる微生物を１．５％以上、ゲンマティモナス門に含まれる微生物を０．５％以上、又は、ウェルコミクロビウム門に含まれる微生物を０．５％以上含む。

回収された植物生長促進剤は、そのままもしくは５０倍まで希釈して植物に使用することができ、植物生長促進剤単体、又は植物生長促進剤と無機肥料もしくは有機肥料とを混合して使用することにより、相乗的に植物生長促進効果が期待できる。

回収された植物生長促進剤は、（２）のステップにおいて微生物により液体成分に含まれる有機物がほぼ完全に消費されているので、植物に植物生長促進剤を加えた場合に、土壌中の有機物濃度が高くなることを抑制することができる。このため、高い有機物濃度に起因する酸素の欠乏や植物の根腐れを抑制することができる。また、これまで利用方法が乏しかった家畜糞尿の液体成分を植物生長促進剤として有効活用することができる。植物生長促進剤を使用する対象となる植物の栽培形態は特に限定されず、畑作、稲作及び水耕栽培において生長促進効果を示すことが確認されている。また、植物生長促進剤に有機肥料又は無機肥料以外の副成分を混合した状態で植物の生長促進のために用いてもよい。

［実施例１］
［植物生長促進剤Ａの製造］
図２に示した製造装置１００を用いて植物生長促進剤Ａを製造した。植物生長促進剤Ａの原材料として牛舎中の牛の糞尿を用いた。図２の第４曝気処理槽３０ｄの貯留液から１ヶ月に１回約６トンの植物生長促進剤Ａを取り出した。第１曝気処理槽３０ａ～第４曝気処理槽３０ｄの体積はそれぞれ２０ｋＬとした。曝気量は各曝気処理槽で約３．７５ｍ^３／分とした。Ｆ［ｍ／ｓ］を空気流量、Ｖ［ｍ^３］を処理液体積、Ｈ_Ｌ［ｍ］を処理液深度とした場合に、以下の式（ａ）：

において数値ｋは、０．０１１〔ｍ^２／３／ｓ〕であり、式（ａ）の不等式の条件を満たした。

［植物生長促進剤Ａの組成分析］
簡易ＣＯＤメーターＨＣ－６０７を用いて化学的酸素要求量（ＣＯＤ）を測定した。水素イオン濃度ｐＨは、ＪＩＳＫ０１０２１７．１に従い、ガラス電極法を用いて測定した。全炭素濃度は、全有機炭素計（ＴＯＣ－Ｖ，ＳＳＭ－５０００Ａ，島津製作所）を用いて測定した。全窒素濃度の測定では、ケルダール法により変換されたアンモニア態窒素をインドフェノール青法で測定した。全リン濃度の測定では、植物生長促進剤Ａ中のリンにモリブデン酸アンモニウムを加えて錯体を形成させ、アスコルビン酸により還元させ、還元反応による生成物の７１０ｎｍの吸収を測定した。全カリウム濃度は、原子吸光法により測定した。無機窒素は試料４．０ｇを１．０ＭＫＣｌ４０ｍＬに溶解させ、遠心分離後の上清を測定に用いた。

アンモニア態窒素の濃度の測定は、アンモニア態窒素の抽出液１．０ｍＬにフェノールニトロプルシッド溶液４００μＬを混合し、次亜塩素酸ナトリウム溶液６００μＬを加えてから撹拌し、４５分後に６３５ｎｍの光の吸光度を分光光度計で測定することにより行った。

また、亜硝酸態窒素の濃度の測定では、まず、亜硝酸態窒素の１．０ｍＬの抽出液に１００μＬのスルファニルアミド溶液を加えてから撹拌し、３分間放置した。その後、ナフチルエチレンジアミン溶液１００μＬを加えてから撹拌し、２０分間放置した。その後、５４０ｎｍの光の吸光度を分光光度計で測定することにより亜硝酸態窒素の濃度を測定した。

硝酸態窒素の測定では、硝酸態窒素の抽出液２００μＬにブルシン・４－アミノベンゼンスルホン酸溶液１００μＬを加えた。その後、硫酸（水：濃硫酸＝３：２０）１．０ｍＬを加えてから撹拌し、冷暗所で１０分間反応させた。さらに水１．０ｍＬを加えた後に、４１０ｎｍの光の吸光度を分光光度計で測定した。

植物生長促進剤ＡのｐＨは８．８２、化学的酸素要求量（ＣＯＤ）は７４９．３±３３．４ｍｇ／Ｌ（試行回数３回、±以下の数値は標準偏差）であった。全炭素濃度は１，１００ｍｇ／ｋｇ、全窒素濃度は２９０ｍｇ－Ｎ／ｋｇ、全リン濃度は、２６ｍｇ／ｋｇ、全カリウム濃度は２，７００ｍｇ／ｋｇであった。水溶性硝酸態窒素濃度は３８０ｍｇ－Ｎ／ｋｇ、アンモニア性窒素は不検出、水溶性リン酸濃度は五酸化リン酸換算で６４ｍｇ－Ｐ_２Ｏ_５／ｋｇ、水溶性カリウム濃度は酸化カリウム換算で３，２５４ｍｇ－Ｋ_２Ｏ／ｋｇであった。

北海道施肥ガイド２０１５（北海道ホームページ、 http://www.pref.hokkaido.lg.jp/ns/shs/clean/sehiguide2015.htm、２０１９年１月２１日閲覧）によると、一般的な牛糞堆肥の全炭素量は７２，０００ｍｇ／ｋｇ、全窒素量は６，０００ｍｇ－Ｎ／ｋｇ、水溶性リン酸は４，０００ｍｇ－Ｐ_２Ｏ_５／ｋｇ、水溶性カリウムは５，０００ｍｇ－Ｋ_２Ｏ／ｋｇ程度である。したがって、植物生長促進剤Ａの中に含まれる肥料成分は、一般的な牛糞堆肥に比べて極めて希薄であることがわかる。

［植物生長促進効果の検証（水耕栽培）］
ＬＥＤ光源付の栽培棚でトマト及び小松菜を栽培することにより、植物生長促進効果の確認試験を実施した。試験区では、水で１／１０希釈した植物生長促進剤Ａを吸収させた約１ｃｍ角のウレタンフォームに、種子が上を向いた状態で並べた。一方、比較のための対照区では、脱イオン水を入れたバットに、種子が上を向いた状態で並べた。１２時間ごとに光源の点灯状態と消灯状態とを切り替えた。温度の調節は、実験室のエアコンを用いて、２８℃に設定することにより行った。それぞれの試験区で２７検体の試験を実施し、発芽して生育した植物体の高さを測定し、平均高さ及び標準偏差を求めた。発芽しなかった植物体は実験結果の評価対象から除外した。

図３は、播種後１ヶ月の小松菜及びトマトを撮影した様子を示す写真である。対照区の水のみで生育したトマトならびに小松菜の地上部の高さは、それぞれ１．９８±０．１３ｃｍ、１．９３±４．３４ｃｍであったのに対し、試験区にて１／１０希釈した植物生長促進剤Ａで生育したものは、それぞれ７．５５±０．８６ｃｍ、５．０４±０．６２ｃｍであった。小松菜及びトマトは、試験区においては対照区と比べて、それぞれ３．８倍、２．６倍の高さまで生長した。したがって、製造した植物生長促進剤Ａは、小松菜及びトマトの両方において植物生長促進効果をもたらすことを確認できた。

［実施例２］
［無機栄養源との併用効果］
実施例１と同様の条件で、試験区において、水で５００倍希釈したハイポネックス社製のハイポネックス原液（マニュアルの標準使用量。以下、無機栄養とも表記する）と１０倍希釈した植物生長促進剤Ａとを併用した状態で、トマト及び小松菜を栽培した。対照区において、水で５００倍希釈したハイポネックス原液のみを用いて植物生長促進剤Ａを加えない状態で、トマト及び小松菜を栽培した。

植物生長促進剤Ａを添加せずに無機栄養のみを用いた対照区では、小松菜及びトマトの生長後の高さがそれぞれ５．９７±２．４ｃｍ、４．７０±２．１ｃｍであったのに対し、植物生長促進剤Ａと無機栄養を併用した試験区では、それぞれ１０．２２±５．５８ｃｍ、４．９４±３．２８ｃｍであった。小松菜においては約４０％の生長促進効果が認められた。トマトを栽培する場合、無機栄養のみの場合と比べて、有意な生長促進効果は認められなかった。以上のように、実施例に記載した植物生長促進剤Ａは、市販の肥料と併用する場合に植物の生長促進の相乗効果を発揮することを確認した。

［微生物群集解析］
実施例１に記載した方法で製造した植物生長促進剤Ａ（１ｍＬ）を遠心分離（２０，０００×ｇ、５分間）し、沈殿物を回収した。沈殿物を５６０μＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ）に溶解した後、３０μＬのＳＤＳ溶液、１０μＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、混ぜた後、３７℃で１時間保温した。その後、１００μＬの５ＭＮａＣｌを添加し、よく混ぜた後、８０μＬのＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液を加え、よく混ぜた。サンプルを６５℃で１０分間保温した。保温後、０．７ｍＬのクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を添加し、反転混合した。その後、遠心分離（２０，０００×ｇ、５分間）した。生じた上清を新しいサンプルチューブに移し、フェノールクロロホルム抽出、イソプロパノール沈殿により、ＤＮＡを調整した。

分離したＤＮＡを鋳型として、5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′（配列番号４）の塩基配列からなる第１プライマー、及び、5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3′（配列番号３）の塩基配列からなる第２プライマーを用いて、１６ＳｒＲＮＡの部分配列を増幅した。具体的には、5 ng/μlのDNA2.5 μlにAmplion PCR Forward Primer （1 μM） 5 μl、Amplicon PCR Reverse Primer （1 μM） 5 μl、KAPA HiFi Hotstart ReadyMix （KAPA Biosystems） 12.5 μlを混合し、サーマルサイクラーT-100 （BioRad）を用いてＰＣＲ増幅した。サーマルサイクル反応は初期変性（９５℃、３分）の後、変性（９５℃、３０秒）、アニーリング（５５℃、３０秒）、伸長反応（７２℃、３０秒）を２５サイクル行い、７２℃、５分の伸長反応を行った。

アガロースゲル電気泳動を用いてＰＣＲ増幅反応を確認後、AMPure XPビーズを用いて、ＰＣＲ増幅産物の精製をした。ＰＣＲ増幅産物を遠心機でスピンダウンした後、ボルテックスでよく撹拌したAMpure XPビーズを20 μl加え、ピペッティングで１０回混合した。室温で５分静置後、マグネティックスタンドにセットした状態で２分静置した。その後、透明になった上清をピペッティングで取り除いた。８０％エタノールを200 μl加え、３０秒静置した。上清を再び取り除き、再度８０％エタノールを200 μl加えた。３０秒静置後、ピペッティングでエタノールを完全に取り除き、１０分風乾した。

続いて、マグネティックスタンドからチューブを取り出し、10 mM Tris-HCl （pH 8.5）を52.5 μl加え、ピペッティングでよく撹拌した。室温で２分静置した後、マグネティックスタンドにセットし、さらに２分静置した。ＰＣＲ産物が含まれる上清を新しいチューブに移した。Qubit fluorometerを用いて、ＤＮＡ濃度を確認し、0.2 ng/μl以上であることを確認した。

アダプタ及びインデックスを付加するため、２回目のＰＣＲを行った。精製済みのPCR産物5 μlに対してNextera XT Index Primer mix 10 μl、KAPA HiFi HotStart ReadyMix （2 x） 25 μl、RCR grade water 10 μlを混合し、サーマルサイクル反応を行った。サーマルサイクル反応は初期変性（９５℃、３分）の後、変性（９５℃、３０秒）、アニーリング（５５℃、３０秒）、伸長反応（７２℃、３０秒）を８サイクル行い、７２℃、５分の伸長反応を行った。その後、AMPure XPビーズを用いて、ＰＣＲ増幅産物の精製をした。更に、Qubit fluorometerを用いて、ＤＮＡ濃度を確認し、5 ng/μl以上であることを確認した。

Illumina社MiSeqシーケンサーを用いて、ペアエンドシークエンスした。得られたリードデータはクオリティーチェック、アダプタならびにインデックス配列を除去し、Qiimeプログラムを用いたクラスター解析に供した。９７％以上の相同性に基づくOperated Taxonomic Unit （OTU）を作成し、ＢＬＡＳＴ解析を用いて、系統学的な情報を付与した。計算過程でOTU代表配列データ、多様性解析データを得た。

ＯＴＵ代表配列データを門レベルでまとめた表を図１に示す。代表配列に含まれるリード数ならびに全リードに対する割合を示している。全リード数は４６，６０５リードであった。アシドバクテリア門に含まれる微生物の割合は１４．８８％、バクテロイデス門に含まれる微生物の割合は６．８０４％、クロロビウム門に含まれる微生物の割合は８．６１９％、クロロフレクサス門に含まれる微生物の割合は８．９５２％、ゲンマティモナス門に含まれる微生物は３．１２％、未培養門ＯＤ１に含まれる微生物は２．９２９％、プランクトミケス門に含まれる微生物は３．５２５％、プロテオバクテリア門に含まれる微生物は３６．７９２％、ウェルコミクロビウム門に含まれる微生物は２．８３％含まれていることを確認した。

以上、実施形態を用いて本発明を説明したが、本発明の技術的範囲は上記実施の形態に記載の範囲には限定されず、その要旨の範囲内で種々の変形及び変更が可能である。例えば、装置の全部又は一部は、任意の単位で機能的又は物理的に分散・統合して構成することができる。また、複数の実施の形態の任意の組み合わせによって生じる新たな実施の形態も、本発明の実施の形態に含まれる。組み合わせによって生じる新たな実施の形態の効果は、もとの実施の形態の効果を併せ持つ。

本実施形態の植物生長促進剤は、植物の生長を促進するので、農作物の収穫量を増加させることができる。

１０糞尿貯め
２０供給部
３０ａ第１曝気処理槽
３０ｂ第２曝気処理槽
３０ｃ第３曝気処理槽
３０ｄ第４曝気処理槽
５０回収部
１００製造装置

Claims

家畜の糞尿を原料とする植物生長促進剤であって、バクテロイデス門に含まれる微生物、クロロフレクサス門に含まれる微生物、ゲンマティモナス門に含まれる微生物、及びウェルコミクロビウム門に含まれる微生物からなる群のうち少なくともゲンマティモナス門に含まれる微生物を含み、
さらに、プロテオバクテリア門に含まれる微生物及びアシドバクテリア門に含まれる微生物を含む、植物生長促進剤であって、
ケルダール法で測定した全窒素濃度が500mg/kg以下である、
植物生長促進剤。
家畜の糞尿を原料とする植物生長促進剤であって、バクテロイデス門に含まれる微生物、クロロフレクサス門に含まれる微生物、ゲンマティモナス門に含まれる微生物、及びウェルコミクロビウム門に含まれる微生物からなる群のうち少なくともゲンマティモナス門に含まれる微生物を含み、
さらに、プロテオバクテリア門に含まれる微生物及びアシドバクテリア門に含まれる微生物を含む、植物生長促進剤であって、
全リン濃度が2，000mg/kg以下である、
植物生長促進剤。
家畜の糞尿を原料とする植物生長促進剤であって、バクテロイデス門に含まれる微生物、クロロフレクサス門に含まれる微生物、ゲンマティモナス門に含まれる微生物、及びウェルコミクロビウム門に含まれる微生物からなる群のうち少なくともゲンマティモナス門に含まれる微生物を含み、
さらに、プロテオバクテリア門に含まれる微生物及びアシドバクテリア門に含まれる微生物を含む、植物生長促進剤であって、
全カリウム濃度が5，000mg/kg以下である、
植物生長促進剤。
5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′(配列番号1)で示される塩基配列(該塩基配列中、NはA、T、G又はCであり、WはA又はTである)を含む第1プライマーと5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′(配列番号2)で示される塩基配列(該塩基配列中、HはA、T又はCであり、VはA、C又はGである)を含む第2プライマーとを用いて、該植物生長促進剤中に含まれる微生物を検出したときに、バクテロイデス門に含まれる微生物、クロロフレクサス門に含まれる微生物、ゲンマティモナス門に含まれる微生物、及び、ウェルコミクロビウム門に含まれる微生物からなる群のうち少なくともいずれか1つ以上が検出される、
請求項１から３のいずれか一項に記載の植物生長促進剤。
全炭素濃度が2，000mg/kg以下である、
請求項１から４のいずれか一項に記載の植物生長促進剤。
前記植物生長促進剤は、液体、固形又はスラリーの態様である、
請求項１から５のいずれか一項に記載の植物生長促進剤。