JP7481758B2 - 試料中の被検出物質を検出する方法 - Google Patents
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Description
非特許文献1に開示されているように、イムノクロマトグラフィー法により抗体を用いた測定方法は多種開発されてきている。イムノクロマトグラフィー法は使用するにあたり、知識、技術、装置、環境を選ばないため、例えば、抗ヒト絨毛性ゴナドトロピン抗体を用いた妊娠検査器は一般家庭で広く使われている。同様に、A型およびB型インフルエンザウイルスに結合する抗体を用いたイムノクロマトグラフィー法は、臨床現場で迅速にインフルエンザの判定をすることに大きく寄与している。
また、インフルエンザウイルスにおいては、非特許文献4に開示されているように、100~1000倍の感度向上に成功すれば検体を鼻汁ではなく、唾液での検査が可能となるため、医療従事者および患者の負担が軽減されることが期待されている。
さらに、非特許文献7には、電極付近に菌を濃縮したのちに菌に特異性のある抗体を添加して凝集させ、その後洗浄することによって、抗体によって凝集したかどうかで菌を判定することが開示されている。
また、特許文献2には、複合体物質と試料中に含まれる特定分子以外の分子とを分離する方法が開示されている。具体的には、AFPを検出対象物質とし、抗AFP抗体を予めラテックス粒子に結合し、AFPの異なるエピトープに結合する抗体WA1のFabを蛍光標識したものと抗原抗体反応させたのちに、誘電泳動を行いAFPの有り無しで誘電泳動される様子をサンドイッチ反応した蛍光標識Fabで評価している。すなわち、特許文献2に開示される技術では、誘電泳動を行うことによりAFPを介してラテックス粒子に結合した蛍光標識Fabと、フリーに存在する蛍光標識Fabを、分離しているので、抗原の有無を、誘電泳動の有無によって区別している。
また、非特許文献7に記載の方法では、抗体による特異性で菌の同定は可能となるが、反応セルは十分な流量を確保するために一定以上の大きさとなり、装置も三種の液体を切り替えて流す必要があるため大型化せざるを得ない。
そこで、本発明が解決しようとする課題は、高感度な測定を専用の設備、環境、知識および技術を必要とすることなく行うことが可能となる新たな測定系を提供することである。
[1]
試料中の被検出物質を検出する方法であって、
試料中の被検出物質、被検出物質認識材料もしくは被検出物質と被検出物質認識材料との結合体を電気泳動または誘電泳動により局所に濃縮する工程、
場合により、試料中で被検出物質と被検出物質認識材料とを結合する工程、
被検出物質と被検出物質認識材料との結合体の蛍光強度の変化を測定する工程、
測定された蛍光強度により試料中の被検出物質の存在を確認する工程、
を含み、
被検出物質認識材料は特定波長で蛍光を発する蛍光物質で標識されており、特異的に被検出物質を認識して結合する、方法。
[2]
試料中で被検出物質と、特定波長で蛍光を発する蛍光物質で標識された被検出物質認識材料と、当該特定波長とは異なる波長で蛍光する蛍光物質または当該特定波長の蛍光を吸収する消光物質で標識された被検出物質認識材料と、を混合することにより、被検出物質と被検出物質認識材料とを結合する、[1]に記載の方法。
[2-1]
試料中の被検出物質を検出する方法であって、
試料中の被検出物質、被検出物質認識材料もしくは被検出物質と被検出物質認識材料との結合体を電気泳動または誘電泳動により局所に濃縮する工程、
場合により、試料中で被検出物質と被検出物質認識材料とを結合する工程、
被検出物質と被検出物質認識材料との結合体の蛍光強度を測定する工程、
測定された蛍光強度により試料中の被検出物質の存在を確認する工程、
を含み、
蛍光強度を測定するために、試料中で被検出物質と、特定波長で蛍光を発する蛍光物質で標識された被検出物質認識材料と、当該特定波長とは異なる波長で蛍光する蛍光物質または当該特定波長の蛍光を吸収する消光物質で標識された被検出物質認識材料と、を混合することにより、被検出物質と被検出物質認識材料とを結合する、
被検出物質認識材料は特定波長で蛍光を発する蛍光物質で標識されており、特異的に被検出物質を認識して結合する、方法。
[3]
試料中で被検出物質と、特定波長で蛍光を発する蛍光物質で標識された被検出物質認識材料と、当該特定波長とは異なる波長で蛍光する蛍光物質または当該特定波長の蛍光を吸収する消光物質で標識された被検出物質もしくは被検出物質認識材料において被検出物質と同じ部位で認識される被検出物質ではない物質と、を混合することにより、試料中の被検出物質と被検出物質認識材料とを結合する、[1]または[2]に記載の方法。
[3-1]
試料中の被検出物質を検出する方法であって、
試料中の被検出物質、被検出物質認識材料もしくは被検出物質と被検出物質認識材料との結合体を電気泳動または誘電泳動により局所に濃縮する工程、
場合により、試料中で被検出物質と被検出物質認識材料とを結合する工程、
被検出物質と被検出物質認識材料との結合体の蛍光強度を測定する工程、
測定された蛍光強度により試料中の被検出物質の存在を確認する工程、
を含み、
蛍光強度を測定するために、試料中で被検出物質と、特定波長で蛍光を発する蛍光物質で標識された被検出物質認識材料と、当該特定波長とは異なる波長で蛍光する蛍光物質または当該特定波長の蛍光を吸収する消光物質で標識された被検出物質もしくは被検出物質認識材料において被検出物質と同じ部位で認識される被検出物質ではない物質と、を混合することにより、試料中の被検出物質と被検出物質認識材料とを結合する、
被検出物質認識材料は特定波長で蛍光を発する蛍光物質で標識されており、特異的に被検出物質を認識して結合する、方法。
[4]
試料中で特定波長を発する蛍光物質で標識された被検出物質認識材料と、当該特定波長とは異なる波長で蛍光する蛍光物質または当該特定波長の蛍光を吸収する消光物質で標識された被検出物質認識材料とが、被検出物質に同時に結合する、[1]~[3]に記載の方法。
なお、[2]または[3]については、[2]は[2-1]であってもよく、[3]は[3-1]であってもよい。
[5]
特定波長で蛍光を発する蛍光物質が波長1で励起して波長2を発する蛍光物質であり、当該特定波長とは異なる波長で蛍光する蛍光物質が波長2を吸収して波長3を発する蛍光物質であり、波長1で励起して波長3の蛍光強度を測定する、[1]~[4]のいずれかに記載の方法。
ここで、波長3の蛍光強度の測定は、波長3単独、波長2および波長3の双方の測定であってもよい。
[6]
特定波長で蛍光を発する蛍光物質が波長1で励起して波長2を発する蛍光物質であり、当該特定波長の蛍光を吸収する消光物質が波長2を吸収するが少なくとも測定波長域では蛍光を発しない消光物質であり、波長1で励起して波長2の蛍光強度を測定する、[1]~[5]のいずれかに記載の方法。
[7]
被検出物質認識材料、被検出物質および被検出物質認識材料において被検出物質と同じ部位で認識される被検出物質ではない物質からなる群から選択されるいずれかが担体粒子に物理的または化学的に結合している、[1]~[6]のいずれかに記載の方法。
[8]
試料中で特定波長を発する蛍光物質で標識された被検出物質認識材料と、当該特定波長とは異なる波長で蛍光する蛍光物質または当該特定波長の蛍光を吸収する消光物質で標識された被検出物質認識材料とが、被検出物質に同時に結合し、
担体粒子に物理的または化学的に結合している被検出物質認識材料をさらに含み、試料中で被検出物質と当該被検出物質認識材料とが結合体を形成する、[1]~[7]のいずれかに記載の方法。
[9]
担体粒子が、金属微粒子、金属酸化物微粒子、非金属性微粒子、金属コーティングされた樹脂微粒子または非感染性の球状生物微粒子である、[1]~[8]のいずれかに記載の方法
[10]
正の誘電泳動により局所に濃縮する、[1]~[9]のいずれかに記載の方法
[11]
被検出物質認識材料が、抗体または抗体断片である、[1]~[10]のいずれかに記載の方法。
[12]
被検出物質が、細菌、ウイルス、核酸、タンパク質またはペプチドである、[1]~[11]のいずれかに記載の方法。
[13]
被検出物質がインフルエンザウイルス由来物質である、[1]~[12]のいずれかに記載の方法。
[14]
蛍光物質の少なくとも1つが量子ドットである、[1]~[13]のいずれかに記載の方法。
[15]
被検出物質が核酸であり、被検出物質認識材料が被検出物質の核酸の少なくとも一部に対して相補的な核酸である、[1]~[14]のいずれかに記載の方法。
[16]
被検出物質が単鎖のRNAである、[1]~[15]のいずれかに記載の方法。
試料中の被検出物質を検出する方法であって、
試料中の被検出物質、被検出物質認識材料もしくは被検出物質と被検出物質認識材料との結合体を電気泳動または誘電泳動により局所に濃縮する工程、
場合により、試料中で被検出物質と被検出物質認識材料とを結合する工程、
被検出物質と被検出物質認識材料との結合体の蛍光強度の変化を測定する工程、
測定された蛍光強度により試料中の被検出物質の存在を確認する工程、
を含み、
被検出物質認識材料は特定波長で蛍光を発する蛍光物質で標識されており、特異的に被検出物質を認識して結合する。
本発明の検出方法により、上記各工程を行うことで、被検出物質認識材料に結合させた蛍光物質を利用して蛍光スペクトルなどの変化を測定することによって、被検出物質を検出することができる。また、蛍光スぺクトルなどの変化を検出することがにより、電気泳動または誘電泳動を蛍光スぺクトルなどの変化の測定とは別の用途すなわち、直接または間接的な被検出物質の濃縮に独立して用いることが可能な方法を提供し得る。したがって、本発明により、イムノクロマトグラフィー法を利用した従来の方法に比して高感度、高速度で検出可能な検出方法が提供される。
また、本発明の検出方法においては、被検出物質に特異的に結合し、蛍光物質で標識しておいた被検出物質認識材料と被検出物質との結合体を濃縮しつつ、被検出物質認識材料に結合させた蛍光物質を利用して蛍光スペクトルなどの変化を測定することによって、被検出物質を検出してもよい。この場合においても、本発明により、イムノクロマトグラフィー法を利用した従来の方法に比して高感度、高速度で検出可能な検出方法が提供される。
被検出物質認識材料が被検出物質と特異的に結合するとは、被検出物質認識材料が認識して結合する対象として、被検出物質に対する特異性を有していることを意味し、本発明における「特異性」とは、被検出物質認識材料が特定の被検出物質に結合することである。
病院においては、院内感染が問題となることがあり、本発明の検出方法を適用して、高感度、高速度で院内感染の起因菌を検出可能である。
生体由来試料の生体としては、特に限定されないが、例えば、哺乳動物が挙げられ、具体的には、ヒトや家畜などが挙げられ、試料として、唾液、血液などの生体由来試料を用いてもよい。
本発明においては、上記試料をそのまま検出対象としてもよく、水やアルコールなどの溶媒で試料を希釈、懸濁または溶解したものを用いてもよい。
また、試料中に被検出物質が存在していることを検出するために、試料をそのまま検出するための試料とすることが好適であるものの、検出を行う前に、超音波処理などを行って、試料を粉砕して被検出物質を溶出などしてもよい。
細菌やウイルスの存在を確認することにより、有害細菌やウイルスの存在を確認することが可能となるし、核酸、タンパク質およびペプチドなどの生体由来物質の存在を確認することで、試料中の有害物質の存在の検出や、有用物質の存在の検出が可能となる。
生体内に存在する物質を被検出物質とする場合には、試料に事前に超音波処理などを行って、試料中に被検出物質を溶出または析出させておくことが好ましい。
被検出物質となる細菌としては、特に限定されないが、例えば、大腸菌(好ましくは病原性大腸菌)、肺炎球菌、白癬菌、クラミジア、黄色ブドウ球菌、サルモネラ菌、カンピロバクターおよび結核菌などが挙げられる。
被検出物質となるウイルスとしては、特に限定されないが、例えば、インフルエンザウイルス、ノロウイルス、コロナウイルス(新型コロナウイルスを含む)、ロタウイルス、肝炎ウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスおよびヒトパピローマウイルスなどが挙げられる。
細菌やウイルスとしては、病原性を有するものが好適な被検出物質である。病原性を有するものとしては、感染症の原因となるものや、食中毒の原因となるものが挙げられ、食品の製造過程などにおける衛生管理の観点で検査することが有用なものであってもよい。例えば、食品の腐敗を促進してしまなど、食品中にコンタミしないことが求められる非病原性大腸菌などが挙げられる。
被検出物質となる核酸、タンパク質およびペプチドとしては、細菌やウイルスに由来するものが挙げられ、細菌やウイルスに由来するもの以外としては、蛇毒のような毒物、異常プリオンや各種腫瘍マーカーとなるものも挙げられる。また、生体内に存在して血液検査など生体の状態を測定するために実施される検査での対象となる物質であってもよい。
抗体または抗体断片としては、試料中でその存在を検出することを予定している被検出物質を認識することが知られた抗体やその抗体断片を用いることができる。
被検出物質認識材料としての抗体または抗体断片は、従来公知の方法により製造可能である。
抗体または抗体断片としては、糖鎖が結合している分子であることが好ましく、抗体断片としては、蛍光物質や消光物質を標識可能なものであり、被検出物質を認識することができれば特に限定されない。特に限定されないが、Fv、FabおよびF(ab’)2などが挙げられる。
被検出物質が、核酸であるとき、被検出物質認識材料は、被検出物質の核酸の塩基配列の一部に対して相補的な塩基配列を有する核酸であってよい。核酸は、従来公知の方法により製造可能である。
糖鎖を有する抗体を用いてFc領域の糖鎖を介して蛍光標識を行うことで、アフィニティーを維持することが可能である。
抗体としては、ポリクローナル抗体を用いてもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。
モノクローナル抗体の製造は従来公知の方法により実施可能であり、本発明においては、公知の方法により製造される抗体であってもよく、市販の抗体を用いることも可能である。
また、抗体の由来は特に問わないため、哺乳動物が挙げられ、実験動物であってもよく、具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ラクダなどに由来する抗体を利用可能である。抗体としては、ヒト抗体であってもよく、また、キメラ抗体や、ヒト化抗体などを用いてもよい。
抗体は、IgG、IgA、IgM、IgDおよびIgEといったクラスがあり、IgGまたはIgMを好適に用いればよいが特に限定されず、例えば、IgGを用いる場合にもIgG1~IgG4などのサブクラスは特に限定されない。
抗体断片は、上記説明したようなこれらの抗体の断片であってよい。
ここで、本発明におけるB/F分離とは、被検出物質認識材料に結合した被検出物質(B)から水中に遊離して存在している被検出物質(F)を分離することである。最も一般的な例として、ELISA法では1)抗体を容器の表面に固定化し、洗浄、2)非特異吸着を抑えるブロッキング剤を加えて、洗浄、3)検体を加えて一定時間後に廃棄して、洗浄、4)抗原に結合する抗体(酵素標識)を加えて、洗浄、5)何らかの基質を加えて酵素反応を検出、などの工程を含む方法であるが、各工程で洗浄操作が入り、このために各工程が煩雑化、設備が複雑化、当該検査を行う者が一定のレベルで技術に習熟することが必要となる。
被検出物質と被検出物質認識材料の結合は、被検出物質を含む試料中で行われるため、試料は、液性試料であることが好ましい。
被検出物質と、被検出物質認識材料との結合は、被検出物質の存在を確認するために検出対象となる試料と、被検出物質認識材料とを混合することにより行われる。
被検出物質が存在しない試料を用いた場合、被検出物質と被検出物質認識材料との結合は起こらないが、本発明の検出方法においては、測定された蛍光強度の変化により試料中の被検出物質の存在を確認する工程を行うことにより、被検出物質と被検出物質認識材料との結合が起こっていなかったことが確認される。
したがって、本発明の検出方法においては、試料中で被検出物質と被検出物質認識材料とを結合する工程は、被検出物質が存在する試料中では結合が生じるが、被検出物質が存在しない試料中では結合が生じない。
すなわち、本発明の検出方法における結合工程は、実質的には、試料と被検出物質認識材料とを混合する工程と理解される。
被検出物質と被検出物質認識材料との結合は、可逆な平衡反応となる結合であってよく、生体内におけるリガンドと受容体との結合や、抗原と抗体との結合と類似の様式での結合であってよい。
(1)試料中の被検出物質と、特定波長で蛍光を発する蛍光物質で標識された被検出物質認識材料と、当該特定波長とは異なる波長で蛍光する蛍光物質または当該特定波長の蛍光を吸収する消光物質で標識された被検出物質認識材料と、を混合することにより、試料中の被検出物質と被検出物質認識材料とを結合する、
(2)試料中の被検出物質と、特定波長で蛍光を発する蛍光物質で標識された被検出物質認識材料と、当該特定波長とは異なる波長で蛍光する蛍光物質または当該特定波長の蛍光を吸収する消光物質で標識された被検出物質もしくは被検出物質認識材料において被検出物質と同じ部位で認識される被検出物質ではない物質と、を混合することにより、試料中の被検出物質と被検出物質認識材料とを結合する、および
(3)試料中の被検出物質と、特定波長で蛍光を発する蛍光物質で標識された被検出物質認識材料と、を混合することにより、試料中の被検出物質と被検出物質認識材料とを結合する。
この場合、特定波長で蛍光を発する蛍光物質で標識された被検出物質認識材料と、当該特定波長とは異なる波長で蛍光する蛍光物質または当該特定波長の蛍光を吸収する消光物質で標識された被検出物質認識材料と、試料中の被検出物質の混合順序は特に限定されないが、特定波長で蛍光を発する蛍光物質で標識された被検出物質認識材料と、当該特定波長とは異なる波長で蛍光する蛍光物質または当該特定波長の蛍光を吸収する消光物質で標識された被検出物質認識材料とが存在する空間に、被検出物質が含まれているかを確認したい試料を添加して、また、その逆でも可であるが、被検出物質認識材料と、被検出物質を混合して結合させることが好ましい。試料中の被検出物質と一方の被検出物質認識材料とを先に混合して結合させて、その後、他方の被検出物質認識材料を混合してもよい。この場合、他方の被検出物質認識材料の混合時期は、結合体の濃縮後であってもよい。また、被検出物質または被検出物質認識材料を濃縮した後に、結合体を形成してもよく、濃縮と結合体の形成が同時期に行われてもよい。
結合工程が上記(1)である場合、被検出物質には、特定波長で蛍光を発する蛍光物質で標識された被検出物質認識材料と、当該特定波長とは異なる波長で蛍光する蛍光物質または当該特定波長の蛍光を吸収する消光物質で標識された被検出物質認識材料とが、結合するため、模式的には、2つの異なる被検出物質認識材料により被検出物質はサンドイッチされる。
この場合、一方の被検出物質と被検出物質認識材料とを先に混合して結合させて、その後、他方の被検出物質を混合してもよい。この場合、他方の被検出物質の混合時期は、結合体の濃縮後であってもよい。また、被検出物質または被検出物質認識材料を濃縮した後に、結合体を形成してもよく、濃縮と結合体の形成が同時期に行われてもよい。
結合工程が上記(2)である場合、被検出物質認識材料には、試料中の被検出物質と、蛍光物質または消光物質で標識された被検出物質とが、競合的に結合する。
特定波長で蛍光を発する蛍光物質で標識された被検出物質認識材料と、当該特定波長とは異なる波長で蛍光する蛍光物質または当該特定波長の蛍光を吸収する消光物質で標識された被検出物質とを結合しておいて、おって、試料中の被検出物質を混合することが好ましい。なお、特定波長で蛍光を発する蛍光物質で標識された被検出物質認識材料と、試料中の被検出物質とを結合しておいて、おって、当該特定波長とは異なる波長で蛍光する蛍光物質または当該特定波長の蛍光を吸収する消光物質で標識された被検出物質を混合してもよい。
蛍光物質としては、以下の一部またはすべての要件を満たす物質が好適に用いられる。
・励起波長が長いこと、好ましくは350nm以上、より好ましくは400nm以上
・蛍光波長が短いこと、好ましくは1500nm以下。
・吸光係数が高いこと、好ましくはモル吸光係数が10000以上。
・量子収率が高いこと、好ましくは0.1以上。
・複数の蛍光物質を用いる場合、一方の蛍光物質を励起する波長では他方の蛍光物質は励起されず、他方の蛍光物質の蛍光を測定する際には一方の蛍光物質が発する蛍光が重ならないこと。この場合、一方の蛍光物質の蛍光により他方の蛍光物質の励起が効率よく行えるよう、一方の蛍光物質の蛍光スペクトルと他方の蛍光物質の励起スペクトルのピークが十分近いことが好ましい。さらに、一方の蛍光物質の蛍光スペクトルは十分狭く、他方の蛍光物質の励起スペクトルは十分広いことが好ましく、励起スペクトルのピークと蛍光スペクトルのピークの位置の間の差(ストークスシフト)が十分大きいことがより好ましい。
また、蛍光物質としては、以下の一部またはすべての要件を満たすことが好適である。
・標識する物質の水溶性を阻害しないこと。
・標識した後で、被検出物質と被検出物質認識材料の特異的結合を阻害しないこと。
・標識により、非標識の物質を凝集させない、および/または光散乱を増強させないこと。
本発明においては、被検出物質や被検出物質認識材料を標識する消光物質は、適宜選択すればよい。
消光物質としては、上記蛍光物質について記載した要件に加え、以下の要件を満たす物質が求められる。
・エネルギー移動しても第二の蛍光がでないか、測定範囲よりさらに遠い波長で光る。
蛍光標識として、量子ドットと一般に呼ばれている、半導体からなる粒径数nmの蛍光粒子が有機色素の数十倍の吸光係数と量子収率を持っていて、蛍光が強くかつ半値幅が狭いので系としては高い性能を得やすい。半値幅が狭いことにより、FRET現象と呼ばれているエネルギー移動の際、発光の波長範囲で漏らさず励起エネルギーを相手の色素(アクセプター)に受けさせることができる。量子ドットを抗体の糖鎖に結合する方法を取ることにより、場合によっては生じていたFv領域の化学操作によるアフィニティーの低減を完全に回避することができる点も大きな利点である。
なお、本発明においては、正確な意味でのFRET的エネルギー移動である必要はなく、結果的に優位に判別できるだけの変化を生じるエネルギー移動が起これればよい。
担体粒子に結合する被検出物質認識材料を用いるか用いないかの判断は、被検出物質の性質により決定してよい。
本発明の検出方法においては、被検出物質、被検出物質認識材料、または被検出物質と被検出物質認識材料との結合体を電気泳動または誘電泳動により局所に濃縮する。したがって、被検出物質と被検出物質認識材料との結合体の形成は、濃縮工程の前工程であっても、後工程であってもよく、また、濃縮と結合を同時に行ってもよい。例えば、被検出物質と被検出物質認識材料とを混合する際に、電気泳動または誘電泳動を行えば、濃縮工程と結合工程が同時に行われているといえる。
特に限定されるものではないが、例えば、電気泳動または誘電泳動により局所に濃縮することが可能な被検出物質と被検出物質認識材料との結合体であれば、担体粒子に結合していない被検出物質認識材料を用いることができる。なお、電気泳動または誘電泳動により局所に濃縮することが可能な被検出物質と被検出物質認識材料との結合体であったとしても、被検出物質認識材料を担体粒子に結合させて、より効率的に電気泳動または誘電泳動を行ってもよい。
したがって、本発明の検出方法を行う前に、被検出物質自体、被検出物質認識材料自体、被検出物質と被検出物質認識材料との結合体を電気泳動または誘電泳動により局所に濃縮することが可能か確認することにより、被検出物質認識材料に担体粒子を物理的または化学的に結合させるか決定してよい。
被検出物質自体、被検出物質認識材料自体、被検出物質と被検出物質認識材料との結合体を電気泳動または誘電泳動により局所に濃縮することができない場合に、被検出物質自体、被検出物質認識材料自体、被検出物質と被検出物質認識材料との結合体のいずれかに担体粒子を物理的または化学的に結合させてよい。
担体粒子の選択は、電気泳動または誘電泳動による局所への濃縮効率により決定すればよい。
被検出物質認識材料を担体粒子に物理的または化学的に結合させる方法は、特に限定されず、従来公知の方法や、担体粒子に添付されるマニュアルに沿って結合させてよい。
当該被検出物質認識材料は、蛍光物質や消光物質で標識されていても、いなくてもよいが、標識されていない被検出物質認識材料であってよい。
この場合、例えば、
試料中で特定波長を発する蛍光物質で標識された被検出物質認識材料と、当該特定波長とは異なる波長で蛍光する蛍光物質または当該特定波長の蛍光を吸収する消光物質で標識された被検出物質認識材料とが、被検出物質に同時に結合し、
担体粒子に物理的または化学的に結合している被検出物質認識材料をさらに含み、試料中で被検出物質と当該被検出物質認識材料とが結合体を形成する、
あるいは、
試料中で被検出物質と、特定波長で蛍光を発する蛍光物質で標識された被検出物質認識材料と、当該特定波長とは異なる波長で蛍光する蛍光物質または当該特定波長の蛍光を吸収する消光物質で標識された被検出物質もしくは被検出物質認識材料において被検出物質と同じ部位で認識される被検出物質ではない物質と、担体粒子に物理的または化学的に結合している被検出物質認識材料と、が用いられてもよい。
標識されていないが、担体粒子に物理的または化学的に結合している被検出物質認識材料を用いずに、標識されている被検出物質認識材料が、さらに、担体粒子に物理的または化学的に結合していてもよい。
担体粒子の具体例としては、特に限定されないが、例えば、金属微粒子、金属酸化物微粒子、非金属性微粒子、金属コーティングされた樹脂微粒子および非感染性の球状生物微粒子などが挙げられる。
金属微粒子の具体例としては、金、銀、白金、チタン、パラジウム、鉄およびアルミニウムなどが挙げられる。
金属酸化物微粒子の具体例としては、二酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化マグネシウムおよびITO(インジウム-スズ酸化物)、ATO(アンチモンースズ酸化物)などが挙げられる。
非金属性微粒子の具体例としては、磁性粒体や、黒鉛、ポリスチレン、導電性樹脂からなる微粒子などが挙げられる。
非感染性の球状生物微粒子としては、細菌、卵菌、変形菌または真菌などに属する菌類であってよく、その具体例としては、乳酸球菌および酵母(イースト菌)などが挙げられる。
積水化学工業製のミクロパールやミクロパールAuの商品名で販売されている、導電性金属で表面をメッキした微粒子を用いてもよい。
粒形は、特に限定されないが、例えば、金コロイド微粒子としては30~100nm、好ましくは40~60nm、ポリスチレン微粒子としては100nm~3μm、乳酸球菌やイースト菌としては1~5μmの範囲であること好ましい。
金属コーティングされた樹脂微粒子は、5μm以下の粒径を有する微粒子を好適に用いることができる。
ここで、被検出物質認識材料は担体粒子に結合していてもよい。
結合体の電気泳動または誘電泳動は、従来公知の方法により実施可能である。
本発明においては、誘電泳動が好適に用いられるが、誘電泳動を行って被検出物質と被検出物質認識材料との結合体を濃縮して、所望の被検出物質を検出することが可能となっている。なお、電気泳動により結合体を濃縮する場合にも誘電泳動の場合と同様に、所望の被検出物質を検出することが可能である。
直流で印加する(電気泳動)と、水の電気分解を誘引することがあり、また、同じ原理で電極材料がイオン化して溶解してしまうことが考えられるので、交流で印加する(誘電泳動)ことが好ましい。
交流で印加する場合には、金属電極で数Vまで印加しても電気分解は起こらず、誘電泳動と呼ばれる現象により粒子は電界密度の異なる領域間を移動することが知られている。この時、粒子は表面電荷ではなく、粒子および溶媒の誘電性と導電性と電界の周波数が関係することが知られている(R. Pethig, BIOMICROFLUIDICS, 4, 022811(2010))。
印加する電圧は、特に限定されないが、例えば、0.1~10Vであり、1~5V、1~4V、2~4Vであってもよい。周波数としては、特に限定されないが、例えば、100Hz~200MHzであり、MHzのオーダーであることが好ましく、2MHz前後であってもよい。
本発明においては、正の誘電泳動であってもよく、負の誘電泳動であってもよいが、正の誘電泳動であることが好ましい。
本発明において濃縮しつつ、蛍光強度の変化を測定するとは、B/F分離を行っていないことを意味しており、B/F分離を行わないのであれば、結合体を局所に濃縮した後に、蛍光強度を測定してもよい。
また、本発明においては、
試料中の被検出物質、被検出物質認識材料もしくは被検出物質と被検出物質認識材料との結合体を電気泳動または誘電泳動により局所に濃縮する工程、
場合により、試料中で被検出物質と被検出物質認識材料とを結合する工程、
被検出物質と被検出物質認識材料との結合体の蛍光強度の変化を測定する工程、
を含むが、濃縮と蛍光強度測定が同時であってもよく、濃縮と結合が同時であってもよおく、結合と蛍光強度測定が同時であってもよく、濃縮と結合と蛍光強度測定が同時であってもよい。
なお、本発明においては、設計の自由度を高めるために、濃縮と蛍光強度測定とを分離することを考え、蛍光の強度が変化する系を用いて蛍光変化から検出を行う工程と、これとは独立して電気泳動または誘電泳動により反応系を濃縮してシステム全体の感度を向上させる工程をそれぞれ独立に行うことが、より好ましい態様である。
また、好ましい一実施態様としては、
試料中で被検出物質と、特定波長で蛍光を発する蛍光物質で標識された被検出物質認識材料と、当該特定波長とは異なる波長で蛍光する蛍光物質または当該特定波長の蛍光を吸収する消光物質で標識された被検出物質認識材料と、を混合することにより、被検出物質と被検出物質認識材料とを結合する、
あるいは、
試料中で被検出物質と、特定波長で蛍光を発する蛍光物質で標識された被検出物質認識材料と、当該特定波長とは異なる波長で蛍光する蛍光物質または当該特定波長の蛍光を吸収する消光物質で標識された被検出物質もしくは被検出物質認識材料において被検出物質と同じ部位で認識される被検出物質ではない物質と、を混合することにより、試料中の被検出物質と被検出物質認識材料とを結合する、
あるいは、
試料中で特定波長を発する蛍光物質で標識された被検出物質認識材料と、当該特定波長とは異なる波長で蛍光する蛍光物質または当該特定波長の蛍光を吸収する消光物質で標識された被検出物質認識材料とが、被検出物質に同時に結合し、
担体粒子に物理的または化学的に結合している被検出物質認識材料をさらに含み、試料中で被検出物質と当該被検出物質認識材料とが結合体を形成する。
また、他の好ましい一実施態様としては、
担体粒子に物理的または化学的に結合している被検出物質認識材料を、被検出物質と結合させて、あるいは結合させないで、電気泳動または誘電泳動により局所に濃縮し、場合により、試料中で被検出物質と被検出物質認識材料とを結合して、被検出物質に対して、上記好ましい一実施態様として記載の方法のいずれかにより、蛍光強度の変化を測定する。
蛍光強度を測定する場合の条件も適宜設定可能であるが、励起光が一般的には300~600nmの波長を有するが、350nm以上の波長を有することが好ましく、400nm以上の波長を有することがより好ましい。
蛍光強度の測定においては、フィルター+光センサー(フォトダイオード、フォトトランジスタ)による測定や、光っている状態を画像としてスマホ用の撮像素子で撮影し、あらかじめわかっている電極形状と照合して、画像認識させることにより、光っている部分のみを切り出すことが可能で、これによりコントラストを強調し、より精度の高い検出を行うことも可能である。
結合工程が上記(1)または(2)であり、2種の蛍光物質が用いられる場合には、特定波長で蛍光を発する蛍光物質が波長1で励起して波長2を発する蛍光物質であり、当該特定波長とは異なる波長で蛍光する蛍光物質が波長2を吸収して波長3を発する蛍光物質であり、波長1で励起して波長3の蛍光強度または波長2と波長3の蛍光強度を測定する、
結合工程が上記(1)または(2)であり、消光物質が用いられる場合には、特定波長で蛍光を発する蛍光物質が波長1で励起して波長2を発する蛍光物質であり、当該特定波長の蛍光を吸収する消光物質が波長2を吸収するが少なくとも測定波長域では蛍光を発しない消光物質であり、波長1で励起して波長2の蛍光強度を測定する、
結合工程が上記(3)である場合には、特定波長で蛍光を発する蛍光物質が波長1で励起して波長2を発する蛍光物質であり、波長1で励起して波長2の蛍光強度を測定する。
蛍光強度の変化の測定においては、蛍光の波長の変化や、蛍光の大小の変化を測定することで、被検出物質と被検出物質認識材料との結合体の蛍光強度の変化を測定する工程としてよい。
より具体的には、インフルエンザウイルスを検出する場合に、試料として鼻汁ではなく唾液を用いることが可能となり、また、税関などの水際を検査の現場とすることが可能となり、従来数日の培養を必要としていた食品の加工工場、流通工程などの現場もそのまま検査現場として、目の前で結果を得ることが可能となり得る。あるいは、異常プリオンなど遺伝子を含んでいない病原因子も検査が可能となる。
水性の試料を導入して保持することができる液だめに一対のマイクロ電極を有する検出セルを備え、マイクロ電極は外部または内部の電圧発生装置に電気的に接続され、試料と接触した状態で電極間に直流または交流を印加することにより試料中の被検出物質を電気泳動または誘電泳動により濃縮する手段と、被検出物質に特異的に結合することが可能で、あらかじめ蛍光標識を施した被検出物質認識材料を少なくとも有しており、標識の蛍光強度を測定する検出手段を備えており、水性の試料を移動させて被検出物質と被検出物質認識材料との結合体(B)とフリーの被検出物質認識材料(F)のB/F分離を行うことなく、蛍光強度を評価することにより被検出物質と被検出物質認識材料との結合の状態を定性的または定量的に測定して、試料中の被検出物質の存在を測定することを可能とする検出装置。
検出装置においては、検出手段として、光源63とレンズ65とを備え、光源63からレンズ65を介して蛍光物質を励起する波長を有する励起光64が検出セル61に照射される。加えて、被検出物質の存在を確認するために蛍光強度を測定するための光センサー68と光フィルター67とを備え、検出波長の蛍光66が、あるいは検出波長の蛍光以外の蛍光66が光フィルター67により集光され、光センサー68で蛍光強度を測定する。光フィルター67では、検出波長以外の波長の蛍光がカットされることが好ましい。検出セルは、試料中の被検出物質を電気泳動または誘電泳動により濃縮する手段を備え、基板41にマイクロ電極42が印刷される。一対のマイクロ電極は、電極1 47と電極2 48として示される。検出装置にある液だめは、基板41、スペーサー43、カバー44により形成され、キャピラリー45として示される。カバー44には空気穴46が設けられている。図4においては、試料の導入方向を4Aとして示す。
濃縮手段として、電極1 47および電極2 48に端子69が繋がる。端子69により、例えば、誘電泳動を行う際、ファンクションジェネレーター(図示していない)から最適な電圧、周波数の高周波が印加される。
本発明において、蛍光検出に用いる反応溶液としては、被検出物質と被検出物質認識材料との結合反応、電気泳動または誘電泳動を実施可能である溶液中で行うことが好ましい。例えば、被検出物質を含む試料を当該溶液に混合して、被検出物質を検出してもよい。反応溶液は、例えば、実施例に記載の溶液を好適に用いることができる。望ましくは被検出物質と被検出物質認識材料の反応を阻害しない範囲で、導電率を極力低くする溶媒、例えば、非イオン水、またはこれと糖アルコールの混合物を用いてよい。また、被検出物質と被検出物質認識材料との結合および濃縮が同じ溶媒でできることを考慮して、例えば、リン酸緩衝液を用いてよく、濃度が1mM以下のPBSを用いてよい。
ここで用いられるpH調整用バッファーは、特に限定されず、検出することを予定する被検出物質や、被検出物質と被検出物質認識材料との結合反応を考慮して適宜選択すればよい。
界面活性剤は、例えば、ウイルスを分解して内部の核タンパク質を抽出するために用いられ、また、試料を毛細管現象によりセル内に導くために用いられる。界面活性剤は1種を用いてもよく、必要とする作用に応じて、2種以上を用いてもよい。例えば、インフルエンザウイルスから核タンパク質を抽出するのには、TritonX-100を好適に用いることができる。
本発明においては、試料の有無で測定を行って校正してもよく、標準溶液を用いた検出を行ってもよく、ロットごとに標準のリファレンス値を用いて検出を行ってもよく、品質管理を徹底することで、リファレンス値を使わないで検出を行ってもよい。
抗体の標識
インフルエンザA型ウイルスの核タンパク質に結合する抗体としてFIA3298(Bio Matrix研究所)を用いた。Qdot Antibody Conjugation Kit(Bio Matrix研究所)の方法にしたがって、抗体のFc領域の糖鎖に量子ドット(Qdot565、Thermo Fisher)を化学標識した。量子ドットを化学標識した抗体Ab1Qd565の蛍光分光光度計(F2500、日立ハイテック)を用いて測定した蛍光スペクトルは、561nmに蛍光のピークを有していた(図1)。
例示として、量子ドットを標識した抗体は以下の式で表される。
遺伝子組み換えによって作成したインフルエンザA(H1N1)核タンパク質(NP)としてAAM75159.1(Sino Biological)を用いた。また、消光物質として、QSY9のNHSエステル(Thermo Fisher)を用いた。
QSY9のNHSエステルは以下の式で表される。
図1と図2の比較から、量子ドットを化学標識した抗体Ab1Qd565における蛍光ピークと、消光物質を標識した核タンパク質NPQSY9における消光物質の吸収ピークはほぼ理想的に重なっていた。
Ab1Qd565をPBSで10nMの濃度に希釈した。希釈液200μLをマイクロセルを用いて、蛍光分光光度計(F2500、日立製作所)で蛍光スペクトルを測定した。この溶液にタンパク濃度として10μMに調整したNPQSY9を、2μLずつ混合して561nmの蛍光強度の変化を観察した(図3)。
図3の結果から、NPQSY9とAb1Qd565が溶液中で結合することにより、561nmをピークとする蛍光が消光されていることが確認された。
粒径3μmのポリスチレン微粒子水分散液(Polysciences)を非イオン水で10万倍に希釈した。導電率計(EC-33、堀場製作所)を用いて導電率を測定したところ、13μS/cmであった。
続いて、以下の条件で、このポリスチレン微粒子の誘電泳動を観察した。
セル:BAS製くし形マイクロ電極(Au、電極間距離5μm)をベースとし、マイクロ電極部に12μmのスペーサーを介して、カバーガラスを装着したもの
高周波発生装置:テクトロニクス製AFG3022ファンクションジェネレーター
オシロスコープ:ヒューレットパッカード製54602B
顕微鏡:テクトロニクス製VHX900に1000倍のレンズ搭載
上記のように調整したポリスチレン微粒子の希釈液約10μLをマイクロ電極の上にのせ、顕微鏡で観察しながら、電圧および周波数を掃引した。2V/1kHzの条件で、ポリスチレン微粒子が電極の輪郭に沿って並ぶことが確認された。
すなわち、ポリスチレン微粒子における正の誘電泳動が観察された。凝集して定常状態に達するのに必要な時間は約1~2秒であった。また、同様に、酵母を用いた場合も同様に正の誘電泳動が観察され、酵母が電極に沿って濃縮された。
ラテックス粒子メーカーの指定の方法で、ポリスチレン微粒子表面にAb1Qd565を担持した。その後、不要な非特異吸着を防止するためにBSAでブロッキング処理を行った。これに、抗体/NPの分子数が同等になるようNPQSY9を混合し、あらかじめ消光を起こした状態とした。
蛍光顕微鏡としてライカマイクロシステムズ製DFC360FXを用い、光源ebq100による観察下で、上記セルを用いて誘電泳動を行いAb1Qd565由来の蛍光が、2V/1kHzで電極の輪郭に沿って集まることを確認した。上記と同条件のAb1Qd565担持ポリチレン微粒子とNPQSY9の混合液に、未標識のNP(上記と同一品)をNPQSY9とタンパク濃度で同等量混合し、5分インキュベートした。これを蛍光顕微鏡で観察しつつ、2V/1kHzで電極の輪郭に沿って並んだことを確認した。
未標識のNP有/無について、誘電泳動時の蛍光顕微鏡画像を接続しているコンピュータで静止画として電子的に保管した。両者を比較すると、NP有の場合が蛍光の強度が高いことを確認した。これらの電子画像はAdobeのPhotoshopで読み込み、マイクロ電極付近の画像を切り取り、バックグラウンドノイズを消すこと、またコントラストを強調することにより両社の違いをより鮮明にできることを確認した。
また、不活化ウイルス(81N73、Hy Test)をTritonX-100(1%)を含む展開液を用いてイムノクロマト(抗NP抗体としてFIA2121およびFIA3298、いずれもSino Biological製)に流すと展開中にウイルスが破壊され、NPが現れて両者の抗体でサンドイッチ反応を起こし、その結果イムノクロマトで検出できることを確認した。
以上を総合的に判断すると、本実施例により、誘電泳動と蛍光観察を融合させることができ、高感度、高速度での検出の可能性を示せたと考えられる。
抗体の標識
BSA(シグマ)に結合する抗体として抗BSAマウスモノクローナル抗体(フナコシ)を用いた。SiteClickTM QdotTM 655 Antibody Labeling Kit(Invitrogen)に内包されている抗体濃縮機を用いて抗体を100μL(1mg/mL)に濃縮した。キットの方法にしたがって、抗体のFc領域の糖鎖に選択的に量子ドット(Qdot655、Thermo Fisher)を化学標識した。キットに内包されているゲルろ過装置を用いて、量子ドットを化学標識した抗体Ab1Qd655を精製した。Ab1Qd655の蛍光分光光度計(F7100、日立ハイテック)を用いて測定したPBS溶液の蛍光スペクトル(励起光370nm)は、図6のとおりのピークを有していた。なお、720nmにわずかに見えるピークは、励起光の2倍波長が散乱したものである。
消光物質として、QSY21コハク酸エステル(QSY21NHS、Thermo Fisher)を用いた。
QSY21NHSは以下の式で表される。QSY21は650nm付近に大きな吸収を持つが、少なくとも可視光領域には蛍光を発しない消光物質であることが知られている
Ab1Qd655をPBSで10-8Mの濃度に希釈した。希釈液を蛍光マイクロセル(励起側光路長10mm、蛍光側光路2mm、Hellma)を用いて、蛍光分光光度計(F-7100、日立ハイテクサイエンス)で370nmの励起光を照射し、350nmから800nmまでの蛍光スペクトルを測定した。以下、消光確認実験での蛍光スペクトルの波長範囲は全て同一とした。
10-8M のAb1Qd655に1.0E-6MのBSAQSY21を最終濃度10-8Mとなるように加え、ボルテックスにより5秒間撹拌した。撹拌後、素早く蛍光マイクロセルに入れ、蛍光分光光度計で蛍光スペクトルを測定した。
その後30分までは5分置きに蛍光スペクトルを測定し、30分以降150分までの間は10分置きに蛍光スペクトルを測定した。結果を図8に示す。
測定開始後瞬時に20%の消光が起き、その後速度は遅いながらも最終的に72%の蛍光の減少が確認できた。すなわち、抗原抗体反応に基づく分子間エネルギー移動(FRET)による蛍光の減少が確認できた。
消光確認実験の反応液に10-5M無標識BSAを最終濃度10-7Mになるよう添加した。添加後は素早くピペッティングで撹拌を行い、消光確認実験と同様に、蛍光分光光度計(F-7100、日立ハイテック)で370nmの励起光を照射し、350nmから800nmまでの蛍光スペクトルを測定した。以下、阻害確認実験での蛍光スペクトルの波長範囲は全て同一とした。
その後3分後の蛍光スペクトルを測定し、それ以降は5分置きに12回蛍光スペクトルを測定した。結果を図9に示す。
72%消光した蛍光が無標識BSAを加えたことで、そこから37%増加した。Ab1Qd655とBSAQSY21が抗原抗体反応で結合し、消光している状態から非標識のBSAが置き換わり、Ab1Qd655の蛍光が増強したことを確認した。蛍光の増強を観察することにより、B/F分離を用いることなくBSAが検出できることが確認された。それぞれの段階の蛍光スペクトルを比較として並べたものを図10に示す。なお、Qd655で修飾した場合はAb1Qd655の溶液が4℃、数日間の保存中に凝集して沈降しやすい性質を持っている。この現象は、例えばアルギニン(10mM-500mM、好ましくは50mM-200mM)で凝集が抑制される。
図11にBAS製微小くし形電極を用いた誘電泳動セルを示す。図11中、111はマイクロ電極であり、電極長さ2mmの対向、電極幅および電極間5μmの金電極が基板112の上に印刷されており、それぞれの電極は端子113および113’と電気的に接続している。この上部に130μmのスペーサー115を介してカバーガラス114を張り付け、スペース(試料部)とした。高周波の発生は、テクトロニクスAFG3022を用いた。AFG3022の出力端子の一方に直流の防止用に0.001μFのコンデンサを介して端子113に接続した。端子113および113’に並列にオシロスコープ(ヒューレットパッカード 54602B)を接続し、波形をモニターした。
非イオン水にイースト菌を分散させた試料を誘電泳動セルの試料部に導入し、デジタル顕微鏡(VHX900、1000倍、キーエンス)で画像を録画しながら端子3および3’間に2MHz、2Vを印加したところ、分散していたイースト菌が瞬時に電極の端面に整列することが観察できた。同様のことが周波数5MHz、1MHz、300kHz、100kHzでも観察できた。
関連の粒子として以下いずれも粒径2μmのITO(スズ酸化インジウム)、ATO(アンチモン酸化スズ)および積水化学製ポリビーズ(ポリスチレン粒子の表面に金メッキしたもの)のA型(MB-A)およびB型(MB-B)で行うと誘電泳動は観察されなかったが、これらを0.1%BSAのPBS溶液に浸漬し8時間後5000gで20分遠心して上澄みを捨てることを2度行って、表面をBSAコーティングしたところ、ITO、ATO、MB-A、MB-Bのいずれも、1mMPBS中で2MHz5Vで瞬時に整列した。言い換えれば、電極端に濃縮された。
グラファイト微粒子(伊藤黒鉛工業)はBSAコーティングの有無にかかわらず、1mMPBSで2MHz、5MHz、300kHzで非常に速い誘電泳動が観察できた。PBSを10mMの濃度にしても若干の速度低下は認められたが誘電泳動を確認した。なお、上記の誘電泳動とはいずれも電極端(より正確には印刷している電極の角)のところに集る、正の誘電泳動であった。参考までに堀場製作所製の導電率計(Laqua Twin EC-33)を用いて、各種濃度のPBSの導電率を測定したところ、10mM:13,000μS/cm、2mM:3,360μS/cm、1mM:2,110μS/cm、唾液は、参考文献(Yen-Pei Lu et. al, Scientific Reports | (2019) 9:14771)によれば2,000-8,000μS/cmと記載されており、実検体を用いた実測値は5,780μS/cmであった。
測定部の基本的な構成を図11に示す。検出セル121は光路長10mmの4面透明蛍光測定用セル、カラーフィルター123(シャープカットフィルターY50、HOYA)は500nmより短波長の光線を完全に遮断する。LED122はOSV2YL5111A(Opto Supply製)で370nmの光を発する。励起波長は370nm付近を用いた。センサー124はS7183(浜松ホトニクス)で650nm付近の光に感度の中心を持つ。
ADコンバータはArduinoUnoを使用し、ArduinoIDEでプログラムを作成した。また、PCとArduinoはUSB接続し、PC上のプログラムはProcessingで作成した。
以下動作のステップを示す。
・検出セルにはあらかじめBSA以外のタンパク質を用いて表面をブロッキングし、非特異吸着しないよう処理する。
・Ab1Qd655とBSAQSY21の PBS溶液(それぞれ10-8M)を混合し、24時間室温にてインキュベートする。
・得られた混合液を検出セルに入れ、PC上のアプリケーションを立ち上げる。
・PC上のソフトから指示が送られADコンバータがセンサーの出力電圧を測定し、AD変換を行い、USBインタフェースを介してPCに信号を送る。これを0.5秒ごとに合計5回行い平均値を初期値として保存する。
・PCのモニターに「準備完了」を意味する文言を表示する。
・試験者は検体を検出セルに添加する(この時、体積変化は無視できる範囲とする)
・検出セルに接触した振動子(図示していない)が振動して液を3分間撹拌する。
・センサーの信号を読み取りPCに送るこれを5回繰り返し、PCは平均値を出しこれを測定値として保存する。
・振動子の撹拌を停止する。
・PCは初期値と測定値を比較し、あらかじめ定めた閾値(例えば5%)以上の蛍光強度上昇があれば「陽性」と判定を表示する。この時参考値として、上昇のパーセンテージを表示する、さらに「陽性」、「陰性」の2段階に加え、5-10段階で準定量値を表示してもよい。
試料を混合するだけでラテラルフロー方式のような展開工程や、ELISAのような洗浄工程、そのほかのB/F分離を行うことなく、均一溶液のままで対象物を定性的あるいは定量的に検出することが可能である。
一つの抗原に2種類の抗体(Ab2、Ab3)が同時に結合するいわゆるサンドイッチ型の抗原抗体反応において、Ab2とAb3を異なる蛍光色素(F2、F3)で標識し、F3はF2の発する蛍光(波長λF2)によって励起され波長λF3を発するが、F2の励起光(波長λE2)ではF3は励起されないという条件において、λE2で励起して、波長λF3の蛍光強度を検出することにより、サンドイッチ反応の進行をモニターすることが可能となる。
以下、インフルエンザA型ウイルスの核タンパク質(NP)を対象として、2種の抗体を調製した例について記載する。
同時にNPにサンドイッチ反応してAb2・NP・Ab3の抗体抗原結合体を形成する抗体として、抗体FIA2121およびFIA3298(いずれもバイオマトリックス研究所製の抗NPマウスモノクローナル抗体)を用いた。
抗体FIA2121をAb2としてPBS溶液(1mg/mL)10μLを出発点としATTO390NHSエステル(ATTO-Tec)が開示しているプロトコルにしたがって標識反応を行った。反応液はナノセップ分画分子量30kを用いて精製した。吸収スペクトルから算出した抗体1分子当たりの色素結合数は23であった。得られた標識抗体(Ab2AT390)の吸収スペクトル(破線)および390nm励起時の蛍光スペクトル(実線)を図13に示す。
抗体FIA3298をAb3としてPBS溶液(2mg/mL)100μLを調整し、1MのNaHCO3水溶液20μL添加し、直ちに色素DY485XLNHSエステル(Dyomic)のDMSO溶液(2mM)を25μL(抗体の37.5倍の分子数)添加しよく撹拌した。5分後、ナノセップ分画分子量30k(日本ジェネティックス)を用いて反応液を精製した。吸収スペクトルから算出した抗体1分子当たりの色素結合数は37であった。得られた標識抗体(Ab3DY485)の吸収スペクトル(破線)および470nm励起時の蛍光スペクトル(実線)を図14に示す。
図13および14の結果から、2種類の標識抗体を含有する反応液を390nmで照射すると、Ab2AT390のみが励起されて470nm付近に蛍光を発するが、Ab2AT390とAb3DY485の分子は十分に距離が離れているのでAb3DY485は励起されることはないことが理解できる。また、溶液中にNPがあると、NPを介してAb2AT390とAb3DY485の分子は、推定5-10nmの近距離でNPに結合するため、FRETによるエネルギー移動が起こり、すなわちAb2AT390が発する470nm付近の蛍光に相当する励起エネルギーが移動してAb3DY485が励起され、560nmの蛍光を発する。つまり、390nmで反応液を励起して、560nmの蛍光を観察することによりNPの存在を判定することができる。
実施例1~3の結果から、以下の実施形態により本発明の実施が可能となる。なお、以下に示す実施形態は、例示として示すものであって、本発明の範囲を限定するものでなく、種々変法により本発明を実施可能である。
インフルエンザA型ウイルスの核タンパク質(NP)のうち、異なる3箇所をエピトープとするモノクローナル抗体mAb11、mAb12、mAb13を用いる。
あらかじめmAb11の10μg/mL溶液1mLに平均粒径2μLのITOを0.2mg/mLの濃度で分散させる。十分に撹拌しながら2hインキュベートし、5000g/5分の遠心にかけ、上清を捨てる。沈殿物を1mg/mLのBSA溶液(0.05%のアジ化ナトリウムおよび1%のTritonX-100含有)に分散し試薬11とする。
一方、mAb12とmAb13はそれぞれATTO390とDY485XLで標識して、標識抗体Ab12AT390およびAb13DY485を得る。Ab12AT390、Ab13DY485を10-7M含む1mMPBS(0.05%アジ化ナトリウム含有)を調製し、試薬12とする。
検体として、インフルエンザA型不活化ウイルスを含有する唾液100μLを、400μLの試薬11と混合し5分間放置する。この時、ウイルスのエンベロープがTritonX-100によって破壊され、NPが放出される(社内で作製したイムノクロマトグラフィーによる評価で確認済み)。放出されたNPはITOの表面に吸着したmAb11に結合する。その後、500μLの試薬12と混合する。この時点で、唾液は10倍に希釈されており、導電率は誘電泳動が十分に起き得る1000μS/cm以下に低下している。
マイクロ電極を底面に備えた検出セルに導入する。以下の工程で検出を行う。
1)マイクロ電極に2MHz,5Vの交流電圧を印加する。
2)マイクロ電極付近を390nmの光源で照射し、560nm付近の蛍光強度を観察する。
3)蛍光観察は連続して10回行いこの平均値をPCに送る
4)これを5秒ごとに合計2分間行い、蛍光強度の増加の傾向から最終強度を算出する。
5)最終強度に基づき、定量的データとともに陰性/陽性の判定を行う。
本実施形態1では、検体由来のNPをITOにmAb11を介して結合させることにより、誘電泳動でマイクロ電極付近に局所的にNP濃度を高めている。電極面(XY面)での濃縮は100倍程度が見込まれるが、深さ方向(Z軸)は、振動子を利用してセルの深さ方向に効率的に対流を行うことにより、強制的に電極面に接触する頻度をあげることができ、総和として1000倍以上の検体の濃縮を行うことが可能となる。
実施形態1においては、例えば蛍光色素は分子吸光係数が高くかつ量子収率が高い色素であって、かつ効率よくFRET現象を起こす色素の組み合わせであれば応用可能である。反応はわかりやすくするために異なる試薬として調製しているが、試薬11と12はあらかじめ混合されていても差し支えない、さらには試薬11、12を検出セルに付着させて凍結乾燥したものを準備すれば、検査の際の工程がさらに削減されることは自明である。なお、実施形態2~3においても同様に適宜選択して応用可能である。
インフルエンザA型ウイルスの核タンパク質(NP)のうち、異なる2箇所をエピトープとするモノクローナル抗体mAb21、mAb22を用いる。また、mAb22に結合するNPの断片(NP断片)を用いる。
NPは遺伝子組換えによる合成が可能なので、まずNPの断片を決めてからNP断片を免疫源として抗体作製を行うことによりmAb21、mAb22を調製してよい。得られた抗体がNPを認識することを確認する。その際、mAb22とNP断片の反応速度定数(ka:結合速度定数、kd:解離速度定数)は例えば、表面プラズモン共鳴法で決定できるので、のぞましくはka>106、kd<10-3の抗体をスクリーニングで拾い上げると高速な測定速度が得られる。
mAb21はITO表面に吸着し、ITOはその後BSAでブロッキングして、1%のTritonX100を含有する試薬21を調製する。
一方、mAb22はQd655で、またNP断片はQSY21で標識して、標識抗体Qd655Ab22、抗原の標識断片QSY21NP断片をいずれも10-8Mの濃度で含む1mMPBS溶液(0.05%アジ化ナトリウム含有)を試薬22として調製する。以下の工程で検査を行う。
1)検体(インフルエンザA型ウイルスを含有する唾液)100μLを400μLの試薬21と混合し5分間放置する。
2)得られた混合液を500μLの試薬22と混合する。
3)直ちに、マイクロ電極を底面に備えた検出セルに上記混合液を導入する。
4)振動子による撹拌を開始するとともに、370nm以下の波長でマイクロ電極付近を照射し、マイクロ電極付近から発する蛍光を500nm以下の波長をカットするカラーフィルターを介して、センサーで測定する。
5)最初の測定値を初期値として保存し、その後の蛍光強度の変化を測定するとともにその変化の傾向から最終測定値を算出する。
6)あらかじめ、Qd655Ab22とASY21NPが結合して一定の消光が起きている状態から、電極付近に存在するNPとQd655Ab22が結合して、消光の阻害(すなわち蛍光の増強)からNPの有無、および感染の陽性/陰性を判定する。
A型インフルエンザウイルスの表面抗原に同時に結合するAb31、Ab32を用いる。Ab31、Ab32をそれぞれATTO390とDY485XLで標識する(以降Ab31AT390とAb32DY485とする)これらを10-7M以上含有する1mMのPBS(0.05%のアジ化ナトリウム含有)を調製する(試薬31)。以下の工程で検査を行う。
1)検体(インフルエンザA型ウイルスを含有する唾液)100μLを900μLの試薬31と混合し、底面にマイクロ電極を配した検出セルに導入する。
2)ただちにマイクロ電極に1kHz-5MHz望ましくは100kHz、5Vの高周波を印加するとともに、振動子による撹拌を開始する。
3)電極付近を390nmで励起し、560nm付近の蛍光強度を測定する。
4)蛍光強度の時間変化から、最終測定値を算出する。
5)最終測定値から、ウイルスの濃度、および感染の状態を判定する。
本実施形態3では、ウイルスそのものを誘電泳動によって電極付近に濃縮しているので、NPの抽出に必要な界面活性剤およびインキュベートの時間は不要である。
底面に電極幅および電極間隔5μm電極長さ5mmの櫛形が向かい合った形状のマイクロ電極を備えた検出セル151を用い、LED光源153およびセンサー155はマイクロ電極に向けて傾けた検出装置を構成する(図15)。センサー155が出力するアナログ信号の処理を行う。
BSAQSY21を10-6M含有するPBS溶液に、粒径2μmのITOを0.11mg/mLで分散させ一晩室温で放置し後、5000g, 20分で遠心分離したのち上清を捨て、次は1mg/mLの濃度のスキムミルクに分散し、ブロッキングを行なったのち遠心分離し上清を捨て,沈殿物を回収する、遠心分離による損失を30%と概算して、BSAQSY21が最終濃度10-8MになるようにAb1Qd655(最終濃度10-8M)とのPBS分散溶液を調製し、一晩室温で放置し、以下のステップでBSAの測定を行なう。
・得られた混合分散溶液を検出セルに入れ、PC上のアプリケーションを立ち上げる。
・PC上のソフトから指示が送られLEDが370nmを照射すると同時に、ADコンバータがセンサーの出力電圧を測定し、AD変換を行い、USBインタフェースを介してPCにデジタル信号を送る。これを0.5秒ごとに合計5回行い平均値を初期値として保存する。
・PCのモニターに「準備完了」を意味する文言を表示する。
・試験者は検体を検出セルに添加する(この時、体積変化は無視できる範囲とする)
・検出セルに接触した振動子(図示していない)が振動して液を3分間撹拌する。同時にマイクロ電極間に5V, 2MHzの高周波を印加する。
・センサーの信号を読み取りPCに送るこれを5回繰り返し、PCは平均値を出しこれを測定値として保存する。
・振動子の撹拌と、高周波の印加を停止する。
・PCは初期値と測定値を比較し、あらかじめ定めた閾値(例えば5%)以上の蛍光強度上昇があれば「陽性」として判定を表示する。この時参考値として、上昇のパーセンテージを表示する、さらに「陽性」、「陰性」の2段階に加え、5-10段階で擬似定量値を表示してもよい。
本実施形態4は、検出物ではなく、あらかじめ用意した検出物と同等のもの(擬似抗原)を担体表面に吸着させ、誘電泳動で電極付近に擬似抗原を濃縮したものである。同様に、標識抗体を担体表面に結合させ、誘電泳動で濃縮することも可能である。抗原抗体反応における、抗原抗体結合物の濃度は遊離の抗体濃度、遊離の抗原濃度、抗体のアフィニティーに比例するので今回のように擬似抗原と抗原が競争する場合には、抗体、擬似抗原、検出物質のいずれを担体に吸着させ誘電泳動で濃縮しても一定の効果がある。検体中の被検出物質を濃縮することにより、同じアフィニティーの抗体を用いてもシステムとしての感度を向上させることが最も効率的に行われるため望ましい。
検体として、唾液を100μL採取する。採取方法は任意であるが、ある程度の定量性を持たせながらかつ専用の器具を使用しないためには、綿棒状のスワブ164が有効である(図16)。マイクロ電極165が設けられた検査容器161に反応溶液が162のところまであらかじめ入っている状態で、スワブ164を絞り板163のくぼみに引っ掛けて絞ることにより、反応溶液に検体が混合される。
反応液は1mMのPBSに1%のTritonX-100を溶解したものにあらかじめインフルエンザA型RNAの一部の異なる位置の塩基配列にそれぞれ相補的なRNA1,2が被検出物質認識材料として混入されている。村上章ほか、化学と生物Vol.41, No.8, 2003を参考に、RNA1はピレン修飾2'-O-メチル型オリゴRNAとしたものとする。また、RNA2は粒径2μmの黒鉛に、物理的に吸着されたのちその上から0.1%BSAでブロッキング処理を加えられている。以上の反応液は、検出器に装着されると、以下の工程が行われる。
1)PCより送られた制御信号に従い、検査容器に接触した振動子が起動し、対流による撹拌が開始される。
2)常温で30秒撹拌することにより、検体に被検出物質であるインフルエンザA型ウイルスが含まれていた場合は、TritonX-100の作用によりウイルスのエンベロープが破壊され、単鎖RNAが反応液に露出し、このRNAに被検出物質認識材料としてのRNA1およびRNA2が結合する(RNA結合物)。
3)PCより送られた信号によって、検出容器の底面に配置されたマイクロ電極に2MHz、5Vの高周波が印加される。これにより、マイクロ電極に沿って、底面のXY方向にRNA結合物が濃縮される。さらに対流的撹拌により、反応液が満遍なくマイクロ電極に接触することによりZ方向の濃縮が行われる。
4)マイクロ電極付近に275nmの光をLED(スタンレー電気、MNU1109EAE-275)が照射する。
5)カラーフィルターで350nm以下の波長の光をカットし、カラーフィルターを通過してくる380nmの蛍光を光センサー(日置電機 9743)で検出し、AD変換ののちデジタル信号をPCに送る。
6)PCでは光センサーの出力変動を3分間に渡って記録し、あらかじめネガティブコントロール(導電率8000μS/cmに調整したバッファー)で検出した値との差を評価し、インフルエンザウイルスの有無の判定結果あるいは準定量データを表示する。
誘電泳動を確実なものにするために担体を使用したが、反応溶液の伝導率が十分小さく、印加電圧の上昇や検出速度の低下が許されるなら、担体を用いずに直接RNAを誘電泳動で濃縮すれば系はさらに簡単になる。
42 マイクロ電極
43 スペーサー
44 カバー
45 キャピラリー
46 空気穴
47 電極1
48 電極2
4A 試料の導入方向
4B マイクロ電極拡大図
61 検出セル
62 振動子
63 光源
64 励起光
65 レンズ
66 蛍光
67 光フィルター
68 光センサー
69 端子
111 マイクロ電極
112 基板
113, 113’ 端子
114 カバーガラス
115 スペーサー
121 検出セル
122 LED
123 カラーフィルター
124 センサー
151 検出セル
152 マイクロ電極
153 LED
154 カラーフィルター
155 センサー
156 高周波
161 検査容器
162 反応溶液
163 絞り板
164 スワブ
165 マイクロ電極
Claims (16)
- 試料中の被検出物質を検出する方法であって、
試料中の被検出物質、被検出物質認識材料または被検出物質と被検出物質認識材料との結合体を電気泳動または誘電泳動により局所に濃縮する工程と、
試料中で被検出物質と、特定波長で蛍光を発する蛍光物質で標識された被検出物質認識材料と、当該特定波長とは異なる波長で蛍光を発する蛍光物質で標識された被検出物質認識材料と、を混合する工程と、
被検出物質と被検出物質認識材料との結合体の蛍光強度の変化を測定する工程と、
測定された蛍光強度により試料中の被検出物質の存在を確認する工程と、
を含み、
前記被検出物質認識材料は、特異的に被検出物質を認識して結合し、
前記蛍光強度の変化を測定する工程は、特定波長で蛍光を発する蛍光物質が波長1の光で励起されて波長2の蛍光を発する蛍光物質であり、当該特定波長とは異なる波長で蛍光を発する蛍光物質が波長2の光を吸収して波長3の蛍光を発する蛍光物質であり、波長1の光で励起して波長3の蛍光強度を測定することを含む、方法。 - 試料中の被検出物質を検出する方法であって、
試料中の被検出物質、被検出物質認識材料または被検出物質と被検出物質認識材料との結合体を電気泳動または誘電泳動により局所に濃縮する工程と、
試料中で被検出物質と、特定波長で蛍光を発する蛍光物質で標識された被検出物質認識材料と、当該特定波長の蛍光を吸収する消光物質で標識された被検出物質認識材料と、を混合する工程と、
被検出物質と被検出物質認識材料との結合体の蛍光強度の変化を測定する工程と、
測定された蛍光強度により試料中の被検出物質の存在を確認する工程と、
を含み、
前記被検出物質認識材料は、特異的に被検出物質を認識して結合し、
前記蛍光強度の変化を測定する工程は、特定波長で蛍光を発する蛍光物質が波長1の光で励起されて波長2の蛍光を発する蛍光物質であり、当該特定波長の蛍光を吸収する消光物質が波長2の光を吸収する消光物質であり、波長1の光で励起して波長2の蛍光強度を測定することを含む、方法。 - 試料中の被検出物質を検出する方法であって、
試料中の被検出物質、被検出物質認識材料または被検出物質と被検出物質認識材料との結合体を電気泳動または誘電泳動により局所に濃縮する工程と、
試料中で被検出物質と、特定波長で蛍光を発する蛍光物質で標識された被検出物質認識材料と、当該特定波長とは異なる波長で蛍光を発する蛍光物質で標識され、被検出物質認識材料で認識される物質と、を混合する工程と、
被検出物質と被検出物質認識材料との結合体の蛍光強度の変化を測定する工程と、
測定された蛍光強度により試料中の被検出物質の存在を確認する工程と、
を含み、
前記被検出物質認識材料は、特異的に被検出物質を認識して結合し、
前記蛍光強度の変化を測定する工程は、特定波長で蛍光を発する蛍光物質が波長1の光で励起されて波長2の蛍光を発する蛍光物質であり、当該特定波長とは異なる波長で蛍光を発する蛍光物質が波長2の光を吸収して波長3の蛍光を発する蛍光物質であり、波長1の光で励起して波長3の蛍光強度を測定することを含む、方法。 - 試料中の被検出物質を検出する方法であって、
試料中の被検出物質、被検出物質認識材料または被検出物質と被検出物質認識材料との結合体を電気泳動または誘電泳動により局所に濃縮する工程と、
試料中で被検出物質と、特定波長で蛍光を発する蛍光物質で標識された被検出物質認識材料と、当該特定波長の蛍光を吸収する消光物質で標識され、被検出物質認識材料で認識される物質と、を混合する工程と、
被検出物質と被検出物質認識材料との結合体の蛍光強度の変化を測定する工程と、
測定された蛍光強度により試料中の被検出物質の存在を確認する工程と、
を含み、
前記被検出物質認識材料は、特異的に被検出物質を認識して結合し、
前記蛍光強度の変化を測定する工程は、特定波長で蛍光を発する蛍光物質が波長1の光で励起されて波長2の蛍光を発する蛍光物質であり、当該特定波長の蛍光を吸収する消光物質が波長2の光を吸収する消光物質であり、波長1の光で励起して波長2の蛍光強度を測定することを含む、方法。 - 試料中で特定波長の蛍光を発する蛍光物質で標識された被検出物質認識材料と、当該特定波長とは異なる波長で蛍光を発する蛍光物質または当該特定波長の蛍光を吸収する消光物質で標識された被検出物質認識材料とが、被検出物質に同時に結合する、請求項1または2に記載の方法。
- 被検出物質認識材料および被検出物質からなる群から選択されるいずれかが担体粒子に物理的または化学的に結合している、請求項1、2または5に記載の方法。
- 被検出物質認識材料、被検出物質および被検出物質認識材料で認識される物質からなる群から選択されるいずれかが担体粒子に物理的または化学的に結合している、請求項3または4に記載の方法。
- 試料中で特定波長の蛍光を発する蛍光物質で標識された被検出物質認識材料と、当該特定波長とは異なる波長で蛍光を発する蛍光物質または当該特定波長の蛍光を吸収する消光物質で標識された被検出物質認識材料とが、被検出物質に同時に結合し、
担体粒子に物理的または化学的に結合している被検出物質認識材料をさらに含み、試料中で被検出物質と当該担体粒子に物理的または化学的に結合している被検出物質認識材料とが結合体を形成する、請求項1または2に記載の方法。 - 担体粒子が、金属微粒子、金属酸化物微粒子、非金属性微粒子、金属コーティングされた樹脂微粒子または非感染性の球状生物微粒子である、請求項6から8のいずれか一項に記載の方法。
- 正の誘電泳動により局所に濃縮する、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 被検出物質認識材料が、抗体または抗体断片である、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 被検出物質が、細菌、ウイルス、核酸、タンパク質またはペプチドである、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 被検出物質がインフルエンザウイルス由来物質である、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 蛍光物質の少なくとも1つが量子ドットである、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- 被検出物質が核酸であり、被検出物質認識材料が被検出物質の核酸の少なくとも一部に対して相補的な核酸である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 被検出物質が単鎖のRNAである、請求項15に記載の方法。
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---|---|---|---|---|
JP2001165906A (ja) | 1999-09-30 | 2001-06-22 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 誘電泳動力を用いた物質の分離方法 |
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---|---|---|---|---|
JPH0750113B2 (ja) * | 1988-12-02 | 1995-05-31 | 日本電信電話株式会社 | レーザ磁気免疫測定法 |
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JP2005304376A (ja) * | 2004-04-21 | 2005-11-04 | Kri Inc | 生体検出方法および生体検出装置 |
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JP2010185703A (ja) * | 2009-02-10 | 2010-08-26 | Nec Corp | 試料解析方法 |
US20180231555A1 (en) * | 2015-08-11 | 2018-08-16 | Apocell, Inc. | Systems and methods for isolating target particles and their use in diagnostic, prognostic, and therapeutic methods |
US20180275121A1 (en) * | 2015-10-02 | 2018-09-27 | Tgr Biosciences Pty Ltd. | Analyte Detection with Multiple Substrates |
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JP2002174636A (ja) | 2000-12-08 | 2002-06-21 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 微生物数・微生物濃度測定装置および微生物数・微生物濃度測定方法 |
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