JP7479821B2 - 分析方法及び光学的分析装置 - Google Patents
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Description
本発明の実施形態は、分析方法及び光学的分析装置に関する。
インフルエンザウイルスなどの病原体を迅速に検出する方法として、光導波路上で行われる抗原抗体反応を利用した簡易的な検査キットが用いられている。このような方法は、生体から得られた検体を抗体と接触させるという簡便な手順により、迅速に陽性陰性の判定を行うことが可能である。そのため、臨床現場で好適に用いられている。
一方で、病原体を定量する方法として、培養法やリアルタイムＰＣＲ法が用いられている。この方法は、病原体を高感度に検出することができ、尚且つ病原体の定量も行うことが可能である。
しかしながら、抗原抗体反応を用いた方法は、病原体が存在するか（陽性）、存在しないか（陰性）を判定できるだけであり、検体中の病原体の定量を行うことは難しい。一方、培養法やリアルタイムＰＣＲ法は病原体の定量を行うことができるが、操作が煩雑なうえ、一回の測定に数時間かかり、迅速性が求められる場合には適さない。
本発明は、迅速かつ正確に病原体の定量を行うことができる分析方法及び光学的分析装置を提供することを目的とする。
実施形態に従う分析方法は、検体中の標的を定量するための分析方法である。本方法は、標的を特異的に捕捉する第１の捕捉体が表面に固定された光導波路の表面に検体を滴下し、標的と第１の捕捉体との結合による光の減衰率を測定する測定工程、及び標的の定量値と光の減衰率との関係性を示す検量線を用いて、測定工程で得られた減衰率から、検体中の標的を定量する定量工程を含む。
以下、実施形態の分析方法及び光学的分析装置について説明する。
・分析方法
実施形態の分析方法は、検体中の標的を定量するための方法である。分析方法は、図１に示すように、（Ｓ１）標的を特異的に捕捉する第１の捕捉体が表面に固定された光導波路の表面に検体を滴下し、標的と第１の捕捉体との結合による光の減衰率を測定する測定工程、及び（Ｓ２）標的の定量値と減衰率との関係性を示す検量線を用いて、測定工程で得られた減衰率から標的を定量する定量工程を含む。以下、各工程について詳細に説明する。
実施形態の分析方法は、検体中の標的を定量するための方法である。分析方法は、図１に示すように、（Ｓ１）標的を特異的に捕捉する第１の捕捉体が表面に固定された光導波路の表面に検体を滴下し、標的と第１の捕捉体との結合による光の減衰率を測定する測定工程、及び（Ｓ２）標的の定量値と減衰率との関係性を示す検量線を用いて、測定工程で得られた減衰率から標的を定量する定量工程を含む。以下、各工程について詳細に説明する。
測定工程（Ｓ１）は、例えば、図２に示す光学的システム１を用いて行われる。光学的システム１は、光透過性の材料からなる基板２と、基板２の主面２ａ上に設けられ、光透過性の樹脂等の材料からなる、平面的な光導波路３とを有する。光導波路３の主面３ａ上には、低屈折樹脂層４が設けられている。低屈折樹脂層４には、光導波路３の主面３ａの一部の領域が露出するように開口５が設けられている。また、低屈折樹脂層４の開口５の縁に沿ってウェル壁６が設けられている。開口５及びウェル壁６により、光導波路３の主面３ａを底部とする、検体を収容するためのウェル７が形成されている。
ウェル７の底部に露出する光導波路３の主面３ａ上には、標的を特異的に補足する第１の捕捉体８が固定されている。また、ウェル７内の主面３ａ上には微粒子９分散されている。
微粒子９は、例えば、樹脂ビーズ若しくは金属コロイド、無機酸化物粒子、多糖類粒子又は非金属粒子等を用いることができる。微粒子９は、５０ｎｍ～１０μｍの径を有することが好ましい。
微粒子９の表面には、標的を特異的に補足する、第１の捕捉体８とは異なる第２の捕捉体１０が固定されている。第１の捕捉体８及び第２の捕捉体１０は、標的が抗原である場合、抗体又は抗原結合断片等である。第１の捕捉体８及び第２の捕捉体１０は、それぞれ一次抗体及び二次抗体であってもよい。或いは、第１の捕捉体８及び第２の捕捉体１０は、アプタマー、核酸又は酵素等であってもよい。
また、光学的システム１は、光導波路３に光を入射させるための光源１１（例えばレーザダイオード）と、光導波路３から出射される光を受光する光検出部１２（例えばフォトダイオード）を備えている。
光導波路３内の基板２の主面２ａには、入射側グレーティング１３ａおよび出射側グレーティング１３ｂが設けられている。入射側グレーティング１３ａは、光源１１から光１４が入射される主面２ａ上の位置に配置され、光１４が光導波路３内を全反射して伝搬されるように光１４の入射角を調節する。出射側グレーティング１３ｂは、光１４が光導波路３から出射される主面２ａ上の位置に配置され、光１４が光導波路３から出射されて光検出部１２で受光されるよう、光１４の出射角を調節する。グレーティング１３ａ，１３ｂは、例えば酸化チタン（ＴｉＯ２）、酸化錫（ＳｎＯ２）、酸化亜鉛、ニオブ酸リチウム、ガリウム砒素（ＧａＡｓ）、インジウム錫酸化物（ＩＴＯ）、ポリイミド等から形成される。
次に、光学的システム１を用いて検体の光の減衰率を測定する方法について説明する。
まず、検体を採取する。検体は、標的を含み得る分析対象であり、例えば、血液、血清、リンパ液、髄液、涙液、母乳、羊水、***、尿、便、汗、鼻腔粘膜、鼻腔拭い液、鼻かみ液、鼻吸引液、鼻洗浄液、咽頭拭い液、唾液、咽頭粘膜、咽頭拭い液、口腔内粘膜、口腔洗浄液、喀痰等の体液である。或いは、検体は、細胞、組織、バイオプシー、培養細胞、培養上清、細胞抽出物等の他の生物学的材料、土壌、河川水、海水、地下水、上下水道水等の環境由来の材料、植物由来の材料、食物若しくは飲料由来の材料又はこれらの何れかの組み合わせ等であってもよい。
上記生物学的材料の検体は、例えば、生体から得られる。生体は、例えば、ヒト又はサル等の霊長類、マウス、ラット又はモルモット等の齧歯類、ブタ、ウシ又はウマ等の家畜動物、或いはイヌ、ネコ又はウサギなどの伴侶動物等の哺乳動物などである。或いは、検体は、鳥類、爬虫類、両生類又は魚類等から得られたものであってもよい。
標的は、例えば、ウイルス、細菌又は菌類等の微生物（例えば、病原体）、或いは核酸、タンパク質、ペプチド、又は細胞外小胞等であってもよい。ウイルスは、例えば、インフルエンザウイルス（Ａ型（Ｈ１Ｎ１）、Ａ型（Ｈ３Ｎ２）又はＢ型）、ＲＳウイルス又はアデノウイルスなどである。細菌は、例えば、Ａ群溶血連鎖球菌（溶連菌）などである。
検体の採取方法は検体の種類に従う一般的な方法であればよく、例えば、スワブ、注射器又はピペットなどを用いることができる。例えば、検体が咽頭拭い液（咽頭粘膜）である場合は、滅菌したスワブの先端を被験者の口内に挿入し、咽頭拭い液を採取する。
必要に応じて、非特異的検出を防止する検体懸濁液に上記採取した材料を懸濁したものを検体として用いてもよい。検体懸濁液は、例えば緩衝液及び界面活性剤等を含む。
次に、ウェル７内、即ち、光導波路３の表面上に検体を滴下する。検体の滴下の前から又は滴下の後、光源１１から光１４を入射側グレーティング１３ａを介して光導波路３に入射する。それにより光１４が光導波路３内を全反射して伝搬する。その結果、開口５に露出する光導波路３表面にエバネッセント光が発生する。そして、光検出部１２で光導波路３から出射側グレーティング１３ｂを介して出射した光１４を検出する。
図３に示す通り、検体中に標的１５が存在する場合、標的１５が第１の捕捉体８及び第２の捕捉体１０と結合する。それにより、微粒子９が光導波路３表面に固定される。
光導波路３表面に固定された微粒子９は、エバネッセント光が存在する領域（エバネッセント光領域、図示せず）に存在するため、エバネッセント光の吸収や散乱に関与する。そのため、光検出部１２で検出される光の強度は標的１５を含まない場合の光の強度と比較して減衰する。表面に固定される微粒子９が多いほど、光の減衰率が大きくなる。
一方、検体中に標的１５が存在しない場合、微粒子９は検体中に浮遊しており、エバネッセント光領域に存在しない。そのため光の減衰は少ないか、又は起こらない。
次に測定工程（Ｓ１）で得られた減衰率を用いて、標的の定量を行う（定量工程（Ｓ２））。定量工程では、標的の定量値と光の減衰率との関係を示す検量線を用いる。定量値と光の減衰率との関係性を示す検量線は、例えば次の方法により作成することができる。
まず、図４の（ａ）に示すように、標的１５の存在量と定量値との関係性を示す第１の検量線を得る。第１の検量線は、例えば、既知の濃度の標的１５を含む溶液を異なる倍率で希釈して得られた複数の標準検体を用いて、非免疫学的定量方法により標的の定量を行うことにより作成可能である。
非免疫定量方法は例えば核酸定量法であり、その場合、定量値は核酸のコピー数である。核酸定量法は、リアルタイムＰＣＲ法などを用いることができる。又は非免疫定量方法はウイルス感染価測定による定量法であり、その場合、定量値はＴＣＩＤ５０値である。又は、非免疫定量方法はコロニー計数法であり、定量値はコロニー数である。
次に、標的の存在量と光の減衰率との関係性を示す第２の検量線を得る（図３の（ｂ））。第２の検量線は、例えば、既知の濃度の標的１５を含む溶液を異なる倍率で希釈して得られた複数の標準検体を用いて、実施形態の光学的分析装置により各標準検体の光の減衰率の測定を行うことにより作成可能である。
第２の検量線は、標準検体に実施形態の分析方法に用いられる検体に含まれる成分と同じ又は類似の成分を更に含ませた、疑似標準検体を用いて作成することが好ましい。例えば、用いられる検体が鼻腔、咽頭又は口腔に由来するものである場合は、疑似標準検体は、標的（例えば、不活性化ウイルス抗原等）と、ムチン又は標的を含まない検体とを混合したもの等であることが好ましい。
第１の検量線及び第２の検量線を用いれば、定量値と光の減衰率との関係性を示す第３の検量線が得られる（図３の（ｃ））。第３の検量線を定量工程において「検量線」として使用する。
測定工程（Ｓ１）で得られた光の減衰率を第３の検量線と照らし合わせることによって、標的の定量値を得ることができる（定量工程（Ｓ２））。
従来、光導波路３上での抗原抗体反応を用いた方法は、標的の定量は行うことができなかった。即ち、光の減衰率（相対量）を用いて、単に標的の陽性及び陰性のみを判定するものであった。その理由の１つは、光の減衰率と標的の数とは必ずしも正確に比例しないと考えられていたためである。そのため、光の減衰率（相対量）からはあくまで標的１５が多いか少ないかを判断できるに過ぎず、正確な定量を行うことは困難であると考えられていた。
しかしながら、本発明者らは、光の減衰率が標的の定量値（例えば、核酸定量値又はコロニー数等）と比例することを見出し、それにより上記定量工程が可能であることを下記例に示す実験により証明した。
特に、標的１５の存在量が後述する特定の範囲（検量線の上限値及び下限値の間）であれば、標的の定量値と減衰率とに特に強い相関性があることを見いだした。上限値及び下限値は、例えば、下記表１のとおりであることが好ましい。
この下限値及び上限値の間の標的存在量であれば、標的の定量値と減衰率とに強い相関性があるため、特に正確に定量を行うことが可能である。
この下限値及び上限値の間の標的存在量であれば、標的の定量値と減衰率とに強い相関性があるため、特に正確に定量を行うことが可能である。
上限値を超える範囲で減衰率と定量値との間の相関が弱くなり得る理由の一つは、図５の（ｂ）に示すように、標的の存在量が増えると、標的１５が複数集まって複合体１５ａを形成する可能性が高くなるためであると考えられる。例えば、上限値を超えると１分子の捕捉体８，１０に対して複数の標的１５が結合し、光導波路３上に固定される微粒子９の数が標的１５の存在量に比例しなくなる。その結果、図５の（ａ）に示すようにそれ以上減衰率が上がらなくなると考えられる。
例えば、減衰率が検量線の上限値を越える場合であっても、標的存在量が上限値以下となるように検体を希釈して、再度実施形態の分析方法を行うことにより正確に定量を行うことができる。その場合、得られた定量結果を希釈率に基づいて実際の定量値に換算すればよい。
以上に説明した実施形態の分析方法によれば、迅速に、例えば、３分～８分ほどで正確に標的の定量を行うことができる。
迅速に定量が行われることによって、例えば、標的が病原体である場合は検体を得た生体の感染症の重症度を素早く判定することができる。迅速な重症度の判定は、緊急性のある感染症の診断においては特に有効である。また、迅速に重症度判定ができれば、臨床現場でもより適切な治療方法、投薬する薬剤種又は投薬量を判定することができる。
更なる実施形態において、光学的システム１は、微粒子９及び第２の捕捉体１０を含まなくともよい。その場合は、標的１５と第１の捕捉体８との結合により、標的１５が光導波路３表面上に固定され、エバネッセント光の吸収や散乱に関与し、光の減衰が起こる。
・光学的分析装置
実施形態の分析方法は、例えば図６に示す光学的分析装置１００を用いて自動的に行うことができる。光学的分析装置１００は、測定部１０１と、記憶部２０と、情報処理部３０と、表示部４０と、制御部５０とを備える。
実施形態の分析方法は、例えば図６に示す光学的分析装置１００を用いて自動的に行うことができる。光学的分析装置１００は、測定部１０１と、記憶部２０と、情報処理部３０と、表示部４０と、制御部５０とを備える。
測定部１０１は、図２に示す光学的システム１を含み、測定工程（Ｓ１）を行う。
記憶部２０は、光検出部１２で得られた第１の光の強度２１ａ、標的を含まない時の第２の光の強度２１ｂ、検量線２２、第１の光の強度２１ａ及び第２の光の強度２１ｂをもとに算出された光の減衰率２３、及び検量線２２と光の減衰率２３とから算出される標的の定量値２４等を格納する。また、記憶部２０は、第１の光の強度２１ａ及び第２の光の強度２１ｂから光の減衰率２３を算出し、検量線２２を用いて減衰率２３から標的の定量値２４を算出するためのプログラムＰを格納する。更に、記憶部２０には、制御部５０が各部を制御して測定工程（Ｓ１）及び／又は定量工程（Ｓ２）を実行するために使用されるその他のプログラム及びパラメータ等も格納されている。
情報処理部３０は、プログラムＰに従って、記憶部２０に格納された第１の光の強度２１ａ及び第２の光の強度２１ｂを取り出して光の減衰率２３を算出し、記憶部２０に格納する。また、記憶部２０に格納された検量線２２及び減衰率２３を取り出して標的の定量値２４を算出し、記憶部２０に格納する。
表示部４０は、例えば、ディスプレイ又はプリンタ等を備え、定量値２４を出力する。
制御部５０は、測定部１０１、記憶部２０、情報処理部３０及び表示部４０の各挙動を制御する。
記憶部２０、情報処理部３０、表示部４０及び制御部５０は、これらの各部を一体として含むコンピュータであってもよい。
更なる実施形態において、記憶部２０は、複数種類の標的それぞれに対応する複数の検量線２２を格納していてもよい。例えば、インフルエンザウイルスの各型に対応する検量線を全て含んでもよいし、複数種類の病原体のそれぞれに対応する複数の検量線を含んでもよい。
また、更なる実施形態において、情報処理部３０は、減衰率２３が検量線２２の上限値を超えている場合、標的の定量値は上限値以上であると判定する。同時に、情報処理部３０は該減衰率２３から推奨検体希釈率を算出し、記憶部２０に格納する。そして、表示部４０に標的が上限値を超えている旨及び推奨希釈率が表示される。推奨希釈率について測定者から同意が得られて再び測定が実行された場合、情報処理部３０は推奨希釈率を用いて、その測定の結果として得られた定量値２４を希釈前の標的の定量値に換算し、それが表示部４０に表示される。
或いは、減衰率２３が検量線２２の下限値を下回っている場合には、情報処理部３０は、標的１５の定量値は下限値以下であると判定し、表示部４０にその旨が表示される。
以上に説明した実施形態の分析方法によれば、迅速かつ正確な標的の定量を自動的に行うことができる。
［例］
以下、実施形態の光学的分析装置及び分析方法を用いて標的の検出を行った例について記載する。しかしながら、本発明はこの実施の形態に限定されるものではない。
［例］
以下、実施形態の光学的分析装置及び分析方法を用いて標的の検出を行った例について記載する。しかしながら、本発明はこの実施の形態に限定されるものではない。
例１．不活性化処理されたインフルエンザウイルス溶液における減衰率とウイルスＲＮＡ量との相関性試験
（測定検体の調製）
測定検体として、不活性化処理されたインフルエンザウイルスＡ型／北京（以下、不活性化インフルエンザウイルス溶液という）を使用した。不活性化インフルエンザ溶液を培地で段階的に希釈することにより、異なる濃度で被検ウイルスを含む複数の希釈系列を作製した。前記作製した希釈溶液３０μｌを検体処理液４００μｌに添加して検体とした。
（測定検体の調製）
測定検体として、不活性化処理されたインフルエンザウイルスＡ型／北京（以下、不活性化インフルエンザウイルス溶液という）を使用した。不活性化インフルエンザ溶液を培地で段階的に希釈することにより、異なる濃度で被検ウイルスを含む複数の希釈系列を作製した。前記作製した希釈溶液３０μｌを検体処理液４００μｌに添加して検体とした。
（光学的減衰率の測定）
光導波路上にインフルエンザウイルス抗体を固定した図２の光学的分析装置に上記検体を滴下し、抗原蛋白質量を抗原抗体反応による光学的減衰率として測定した。
光導波路上にインフルエンザウイルス抗体を固定した図２の光学的分析装置に上記検体を滴下し、抗原蛋白質量を抗原抗体反応による光学的減衰率として測定した。
（結果）
結果を図７に示す。図７のグラフより、光学的減衰率と不活性化インフルエンザウイルス溶液の希釈率との間には強い相関性が認められた（Ｒ２＝０．９７５１）。
結果を図７に示す。図７のグラフより、光学的減衰率と不活性化インフルエンザウイルス溶液の希釈率との間には強い相関性が認められた（Ｒ２＝０．９７５１）。
（インフルエンザウイルスのＲＮＡの定量）
前記不活性化インフルエンザウイルス溶液の希釈系列からそれぞれ６０μｌを用いてＲＮＡ抽出キット（商品名：High Pure FFPE RNA Micro Kit、Roche製）によりＲＮＡを抽出及び精製した。Swine H1N1 Influenza Human Pandemic Strain genesig Advanced kit （商品名、ＧＮＳＩＧ製）を用いて、以下の表２に示す組成でリアルタイムＲＴ－ＰＣＲマスターミックスを調整した。
リアルタイムＲＴ－ＰＣＲマスターミックス（１５μｌ）に、抽出・精製したＲＮＡをそれぞれ５μｌ添加し、合計２０μｌのリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ反応液を得た。また、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲマスターミックス（１５μｌ）に、コピー数が既知の陽性コントロール（２×１００～２×１０５コピー／μｌ）をそれぞれ５μｌ添加することで、合計２０μｌの検量線作成用反応液を得た。
前記不活性化インフルエンザウイルス溶液の希釈系列からそれぞれ６０μｌを用いてＲＮＡ抽出キット（商品名：High Pure FFPE RNA Micro Kit、Roche製）によりＲＮＡを抽出及び精製した。Swine H1N1 Influenza Human Pandemic Strain genesig Advanced kit （商品名、ＧＮＳＩＧ製）を用いて、以下の表２に示す組成でリアルタイムＲＴ－ＰＣＲマスターミックスを調整した。
リアルタイムＲＴ－ＰＣＲマスターミックス（１５μｌ）に、抽出・精製したＲＮＡをそれぞれ５μｌ添加し、合計２０μｌのリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ反応液を得た。また、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲマスターミックス（１５μｌ）に、コピー数が既知の陽性コントロール（２×１００～２×１０５コピー／μｌ）をそれぞれ５μｌ添加することで、合計２０μｌの検量線作成用反応液を得た。
これらの反応液をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ反応用チューブに分注し、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ装置（商品名：QuantAtudio3、Thermo Fisher Scientific製）を用いて、表３に示すＰＣＲサーマルサイクル条件により、ＲＮＡの増幅を実施した。
陽性コントロールから得たＣｔ値とコピー数との検量線を用いて、各希釈率における不活性化インフルエンザウイルスＲＮＡのコピー数を算出した。
陽性コントロールから得たＣｔ値とコピー数との検量線を用いて、各希釈率における不活性化インフルエンザウイルスＲＮＡのコピー数を算出した。
（結果）
結果を図８に示す。図８のグラフより、不活性化抗原が有するＲＮＡ量と抗原量（不活性化インフルエンザウイルス溶液の希釈率）との間には強い相関性が認められた（Ｒ２＝０．９９７４）。
結果を図８に示す。図８のグラフより、不活性化抗原が有するＲＮＡ量と抗原量（不活性化インフルエンザウイルス溶液の希釈率）との間には強い相関性が認められた（Ｒ２＝０．９９７４）。
図７及び図８の結果から、光学的減衰率と抗原量との間には相関性があり、且つ不活性化抗原が有するＲＮＡ量と抗原量との間にも相関性が認められた。故に、光学的減衰率とＲＮＡ量との間にも相関性があると考え、両者の相関性試験を行った。
その結果を図９に示す。図９より、光学的減衰率と不活性化抗原が有するＲＮＡ量との間には強い相関性が認められた（Ｒ２＝０．９７２２）。特にＲＮＡ量が３３００～３７００ｃｏｐｙ／ｍｌから３３０００～３７０００ｃｏｐｙ／ｍｌまでの間であるとき相関が高いことが明らかとなった。したがって、光学的減衰率とＲＮＡ量との関係性を示す検量線を用いれば、光学的減衰率からインフルエンザウイルスの正確な定量が可能であることが明らかとなった。
例２．インフルエンザウイルスＢ型培養液における減衰率とウイルスＲＮＡ量との相関性試験
（測定検体の調製）
測定検体として、宿主細胞であるＭＤＣＫ細胞（ATCC（登録商標）Number: CCL-34（登録商標）イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来)を用いて培養したインフルエンザウイルスＢ型培養液を使用した。インフルエンザウイルスＢ型培養液を培地で段階的に希釈することにより、異なる濃度で被検ウイルスを含む複数の希釈系列を作製した。前記作製した希釈溶液３０μｌを検体処理液４００μｌに添加して検体とした。
（測定検体の調製）
測定検体として、宿主細胞であるＭＤＣＫ細胞（ATCC（登録商標）Number: CCL-34（登録商標）イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来)を用いて培養したインフルエンザウイルスＢ型培養液を使用した。インフルエンザウイルスＢ型培養液を培地で段階的に希釈することにより、異なる濃度で被検ウイルスを含む複数の希釈系列を作製した。前記作製した希釈溶液３０μｌを検体処理液４００μｌに添加して検体とした。
（光学的減衰率の測定）
光導波路上にインフルエンザウイルス抗体を固定した図２の光学的分析装置に上記検体を滴下し、抗原蛋白質量を抗原抗体反応による光学的減衰率として測定した。
光導波路上にインフルエンザウイルス抗体を固定した図２の光学的分析装置に上記検体を滴下し、抗原蛋白質量を抗原抗体反応による光学的減衰率として測定した。
（結果）
結果を図１０に示す。図１０のグラフより、光学的減衰率とインフルエンザウイルスＢ型培養液の希釈率との間には強い相関性が認められた（Ｒ２＝０．９８８９）。
結果を図１０に示す。図１０のグラフより、光学的減衰率とインフルエンザウイルスＢ型培養液の希釈率との間には強い相関性が認められた（Ｒ２＝０．９８８９）。
（インフルエンザウイルスのＲＮＡの定量）
前記インフルエンザウイルスＢ型培養液の希釈系列からそれぞれ６０μｌを用いてＲＮＡ抽出キット（商品名：High Pure FFPE RNA Micro Kit、Roche製）によりＲＮＡを抽出及び精製した。Human Influenza B virus Haemoglutinin gene genesig Advanced kit （商品名、ＧＮＳＩＧ製）を用いて、前記表２に示す組成でリアルタイムＲＴ－ＰＣＲマスターミックスを調整した。
前記インフルエンザウイルスＢ型培養液の希釈系列からそれぞれ６０μｌを用いてＲＮＡ抽出キット（商品名：High Pure FFPE RNA Micro Kit、Roche製）によりＲＮＡを抽出及び精製した。Human Influenza B virus Haemoglutinin gene genesig Advanced kit （商品名、ＧＮＳＩＧ製）を用いて、前記表２に示す組成でリアルタイムＲＴ－ＰＣＲマスターミックスを調整した。
リアルタイムＲＴ－ＰＣＲマスターミックス（１５μｌ）に、抽出・精製したＲＮＡをそれぞれ５μｌ添加し、合計２０μｌのリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ反応液を得た。また、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲマスターミックス（１５μｌ）に、コピー数が既知の陽性コントロール（２×１００～２×１０５コピー／μｌ）をそれぞれ５μｌ添加することで、合計２０μｌの検量線作成用反応液を得た。
これらの反応液をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ反応用チューブに分注し、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ装置（商品名：QuantAtudio3、Thermo Fisher Scientific製）を用いて、前記表３に示すＰＣＲサーマルサイクル条件により、ＲＮＡの増幅を実施した。
陽性コントロールから得たＣｔ値とコピー数との検量線を用いて、各希釈率におけるインフルエンザウイルスＢ型ＲＮＡのコピー数を算出した。
（結果）
結果を図１１に示す。図１１のグラフより、インフルエンザウイルスＢ型抗原が有するＲＮＡ量と抗原量（インフルエンザウイルスＢ型培養液の希釈率）との間には強い相関性が認められた（Ｒ２＝０．９６３９）。
結果を図１１に示す。図１１のグラフより、インフルエンザウイルスＢ型抗原が有するＲＮＡ量と抗原量（インフルエンザウイルスＢ型培養液の希釈率）との間には強い相関性が認められた（Ｒ２＝０．９６３９）。
図１０及び図１１の結果から、光学的減衰率と抗原量との間には相関性があり、且つ抗原が有するＲＮＡ量と抗原量との間にも相関性が認められた。故に、光学的減衰率とＲＮＡ量との間にも相関性があると考え、両者の相関性試験を行った。
その結果を図１２に示す。図１２より、光学的減衰率と抗原が有するＲＮＡ量との間には強い相関性が認められた（Ｒ２＝０．９８２）。特にＲＮＡ量が２００～３００ｃｏｐｙ／ｍｌから３６００～４４００ｃｏｐｙ／ｍｌまでの間であるとき相関が高いことが明らかとなった。したがって、光学的減衰率とＲＮＡ量との関係性を示す検量線を用いれば、光学的減衰率からインフルエンザウイルスＢ型の正確な定量が可能であることが明らかとなった。
例３．Ａ群溶血連鎖球菌を用いた生菌数と光学的減衰率との間の相関性試験
（測定検体の調製）
測定検体としてＡ群溶血連鎖球菌であるStreptococcus pyogenesの培養液を使用した。培養液を生理食塩水で希釈することで異なる濃度で被検細菌を含む複数の希釈系列を作製した。前記希釈培養液３０μｌを培地４００μｌに添加して希釈して検体とした。
（測定検体の調製）
測定検体としてＡ群溶血連鎖球菌であるStreptococcus pyogenesの培養液を使用した。培養液を生理食塩水で希釈することで異なる濃度で被検細菌を含む複数の希釈系列を作製した。前記希釈培養液３０μｌを培地４００μｌに添加して希釈して検体とした。
（光学的減衰率の測定）
光導波路上にＡ群溶血連鎖球菌抗体を固定した例１と同様の光学的分析装置に上記検体を滴下し、抗原蛋白質量に基づく光学的減衰率を測定した。
光導波路上にＡ群溶血連鎖球菌抗体を固定した例１と同様の光学的分析装置に上記検体を滴下し、抗原蛋白質量に基づく光学的減衰率を測定した。
（結果）
その結果を図１３に示す。図１３のグラフより、光学的減衰率とＡ群溶血連鎖球菌培養液の希釈率との間には強い相関性が認められた（Ｒ２＝０．９９９２）。
その結果を図１３に示す。図１３のグラフより、光学的減衰率とＡ群溶血連鎖球菌培養液の希釈率との間には強い相関性が認められた（Ｒ２＝０．９９９２）。
（Ａ群溶血連鎖球菌の生菌数の測定）
前記Streptococcus pyogenesの培養液の希釈系列をそれぞれ１００μｌずつ平板寒天培地に塗抹し、インキュベーターで３７℃、５％ＣＯ２の条件下、一昼夜培養した。培養後、平板寒天培地上のコロニー数を計測することで生菌数を測定した。
前記Streptococcus pyogenesの培養液の希釈系列をそれぞれ１００μｌずつ平板寒天培地に塗抹し、インキュベーターで３７℃、５％ＣＯ２の条件下、一昼夜培養した。培養後、平板寒天培地上のコロニー数を計測することで生菌数を測定した。
（結果）
その結果を図１４に示す。図１４より、生菌数を測定して得られたコロニー数とＡ群溶血連鎖球菌培養液の希釈率との間には強い相関性が認められた（Ｒ２＝０．９７３９）。
その結果を図１４に示す。図１４より、生菌数を測定して得られたコロニー数とＡ群溶血連鎖球菌培養液の希釈率との間には強い相関性が認められた（Ｒ２＝０．９７３９）。
（Ａ群溶血連鎖球菌の生菌数と抗原蛋白質量の相関性）
図１３及び１４より、光学的減衰率と抗原量との間には相関性があり、且つコロニー数と抗原量との間にも相関性が認められた。このことから、光学的減衰率とコロニー数との間にも相関性があると考え、相関性試験を行った。
図１３及び１４より、光学的減衰率と抗原量との間には相関性があり、且つコロニー数と抗原量との間にも相関性が認められた。このことから、光学的減衰率とコロニー数との間にも相関性があると考え、相関性試験を行った。
その結果を図１５に示す。図１５より、光学的減衰率とコロニー数との間には相関性が認められた（Ｒ２＝０．９６４）。特にコロニー数が４．５～５．５Ｅ＋０６ｃｆｕ／ｍｌから２．２５～２．７５Ｅ＋０７ｃｆｕ／ｍｌまでの間であるとき相関が高いことが明らかとなった。よって、光学的減衰率とコロニー数との関係性を示す検量線を用いれば、光学的減衰率からＡ群溶血連鎖球菌の正確な定量が可能であることが明らかとなった。
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
検体中の標的を定量するための分析方法であって、
前記標的を特異的に捕捉する第１の捕捉体が表面に固定された光導波路の前記表面に前記検体を滴下し、前記標的と前記第１の捕捉体との結合による光の減衰率を測定する測定工程、及び
前記標的の定量値と光の減衰率との関係性を示す検量線を用いて、前記測定工程で得られた前記減衰率から、前記検体中の前記標的を定量する定量工程を含む、分析方法。
［２］
前記光導波路の前記表面上には微粒子が分散されており、前記微粒子の表面には、前記第１の捕捉体とは異なる、前記標的を特異的に捕捉する第２の捕捉体が固定されている、［１］に記載の分析方法。
［３］
前記検量線は、
非免疫定量方法により予め得られた前記標的の存在量と定量値との関係性を示す第１の検量線、及び
前記光導波路を用いて予め得られた前記標的の存在量と前記光の減衰率との関係性を示す第２の検量線を用いて得られる、前記定量値と前記減衰率との関係性を示す第３の検量線である、［１］又は［２］に記載の分析方法。
［４］
前記非免疫定量方法は核酸定量法であり、前記定量値は核酸のコピー数であるか、
又は
前記非免疫定量方法はコロニー計数法であり、前記定量値はコロニー数である、［３］に記載の分析方法。
［５］
前記標的は、ウイルス又は細菌である、［１］～［４］の何れか１つに記載の分析方法。
［６］
前記定量値の上限値は、
前記標的が不活性化インフルエンザウイルスＡ型であり、前記定量値が核酸のコピー数である場合、３３０００～３７０００コピー／ｍｌであり、
前記標的がインフルエンザウイルスＢ型であり、前記定量値が核酸のコピー数である場合、３６００～４４００コピー／ｍｌであり、
前記標的がＡ分溶結連鎖球菌であり、前記定量値がコロニー数である場合、２．２５～２．７５Ｅ＋０７ｃｆｕ／ｍｌである、
［５］に記載の分析方法。
［７］
検体中の標的を定量するための光学的分析装置であって、
前記標的を特異的に捕捉する第１の捕捉体が表面に固定された光導波路と、前記光導波路に光を入射する光源と、前記光の出射側から前記光を検出する光検出部とを含み、前記標的と前記第１の捕捉体との結合による光の減衰率を測定するための測定部、
前記標的の定量値と光の減衰率との関係性を示す検量線と、前記測定部の前記光検出部で得られた前記光の強度から前記検体についての前記光の減衰率を算出し、前記検量線を用いて前記減衰率から前記標的の定量値を算出するためのプログラムとを含む記憶部、及び
前記プログラムに従って前記減衰率の算出と、前記標的の前記定量値の算出とを行う情報処理部、を備える光学的分析装置。
［８］
前記光学的分析装置は、前記光導波路上に分散された微粒子を備え、前記微粒子の表面には、前記第１の捕捉体とは異なる、前記標的を特異的に捕捉する第２の捕捉体が固定されている、［７］に記載の光学的分析装置。
［９］
前記検量線は、
非免疫定量方法により予め得られた前記標的の存在量と前記定量値との関係性を示す第１の検量線、及び
前記光学的分析装置を用いて予め得られた前記標的の存在量と前記光の減衰率との関係性を示す第２の検量線を用いて得られる、前記定量値と前記減衰率との関係性を示す第３の検量線である、［７］又は［８］に記載の光学的分析装置。
［１０］
前記非免疫定量方法は核酸定量法であり、前記定量値は核酸のコピー数であるか、
又は
前記非免疫定量方法はコロニー計数法であり、前記定量値はコロニー数である、［９］に記載の光学的分析装置。
［１１］
前記記憶部は、複数種類の前記標的それぞれに対応する複数の前記検量線を格納する、［７］～［１０］の何れか１つに記載の光学的分析装置。
［１２］
前記標的は、ウイルス又は細菌である、［７］～［１１］の何れか１つに記載の光学的分析装置。
［１３］
前記検量線は前記定量値及び前記減衰率の上限値及び下限値を有し、
前記測定部で得られた前記減衰率が前記上限値を超える場合、前記情報処理部は、前記標的の前記定量値は上限値を超えると判定し、
前記測定部で得られた前記減衰率が前記下限値を下回る場合、前記情報処理部は、前記標的の前記定量値は下限値以上であると判定する、［７］～［１２］の何れか１つに記載の光学的分析装置。
［１４］
前記定量値が核酸のコピー数である場合、前記定量値の上限値は、
前記標的が不活性化インフルエンザウイルスＡ型であり、前記定量値が核酸のコピー数である場合、３３０００～３７０００コピー／ｍｌであり、
前記標的がインフルエンザウイルスＢ型であり、前記定量値が核酸のコピー数である場合、３６００～４４００コピー／ｍｌであり、
前記標的がＡ分溶結連鎖球菌であり、前記定量値がコロニー数である場合、２．２５～２．７５Ｅ＋０７ｃｆｕ／ｍｌである、
［１３］に記載の光学的分析装置。
［１５］
表示部をさらに備え、
前記減衰率が前記上限値を超える場合、前記情報処理部は、更に前記減衰率から推奨の検体希釈率を算出し、前記推奨の検体希釈率を前記表示部に表示し、前記推奨の検体希釈率の下で再び前記減衰率の測定が行われた場合、得られた前記標的の定量値を前記推奨の希釈率を用いて希釈する前の前記標的の定量値に換算し、それを前記表示部に表示する、［１３］又は［１４］に記載の光学的分析装置。
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
検体中の標的を定量するための分析方法であって、
前記標的を特異的に捕捉する第１の捕捉体が表面に固定された光導波路の前記表面に前記検体を滴下し、前記標的と前記第１の捕捉体との結合による光の減衰率を測定する測定工程、及び
前記標的の定量値と光の減衰率との関係性を示す検量線を用いて、前記測定工程で得られた前記減衰率から、前記検体中の前記標的を定量する定量工程を含む、分析方法。
［２］
前記光導波路の前記表面上には微粒子が分散されており、前記微粒子の表面には、前記第１の捕捉体とは異なる、前記標的を特異的に捕捉する第２の捕捉体が固定されている、［１］に記載の分析方法。
［３］
前記検量線は、
非免疫定量方法により予め得られた前記標的の存在量と定量値との関係性を示す第１の検量線、及び
前記光導波路を用いて予め得られた前記標的の存在量と前記光の減衰率との関係性を示す第２の検量線を用いて得られる、前記定量値と前記減衰率との関係性を示す第３の検量線である、［１］又は［２］に記載の分析方法。
［４］
前記非免疫定量方法は核酸定量法であり、前記定量値は核酸のコピー数であるか、
又は
前記非免疫定量方法はコロニー計数法であり、前記定量値はコロニー数である、［３］に記載の分析方法。
［５］
前記標的は、ウイルス又は細菌である、［１］～［４］の何れか１つに記載の分析方法。
［６］
前記定量値の上限値は、
前記標的が不活性化インフルエンザウイルスＡ型であり、前記定量値が核酸のコピー数である場合、３３０００～３７０００コピー／ｍｌであり、
前記標的がインフルエンザウイルスＢ型であり、前記定量値が核酸のコピー数である場合、３６００～４４００コピー／ｍｌであり、
前記標的がＡ分溶結連鎖球菌であり、前記定量値がコロニー数である場合、２．２５～２．７５Ｅ＋０７ｃｆｕ／ｍｌである、
［５］に記載の分析方法。
［７］
検体中の標的を定量するための光学的分析装置であって、
前記標的を特異的に捕捉する第１の捕捉体が表面に固定された光導波路と、前記光導波路に光を入射する光源と、前記光の出射側から前記光を検出する光検出部とを含み、前記標的と前記第１の捕捉体との結合による光の減衰率を測定するための測定部、
前記標的の定量値と光の減衰率との関係性を示す検量線と、前記測定部の前記光検出部で得られた前記光の強度から前記検体についての前記光の減衰率を算出し、前記検量線を用いて前記減衰率から前記標的の定量値を算出するためのプログラムとを含む記憶部、及び
前記プログラムに従って前記減衰率の算出と、前記標的の前記定量値の算出とを行う情報処理部、を備える光学的分析装置。
［８］
前記光学的分析装置は、前記光導波路上に分散された微粒子を備え、前記微粒子の表面には、前記第１の捕捉体とは異なる、前記標的を特異的に捕捉する第２の捕捉体が固定されている、［７］に記載の光学的分析装置。
［９］
前記検量線は、
非免疫定量方法により予め得られた前記標的の存在量と前記定量値との関係性を示す第１の検量線、及び
前記光学的分析装置を用いて予め得られた前記標的の存在量と前記光の減衰率との関係性を示す第２の検量線を用いて得られる、前記定量値と前記減衰率との関係性を示す第３の検量線である、［７］又は［８］に記載の光学的分析装置。
［１０］
前記非免疫定量方法は核酸定量法であり、前記定量値は核酸のコピー数であるか、
又は
前記非免疫定量方法はコロニー計数法であり、前記定量値はコロニー数である、［９］に記載の光学的分析装置。
［１１］
前記記憶部は、複数種類の前記標的それぞれに対応する複数の前記検量線を格納する、［７］～［１０］の何れか１つに記載の光学的分析装置。
［１２］
前記標的は、ウイルス又は細菌である、［７］～［１１］の何れか１つに記載の光学的分析装置。
［１３］
前記検量線は前記定量値及び前記減衰率の上限値及び下限値を有し、
前記測定部で得られた前記減衰率が前記上限値を超える場合、前記情報処理部は、前記標的の前記定量値は上限値を超えると判定し、
前記測定部で得られた前記減衰率が前記下限値を下回る場合、前記情報処理部は、前記標的の前記定量値は下限値以上であると判定する、［７］～［１２］の何れか１つに記載の光学的分析装置。
［１４］
前記定量値が核酸のコピー数である場合、前記定量値の上限値は、
前記標的が不活性化インフルエンザウイルスＡ型であり、前記定量値が核酸のコピー数である場合、３３０００～３７０００コピー／ｍｌであり、
前記標的がインフルエンザウイルスＢ型であり、前記定量値が核酸のコピー数である場合、３６００～４４００コピー／ｍｌであり、
前記標的がＡ分溶結連鎖球菌であり、前記定量値がコロニー数である場合、２．２５～２．７５Ｅ＋０７ｃｆｕ／ｍｌである、
［１３］に記載の光学的分析装置。
［１５］
表示部をさらに備え、
前記減衰率が前記上限値を超える場合、前記情報処理部は、更に前記減衰率から推奨の検体希釈率を算出し、前記推奨の検体希釈率を前記表示部に表示し、前記推奨の検体希釈率の下で再び前記減衰率の測定が行われた場合、得られた前記標的の定量値を前記推奨の希釈率を用いて希釈する前の前記標的の定量値に換算し、それを前記表示部に表示する、［１３］又は［１４］に記載の光学的分析装置。
３…光導波路 ８…第１の捕捉体 ９…微粒子 １０…第２の捕捉体 １１…光源
１２…光検出部 １４…光 １５…標的 ２０…記憶部 ２２…検量線
２３…減衰率 ２４…定量値 ３０…情報処理部 ４０…表示部 ５０…制御部
１００…光学的分析装置 １０１…測定部 Ｐ…プログラム
１２…光検出部 １４…光 １５…標的 ２０…記憶部 ２２…検量線
２３…減衰率 ２４…定量値 ３０…情報処理部 ４０…表示部 ５０…制御部
１００…光学的分析装置 １０１…測定部 Ｐ…プログラム
Claims (11)
- 検体中の標的を定量するための分析方法であって、
前記標的を特異的に捕捉する第１の捕捉体が表面に固定された光導波路の前記表面に前記検体を滴下し、前記標的と前記第１の捕捉体との結合による光の減衰率を測定する測定工程、及び
前記標的の定量値と光の減衰率との関係性を示す検量線を用いて、前記測定工程で得られた前記減衰率から、前記検体中の前記標的を定量する定量工程を含み、
前記標的が不活性化インフルエンザウイルスＡ型、インフルエンザウイルスＢ型、又はＡ群溶結連鎖球菌であり、
前記標的が前記不活性化インフルエンザウイルスＡ型である場合、前記定量値が核酸のコピー数であり、前記定量値の上限値が３３０００～３７０００コピー／ｍｌであり、
前記標的が前記インフルエンザウイルスＢ型である場合、前記定量値が核酸のコピー数であり、前記定量値の上限値が３６００～４４００コピー／ｍｌであり、
前記標的が前記Ａ群溶結連鎖球菌である場合、前記定量値がコロニー数であり、前記定量値の上限値が２．２５～２．７５Ｅ＋０７ｃｆｕ／ｍｌである、分析方法。 - 前記光導波路の前記表面上には微粒子が分散されており、前記微粒子の表面には、前記第１の捕捉体とは異なる、前記標的を特異的に捕捉する第２の捕捉体が固定されている、請求項１に記載の分析方法。
- 前記検量線は、
非免疫定量方法により予め得られた前記標的の存在量と定量値との関係性を示す第１の検量線、及び
前記光導波路を用いて予め得られた前記標的の存在量と前記光の減衰率との関係性を示す第２の検量線を用いて得られる、前記定量値と前記減衰率との関係性を示す第３の検量線である、請求項１又は２に記載の分析方法。 - 前記非免疫定量方法は核酸定量法であり、前記定量値は核酸のコピー数であるか、
又は
前記非免疫定量方法はコロニー計数法であり、前記定量値はコロニー数である、請求項３に記載の分析方法。 - 検体中の標的を定量するための光学的分析装置であって、
前記標的を特異的に捕捉する第１の捕捉体が表面に固定された光導波路と、前記光導波路に光を入射する光源と、前記光の出射側から前記光を検出する光検出部とを含み、前記標的と前記第１の捕捉体との結合による光の減衰率を測定するための測定部、
前記標的の定量値と光の減衰率との関係性を示す検量線と、前記測定部の前記光検出部で得られた前記光の強度から前記検体についての前記光の減衰率を算出し、前記検量線を用いて前記減衰率から前記標的の定量値を算出するためのプログラムとを含む記憶部、及び
前記プログラムに従って前記減衰率の算出と、前記標的の前記定量値の算出とを行う情報処理部、を備え、
前記標的が不活性化インフルエンザウイルスＡ型、インフルエンザウイルスＢ型、又はＡ群溶結連鎖球菌であり、
前記標的が前記不活性化インフルエンザウイルスＡ型である場合、前記定量値が核酸のコピー数であり、前記定量値の上限値が３３０００～３７０００コピー／ｍｌであり、
前記標的が前記インフルエンザウイルスＢ型である場合、前記定量値が核酸のコピー数であり、前記定量値の上限値が３６００～４４００コピー／ｍｌであり、
前記標的が前記Ａ群溶結連鎖球菌である場合、前記定量値がコロニー数であり、前記定量値の上限値が２．２５～２．７５Ｅ＋０７ｃｆｕ／ｍｌである、光学的分析装置。 - 前記光学的分析装置は、前記光導波路上に分散された微粒子を備え、前記微粒子の表面には、前記第１の捕捉体とは異なる、前記標的を特異的に捕捉する第２の捕捉体が固定されている、請求項５に記載の光学的分析装置。
- 前記検量線は、
非免疫定量方法により予め得られた前記標的の存在量と前記定量値との関係性を示す第１の検量線、及び
前記光学的分析装置を用いて予め得られた前記標的の存在量と前記光の減衰率との関係性を示す第２の検量線を用いて得られる、前記定量値と前記減衰率との関係性を示す第３の検量線である、請求項５又は６に記載の光学的分析装置。 - 前記非免疫定量方法は核酸定量法であり、前記定量値は核酸のコピー数であるか、
又は
前記非免疫定量方法はコロニー計数法であり、前記定量値はコロニー数である、請求項７に記載の光学的分析装置。 - 前記記憶部は、複数種類の前記標的それぞれに対応する複数の前記検量線を格納する、請求項５～８の何れか１項に記載の光学的分析装置。
- 前記検量線は前記定量値及び前記減衰率の上限値及び下限値を有し、
前記測定部で得られた前記減衰率が前記上限値を超える場合、前記情報処理部は、前記標的の前記定量値は上限値を超えると判定し、
前記測定部で得られた前記減衰率が前記下限値を下回る場合、前記情報処理部は、前記標的の前記定量値は下限値以下であると判定する、請求項５～９の何れか１項に記載の光学的分析装置。 - 表示部をさらに備え、
前記減衰率が前記上限値を超える場合、前記情報処理部は、更に前記減衰率から推奨の検体希釈率を算出し、前記推奨の検体希釈率を前記表示部に表示し、前記推奨の検体希釈率の下で再び前記減衰率の測定が行われた場合、得られた前記標的の定量値を前記推奨の希釈率を用いて希釈する前の前記標的の定量値に換算し、それを前記表示部に表示する、請求項１０に記載の光学的分析装置。
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Non-Patent Citations (2)
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| Palaniappan Subramanian et al，Graphene-Coated Surface Plasmon Resonance Interfaces for Studying the Interactions between Bacteria and Surfaces，ACS Applied Materials & Interfaces，2014年，Vol.6，pp.5422-5431 |
| Ying-Feng Chang et al，Simple Strategy for Rapid and Sensitive Detection of Avian Influenza A H7N9 Virus Based on Intensity-Modulated SPR Biosensor and New Generated Antibody，Analytical Chemistry，2018年，Vol.90，pp.1861-1869 |
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