JP7479051B2 - プラスチック粒子の検出方法およびプラスチック粒子の検出キット - Google Patents
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Description
(a)配列番号1に示すアミノ酸配列を含むペプチド、
(b)配列番号1のアミノ酸配列において、1または複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ前記ポリスチレン粒子と結合する活性を有するペプチド。
(c)配列番号5に示すアミノ酸配列を含むペプチド、
(d)配列番号5のアミノ酸配列において、1または複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ前記ポリプロピレン粒子と結合する活性を有するペプチド。
本発明の一実施形態に係るプラスチック粒子の検出方法(以降、「本発明の検出方法」と称する)は、長径が360nm以下であり、かつ下記式(1)で示される構造を有するプラスチック粒子(以降、「本発明のプラスチック粒子」と称する)と、前記プラスチック粒子に結合するペプチド(以降、「本発明のペプチド」と称する)と、前記ペプチドと結合する蛍光色素(以降、「本発明の蛍光色素」と称する)と、を混合する混合工程と、前記プラスチック粒子と、前記ペプチドと、前記蛍光色素との第1の複合体を検出する検出工程と、を含む。
(プラスチック粒子)
本発明の検出方法により検出されるプラスチック粒子は、下記式(1)で示される構造を有するプラスチック粒子である。
本発明のペプチドは、本発明のプラスチック粒子が有する、上述の各構造に対して結合するアミノ酸配列を含む。本発明のペプチドのアミノ酸配列は、検出対象のプラスチック粒子を構成するプラスチックの種類に応じて、適宜決定される。
(a)配列番号1に示すアミノ酸配列を含むペプチド、
(b)配列番号1のアミノ酸配列において、1または複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ前記ポリスチレン粒子と結合する活性を有するペプチド。
(c)配列番号5に示すアミノ酸配列を含むペプチド、
(d)配列番号5のアミノ酸配列において、1または複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ前記ポリプロピレン粒子と結合する活性を有するペプチド。
本発明の蛍光色素は、本発明のペプチドと結合して複合体を形成することにより、本発明のペプチドを標識する。当該複合体の形成については後述する。本発明の蛍光色素としては特に限定されず、適宜、公知の蛍光色素を用いることが可能である。本発明の蛍光色素としては、例えば、Cy3、Cy5、PE(phycoerythrin)、FITC(fluorescein isothiocyanete)、フルオロセイン、DyLight(登録商標)488、AlexaFluor(登録商標)488、ATTO(登録商標)488、CF(登録商標)488、CF(登録商標)488A、DyLight(登録商標)550、CF(登録商標)555、Cy2、ローダミングリーン、ローダミン、Alexa Fluor(登録商標)546、Alexa Fluor(登録商標)555、Alexa Fluor(登録商標) 568、Alexa Fluor(登録商標)594、CF(登録商標)568、CF(登録商標)594、DY547等を挙げることができる。また、ストークシフトの大きい蛍光色素であるDY480XL、DY485XLおよびDyLight(登録商標)510-LS等は、自然界には殆ど存在しない特徴的な蛍光波長を有する。そのためこれらの蛍光色素は、自然界の物質が有する自家蛍光と識別が容易である。したがって、本発明のプラスチック粒子を検出するための試料に自家蛍光を発する粒子が多く含まれている場合に、これらのストークシフトの大きい蛍光色素が、本発明の蛍光色素として好ましい。なお、本発明の蛍光色素はこれらに限定されない。
ここで、図1を用いて、本発明のペプチドおよび本発明の蛍光色素の一例を簡潔に説明する。図1は、本発明のペプチドと本発明の蛍光色素との第2の複合体の一例を示す概略図である。図1に示すように、例えば、ビオチンを結合させた本発明のペプチド(プラスチック結合ペプチド)と、ストレプトアビジンとを結合させた本発明の蛍光色素を用いることで、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を介して、本発明のペプチドと本発明の蛍光色素との第2の複合体を形成することが可能である。ストレプトアビジンは4量体を形成する性質を有しているため、1つの「蛍光色素と結合したストレプトアビジン」に対して4つの「ペプチドに結合したビオチン」が結合して第2の複合体を形成する。1つの第2の複合体は、4つのペプチドを介してプラスチック粒子に結合することができるので、第2の複合体とプラスチック粒子との間の結合力が極めて高くなる。したがって、第2の複合体を用いれば、極めて高感度にてプラスチック粒子を検出することができる。
(混合工程)
混合工程では、本発明のプラスチック粒子と、該プラスチック粒子に結合するペプチドと、前記ペプチドと結合する蛍光色素と、を混合し、前記プラスチック粒子と、前記ペプチドと、前記蛍光色素との、第1の複合体を形成させる。
検出工程では、前記混合工程において形成された、本発明のプラスチック粒子と、本発明のペプチドと、本発明の蛍光色素との第1の複合体を検出する。本工程において、蛍光顕微鏡等を用いて、第1の複合体を検出することができる。
本発明の一実施形態に係る、長径が360nm以下のプラスチック粒子の判別方法(以降、適宜「本発明の判別方法」という)は、上述した本発明の検出方法により検出されたプラスチック粒子が明視野の光学顕微鏡下で観察可能か否かにより、検出されたプラスチック粒子の長径が360nm以下であるか否かを判別する判別工程を含んでいてもよい。なお、本発明の判別方法は、該判別工程に加え、上述した本発明の検出方法に含まれる混合工程および検出工程を含む。判別工程は、該検出工程により検出されたプラスチック粒子に対して行われる。混合工程および検出工程については、〔1.プラスチック粒子の検出方法〕で説明しているため、説明を繰り返さない。
判別工程の一例を、以下に簡潔に説明する。まず、上述の検出工程において、蛍光装置を備えた光学顕微鏡により、第1の複合体を検出する。このような顕微鏡として、明視野での分解能を最大限に確保する観点から、例えば位相差顕微鏡用コンデンサおよび蛍光装置を備えた光学顕微鏡(位相差蛍光顕微鏡)または両者を備えた偏光顕微鏡等を用いることが好ましい。暗視野での蛍光検出による第1の複合体の検出後、蛍光から明視野観察用の透過光へと、上述の顕微鏡の光路を切り換える。切り換え後、暗視野で蛍光発色が認められたが、明視野では視認できなかった物質は、長径360nm以下のプラスチック粒子であると判別できる。一方、暗視野で蛍光発色が認められ、かつ明視野でも視認された物質は、マイクロプラスチック粒子等の可視光においても視認できる長径を有するプラスチック粒子であると判別できる。
本発明の一実施形態に係る、プラスチック粒子の検出キット(以降、「本発明のキット」と称する)は、本発明のペプチドおよび本発明の蛍光色素を含む、長径が360nm以下であり、かつ前記式(1)で示される構造を有するプラスチック粒子を検出する。〔1.プラスチック粒子の検出方法〕で説明した事項については、本実施形態においてこれを援用する。
(プラスチック粒子の検出方法)
<A:混合工程>
ポリスチレン粒子に結合するペプチドとして、アミノ酸配列RIIIRRIRR(配列番号1)を含むペプチドを採用した。また、ポリプロピレン粒子に結合するペプチドとして、アミノ酸配列SMKYSHSTAPAL(配列番号5)を含むペプチドを採用した。上述の各配列のC末端側に、リンカーとなるアミノ酸配列GGGSGGGSGGGS(配列番号10)を付加し、さらにそのC末端側にビオチンを付加したペプチドを化学合成により作製した。
第1の複合体を含む溶液をスライドガラス上に滴下した後、カバーガラスをスライドガラス上に載せ、蛍光顕微鏡BZ-9000(Keyence社)を用いて、蛍光観察を行った。なおこの際、用いた蛍光色素に合わせて適切な蛍光フィルターを使用して、蛍光観察を行った。
結果を図2から図5に示す。図2から図4は、ポリスチレン粒子の、顕微鏡観察の結果を示す図である。図5は、ポリプロピレン粒子の、顕微鏡観察の結果を示す図である。なお、図2から図5の、符号1、3、5および7は明視野の像を示す。一方、図2から図5の、符号2、4、6および8は暗視野の像を示す。
(ナノプラスチック粒子の判別方法)
実施例1の<A:混合工程>と同様の手順で、第2の複合体を含む標識用組成物を調製した。続いて、実施例1の<A:混合工程>と同様の手順で、該標識用組成物を含む溶液を希釈し、希釈後の溶液と、長径が3μmのポリスチレン粒子および50nmのポリスチレン粒子とを混合し、第1の複合体を含む溶液を得た。同様に、希釈後の溶液と長径が3μmのポリスチレン粒子とを混合し、第1の複合体を含む溶液を得た。また、比較例として、ポリスチレン粒子を含まない溶液を作製した。そして、実施例1の<B:検出工程>と同様の手順で、それぞれ蛍光観察を行った。
(第2の複合体を用いたプラスチック粒子の検出方法の感度評価)
実施例1の<A:混合工程>と同様の手順で、アミノ酸配列RIIIRRIRR(配列番号1)を含むペプチドを用いた、第2の複合体を含む標識用組成物を調製した。さらに、実施例1の<A:混合工程>と同様の手順で、該標識用組成物を含む溶液を希釈し、ポリスチレン粒子と混合することにより、第1の複合体を含む溶液(標識用組成物サンプル)を得た。
Claims (8)
- 前記プラスチック粒子は、長径が360nm以下である、請求項1に記載のプラスチック粒子の検出方法。
- 前記混合工程では、前記ペプチドと、前記蛍光色素との第2の複合体を含む標識用組成物を、前記プラスチック粒子と混合する、請求項1または2に記載のプラスチック粒子の検出方法。
- 前記ペプチドは、ビオチンが結合しており、前記蛍光色素は、ストレプトアビジンが結合している、請求項1から3の何れか1項に記載のプラスチック粒子の検出方法。
- 前記蛍光色素としてCy3を用いる、請求項1から4の何れか1項に記載のプラスチック粒子の検出方法。
- 前記ペプチドは、以下の(a)または(b)の何れかに示すペプチドであり、
前記プラスチック粒子は、ポリスチレン粒子である、請求項1から5の何れか1項に記載のプラスチック粒子の検出方法;
(a)配列番号1に示すアミノ酸配列を含むペプチド、
(b)配列番号1のアミノ酸配列において、1または複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ前記ポリスチレン粒子と結合する活性を有するペプチド。 - 前記ペプチドは、以下の(c)または(d)の何れかに示すペプチドであり、
前記プラスチック粒子は、ポリプロピレン粒子である、請求項1から5の何れか1項に記載のプラスチック粒子の検出方法;
(c)配列番号5に示すアミノ酸配列を含むペプチド、
(d)配列番号5のアミノ酸配列において、1または複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ前記ポリプロピレン粒子と結合する活性を有するペプチド。
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