JP7475586B2 - Method for screening immunosuppressants - Google Patents
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Description
本発明は、免疫抑制剤のスクリーニング方法に関し、更に詳しくは、カイコの菌による感染死の程度を利用した免疫抑制剤のスクリーニング方法に関するものである。 The present invention relates to a method for screening immunosuppressants, and more specifically, to a method for screening immunosuppressants that utilizes the degree of death of silkworms due to bacterial infection.
免疫抑制剤は、免疫の過剰亢進、又は、免疫応答を抑制する目的で、様々な炎症性疾患の治療や臓器移植の際において用いられている（非特許文献１）。
一方で、免疫の過剰亢進等に起因する炎症性疾患に苦しむ患者は多く、新しい免疫抑制剤による治療効果の改善が求められている。
Immunosuppressants are used in the treatment of various inflammatory diseases and in organ transplants for the purpose of suppressing excessive immune activation or immune responses (Non-Patent Document 1).
On the other hand, many patients suffer from inflammatory diseases caused by overactive immune systems, and there is a demand for new immunosuppressants to improve the therapeutic effects.
現在用いられている免疫抑制剤は、免疫担当細胞の機能を抑制するもの、サイトカイン等の産生を抑制するもの、細胞毒性を示すもの等と言ったカテゴリーに分類することができる（非特許文献１、２）。
また、近年では、免疫担当細胞が発現する分子を標的とした抗体による医薬品も開発が進んでいる。
Immunosuppressants currently in use can be classified into categories such as those that suppress the function of immunocompetent cells, those that suppress the production of cytokines, etc., and those that exhibit cytotoxicity (Non-Patent Documents 1 and 2).
In recent years, there has also been progress in the development of antibody-based pharmaceuticals that target molecules expressed by immune cells.
しかしながら、これらのスクリーニングは、主に試験管内で行われるため、候補化合物の体内動態や毒性（ＡＤＭＥＴ）を探索（スクリーニング）の初期段階で考慮することが難しく、研究開発上の課題となっている。 However, because these screening methods are mainly performed in vitro, it is difficult to take into account the pharmacokinetics and toxicity (ADMET) of candidate compounds at the early stages of discovery (screening), which poses a challenge in research and development.
上記の問題を解決するために、カイコを用いたスクリーニング系があり、実際、カイコ感染症モデルを用いた抗菌化合物のスクリーニングにおいて、脊椎動物において良好な治療成績を示す新規抗菌化合物の同定に至っている（特許文献１）。すなわち、カイコとヒト等の哺乳類では、体内動態が近似していることが確かめられている。 To solve the above problems, a screening system using silkworms has been developed. In fact, screening for antibacterial compounds using a silkworm infection model has led to the identification of a new antibacterial compound that shows good therapeutic results in vertebrates (Patent Document 1). In other words, it has been confirmed that the pharmacokinetics of silkworms are similar to that of mammals such as humans.
また、本発明者らは、菌の細胞壁画分を生きたカイコの血液に注射すると、自然免疫活性化に伴って麻痺ペプチドと呼ばれるサイトカインの成熟が引き起こされ、その結果として、カイコの筋肉が収縮することを見出し、かかるカイコ筋肉収縮系による自然免疫活性評価法を用いて、ヒト等の自然免疫を活性化する物質を定量的に評価・スクリーニングできることを確かめている（特許文献２、非特許文献３、４）。
すなわち、特許文献２には、カイコに被検物質を投与する工程、及び、該被検物質がカイコの筋肉を収縮させるか否かを評価する工程を含む「被検物質が自然免疫を活性化させるか否かを評価する方法」が記載されている。
Furthermore, the inventors have found that injecting a cell wall fraction of the fungus into the blood of live silkworms induces the maturation of cytokines known as paralytic peptides, accompanied by activation of the innate immune system, resulting in contraction of the silkworm's muscles. They have confirmed that a method for evaluating innate immune activity using the silkworm muscle contraction system can be used to quantitatively evaluate and screen substances that activate the innate immune system of humans and other organisms (Patent Document 2, Non-Patent Documents 3 and 4).
That is, Patent Document 2 describes a "method for evaluating whether or not a test substance activates natural immunity" that includes a step of administering a test substance to silkworms and a step of evaluating whether the test substance causes the silkworms to contract their muscles.
また、カイコ個体の死に関しても、本発明者らによる特許文献３には、哺乳類に対して細胞毒性を示す被検対象物を評価する方法として、カイコに投与してＬＤ５０値を算定して哺乳類のＬＤ５０値の代替値とすることが記載されている。 Furthermore, with regard to the death of individual silkworms, Patent Document 3 by the present inventors describes a method for evaluating test substances that exhibit cytotoxicity in mammals, in which the substance is administered to silkworms, the LD50 value is calculated, and this is used as a substitute for the LD50 value in mammals.
しかし、免疫抑制剤（の候補となり得る物質）のスクリーニング方法においては、探索初期の段階から体内動態をも加味して免疫抑制剤をスクリーニングする有効な方法は少なく、そのような免疫抑制剤のスクリーニング方法が望まれていた。 However, there are few effective screening methods for immunosuppressants (or substances that could be candidates) that take into account pharmacokinetics from the early stages of the search, and there is a demand for such screening methods.
本発明は上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、優れた「免疫抑制剤のスクリーニング方法」を提供することにある。 The present invention has been made in view of the above background art, and its objective is to provide an excellent "method for screening immunosuppressants."
本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、カイコは、様々な菌Ａにより感染死するという事実を見出した。そして更に検討を進め、被験物質をカイコに投与しておくと、又は、菌Ｂでカイコを感染させておくと、該菌Ａによる感染死が促進されることを見出した。
そして、ヒトの免疫を抑制するものとして既に知られている「物質」や「菌感染」や「高温ストレス、飢餓ストレス等のストレス」で、実際に上記した「菌Ａによるカイコの感染死」が促進されることをも見出すことによって、該方法がヒトに対する免疫抑制剤のスクリーニング方法として有力であることを確認して本発明を完成するに至った。
As a result of intensive research aimed at solving the above problems, the present inventors have found that silkworms die from infection with various types of bacteria A. Further research has revealed that administering a test substance to silkworms or infecting silkworms with bacteria B promotes infection and death by the bacteria A.
Furthermore, the inventors discovered that the above-mentioned "infection and death of silkworms by Bacterium A" is actually promoted by "substances,""bacterialinfection," and "stresses such as high temperature stress and starvation stress" that are already known to suppress the human immune system. This confirmed the usefulness of this method as a screening method for immunosuppressants for humans, and led to the completion of the present invention.
すなわち、本発明は、カイコに感染死をもたらす菌Ａをカイコに投与して該カイコの生存率を測定するスクリーニング方法であって、
被験物質を投与していないときのカイコの生存率に比較して、被験物質を投与しているときのカイコの生存率が小さくなる被験物質を免疫抑制剤として選択することを特徴とする免疫抑制剤のスクリーニング方法を提供するものである。
That is, the present invention provides a screening method for measuring the survival rate of silkworms by administering to the silkworms a bacterium A that causes infection and death of the silkworms, comprising the steps of:
The present invention provides a method for screening immunosuppressants, which comprises selecting, as an immunosuppressant, a test substance that reduces the survival rate of silkworms when the test substance is administered compared to the survival rate of silkworms when the test substance is not administered.
また、本発明は、カイコに感染死をもたらす菌Ａをカイコに投与した際の菌ＡのＬＤ５０を測定するスクリーニング方法であって、
被験物質を投与していないときのカイコのＬＤ５０に比較して、被験物質を投与しているときの菌ＡのＬＤ５０が小さくなる被験物質を免疫抑制剤として選択することを特徴とする免疫抑制剤のスクリーニング方法を提供するものである。
The present invention also provides a screening method for measuring the LD50 of Bacterium A, which causes infection and death in silkworms, when Bacterium A is administered to silkworms, comprising the steps of:
The present invention provides a method for screening immunosuppressants, which comprises selecting, as an immunosuppressant, a test substance that reduces the LD50 of bacteria A when the test substance is administered compared to the LD50 of silkworms when the test substance is not administered.
また、本発明は、以下の工程（１）ないし（５）
（１）被験物質を、複数のカイコよりなるカイコ群に投与する工程
（２）対照物質を、複数のカイコよりなるカイコ群に投与する工程
（３）カイコに感染死をもたらす菌Ａを、上記工程（１）を行ったカイコ群に投与して、該カイコ群の生存率、又は、菌ＡによるＬＤ５０を測定する工程
（４）カイコに感染死をもたらす菌Ａを、上記工程（２）を行ったカイコ群に投与して、該カイコ群の生存率、又は、菌ＡによるＬＤ５０を測定する工程
（５）工程（３）で測定される生存率又はＬＤ５０の方が、工程（４）で測定される生存率又はＬＤ５０より小さくなる被験物質を免疫抑制剤として選択する工程
の全ての工程を有する前記の免疫抑制剤のスクリーング方法を提供するものである。
The present invention also relates to a method for producing a pharmaceutical composition comprising the steps of:
(1) administering a test substance to a group of silkworms consisting of a plurality of silkworms; (2) administering a control substance to a group of silkworms consisting of a plurality of silkworms; (3) administering a bacterium A that causes infection and death in silkworms to the group of silkworms subjected to the above-mentioned step (1) and measuring the survival rate of the group of silkworms or the LD50 of the bacterium A; (4) administering a bacterium A that causes infection and death in silkworms to the group of silkworms subjected to the above-mentioned step (2) and measuring the survival rate of the group of silkworms or the LD50 of the bacterium A; (5) selecting as an immunosuppressant a test substance for which the survival rate or LD50 measured in step (3) is smaller than the survival rate or LD50 measured in step (4).
また、本発明は、前記の免疫抑制剤のスクリーニング方法を用いることを特徴とする免疫担当細胞の機能抑制剤のスクリーニング方法、サイトカイン産生抑制剤のスクリーニング方法、又は、細胞毒性物質のスクリーニング方法を提供するものである。 The present invention also provides a method for screening for an immunocompetent cell function inhibitor, a method for screening for a cytokine production inhibitor, or a method for screening for a cytotoxic substance, which is characterized by using the above-mentioned method for screening for an immunosuppressant.
本発明によれば、免疫担当細胞の機能を抑制する物質、サイトカインの産生を抑制する物質、細胞毒性を有する物質等と言った「免疫機能を抑制する物質」を、カイコを用いて好適にスクリーニングすることができる。
ここでの「免疫機能」とは、ヒト等の哺乳類が有する免疫機能のことであり、具体的には、例えば、ヒト等の哺乳類が有する自然免疫機能であったり、獲得免疫の獲得し易さであったりする。
According to the present invention, "substances that suppress immune function," such as substances that suppress the function of immunocompetent cells, substances that suppress the production of cytokines, and substances that have cytotoxicity, can be suitably screened using silkworms.
Here, "immune function" refers to the immune function possessed by mammals such as humans, and specifically, for example, the innate immune function possessed by mammals such as humans, or the ease of acquiring adaptive immunity.
ある物質の「カイコに対する免疫活性能」が、該物質の「ヒト等の哺乳類が有する免疫活性能」と相関があることは、既に本発明者らによって報告されている。
また、カイコ感染モデルを用いて、哺乳類における抗菌活性が評価可能であることも、既に本発明者らによって報告されている。
本発明は、カイコを利用した免疫抑制剤のスクリーニング方法であり、カイコを用いて行われた検討結果に基づいてなされたものであるが、ヒト等の哺乳類における免疫抑制剤のスクリーニング方法として成立する。
The present inventors have already reported that the "immunoactivity of a substance in silkworms" correlates with the "immunoactivity of a substance in mammals such as humans."
In addition, the present inventors have already reported that antibacterial activity in mammals can be evaluated using a silkworm infection model.
The present invention is a screening method for immunosuppressants using silkworms, and was made based on the results of studies conducted using silkworms, but it can also be used as a screening method for immunosuppressants in mammals such as humans.
本発明において、（１）高温ストレス、（２）飢餓ストレス、（３）クリプトコッカス感染、及び、（４）ヒトで抗炎症性ステロイドとして用いられているベタメタゾン（betamethasone）の投与が、カイコの黄色ブドウ球菌に対する感染感受性を増大させることが分かった。
具体的には、黄色ブドウ球菌ＭＳＳＡ１株のＬＤ５０値で測られるカイコの感染感受性は、上記した処理によって、それぞれ、（１）１００倍程度、（２）２０倍程度、（３）６４倍以上、（４）１００倍程度の増大が見られた（実施例参照）。
In the present invention, it was found that (1) high temperature stress, (2) starvation stress, (3) cryptococcus infection, and (4) administration of betamethasone, which is used as an anti-inflammatory steroid in humans, increase the susceptibility of silkworms to infection with Staphylococcus aureus.
Specifically, the infection susceptibility of silkworms, as measured by the LD50 value of Staphylococcus aureus MSSA1 strain, was increased by (1) approximately 100-fold, (2) approximately 20-fold, (3) more than 64-fold, and (4) approximately 100-fold as a result of the above-mentioned treatments (see Examples).
上記の結果は、ヒトの免疫機能を低下させる上記の処理が何れも、カイコの免疫機能をも抑制することを示している。
従って、カイコの免疫を抑制する物質（をスクリーニングする方法）が見いだされたならば、該方法はヒト等の哺乳類の免疫を抑制する物質（をスクリーニングする方法）となり得ることが確認された。
特に、ヒトで免疫抑制作用が知られているベタメタゾン（betamethasone）が、カイコに対しても免疫抑制作用を示したことから、カイコをヒトの免疫抑制剤のスクリーニングに用いることができることが確認された。
The above results indicate that any of the above treatments that reduce immune function in humans also suppress immune function in silkworms.
Therefore, it was confirmed that if a substance that suppresses the immunity of silkworms (a method for screening for such a substance) is found, the method can also be used as a method for screening for a substance that suppresses the immunity of mammals such as humans.
In particular, betamethasone, which is known to have immunosuppressant effects in humans, also exhibited immunosuppressant effects in silkworms, confirming that silkworms can be used to screen for human immunosuppressants.
カイコを用いた免疫抑制剤のスクリーニングは、試験管内でのスクリーニング系とは異なり、候補化合物の体内動態や毒性（ＡＤＭＥＴ）を考慮（加味）できているという利点がある。
また、候補化合物の体内動態や毒性（ＡＤＭＥＴ）を探索（スクリーニング）の初期段階で考慮することができるので、本発明によって、新しい免疫抑制剤の探索が可能になる。従来のスクリーニング方法では漏らしていた（新免疫抑制剤として発見・発明できていなかった）例えば「免疫抑制効果は極めて高い訳ではないが体内動態が良好な物質」を、「免疫抑制剤」として選択する（漏らさない）ことができる。
Screening of immunosuppressants using silkworms has the advantage that, unlike in vitro screening systems, it is possible to take into account the pharmacokinetics and toxicity (ADMET) of the candidate compounds.
In addition, since the pharmacokinetics and toxicity (ADMET) of candidate compounds can be taken into consideration at the early stage of the search (screening), the present invention makes it possible to search for new immunosuppressants. For example, it is possible to select (not miss) as an "immunosuppressant" a "substance with good pharmacokinetics, even though it does not have an extremely high immunosuppressive effect," which would have been missed (not discovered or invented as a new immunosuppressant) by conventional screening methods.
本発明によれば、「生きたカイコの体内の作用・機構」を利用しているので、被験物質の体内動態をも加味したスクリーニングが可能である。そのため、被験物質が多い初期のスクリーニングの段階から、「体内動態の良さ」をも加味した免疫抑制剤のスクリーニングが可能である。
例えば、「免疫機能が過剰亢進した際の症状」を治療する剤を、初期の段階からスクリーニングすることが可能である。それによって、例えば、ヒトでの治験の最終段階で不合格となる確率を減らすことができる。
According to the present invention, since the "intracellular action and mechanism of living silkworms" is utilized, screening that also takes into account the pharmacokinetics of the test substance is possible. Therefore, it is possible to screen immunosuppressants that also take into account "good pharmacokinetics" from the early screening stage when there are many test substances.
For example, it is possible to screen for agents that treat "symptoms of overactive immune function" at an early stage, thereby reducing the chance of failure at the final stage of clinical trials in humans.
本発明によって、新しい免疫抑制剤をスクリーニングする道が拓け、カイコを用いた免疫抑制モデルを構築することができた。
本発明のスクリーニング方法は、少数の「最終的に免疫活性剤として（確実に）成立する物質」のスクリーニングに適用することもできるが、特に、免疫抑制剤の絞り込みの初期段階に適用することは、本発明の前記効果を発揮し易いために好ましい。従って、本発明は、「免疫抑制剤の候補となり得る物質」のスクリーニング方法であるとも言える。
The present invention has opened the way to screening for new immunosuppressants and enabled the construction of an immunosuppression model using silkworms.
Although the screening method of the present invention can be applied to the screening of a small number of "substances that will (definitely) ultimately become immunostimulants," it is particularly preferable to apply the method to the early stage of narrowing down immunosuppressants, since the above-mentioned effects of the present invention are easily exhibited. Therefore, the present invention can also be said to be a screening method for "substances that can be candidates for immunosuppressants."
また、カイコを用いているので、実験動物に対する道義的な問題も少ない。また、カイコを用いているので、犠牲となる被験物質の多い初期のスクリーニング段階でも、道義的問題が生じ難いので有用である。 In addition, because silkworms are used, there are fewer ethical issues regarding experimental animals.In addition, because silkworms are used, there are fewer ethical issues even in the early screening stage, when many test substances are sacrificed, making it useful.
以下、本発明について説明するが、本発明は、以下の具体的態様に限定されるものではなく、技術的思想の範囲内で任意に変形することができる。 The present invention is described below, but is not limited to the specific embodiments below and can be modified as desired within the scope of the technical concept.
本発明の「免疫抑制剤のスクリーニング方法」は、カイコに感染死をもたらす菌Ａをカイコに投与して該カイコの生存率又は菌ＡのＬＤ５０を測定する免疫抑制剤のスクリーニング方法であって、被験物質を投与していないときのカイコの生存率又は菌ＡのＬＤ５０に比較して、被験物質を投与しているときのカイコの生存率又は菌ＡのＬＤ５０が小さくなる被験物質を免疫抑制剤として選択することを特徴とする。 The "method for screening immunosuppressants" of the present invention is a method for screening immunosuppressants in which bacterium A, which causes infection and death in silkworms, is administered to the silkworms and the survival rate of the silkworms or the LD50 of bacterium A is measured, and is characterized in that a test substance that reduces the survival rate of silkworms or the LD50 of bacterium A when the test substance is administered compared to the survival rate of silkworms or the LD50 of bacterium A when the test substance is not administered is selected as an immunosuppressant.
ここで、菌Ａとしては、カイコに感染してカイコ個体を殺す菌であれば特に限定はないが、ヒトに対する安全性、汎用性、扱いの容易性等の点から、例えば、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、大腸菌、カンジダ菌等が挙げられる。中でも、黄色ブドウ球菌が好ましく、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（methicillin-susceptible Staphylococcus aureus：ＭＳＳＡ）（以下、単に「ＭＳＳＡ」と略記することがある）が、上記点から特に好ましい。 The bacterium A is not particularly limited as long as it infects silkworms and kills the individual silkworms, but examples of the bacterium A include Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Candida, etc., from the standpoints of safety for humans, versatility, ease of handling, etc. Among them, Staphylococcus aureus is preferred, and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus (MSSA) (hereinafter sometimes simply abbreviated as "MSSA") is particularly preferred from the above standpoints.
ここで、「菌Ａのカイコへの投与」としては、カイコの体内に菌Ａの生菌を入れてカイコを感染させればよく、特に限定はないが、カイコの血液、腸管内等への注射、餌への配合（菌液の滴下若しくは餌への混入）等が好ましい。
注射の場合、菌Ａを溶媒若しくは分散媒中に分散させた液を用いることが好ましく、該液の１回の投与体積は、カイコ１ｇあたり、１～２００μＬ／ｇが好ましく、５～１５０μＬ／ｇがより好ましく、２０～１００μＬ／ｇが特に好ましい。
Here, "administration of Bacterium A to silkworms" refers to any method that involves introducing live bacteria of Bacterium A into the body of the silkworm to infect the silkworm. Although there are no particular limitations, preferred methods include injection into the blood or intestinal tract of the silkworm, incorporation into feed (dropping a liquid of the bacteria or mixing it into feed), etc.
In the case of injection, it is preferable to use a liquid in which the bacteria A is dispersed in a solvent or dispersion medium, and the volume of the liquid administered at one time is preferably 1 to 200 μL/g, more preferably 5 to 150 μL/g, and particularly preferably 20 to 100 μL/g, per 1 g of silkworms.
菌Ａ自体の投与量は、カイコに感染させて好適に生存率やＬＤ５０が測定できるような範囲であればよく、菌Ａの種類にもより特に限定はないが、菌Ａが黄色ブドウ球菌のとき、カイコ１ｇあたり、Full Growth で、１／１００００～無希釈（１／１）が好ましく、１／３０００～１／３がより好ましく、１／１０００～１／１０が更に好ましく、１／３００～１／３０が特に好ましい。上記範囲で投与量を振って好適に生存率やＬＤ５０を求めることが好ましい。 The dosage of the bacterium A itself may be within a range that allows the survival rate and LD50 to be suitably measured by infecting silkworms, and there is no particular limitation on the type of bacterium A. However, when the bacterium A is Staphylococcus aureus, the dosage is preferably 1/10,000 to undiluted (1/1) per gram of silkworms at full growth, more preferably 1/3,000 to 1/3, even more preferably 1/1,000 to 1/10, and particularly preferably 1/300 to 1/30. It is preferable to appropriately determine the survival rate and LD50 by varying the dosage within the above range.
本発明を実施中の、すなわち、カイコの生存率やＬＤ５０を測定中、カイコの飼育温度、カイコへの給餌の有無と給餌量、測定（経過）時間（日数）等は、特に限定はないが、飼育温度は、一定であることが好ましく、７～４５℃がより好ましく、１０～４０℃がより好ましく、２０～３５℃が特に好ましい。 While carrying out the present invention, i.e., while measuring the survival rate and LD50 of the silkworms, there are no particular limitations on the temperature at which the silkworms are reared, whether or not the silkworms are fed and the amount of feeding, the measurement (elapsed) time (days), etc., but it is preferable that the rearing temperature is constant, more preferably 7 to 45°C, even more preferably 10 to 40°C, and particularly preferably 20 to 35°C.
菌Ａの投与から、生存率の測定まで、又は、菌ＡによるＬＤ５０の測定までの経過時間（日数）は、０．５日～４日が好ましく、１日～３日がより好ましく、１．５日～２．５日が特に好ましい。上記経過時間（日数）の範囲内の１点の経過時間（日数）であれば、死ぬはずのカイコは死に、生き残るはずのカイコは生き残るので、生存率やＬＤ５０が時間経過に対して飽和して値が安定する。また、不必要に長くなって時間が無駄にならない。 The time (number of days) that elapses from administration of Bacterium A to measurement of survival rate or measurement of LD50 by Bacterium A is preferably 0.5 to 4 days, more preferably 1 to 3 days, and particularly preferably 1.5 to 2.5 days. If the time (number of days) that elapses is within the above range of elapsed times (number of days), silkworms that should die will die and silkworms that should survive will survive, so that survival rate and LD50 will saturate over time and the values will stabilize. In addition, time will not be wasted by being unnecessarily long.
前記被験物質としては、免疫抑制剤（の候補）になり得る可能性が少しでもあるもの（スクリーニングの対象となり得るもの）であれば特に限定はなく、菌等の生物でもウイルスでも無生物でもよく、単一化合物でも混合物でもよく、液体でも固体でもよい。
また、該被験物質が菌Ｂであって、前記「被験物質の投与」が、カイコを該菌Ｂに感染させることであってもよい。すなわち、菌Ｂをカイコに投与して、該カイコを菌Ｂに感染させることでもよい。
The test substance is not particularly limited as long as it has even the slightest possibility of being an immunosuppressant (a candidate for an immunosuppressant) (i.e., can be the subject of screening), and may be a living organism such as a bacterium, a virus, or a non-living organism, a single compound or a mixture, and a liquid or a solid.
In addition, the test substance may be the bacterium B, and the "administration of the test substance" may be infecting the silkworm with the bacterium B. That is, the bacterium B may be administered to the silkworm to infect the silkworm with the bacterium B.
具体的には、免疫担当細胞の機能を抑制しそうな物質、サイトカインの産生を抑制しそうな物質、細胞毒性を有していそうな物質、抗生物質の探索に用いられる細菌培養上清等に含まれる二次代謝産物、化合物ライブラリー中の物質等が挙げられる。また、上記可能性の有無は分からないが、ある化学構造や官能基を有する物質群から選ばれる物質等が挙げられる。また、該物質としては、化合物に限定されず、菌Ｂ若しくは菌Ｂ由来物であってもよい。 Specific examples include substances that may suppress the function of immune cells, substances that may suppress the production of cytokines, substances that may have cytotoxicity, secondary metabolites contained in bacterial culture supernatants used in the search for antibiotics, substances in compound libraries, etc. In addition, examples include substances selected from a group of substances that have a certain chemical structure or functional group, although it is not known whether or not they have the above-mentioned potential. In addition, the substance is not limited to compounds, and may be Bacillus subtilis or a substance derived from Bacillus subtilis.
前記被験物質としては、菌Ｂ若しくは菌Ｂ由来物であることが好ましい。
ここで、「菌Ｂ」には、菌Ｂの生菌と死菌が含まれ、例えば、生菌体、湿潤菌、乾燥菌等が含まれる。
また、「菌Ｂ由来物」としては、菌Ｂの一部分（菌Ｂを構成する部分）、菌Ｂの産生物、菌Ｂに何らかの処理を施した菌体処理物等が挙げられる。
菌Ｂ由来物の具体例としては、例えば、菌Ｂの培養上清物等の培養物；懸濁物；希釈物；濃縮物；ペースト化物；噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物等の乾燥物；液状化物；希釈物；破砕物；加熱殺菌処理物、放射線殺菌処理物等の殺菌加工物；該培養物からの抽出物；酵素処理物；等が挙げられる。
The test substance is preferably Bacillus subtilis or a substance derived from Bacillus subtilis.
Here, "bacterium B" includes live and dead bacteria of bacterium B, for example, live bacteria, wet bacteria, dry bacteria, etc.
Furthermore, examples of "substances derived from bacteria B" include parts of bacteria B (parts that constitute bacteria B), products of bacteria B, and treated bacteria bodies obtained by subjecting bacteria B to some kind of treatment.
Specific examples of products derived from Bacterium B include cultures such as culture supernatants of Bacterium B; suspensions; dilutions; concentrates; pastes; dried products such as spray-dried products, freeze-dried products, vacuum-dried products, and drum-dried products; liquefied products; dilutions; crushed products; sterilized products such as heat-sterilized products and radiation-sterilized products; extracts from the cultures; and enzyme-treated products.
本発明は、前記被験物質が菌Ｂであって、「被験物質の投与」が、カイコを該菌Ｂに感染させることである前記の免疫抑制剤のスクリーニング方法でもある。
このとき、該菌Ｂとしては、例えば、土壌細菌、海洋細菌、河川細菌、発酵用細菌、人体又は動植物常在菌等が好ましいものとして挙げられる。中でも、土壌細菌が、多様性並びに取得の容易性の点等から特に好ましい。
The present invention also relates to the method for screening an immunosuppressant, wherein the test substance is Bacterium B, and "administration of the test substance" comprises infecting silkworms with Bacterium B.
In this case, preferred examples of the bacteria B include soil bacteria, marine bacteria, river bacteria, fermentation bacteria, and bacteria normally present in the human body or animals and plants. Among these, soil bacteria are particularly preferred in terms of diversity and ease of acquisition.
本発明の好ましい態様を工程別に記載すると、以下の工程（１）ないし工程（５）となる。本発明は、好ましくは、以下の工程（１）ないし工程（５）の全ての工程を有する前記の免疫抑制剤のスクリーング方法である。
（１）被験物質を、複数のカイコよりなるカイコ群に投与する工程
（２）対照物質を、複数のカイコよりなるカイコ群に投与する工程
（３）カイコに感染死をもたらす菌Ａを、上記工程（１）を行ったカイコ群に投与して、該カイコ群の生存率、又は、菌ＡによるＬＤ５０を測定する工程
（４）カイコに感染死をもたらす菌Ａを、上記工程（２）を行ったカイコ群に投与して、該カイコ群の生存率、又は、菌ＡによるＬＤ５０を測定する工程
（５）工程（３）で測定される生存率又はＬＤ５０の方が、工程（４）で測定される生存率又はＬＤ５０より小さくなる被験物質を免疫抑制剤として選択する工程
A preferred embodiment of the present invention can be described by each step as follows: Step (1) to Step (5). The present invention is preferably the above-mentioned method for screening an immunosuppressant, which comprises all of the following steps (1) to (5).
(1) A step of administering a test substance to a group of silkworms consisting of a plurality of silkworms; (2) A step of administering a control substance to a group of silkworms consisting of a plurality of silkworms; (3) A step of administering a bacterium A that causes infection and death in silkworms to the group of silkworms subjected to the above step (1) and measuring the survival rate of the group of silkworms or the LD50 of the bacterium A; (4) A step of administering a bacterium A that causes infection and death in silkworms to the group of silkworms subjected to the above step (2) and measuring the survival rate of the group of silkworms or the LD50 of the bacterium A; (5) A step of selecting, as an immunosuppressant, a test substance for which the survival rate or LD50 measured in step (3) is smaller than the survival rate or LD50 measured in step (4).
＜工程（１）＞
工程（１）は、被験物質を、複数のカイコよりなるカイコ群に投与する工程である。
工程（１）における被験物質としては、前記したものが挙げられる。
また、投与量としては、特に限定はないが、溶液又は分散液として実際にカイコに投与するときの該液の１回の体積としては、カイコ１ｇあたり、１～２００μＬ／ｇが好ましく、５～１５０μＬ／ｇがより好ましく、２０～１００μＬ／ｇが特に好ましい。
<Step (1)>
Step (1) is a step of administering a test substance to a group of silkworms consisting of a plurality of silkworms.
The test substance in step (1) includes those mentioned above.
The dosage is not particularly limited, but the volume of the liquid at one time when actually administered to silkworms as a solution or dispersion is preferably 1 to 200 μL/g, more preferably 5 to 150 μL/g, and particularly preferably 20 to 100 μL/g per 1 g of silkworms.
被験物質が、菌Ｂ若しくは菌Ｂ由来物の場合、菌Ｂ若しくは菌Ｂ由来物を溶媒若しくは分散媒中に分散させた液を用いることが好ましい。
また、被験物質である菌Ｂをカイコに投与して、該カイコを菌Ｂに感染させることも好ましい。
When the test substance is Bacterium B or a substance derived from Bacterium B, it is preferable to use a liquid in which Bacterium B or a substance derived from Bacterium B is dispersed in a solvent or dispersion medium.
It is also preferable to administer the test substance, Bacterium B, to silkworms to infect the silkworms with Bacterium B.
被験物質を、複数のカイコよりなるカイコ群に投与するが、その際、１つのカイコ群を構成するカイコの匹数は、それら複数匹の平均をとること等で、正確に生存率やＬＤ５０の算出ができれば特に限定はないが、１～３０匹が好ましく、２～１０匹がより好ましく、３～６匹が特に好ましい。 The test substance is administered to a group of silkworms consisting of multiple silkworms. The number of silkworms constituting one group is not particularly limited as long as the survival rate and LD50 can be accurately calculated by taking the average of the multiple silkworms, but 1 to 30 silkworms are preferable, 2 to 10 silkworms are more preferable, and 3 to 6 silkworms are particularly preferable.
＜工程（２）＞
工程（２）は、対照物質を、複数のカイコよりなるカイコ群に投与する工程である。
被験物質を投与していないときのカイコの生存率やＬＤ５０は、比較のために測定することが必須であるが、その際の投与としては、何も投与しない、生理食塩水を投与する、投与した被験物質の「溶媒若しくは分散媒」と同じ「溶媒若しくは分散媒」を投与する、等が挙げられる。
中でも、投与した被験物質の溶媒若しくは分散媒のみを、被験物質を投与したときの溶媒若しくは分散媒の量（体積）と同量（同体積）を投与することが好ましい。すなわち、工程（２）の「対照物質」としては、「工程（１）で投与した被験物質の溶媒若しくは分散媒」と同一のもの（液）であることが好ましい。
<Step (2)>
Step (2) is a step of administering a control substance to a group of silkworms consisting of a plurality of silkworms.
It is essential to measure the survival rate and LD50 of the silkworms when the test substance is not administered for comparison purposes. Examples of administration methods for this include not administering anything, administering saline, administering the same "solvent or dispersion medium" as the "solvent or dispersion medium" of the administered test substance, etc.
In particular, it is preferable to administer only the solvent or dispersion medium of the administered test substance in the same amount (same volume) as the amount (volume) of the solvent or dispersion medium when the test substance is administered. In other words, it is preferable that the "control substance" in step (2) is the same (liquid) as the "solvent or dispersion medium of the test substance administered in step (1)".
＜工程（３）＞
工程（３）は、カイコに感染死をもたらす菌Ａを、上記工程（１）を行ったカイコ群に投与して、該カイコ群の生存率、又は、菌ＡによるＬＤ５０を測定する工程である。
菌Ａの種類、菌Ａの投与方法（カイコを菌Ａに感染させることを含む）、投与（感染）後の経過時間等は、前記した通りである。
<Step (3)>
Step (3) is a step of administering bacteria A, which causes infection and death in silkworms, to the group of silkworms subjected to step (1) above, and measuring the survival rate of the group of silkworms or the LD50 of bacteria A.
The type of bacteria A, the method of administering bacteria A (including infecting silkworms with bacteria A), the time elapsed after administration (infection), etc. are as described above.
「ＬＤ５０」は、菌Ａの投与量を変化させてカイコに投与して、カイコの感染死を観察し、使用したカイコの一定割合（例えば５０％）が死ぬ点に内挿したときの菌Ａの量（生菌数、吸光光度計で測定した濁度、乾燥重量等）であり、常法により用量作用曲線等を作成し、それを用いて求める。
本発明において、使用される「一定割合の死亡（生存率）」は、丁度５０％だけに限定されず、例えば、「２０％～８０％内の１点」等でもよい。すなわち、５０％と同等のスクリーニングができるならば、本明細書中で「ＬＤ５０」なる記載は、５０％のみに限定されない。
"LD50" is the amount of bacteria A (viable cell count, turbidity measured with an absorptiometer, dry weight, etc.) when varying doses of bacteria A are administered to silkworms, the silkworms are observed to die from infection, and the amount is interpolated to the point where a certain percentage (e.g., 50%) of the silkworms used die; a dose-response curve or the like is prepared in the usual manner and used to determine the amount.
In the present invention, the "certain percentage of deaths (survival rate)" is not limited to just 50%, but may be, for example, "a point between 20% and 80%". In other words, if screening equivalent to 50% is possible, the term "LD50" in this specification is not limited to only 50%.
「生存率」（Survival（％））は、一定量の菌Ａを投与した際（一定量の菌Ａで感染させた際）、「生きているカイコ数」を「用いた全カイコ数」で割った値である。生存率を比較するときは、同一量の菌を投与した系同士で比較する。 "Survival rate" (%) is the "number of surviving silkworms" divided by the "total number of silkworms used" when a certain amount of bacteria A is administered (when infected with a certain amount of bacteria A). When comparing survival rates, compare systems that were administered the same amount of bacteria.
＜工程（４）＞
工程（４）は、カイコに感染死をもたらす菌Ａを、上記工程（２）を行ったカイコ群に投与して、該カイコ群の生存率、又は、菌ＡによるＬＤ５０を測定する工程である。
すなわち、比較のために、工程（２）で、対照物質を投与したカイコ群にも菌Ａを投与する工程である。なお、本発明に用いる「ＬＤ５０」なる表現は、上記した通り、丁度「５０％の死」には限定されない。
菌Ａ、対照物質、経過時間、温度、生存率、ＬＤ５０等に関する事項は、前記記載や上記工程（３）における記載事項と同様である。
<Step (4)>
Step (4) is a step of administering bacteria A, which causes infection and death in silkworms, to the group of silkworms subjected to step (2) above, and measuring the survival rate of the group of silkworms or the LD50 of bacteria A.
That is, for comparison, the group of silkworms to which the control substance was administered in step (2) is also administered the bacteria A. As described above, the expression "LD50" used in the present invention is not limited to "50% death".
The details regarding the bacterium A, the control substance, the elapsed time, the temperature, the survival rate, the LD50, and the like are the same as those described above and in the step (3) above.
＜工程の順番＞
被験物質又は対照物質をカイコに投与してから、経時させてから、菌Ａをカイコに投与してもよく；被験物質又は対照物質、及び、菌Ａを、カイコに実質的に同時に投与してもよく；菌Ａをカイコに投与してから、被験物質又は対照物質をカイコに投与してもよいが、被験物質又は対照物質をカイコに投与してから、経時させて、菌Ａをカイコに投与することが、後記する理由等から好ましい。
<Process order>
The test substance or control substance may be administered to the silkworms, and then after allowing time to elapse, the bacterium A may be administered to the silkworms; the test substance or control substance and the bacterium A may be administered to the silkworms substantially simultaneously; or the bacterium A may be administered to the silkworms, and then the test substance or control substance may be administered to the silkworms; however, it is preferable to administer the test substance or control substance to the silkworms, and then after allowing time to elapse, the bacterium A is administered to the silkworms, for reasons described below.
この場合の「経時」は、被験物質と菌Ａに依存し、特に限定はないが、被験物質が菌Ｂの生菌であって、「被験物質の投与」が、カイコを菌Ｂに感染させることである場合には、１分～２０分が好ましく、直ちに（経時させない）～１０分が特に好ましい。
また、被験物質が、菌Ｂの死菌、菌Ｂ由来物、菌に由来しない化合物等である場合にも、１分～２０分が好ましく、直ちに（経時させない）～１０分が特に好ましい。
In this case, the "time lapse" depends on the test substance and the bacterium A, and is not particularly limited; however, when the test substance is a live bacterium B and "administration of the test substance" involves infecting the silkworms with the bacterium B, 1 to 20 minutes is preferable, and immediately (without allowing time to lapse) to 10 minutes is particularly preferable.
Also, when the test substance is killed bacteria B, a substance derived from bacteria B, a compound not derived from bacteria, etc., the incubation time is preferably 1 to 20 minutes, and immediately (without aging) to 10 minutes is particularly preferable.
菌Ａを投与せず（菌Ａに感染させることなく）、被験物質のみを工程（１）と同程度の量カイコに投与しても、カイコは死なないか、生存率があまり低下しない。従って、カイコの死亡の原因は、菌Ａによる感染死であり、投与された被験物質は、「菌Ａによる感染死」を促進している（に過ぎない）。
このことは、「菌Ａによる感染死の促進」は、工程（１）で投与した被験物質が免疫を抑制していることを意味する。
上記理由からも、前記した通り、被験物質（又は対照物質）をカイコに投与して、経時させて免疫を抑制させてから、菌Ａをカイコに投与することが好ましい。
Even if the test substance alone is administered to silkworms in the same amount as in step (1) without administering bacteria A (without infecting the silkworms with bacteria A), the silkworms do not die or the survival rate does not decrease significantly. Therefore, the cause of death of the silkworms is infection with bacteria A, and the administered test substance (simply) promotes "infection with bacteria A and death."
This means that "promotion of death by infection with Bacterium A" means that the test substance administered in step (1) suppresses immunity.
For the above reasons, as described above, it is preferable to administer the test substance (or control substance) to silkworms and allow time for immune suppression before administering Bacterium A to the silkworms.
＜工程（５）＞
工程（５）は、工程（３）で測定される生存率又はＬＤ５０の方が、工程（４）で測定される生存率又はＬＤ５０より小さくなる被験物質を免疫抑制剤として選択する工程である。
被験物質を投与したカイコ群と、対照物質を投与したカイコ群とは、菌Ａ（の種類、投与量等）、飼育条件、経過時間等について、実質的に同一である（同一で比較する）ことが好ましい。
「生存率」は、菌Ａの投与量一定の場合のカイコ群同士で比較する。
<Step (5)>
Step (5) is a step of selecting, as an immunosuppressant, a test substance for which the survival rate or LD50 measured in step (3) is smaller than the survival rate or LD50 measured in step (4).
It is preferable that the group of silkworms administered with the test substance and the group of silkworms administered with the control substance are substantially identical (compared identically) in terms of bacteria A (type, dosage, etc.), rearing conditions, elapsed time, etc.
The "survival rate" is compared between groups of silkworms when the dosage of bacteria A is constant.
＜免疫担当細胞の機能抑制剤のスクリーニング方法＞
本発明は、前記の免疫抑制剤のスクリーニング方法を用いることを特徴とする免疫担当細胞の機能抑制剤のスクリーニング方法でもある。
<Method of screening for an agent that inhibits the function of immunocompetent cells>
The present invention also relates to a method for screening an immunosuppressant for an immunocompetent cell function, which comprises using the above-mentioned method for screening an immunosuppressant.
前記した被験物質は、その中から免疫抑制剤となり得るものが選択されるのであるが、かかる免疫抑制は、具体的には例えば、免疫担当細胞の機能抑制等によって行われることが知られている。
従って、本発明は、原理・作用・機序に遡った「免疫担当細胞の機能抑制剤のスクリーニング方法」でもある。
Among the above-mentioned test substances, those that have the potential to become immunosuppressants are selected, and it is known that such immunosuppression is specifically achieved, for example, by suppressing the functions of immunocompetent cells.
Therefore, the present invention is also a "screening method for agents that suppress the function of immunocompetent cells" that traces back to the principles, actions, and mechanisms.
＜サイトカイン産生抑制剤のスクリーニング方法＞
本発明は、前記の免疫抑制剤のスクリーニング方法を用いることを特徴とするサイトカイン産生抑制剤のスクリーニング方法でもある。
<Screening method for cytokine production inhibitors>
The present invention also relates to a method for screening for a cytokine production suppressor, which comprises using the above-mentioned method for screening for an immunosuppressant.
前記した被験物質は、その中から免疫抑制剤となり得るものが選択されるのであるが、かかる免疫抑制は、具体的には例えば、サイトカイン産生の抑制等によって行われることが知られている。
従って、本発明は、原理・作用・機序に遡った「サイトカイン産生抑制剤のスクリーニング方法」でもある。
Among the above-mentioned test substances, those that have the potential to become immunosuppressants are selected, and it is known that such immunosuppression is specifically achieved, for example, by suppressing cytokine production.
Therefore, the present invention is also a "screening method for cytokine production inhibitors" that traces back to the principles, actions, and mechanisms.
＜細胞毒性物質のスクリーニング方法＞
本発明は、前記の免疫抑制剤のスクリーニング方法を用いることを特徴とする細胞毒性物質のスクリーニング方法でもある。
<Screening method for cytotoxic substances>
The present invention also relates to a method for screening a cytotoxic substance, which comprises using the above-mentioned method for screening an immunosuppressant.
前記した被験物質は、その中から免疫抑制剤となり得るものが選択されるのであるが、かかる免疫抑制は、具体的には例えば、細胞毒性物質等によって助長されることが知られている。
従って、本発明は、原理・作用・機序に遡った「細胞毒性物質のスクリーニング方法」でもある。
Among the above-mentioned test substances, those that have the potential to act as immunosuppressants are selected, and it is known that such immunosuppression is promoted by, for example, cytotoxic substances.
Therefore, the present invention is also a "screening method for cytotoxic substances" that traces back to the principles, actions, and mechanisms.
以下、実施例に基づき本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例の具体的範囲に限定されるものではない。以下、「％」と言う記載は、それが質量に関するものについては「質量％」を意味する。 The present invention will be described in detail below based on examples, but the present invention is not limited to the specific scope of the following examples. In the following, when the term "%" refers to mass, it means "mass %."
＜カイコ＞
以下の実施例で用いたカイコは、他に明記されていない限り、５令１日目のカイコに、終夜、餌（１ｇ／ｌａｒｖａ）を与えた５令２日目のカイコである。
<Silkworm>
The silkworms used in the following examples were 5th instar silkworms, 1st day of the 5th instar silkworms, 2nd day of the 5th instar silkworms, which were fed with food (1 g/larva) overnight, unless otherwise specified.
実施例１
＜高温におけるカイコの感染感受性の増大＞
高温（温度ストレス）によって、カイコの黄色ブドウ球菌感染に対する感受性が増大することを確かめた。
５令２日目のカイコに対し、異なる用量の黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ１株）を注射し、２７℃（通常条件）、及び、３７℃（高温条件）で、餌を与えずに飼育した。
Example 1
<Increased susceptibility of silkworms to infection at high temperatures>
We found that high temperature (temperature stress) increases the susceptibility of silkworms to Staphylococcus aureus infection.
Silkworms on the second day of the fifth instar were injected with different doses of Staphylococcus aureus (MSSA1 strain) and reared without food at 27°C (normal conditions) and 37°C (high temperature conditions).
感染から４８時間後のカイコの生存数を観測し、用量作用曲線からＭＳＳＡ１株のカイコに対するＬＤ５０を求めた。 The number of surviving silkworms 48 hours after infection was observed, and the LD50 of the MSSA1 strain against silkworms was calculated from a dose-response curve.
高温で飼育された（温度ストレスを与えた）カイコに対する黄色ブドウ球菌ＭＳＳＡ１株のＬＤ５０値は、通常条件で飼育されたカイコに対する黄色ブドウ球菌ＭＳＳＡ１株のＬＤ５０値に比べて１００倍程度小さかった（図１参照）。 The LD50 value of the S. aureus MSSA1 strain for silkworms reared at high temperatures (temperature stressed) was approximately 100 times smaller than the LD50 value of the S. aureus MSSA1 strain for silkworms reared under normal conditions (see Figure 1).
すなわち、カイコは、高温ストレス（３７℃）を与えることによって、高温ストレスを与えず通常飼育温度（２７℃）で飼育したものに比べて、黄色ブドウ球菌による感染に対する感受性が１００倍程度増大した。このことは、高温では免疫機能が抑制されると考えられる。 In other words, silkworms exposed to high temperature stress (37°C) were approximately 100 times more susceptible to infection by Staphylococcus aureus than those not exposed to high temperature stress and raised at normal rearing temperatures (27°C). This suggests that immune function is suppressed at high temperatures.
実施例２
＜飢餓によるカイコの感染感受性の増大＞
飢餓ストレスによって、カイコの黄色ブドウ球菌感染に対する感受性が増大することを確かめた。
対照群（飢餓ストレスなし）では、分離された５令１日目のカイコに餌（１ｇ／ｌａｒｖａ）を与え、５令２日目のカイコを用いて黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ１株）感染実験を行い、黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ１株）のカイコに対するＬＤ５０を求めた。
Example 2
＜Starvation increases silkworm susceptibility to infection＞
We confirmed that starvation stress increases the susceptibility of silkworms to Staphylococcus aureus infection.
In the control group (without starvation stress), the isolated 5th instar silkworms on the first day were fed food (1 g/larva), and an infection experiment with Staphylococcus aureus (MSSA1 strain) was conducted using 5th instar silkworms on the second day, and the LD50 of Staphylococcus aureus (MSSA1 strain) against the silkworms was calculated.
飢餓ストレスを与えた群では、５令２日目以降、餌を与えず、上記と同様の感染実験を５例３日目（飢餓１日間）、４日目（飢餓２日間）、５日目（飢餓３日間）行って、それぞれＬＤ５０を算出した。 In the starvation stressed group, food was not provided from the second day of the fifth instar onwards, and the same infection experiment as above was carried out on the third day (one day of starvation), the fourth day (two days of starvation), and the fifth day (three days of starvation) for five cases, and the LD50 was calculated for each.
飢餓ストレスを与えたカイコの黄色ブドウ球菌に対する感染感受性は、飢餓ストレスを与えた期間が長くなるにつれて増大し、３日間の飢餓条件では、飢餓ストレスを与えなかったカイコに比べて、黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ１株）のＬＤ５０値が２０倍程度小さくなった（図２参照）。 The susceptibility of silkworms subjected to starvation stress to infection by Staphylococcus aureus increased as the period of starvation stress increased, and after three days of starvation, the LD50 value of Staphylococcus aureus (MSSA1 strain) was approximately 20 times lower than that of silkworms that were not subjected to starvation stress (see Figure 2).
すなわち、カイコは、飢餓ストレスを与えることによって、通常の給餌飼育したものに比べて、黄色ブドウ球菌による感染に対する感受性が２０倍程度増大した。飢餓ストレスを加えることによって、免疫機能が抑制されたと考えられる。 In other words, starvation stress increased silkworms' susceptibility to Staphylococcus aureus infection by about 20 times compared to silkworms raised on a normal diet. It is believed that starvation stress suppresses immune function.
実施例３
＜クリプトコッカス感染によるカイコの感染感受性の増大＞
真菌であるクリプトコッカスに感染させたカイコでは、黄色ブドウ球菌感染に対する感受性の増大することを確かめた。
カイコに対して、被験物質として、４倍に濃縮し「クリプトコッカス（C. neoformans）」の培養液を血液内に注射（５０μＬ／larva）した群（C. neoformans pre-感染群）、及び、対照物質として、生理食塩水（５０μＬ／larva）を注射した群に対して、それぞれ異なる用量の黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ１株）を注射し、２７℃でカイコを飼育した。その後、カイコの生存数を経時的に観察した。
Example 3
<Increased susceptibility of silkworms to infection by Cryptococcus>
Silkworms infected with the fungus Cryptococcus were found to be more susceptible to Staphylococcus aureus infection.
Silkworms were injected with different doses of Staphylococcus aureus (MSSA1 strain) into the blood of one group (C. neoformans pre-infected group) in which a 4-fold concentrated culture solution of C. neoformans was injected into the blood (50 μL/larva) as the test substance, and into the blood of another group in which physiological saline (50 μL/larva) was injected into the blood of the control group, and the silkworms were raised at 27° C. The number of surviving silkworms was then observed over time.
クリプトコッカスに感染したカイコは、クリプトコッカスに感染していないカイコに比べて、黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ１株）のＬＤ５０が６４倍以上小さかった（図３参照）。なお、この程度のクリプトコッカスの投与（注射）だけでは、カイコは死なない。 Silkworms infected with Cryptococcus had a LD50 of Staphylococcus aureus (MSSA1 strain) that was more than 64 times lower than silkworms not infected with Cryptococcus (see Figure 3). Furthermore, the administration (injection) of this amount of Cryptococcus alone did not kill the silkworms.
すなわち、カイコは、クリプトコッカス感染によって、クリプトコッカス非感染に比べて、黄色ブドウ球菌による感染に対する感受性が６４倍程度増大した。このことは、クリプトコッカス感染によって、免疫機能が抑制されたことを示唆している。 In other words, silkworms infected with Cryptococcus were approximately 64 times more susceptible to infection with Staphylococcus aureus than those not infected with Cryptococcus. This suggests that Cryptococcus infection suppresses immune function.
実施例４
＜ベタメタゾン（Betamethasone）投与によるカイコの感染感受性の増大＞
ステロイドであるベタメタゾン（Betamethasone）を投与したカイコでは、黄色ブドウ球菌感染に対する感受性が増大することを確かめた。
対照物質として１０％ＤＭＳＯ、又は、被験物質として「ベタメタゾン（Betamethasone）２０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した１０％ＤＭＳＯ」をカイコに注射し、直後に異なる用量の黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ１株）を注射して、２７℃で餌を与えずに飼育した。
Example 4
<Increased susceptibility of silkworms to infection by administration of betamethasone>
They found that silkworms treated with the steroid betamethasone were more susceptible to Staphylococcus aureus infection.
Silkworms were injected with 10% DMSO as a control substance or 10% DMSO dissolved in betamethasone at a concentration of 20 mg/mL as a test substance, and immediately thereafter injected with different doses of Staphylococcus aureus (MSSA1 strain), and then reared at 27°C without food.
黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ１株）による感染から４８時間後のカイコの生存数を観測し、用量作用曲線を作成し、そこから黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ１株）のカイコに対するＬＤ５０を求めた。 The number of surviving silkworms 48 hours after infection with Staphylococcus aureus (MSSA1 strain) was observed, a dose-response curve was created, and the LD50 of Staphylococcus aureus (MSSA1 strain) against silkworms was calculated.
ベタメタゾン（Betamethasone）を投与したカイコに対する黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ１株）のＬＤ５０は、対照群（１０％ＤＭＳＯ投与群）のカイコに対する黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ１株）のＬＤ５０に比べて１００倍程度小さかった（図４参照）。
ヒトで免疫を抑制するステロイドとして知られているベタメタゾン（Betamethasone）を投与したカイコにおいて、黄色ブドウ球菌感受性が、対照群に比べて１００倍上昇した（図４参照）。
The LD50 of Staphylococcus aureus (MSSA1 strain) against silkworms administered betamethasone was about 100 times smaller than the LD50 of Staphylococcus aureus (MSSA1 strain) against silkworms in the control group (10% DMSO-administered group) (see FIG. 4).
Silkworms administered betamethasone, a steroid known to suppress the immune system in humans, showed a 100-fold increase in susceptibility to Staphylococcus aureus compared to the control group (see FIG. 4).
以上の結果は、カイコにおいて、様々なストレス条件下において認められるものと同程度の免疫抑制を、ステロイドの投与によって誘導できることを示唆している。 These results suggest that steroid administration can induce immunosuppression in silkworms to the same extent as that observed under various stress conditions.
実施例５
＜土壌細菌ライブラリーの培養上清によるカイコの感染感受性の増大＞
発明者らの研究室に保管されている土壌細菌ライブラリーの中に、その培養上清を注射するとカイコの黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ１株）に対する感染感受性を増大させるものが７種存在した。
それら７種のうち６種は、土壌細菌単独ではカイコを殺傷しなかった。
Example 5
<Increasing susceptibility of silkworms to infection by culture supernatant of soil bacteria library>
Among the soil bacterial library stored in the inventors' laboratory, there were seven species that increased the susceptibility of silkworms to infection with Staphylococcus aureus (MSSA1 strain) when their culture supernatants were injected.
Of those seven, six of the soil bacteria alone did not kill silkworms.
土壌細菌（由来物）が免疫抑制剤となり得ることが分かった。
土壌細菌、又は、「土壌細菌の培養上清等の菌由来物」を被験物質とすることで、免疫抑制剤のスクリーニングができることが確かめられた。
土壌細菌（ライブラリー）を対象として、「新しい免疫抑制剤」の発見の可能性がある。例えば、土壌細菌（ライブラリー）等を対象として、本発明の新しい「免疫抑制剤のスクリーニング方法」が成立する。
It has been found that soil bacteria (derived substances) can act as immunosuppressants.
It has been confirmed that immunosuppressants can be screened by using soil bacteria or "bacterial derivatives such as culture supernatants of soil bacteria" as test substances.
There is a possibility of discovering a "new immunosuppressant" by targeting soil bacteria (library). For example, the new "screening method for immunosuppressants" of the present invention can be established by targeting soil bacteria (library) and the like.
本発明によれば、体内動態を考慮した免疫抑制剤のスクリーニングができるので、本発明は、医薬品、薬品原料、健康食品等の、研究、製造、販売、使用等をする分野に広く利用されるものである。
According to the present invention, it is possible to screen immunosuppressants taking into account their pharmacokinetics, and therefore the present invention can be widely used in the fields of research, production, sale, use, etc. of pharmaceuticals, pharmaceutical raw materials, health foods, etc.
Claims (9)
被験物質を投与していないときのカイコの生存率又は菌ＡのＬＤ５０に比較して、被験物質を投与しているときのカイコの生存率又は菌ＡのＬＤ５０が小さくなる被験物質を免疫抑制剤として選択する免疫抑制剤のスクリーニング方法であり（ただし、上記及び下記「ＬＤ５０」は、使用したカイコの「２０％～８０％内の１点」が死ぬ点に内挿したときの菌Ａの量を示す）、
以下の工程（１）ないし（５）
（１）被験物質を、複数のカイコよりなるカイコ群に投与する工程
（２）対照物質を、複数のカイコよりなるカイコ群に投与する工程
（３）カイコに感染死をもたらす菌Ａを、上記工程（１）を行ったカイコ群に投与して、該カイコ群の生存率、又は、菌ＡによるＬＤ５０を測定する工程
（４）カイコに感染死をもたらす菌Ａを、上記工程（２）を行ったカイコ群に投与して、該カイコ群の生存率、又は、菌ＡによるＬＤ５０を測定する工程
（５）工程（３）で測定される生存率又はＬＤ５０の方が、工程（４）で測定される生存率又はＬＤ５０より小さくなる被験物質を免疫抑制剤として選択する工程
の全ての工程を有することを特徴とする免疫抑制剤のスクリーング方法。 A method for screening an immunosuppressant comprising administering to silkworms a bacterium A which causes infection and death in silkworms, and measuring the survival rate of the silkworms or the LD50 of the bacterium A,
A screening method for immunosuppressants is provided for selecting a test substance that reduces the survival rate of silkworms or the LD50 of bacteria A when the test substance is administered compared to the survival rate of silkworms or the LD50 of bacteria A when the test substance is not administered, as an immunosuppressant (wherein "LD50" above and below indicates the amount of bacteria A when interpolated to the point at which "one point within 20% to 80%" of the silkworms used die).
The following steps (1) to (5)
(1) administering a test substance to a group of silkworms consisting of a plurality of silkworms; (2) administering a control substance to a group of silkworms consisting of a plurality of silkworms; (3) administering a bacterium A that causes infection and death in silkworms to the group of silkworms subjected to the above-mentioned step (1) and measuring the survival rate of the group of silkworms or the LD50 of the bacterium A; (4) administering a bacterium A that causes infection and death in silkworms to the group of silkworms subjected to the above-mentioned step (2) and measuring the survival rate of the group of silkworms or the LD50 of the bacterium A; (5) selecting as an immunosuppressant a test substance for which the survival rate or LD50 measured in step (3) is smaller than the survival rate or LD50 measured in step (4).
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