JP7475427B2 - ナノ細孔デバイス内で特徴をマッピングするための強制移動ポリヌクレオチドスキャンニング - Google Patents
ナノ細孔デバイス内で特徴をマッピングするための強制移動ポリヌクレオチドスキャンニング Download PDFInfo
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Description
本明細書で交換可能に使用される用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、即ちリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドをいう。従って、この用語は、一本鎖、二本鎖、又は複数鎖(multi-strand)DNA若しくはRNA、ゲノムDNA、cDNA、DNA-RNAハイブリッド、又は、プリン及びピリミジン塩基又は他の天然のヌクレオチド塩基、化学的若しくは生化学学的に修飾されたヌクレオチド塩基、非天然のヌクレオチド塩基又は誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含むが、これらに限定されない。
本開示は、標的ポリヌクレオチドの1以上の特徴をマッピングする自動化方法を提供する。本開示はまた、ポリヌクレオチド配列の配列決定のための自動化方法を提供する。本開示はまた、ポリヌクレオチド配列内のメチル化及び非メチル化領域の差動的検出のための方法を提供する。本開示はまた、細孔デバイス内のポリヌクレオチドの拡張された再捕捉(extended recapture)の方法を提供する。ナノ細孔デバイス内のポリヌクレオチドを配列決定するための方法も提供される。本開示の方法を実施するためのデバイス及びシステムも本開示において提供される。
本開示は、本明細書で開示される方法を実施するためのデバイス及びシステムを含む。本開示は、第1及び第2の細孔を通る標的ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列の1以上の特徴をマッピングするためのデバイス及びシステムを提供する。本開示はまた、標的ポリヌクレオチドを捕捉するためのデバイス及びシステムを提供する。本開示はまた、第1及び第2の細孔を通る標的ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列を配列決定するためのデバイス及びシステムを提供する。
いくつかの実施形態では、デュアル細孔デバイスは、2つの体積部にナノ細孔デバイスの内側スペースを分離する構造で開口部を形成する少なくとも1つのナノ細孔(図8に示される)を含む。ナノ細孔デバイスはまた、開口と電気的に導通し、ナノ細孔を通る対象物を(例えば、対象物であることを示す電気信号パラメータの変化を検出することによって)同定するように構成された少なくともセンサーを含む。本明細書に記載される方法及びシステムで使用されうるナノ細孔デバイスは、国際公開第2013/012881(WO/2013/012881)(特許文献1)、及び国際公開第2018/236673(WO/2018/236673)(特許文献2)、米国特許出願公開第2017/0145481(U.S.Application Publication No.2017/0145481)(特許文献3)、及び米国特許第9,863,912(U.S.Patent No.9,863,912)(特許文献4)にも開示されており、これらはその全体を参照により本明細書に取り込まれる。本方法及びシステムで使用されうるナノ細孔デバイスにおける増幅器及び回路は、米国特許出願公開第2017/0145481(特許文献3)にも開示されており、これはその全体を参照により本明細書に取り込まれる。
先に議論したとおり、種々の態様では、ナノ細孔デバイスは、ナノ細孔を通る物質に対応する電気信号を生じる1以上のセンサーを更に含む。
上述したとおり、本開示の実施形態のシステムは、1以上のナノ細孔デバイスのセットをインターフェースで連結するように、並びに、ナノ細孔デバイスのセットのセンサーから電気信号を受け取るための電子機器サブシステム、及び、例えばリアルタイム(例えば、ナノ細孔を横切って印加される電圧操作し、分子全体の種々の領域をスキャンニングし、探査することによって)で分子の1以上の特徴のローカルマップ、グローバルマップ、及び/又はコンセンサスマップを生成するための電子機器サブシステムを含むように構成される。電気的サブシステムは、ナノ細孔デバイス内の分子の種々の領域にわたって1以上の特徴を自動検出し、これらをマッピングすることを可能にするために、シグナル加工要素(例えば、増幅器、フィルター、シグナルの予備コンディショニング要素など)、及び/又は異なるナノ細孔にわたって印加される電圧を制御するための要素を含むことができる。
適応理論に関連して、目標は、標的ポリヌクレオチドの1以上の特徴を同定し、標的ポリヌクレオチドの1以上の特徴のローカル及び/又はグローバルコンセンサスマップを作成することである。適応コントローラー(適応制御装置)は、分子の特徴及び位置のどれを再スキャンするか(例えば、双方向スキャンニング)及び/又はまだ探査されていない異なる位置に、ほぼリアルタイムで、いつ移動するかを探すために特徴の数を変化することができる。適応コントローラーは、1以上の特徴のレアルタイムローカルマップを作成でき、且つ、分子全体のコンセンサスマップを作成するためのデータセットを生成することができる。機械学習アルゴリズムを実行する場合、モデルは、以下の評価基準に関したトレーニングデータでトレーニングされうる:IRMS、ベースラインドリフト(Baseline drift)、ベースラインアップダウンモーション(Baseline up-down motion)、LFNP、及び他の評価基準。次に、モデルが使用され、分子の特徴の通過を検出するのに応じて分子の転移の方向をいつ変化するか、異なるタイプの特徴的なふれについて最良の介在作用(intervening action)をいつ自動的に生じるかの確率を示す判断基準の組み合わせを決定することができる。フィールドプログラマブルゲートアレイ(FPGA)又は特定用途向け集積回路(ASIC)に基づく能動理論(active logic)を用いて、分子の転移の方向が、分子の特徴の通過を検出することに応じて変化しうる。これは、平均化を通して精度を増加するのに使用できる、ローカルDNA(local DNA)領域の往復再スキャンニングを可能にする。
別のアプローチは、信号処理畳み込みニューラルネットワーク(signal processing convolutional neural network)を使用して、明確な分子モチーフと、明確な分子モチーフの位置及びこれらの間の間隔を電気的に同定し、ディープQラーニングアルゴリズムにこれを供給し、適応ロジック及びコンセンサスマッピングの連続的改善を発展させることである。この技術は、マップ生成のための分子の自動調査及び探査のシステムによって行われる将来の決定を改善する。
本発明の実施形態の上記の記載は、例示の目的で与えられ、これが網羅的であること、及び開示されたとおりの形態に本発明を制限することを意図しない。関連する技術分野で熟練した者は、多くの修飾及びバリエーションが上記開示に照らして可能であることを認識できる。
本開示は、ナノ細孔デバイス内のポリヌクレオチドを再捕捉するための方法を提供する。本開示のシステム及びデバイスは、標的ポリヌクレオチドを再捕捉するための方法を実行する。
本開示は、細孔を通して複数のプローブに結合された標的ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列の1以上の特徴をマッピングするための方法を提供する。本開示は、ナノ細孔デバイスの第1及び第2の細孔を通って別々に移動する1以上のポリヌクレオチド配列を含有する、混合サンプル内の5mC及び5hmC領域の差動的検出のための方法を更に提供する。
先に記載された本主題の、実施形態を含めた態様は、1以上の他の態様又は実施形態単独で、又はこれらと組み合わせて、利益をもたらしうる。先の記述を制限することなく、1~171の番号付けをされた開示の特定の非制限的態様が、以下に提供される。この開示を読んだ当業者に明らかであるように、個別に番号付けされた態様は、それぞれ、先の又は以下の個別に番号付けされた態様の何れかを用いて、又はそれらと組み合わせることができる。これは、態様の係る組み合わせの全てに対するサポートを提供し、以下に明示的に提供された態様の組み合わせに限定されないことを意図する。
ここでは、タンパク質でタグ化されたDNA分子をトラップするためのデュアルナノ細孔デバイスを使用し、数秒内に分子の100回までの前後の電気スキャンを実施する、「フロッシング」と称されるアクティブコントロール技術が提示された。48kbのλDNAに結合されたタンパク質モチーフが、二方向制御の活性な引き金となるための検出可能な特徴として使用される。分子ノイズは、複数スキャンのデータを平均することにより抑制され、公知の値と比較可能な、平均されたタグ間距離の評価をもたらす。ナノ細孔の特徴のマッピング応用は、細孔を通過するときにDNAの線状化を必要とするので、フロッシングの鍵となる利点は、分子の同じセットのシングルナノ細孔(single nanopore)の通過に対する35%と比較して、第2のスキャンによって>98%まで細孔移動(trans-pore)の線状化が増加することであった。バーコーディング法と協力して、デュアル細孔フロッシング技術は、ゲノムマッピング及び構造のバリエーションの応用を可能にし、又は後成関連部位(loci of epigenetic relevance)のマッピングを可能にする。
DNAフロッシングコンセプト
図9は、一般的なフロッシングコンセプトを導入したものであり、絵入り及び実際の記録されたデータによる、デュアル細孔デバイスで共捕捉された分子の繰り返しの双方向スキャンを示す。デュアル細孔デバイスは、公知の方法を用いて調製され、細孔1及び2で独立してそれぞれ適用された電圧V1及びV2を有する。2つの電流(I1及びI2)も細孔で独立して測定された。タグ化された試薬は、DNAに沿って結合された1価ストレプトアビジン(MS)を特徴とする。
図9に示されるフロッシングプロセスを自動化した制御ロジックが、ここで詳細に記載される。フロッシング法は、単一分子の共捕捉及び綱引きを初期化するのを自動化するために、最初に、アクティブコントロールを使用した。制御ロジックは、フィールドプログラマブルゲートアレイ(FPGA)をリアルタイム(MHzクロック速度)で実施した。設計された綱引き制御プロセスは、2つのナノ細孔上の共通の流体チャンバに試薬を導入でき、短いフラグメントを除去する(screen out)ように修飾された(SI セクション2、図16)。共捕捉が達成されると、V1及びV2での競合電圧力は綱引きを導き、検知の間のDNA速度を低下する。共捕捉のイベントの全ての平均持続時間は、V2を一定に保持しながら、異なるV1のセットの各々で計算され、共捕捉の持続時間を最大化する力平衡電圧(force-balancing voltages)を示すピークを持ったベル型曲線を示す。図16cは、V1及びV2の両方を500mVに設定して、110msのピーク平均持続時間を有する例示的デバイスを示した。このデータは、タグを持たないむき出しのDNAで生成された。
スキャン電圧値が同定されると、完全なフロッシング複数スキャンロジックが適用されうる。FPGAで実行されるロジックの詳しい説明は、補助材料(SI セクション4、図17)で提供された。ロジックの出力は、代表的なフロッシングデータ[10]によってここに伝えられた。図10aは、典型的なフロッシングイベントからのI1、V1、I2及びV2の完全なシグナル追跡を示した。tV 2 は、イベントの間変更されずにV2=300mVに保持された。V 1 は、LからRの移動についてV1=100mVに設定され、RからLの移動についてV1=850mVに設定された。I2のベースラインは、V2が一定であっても、V1が調節される場合、変化することに注意する。この効果は、先に特徴付けされた細孔1及び細孔2の間のクロストークに起因した。I2のDNAベースラインに関するタグの検出可能性は、ベースラインの変化にもかかわらず、まだ堅牢(安定(robust))していた。先のセクションで詳述したとおり、十分に大きな電圧差は、V 1 とV 2 との間で選択され、検知の間各方向で制御された動きを促進する。
P(n)=pn-1(1-p) (1)
である。
ナノ細孔特徴マッピングの適用は、センサー細孔(sensing pore)を通過するときにDNAの線状化を必要とする。この場合、フロッシング技術で線状化できるDNAのフラクションが検討され、ここで、線状化は、共捕捉が初期化されたとき、細孔内に最初にあるDNAの折り畳みの除去をいう。例として、図10a~cの分子は、第1(1st)のサイクルで約10msで部分的に折り畳まれ(図10b)、これは、第2(2nd)サイクルで除去され、その後、DNAの線状化を誘導し、維持するために綱引き制御の傾向を示す。細孔2を通るスキャンニングサイクルにわたる完全な線状化の確率は、図10a~cの傾向が代表的な分布であったかどうかを見るために、スキャン数の関数として試験された。実際に、図11は、線状化の確率が第2のスキャンによって98%に増加したことを示した。データでは、折り畳みのイベントは、電流のブロッケージ(blockage)が、折り畳まれていないときのブロッケージ(blockage)量よりも1.5倍高く、180μsを越えて持続する場合に同定された。図11a、bは、観測可能な折り畳みの例による、代表的な単孔及び複数スキャンイベントを示す。
複数スキャンデータセット(各細孔に対するLからR及びRからLで構成する)は、基本的なタグ結合プロファイル、及び転移物理学に関するリッチな情報を含有する。2つの細孔で取られる各個別のスキャンは、スキャンされるDNAの部分に対する転移プロセスのスナップショットを提供する。タグからの転移速度を評価する2つの方法がある。第1のアプローチは、単孔を通って移動するタグの速度を定量すること(「休止時間評価(dwell time estimation)」であり、これは、タグブロッケード(tag blockade)持続時間(最大値の半分での幅(width-at-half-maximum))を膜厚(35nm)に分類することに基づく。第2のアプローチは、デュアル細孔技術に特有のものであり、これが第1の細孔(入口)から第2の細孔(出口)まで移動するので、タグの速度を評価することになる。この入口から出口までの時間は、タグが両細孔の上の共通チャンバに残る時間をいい、細孔-細孔(pore-to-pore)時間ともいわれる。細孔-細孔(pore-to-pore)の速度評価において、細孔-細孔(pore-to-pore)時間は、各チップに対する細孔間の測定された距離に分類された。定義では、細孔-細孔(pore-to-pore)アプローチは、タグが、入口細孔から出て、タグを有する末端が出口細孔に入るときに時間が始まるので、2つの電流シグナルI1及びI2の間の関係を利用する。加えられた電圧で、共通のリザーバ内のDNAは、細孔間(0.34nm/bp)で完全に引き延ばされることが期待された。
複数スキャンイベント内の個々のスキャンから得られる距離を平均化するエラー低減の品質が試験された。少なくとも30サイクルを含む5つの異なる複数スキャンイベントが表1に報告された。各イベントについて、平均化された距離の評価は各スキャン方向について、細孔1及び細孔2の評価を単独で並びに結合させて細孔2の評価を用いて示された。表は、各方向でのスキャンの数に等しいサイクルの数、及び、各間隔距離(分離距離(separation distance))の評価に寄与するタグ-対(tag-pair)の数を報告する。全ての場合において、スキャンよりも少ない距離の評価があった。例えば、各方向で65のスキャンを有するイベント(v)について、及びRからLの方向については、57のスキャンが、I2において検出可能なタグ対をもたらし、一方、62のタグ対が119の間隔(分離(separation))の評価の全てについてI1で検出された。摩擦は、式(1)で説明されるように、いずれか1つのスキャン範囲内でタグを見失う確率がサイクルカウントと共に増加する理由となる。
本発明者等は、デュアルナノ細孔デバイスで個別の長いDNA分子を最初にトラップして、線状化し、次いでデュアルナノ細孔電流検知の間に前後に分子を移動する自動化された「フロッシング」制御ロジックを用いて、複数読み取り対象データ(multi-read coverage data)を提供するアプローチを開発した。デュアル細孔技術の開発の見地から、本試験の再スキャンニングアプローチは、鍵となる挑戦:即ち、最も長いトラップ時間が各細孔での競合力を均衡することによって実現されうるが、サブ拡散動力学(sub-diffusive dynamics)が、速度が低下されるので持続し、タグが検出される時間とDNAに沿ったタグの物理的な位置との間の対応関係に頼るマッピングベースのアプローチを損なうこと、を解決する。本試験のアプローチでは、広い転移時間分布を避けるのに十分高いと同時に、信頼性のあるタグ検出を許容する速度を使用して分子の双方向スキャンニングの間に、サブ拡散動力学が避けられる。ゲノムスケーリングは、短いDNA構成物及びテークルコンプレックス(tackle complex)の、Gbpスケールのゲノムから抜き出されたメガ-塩基サイズのフラグメントを含有する異種サンプルを用いた実験を越えて移動する可能性があった。ゲノムスケーリングについては、単一分子の読みは、参照ゲノムへの整列を可能にし、シェアされたゲノム領域から抜き出されたオーバラップした読みからのコンティグ(contig)を構築するのに十分な品質(例えば、十分に低い系統的及びランダムな誤差を含有する)を有しなければならない。これは、ショートリード(short read)法(即ち、NGSによる)によってマスキングされ、いくつかの場合には、ロングリード(long read)シーケンシングによってさえもマスキングされるロングレンジの構造変化を同定する唯一の方法であった。このアプローチは、できれば、バーコード構造を徐々に探索するための標的領域の繰り返しスキャンニングを用いて、より複雑なタグパターンを有する長い分子に適用されうる。後生学の適用された文脈では、本試験の技術は、メチル化特異的標識検出により、標識あたりの低い空間的フットプリントを有する、ここでの又は他のナノ細孔融和性(nanopore-compatible)のスキームと同じ化学を用いる、配列特異的な標識マッピングと組み合わせる。
モノストレプトアビジンでタグ化されたλDNA試薬の調製
5μgの商業的に調製されたλDNA(New England Biolabs)を、100μlの最終体積の1XのCutSmartバッファ(New England Biolabs)中において0.025UのNt.BbvC1とインキュベートし、λDNAに配列特異的なニックを導入した。ニッキング反応物は、37℃で30分間インキュベートされた。ニッキングエンドヌクレアーゼNt.BbvC1は認識配列、5’-CC↓TCAGC-3’を有し、λDNAに7つのNt.BbvC1部位があった。ニック翻訳が5μlの250μMビオチン-11-dUPT(ThermoFisher Scientific)と1.5UのE.coliDNAポリメラーゼ(New England Biolabs)を添加することによって開始され、37℃で更に20分間インキュベートされた。反応を、3μlの0.5MEDTAを添加することによってクエンチングした。取り込まれていないビオチン-11-dUTPをSephadex G-75スピンカラム濾過によって除去した。モノストレプトアビジンでタグ化されたλDNA複合体を生成するために、モノストレプトアビジンを50nMの最終濃度までG-75で精製されたビオチン標識化DNAに添加し、5分間室温でインキュベートし、ビオチン-モノストレプトアビジン相互作用を飽和させた。モノストレプトアビジンでタグ化されたλDNA複合体は、次に、ナノ細孔実験に直接使用した。
作成プロトコルは先に説明した。手短には、マイクロチャネルをガラス基板に、及びSi基板上のSiN膜に別々に調製した。全ての絶縁アーキテクチャは、システムのキャパシタンスを最小化した。従って、ノイズの性能は最適化された。最初に、形状は、2つの「V」形状、即ち、8mm×8mmダイのガラス上の、「V」の先端で互いに0.4μm離れた1,5μmの深さのマイクロチャネルにドライエッチングされた。次に、400nm厚のLPDVDSiN、100nm厚のPECVDSiO2、及び30nm厚のLPCVDSiNをSi基板上に蒸着した。3層フィルムのスタックをSi基板からガラス基板に移すために、ガラス上のマイクロチャネルがSi上の3層フィルムスタックに向くようにして2つの基板を陽極結合した。Si基板を除去するために、430nmのSiNを、最初にSiの裏側でドライエッチングにより除いた。次に、Si基板を、熱KOHを用いてエッチングで除去し、ガラス上の3層フィルムスタックを露出した。3層フィルムスタックは、ガラス上のマイクロチャネルを覆う機械的な支持体を備えるが、それはナノ細孔検知に対して厚すぎない。そして、ウィンドウは、ナノ細孔の中心に開けられる。これを実現するために、10μm×10μmウィンドウが、400nm厚のSiNマスクを通して、100nm厚のSiO2バッファ層に、中心でドライエッチングされた。次に、残りの100nm厚のSiO2層が、フッ化水素酸を用いてエッチング除去され、単一の35nm厚のSiN膜層を露出した。最後に、2つのナノ細孔を、2つの「V」形状のチャネルの先端部で集束イオンビーム(Focused Ion Beam)を用いて膜を通して穴開けした。
全てのナノ細孔実験を、2MLiCl、10mMトリス、1mMEDTA、pH=8.8バッファで実施した。2細孔チップを、チャネル1、チャネル2、及び中央の共通チャンバにバッファを案内する、自家製マイクロ流体チャンクに組み立てた。Ag/AgCl電極をバッファに挿入し、電圧をかけ、電流を測定した。電流及び電圧シグナルを、Molecular Device Multi-Clamp 700Bによって集め、Axson Digidata 1550でデジタル化した。シグナルを、250kHzでサンプリングし、10kHzでフィルタリングした。タグシグナリング及び電圧制御モジュールを、National Instruments Field Programmable Gate Array(FPGA)PCIe-7851に構築し、制御ロジックを、LabViewを通してFPGA上で開発し、実行した。
全てのデータプロセッシングは、Matlab(2018、MathWorks)で書かれたカスタムコードを用いて実施された。各スキャンとイベントの開始と終了は、オフライン分析に対して、FPGA状態シグナル(SI)から抽出された。FPGA上でのリアルタイムタグ検出の間に、任意のサンプルがベースラインの下70pAに降下し、少なくとも12μs持続した場合に、タグの存在がコントールロジックで検出される。オフライン分析の間に、図4及び表1で報告された分析に対し、各スキャンの間でタグブロッケード(tag blockade)の定量化が以下のように実施された:開いた細孔のベースラインの標準偏差が、500μsのイベントフリーのサンプル(σ)を用いて計算された、DNAの共捕捉ベースラインIDNAが100のタグブロッケード(tag blockade)フリーのサンプルを用いて決定された、タグブロッケード(tag blockade)の候補が、少なくとも1つのサンプルがIDNA-6σ、即ち十分に低いDNA共捕捉のベースライン以下に下降する場合に検出された、タグブロッケード(tag blockade)が、ブロッケードの候補がIDNAより低い1σの範囲内に戻ったサンプルを有する場合に定量化された、及び、タグ持続時間が、最小値の半分での全幅(full width at half minimum)(FWHM)(ここで、最小値の半分(half minimum)は、DNAベースラインの下の最も低いサンプルとDNAベースラインとの間の中間点である)として計算される。図5のアライメントストラテジーデータで利用される最小二乗法のフィッティング(適用(fitting))による代替のタグプロファイル特徴付けは、SI セクション12で説明された。タグ-タグ(tag to tag)時間が、上昇する端部から下降する端部まで、FWHM時間転移(端部)部分を用いて計算され、細孔-細孔(tag to tag)時間は、入口細孔(entry pore)でのタグブロッケード(tag blockade)の上昇する端部から、出口細孔(exit pore)でのタグブロッケード(tag blockade)に対応する下降する端部までを用いて計算される。細孔-細孔(pore-to-pore)時間は、先に割り当てられていない第1の出孔タグ(exit tag)を用いて、10msの時間制限内で、1つのマッチングした出孔タグを有するように入孔タグ(entry tag)を割り当てることによって計算された。分析で見逃されたタグが不正確に割り当てられた細孔-細孔(pore-to-pore)時間をもたらす場合は、~9%の時間(表S3、図21のタグ-対(tag-pair)及びタグ-タグ(tag-tag)時間の内容を参照)で起こり、これは手動で削られた。細孔-細孔(pore-to-pore)時間は、スキャンベースあたりでの細孔-細孔(pore-to-pore)速度を計算するために使用された(図4、表1、表S3、図21)。V 1 のステップ変更に続いて、I 1 の過渡的減衰の補償がある。
1.λDNAを用いた綱引き実験
図16は、λDNAを用いた綱引き実験の詳細を示した。綱引き実験が、2細孔デバイスを矯正するために、前もってλDNAを用いて実施された。図16aは、図16bの対応する電流トレース(追跡(trace))のI1及びI2を用いた、綱引き実験の全ステップを示した。最初に、共通チャンバが、20pMのλDNAで満たされた。システムのアイドル状態(状態pre-i、0~50ms)は、V 1 =300mV、V 2 =300mVとなるように設定された。下方向のスパイクが、15msでI 1 に現れると、FPGAがスパイクを測定した。このスパイクが、ベースラインの下少なくとも70pAにジャンプし、少なくとも0.5ms持続する場合、システムは、無傷の分子としてこれを処理し、状態pre-iiに進む準備をする。さもなければ、システムは、状態pre-iに止まり、次のトリガーに対する準備をする。偽陽性のスパイクが、いくつかのDNAフラグメント、又はタグ化されたλDNAが調製されたときの遊離の残りのタンパク質によって生じうる。この場合、電圧1を、状態pre-ii(50~70ms)でV1=0mVに設定し、λDNA分子をその平衡コンホーメーションに弛緩させる。その後、電圧1をV1=200mVに設定し、分子を状態pre-iiiの細孔1に戻す。表示V1は、スパイクの後、状態pre-iで30ms間変更されずにV=300mVに維持された。この目的は、分子をナノ細孔から離れた距離に押し上げることである。従って、分子は、速く戻らず、指数関数的に減衰するベースライン(これは、約70msの軸の破断部分で隠される)に表れる。これは、ドリフトするベースラインで転移を引き起こすことが困難なためである。分子が細孔1に戻ったとき、これは約80msに上向きのスパイクを生じる(挿入を参照)。転移が完了する前に、細孔1に係留されたλDNAの残部を維持しながら、V 1 を、状態iにおいて0.3ms以内にオフにして、共通のチャンバでλDNAの頭をぶらぶらさせ、細孔1によって捕まえられるのを待つ。V 2 も、状態iで500mVとなるように増加し、より強い力を生じさせ、λDNAのその頭を捕らえる。約165msで、λDNA分子の頭が細孔2に到達し、別の下向きのスパイクが生じる(挿入を参照)。次に、V 1 を400mVとなるように設定し、分子の他端を逆の方向に引き込み、綱引きの状態iiに到達する。細孔1での引っ張る力が細孔2のものよりもまだ弱いので、分子はまだ、細孔2に向けてスライドする。分子が、状態iiiで、約215msで順に最終的に細孔1及び細孔2を出て行く。次に、システムは、別のサイクルに向けてアイドル状態iに戻る。I 2 のベースラインは、状態iでは最初の値に戻らず、これは、2つの細孔間のクロストークによって起こる。I 1 は、その電圧を各時間で変化した後に、大きなスパイクと、指数関数的に減衰するベースラインを示し、これは、チップのキャパシタンスにより引き起こされる。3つの状態、pre-i、pre-ii及びpre-iiiを加えると、2つの利点がもたらされる。第1として、チャネル1に試薬を満たすのに比べて、共通のチャンバに試薬を満たすことは、チャネルを通した試薬の吸い上げを一段階節約し、これは、より効率的に異なる試薬に交換することを可能にする。第2として、状態iでの単孔の転移は短いフラグメントを選別して取り除く。綱引き実験が、むき出しの分子を捕まえる効率を高める状態iでの十分長い持続時間を示す分子を用いて、状態i、ii及びiiiで実施される。
図17は複数スキャン実験のFPGAロジックを例示する。図17aは主文の図2aのイベントの最終サイクルからのI 2 のシグナルと、FPGA状態を示した。細孔2はセンサーとしては働き、一方、細孔1は試験設計ではコントローラーとして働く。FPGA状態は、FPGAによって報告された整数であり、その内部状態を表す。図17bは、FPGAロジックフローを示した。このフローは、2つの主要な状態の間でシステムのスイッチを制御するように設計され、この2つの状態は、分子が左から右へ移動したときのLからR(L-to-R)(8)と、分子が右から左へ移動したときのRからL(R-to-L)(15)である。スパイク中(In Spike)(16)、待ち(Delay)(16)及び保持(Hold)(18)は転移状態であった。FPGAは、最大10msまでのI 2 の平均としてベースラインを計算し、一方、スパイク中(In Spike)(16)の間のI 2 サンプルは排除された。そして、FPGAは、主要な状態(8又は15)が変化したら、ベースラインの値をリフレッシュする。Iタグ及びIイベントは、ベースラインと比較する相対的な値であり、スパイクとイベントの終わりの引き金となる。システムは、637msから642msまでの間状態15にいる。I 2 は、638msでIタグよりも下にジャンプし、システムの引き金を引いて、システムが持続時間をカウントし始めたとき、状態16に入る。I 2 がIタグより上にジャンプして戻ると、システムは、状態15に切り替わる。タグの持続時間が、使用者が設定した最小値(7μs)と最大値(2ms)の間である場合、内部タグのカウントを1つ増加する。タグのカウントをもう1つ増加するとき、同様のプロセスが641msで起こる。タグのカウントを使用者が入力したN(この実験ではN=2に設定された)を越えて増加したら、システムは、別の主要状態(8)に切り替えるプロセスに入る。状態を切り替えた後、スパイクが非常に速く表れるのを防止する為に、待ち(delay)状態17は、最後のタグを押してナノ細孔を更に離れて移動するように、1.5ms待つように設計され、これは、642msと652msに示された。システムが主要状態を切り替えるのと同じぐらい速く、新たな引き金を準備するために、タグのカウントを0にリセットする。電圧を切り替えた後、引き金が、右を使用不可にするとき(これは、シグナルの約653msから654msである)、他の0.5ms長さの保持状態(18)があることに注意する。これは、システムが、ベースラインの値を計算する時間を必要とするためである。結果として、システムは、654msのスパイクを見逃した。従って、タグのカウンターは、2つのタグがすでに表れた後でも、Nに達しなかった。結果として、I 2 は、661msでIイベントよりも上に最終的にジャンプし、これは、分子が細孔2を去ったことを示す。次に、イベントは終了する。
主文の図2dは、P=0.89の確率(これはかなり高い)でスキャンを捕らえるシステムを示した。しかし、最後のサイクルを試験し、なぜ分子が複数スキャンで逃れるのかの理由を解明した。図18は、FPGA状態、及び最後のサイクルのI 2 のシグナルを示し、これには、(n-1)回及びn回のスキャンが含まれる。
図19は、3つのタグの引き金による実験を示した。図19aは、6サイクルのイベントからのシグナル追跡を示した。図19bは、2回目(2nd)のサイクルの拡大シグナルを示した。図19cは、イベントあたりのスキャンカウントの分布を示した。
タグロケーションマップについて、ニック部位の位置はλDNAに沿っていた。NbBbvCIニッキング酵素は、「CCTCA↑GC」の配列に位置し、一方の鎖を切断した。次いで、ビオチン化dNTPをニッキング部位に結合した。そして、モノストレプトアビジンタグをニッキングした部位に配置することになる。任意の2つの結合部位の間の距離は、短いものから長いものまで、以下のとおりであった。d45は301bp:102nmであり、d23は323bp:110nmであり、d56は614bp:209nmであり、d46は915bp:311nmであり、d67は3982bp:1354nmであり、d57は4596bp:1563nmであり、d47は4897bp:1665nmであり、d12は10135bp:3446nmであり、d13は10458bp:3556nmであり、d34は12451bp:4233nmであり、d35は12752bp:4336nmであり、d24は、12774bp:4343nmであり、d25は13075bp:4446nmであり、d36は13366bp:4544nmであり、d26は13689bp:4654nmであり、d37は17348bp:5898nmであり、d27は、17671bp:6008nmであり、d14は22909bp:7789nmであり、d15は、23210bp:7891nmであり、d16は23824bp:8100nmであり、d17は27806bp:9454nmであった。
このセクションでは、試験のアプローチは、モデルタグブロッケードのプロファイルの最小二乗適用(least-square fitting)を用いて、最大値の半分(half-maximum)でのピーク位置及びピーク幅を得るために記載された。第1に、未加工の複数スキャンイベントを、全てのコンポーネントをLからR及びRからLのスキャンに分けた。次いで、データを(電流値のサインを反転することによって)反転し、Matlabのfindpeaksアルゴリズムを使用して、個々のタグブロッケード(brockade)に対応する局所最大値を同定した。細孔1(LからRの極性に対しては入口細孔(entry pore))について、電圧をスキャンの終わりで変化し、方向の反転を可能にし、電流のキャパシタンスの過渡現象(トランジェント(transients))を誘導する。これらの過渡現象xacは指数関数モデルにフィッティングされる。過渡現象をフィッティングさせる前に、タグブロッケード(tag blockade)がバックグラウンドのフィット(fit)と干渉しないことを補償するために、同定された各タグの周りの400μsの固定領域を除去した。細孔1チャネルに対するフィッティングされた過渡現象のバックグラウンドを除去し、次いで、各タグブロッケード(blockade)をモデルプロファイルにフィッティングさせた。過渡現象をほとんど除去したが、指数が正確なモデルでないので、スキャンの開始の約1msの範囲内でわずかな残留物があった。タグブロッケード(blockade)として、この残留物を見落とす危険性はなかった。なぜならば、これが、ベースラインよりも上での電流の増加に対応し、各スキャンに対して同じ位置で起こるからである。
タグ整列アルゴリズムの詳細がここで説明される。連続した各スキャンは、分子の特定の領域にわたるタグの基本的な結合パターンの測定を示す。固定された極性(即ち、LからR又はRからL)の各シリーズのスキャンは、分子の異なる位置が各スキャンで観測されるという事実から生じる、相対的な並進オフセット(translational offset)を有する。ブラウンゆらぎ(Brownian fluctuations)から生じる、タグ位置での確率変数もある(図16a、16b、これらのイベントは図5の原稿に示される結果に対応する)。これらの影響は、複数スキャンの全域にわたるタグの正しい関連付けを困難にする(即ち、スキャンiで観測されるタグが、スキャンjの同じタグに対応することは、どのように確保されか。ここで、「同じ」は、タグが同じ配列位置で単一のタグに対応することを意味する。)。このアルゴリズムの目的は、連続したスキャン間で正しく対応したタグの対を同定し、次いで、スキャンの対の間の並進オフセット(translational offset)を除去することによって、与えられたシリーズ(孔1又は孔2についてLからR又はRからL)のスキャンを整列するための系統的な手順を導入することである。
表S3は、9つの異なる複数スキャンイベント(このうちの5つは表1として主文にまとめられている)に関するデータを示した(独特のサイクル数が対応関係を示す)。多くのデータの観測が一の細孔対他の細孔から生じるか、又は両細孔にわたる体積部(volume)で平衡化されうる。2つのスキャン方向の一方が、他方よりも多くのデータももたらし、これは、デバイス依存及び/又は電圧設定依存であると思われる。細孔2のデータに対する例から、(iii)及び(iv)は、RからLよりも多いデータをLからRで生じる一方の例であり、(viii)及び(ix)は、LからRよりも多いデータをRからLで生じる他方の例である。
DNAメチル化は、哺乳類の発達及び疾病に対して最も重要である。実際に、DNAメチル化の不調は、事実上全ての癌のタイプで、決定的な特徴である。最も一般的なメチル化は、シトシンの5番目の炭素であり(5-メチルシトシン(5mC))、真核生物では、対称的なCpGジヌクレオチドのコンテキスト(context)に主に見出される。哺乳類は、それらのゲノムのヌクレオチド組成から期待されるよりも、大まかに5倍少ないCpGジヌクレオチドを有しているが、CpGの70~80%は、メチル化されている。CpGでの5mC修飾は、転写抑制に関連付けられ、ゲノムインプリンティング及びX-染色体の不活性化の後生的な現象に関係している。修飾5-ヒドロキシメチルシトシン(5-hmC)は、しばしば、5mCに次ぐものとされるが、細胞の分化、発達、老化、及び精神障害に重要な役割を有し、5hmCの全ゲノムプロファイルは、癌を有する成人患者において堅牢な診断バイオマーカーを提供する。
1. 5mC及び5hmCの多重分析
2. 長いDNAの読み(ロングDNAリード(long DNA read))(100kbから2Mb)において、100bpの解像度で、CpGのメチル化状態をマッピングする
3. CpG状態のコーリング(>90%)及び単分子内での位置マッピング(10%誤差)での高精度
4. 4時間での、高スループットで費用効率の高い、50Xハプロイドゲノムカバレッジを標的化すること
適切な部位特異的5mC又は5hmCを含有する200bpの相補的オリゴヌクレオチドを、それぞれ適切なCpGに化学的に合成し、このモデルは、結紮用に準備するために5’リン酸基を有して合成された。
相補的オリゴヌクレオチドを、95に加熱し、次いで20分間25℃に冷却することによって各モデルに対してアニーリングした。オリゴヌクレオチドは、クレノウポリメラーゼとdATPを用いてA-テール化した。鈍端化したλDNAフラグメントを、ラムダのみを1度切断し、鈍端を残す制限酵素によって調製した。SnaB1、Nae1、及びSfoは、T-テール化に適した鈍端フラグメントを生じた。SnaB1フラグメントは、ターミナルトランスフェラーゼとddTTPを用いてT-テール化した。アニール化及びテール化したオリゴヌクレオチドの二本鎖(二量体(duplex))は、次にT4DNAリガーゼを用いて、12℃で12~18時間20kbフラグメントに結紮された。
相補的T-Aクローニング末端のみが、全長分子(40,2kb)を生じる。結紮期間後の全長分子の量は、効率の指標となる。リバーストランスクリプターゼテール化法を用いた代替の結紮ストラテジーは、効率が非常に低い場合に使用しうる。ゲル電気泳動を使用して効率を評価し、目標の95%収率を得た。単一細孔は、DNA長を評価するのに使用され、単分子イベントでの持続時間の明確な倍加を40kbvs.20kbとして示した。
(a)変化した大きさの結合タンパク質及び抗体を使用し、各モチーフの、ナノ細孔の差動可能な検出可能性(nanopre differentiable ditectability)を確立した。(b)デュアル細孔の取り調べ(dual-pore interrogation)の間に、配列ランドマークを使用して、内側の200bpメチル化可能領域の再スキャンのきっかけとした。
デバイスを公知の方法を用いて作製した。30nm厚さの窒化物膜は、空間的センシングフットプリント(spatial sensing footprint)(約100bp)を設定し、FIBミリングは、約20nm直径のナノ細孔を生じる。
予備データは、5mCに結合された抗体が検出され、目的1で概説した、200bpTERTプロモーターモデルに存在する5mC及び5hmC部位を標的にする抗体を用いる提案された戦略に実質的な信頼を与える。一般に、大きな結合分子は、大きなシグナルを与え、一方、小さな結合分子(結合又は化学的に付着された)は小さく明確なシグナルを与える。特徴的な「デュアル細孔装置でモデル試薬を用いるシングルプレックス(single-plex)アッセイとしての5mC及び5hmC標識化方法」の主に期待される結果は、1)5mC及び5hmCの両方に電気的に検出可能なタグを結合する生化学的方法、及び2)5mC及び5hmCの間を区別する(異なる分子であっても)電気的なシグネチャーを生成するタグである。
5mC:5hmCの、等しい(1:1)及び限定した(9:1)混合物のポジティブな試薬を、メチル化していないバックグラウンドと共に試験した。
評価基準:10以上のスキャンを用いて各分子に対して、「デュアル細孔装置でモデル試薬を用いるシングルプレックス(single-plex)アッセイとしての5mC及び5hmC標識化方法」のマッピング性能を再現しながら、反復デュアル細孔データ(>10の試験/試薬のセット)が、プロポーショナルな確認されたメチル化状態と、95%CIを有する、複製の全体にわたる2%の平均絶対コールエラー(mean absolute call-error)を有する各試薬(例えば、50%非メチル化、5%5hmC、45%5mC混合物=48~52%非メチル化、3~7%5hmC、43~47%5mC)比とを、調和させさせるべきである。長いDNA分子についての5mC及び5hmCのデュアル細孔での区別。特別な「デュアル細孔装置を用いる5mC及び5hmCの同時検出とマッピング」では、多重アッセイの基礎が、単分子の正確さで5mC及び5hmCの何れかを検出するために確立された。最初に、1:1のモデル基質を試験し、この基質は、(モデル試薬のセットの合成で先に説明した)約100bpの間隔を用いる電気的に区別されるタグを用いて、5mC又は5hmCの何れかに対してタグ化された。5mCのバックグラウンドでの5hmCの相対的な検出。ヒトゲノムでは、約4%のシトシンがメチル化され、これらのほとんどは、CGジヌクレオチド配列に存在する。反対に、5hmCの存在は、一桁低くなる。この分布は、5hmC標的化DNAを、5mC標的化DNAに、1:5、1:10、及び1:100の希釈で順次希釈することで評価した。この混合物を、デュアル細孔デバイスで測定し、5hmC vs 5mCのフラクション予測を測定し、公知の値と比較して、ロジックをてこ入れした。
5mCでタグ化された分子と5hmCでタグ化された分子の比が明確に同定された。
Claims (30)
- 予め捕捉されたナノ細孔デバイス内のポリヌクレオチドを部分的に又は完全に再捕捉するための方法であって、この方法は、
a)少なくとも1つのナノ細孔を有するデバイスを提供する工程であって、前記デバイスが、
(i)チャンバ及び幾何学的に制約された筐体である第1の流体体積部の間に配置され、連通された第1の細孔、
(ii)流体を満たし、電極とアクセスできる入口及び出口備えた第1の流体体積部であって、前記第1の細孔が前記入口及び出口の間の位置で第1の流体体積部に接続された第1の流体体積部、
(iii)前記第1の流体体積部内に配置された少なくとも1つの電極と、前記チャンバ内に配置された少なくとも1つの電極、
(iv)センサーであって、
前記第1の流体体積部内の電極と前記チャンバ内の電極との間の電圧と、
前記第1の細孔内へのポリヌクレオチドの捕捉及び転移と、前記第1の細孔を通るポリヌクレオチドの捕捉及び転移を検出する電流測定を提供するように構成されたセンサー
を含む、工程と、
b)前記ポリヌクレオチドを前記デバイスの前記チャンバ内に導入する工程と、
c)第1の電圧を印加して、第1の方向で、前記第1の細孔を通って前記チャンバから前記第1の流体体積部内にポリヌクレオチドを捕捉し、転移する工程と、
d)ポリヌクレオチドが第1の細孔を通って第1の方向で転移しているときに第1のセンサーで電流を検出する工程と、
e)前記ポリヌクレオチドが前記第1の流体体積部内に収容されている間に、所定時間にわたってゼロmVに等しい第2の電圧を印加する工程と、
f)第3の電圧を印加して、前記第1の流体体積部から前記第1の細孔を通って前記チャンバ内に前記ポリヌクレオチドを捕捉し、部分的に又は完全に転移する工程と、
g)前記ポリヌクレオチドが前記第1の細孔を通って部分的に又は完全に転移しているときに、前記第1のセンサー内で電流を検出する工程
を含む、方法。 - 前記ナノ細孔デバイスは第2の細孔を更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の流体体積部は、流体チャネルである、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドは、ステップ(e)を実行する前に、前記ポリヌクレオチドが前記第1の細孔を通って捕捉され、転移されたことを、前記電流を検出する工程(d)の間に最小の持続時間で示し、これは前記ポリヌクレオチドが最小の長さを超えるものであることを示すものである、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドは、前記最小の持続時間が閾値よりも長いとき、標的として同定され、前記持続時間が閾値よりも短いとき、標的でないと同定される、請求項4に記載の方法。
- 前記電流を検出する工程(d)は、前記ポリヌクレオチドが、第1の電圧で第1の細孔で捕捉され、第1の細孔から転移されるものであり、前記第1の電圧が、30msから500ms以上長い時間範囲で維持される、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(e)においてゼロに等しい前記第2の電圧が、10msから5秒以上までの時間範囲維持される、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(e)においてゼロに等しい第2の電圧は、ポリヌクレオチドがエントロピー的に平衡な配置に弛緩するのを可能にするのに十分な期間維持される、請求項7に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドの第1の端部は、5ミクロンから5ミリメートル以上の範囲の距離で、少なくとも第1の細孔から離れて配置される、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記チャンバは、少なくとも第1の細孔の上に配置される請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。
- 幾何学的に制約された筐体である前記第1の流体体積部は、前記第1の細孔の反対側に配置される、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2の細孔は、第2の流体体積部に連通され、前記第2の流体体積部は、第2の入口及び第2の出口を備えた幾何学的に制約された筐体であり、第2の細孔は、前記入口及び出口の間で第2の流体体積部に連通される、請求項2~11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2の流体体積部は、第2の流体チャネルである、請求項12に記載の方法。
- 前記ナノ細孔デバイスは、第2の流体体積部内に配置された少なくとも1つの電極を含み、前記少なくとも1つの電極は、前記第1の細孔での電圧と独立して制御可能な第2の細孔での電圧を提供できるように構成される、請求項13に記載の方法。
- 前記方法は、第2のセンサー電流を検出した後、前記第1の細孔での前記第1の電圧を調節し、ポリヌクレオチドの少なくとも一部が前記第1の細孔と前記第2の細孔を通って移動するように前記第2の細孔での電圧を設定する工程を更に含む、請求項14に記載の方法。
- 前記第2の電圧は0mVである、請求項15に記載の方法。
- 前記第1の電圧は50~900mVの範囲である請求項15に記載の方法。
- 前記第1の電圧、前記第2の電圧、及び第3の電圧はそれぞれ、50~900mVの範囲である、請求項1~17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドは、ステップf)で第2の方向に移動し、前記第2の方向は、第1の流体体積部から第1の細孔を通る、請求項1~18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法は、第1の細孔での第3の電圧、第2の細孔での第1の電圧、又はそれらの両方を調節し、これによって、前記ポリヌクレオチドの少なくとも一部が第1の方向及び/又は第2の方向に移動し、これが、30msから5分以上の範囲の間、ポリヌクレオチドがデバイスを出るまで繰り返される、請求項14に記載の方法。
- 前記方法は、前記ポリヌクレオチドが両細孔にあるとき、ポリヌクレオチドの特徴の第1のセットを検出する工程を更に含む、請求項15に記載の方法。
- 前記方法は、前記ポリヌクレオチドが、30msから500ms以上の時間範囲の間第1の細孔を通って移動するように、第1の電圧を調節する工程を更に含む、請求項1~21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の電圧は、第1の細孔を横切り、第1の流体体積部の長さに沿った電圧勾配を生じる、請求項1~22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の流体体積部である第1の流体チャネルの抵抗は、前記第1の流体チャネルの幅に反比例する、請求項3~23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1及び第2の流体体積部が流体チェネルであり、第1の流体チャネル及び/又は第2の流体チャネルの抵抗は、第1の流体チャネル及び/又は第2の流体チャネルの体積;第1の流体チャネル及び/又は第2の流体チャネルの半径;及び第1の流体チャネル及び/又は第2の流体チャネルの断面の半径の1つ以上に比例する、請求項3~24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法は、ポリヌクレオチドが2回目又は3回目についてポリヌクレオチドの1以上の特徴の再スキャンニングを必要とするとき、コントローラーによって制御することを更に含む、請求項1~25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法は、前記コントローラーは、前記ポリヌクレオチドの1以上の特徴の何れかを決定し、第1の方向及び/又は第2の方向での1以上の特徴の追加の再捕捉を実施する、請求項26に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドの長さは、第1の細孔と第2の細孔との間、チャンバと第1の流体体積部との間、及び/又はチャンバと第2の流体体積部との間の距離の、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、又は少なくとも5倍である、請求項1~27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の電圧は、0~1000ミリ秒、0~20ミリ秒、20~50ミリ秒、50~100ミリ秒、100~500ミリ秒、又は500~1000ミリ秒の範囲の間維持される、請求項1~28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の電圧は、標的ポリヌクレオチドが第1の細孔を通って捕捉及び転移した後の期間維持される、請求項1~29のいずれか1項に記載の方法。
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