JP7467205B2 - バイオマーカを光学的に検出するための方法 - Google Patents

Description

発明の分野

本発明は、光学センサおよびバイオセンサの分野、より具体的には暗視野マイクロ分光光度法に基づくその用途を有する。

より詳細には、本発明は、複数のタンパク質バイオマーカの超高感度かつ超高速の同時光学的検出のための方法に関する。

発明の背景

バイオセンサは、固体トランスデューサにバインドされた生物学的認識層が分子ターゲットを含むサンプルと相互作用するときに受ける物理的変化を測定する。

バイオセンシングプラットフォームの例は欧州特許出願公開第３１５３８４４号明細書に開示されており、表面に堆積したタンパク質バイオマーカの超高感度検出を提供する。このバイオセンシングプラットフォームの主な特徴は次の通りである。
１）各バイオマーカは、特定の種類のプラズモンナノ粒子（ナノスフェア、ナノロッド、ナノキューブ、ナノプリズムなど）で標識付けされる。
２）プラズモンナノ粒子は、機能化された吊り下げられた複数の誘電体基板上に堆積して、同時に、
ｉ．プラズモンナノ粒子からの弱い散乱信号を強く増強し（オプトプラズモン効果）、
ｉｉ．ナノ粒子の質量を計量する。
３）バイオセンシングプラットフォームは、二重変換メカニズムを提示する。
ａ）光学的検出：プラズモンナノ粒子は、標準的な暗視野顕微鏡で光学的に検出される。
ｂ）機械的検出：プラズモンナノ粒子の質量は、ナノ粒子の堆積後の吊り下げられた機械的基板の共振周波数の変化を測定することによって検出される。

欧州特許出願公開第３１５３８４４号明細書に開示されているこのバイオセンシングプラットフォームの主な欠点は、以下のことができないことである。ｉ）様々な種類のナノ粒子を区別すること。これは、光信号はすべての表面積にわたって平均化されるためである。およびｉｉ）表面のナノ粒子の基本的なスペクトル特性を抽出すること。これは、光学的認識が標準の暗視野顕微鏡で行われるためである。同様に、このモードではセンサの統合された機械的特性のみが測定されるため、機械的変換では個々のナノ粒子に関する情報を得ることができない。

したがって、光学スキャナに、バイオセンサ中でバイオマーカを検出するための堅牢で高速な方法を提供し、測定プロセス中に観察された実験的変動性（サンプル照明の不均一性、バイオセンサ基板の変動、およびナノ粒子の変動）に依存しないことが非常に望ましい。

本発明は、バイオマーカを光学的に検出する方法を提供することにより、前述の問題を解決し、以前に説明された最先端の作業制限を克服する。本方法では、光学検出は、バイオセンサ上のサンプルから空間的およびスペクトル的に分解された光学信号を取得し、これらの空間的およびスペクトル的に分解された光信号の１つまたは複数を画像取得と並行して解析することができる。光信号の解析は、各サンプルのバイオマーカの情報（例えば、存在レベルや濃度レベル）を提供し、この情報には、「典型的な」顕微鏡画像よりもはるかに多くのおよび／または異なるスペクトル情報が含まれている。解析の主要部分は画像取得と並行して実行され、非常に効率的な画像解析が実装されているため、複数の画像を並行して解析することができ、これにより、ほとんどの解析で画像を個別に処理できるようになり、画像の取得から結果の達成までの時間を最小限に抑えることができる。

画像取得では、各画像が読み出され、必要に応じて補正が適用される（背景、不均一性など）。解析の中核は、粒子の認識、分類およびカウントにある。これを行うには、まず粒子を画像サンプルに局在化し、それらを特性評価し（輝度、発光スペクトルなど）、その結果を使用してそれらを分類し（ナノ粒子モノマー、クラスタ、ダストなど）、最後にそれらをクラスごとにカウントする。これらの数値は、画像ごとの主要な結果を構成する。さらに、測定品質の制御（正しい焦点合わせなど）を可能にするさらなる結果が導き出される。特定のタイプのプラズモンナノ粒子はそれぞれ異なるバイオマーカに具体的に関連付けられているため、各画像サンプルの異なる粒子の数から、対応するサンプルのそれぞれのバイオマーカの濃度を推定することができる。

本発明の一態様は、バイオマーカを光学的に検出するための方法であって、
－光学スキャナで実行される、バイオセンサの少なくとも１つのサンプルからの空間的およびスペクトル的に同時に分解された画像の画像取得と、－画像取得と並行して実行される画像解析と、を含み、
画像解析は、
－取得した画像のデータを記憶手段から読み出すステップと、
－取得した画像の不均一性およびノイズを低減するために、読み出したデータを補正するステップと、
－各粒子の位置を取得するために、補正されたデータを使用して取得した画像内の粒子の位置を特定するステップと、
－各粒子の位置および特性評価パラメータを含む中間解析結果を取得するために、各粒子を個別に特性評価するステップと、
－粒子の分類グループ（または粒子クラス）を取得するために、各粒子の特性評価パラメータに基づいて粒子を分類するステップと、
－取得した各画像の分類グループごとに粒子数をカウントするステップと、
－同じサンプルから取得したすべての画像の分類グループごとの粒子数を使用してバイオセンサの各サンプルの各バイオマーカについて計算された、少なくとも１つの統計値を含む全体的な解析結果を計算するステップであって、サンプルごとに計算された統計値は、サンプル中のバイオマーカの存在の指標と相関している、ステップと、を含む。

本発明は、先行技術に関していくつかの利点を有し、それらは以下のように要約することができる。
－本発明は、暗視野マイクロ分光光度法における最新技術と比較して少なくとも１００倍高いスループットでプラズモンナノ粒子の超高速スペクトル解析を可能にする。提案された方法は、画像の空間分解能とスペクトル分解能を同時に取得するため、はるかに高速な測定とより高いサンプルスループットに到達する。
－ナノ粒子のカウントは「デジタル」技法であり、バイオセンサの特定の領域にわたって標識バイオマーカからの光信号を積分する代わりに、検出された標識バイオマーカの実際の数がカウントされる。これにより、本方法はより堅牢になり、画像の取得パラメータ、例えば照明の輝度やスペクトル、およびバイオセンサ基板の変動、ナノ粒子の変動などから独立する。

これらおよび他の利点は、本発明の詳細な説明に照らして明らかになるであろう。

本発明の特徴の理解を補助する目的で、その好ましい実用的な実施形態に従って、この説明を補足するために、以下の図面は、その不可欠な部分として添付され、例示的かつ非限定的な特性を有する。
本発明の好ましい実施形態による、バイオマーカを光学的に検出するための方法のフローチャートを示す図である。 本発明の可能な実施形態による画像解析のフローチャートを示す図である。 画像解析のための画像の可能な補正と変換のフローチャートを示す図である。 画像解析のための粒子位置特定のフローチャートを示す図である。 画像解析のための粒子特性評価のフローチャートを示す図である。 画像解析のための粒子分類のフローチャートを示す図である。 粒子分類に使用される分類ルールのフローチャートを示す図である。 粒子分類のための特性評価パラメータの２次元密度分布を示す図である。 粒子分類のための特性評価パラメータの３次元密度分布を示す図である。 多重化の場合の粒子の分類のためのパラメータ空間の表現を示す図である。 直径が１００ｎｍおよび８０ｎｍの金ナノ粒子を使用して、９６ウェルのバイオセンサで２つのバイオマーカを検出するための、輝度とスペクトルの２つの特性評価パラメータの２次元密度分布を示す図である。 １つの粒子クラスの解析結果がバイオセンサ上のサンプルの位置に似た２次元で表され、粒子番号がグレーコード化されているヒートマップを示す図である。

発明の好ましい実施形態

この詳細な説明で定義された事項は、本発明の包括的な理解を助けるために提供されている。したがって、当業者は、本明細書に記載の実施形態の変更および修正が、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく行われ得ることを認識するであろう。また、周知の機能と要素の説明は、明確さと簡潔さのために省略されている。

もちろん、本発明の実施形態は、様々なアーキテクチャプラットフォーム、オペレーティングおよびサーバシステム、デバイス、システム、またはアプリケーションで実施することができる。本明細書に提示される特定のアーキテクチャのレイアウトまたは実施態様は、例示および理解の目的でのみ提供されており、本発明の態様を限定することを意図していない。

本発明の好ましい実施形態は、バイオマーカが１つまたは複数のタイプのナノ粒子で標識付けされている、バイオセンサに取り付けられた１つまたは複数のバイオマーカの存在および／または濃度を決定する方法に関する。本方法は、バイオセンサの空間的およびスペクトル的に分解された情報を得るためのデータ取得を含む。この情報は、以下では「画像」と呼ばれる。本方法では、この情報（「画像」）を解析して、バイオマーカの存在を検出し、その数および／または濃度を定量化する。

図１は、画像取得（１１００）と並行して画像解析（１０００）を実行する提案された方法の全体的なワークフローを示している。本方法では、複数のスレッド、複数のコンピュータ、クラウドサービスなどを使用して、順次または並列の画像解析（１０００）を実行することができる。通常、図１に示すように、いくつかの画像が並行して解析される（１０００_１０、１０００_１１、・・・１０００_１ｎ、１０００_２０、１０００_２１、・・・１０００_２ｐ、１０００_３０、１０００_３１、・・・１０００_３ｑ）。解析（１０００）に必要な入力データ（１３００）には、画像に加えて、測定を調整するための較正パラメータ（１３１０）（例えば、画像を取り込むために使用されるカメラのタイプ、サンプルを照らすために使用される光源のタイプ、サンプルの形状、患者とサンプルとの対応など）が含まれる。すべての画像が解析されると、全体的な結果が生成され（１４００）、そこからサンプル内のバイオマーカ（１４１０）の濃度を取得することができる。

実際の画像解析（１０００）の前に、光学的スキャンによる入力データ（１１００）の取得に使用され、かつ画像解析（１０００）に必要な取得パラメータ（１３１０）が取得される（１３００）。通常、これらのパラメータ（１３１０）は、ファイルまたはデータベースから読み出されるか、ユーザが手動で入力する。これらのパラメータ（１３１０）は、サンプルの数と位置、およびバイオセンサ上の個々の画像の数と位置、サンプルに存在するバイオマーカのタイプ、使用するナノ粒子のタイプとバイオセンサ基板、サンプル量に関する情報、照明、カメラと画像取り込みの設定などを含む。可能な実施態様では、この情報は光学的スキャン中に１つまたは複数のテキストファイルに自動的に保存され、例えば、１つのファイルがカメラ、照明、オートフォーカスの設定に関する情報を収容し、第２のファイルがバイオセンサ上のサンプルの形状、各サンプルの領域内の画像の形状、および実際にスキャンされたサンプル（つまり、すべてのサンプルまたはそれらのサブセット）に関する情報を収容する。さらに、バイオセンサ上のサンプルと患者情報の対応（例えば、バイオセンサ上のどのウェル／サンプルがどの患者識別子に対応するか）が保存されている必要があり、この情報は解析自体には関係ないが、もちろんその結果の診断的使用には不可欠である。臨床環境では、この情報は通常、中央のＨＩＳ（病院情報システム）に格納される。可能な実施態様では、情報はバイオセンサを準備する人によって編集され、光学スキャナと解析ソフトウェアの両方で読み取ることができるネットワークドライブ上のフォルダに格納される。

入力データまたは画像（１１００）を取得するために、カメラ（例えば、ＲＧＢカメラ）を使用して画像を取り込むことができる。カラーカメラを使用する代わりに、ｉ）モザイクパターンに配置された光フィルタのアレイと結合された光検出器のアレイ、ｉｉ）ダイクロイック光フィルタと結合された光検出器の複数のアレイ、またはｉｉｉ）同じ空間位置で異なるスペクトル帯域を検出することができる垂直に積層された光検出器のアレイを使用してもよい。この種の光検出器は、サブマイクロメートルの分解能で、複数のスペクトル帯域（通常は少なくとも２つで３０以下）でサンプルの空間解析とスペクトル解析を同時に行うための実行可能な技術的解決策である。この画像取得（１１００）に使用されるパラメータの設定（１３１０）は、白黒レベル、ホワイトバランス、および色再現に関して、よく露出された画像を生成するように、カメラのパラメータを調整することを含む。設定は、バイオマーカ標識として機能するナノ粒子を良好に撮像することができるように選択され、（感度と露光時間を調整することにより）ノイズレベルを超え飽和領域を下回る信号で、散乱スペクトル（「色」；色補正行列を調整することによる）に関して異なる粒子間の良好な識別をもたらす。

画像を取り込むために、光学スキャナが使用される。通常、スキャンされるバイオセンサは、マルチウェルプレートに非常に類似しており、患者サンプルごとに１つのウェルを有する、異なるサンプルに対応する異なる領域を備えている。

ここで提案されている光学スキャナは、以下のステップでバイオセンサから空間的およびスペクトル的に分解された画像（１１００）を取得するように構成されている。
－広帯域連続スペクトルを用いてグレージング角度でバイオセンサを照明するステップ、
－オートフォーカスシステムを使用して、バイオセンサの表面に光学センサの焦点を合わせるステップ、
－サンプルからの散乱光を空間およびスペクトル分解能で同時に取り込む光検出器を使用することにより、サンプルから空間的およびスペクトル的に分解された光信号を取り込むステップ、
－サンプルと光学スキャナとの間の相対移動を生成するために、モータ化システムによりバイオセンサおよび／またはスキャナの光学ヘッドを２つの空間座標で移動させるステップ。

バイオセンサの空間分解能は、２つの手段で達成される。それ自体が空間分解能を提供する光検出器（つまり、カメラセンサ）、およびサンプルと光学スキャナとの間の相対移動である。可能な実施態様では、バイオセンサは、２軸のモータ化ステージによって、静止した光学ヘッドに対して移動する。通常、同じサンプルに対応する各領域の複数の画像が取得されるが、それでも、撮影された画像は通常、サンプル領域を完全には覆っていない。典型的なスキャンでは、サンプルごとに取得される画像の数と、サンプル領域内のそれらの位置は、バイオセンサのすべてのサンプル領域で同じにすることができる。それでも、これは必ずしも最良のオプションではない。数と位置は、サンプルごとに個別に選択することもできる。例えば、バイオマーカの濃度が低いサンプルの画像をより多く取得して、測定の統計的ロバスト性を向上させることができる。バイオセンサのスキャン中に取得される画像の総数は、１から数千の範囲に及ぶ可能性がある。

個々の画像でのデータ取得の細分割には、それらの画像の解析をスキャンと並行して、つまり画像の取得を継続しながら実行することができるという重要な利点があり、これにより、サンプルのスループットが向上する。
画像解析（１０００）の並列化：取得したすべての画像（またはすべてのサブセット）を解析する。コンピュータでは、この解析は厳密に連続して（時間ごとに１つの画像）、または並列でいくつかの画像（コンピュータの複数のスレッドを使用して、例えば、スレッドごとに１つの画像）を解析することができる。通常、コンピュータで使用可能な最大数に近い並列スレッドの数（＝カーネルの数または論理プロセッサの数）が選択され、解析の合計時間を短縮する。並列化は、画像（スレッドごとに１つの画像）対して行うこともできるし、あるいは各画像を細分割して並列にサブ画像を解析することもできる。

可能な実施態様では、画像解析（１０００）は、提案されたスキャナによるデータ取得を制御する同じコンピュータ上で実行される。異なる画像を個別に解析することにより、バイオセンサに関する関心のある情報を取得できる可能性は、この手法の大きな利点である。このようにして、最も時間のかかるタスク（各画像の解析）を容易に並列化でき、この並列化を直接的、効率的、かつ経済的に実現可能な方法（カーネル数が多いコンピュータ、複数のＣＰＵ、ネットワーク内の複数のコンピュータなど）で拡張することができる。

別の可能な実施態様では、画像はネットワーク内に保存され、画像解析（１０００）は、提案されたスキャナを制御するコンピュータとは異なるコンピュータで実行することができる。同様に、すべての画像の解析は、各コンピュータが画像のサブセットを解析するように、ネットワーク内のいくつかのコンピュータ間で分割することができる。記憶と解析の両方をクラウドサービスを使用して行うことができる。スキャン中に取り込まれた画像は、例えば、ＴＩＦＦやＪＰＥＧなどの一般的な画像フォーマットで、通常、色チャネルごとに８ビットのＲＧＢ画像として保存することができる。ほとんどの場合、ＪＰＥＧが推奨されるが、これは、結果のファイルが小さくなり、書き込みと読み出しの両方がより高速になるからである。一方、ＪＰＥＧは、特にカラー表現に影響する非可逆圧縮を使用する。バイオセンサ上の粒子のスペクトル特性評価は本発明の本質的な側面であるので、かなり穏やかなＪＰＥＧ圧縮（すなわち、高い「品質係数」）のみが使用され、色表現の潜在的な歪みを最小限に抑える。別の実施形態では、散乱強度が低い粒子の場合に画像内のアーチファクトを回避するために、画像をより大きな色深度で、例えば１６ビットＴＩＦＦ画像として保存することができる。別の可能な実施形態では、画像をカメラの生データとして保存することができ、これにより、カメラセンサのダイナミックレンジ全体（通常１２～１４ビット）、および散乱光の量とセンサによって測定された信号との間の線形依存性が保持される。複数（４つ以上）のスペクトル帯域を有するセンサの場合、通常は製造元の独自の画像形式を使用する必要がある。ＲＡＷフォーマットとは別に、これはコンテナとしてＴＩＦＦに基づくこともできる。

画像の保存に必要な時間とメモリの量、およびそれらを解析する時間を削減するために、取り込まれた画像はビニングされる。通常、２×２のビニングが適用される。つまり、４つのセンサピクセルが１つの画像ピクセルになる。ピクセル間の二次補間は、ビニングされた画像を計算するために使用される。画像の後続のビニングを行わずに、ピクセル数の少ないセンサを直接使用する代替方法と比較して、このアプローチは、色の点で粒子間のより良い識別を実現する。したがって、可能な実施態様では、１２ＭＰのカメラを使用する場合に画像のビニングが適用され、４ＭＰカメラからの画像は、残りの空間解像度が低すぎるため、ビニングされない。通常、画像は最初に、光学スキャナの一部であるコンピュータのハードディスクにローカルに格納される。あるいは、スキャナのコンピュータのネットワーク内で、画像を別のコンピュータまたは記憶システムに直接転送することもできる。

画像をコンピュータのメモリまたはＲＡＭに残したまま、取り込んだ各画像の画像解析（１０００）を直接実行する場合は、記憶装置（例えばハードディスク）への画像の格納を省略することができる。

画像解析（１０００）は、バイオセンサ全体をスキャンした後に、またはスキャンと並行して（例えば、特定のサンプルのすべての画像が取得されるたびに）実行することができるので、結果がスキャン後にできるだけ早く取得される。

画像解析（１０００）は、必要な解析時間を短縮するために、例えば、光検出器に直接接続されたＦＰＧＡ（フィールドプログラマブルゲートアレイ）などを使用して、部分的または完全にハードウェアで実装することができる。

図２は、画像解析（１０００）のフローチャートを示す図であり、各画像に対して実行される次のステップを示している。
－画像の読み出し（２１００）：画像データが前述の記憶手段（例えば、メモリ）から読み出される。
－画像補正（２２００）：対応するオプションがユーザによって選択されているか、デフォルトで有効になっているか、スキャンに関する情報（使用するカメラセンサのタイプ、撮像パラメータなど）に基づいて自動的に有効になっている場合には、画像補正および／または変換が計算される。
－粒子位置特定（２３００）：可能性のある粒子が画像内で位置特定される。
－粒子特性評価（２４００）：各粒子は個別に特性評価され、解析の次のステップで粒子を分類することができる。
－粒子分類（２５００）：粒子が分類され、これにより、バイオマーカに最も特異的な粒子のみを考慮することができ、多重化に不可欠なステップである。
－粒子カウント（２６００）：バイオセンサの特定の領域にわたって標識バイオマーカからの光信号を積分する代わりに、検出された標識バイオマーカの実際の数がカウントされるため、本方法ははるかに堅牢で画像取得パラメータ、例えば、照明の輝度またはスペクトル、およびバイオセンサ基板の変動、ナノ粒子などから独立している。
－品質管理（２７００）：一般に測定の品質、特に各画像の品質を評価するために、品質インジケータが推定される。これらのインジケータは、次の（最終）ステップでの解析結果の計算をガイドするために使用される。
－全体的な解析結果（２８００）：同じサンプルに対して複数の画像が取得された場合、同じサンプルのすべての画像から適切な統計値（例えば、画像からの値の平均または合計、トリミングされた平均、中央値、変位値など）が計算される。各サンプルと各バイオマーカの全体的な結果は、定性的（バイオマーカの有無）または定量的（バイオマーカの濃度）のいずれかである。例えば、濃度（例えば、特定のサンプルボリューム中の抗原の量）は、ナノ粒子の数から計算することができる。

図３～図７は、以下に説明する画像補正（２２００）および粒子位置特定（２３００）、特性評価（２４００）、および分類（２５００）のステップのフローチャートをさらに詳細に示している。

－画像補正（２２００）：
図３は、好ましい実施形態による、画像解析（１０００）のための画像補正および変換のステップ（２２００）によって構成される可能なステップを示す。
ａ）画像の背景補正（３１００）を実行して、黒レベルを調整する。光学スキャナからの典型的な画像では、対象の粒子は暗い背景に個々の小さな明るいスポットとして現れる。基板、カメラセンサのタイプ、および取得パラメータによっては、この背景が「黒」（つまり、センサの値がゼロに近い、「理想的な」場合）ではなく、「灰色」（特定の色合いの有無にかかわらず）で表示される場合がある。センサ値の評価（例えば、すべてのピクセルのヒストグラムに基づく）により、信号オフセットと潜在的な色合いの両方を補正することができる。これにより、画像解析（１０００）の後のステップで粒子特性評価（２４００）が簡素化される。
ｂ）画像は、輝度および／または色の潜在的な不均一性（３２００）について補正される。このような不均一性は、照明、集光、カメラセンサなどによる可能性がある。典型的な効果は、画像の中心が境界よりも明るく見えることである。これらの影響の補正は、画像解析の後のステップ（１０００）で粒子の正しい特性評価（２４００）と分類（２５００）を確実にするために必要な場合がある。
ｃ）ダイナミックレンジを調整するために、画像のガンマ曲線（３３００）の修正が行われる。「ガンマ曲線」とは、検出された光の実際の（物理的な）量に対する画像内のピクセル値の依存性を指す。標準画像（ＪＰＥＧ、ＴＩＦＦなど）では、この依存性は非線形であり、光の増加に伴い、ピクセル値の増加は比例よりも遅くなる。提案された画像解析（１０００）では、この非線形依存性は「ガンマ曲線」の逆関数を使用して補正されるため、取得されたピクセル値は散乱光の量に比例する。
ｄ）画像ノイズを低減するために画像データを平滑化（３４００）する。実際の光学解像度は通常、カメラセンサのピクセルピッチよりも大きいため、解像度に影響を与えずに平滑化（３４００）することで、（光強度が低いことなどによる、カメラセンサからの）画像ノイズを低減することができる。画像ノイズの低減により、正しい粒子特性評価（２４００）と分類（２５００）が再び改善される。
ｅ）標準のカラーカメラの場合、別の色空間（３５００）への変更／変換を実行することができる。例えば、ＲＧＢからＨＳＶ、Ｌ＊ａ＊ｂなどに変換することができ、これにより、粒子特性評価（２４００）の結果の解釈を簡素化し、色に関して粒子をより正確に区別することができる。Ｌ＊ａ＊ｂ色空間には、例えば、光強度Ｌの１つのチャネルが含まれ、他の２つの軸は色を表す。それに比べて、ＲＧＢのチャネルはすべて色と輝度を混合している。
ｆ）使用する色空間に専用の輝度値（例えばＲＧＢなどで）が含まれていない場合には、輝度値（３６００）は各画像ピクセルの色チャネルを合計して計算される。結果として得られるグレースケール画像は、以下では「輝度画像」と呼ばれる。この輝度画像は通常、正規化されており、「０」と「１」は指定された画像形式の最低と最高の輝度レベルに対応する（８ビットＲＧＢ：（０｜０｜０）→０、（２５５｜２５５｜２５５）→１）。
ｇ）使用する色空間に相対色値が含まれていない場合には、各色チャネルをチャネルの合計で除算することにより、各ピクセルの相対色値（３７００）を計算することができ、例えば、チャネル「赤」の相対的寄与についてＲ_ｒｅｌ＝Ｒ／（Ｒ＋Ｇ＋Ｂ）である。

複数のスペクトル帯域を有するカメラが使用されている場合、ＲＧＢ値の代わりに、センサの各波長範囲で測定された散乱強度が使用される。したがって、ＲＧＢ画像の３つの値は、異なる波長領域を表す要素の配列と交換されるだけである。要素の数は通常、スペクトル分解能を得るために３よりも多くなる。それでも、適切に選択された２つの波長の組み合わせは、異なる粒子間の正確な識別に適した選択になり得る。

－粒子位置特定（２３００）
図４は、好ましい実施形態による、粒子の位置特定（２３００）のための可能なステップを示す。
ａ）使用される実際の画像取得パラメータ（光学およびセンサの解像度、倍率など）を考慮して、光学プラットフォームからの画像内のナノ粒子の典型的な形状を表すテストパターン（４１００）が生成される。好ましくは、単一のグレースケールテストパターンが使用される。ナノ粒子の形状は、例えば、２次元ガウス関数、エアリーパターン、単純な円盤形状などで表すことができる。可能な実施態様では、２つのガウス関数の合計（Ｇ_１＋（－Ｇ_２））を使用して、個々のプラズモンナノ粒子の典型的な「ドーナツ」形状の散乱パターンをほぼ一致させる。
単一のグレースケールテストパターンの代わりに、色付きのパターンを使用することができ、例えば、ＲＧＢ成分ごとに１つのパターンを使用したり、複数のスペクトル帯域を備えたカメラのチャネルごとに１つのパターンを使用したりすることができる。これにより、形状が波長に依存する場合に、可能性のある粒子の正確な識別を改善することができる（例えば、緑色のガウス形状とオレンジ色のスペクトル範囲のドーナツ形状）。
ｂ）輝度画像と（１つまたは複数の）テストパターンとの間の正規化された２次元相互相関（４２００）が計算される。この相互相関画像（４２００）は、テストパターンと形状が類似している画像の領域に対して「１」に近い値を有する。
輝度画像を使用する代わりに、相互相関（４２００）をテストパターンと、例えば画像の色チャネルの１つ（または複数のチャネルの線形結合、またはその他の関数）との間で計算することができる。これは、例えば、特定のパターンが他のチャネルと比較して１つのチャネルでより顕著である場合に適している。
ｃ）画像に対してマスク（４３００）が計算される。例えば、バイナリマスクが定義されており、あるしきい値を超える相互相関値（例えば＞０．６）と特定の範囲（例えば、＞０．０３かつ＜０．９８、つまりノイズより高く、飽和より低い）の相対輝度を有するピクセルのマスクは「１」（＝真）に等しい。他のすべてのピクセルはゼロ（＝偽）である。
バイナリマスク（「０」または「１」）の代わりに、連続値を使用してマスク（４３００）を定義することができる。すなわち、制約が十分に一致している場合には、グレースケールマスクは（例えば）１に近い値を有し、そうでない場合はゼロに近い値を有し、これらの間のすべての値が可能である。
相関と輝度の所定のしきい値は単なる例であり、実際の測定値に基づいて、より適切な値を選択したり、あるいは、異なるおよび／または追加のパラメータのしきい値を選択することができる（色、信号－バックグラウンド比など）。
ｄ）グレースケールマスク（４４００）は、以前に定義されたマスク（４３００）と相互相関画像（４２００）をピクセル単位で乗算することによって生成される。相互相関画像とバイナリマスクの積を使用する代わりに、可能性のある粒子の位置は、バイナリマスクのみ（値「１」を有する領域の位置）から導き出すことができる。積の代わりに、例えば、相互相関画像の二乗を取るなど、他の関数が使用されている。
ｅ）結果のグレースケール画像（４４００）から、極大点、つまりすべての直接隣接するピクセルの値よりも高い値を有するピクセルが位置特定され、これらの極大点の位置が粒子の可能性のある位置（４５００）とみなされる。テストパターン（４１００）で相互相関（４２００）を使用する代わりに、粒子検索は、画像のハフ変換（例えば、特定のサイズの円形のオブジェクトを見つける）などでしきい値処理技術（例えば、特定の背景値を超えるすべてが可能性のある粒子とみなされる）に基づくこともできる。

－粒子特性評価（２４００）
図５は、好ましい実施形態による、粒子特性評価（２４００）のための可能なステップを示す。
ａ）画像の平滑化されたパラメータ（５１００）を取得する。最も重要なパラメータは、各粒子の輝度と散乱スペクトル（「色」）である。これらのパラメータの平均値（つまり、粒子の領域全体の平均）を取得するためには、対応する画像（輝度画像、相対的な色の寄与がある画像など）を適切なカーネル、例えば、予想される粒子サイズに近いサイズの２次元ガウス、またはディスク形状のパターンでフィルタ処理する。
ｂ）これらのフィルタ処理／平滑化された画像は、前に計算された可能性のある粒子位置（４５００）で評価される（５２００）。特性評価される画像あたりの粒子の数が「少ない」場合には、平均値を抽出するためにカーネルを使用して画像全体の畳み込みを計算することは計算上非効率的である可能性がある。代わりに、各粒子の周りの画像から小さな領域を直接抽出し、それを使用して平均値を導き出す方がより効率的なオプションである。「低い」数とみなされるものは、撮像パラメータ、コンピュータのハードウェア、および解析ルーチンの実施態様によって異なる。特定の設定で、クロスオーバーポイントを決定して、どちらか一方のオプションを自動的に使用することができる。
ｃ）関心のある追加特性（５３００）は、粒子のサイズと形状、例えば、輝度画像のＦＷＨＭ－半値全幅－、テストパターンとの相関の程度、および粒子の中心での局所形状である。後者のパラメータは、ドーナツ形状（＝中心に凹み）をガウス（または類似の）形状（＝中心に最大値）から区別することを可能にする。現在の実施態様で使用されている解析は、粒子の中心での離散ラプラシアンに比例する値を計算する。この選択により、３×３カーネルによる画像の単純な畳み込みに基づく効率的な実施態様が可能になる。関心のあるさらなる追加特性（５３００）は、（例えば、最近傍距離に基づく）局所粒子密度、およびさらなるスペクトル特性（例えば、スペクトル成分の差または比）である。
ｄ）その結果、各可能性のある粒子の特性が取得され、それらの位置は、粒子位置特定の前のステップ（２３００）からすでに分かっている。各画像について、粒子の特性と位置は、表として表される中間結果（５４００）を定義しており、可能性のある粒子ごとに１行、特性が導き出されたのと同じ数の列がある。例については、以下の表１を参照されたい。

表１は、１つの画像の特性評価（２４００）の結果の例を示している。表の各行は１つの粒子に対応し、ｘとｙは画像内の座標、Ｉはその輝度、Ｒ、Ｇ、Ｂはそれぞれ相対的な色の寄与である。解析によっては、追加特性評価パラメータ用に列を追加することができる。

－粒子分類（２５００）
図６は、好ましい実施形態による、粒子の分類（２５００）のための可能なステップを示す。
ａ）必要に応じて、粒子カウント（２６００）、品質管理（２７００）、および画像解析（１０００）の最終結果（２８００）のさらなるステップから粒子（６１００）を除外するために特定の特性を使用することができる。例えば、ナノ粒子のモノマーのみが対象であり、モノマーが識別機能としてドーナツ形状を示す場合、このパラメータを使用して、すべての非ドーナツ形状の粒子を除去することができる。
ｂ）以前の解析の情報に基づいて、粒子の様々なクラス（６２００）がそれらの特性（輝度、「色」、形状、サイズ）に基づいて定義される。例えば、
（１）ノイズ（非常に低い輝度）、
（２）バイオセンサ製造からの残留物（特定のスペクトルパターン）、
（３）ダスト（異なるスペクトルパターン）、
（４）個々のナノ粒子（明確なスペクトルパターン、輝度、形状など）、
（５）ナノ粒子のクラスタ（ダイマー、トリマーなど、スペクトルパターン、輝度に基づく）。これらのクラスタの場合、それらの輝度は通常、対応する個々のナノ粒子の輝度に系統的に依存する。この情報は分類を改善するために使用される。
ｃ）多重化（６３００）の場合、すなわち、様々なバイオマーカの同時検出の場合、後の図１０の粒子カウント（２６００）に示すように、それぞれが異なるナノ粒子で標識付けされ、使用されるすべてのナノ粒子を考慮して追加の分類グループが定義される。
ｄ）各クラスに対応する特性の組み合わせを定義する必要な分類パラメータおよびルール（６４００）は、以前の測定に基づいて事前に与えることができ、または、図７に示すように、解析する測定自体から導き出すことができる。後者の場合、この解析は通常、測定値のすべての画像から個別にではなく、（統計を改善し、分類がすべての画像間で一貫していることを確認するために）すべての画像の結合結果に基づいている。
ｅ）分類は、基本的にパラメータ空間のセグメンテーション（６５００）で構成される。そのルールは、オペレータが定義するか（手動によるセグメンテーションなど）、または自動的に導き出すことができる（例えば、クラスタ検索、ｋ平均法、セグメンテーションアルゴリズム、機械学習アルゴリズムなど）。ＲＧＢカメラの場合、分類の一例は、範囲［＞０．１、＜０．７］の正規化された輝度、および範囲［＞０．０、＜０．３３］の色チャネル「赤」の相対的な寄与を有するすべての粒子は、製造からの残留物とみなされるということである。
ｆ）ナノ粒子ロット間の違い、照明の変化、検出パラメータの変化などの場合、分類は手動または自動で適応する（６６００）ことができる。

可能な実施態様では、分類ルールは図７に示され、以下で説明するように導き出すことができる。
ｉ．特性評価パラメータ（２つのパラメータ：輝度と色の成分）を選択し（７１００）、すべての可能性のある粒子からこれらのパラメータのヒストグラム（７２００）を計算する。ＲＧＢカメラの場合、通常、正規化された輝度とチャネル「赤」の相対的な寄与がパラメータとして使用される。図８は、２つのパラメータ値の２次元ヒストグラムを示しており、粒子の正規化された輝度が横軸に沿って表され、チャネル「赤」の相対的な寄与が縦軸に沿って表されている。ナノ粒子のモノマー、ダイマー、トリマーなどは、このヒストグラムで「ピーク」を形成し、図８に描かれた線は、異なるタイプの粒子間の境界を示す。２つのパラメータの使用と、対応する２次元ヒストグラムの計算は、単なる一例である。より多くのパラメータが使用される場合には、数学的なステップは基本的に同じである。例えば、３つのパラメータの場合、図９に示すように、３次元密度分布（「ヒストグラム」）を取得することができ、線を分離する代わりに、粒子の異なるタイプ／クラス間で分離平面（または他の表面）が使用される。
ｉｉ．計算されたヒストグラムで、モノマーの「ピーク」が識別される（７３００）。同じタイプの粒子（例えば、個々のナノ粒子）は、一種の「ピーク」（＝ヒストグラムの、または一般的に、パラメータ空間の「密な」領域）を形成するが、これは、それらすべての輝度と色が類似しているためである。個々の粒子の違い、およびノイズおよび／または測定の精度不足のため、これらは類似しているが同一ではない。典型的な測定では、メインの「ピーク」は個々のナノ粒子（モノマー）に対応する。以前の測定からの知識に基づいて、解析するデータのヒストグラムのこの「ピーク」の位置を自動的に識別し、所与のパラメータ範囲、例えば、［０．１、０．３］の正規化された輝度、および［０．３５、０．４５］のチャネル「赤」の相対的寄与でヒストグラムの極大点を検索することができる。
ｉｉｉ．モノマーのこの位置が分かれば、ダイマー、トリマーなどの位置は、それらの輝度がモノマーの輝度の約２倍、３倍などであるという知識に基づいて推定する（７４００）ことができる。繰り返しになるが、推定値は実際の極大点の検索をガイドするために使用される。
ｉｖ．モノマー、ダイマーなどのピークは多少重なる傾向がある。粒子を一方または他方のピークに割り当てるには、２つのピーク間の「境界」を定義して（７５００）、粒子のクラスを区別する。ルーチンは、２つのピーク間の「谷」を最もよく定義する（直線）ラインを検索する。
ｖ．モノマー、ダイマー、トリマー、およびヒストグラム内のナノ粒子のより大きな凝集体の間の位置と分離線は、上記のように識別される。次に、境界を使用して（７６００）、粒子の異なるクラスを定義し、例えば、ダイマーは、粒子のパラメータがヒストグラムのポイントに対応することになり、モノマーとダイマーを分離する「境界」の「右側」（＝より高い正規化された輝度）、およびダイマーとトリマーを分離する「境界」の左側（＝より低い輝度）である。さらに、データポイントは、チャネル「赤」の寄与に関して特定の範囲内にある必要がある（例えば、０．３４より大きく０．６より小さい）。好ましい実施態様では、ナノ粒子は、モノマー、ダイマー、トリマー、および「より大きな凝集体」（すなわち、Ｎ≧４）として分類される（７７００）。ナノ粒子のモノマー、ダイマー、トリマー、およびより大きな凝集体に対して自動的に適応される４つのルールとは別に、粒子の追加クラス（７８００）に対して固定ルールが定義され、例えば、さらに４種類の「粒子」を次のように定義することができる。
（１）ノイズ：０．１未満の正規化された輝度を有し、すでに定義されているナノ粒子のグループに属さないすべての「粒子」。
（２）低輝度の残留物：０．３３未満の「赤」、［＞０．１、＜０．７］の範囲の輝度。
（３）高輝度の残留物：０．３３未満の「赤」、範囲［＞０．７、＜１．０］の輝度。
（４）飽和粒子：輝度値が１（＝飽和）の画像ピクセルを含む。
ｇ）その結果、すべての可能性のある粒子の分類が得られる（６７００）。この結果の表現は、特性評価のステップ（２４００）で生成されたテーブルに基づいており、以下の表２に示すように、分類結果を含む列が追加されている。

表２は、１つの画像について、ナノ粒子分類（２５００）後に得られた結果を示している。表１と比較して、右側に列が１つ追加され、対応する粒子が属する「クラス」を示している。この例では、クラスは整数を使用して示されている。

－粒子カウント（２６００）
粒子のカウント（２６００）は次のように機能する。
ａ）各分類グループの粒子の数がカウントされる。
ｂ）この「カウント」は、直接（１粒子、１カウント）または重み付け（例えば、グループ内の各粒子の輝度、または正しい分類の確率の推定などによる）することができる。
ｃ）その結果、分類グループごとの粒子数が各画像について得られる。この結果は、例えば、画像ごとに１行、分類グループごとに１列の表として表すことができる。

多重化の場合、特定のグループはパラメータ空間で大幅に重複する可能性があり、例えば、図１０に示すように、異なる（輝度より高い）ナノ粒子のモノマーを伴う輝度がより低いナノ粒子のクラスタ（ダイマー、トリマーなど）である。この場合、計算された粒子数は、以下を考慮して補正する必要がある。
ａ）ナノ粒子の１つのタイプのみが存在する測定は、多重化で使用される各タイプのナノ粒子のモノマー、ダイマー、トリマーなどの間の比率を計算するために使用される。
ｂ）これらの粒子について、それらのどの割合が、使用されるさらなるタイプのナノ粒子に属するパラメータ空間の領域に該当するかが計算される。
ｃ）例えば、輝度が最も低いモノマーから始めて、それらの数を使用して、対応するダイマー、トリマーなどの数、および他のナノ粒子に対応するパラメータ空間の領域にそれらがいくつ出現するかを推定する。
ｄ）これらの数値は、特定の領域でカウントされた粒子の数を補正するために使用される。つまり、クラスタの数が未補正のカウントから差し引かれる。
ｅ）例えば、輝度を増すために、残りのナノ粒子に対して手順を繰り返す。

図１０は、３つのバイオマーカ（バイオマーカＡ、バイオマーカＢ、およびバイオマーカＣ）を想定して、多重化の場合の粒子の分類を示している。ここでは、図８と同じパラメータ空間の表現が選択されており、すなわち、１つの色成分と輝度の関係である。各バイオマーカＡ、Ｂ、Ｃに対して個別に、モノマー（Ａ１、Ｂ１、Ｃ１）、ダイマー（Ａ２、Ｂ２、Ｃ２）、トリマー（Ａ３、Ｂ３、Ｃ３）、およびより大きな凝集体（Ａ４、Ｂ４、Ｃ４）がそれぞれ識別される。バイオマーカＡ、Ｂ、Ｃを比較すると、標識として使用される３種類のナノ粒子の輝度と散乱スペクトルが異なるため、ヒストグラム内の「山」の位置が変化する。多重化では、図１０の右下の図に示すように、３つのバイオマーカすべてが一緒に表示される。３つのモノマー（Ａ１、Ｂ１、Ｃ１）は十分に分離されているが、例えば、バイオマーカＣ（Ｃ２）のダイマーはバイオマーカＢ（Ｂ１）のモノマーと重複している。

２つ（またはそれ以上）のタイプの粒子の「山」が実質的に重複している場合、それらの間に単純な境界線を割り当てると、かなりの数の誤って分類された粒子が生じる可能性がある。これは別のアプローチで減らすことができる。適切な関数の合計を使用して、関心のある各粒子タイプ（「山」）に少なくとも１つの成分を使用して、すべての画像から取得したヒストグラムまたは密度分布を当てはめる。次に、各画像のすべての粒子（または同じサンプルに対応するすべての粒子）について、この画像（またはサンプル）のヒストグラムに最もよく一致するこれらの成分の重みが決定され、これらの重みが前述の粒子カウントの代わりに使用される。

－品質管理（２７００）
一般に測定の品質、特に各画像の品質を評価するために、飽和が発生する画像の面積（つまり、正規化された輝度が１に近い領域）が計算され、画像の合焦の程度を表す値が導き出される（例えば、個々のナノ粒子の平均測定サイズ）。
一般的な品質管理とは別に、これらの値は、全体的な解析結果（２８００）の計算をガイドするために使用することができる。

－全体的な解析結果（２８００）
同じサンプルのすべての画像から少なくとも１つの統計値が計算される。可能な実施態様では、４０％の対称トリミングによるトリミング平均は、同じサンプルのすべての画像から計算することができる。この値の計算では、画質（２７００）と相関するパラメータを使用して、サンプルの最も代表的な画像の選択をガイドすることができ、例えば、飽和が発生した領域が大きすぎる画像（例えば、飽和領域＞１０％）、または十分に焦点が合っていない画像（例えば、モノマーのＦＷＨＭ＞１μｍ）を省略することができる。各サンプルについて、サンプルに存在するバイオマーカの量と相関する値が計算される。多重化の場合、バイオマーカごとにそのような値が１つ計算される。この値の適切な選択は、標識として使用される個々のナノ粒子の数である。結果は、画像あたりの平均粒子数、粒子密度（例えば、ｍｍ^２あたりの粒子数）、またはサンプル領域内の粒子の総数への外挿（通常、撮影された画像は領域全体をカバーしていないので外挿）として表すことができる。後者の表現が好ましいが、それは、解釈するのが最も直接的であるため、つまり、バイオセンサで使用される特定の（既知の）量の患者サンプルでは、この数のバイオマーカが検出されているからである。
ユーザに提示される値は、例えば、標準偏差または変動係数（ＣＶ）に基づいて、不確実性の適切な尺度と共に提供される。これらの不確実性は、同じサンプルからの様々な画像間の変動から、および／または個々の画像内の変動から推定することができる。それらは、数値（Ｎ±ΔＮ粒子）として直接報告でき、および／または結果が信頼することができるかどうかを示すために使用することができる。
サンプルの結果の不確実性が特定の限界よりも高い場合には、解析ソフトウェアがこの結果をフィードバックし、スキャナが対応するサンプルの追加の画像を取得して、一貫した結果が得られるかどうかを確認することができる。
さらなるステップとして、解析結果（２８００）はスキャン全体を直接ガイドすることができる。すなわち、特定の目標値が品質パラメータによって満たされるまで、あるいはサンプルごとに時間または画像数が上限に達するまで、各サンプルについて画像が取得される。

画像解析の記載した手順は、概念実証実験で実行され、２つのバイオマーカを検出するためのバイオセンサが準備された。９６ウェルのバイオセンサが使用され、８つの異なるバイオマーカ濃度（１ｆｇ／ｍｌから１ｎｇ／ｍｌと陰性対照）をそれぞれ１２回複製した。提案された光学スキャナでバイオセンサをスキャンし、前述のように解析を行った。バイオセンサには、サイズが１２０ｍｍ ｘ ８０ｍｍのＳｉベースの多誘電体基板を使用した。表面をシラン処理した後に、目的のバイオマーカ用の２つの捕捉抗体の１：１混合物に基づく自己組織化単分子膜を成長させた。取り外し可能な上部構造により、９６の長方形のウェル内のバイオセンサの分割が達成された。直径が１００ｎｍおよび８０ｎｍの球状の金ナノ粒子ＧＮＰが、それぞれＩＬ－６およびＩＬ－１０検出抗体で機能化された。２種類の機能化ＧＮＰの１：１混合物を調製した。サンプルでは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＴ）の緩衝液とウシ胎仔血清ＦＢＳ、ＰＢＳＴ－２５％ＦＢＳを段階希釈したバイオマーカ（１：１０）でスパイクし、最終濃度を１ｎｇ／ｍｌから１ｆｇ／ｍｌにし、陰性対照を加えた。ウェルあたり２００μｌの溶液を使用した。９６ウェルのバイオセンサ上のサンプルの分布を以下の表３に示す。各バイオマーカの濃度は１／ｍｌで示され、値「０」は陰性対照、各濃度（行１～８）は１２回複製される（列１～１２）。

２つのインキュベーションステップの後に、最初にサンプルを使用し、次にＧＮＰを使用して、９６ウェル上部構造を取り外した。バイオセンサ基板を数回洗浄し、最後に乾燥窒素でブロー乾燥した。

－画像の読み出し
この実験では、光学スキャナまたはリーダーは次の構成要素で構築された。
－暗視野顕微鏡対物レンズ５０×／０．８
－高出力白色光ＬＥＤ光源を使用した暗視野ＥＰＩ照明
－１２メガピクセルのＣＭＯＳ ＲＧＢセンサを有するカメラ
－ＪＰＥＧファイルフォーマットで保存する前に適用された画像の２×２ビニング。

バイオセンサの各ウェル内で１３×１３の画像を撮影した。合計１６２２４枚の画像の取得時間は約１００分、つまり１時間あたり約１０，０００枚であった。バイオセンサの均質性の詳細な解析を可能にするために、多数の画像が選択された。関心のある主要な結果である２つのバイオマーカの濃度については、はるかに少ない数の画像で十分であった。例えば、３×３の画像の取得は、約５：２０分しか必要としなかったであろう。顕微鏡の対物レンズの倍率とカメラセンサのサイズにより、バイオセンサの２０８×２８４μｍ^２の視野に対応する画像が得られる。ビニング後の１５０４×２０５６ピクセルの場合、画像のスケールはピクセルあたり０．１３８μｍであった。

画像の解析は、データ収集と並行して、光学スキャナを制御する同じコンピュータで実行した。１つのウェルの１６９枚すべての画像が取得されるたびに、それらはコンピュータで実行されている１１のスレッドを使用して並行して解析した。

－画像の補正と変換
画像のＲＧＢ形式は独立した輝度と色の値を提供しないため、そのような正規化された値を最初に計算した。
輝度＝範囲０～１に正規化されたＲＧＢ値の合計。
相対成分＝各ＲＧＢ成分をＲＧＢ値の合計で割ったもので、範囲０～１に正規化される。

－粒子位置特定
粒子の位置特定は、前述のように行われた。２つの２次元ガウス関数の合計で構成されるグレースケールパターンを使用して、個々の金ナノ粒子からの発光のドーナツ形状を一致させた。パターンのＦＷＨＭ（半値全幅）は、０．７μｍの見かけの粒子サイズに対応した。可能性のある粒子の許容基準として、パターンと画像の間の少なくとも０．６の相関を使用した。ＧＮＰの輝度の１０％未満の可能性のある粒子でさえも特定するために、０．０３の相対輝度という低いしきい値を設定した。

－粒子特性評価
各粒子の強度と発光スペクトルの平均値を取得するために、以前に計算された画像レイヤ（正規化された輝度、正規化された相対色成分）は、２．５ピクセルのシグマを有するガウスフィルタで平滑化され、これは、ＦＷＨＭが約０．８μｍの画像領域全体の平均に対応する、すなわち、一般的な見かけの粒子サイズに近くなる。フィルタ処理されたレイヤは、位置特定ステップで取得された位置で評価され、各粒子の特性のリストが得られた（画像ごとに１つのリスト）。

－粒子分類
前のステップで取得した特性から、正規化された輝度と１つの色成分が選択され、見つかったすべての粒子に基づいて２次元のヒストグラムが計算された。この２Ｄヒストグラム（赤で正規化）のスペクトルと輝度の関係を図１１に示す。ＧＮＰの両方のタイプ（直径８０と１００ｎｍ）のモノマーとダイマーは簡単に区別することができる。最も顕著な２つの「ピーク」は、８０ｎｍ（Ｍ８０）の粒子のモノマーと１００ｎｍ（Ｍ１００）の粒子のモノマーに対応する。対応するダイマー（Ｄ８０、Ｄ１００）も簡単に区別することができるが、大きな凝集体は実質的に重複する。
低い輝度値（＜０．１）では、「ノイズ」として分類された粒子が見られる。発光スペクトルが異なるため（＜０．３３）、製造からの残留物を区別することができ、それらの輝度に応じて、２つのクラス、すなわち、０．１～０．７の範囲の輝度については低、より高い輝度値（＞０．７）については高に分類される。
このヒストグラムに基づいて、分類ルールが定義される。図１１から分かるように、この場合のルールは、２Ｄヒストグラムの長方形（ノイズ、残留物）、楕円形（モノマー、ダイマー）、および多角形領域（凝集体）に対応している。
分類ルールが特性評価ステップの結果に適用され、見つかった各粒子の既知の特性に粒子クラスが追加された。

－粒子カウント
前のステップで取得した分類に基づいて、各クラス内の粒子が各画像でカウントされる。結果は、表４に示すように、画像ごとに１行、粒子クラスごとに１列の表として視覚化することができる。

表４は、粒子カウントの結果を示している。各行は１つの画像に対応し、ウェルと画像インデックスで識別される。さらなる列は、輝度が飽和しているように見える画像領域のパーセンテージ、見つかった粒子の総数、および粒子クラスごとの数（ここでは、クラス１～８）を示している。

粒子クラスごとの結果は、「ヒートマップ」として視覚化することもできる。すなわち、粒子番号は、バイオセンサ上の位置に似た２次元／軸で表される色分けまたはグレースケールの画像として表示される。例として、図１２は、グレースケールヒートマップとしての１つの粒子クラスの結果を示している。

－解析結果
通常、図１２に示すように、カウント統計を改善するために、ウェルごとに複数の画像が取得され、この実験では、１３ｘ１３の画像が取得された。ここで、ウェルの画像の外側の２つの行と列はバイオセンサの非感度領域内にあり、残りの９ｘ９＝８１画像は感度領域内にあり、このウェルの主な結果、すなわち平均値およびその変動係数ＣＶを計算するために使用される。この実験では、８１個の画像に４０％のトリミングを適用した後に、平均粒子数を計算した。
両方のバイオマーカのバイオセンサ上の９６ウェルすべての結果を、以下の表５に示す。

表５に、９６ウェルのバイオセンサの解析結果を示す。各ウェル（＝サンプル）について、ＩＬ－６とＩＬ－１０の２つのバイオマーカの粒子数が示されている。カウント結果ごとに、対応する変動係数が与えられている。測定の最初の品質管理を容易にするために、ＣＶは、変動の程度に応じて、太字（＜２０％）、斜体（＜２５％）、または下線（＞２５％）のフォントで表示される。

例えば、１種類のＧＮＰのモノマーの数とサンプル中の対象のバイオマーカの濃度を関連付ける較正曲線が得られると、粒子カウントをバイオマーカの濃度（例えば、「１２ｐｇ／ｍｌ」）に変換することができる。

このテキストでは、「含む」という用語とその派生語（「含む」など）は、除外の意味で理解されるべきではないことに留意されたい。すなわち、これらの用語は、説明され定義されたものがさらなる要素、ステップなどを含み得る可能性を除外するものとして解釈されるべきではない。

Claims (17)

1. バイオセンサ内のバイオマーカを光学的に検出する方法であって、
   －光学スキャナで前記バイオセンサの少なくとも１つのサンプルから空間的およびスペクトル的に分解された画像を同時に取得し（１１００）、前記画像取得（１１００）と並行して画像解析（１０００）を実行するステップを含み、
   前記画像解析（１０００）は、
   －前記取得した画像のデータを記憶手段から読み出すステップ（２１００）と、
   －前記取得した画像の不均一性およびノイズを低減するために、前記読み出したデータを補正するステップ（２２００）と、
   －各粒子の位置を取得するために、前記補正されたデータを使用して前記取得した画像内の粒子の位置を特定するステップ（２３００）と、ここで、前記粒子はプラズモンナノ粒子であり、
   －各粒子の前記位置および特性評価パラメータを含む中間解析結果（５４００）を取得するために、各粒子を個別に特性評価するステップ（２４００）と、
   －粒子の分類グループを取得するために、各粒子の前記特性評価パラメータに基づいて前記粒子を分類するステップ（２５００）と、
   －取得した各画像について分類グループごとに粒子数をカウントするステップ（２６００）と、
   －同じサンプルから取得したすべての前記画像の分類グループごとの前記粒子数を使用して前記バイオセンサの各サンプルの各バイオマーカについて計算された、少なくとも１つの統計値を含む全体的な解析結果（２８００）を計算するステップであって、サンプルごとの前記少なくとも１つの統計値は、前記サンプル中のバイオマーカの存在の指標と相関している、ステップと、
   を含む、方法。
2. 前記画像取得（１１００）のための前記光学スキャナを制御するために、前記全体的な解析結果（２８００）を使用するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 飽和が発生する画像の領域と画像の合焦の程度の値とを計算することによって、前記中間解析結果（５４００）の少なくとも品質値および取得された各画像の少なくとも品質値を、前記画像解析（１０００）によって取得するステップ（２７００）をさらに含み、前記品質値は、前記全体的な解析結果（２８００）について計算されたサンプルごとの前記統計値と相関付けられるために使用される、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記光学スキャナは、前記品質値が目標値以上になるまで前記サンプルから画像を取得する（１１００）、請求項３に記載の方法。
5. 空間的およびスペクトル的に分解された画像を同時に取得するステップ（１１００）は、
   －広帯域連続スペクトルを用いてグレージング角度で前記バイオセンサを照明するステップと、
   －少なくとも１つのサンプルからの散乱光を取り込むステップと、
   －オートフォーカスシステムを使用して、前記バイオセンサの表面に光学センサで焦点を合わせるステップと、
   －モータ化ユニットを使用して、前記バイオセンサの少なくとも１つのサンプルと前記光学スキャナとの間の３つの空間座標での相対移動を生成するステップと、
   を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. サンプルごとでそして各バイオマーカについての前記全体的な解析結果（２８００）は、前記バイオマーカの濃度をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記全体的な解析結果（２８００）は、前記計算された統計値の不確実性の推定をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記取得した画像の前記読み出したデータを補正するステップ（２２００）は、
   －前記画像の黒レベルを調整するための背景補正（３１００）と、
   －前記画像の輝度および／または色の不均一性（３２００）を補正するステップと、
   －前記画像のガンマ曲線（３３００）を修正するステップと、
   －画像ノイズを低減するために前記画像を平滑化するステップ（３４００）と、
   を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記取得した画像内の粒子の位置を特定するステップ（２３００）は、
   －粒子形状を表す少なくとも１つのテストパターン（４１００）を生成するステップと、－輝度値（３６００）の画像および／または相対色値（３７００）の画像と前記生成されたテストパターンとの間の相互相関画像（４２００）を計算するステップと、
   －前記計算された相互相関画像（４２００）に基づいて前記画像のマスク（４３００）を定義するステップと、
   －定義されたマスク（４３００）および前記相互相関画像（４２００）を使用してグレースケール画像（４４００）を生成するステップと、
   －前記グレースケール画像（４４００）の極大点の位置を特定することにより各粒子の位置を取得するステップと、
   を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 粒子を特性評価するステップ（２４００）が、
    －各粒子の輝度値（３６００）の画像および／または相対色値（３７００）の画像の平滑化されたパラメータ（５１００）を取得するステップと、
    －前記平滑化されたパラメータ（５１００）の平均値を取得するために、各粒子の前記取得された位置で前記平滑化されたパラメータ（５１００）を評価するステップ（５２００）と、
    －各粒子の追加特性（５３００）のパラメータを取得するステップであって、前記パラメータは、少なくとも前記粒子の粒子サイズ、粒子形状、粒子密度、およびスペクトル特性から選択される、ステップと、
    －前記中間解析結果（５４００）の前記特性評価パラメータを、前記平滑化されたパラメータ（５１００）の平均値および前記追加特性（５３００）のパラメータとして取得するステップと、
    を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 粒子を分類するステップ（２５００）が、
    －前記特性評価パラメータに基づいて粒子の分類グループ（６２００）を定義し、様々なバイオマーカの同時検出（６３００）の場合には、粒子カウント（２６００）に使用されるすべての粒子を説明する追加の分類グループを定義するステップと、
    －前記特性評価パラメータの組み合わせを各分類グループにマッピングすることにより、分類パラメータおよびルール（６４００）を定義するステップと、
    －各画像について、前記画像内に局在する各粒子が属する前記分類グループを取得する（６７００）ために、分類パラメータ空間のセグメンテーション（６５００）を実行するステップと、
    を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 粒子を分類するステップ（２５００）が、前記特性評価パラメータに基づいて、前記粒子カウント（２６００）から粒子（６１００）を除外するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
13. 粒子の前記カウント（２６００）が、以下のパラメータ：
    ｉ）粒子の輝度値（３６００）の画像および／または相対色値（３７００）の画像から得られる平滑化されたパラメータ（５１００）、または
    ｉｉ）粒子の少なくとも粒子サイズ、粒子形状、粒子密度およびスペクトル特性から選択される、粒子の追加特性（５３００）のパラメータ、または
    ｉｉｉ）平滑化パラメータ（５１００）および追加特性（５３００）のパラメータの平均値として得られる中間解析結果（５４００）の特性パラメータ
    のうちの少なくとも１つにより重み付けされる、請求項１０～１１のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記取得した画像のデータを読み出すステップ（２１００）は、前記画像解析（１０００）が実行されているコンピュータのメモリにアクセスするステップを含み、前記コンピュータは前記画像を取得する（１１００）ために前記光学スキャナを制御する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記取得した画像のデータを読み出すステップ（２１００）は、前記画像解析（１０００）が実行されている１つまたは複数のコンピュータを有するネットワークの少なくとも１つの記憶装置にアクセスするステップを含み、前記光学スキャナは、前記画像解析（１０００）が実行されている前記コンピュータのいずれとも異なる、前記画像を取得する（１１００）ための別のコンピュータによって制御される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記画像解析（１０００）は、前記ネットワークの複数のコンピュータ間で分割され、各コンピュータが前記光学スキャナによって取得（１１００）された画像のサブセットについて前記画像解析（１０００）を実行する、請求項１５に記載の方法。
17. 前記画像解析（１０００）は、少なくとも１つのコンピュータによって順次実行され、前記少なくとも１つのコンピュータが時間ごとに１つの画像を解析する、または、前記画像解析（１０００）は、少なくとも１つのコンピュータによって並行して実行され、前記少なくとも１つのコンピュータが一度に複数の画像を解析する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
    

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