JP7464038B2 - マイクロ流体デバイスおよび試料分析方法 - Google Patents

Description

本発明は、マイクロ流体デバイスおよび試料分析方法に関する。
本願は、２０１９年３月１日に日本に出願された特願２０１９－０３７５４３号について優先権を主張し、その内容をここに援用する。

近年、半導体回路の製造技術に用いられているエッチング技術やフォトリソグラフィ技術、または微細なプラスチックの成型方法を用いて形成された、種々の形態の微細な流路構造を有するマイクロウェルアレイが検討されている。これらのマイクロウェルアレイのウェルは、微小体積の流体中で種々の生化学的または化学的反応をさせるための化学反応容器として用いられている。

マイクロ流体システムの製作のための材料としては、シリコン及びガラス等の硬質の物質、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）等の種々の高分子樹脂やシリコーンゴム等の軟質の物質等が用いられている。例えば、特許文献１～３および非特許文献１には、このようなマイクロ流体システムを、種々のマイクロチップ、バイオチップとして用いることが記載されている。

ところで、近年、微少量の容積を有する微小空間内で反応を行うことにより生体物質の検査を行う技術が注目されている。そのような技術としては、例えば、デジタル計測技術が挙げられる。デジタル計測技術としては、例えば、核酸の検出および定量における新しいアプローチの一つとして、デジタルＰＣＲ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）技術が挙げられる。デジタルＰＣＲ技術とは、試薬と核酸との混合物を無数の微小液滴に分割してＰＣＲ増幅を行い、核酸を含んだ液滴からは蛍光等のシグナルが検出されるようにしておき、シグナルが検出された液滴を数えることにより定量を行う技術である。

微小液滴の作製方法として、封止液で試薬と核酸との混合物を分断化することにより微小液滴を形成する方法や、基板上に形成した孔に試薬と核酸との混合物を入れ、続いて封止液を入れることにより微小液滴を形成する方法等が検討されている。

特許第６１８３４７１号公報 特表２０１４－５０３８３１号公報 国際公開第２０１３－１５１１３５号

Kim S. H., et al., Large-scale femtoliter droplet array for digital counting of single biomolecules., Lab on a Chip, 12 (23), 4986-4991, 2012.

しかしながら、マイクロ流体デバイスで試料を分析する場合、蓋部材に試薬が非特異的に吸着することがある。従来のマイクロ流体デバイスでは、微細な孔の中の蛍光シグナルを検出する際に、デジタル計測ではない手法では問題とならなかったような、試薬の非特異的な吸着から発せられる蛍光が、蛍光物質を含有するウェルの数をデジタル計測で数える際にノイズとなり得る。
蓋部材にＰＤＭＳ等の一般的に疎水性であるといわれる材料を使うことにより蓋部材への試薬の吸着を抑制することもできるが、用いることができる材料が制約されてしまう。

そこで、本発明者らは、一般的に疎水性であるといわれる材料を用いなくても、蓋部材への試薬の非特異的な吸着を低減させ、検出効率を向上させることが可能であることを見出し、本発明を完成させた。本発明は、蓋部材への試薬の非特異的な吸着を低減させ、検出効率を向上させることが可能なマイクロ流体デバイスを提供することを目的とする。また、本発明は、非特異的な吸着が発する蛍光等が、マイクロウェルから発生するシグナルを検出する際にノイズとなることを抑制し、正しくシグナルを検出することができる試料分析方法を提供することを目的とする。

上記の目的を達成するために、本発明は以下の態様を含む。
［１］複数のマイクロウェルを有するマイクロウェルアレイと、前記マイクロウェルアレイと離間した状態で対向する蓋部材と、を備え、前記マイクロウェルアレイと前記蓋部材との間に流路を有し、前記蓋部材のマイクロウェルアレイ側の面の算術平均粗さＲａが１１ｎｍ以上７０ｎｍ以下であるマイクロ流体デバイス。
［２］前記蓋部材のマイクロウェルアレイ側の面の水との接触角が７０度以上である［１］に記載のマイクロ流体デバイス。
［３］前記蓋部材のマイクロウェルアレイ側の面の表面粗さＲｚが３５０ｎｍ以下である［１］または［２］に記載のマイクロ流体デバイス。
［４］前記蓋部材のマイクロウェルアレイ側の面のＲａ／Ｒｚが０．１０以上０．２３以下である［１］～［３］のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
［５］前記蓋部材のマイクロウェルアレイ側の面に疎水的なコーティングが施されている［１］～［４］のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
［６］［１］～［５］のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイスを用いた試料分析方法であって、試料を含有する水性液体を前記流路に供給することと、前記流路に封止液を導入して前記流路内に存在する前記水性液体と置換し、前記マイクロウェルに前記水性液体を封入することと、前記マイクロウェルにおいて反応を起こし、検出のためのシグナルを発生させることと、前記シグナルを検出することと、を備える試料分析方法。
［７］前記試料が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質、細胞、または細菌である［６］に記載の試料分析方法。

本発明は、試薬の非特異的な吸着を低減させたマイクロ流体デバイスを提供することができる。また、本発明は、非特異的な吸着が発する蛍光等が、マイクロウェルから発生するシグナルを検出する際にノイズとなることを抑制し、正しくシグナルを検出することができる試料分析方法を提供することができる。

本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す斜視図である。 図１のｂ－ｂ線における断面図である。 本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す断面図である。 本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスの使用時の状態を示す図である。 本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスの使用時の状態を示す図である。 本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスを用いた蛍光画像を示す図である。 比較例１に係るマイクロ流体デバイスを用いた蛍光画像を示す図である。 本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスの蓋部材の表面粗さの測定データを示す図である。 本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスの蓋部材の表面粗さの測定データを示す図である。 比較例２に係るマイクロ流体デバイスの蓋部材の表面粗さの測定データを示す図である。 比較例３に係るマイクロ流体デバイスの蓋部材の表面粗さの測定データを示す図である。

本発明の一実施形態について、図１から図５を参照して説明する。本明細書において、各図面における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。

図１は、本実施形態に係るマイクロ流体デバイス１を示す斜視図である。図２は、図１のｂ－ｂ線における断面図である。マイクロ流体デバイス１は、図１および図２に示すように、複数のウェルを有するマイクロウェルアレイ３０と、前記マイクロウェルアレイ３０と離間した状態で対向する蓋部材２０を備え、マイクロウェルアレイ３０と蓋部材２０との間に流路３５を有している。マイクロウェルアレイ３０は、基板１０のみを有してもよく、基板１０の他に底部層３１および壁部層３２を有してもよい。マイクロウェルアレイ３０と蓋部材２０の間には、周縁部材３４が位置している。マイクロウェルアレイ３０と蓋部材２０に挟まれ、且つ周縁部材３４に囲まれた領域が流路３５である。周縁部材３４は、蓋部材２０と一体に形成されていてもよい。

基板１０は、電磁波を透過可能であってもよい。ここで、電磁波としては、Ｘ線、紫外線、可視光線および赤外線等が挙げられる。基板１０が電磁波を透過可能であることにより、マイクロ流体デバイス１に封入した試料と試薬との反応により生じる蛍光又は燐光等を基板１０側から観察することができる。
基板１０は、所定の波長範囲の電磁波のみを透過可能であってもよい。例えば、マイクロウェル内の試料の存在を、可視光領域である３５０～７００ｎｍの波長範囲にピークを有する蛍光の検出により判定場合には、少なくとも上記波長範囲の可視光を透過可能な基板を基板１０として用いればよい。

基板１０を形成する材料としては、例えば、ガラス及び樹脂等が挙げられる。樹脂基板の材料としては、例えば、ＡＢＳ樹脂、ポリカーボネート樹脂、ＣＯＣ（シクロオレフィンコポリマー）、ＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）、アクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリ酢酸ビニル、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）及びＰＥＮ（ポリエチレンナフタレート）等が挙げられる。これらの樹脂は、各種添加剤を含んでいてもよい。添加剤の例としては、酸化防止剤、撥水性を付与する添加剤、親水性を付与する添加剤等が挙げられる。樹脂基板は、上記の樹脂のうち一種のみを含んでいてもよいし、複数の樹脂が混合されていてもよい。

後述する試料分析方法では蛍光や燐光を利用するため、基板１０としては、自家蛍光を実質的に有しない材料を用いる。ここで、「自家蛍光を実質的に有しない」とは、基板が、実験結果の検出に使用する波長の自家蛍光を全く有しないか、自家蛍光を有していても実験結果の検出に影響を与えないほど微弱であることを意味する。例えば、検出対象の蛍光に比べて１／２以下、好ましくは１／１０以下程度の自家蛍光であれば、実験結果の検出に影響を与えないほど微弱であるといえる。

基板１０の厚みは、適宜決定することが出来るが、試料分析において発せられる蛍光や燐光を透過しやすくするため、例えば５ミリメートル（ｍｍ）以下が好ましく、２ｍｍ以下がより好ましく、１．６ｍｍ以下がさらに好ましい。また、加工を容易にするため、例えば、０．１ｍｍ以上が好ましく、０．２ｍｍ以上がより好ましい。基板１０の厚みの上限および下限は、任意に組み合わせることができる。例えば、基板１０の厚みは、０．１ｍｍ以上５ｍｍ以下が好ましく、０．２ｍｍ以上２ｍｍ以下がより好ましく、０．４ｍｍ以上１．６ｍｍ以下がさらに好ましい。

蓋部材２０（単に蓋２０と記載してもよい）は、板状またはシート状に形成された部材である。蓋部材２０は、マイクロウェルアレイ３０と離間した状態で対向している。言い換えれば、蓋部材２０は、複数のマイクロウェル３３を覆っている。流路３５は、蓋部材２０と、マイクロウェルアレイ３０と、周縁部材３４に囲まれる領域である。流路３５は、複数のマイクロウェル３３の開口と接続しており、複数のマイクロウェル３３の上方に位置する。

蓋部材２０は、厚さ方向に貫通する第一孔２１および第二孔２２を有する。蓋部材２０の平面視において、第一孔２１および第二孔２２は、１つまたは複数の前記液的保持部を挟むように位置している。第一孔２１および第二孔２２は、完成したマイクロ流体デバイス１において、マイクロウェルアレイ３０と流路３５を含む内部空間Ｓと連通する。第一孔２１および第二孔２２は、それぞれ内部空間Sに流体を供給する入口および流体が排出される出口として機能する。
蓋部材２０を形成する材料や蓋部材２０の厚みについては、基板１０と同様とすることができる。
蓋部材２０が電磁波透過性を有する場合は、電磁波透過性については適宜設定できる。例えば、後述する電磁波照射工程を蓋部材２０側から行わない場合は、蓋部材２０は電磁波を透過可能でなくてもよい。

前記蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａの算術平均粗さ（Ｒａ）は、７０ｎｍ以下であり、６０ｎｍ以下であることが好ましく、５０ｎｍ以下であることがより好ましく、４０ｎｍ以下であることがさらに好ましく、３５ｎｍ以下であることが特に好ましい。さらに、前記蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａの算術平均粗さ（Ｒａ）は、３０ｎｍ以下であってもよく、２５ｎｍ以下であってもよく、２０ｎｍ以下であってもよく、１５ｎｍ以下であってもよい。前記蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａの算術平均粗さ（Ｒａ）が５０ｎｍ以下であることで、蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａに対する試薬の非特異的な吸着を抑制することができる。

前記蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａの算術平均粗さ（Ｒａ）の下限値は特に限定されないが、例えば５ｎｍである。

前記蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａの算術平均粗さ（Ｒａ）の上限値と下限値は、任意に組み合わせることができる。例えば、前記蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａの算術平均粗さ（Ｒａ）は、５ｎｍ以上７０ｎｍ以下、５ｎｍ以上６０ｎｍ以下、６ｎｍ以上５０ｎｍ以下、７ｎｍ以上４０ｎｍ以下、７ｎｍ以上３５ｎｍ以下、８ｎｍ以上３０ｎｍ以下、８ｎｍ以上２５ｎｍ以下、９ｎｍ以上２０ｎｍ以下、または１０ｎｍ以上１５ｎｍ以下であってもよい。

前記算術平均粗さ（Ｒａ）は、例えば、ＪＩＳ Ｂ ０６０１－２００１に規定された測定方法に準じて測定することができる。測定範囲は、蓋部材の全面であっても、代表的な領域であってもよい。本実施形態における測定範囲は、蓋部材２０の中心を測定範囲の中心とする直線であり、かつ直線の長さ８００μｍ～１．５ｍｍの範囲と定義する。

蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａの算術平均粗さ（Ｒａ）を５０ｎｍ以下とする方法は特に制限はないが、例えば、蓋部材２０に鏡面磨き加工を施すことが挙げられる。蓋部材２０を射出成型により製造する場合は、蓋部材２０の金型をダイヤモンドペースト等により鏡面加工することも挙げられる。

蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａの水との接触角は、７０度以上であってよい。
なお、蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａの水との接触角は、１８０度以下であるので、蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面の水との接触角は、例えば、７０度以上１８０度以下である。
水との接触角は、例えば、ＪＩＳ Ｒ ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて測定することができる。ＪＩＳ Ｒ ３２５７－１９９９に規定された静滴法に代えて、ＡＳＴＭ Ｄ５７２５－１９９７に準拠した方法で接触角を測定してもよい。

前記蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａの表面粗さ（十点平均粗さ）（Ｒｚ）は、３５０ｎｍ以下であることが好ましく、３００ｎｍ以下であることがより好ましく、２５０ｎｍ以下であることが特に好ましい。さらに、前記蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａの表面粗さ（十点平均粗さ）（Ｒｚ）は、２００ｎｍ以下であってもよく、１５０ｎｍ以下であってもよく、１２０ｎｍ以下であってもよく、１１０ｎｍ以下であってもよく、１００ｎｍ以下であってもよく、９０ｎｍ以下であってもよい。前記蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａの表面粗さ（Ｒｚ）が３５０ｎｍ以下であることで、蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａに対する試薬の非特異的な吸着をより抑制することができる。

前記蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａの表面粗さ（十点平均粗さ）（Ｒｚ）の下限値は、は特に限定されないが、例えば５０ｎｍである。
前記蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａの表面粗さ（十点平均粗さ）（Ｒｚ）の上限値と下限値は、任意に組み合わせることができる。例えば、前記蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａの表面粗さ（十点平均粗さ）（Ｒｚ）は、５０ｎｍ以上３５０ｎｍ以下、５５ｎｍ以上３００ｎｍ以下、６０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下、６０ｎｍ以上２００ｎｍ以下、６０ｎｍ以上１５０ｎｍ以下、６５ｎｍ以上１２０ｎｍ以下、７０ｎｍ以上１１０ｎｍ以下、７０ｎｍ以上１００ｎｍ以下または８０ｎｍ以上９０ｎｍ以下であってもよい。

前記表面粗さ（Ｒｚ）は、ＪＩＳ Ｂ ０６０１－２００１に規定された測定方法に準じて測定することができる。測定範囲は、蓋部材の全面であっても、代表的な領域であってもよい。本実施形態における測定範囲は、蓋部材２０の中心を測定範囲の中心とする直線であり、かつ直線の長さ８００μｍ～１．５ｍｍの範囲と定義する。

蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａの表面粗さ（Ｒｚ）を３５０ｎｍ以下とする方法は特に制限はないが、例えば、蓋部材２０に鏡面磨き加工を施すこと等が挙げられる。蓋部材２０を射出成型により製造する場合は、蓋部材２０の金型をダイヤモンドペーストにより鏡面加工することも挙げられる。

前記蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａのＲａ／Ｒｚは、０．１０以上であることが好ましい。前記蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａのＲａ／Ｒｚは、０．２４以下とすることが好ましく、０．２３以下とすることがより好ましく、０．２２５以下とすることがより好ましい。さらに、前記蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａのＲａ／Ｒｚは、０．１６以下であってもよく、０．１５以下であってもよく、０．１４以下であってもよく、０．１３以下であってもよい。

前記蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａのＲａ／Ｒｚの上限値と下限値は、任意に組み合わせることができる。例えば、前記蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａのＲａ／Ｒｚは、０．１０以上０．２４以下、０．１０以上０．２３以下、０．１０以上０．２２５以下、０．１０以上０．１６以下、０．１０以上０．１５以下、０．１０以上０．１４以下または０．１０以上０．１３以下であってもよい。

前記蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａのＲａ／Ｒｚが０．１０以上０．２４以下であると、蓋部材２０の材料が親水性であったとしても、蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａに対する試薬の非特異的な吸着をより抑制することができる。これは、蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａと試薬との電気的及び化学的な相互作用の関係だけではなく、蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａの微小な凹凸が小さいことで、物理的な相互作用も抑制できるからと考えられる。Ｒａ／Ｒｚが０．１０より小さいと、蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａに部分的に突出した部分があることを意味し、その部分に試薬の非特異的な吸着が起こり易いと推測される。Ｒａ／Ｒｚが０．２４より大きいと、蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａが全体的に粗いことを意味し、試薬の非特異的な吸着が起こり易いと推測される。

本実施形態のマイクロ流体デバイスは、前記蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａに疎水的なコーティングを施すことにより、算術平均粗さ（Ｒａ）が前記範囲内であることと代替することができる。従って、前記蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａに疎水的なコーティングが施されていることにより、蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａに対する試薬の非特異的な吸着を抑制することができる。

前記蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａに疎水的なコーティングをする方法としては、例えば、疎水的なコーティング剤を、前記蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａに塗布して、乾燥させる方法等が挙げられる。
前記コーティング剤としては、フッ素系コーティング剤及びフッ素含有ポリマー、シリコーン樹脂等が挙げられる。コーティング方法としては、ドライコーティング法及びウェットコーティング法等が挙げられる。

前記蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａに疎水的なコーティング剤をコートする際の、コーティング層の厚さは、０．０１μｍ以上３μｍ以下が好ましく、０．０５μｍ以上１μｍ以下がより好ましい。

マイクロウェルアレイ３０は、底部層３１と、壁部層３２（隔壁３２と記載してもよい）と、複数のマイクロウェル３３とを有してもよい。底部層３１は、基板１０上に設けられている。壁部層３２は、底部層３１上に形成されている。複数のマイクロウェル３３は、底部層３１と壁部層３２の厚さ方向に形成された複数の貫通孔３２ａとで構成されている。複数のマイクロウェル３３は、壁部層３２においてアレイ状に形成されている。基板１０と蓋部材２０との間の内部空間Ｓにおいて、マイクロウェルアレイ３０と蓋部材２０との間、言い換えれば壁部層３２の上面と蓋部材２０との間には隙間が存在する。この隙間は、複数のマイクロウェル３３、並びに第一孔２１および第二孔２２と連通する流路として機能する。

底部層３１は、マイクロウェル３３の底面を構成する。したがって、底面に親水性を付与したい場合は親水性材料で底部層３１を形成すればよい。底部層３１は、底部層３１が電磁波を透過可能なように形成され、基板１０側からのマイクロウェル３３内の試料観察の妨げにならないようにすることが好ましい。また、底面に疎水性を付与したい場合は疎水性材料で底部層３１を形成すればよい。底部層３１は、基板１０側からのマイクロウェル３３内の試料観察の妨げにならないようにすることが好ましい。また、底部層３１には、自家蛍光を実質的に有しない材料を用いることが好ましい。

なお、マイクロウェル３３の底面の特性が基板１０の特性と同じで問題ない場合は、底部層３１を設けずに、基板１０上に直接壁部層３２が形成されてもよい。従って、その場合、基板１０の表面と壁部層３２の貫通孔３２ａとでマイクロウェル３３が構成される。

壁部層３２は、厚さ方向に見た状態においてアレイ状に設けられた複数の貫通孔３２ａを有する。各貫通孔３２ａの内面は、各マイクロウェル３３の内壁面を構成する。
なお、壁部層３２は、基板１０と一体成形されていてもよい。従って、その場合、基板１０の表面にマイクロウェル３３が構成される。

壁部層３２を形成する材料としては、基板１０を形成する材料と同様の樹脂等を用いることができるが、樹脂に所定の波長の電磁波を吸収する有色成分を混合した材料を用いてもよい。
樹脂材料としては、マイクロウェル３３に求める特性等を考慮して、樹脂の構成成分の分子が親水性基を有する親水性樹脂と、樹脂の構成成分の分子が疎水性基を有する疎水性樹脂とのいずれも用いることができる。

親水性基としては、例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、スルホン基、スルホニル基、アミノ基、アミド基、エーテル基、およびエステル基等が挙げられる。親水性樹脂としては、例えば、シロキサンポリマー；エポキシ樹脂；ポリエチレン樹脂；ポリエステル樹脂；ポリウレタン樹脂；ポリアクリルアミド樹脂；ポリビニルピロリドン樹脂；ポリアクリル酸共重合体等のアクリル樹脂；カチオン化ポリビニルアルコール、シラノール化ポリビニルアルコール、スルホン化ポリビニルアルコール等のポリビニルアルコール樹脂；ポリビニルアセタール樹脂；ポリビニルブチラール樹脂；ポリエチレンポリアミド樹脂；ポリアミドポリアミン樹脂；ヒドロキシメチルセルロース、メチルセルロース等のセルロース誘導体；ポリエチレンオキサイド、ポリエチレンオキサイド－ポリプロピレンオキサイド共重合体等のポリアルキレンオキサイド誘導体；無水マレイン酸共重合体；エチレン－酢酸ビニル共重合体；スチレン－ブタジエン共重合体；および上記の樹脂の組み合わせ等の中から、適宜選択して使用することができる。
疎水性樹脂の例としては、例えば、ノボラック樹脂；アクリル樹脂；メタクリル樹脂；スチレン樹脂；塩化ビニル樹脂；塩化ビニリデン樹脂；ポリオレフィン樹脂；ポリアミド樹脂；ポリイミド樹脂；ポリアセタール樹脂；ポリカーボネート樹脂；ポリフェニレンスルフィド樹脂；ポリスルフォン樹脂；フッ素樹脂；シリコーン樹脂；ユリヤ樹脂；メラミン樹脂；グアナミン樹脂；フェノール樹脂；セルロース樹脂；および上記の樹脂の組み合わせ等の中から、ＪＩＳ Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて測定した接触角が７０度以上である材料を適宜選択して使用することができる。すなわち、本明細書における疎水性とは、ＪＩＳ Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて測定した接触角が７０度以上であることを意味する。なお、ＪＩＳ Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に代えて、ＡＳＴＭ Ｄ５７２５－１９９７に準拠した方法で接触角を測定してもよい。

親水性樹脂および疎水性樹脂のいずれも、熱可塑性樹脂であっても熱硬化性樹脂であってもよい。さらに、電子線やＵＶ光等の活性エネルギー線により硬化する樹脂であってもよく、エラストマーであってもよい。
樹脂材料としてフォトレジストを用いると、フォトリソグラフィにより壁部層３２に多数の微細な貫通孔３２ａを精度良く形成することができる。
フォトリソグラフィを用いる場合、使用するフォトレジストの種類の選択、塗布、および露光（感光）、および不要なフォトレジストの除去の方法には公知の手段を適宜選択することができる。
レジストを用いない場合は、例えば射出成型等により壁部層３２を形成することができる。

有色成分としては、有機質または無機質の顔料が例示できる。具体的には、黒色顔料としては、カーボンブラック、アセチレンブラック、および鉄黒等が挙げられる。黄色顔料としては、クロム黄、亜鉛黄、黄土、ハンザイエロー、パーマネントイエロー、およびベンジンイエローが挙げられる。橙色顔料としては、オレンジレーキ、モリブデンオレンジ、およびベンジンオレンジが挙げられる。赤色顔料としては、べんがら、カドミウムレッド、アンチモン朱、パーマネントレッド、リソールレッド、レーキレッド、ブリリアントスカーレット、およびチオインジゴレッドが挙げられる。青色顔料としては、群青、コバルトブルー、フタロシアニンブルー、フェロシアンブルー、およびインジゴが挙げられる。緑色顔料としては、クロムグリーン、ビリジアンナフトールグリーン、およびフタロシアニングリーン等が挙げられる。

また、壁部層３２を射出成型等で形成する場合、樹脂中に分散する顔料だけでなく、樹脂中に溶解する各種染料も有色成分として用いることが可能である。染料は各種染料法より例示できる。具体的には、直接染料、塩基性染料、カチオン染料、酸性染料、媒染染料、酸性媒染染料、硫化染料、建染染料、ナフトール染料、分散染料、および反応染料などが挙げられる。特に、樹脂を染色する場合には、分散染料が選択されることが多い。

本明細書において、マイクロウェルとは、容積が１０ナノリットル（ｎＬ）以下のウェルを意味する。マイクロウェル３３の容積をこの程度に微小にすることにより、ＰＣＲおよびＩＣＡ（Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅｄ Ａｓｓａｙ）反応等の微小空間内で行う酵素反応を好適に行うことができる。デジタルＰＣＲにより、例えば遺伝子の変異検出等を行うことができる。
マイクロウェル３３の容積は、特に限定されるものではないが、１０フェムトリットル（ｆＬ）以上１００ピコリットル（ｐＬ）以下が好ましく、１０ｆＬ以上５ｐＬ以下がより好ましく、１０ｆＬ以上２ｐＬ以下が最も好ましい。このような範囲に容積を設定すると、後述する試料分析の際に、一つのマイクロウェル３３に、１から数個だけ生体分子または担体を収容するのに適している。

マイクロウェル３３の形状は、容積が上述した範囲内である限り特に制限はない。したがって、例えば、円筒形、複数の面により構成される多面体（例えば、直方体、六角柱、八角柱等）、逆円錐形、および逆角錐形（逆三角錐形、逆四角錐形、逆五角錐形、逆六角錐形、および七角以上の逆多角錐形）等であってもよい。
さらに複数のマクロウェル３３の形状は、上述の形状を二つ以上組み合わせたような形状であってもよい。例えば、複数のマクロウェル３３の一部が円筒形であり、残りが逆円錐形であってもよい。また、複数のマクロウェル３３が逆円錐形または逆角錐形の場合、円錐または角錐の底面が流路３５とマイクロウェル３３とを連通する開口部となる。この場合、逆円錐形または逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状を用いて、マイクロウェル３３の底部を平坦にしてもよい。他の例として、マクロウェル３３の底部が開口部に向かって突出した曲面形状であってもよく、マクロウェル３３の底部が窪んだ曲面形状であってもよい。

壁部層３２の厚さは、マイクロウェル３３の深さを規定する。マイクロウェルが円筒形の場合、生体分子を含む水性液体（試料）を封入する目的のためには、壁部層３２の厚さは、例えば１０ｎｍ以上１００μｍ以下、好ましくは１００ｎｍ以上５０μｍ以下、更に好ましくは１μｍ以上３０μｍ以下、更に好ましくは２μｍ以上１５μｍ以下、更に好ましくは３μｍ以上１０μｍ以下の範囲内とすることができる。
マイクロウェル３３の各部寸法は、収容する水性液体の量や、生体分子を付着させたビーズ等の担体の大きさ等を考慮して、１つのマイクロウェルに１つ、もしくは数個の生体分子が収容されるように適宜決定すればよい。

マイクロウェルアレイ３０に設けるマイクロウェル３３の数や密度は適宜設定できる。
１ｃｍ^２あたりのマイクロウェル３３の数は、例えば１万以上１０００万以下であり、好ましくは１０万以上５００万以下であり、更に好ましくは１０万以上１００万以下である。本明細書において１ｃｍ^２あたりのマイクロウェル３３の数をマイクロウェルの密度と呼ぶことがある。マイクロウェルの密度がこの範囲内であると、所定数のウェルに試料である水性液体を封入させる操作が容易である。また、マイクロウェルの密度がこの範囲内であると、実験結果を解析するためのウェルの観察も容易である。例えば、セルフリーＤＮＡの変異を検出する場合において、野生型ＤＮＡに対する検出対象である変異ＤＮＡの存在割合が０．０１％程度である場合、例えば、１００万～２００万個程度のマイクロウェルを使用することが好適である。
図１では、複数のマイクロウェル３３が一列に並んだ一次元アレイの例を示している。しかしながら、上述のように多数のマイクロウェルを設ける場合、複数のマイクロウェルを二次元に配列した二次元アレイを用いてもよい。

マイクロウェルアレイの周囲には、平面視枠状の周縁部材３４が配置されている。マイクロ流体デバイス１の厚さ方向における周縁部材３４の寸法は、壁部層３２よりも大きい。周縁部材３４は、蓋部材２０を支持することにより蓋部材２０とマイクロウェルアレイとの間に隙間を確保し、流路３５を維持している。つまり、流路３５は、マイクロウェルアレイ３０と蓋部材２０に挟まれ、且つ周縁部材３４により囲まれた領域である。
周縁部材３４の材質等に特に制限はないが、例えばシリコーンゴムまたはアクリル発泡体から形成される芯材フィルムの両面にアクリル系粘着剤が積層された両面粘着テープ等が挙げられる。
なお、周縁部材３４は蓋部材２０と一体成形されていてもよい。その場合、周縁部材３４は、蓋部材２０の段差部となり、前記段差部により蓋部材２０とマイクロウェルアレイとの間に隙間を確保し、流路３５を維持している。

上記のように構成されたマイクロ流体デバイス１は、例えば以下の手順で製造することができる。
まず、基板１０を準備し、基板１０の面上に壁部層３２となる壁部用樹脂層を形成する。底部層３１を設ける場合は、壁部用樹脂層の形成前に底部層３１を形成する。底部層３１を設けない場合でも、必要に応じて基板１０の面上に基板１０と壁部用樹脂層との密着性を高めるアンカー層等を設けてもよい。

壁部樹脂層は、樹脂材料に有色成分を混合した材料により形成されてもよい。樹脂材料がレジストである場合、樹脂材料と有色成分の総質量に対する有色成分の含有率は、例えば０．５質量％（ｍａｓｓ％）以上６０ｍａｓｓ％以下とすることができる。含有率に関して、好ましくは５ｍａｓｓ％以上５５ｍａｓｓ％以下であり、更に２０ｍａｓｓ％以上５０ｍａｓｓ％以下がさらに好ましい。樹脂材料と有色成分の総質量に対する有色成分の含有率は、レジストに含まれる感光成分等の割合を考慮して所望するパターンが構築可能となるように、適宜設定することができる。また、有色成分が顔料である場合、形成するマイクロウェルに対して上述した所定の条件を満たすように顔料の粒子径を設定し、準備する。顔料と共に、樹脂材料に分散剤が適宜添加されてもよい。
形成された壁部樹脂層が樹脂材料に有色成分を混合した材料から形成されている場合、壁部樹脂層は、壁部樹脂層に含有される有色成分に基づいた色彩を有する。

次に、形成された壁部樹脂層に貫通孔３２ａを形成する。上述したように、フォトリソグラフィを用いると、貫通孔３２ａを簡便かつ精度よく形成することができる。壁部樹脂層を射出成型等により形成する場合は、壁部樹脂層の形成と貫通孔の形成とを同一のプロセスで行うことができる。この他、パターンマスクを用いたエッチング等によっても貫通孔３２ａの形成が可能である。
貫通孔３２ａが形成されると、壁部樹脂層が壁部層３２となり、マイクロウェルアレイ３０が完成する。

その後、マイクロウェルアレイ３０の周囲に周縁部材３４を配置してから蓋部材２０を周縁部材３４上に配置する。その際、蓋部材２０のマイクロウェルアレイ３０側の面２０ａのＲａが５０ｎｍ以下となるよう配置する。次に、基板１０、周縁部材３４、および蓋部材２０を一体に接合すると、マイクロ流体デバイス１が完成する。流路は、周縁部材３４により、蓋部材２０と基板１０との間に形成される。接合方法は、特に限定されるものではないが、例えば、接着剤による接合、両面テープを用いた接合、およびレーザー溶着による接合等が挙げられる。

また、マイクロ流体デバイス１は、基板１０と壁部層３２とが一体成形されてもよいし、周縁部材３４と蓋部材２０とが一体成形されていてもよい。図３に、基板１０と壁部層３２とが一体成形され、周縁部材３４と蓋部材２０とが一体成形されているマイクロ流体デバイス２を示す。マイクロ流体デバイス２は、壁部層３２と一体成形された基板１０を、周縁部材３４と一体成形された蓋部材２０に配置し、周縁部材３４と蓋部材２０とが一体成形されることにより形成された段差部を、壁部層３２と一体成形された基板１０に接合することにより、製造することができる。流路３５は、蓋部材２０に形成された段差部により、蓋部材２０と基板１０との間に形成される。
基板１０と壁部層３２とが一体成形され、周縁部材３４と蓋部材２０とが一体成形されている以外のマイクロ流体デバイス２の構成は、上述のマイクロ流体デバイス１と同じである。

他の態様として、基板１０と壁部層３２を別の要素として有し、周縁部材３４と蓋部材２０が一体形成されているマイクロ流体デバイスであってもよい。この場合においても、周縁部材３４と蓋部材２０が一体形成されている以外のマイクロ流体デバイスの構成は、上述のマイクロ流体デバイス１と同じである。

次に、本実施形態に係るマイクロ流体デバイス１を用いた、本実施形態の試料分析方法について図４および図５を参照して説明する。
本実施形態の試料分析方法は、本実施形態に係るマイクロ流体デバイス１を用いた試料の分析方法であって、
試料を含む水性液体を前記流路３５に供給することと、
前記流路３５に封止液を導入して前記流路３５内に存在する前記水性液体と置換し、前記マイクロウェル３３に前記水性液体を封入することと、
前記マイクロ流体デバイスを加熱して前記マイクロウェル３３において反応を起こし、検出のためのシグナルを発生させることと、
前記シグナルを検出することと、
を備える試料分析方法である。

ここで、水性液体とは、試料のほかに、水、緩衝液、および検出反応試薬等を含むことができる。また、水性液体中には、酵素を含有させてもよい。例えば、試料が核酸である場合には、ＰＣＲ法、ＩＣＡ法、ＬＡＭＰ法（商標登録、Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴａｑＭａｎ法（登録商標）、または蛍光プローブ法等を用いることができる。例えば、試料がタンパク質の場合には、ＥＬＩＳＡ法（登録商標）等を用いることができる。さらに、水性液体中には、界面活性剤等の添加物を含有させてもよい。

緩衝液としては、例えばＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、酢酸緩衝液、及びリン酸緩衝液等が挙げられる。
酵素としては、例えばＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、及びフラップエンドヌクレアーゼ等が挙げられる。
界面活性剤としては、例えばＴｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラートともいう）、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（ポリエチレングリコールモノ－４－オクチルフェニルエーテル（ｎ＝約１０）ともいう）、グリセロール、オクチルフェノールエトキシレート、及びアルキルグリコシド等が挙げられる。

本実施形態のマイクロ流体デバイスは、例えば遺伝子の変異検出等において、封入した水性液体の温度を変化させる場合も、ウェル内に水性液体を好適に保持することができる。変化させる温度の範囲、即ち温度変化の下限値から上限値の範囲は、例えば０℃～１００℃であり、好ましくは０℃～８０℃であり、更に好ましくは２０℃～７０℃である。ウェルに封入した水性溶液がこの範囲内であると、ＰＣＲやＩＣＡ反応等の微小空間内で行う反応を好適に行うことができる。

本実施形態に係るマイクロ流体デバイス１を使用して分析する試料としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、脂質、細胞、または細菌等が挙げられる。前記試料としては、例えば血液等の生体から採取した試料であってもよい。また、試料分析により検出する検出対象は、試料に含まれるＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ産物等であってもよいし、人工的に合成された化合物（例えば、試料であるＤＮＡを模した人工的に合成された核酸）等であってもよい。例えば、生体分子であるＤＮＡを検出対象とする場合、ウェルは、ＤＮＡが１分子入るような形状および大きさを有していてもよい。

以下、試料分析方法の詳細について説明する。準備工程として、マイクロウェルに封入する試料を含有する水性液体を調製する。試料を含有する水性液体は、検出対象を含有する水が主な溶媒である液体であり、例えば、生体試料を鋳型とし、検出試薬としてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを含むＰＣＲ反応溶液や、アレルプローブ、ＩＣＡオリゴ、ＦＥＮ－１、および蛍光基質等を含むＩＣＡ反応溶液等が挙げられる。調製においては、界面活性剤を添加して、試料をよりマイクロウェル内に入りやすくしてもよい。また、検出対象を特異的に認識するビーズを添加して、検出対象を捕捉させておいてもよい。検出対象は、ビーズ等の担体に直接または間接的に結合せず、水性液体中に浮遊していてもよい。

次に、シリンジ等を用いて、調製した試料を含有する水性液体１００を第一孔２１から流路３５に供給する（試料供給工程ともいう）。供給された試料を含有する水性液体１００は、図４に示すように、各マイクロウェル３３内および流路３５に充填される。流路３５内の気体は、試料供給工程の前に、脱気操作により予め抜いておく。この脱気操作は、流路３５内にバッファを満たすことにより行ってもよい。バッファとしては、例えば水、緩衝液を含む水、界面活性剤を含む水、及び、緩衝液及び界面活性剤を含む水等が挙げられる。

次に、試料１００を含有する水性液体をマイクロウェル３３に封入する封入工程を行う。封入工程の前に、水性液体に含有される試料内の検出対象に蛍光等の標識を付けておいてもよい。蛍光標識処理は、試料供給工程の前の、例えば試料の調製時に行ってもよいし、試料供給工程後に、蛍光標識を流路３５に導入して行ってもよい。
封入工程では、シリンジ等を用いて、封止液１１０を第一孔２１から流路３５に供給する。供給された封止液１１０は流路内を流れ、図５に示すように、流路３５内に存在する試料を含有する水性液体１００を第二孔２２に向かって押す。そして、封止液１１０は、流路３５内に充填されていた水性液体１００と置換され、流路３５は封止液１１０で充填される。その結果、試料を含有する水性液体１００は、各マイクロウェル３３内のみに、互いに独立した状態で配置され、試料の封入が完了する。

本明細書において封止液１１０とは、マイクロウェルアレイ３０の各マイクロウェル３３に導入された水性液体同士が互いに混合しない状態に隔離するために用いる液体を意味し、例えば、オイル類等が挙げられる。オイルとしては、例えばシグマ社製の商品名「ＦＣ４０」や、３Ｍ社製の商品名「ＨＦＥ－７５００」、ＰＣＲ反応等に用いられるミネラルオイル等を用いることができる。
封止液１１０は、壁部層３２の材質に対する接触角が５度以上３０度以下であることが好ましい。封止液１１０の接触角がこの範囲であると、封止液１１０が水性液体１００を押しやすく、蓋部材２０の表面に水性液体１００が残留しにくくなる。その結果、各マイクロウェル３３に好適に試料を封入することができる。封止液の接触角は、例えば、ＪＩＳ Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて、水の代わりに封止液を用いて測定すればよい。ＪＩＳ Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に代えて、ＡＳＴＭ Ｄ５７２５－１９９７に準拠した方法で接触角を測定してもよい。

続いて、前記マイクロ流体デバイス１を加熱して前記マイクロウェル３３において反応を起こし、検出のためのシグナルを発生させる反応工程を行う。
検出のためのシグナルの例としては、蛍光、化学発光、発色、電位変化、またはｐＨ変化等が挙げられるが、蛍光が好ましい。
反応工程の前に、マイクロ流体デバイス１をサーマルサイクラーにかけて、ＰＣＲ反応やＩＣＡ反応等の酵素反応等を必要に応じて行ってもよい。
前記反応は、例えば生化学反応、より具体的には酵素反応であってもよい。加熱する際の温度は、反応に応じて適宜決定されるが、例えば、６０℃以上１００℃以下である。加熱する際の温度とは、マイクロウェル３３内の試薬液の実際の温度ではなく、サーマルサイクラーまたはインキュベーター等によって設定される、マイクロ流体デバイスの加熱温度のことである。また、加熱する際の温度が例えば６０℃以上１００℃以下であるとは、温度の最高温度が６０℃以上１００℃以下に達することをいい、常に６０℃以上１００℃以下である必要はない。すなわち、上述した変化させる温度の範囲内において、マイクロ流体デバイス１の温度が変化しても構わない。反応の一例として、シグナル増幅反応が挙げられる。シグナル増幅反応は、シグナル増幅のための酵素を含んだ試薬液がマイクロウェル３３内に収容された状態で、マイクロ流体デバイス１を、所望の酵素活性が得られる一定温度条件下、例えば６０℃以上１００℃以下で、所定時間、例えば少なくとも１０分間、好ましくは約１５分間、維持する等温反応である。

次に、上記の反応によってマイクロウェル３３から発生するシグナルを検出する（検出工程）。例えば、シグナルが蛍光である場合は、蛍光顕微鏡にセットし、励起光（電磁波）を照射する。励起光の波長は使用している蛍光標識に応じて適宜設定される。
電磁波の照射は、マイクロ流体デバイス１の基板１０側から行ってもよく、蓋部材２０側、つまりマイクロウェル３３の上側から行ってもよく、その他の任意の方向から行ってもよい。また、電磁波の照射の結果発生する蛍光または燐光の検出は、マイクロウェルアレイの基板側から行ってもよく、ウェル側から行ってもよく、その他の任意の方向から行ってもよいが、例えば蛍光顕微鏡を用いて蛍光または燐光を検出する場合には、マイクロ流体デバイス１の基板１０側から行うことが簡便である。

次に、マイクロウェルアレイ３０を構成する複数のマイクロウェル３３のうち、何個のマイクロウェル３３が蛍光または燐光を発しているかを計測する。計測は、マイクロウェルアレイ３０の蛍光画像を撮影して蛍光画像を用いて行ってもよい。
例えば、マイクロウェルアレイ３０内でＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ増幅が見られたマイクロウェル３３におけるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの蛍光を検出することにより、全てのマイクロウェル３３の数に対する増幅が見られたマイクロウェル３３の数の割合を算出することができる。検出対象が例えば一塩基多型（ＳＮＰ：Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）の場合、蛍光を発するマイクロウェル３３の数を数えることで、ＳＮＰの発現頻度等を分析することができる。

この計測工程において、水性液体は、試料としてタンパク質や酵素を含んでいたり、試薬としての酵素を含んでいたりする場合がある。これらのタンパク質や酵素がビーズに吸着されておらず水性液体中に浮遊している場合、タンパク質や酵素の蓋部材２０表面への吸着が特に発生しやすい。タンパク質や酵素が蓋部材２０に非特異的に吸着し、これらのタンパク質や酵素が蛍光または燐光を発する場合、この蛍光または燐光がノイズとして検出されることになる。本発明のマイクロ流路デバイスによれば、この蓋部材２０への試料や試薬に含まれるタンパク質や酵素の吸着が低減されるため、前記ノイズの発生を抑制することができる。

本発明のもう１つの側面は、以下の態様を包含する。
［８］複数のマイクロウェルを有するマイクロウェルアレイと、前記マイクロウェルアレイと離間した状態で対向する蓋部材と、を備え、前記マイクロウェルアレイと前記蓋部材との間に流路を有し、前記蓋部材のマイクロウェルアレイ側の面の算術平均粗さＲａが５ｎｍ以上５０ｎｍ以下であり、十点平均粗さ（Ｒｚ）が５０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下であるマイクロ流体デバイス。
［９］前記マイクロウェルアレイと前記蓋部材との間に位置し、且つ前記流路を囲む周縁部材をさらに有する［８］に記載のマイクロ流体デバイス。
［１０］前記周縁部材が前記蓋部材と一体に形成された段差部である、［９］に記載のマイクロ流体デバイス。
［１１］前記蓋部材のマイクロウェルアレイ側の面の水との接触角が７０度以上である［８］～［１０］のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
［１２］前記蓋部材のマイクロウェルアレイ側の面のＲａ／Ｒｚが０．１０以上０．２３以下である［８］～［１１］のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
［１３］前記蓋部材のマイクロウェルアレイ側の面に疎水的なコーティングが施されていることを特徴とする［８］～［１２］のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
［１４］前記疎水的なコーティングは、フッ素系コーティング剤及びフッ素含有ポリマー、シリコーン樹脂のうちの１つである、［８］～［１３］のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
［１５］［８］～［１４］のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイスを用いた試料分析方法であって、試料を含有する水性液体を前記流路に供給することと、前記流路に封止液を導入して前記流路内に存在する前記水性液体と置換し、前記マイクロウェルに前記水性液体を封入することと、前記マイクロウェルにおいて反応を起こし、検出のためのシグナルを発生させることと、前記シグナルを検出することと、を備える試料分析方法。
［１６］前記試料が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質、細胞、または細菌である［１５］に記載の試料分析方法。

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
射出成形で形成したＣＯＰ製（ＺＥＯＮＯＲ１０１０Ｒ、日本ゼオン社製）の矩形状の基板とＣＯＰ製の矩形状の蓋部材の２つの樹脂製の部材を準備した。ＣＯＰ製の基板は、基板全面に径１０μｍ、深さ１５μｍの円筒状の微小孔が配置され、射出成形により成形された基板を用いた。蓋部材には、高さが１００μｍとなる段差部、つまり周縁部材と注入口と排出口とを形成した。注入口と排出口は、周縁部材の内側に蓋部材の長手方向に沿って配置させた。
スチール製の蓋部材の金型における蓋部材底面（段差部が形成されている面）に相当する面を、＃３０００ダイヤモンドペーストで磨き、金型の鏡面加工を実施した。
成形した蓋部材底面の水との接触角を、接触角測定器ＳＡ－２０（協和界面科学社製）を用いて、ＪＩＳ Ｒ ３２５７－１９９９に規定される静滴法に準じて測定した。実施例１の蓋部材底面の水との接触角は、８５度であった。
また、成形した蓋部材の表面粗さを、接触式表面粗さ測定器（ＴＡＬＹＳＵＲＦ ＰＧＩ１２４０、Ｔａｙｌｏｒ Ｈｏｂｓｏｎ社製）を使用して測定した。本測定では、走査範囲８００μｍにおける、開始点（高さ０ｎｍとする）に対する高低差を取得した。
表１に、上記蓋部材底面のＲａおよびＲｚの測定結果を示す。

上記のＣＯＰ製の基板と蓋部材とを、蓋部材の鏡面加工した面が基板側となるように、蓋部材の段差部にミネラルオイルを塗布することにより接着し、マイクロ流体デバイスを作製した。
基板と蓋部材の間の流路に下記表２に示す組成のバッファを、２００μＬ送液し、微小孔チップの各ウェルにバッファを充填した。

次に、上記流路に下記表３に示す組成の蛍光試薬（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、東京化成工業社製）を１０μL送液し、バッファを蛍光試薬に置換した。さらにフルオロカーボンオイル（ＦＣ４０、シグマ社製）を１５０μｌ送液して微小孔チップの各ウェルを個別に封止した。なお、本実施例においては、蛍光反応は行っていないが、蛍光反応を行った場合と同様の状態とするために、蛍光試薬に酵素を加えている。

上記マイクロ流体デバイスをホットプレート上にセットし、６６℃で１５分間加熱した後、蛍光顕微鏡（ＢＺ－７１０、ＫＥＹＥＮＣＥ社製）で４倍の対物レンズを用いて、微小孔チップの蛍光画像を観察した。露光時間は、明視野２０ｍｓｅｃで、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）の蛍光フィルターを用いて３０００ｍｓｅｃとした。

図６Aに、実施例１のマイクロ流体デバイスにおける、液滴形成後の微小孔チップの蛍光観察結果を示す。観察画像のサイズは、５８０μｍ×５８０μｍであった。実施例１のマイクロ流体デバイスは、試薬が蓋部材底面に非特異的に吸着することなく、正しく液滴数を計測することができた。

（比較例１）
金型における蓋部材底面に相当する面に鏡面加工を行わない以外は、実施例１と同様にして、マイクロ流体デバイスを作製した。上記蓋部材底面のＲａおよびＲｚの測定結果を表１に示す。比較例１の蓋部材底面の水との接触角は、８５度であった。

上記で作製したマイクロ流体デバイスに、実施例１と同様にして、バッファと蛍光試薬を送液し、液滴を形成させ、微小孔チップの蛍光画像を観察した。
図６Bに比較例１のマイクロ流体デバイスにおける、液滴形成後の微小孔チップの蛍光観察の結果を示す。図中の矢印の部分に代表的な試薬付着を示した。矢印部分以外にも、視野全体に、試薬付着が多数見られた。
図６Bに示したように、鏡面加工していない蓋部材を用いた比較例１のマイクロ流体デバイスは、蓋部材底面に試薬が非特異的に付着し、付着した箇所が原因で正しい液滴数が計測できなかった。
この結果から、蓋部材底面の水との接触角が同じであっても、Ｒａが５０ｎｍ以下であることにより、試薬の蓋部材底面への非特異的な吸着を低減させることができることが明らかとなった。

（実施例２）
実施例１と同じ方法でＣＯＰ製の基材を製造した。蓋部材の金型における蓋部材底面に相当する面の鏡面加工の時間を長くした以外は、実施例１と同じ方法でＣＯＰ製の蓋部材を製造した。成形した蓋部材の表面粗さを、表面粗さ測定器（ＳＪ－２１０、ミツトヨ製）を使用して測定した。本測定の走査範囲は、蓋部材の中心を走査範囲の中心とし、かつ蓋部材の長手方向と垂直な方向に１．５ｍｍとし、開始点（高さ０ｎｍとする）に対する高低差を取得した。表４に、実施例２の蓋部材底面のＲａおよびＲｚの測定結果を示す。図７は、実施例２のマイクロ流体デバイスの蓋部材の表面粗さの測定データを示す図である。

基材と蓋部材とを、蓋部材の鏡面加工した面が基板側となるように、蓋部材の段差部にミネラルオイルを塗布することにより接着し、マイクロ流体デバイスを作製した。
実施例1と同じ条件でバッファ、蛍光試薬およびミネラルオイルをマイクロ流体デバイスに送液し、微小孔チップの各ウェルに蛍光試薬を個別に封止した。なお、本実施例でも、実施例1と同様に蛍光反応は行っていないが、蛍光反応を行った場合と同様の状態とするために、蛍光試薬に酵素を加えている。

上記マイクロ流体デバイスをホットプレート上にセットし、６６℃で１５分間加熱した後、蛍光顕微鏡（ＢＺ－７１０、ＫＥＹＥＮＣＥ社製）で４倍の対物レンズを用いて、微小孔チップの蛍光画像を観察した。露光時間は、明視野２０ｍｓｅｃで、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）の蛍光フィルターを用いて３０００ｍｓｅｃとした。観察視野は、３．６ｍｍ×２．７ｍｍの領域とした。

蛍光画像において、ウェル中に標的分子が存在するときに酵素反応によって発光する蛍光の強度を基準として、基準以上の蛍光強度を発している領域を蛍光試薬が吸着している部分であると判断し、蛍光試薬が吸着している部分の面積を算出した。
蛍光画像全体の面積に対する、蛍光試薬が吸着している部分の面積を、吸着面積の比率（％）として求めた。吸着面積の比率が１０％未満の場合を吸着の抑制が良好であると評価し、１０％以上の場合を吸着の抑制が悪いと評価した。その結果を表４に示す。

（実施例３）
蓋部材の金型における蓋部材底面に相当する面の鏡面加工の時間を短くした以外は、実施例２と同じ方法により、実施例３の試薬の吸着面積の比率を求めた。その結果を表４に示す。図８は、実施例３のマイクロ流体デバイスの蓋部材の表面粗さの測定データを示す図である。

（比較例２および比較例３）
蓋部材の金型における蓋部材底面に相当する面の鏡面加工を行わなかった以外は、実施例２と同じ方法により、比較例２および３の試薬の吸着面積の比率を求めた。その結果を表４に示す。図９および図１０は、それぞれ比較例２および比較例３のマイクロ流体デバイスの蓋部材の表面粗さの測定データを示す図である。

蓋部材底面、つまり蓋部材のマイクロウェルアレイ側の面のＲａが７０ｎｍ以下である実施例２および３では、吸着面積の比率がそれぞれ１．８％および３．６％と良好な値だった。

一方で、蓋部材のマイクロウェルアレイ側の面のＲａが７０ｎｍより大きい比較例２および３では、吸着面積の比率がそれぞれ２２．３％および２１．０％だった。比較例２および３では、蓋部材の金型における蓋部材底面に相当する面の鏡面加工を行なわなかったため、蓋部材底面の表面粗さを制御することができず表面粗さにばらつきが生じた。

吸着面積の比率が１０％未満の場合を吸着の抑制が良好であると評価した理由は以下の通りである。
吸着面積の比率が１０％を超える場合、例えばマイクロ流体デバイスの全ウェル中に１個しか標的分子が入らないような低濃度のサンプルを測定しようとすると、１０％以上の確率で試薬が吸着している部分と重なるウェルに標的分子が封入される。試薬が吸着している部分のウェルが酵素反応によって発光したとしても、その発光を検出することができず、陰性であると誤って判断（擬陰性）されてしまう。同じ測定を２回行ったとしても、１％以上の確率（１００人に１人以上）で擬陰性になってしまう。
一方、吸着面積の比率が１０％未満の場合、例えば実施例２および３のように吸着面積の比率が５％以下の場合、擬陰性は５％以下の確率となり、同じ測定を２回行うことで、偽陰性の確率を０．２５％以下まで下げることができる。

本発明によれば、ウェル内の水性液体の蛍光や燐光等を可能な限り正確に検出することができるマイクロ流体デバイスおよび試料分析方法を提供することができる。例えば、生体由来のＤＮＡやＲＮＡ等の検出により診断を行う場合等に、微小な空間内へ試薬とともに核酸を入れることが可能となる。

１ マイクロ流体デバイス
１０ 基板
２０ 蓋部材
３０ マイクロウェルアレイ
３２ 壁部層
３３ マイクロウェル
１００ 水性液体
１１０ 封止液

Claims (7)

1. 複数のマイクロウェルを有するマイクロウェルアレイと、
   前記マイクロウェルアレイと離間した状態で対向する蓋部材と、
   を備え、
   前記マイクロウェルアレイと前記蓋部材との間に流路を有し、
   前記蓋部材のマイクロウェルアレイ側の面の算術平均粗さＲａが１１ｎｍ以上７０ｎｍ以下である、マイクロ流体デバイス。
2. 前記蓋部材のマイクロウェルアレイ側の面の水との接触角が７０度以上である、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
3. 前記蓋部材のマイクロウェルアレイ側の面の表面粗さＲｚが３５０ｎｍ以下である、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
4. 前記蓋部材のマイクロウェルアレイ側の面のＲａ／Ｒｚが０．１０以上０．２４以下である、請求項１～３のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
5. 前記蓋部材のマイクロウェルアレイ側の面に疎水的なコーティングが施されている、請求項１～４のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
6. 請求項１～５のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイスを用いた試料分析方法であって、
   試料を含有する水性液体を前記流路に供給することと、
   前記流路に封止液を導入して前記流路内に存在する前記水性液体と置換し、前記マイクロウェルに前記水性液体を封入することと、
   前記マイクロ流体デバイスを加熱して前記マイクロウェルにおいて反応を起こし、検出のためのシグナルを発生させることと、
   前記シグナルを検出することと、
   を備える試料分析方法。
7. 前記試料が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質、細胞、または細菌であることを特徴とする請求項６に記載の試料分析方法。

Images