JP7461368B2 - タウの播種または凝集の遺伝的修飾因子を同定するためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓスクリーニングプラットフォーム - Google Patents

タウの播種または凝集の遺伝的修飾因子を同定するためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓスクリーニングプラットフォーム Download PDF

Info

Publication number
JP7461368B2
JP7461368B2 JP2021556257A JP2021556257A JP7461368B2 JP 7461368 B2 JP7461368 B2 JP 7461368B2 JP 2021556257 A JP2021556257 A JP 2021556257A JP 2021556257 A JP2021556257 A JP 2021556257A JP 7461368 B2 JP7461368 B2 JP 7461368B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
tau
cell population
protein
cells
aggregation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2021556257A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2022526099A (ja
JPWO2020190932A5 (ja
Inventor
マリーヌ プリセット，
マシュー コス，
ウェン フューリー，
ブライアン ザンブロウィッツ，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharmaceuticals Inc filed Critical Regeneron Pharmaceuticals Inc
Publication of JP2022526099A publication Critical patent/JP2022526099A/ja
Publication of JPWO2020190932A5 publication Critical patent/JPWO2020190932A5/ja
Priority to JP2024046338A priority Critical patent/JP2024071489A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7461368B2 publication Critical patent/JP7461368B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1082—Preparation or screening gene libraries by chromosomal integration of polynucleotide sequences, HR-, site-specific-recombination, transposons, viral vectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1086—Preparation or screening of expression libraries, e.g. reporter assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1089—Design, preparation, screening or analysis of libraries using computer algorithms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C12N2320/12—Applications; Uses in screening processes in functional genomics, i.e. for the determination of gene function
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/99—Coculture with; Conditioned medium produced by genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7047—Fibrils-Filaments-Plaque formation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０１９年３月１８日に出願された米国出願第６２／８２０，０８６号の利益を主張し、これはすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＥＦＳ ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表への参照
ファイル５４４６３５ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔに記述された配列表は、７５．７キロバイトであり、２０２０年３月１６日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
タンパク質の異常な凝集または線維化は、特にアルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）などのいくつかの神経変性疾患を含む、多くの疾患の決定的な特徴である。これらの疾患の多くでは、ある特定のタンパク質の不溶性凝集体への線維化は、疾患の特徴であるだけでなく、神経毒性の原因因子としても関係している。さらに、これらの疾患は、ステレオタイプのパターンに従って中枢神経系を介する凝集の病状の伝播によって特徴付けられ、このプロセスは疾患の進行と相関している。したがって、異常なタンパク質凝集のプロセス、または凝集体の細胞間増殖を変更する遺伝子および遺伝子経路の同定は、神経変性疾患の病因をよりよく理解する上で、ならびに治療的介入のための戦略を考案する上で大いに価値がある。
タウ凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングする方法、タウ凝集を誘導または感作するための馴化培地を生成する方法、およびタウ凝集陽性細胞集団を生成する方法が本明細書に提供される。Ｃａｓ－タウバイオセンサー細胞またはそのような細胞の集団、ならびにＣａｓ－タウバイオセンサー細胞および馴化培地のインビトロ培養物もまた本明細書に提供される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）－タウバイオセンサー細胞またはそのような細胞の集団、ならびにＳＡＭ－タウバイオセンサー細胞および馴化培地のインビトロ培養物もまた本明細書に提供される。
一態様では、タウ凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングする方法が提供される。いくつかのそのような方法（ＣＲＩＳＰＲｎ）は、（ａ）Ｃａｓタンパク質と、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインと、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインとを含む細胞集団を提供することと、（ｂ）複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを細胞集団に導入することと、（ｃ）ゲノム編集および拡大を可能にするために細胞集団を培養することであって、複数の固有のガイドＲＮＡが、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質が、複数の遺伝子を切断して遺伝子機能のノックアウトをもたらし、遺伝子修飾された細胞集団を生成する、培養することと、（ｄ）遺伝子修飾された細胞集団をタウ播種剤と接触させて、播種された細胞集団を生成することと、（ｅ）タウ凝集体の形成を可能にするために播種された細胞集団を培養することであって、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインの凝集体が、播種された細胞集団のサブセットに形成されて、凝集陽性細胞集団を生成しする、培養することと、（ｆ）ステップ（ｃ）での遺伝子修飾された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された凝集陽性細胞集団における複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することとを含むことができ、ステップ（ｃ）での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊は、タウ凝集を増強するか、またはタウ凝集の候補遺伝的修飾因子であり（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊は、タウ凝集を増強すると予期される。
いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、ヒトタウリピートドメインである。いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、凝集促進変異を含む。任意に、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、タウＰ３０１Ｓ変異を含む。
いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、タウ４リピートドメインを含む。いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、配列番号１１を含む。いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインは、同じである。いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインは、同じであり、各々が、タウＰ３０１Ｓ変異を含むタウ４リピートドメインを含む。
いくつかのそのような方法では、第１のレポーターおよび第２のレポーターは、蛍光タンパク質である。任意に、第１のレポーターおよび第２のレポーターは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対である。任意に、第１のレポーターは、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）であり、第２のレポーターは、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）である。
いくつかのそのような方法では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。任意に、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である。任意に、Ｃａｓタンパク質は、配列番号２１を含む。任意に、Ｃａｓタンパク質は、配列番号２２に示される配列を含むコード配列によってコードされる。
いくつかのそのような方法では、Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインは、細胞集団において安定して発現される。いくつかのそのような方法では、Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインをコードする核酸は、細胞集団においてゲノム的に組み込まれる。
いくつかのそのような方法では、細胞は、真核細胞である。任意に、細胞は、哺乳動物細胞である。任意に、細胞は、ヒト細胞である。任意に、細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。
いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、細胞の大部分が固有のガイドＲＮＡのうちの１つのみを受け取るように選択された濃度で導入される。いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、１００以上の遺伝子、１０００以上の遺伝子、または１００００以上の遺伝子を標的とする。いくつかのそのような方法では、ライブラリは、ゲノムワイドライブラリである。
いくつかのそのような方法では、複数の標的配列は、標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される。任意に、少なくとも３つの標的配列は、標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される。任意に、約３～約６個の標的配列（例えば、約３、約４、または約６個）は、標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される。
いくつかのそのような方法では、各ガイドＲＮＡは、構成的エクソンを標的とする。任意に、各ガイドＲＮＡは、５’構成的エクソンを標的とする。いくつかのそのような方法では、各ガイドＲＮＡは、第１のエクソン、第２のエクソン、または第３のエクソンを標的とする。
いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、ウイルス形質導入によって細胞集団に導入される。任意に、複数の固有のガイドＲＮＡの各々は、別個のウイルスベクター内にある。任意に、複数の固有のガイドＲＮＡは、レンチウイルス形質導入によって細胞集団に導入される。いくつかのそのような方法では、細胞集団は、約０．３未満の感染多重度で感染する。
いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、選択マーカーと共に細胞集団に導入され、ステップ（ｂ）が、選択マーカーを含む細胞を選択することをさらに含む。任意に、選択マーカーは、薬物に対する耐性を付与する。任意に、選択マーカーは、ピューロマイシンまたはゼオシンに対する耐性を付与する。任意に、選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、およびブラストサイジンＳデアミナーゼから選択される。任意に、選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、ブラストサイジンＳデアミナーゼ、およびブレオマイシン耐性タンパク質から選択される。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｂ）において複数の固有のガイドＲＮＡが導入される細胞集団は、固有のガイドＲＮＡあたり約３００個を超える細胞を含む。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｃ）は、約３日～約９日である。任意に、ステップ（ｃ）は、約６日である。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｄ）は、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する培養されたタウ凝集陽性細胞から採取された馴化培地の存在下で、遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含む。任意に、馴化培地は、コンフルエントなタウ凝集陽性細胞上に約１日～約７日間置いた後に採取された。任意に、馴化培地は、コンフルエントなタウ凝集陽性細胞上に約４日間置いた後に採取された。任意に、ステップ（ｄ）は、約７５％の馴化培地および約２５％の新鮮な培地中で遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含む。いくつかのそのような方法では、遺伝子修飾された細胞集団は、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在するタウ凝集陽性細胞と共培養されない。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｅ）は、約２日～約６日である。任意に、ステップ（ｅ）は、約４日である。いくつかのそのような方法では、第１のレポーターおよび第２のレポーターは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対であり、ステップ（ｅ）での凝集陽性細胞集団は、フローサイトメトリーによって同定される。
いくつかのそのような方法では、存在量は、次世代シーケンシングによって決定される。いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対するガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｃ）での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ガイドＲＮＡは、濃縮されているとみなされる。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｆ）は、ステップ（ｃ）の第１の時点および／またはステップ（ｃ）の第２の時点で、ステップ（ｃ）での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での凝集陽性細胞集団において複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することを含む。任意に、ステップ（ｃ）の第１の時点は、細胞集団を培養する第１の継代であり、第２の時点は、ゲノム編集および拡大を可能にするために、細胞集団の培養の途中である。任意に、ステップ（ｃ）の第１の時点は、培養の約３日後であり、ステップ（ｃ）の第２の時点は、培養の約６日後である。
いくつかのそのような方法では、遺伝子は、タウ凝集の遺伝的修飾因子とみなされ、遺伝子の破壊は、（１）複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｃ）の第１の時点およびステップ（ｃ）の第２の時点の両方で、ステップ（ｃ）での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ならびに／または（２）複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とする少なくとも２つの固有のガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｃ）の第１の時点またはステップ（ｃ）の第２の時点のいずれかで、ステップ（ｃ）での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合に、タウ凝集を増強する（またはタウ凝集の候補遺伝的修飾因子であり、遺伝子の破壊はタウ凝集を増強すると予期される）。
いくつかのそのような方法では、以下のステップ：（１）ステップ（ｅ）で生成された凝集陽性細胞集団に、複数の固有のガイドＲＮＡのうちのどれが存在するかを同定すること、（２）式ｎＣｎ’＊（ｘ－ｎ’）Ｃ（ｍ－ｎ）／ｘＣｍを使用して、ステップ（ｆ）（１）で同定されたガイドＲＮＡが存在するランダム確率を計算することであって、式中、ｘが、ステップ（ｂ）で細胞集団に導入された様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｍが、ステップ（ｆ）（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｎが、遺伝子を標的とするステップ（ｂ）で細胞集団に導入され様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｎ’が、遺伝子を標的とする、ステップ（ｆ）（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡである、計算すること、（３）ステップ（ｆ）（１）で同定されたガイドＲＮＡの平均濃縮スコアを計算することであって、ガイドＲＮＡの濃縮スコアが、ステップ（ｅ）で生成された凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの相対存在量を、ステップ（ｃ）での培養された細胞集団におけるガイドＲＮＡの相対存在量で割ったものであり、相対存在量が、ガイドＲＮＡの読み取りカウントを、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団の読み取りカウントで割ったものである、計算すること、および（４）遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが、存在するランダム確率を大幅に下回り、濃縮スコアの閾値を上回っている場合に遺伝子を選択することは、タウ凝集の遺伝的修飾因子として遺伝子を同定するためにステップ（ｆ）で施され、遺伝子の破壊は、タウ凝集を増強する（またはタウ凝集の候補遺伝的修飾因子としてであり、遺伝子の破壊はタウ凝集を増強することが予期される）。
いくつかのそのような方法（ＣＲＩＳＰＲａ）は、（ａ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラＣａｓタンパク質と、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質と、第１のレポーター連結された第１のタウリピートドメインと、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインとを含む細胞集団を提供することと、（ｂ）複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを細胞集団に導入することと、（ｃ）転写活性化および拡大を可能にするために細胞集団を培養することであって、複数の固有のガイドＲＮＡが、キメラＣａｓタンパク質およびキメラアダプタータンパク質と複合体を形成し、複合体が、複数の遺伝子の転写を活性化して遺伝子発現の増加をもたらし、遺伝子修飾された細胞集団を生成する、培養することと、（ｄ）遺伝子修飾された細胞集団をタウ播種剤と接触させて、播種された細胞集団を生成することと、（ｅ）タウ凝集体の形成を可能にするために播種された細胞集団を培養することであって、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインの凝集体が、播種された細胞集団のサブセットに形成されて、凝集陽性細胞集団を生成する、培養することと、（ｆ）ステップ（ｃ）での遺伝子修飾された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された凝集陽性細胞集団における複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することとを含むことができ、ステップ（ｃ）での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウ凝集を増強するか、またはタウ凝集の候補遺伝的修飾因子であり（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウ凝集を増強すると予期される。
いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、ヒトタウリピートドメインである。いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、凝集促進変異を含む。任意に、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、タウＰ３０１Ｓ変異を含む。
いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、タウ４リピートドメインを含む。いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、配列番号１１を含む。いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインは、同じである。いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインは、同じであり、各々が、タウＰ３０１Ｓ変異を含むタウ４リピートドメインを含む。
いくつかのそのような方法では、第１のレポーターおよび第２のレポーターは、蛍光タンパク質である。任意に、第１のレポーターおよび第２のレポーターは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対である。任意に、第１のレポーターは、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）であり、第２のレポーターは、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）である。
いくつかのそのような方法では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。任意に、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である。いくつかのそのような方法では、キメラＣａｓタンパク質は、ＶＰ６４転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含み、任意に、キメラＣａｓタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、核局在化シグナル、およびＶＰ６４転写活性化因子ドメインを含む。いくつかのそのような方法では、アダプタータンパク質は、ＭＳ２コートタンパク質であり、キメラアダプタータンパク質中の１つ以上の転写活性化ドメインは、ｐ６５転写活性化ドメインおよびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み、任意に、キメラアダプタータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、ＭＳ２コートタンパク質、核局在化シグナル、ｐ６５転写活性化ドメイン、およびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含む。いくつかのそのような方法では、キメラＣａｓタンパク質は、配列番号３６を含み、任意に、キメラＣａｓタンパク質は、配列番号３８に示される配列を含むコード配列によってコードされる。いくつかのそのような方法では、キメラアダプタータンパク質は、配列番号３７を含み、任意に、キメラアダプタータンパク質は、配列番号３９に示される配列を含むコード配列によってコードされる。
いくつかのそのような方法では、キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインは、細胞集団において安定して発現される。いくつかのそのような方法では、キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインをコードする核酸は、細胞集団においてゲノム的に組み込まれる。
いくつかのそのような方法では、細胞は、真核細胞である。任意に、細胞は、哺乳動物細胞である。任意に、細胞は、ヒト細胞である。任意に、細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。
いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、細胞の大部分が固有のガイドＲＮＡのうちの１つのみを受け取るように選択された濃度で導入される。いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、１００以上の遺伝子、１０００以上の遺伝子、または１００００以上の遺伝子を標的とする。いくつかのそのような方法では、ライブラリは、ゲノムワイドライブラリである。
いくつかのそのような方法では、複数の標的配列は、標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される。任意に、少なくとも３つの標的配列は、標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される。任意に、約３～約６個の標的配列（例えば、約３、約４、または約６個）は、標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される。任意に、約３つの標的配列は、標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される。
いくつかのそのような方法では、各ガイドＲＮＡは、転写開始部位の２００ｂｐ上流内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする。いくつかのそのような方法では、各ガイドＲＮＡは、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つ以上のアダプター結合エレメントを含む。任意に、各ガイドＲＮＡは、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる２つのアダプター結合エレメントを含む。任意に、第１のアダプター結合エレメントは、１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第１のループ内にあり、第２のアダプター結合エレメントは、１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第２のループ内にある。任意に、アダプター結合エレメントは、配列番号３３に示される配列を含む。いくつかのそのような方法では、１つ以上のガイドＲＮＡの各々は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）部分に融合したＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）部分を含む単一のガイドＲＮＡであり、第１のループは、配列番号１７の残基１３～１６に対応するテトラループであり、第２のループは、配列番号１７の残基５３～５６に対応するステムループ２である。
いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、ウイルス形質導入によって細胞集団に導入される。任意に、複数の固有のガイドＲＮＡの各々は、別個のウイルスベクター内にある。任意に、複数の固有のガイドＲＮＡは、レンチウイルス形質導入によって細胞集団に導入される。いくつかのそのような方法では、細胞集団は、約０．３未満の感染多重度で感染する。
いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、選択マーカーと共に細胞集団に導入され、ステップ（ｂ）が、選択マーカーを含む細胞を選択することをさらに含む。任意に、選択マーカーは、薬物に対する耐性を付与する。任意に、選択マーカーは、ピューロマイシンまたはゼオシンに対する耐性を付与する。任意に、選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、およびブラストサイジンＳデアミナーゼから選択される。任意に、選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、ブラストサイジンＳデアミナーゼ、およびブレオマイシン耐性タンパク質から選択される。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｂ）において複数の固有のガイドＲＮＡが導入される細胞集団は、固有のガイドＲＮＡあたり約３００個を超える細胞を含む。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｃ）は、約３日～約９日である。任意に、ステップ（ｃ）は、約６日である。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｄ）は、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する培養されたタウ凝集陽性細胞から採取された馴化培地の存在下で、遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含む。任意に、馴化培地は、コンフルエントなタウ凝集陽性細胞上に約１日～約７日間置いた後に採取された。任意に、馴化培地は、コンフルエントなタウ凝集陽性細胞上に約４日間置いた後に採取された。任意に、ステップ（ｄ）は、約７５％の馴化培地および約２５％の新鮮な培地中で遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含む。いくつかのそのような方法では、遺伝子修飾された細胞集団は、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在するタウ凝集陽性細胞と共培養されない。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｅ）は、約２日～約６日である。任意に、ステップ（ｅ）は、約４日である。いくつかのそのような方法では、第１のレポーターおよび第２のレポーターは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対であり、ステップ（ｅ）での凝集陽性細胞集団は、フローサイトメトリーによって同定される。
いくつかのそのような方法では、存在量は、次世代シーケンシングによって決定される。いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対するガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｃ）での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ガイドＲＮＡは、濃縮されているとみなされる。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｆ）は、ステップ（ｃ）の第１の時点および／またはステップ（ｃ）の第２の時点で、ステップ（ｃ）での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での凝集陽性細胞集団において複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することを含む。任意に、ステップ（ｃ）の第１の時点は、細胞集団を培養する第１の継代であり、第２の時点は、ゲノム編集および拡大を可能にするために、細胞集団の培養の途中である。任意に、ステップ（ｃ）の第１の時点は、培養の約３日後であり、ステップ（ｃ）の第２の時点は、培養の約６日後である。
いくつかのそのような方法では、遺伝子は、タウ凝集の遺伝的修飾因子とみなされ、遺伝子の転写活性化は、（１）複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｃ）の第１の時点およびステップ（ｃ）の第２の時点の両方で、ステップ（ｃ）での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ならびに／または（２）複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とする少なくとも２つの固有のガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｃ）の第１の時点またはステップ（ｃ）の第２の時点のいずれかで、ステップ（ｃ）での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合に、タウ凝集を増強する（またはタウ凝集の候補遺伝的修飾因子であり、遺伝子の転写活性化はタウ凝集を増強すると予期される）。
いくつかのそのような方法では、以下のステップ：（１）ステップ（ｅ）で生成された凝集陽性細胞集団に、複数の固有のガイドＲＮＡのうちのどれが存在するかを同定すること、（２）式ｎＣｎ’＊（ｘ－ｎ’）Ｃ（ｍ－ｎ）／ｘＣｍを使用して、ステップ（ｆ）（１）で同定されたガイドＲＮＡが存在するランダム確率を計算することであって、式中、ｘが、ステップ（ｂ）で細胞集団に導入された様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｍが、ステップ（ｆ）（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｎが、遺伝子を標的とするステップ（ｂ）で細胞集団に導入され様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｎ’が、遺伝子を標的とする、ステップ（ｆ）（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡである、計算すること、（３）ステップ（ｆ）（１）で同定されたガイドＲＮＡの平均濃縮スコアを計算することであって、ガイドＲＮＡの濃縮スコアが、ステップ（ｅ）で生成された凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの相対存在量を、ステップ（ｃ）での培養された細胞集団におけるガイドＲＮＡの相対存在量で割ったものであり、相対存在量が、ガイドＲＮＡの読み取りカウントを、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団の読み取りカウントで割ったものである、計算すること、および（４）遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが、存在するランダム確率を大幅に下回り、濃縮スコアの閾値を上回っている場合に遺伝子を選択することは、タウ凝集の遺伝的修飾因子として遺伝子を同定するためにステップ（ｆ）で施され、遺伝子の転写活性化は、タウ凝集を増強する（またはタウ凝集の候補遺伝的修飾因子としてであり、遺伝子の転写活性化はタウ凝集を増強することが予期される）。
別の態様では、タウ凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングする追加の方法が提供される。いくつかのそのような方法（ＣＲＩＳＰＲｎ）は、（ａ）Ｃａｓタンパク質と、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインと、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインとを含む細胞集団を提供することと、（ｂ）複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを細胞集団に導入することと、（ｃ）ゲノム編集および拡大を可能にするために細胞集団を培養することであって、複数の固有のガイドＲＮＡが、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質が、複数の遺伝子を切断して遺伝子機能のノックアウトをもたらし、遺伝子修飾された細胞集団を生成する、培養することと、（ｄ）遺伝子修飾された細胞集団をタウ播種剤と接触させて、播種された細胞集団を生成することと、（ｅ）タウ凝集体の形成を可能にするために播種された細胞集団を培養することであって、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインの凝集体が、播種された細胞集団の第１のサブセットに形成されて、凝集陽性細胞集団を生成し、凝集陰性細胞集団を生成するために播種された細胞集団の第２のサブセットに形成されない、培養することと、（ｆ）ステップ（ｅ）で同定された凝集陰性細胞集団および／もしくはステップ（ｄ）での播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された凝集陽性細胞集団における複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定すること、ならびに／またはステップ（ｅ）で同定された凝集陽性細胞集団および／もしくはステップ（ｄ）での播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された凝集陰性細胞集団における複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することとを含むことができ、ステップ（ｅ）で同定された凝集陽性細胞集団および／もしくはステップ（ｄ）での播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された凝集陰性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮、またはステップ（ｅ）で同定された凝集陰性細胞集団および／もしくはステップ（ｄ）での播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊はタウ凝集を防止するか、またはタウ凝集の候補遺伝的修飾因子であり（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊は、タウ凝集を防止することが予期され、かつ／またはステップ（ｅ）で同定された凝集陰性細胞集団および／もしくはステップ（ｄ）での播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮、またはステップ（ｅ）で同定された凝集陽性細胞集団および／もしくはステップ（ｄ）での播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された凝集陰性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊は、タウ凝集を促進もしくは増強するか、またはタウ凝集の候補遺伝的修飾因子であり（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊は、タウ凝集を促進もしくは増強することが予期される。
いくつかのそのような方法では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。任意に、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である。いくつかのそのような方法では、Ｃａｓタンパク質は、配列番号２１を含み、任意に、Ｃａｓタンパク質は、配列番号２２に示される配列を含むコード配列によってコードされる。
いくつかのそのような方法では、Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインは、細胞集団において安定して発現される。いくつかのそのような方法では、Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインをコードする核酸は、細胞集団においてゲノム的に組み込まれる。
いくつかのそのような方法では、各ガイドＲＮＡは、構成的エクソンを標的とする。任意に、各ガイドＲＮＡは、５’構成的エクソンを標的とする。いくつかのそのような方法では、各ガイドＲＮＡは、第１のエクソン、第２のエクソン、または第３のエクソンを標的とする。
いくつかのそのような方法（ＣＲＩＳＰＲａ）は、（ａ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラＣａｓタンパク質と、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質と、第１のレポーター連結された第１のタウリピートドメインと、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインとを含む細胞集団を提供することと、（ｂ）複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを細胞集団に導入することと、（ｃ）転写活性化および拡大を可能にするために細胞集団を培養することであって、複数の固有のガイドＲＮＡが、キメラＣａｓタンパク質およびキメラアダプタータンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質が、複合体が、複数の遺伝子の転写を活性化して遺伝子発現の増加をもたらし、遺伝子修飾された細胞集団を生成する、培養することと、（ｄ）遺伝子修飾された細胞集団をタウ播種剤と接触させて、播種された細胞集団を生成することと、（ｅ）タウ凝集体の形成を可能にするために播種された細胞集団を培養することであって、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインの凝集体が、播種された細胞集団の第１のサブセットに形成されて、凝集陽性細胞集団を生成し、凝集陰性細胞集団を生成するために播種された細胞集団の第２のサブセットに形成されない、培養することと、（ｆ）ステップ（ｅ）で同定された凝集陰性細胞集団および／もしくはステップ（ｄ）での播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された凝集陽性細胞集団における複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定すること、ならびに／またはステップ（ｅ）で同定された凝集陽性細胞集団および／もしくはステップ（ｄ）での播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された凝集陰性細胞集団における複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することとを含み、ステップ（ｅ）で同定された凝集陽性細胞集団および／もしくはステップ（ｄ）での播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された凝集陰性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮、またはステップ（ｅ）で同定された凝集陰性細胞集団および／もしくはステップ（ｄ）での播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウ凝集を防止するか、またはタウ凝集の候補遺伝的修飾因子であり（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウ凝集を防止することが予期され、かつ／またはステップ（ｅ）で同定された凝集陰性細胞集団および／もしくはステップ（ｄ）での播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮、またはステップ（ｅ）で同定された凝集陽性細胞集団および／もしくはステップ（ｄ）での播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された凝集陰性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウ凝集を促進もしくは増強するか、またはタウ凝集の候補遺伝的修飾因子であり（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウ凝集を促進もしくは増強することが予期される。
いくつかのそのような方法では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。任意に、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である。いくつかのそのような方法では、キメラＣａｓタンパク質は、ＶＰ６４転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含み、任意に、キメラＣａｓタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、核局在化シグナル、およびＶＰ６４転写活性化因子ドメインを含む。いくつかのそのような方法では、アダプタータンパク質は、ＭＳ２コートタンパク質であり、キメラアダプタータンパク質中の１つ以上の転写活性化ドメインは、ｐ６５転写活性化ドメインおよびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み、任意に、キメラアダプタータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、ＭＳ２コートタンパク質、核局在化シグナル、ｐ６５転写活性化ドメイン、およびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含む。いくつかのそのような方法では、キメラＣａｓタンパク質は、配列番号３６を含み、任意に、キメラＣａｓタンパク質は、配列番号３８に示される配列を含むコード配列によってコードされる。いくつかのそのような方法では、キメラアダプタータンパク質は、配列番号３７を含み、任意に、キメラアダプタータンパク質は、配列番号３９に示される配列を含むコード配列によってコードされる。
いくつかのそのような方法では、キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインは、細胞集団において安定して発現される。いくつかのそのような方法では、キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインをコードする核酸は、細胞集団においてゲノム的に組み込まれる。
いくつかのそのような方法では、各ガイドＲＮＡは、転写開始部位の２００ｂｐ上流内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする。いくつかのそのような方法では、各ガイドＲＮＡは、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つ以上のアダプター結合エレメントを含む。任意に、各ガイドＲＮＡは、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる２つのアダプター結合エレメントを含む。任意に、第１のアダプター結合エレメントは、１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第１のループ内にあり、第２のアダプター結合エレメントは、１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第２のループ内にある。任意に、アダプター結合エレメントは、配列番号３３に示される配列を含む。任意に、１つ以上のガイドＲＮＡの各々は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）部分に融合したＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）部分を含む単一のガイドＲＮＡであり、第１のループは、配列番号１７の残基１３～１６に対応するテトラループであり、第２のループは、配列番号１７の残基５３～５６に対応するステムループ２である。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｃ）は、約３日～約１３日である。いくつかのそのような方法では、ステップ（ｃ）は、約７日～約１０日、約７日、または約１０日である。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｄ）は、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する培養されたタウ凝集陽性細胞からの細胞溶解物を含む馴化培地の存在下で、遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含む。任意に、培地中の細胞溶解物は、約１～約５μｇ／ｍＬの濃度である。いくつかのそのような方法では、細胞溶解物を含む培地は、リポフェクタミンまたは別のトランスフェクション試薬をさらに含む。任意に、細胞溶解物を含む培地は、約１．５～約４μＬ／ｍＬの濃度でリポフェクタミンを含む。いくつかのそのような方法では、遺伝子修飾された細胞集団は、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在するタウ凝集陽性細胞と共培養されない。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｅ）は、約１日～約３日である。任意に、ステップ（ｅ）は、約２日である。いくつかのそのような方法では、第１のレポーターおよび第２のレポーターは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対であり、ステップ（ｅ）での凝集陽性細胞集団および凝集陰性細胞集団は、フローサイトメトリーによって同定される。いくつかのそのような方法では、存在量は、次世代シーケンシングによって決定される。
いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対するガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｅ）での凝集陽性細胞集団および／またはステップ（ｄ）での播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ガイドＲＮＡはステップ（ｅ）での凝集陰性細胞集団において濃縮されているとみなされ、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対するガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｅ）での凝集陰性細胞集団および／またはステップ（ｄ）での播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合、ガイドＲＮＡはステップ（ｅ）での凝集陽性細胞集団において枯渇しているとみなされ、あるいは複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対するガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｅ）での凝集陰性細胞集団および／またはステップ（ｄ）での播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ガイドＲＮＡがステップ（ｅ）での凝集陽性細胞集団において濃縮されているとみなされ、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対するガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｅ）での凝集陽性細胞集団および／またはステップ（ｄ）での播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合、ガイドＲＮＡがステップ（ｅ）での凝集陰性細胞集団において枯渇しているとみなされる。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｆ）は、ステップ（ｅ）での凝集陽性細胞集団、ステップ（ｃ）の第１の時点での培養された細胞集団、およびステップ（ｄ）の第２の時点での播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での凝集陰性細胞集団における複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することを含み、かつ／またはステップ（ｆ）は、ステップ（ｅ）での凝集陰性細胞集団、ステップ（ｃ）の第１の時点での培養された細胞集団、およびステップ（ｄ）の第２の時点での播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での凝集陽性細胞集団における複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することを含む。任意に、ステップ（ｃ）の第１の時点は、細胞集団を培養する第１の継代である。任意に、ステップ（ｃ）の第１の時点は、培養の約３日後であり、ステップ（ｃ）の第２の時点は、培養の約７日後または培養の約１０日後である。
いくつかのそのような方法では、遺伝子は、タウ凝集の遺伝的修飾因子であるとみなされ、遺伝子の破壊（ＣＲＩＳＰＲｎ）または転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）は、（１）複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｅ）での凝集陽性細胞集団、ステップ（ｃ）の第１の時点での培養された細胞集団、およびステップ（ｄ）の第２の時点での播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ならびに／または（２）複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｅ）での凝集陽性細胞集団およびステップ（ｄ）の第２の時点での播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ならびに／または（３）複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｅ）での凝集陰性細胞集団、ステップ（ｃ）の第１の時点での培養された細胞集団、およびステップ（ｄ）の第２の時点での播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合、ならびに／または、（４）複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｅ）での凝集陰性細胞集団およびステップ（ｄ）の第２の時点での播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合に、タウ凝集を防止する（またはダウ凝集の候補遺伝的修飾因子であり、遺伝子の破壊または転写活性化は、タウ凝集を防止することが予期される）。いくつかのそのような方法では、遺伝子は、タウ凝集の遺伝的修飾因子であるとみなされ、遺伝子の破壊（ＣＲＩＳＰＲｎ）または転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）は、（１）複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｅ）での凝集陰性細胞集団、ステップ（ｃ）の第１の時点での培養された細胞集団、およびステップ（ｄ）の第２の時点での播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ならびに／または（２）複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｅ）での凝集陰性細胞集団およびステップ（ｄ）の第２の時点での播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ならびに／または（３）複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｅ）での凝集陽性細胞集団、ステップ（ｃ）の第１の時点での培養された細胞集団、およびステップ（ｄ）の第２の時点での播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合、ならびに／または、（４）複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｅ）での凝集陽性細胞集団およびステップ（ｄ）の第２の時点での播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合に、タウ凝集を促進または増強する（またはダウ凝集の候補遺伝的修飾因子であり、遺伝子の破壊または転写活性化は、タウ凝集を促進または増強することが予期される）。
いくつかのそのような方法では、以下のステップ：（１）ステップ（ｅ）で生成された凝集陰性細胞集団に、複数の固有のガイドＲＮＡのうちのどれが存在するかを同定すること、（２）式ｎＣｎ’＊（ｘ－ｎ’）Ｃ（ｍ－ｎ）／ｘＣｍを使用して、ステップ（ｆ）（１）で同定されたガイドＲＮＡが存在するランダム確率を計算することであって、式中、ｘが、ステップ（ｂ）で細胞集団に導入された様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｍが、ステップ（ｆ）（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｎが、遺伝子を標的とするステップ（ｂ）で細胞集団に導入され様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｎ’が、遺伝子を標的とする、ステップ（ｆ）（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡである、計算すること、（３）ステップ（ｆ）（１）で同定されたガイドＲＮＡの平均濃縮スコアを計算することであって、ガイドＲＮＡの濃縮スコアが、ステップ（ｅ）で生成された凝集陰性細胞集団におけるガイドＲＮＡの相対存在量を、ステップ（ｅ）で生成された凝集陽性細胞集団またはステップ（ｄ）での播種された細胞集団におけるガイドＲＮＡの相対存在量で割ったものであり、相対存在量が、ガイドＲＮＡの読み取りカウントを、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団の読み取りカウントで割ったものである、計算すること、および（４）遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが、存在するランダム確率を大幅に下回り、濃縮スコアの閾値を上回っている場合に遺伝子を選択することは、タウ凝集の遺伝的修飾因子として遺伝子を同定するためにステップ（ｆ）で施され、遺伝子の破壊（ＣＲＩＳＰＲｎ）または転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）は、タウ凝集を防止する（またはタウ凝集の候補遺伝的修飾因子としてであり、遺伝子の破壊（ＣＲＩＳＰＲｎ）または転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）は、タウ凝集を防止することが予期される）。いくつかのそのような方法では、以下のステップ：（１）ステップ（ｅ）で生成された凝集陽性細胞集団に、複数の固有のガイドＲＮＡのうちのどれが存在するかを同定すること、（２）式ｎＣｎ’＊（ｘ－ｎ’）Ｃ（ｍ－ｎ）／ｘＣｍを使用して、ステップ（ｆ）（１）で同定されたガイドＲＮＡが存在するランダム確率を計算することであって、式中、ｘが、ステップ（ｂ）で細胞集団に導入された様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｍが、ステップ（ｆ）（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｎが、遺伝子を標的とするステップ（ｂ）で細胞集団に導入され様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｎ’が、遺伝子を標的とする、ステップ（ｆ）（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡである、計算すること、（３）ステップ（ｆ）（１）で同定されたガイドＲＮＡの平均濃縮スコアを計算することであって、ガイドＲＮＡの濃縮スコアが、ステップ（ｅ）で生成された凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの相対存在量を、ステップ（ｅ）で生成された凝集陰性細胞集団またはステップ（ｄ）での播種された細胞集団におけるガイドＲＮＡの相対存在量で割ったものであり、相対存在量が、ガイドＲＮＡの読み取りカウントを、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団の読み取りカウントで割ったものである、計算すること、および（４）遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが、存在するランダム確率を大幅に下回り、濃縮スコアの閾値を上回っている場合に遺伝子を選択することは、タウ凝集の遺伝的修飾因子として遺伝子を同定するためにステップ（ｆ）で施され、遺伝子の破壊（ＣＲＩＳＰＲｎ）または転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）は、タウ凝集を促進または増強する（またはタウ凝集の候補遺伝的修飾因子としてであり、遺伝子の破壊または転写活性化は、タウ凝集を促進または増強することが予期される）。
いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、ヒトタウリピートドメインである。いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、凝集促進変異を含む。任意に、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、タウＰ３０１Ｓ変異を含む。
いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、タウ４リピートドメインを含む。いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、配列番号１１を含む。いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインは、同じである。いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインは、同じであり、各々が、タウＰ３０１Ｓ変異を含むタウ４リピートドメインを含む。
いくつかのそのような方法では、第１のレポーターおよび第２のレポーターは、蛍光タンパク質である。任意に、第１のレポーターおよび第２のレポーターは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対である。任意に、第１のレポーターは、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）であり、第２のレポーターは、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）である。
いくつかのそのような方法では、細胞は、真核細胞である。任意に、細胞は、哺乳動物細胞である。任意に、細胞は、ヒト細胞である。任意に、細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。
いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、細胞の大部分が固有のガイドＲＮＡのうちの１つのみを受け取るように選択された濃度で導入される。いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、１００以上の遺伝子、１０００以上の遺伝子、または１００００以上の遺伝子を標的とする。いくつかのそのような方法では、ライブラリは、ゲノムワイドライブラリである。
いくつかのそのような方法では、複数の標的配列は、標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される。任意に、少なくとも３つの標的配列は、標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される。任意に、約３～約６個の標的配列（例えば、約３、約４、または約６個）は、標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される。任意に、約３つの標的配列は、標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される。
いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、ウイルス形質導入によって細胞集団に導入される。任意に、複数の固有のガイドＲＮＡの各々は、別個のウイルスベクター内にある。任意に、複数の固有のガイドＲＮＡは、レンチウイルス形質導入によって細胞集団に導入される。いくつかのそのような方法では、細胞集団は、約０．３未満の感染多重度で感染する。
いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、選択マーカーと共に細胞集団に導入され、ステップ（ｂ）が、選択マーカーを含む細胞を選択することをさらに含む。任意に、選択マーカーは、薬物に対する耐性を付与する。任意に、選択マーカーは、ピューロマイシンまたはゼオシンに対する耐性を付与する。任意に、選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、およびブラストサイジンＳデアミナーゼから選択される。任意に、選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、ブラストサイジンＳデアミナーゼ、およびブレオマイシン耐性タンパク質から選択される。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｂ）において複数の固有のガイドＲＮＡが導入される細胞集団は、固有のガイドＲＮＡあたり約３００個を超える細胞を含む。
別の態様では、タウ凝集および／または脱凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングする方法が提供される。いくつかのそのような方法（ＣＲＩＳＰＲｎ）は、（ａ）Ｃａｓタンパク質と、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインと、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインとを含む細胞集団を提供することであって、細胞が、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在するタウ凝集陽性細胞である、提供することと、（ｂ）複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを細胞集団に導入することと、（ｃ）ゲノム編集および拡大を可能にするために細胞集団を培養することであって、複数の固有のガイドＲＮＡが、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質が、複数の遺伝子を切断して遺伝子機能のノックアウトをもたらし、遺伝子修飾された細胞集団を生成し、培養することが、凝集陽性細胞集団および凝集陰性細胞集団をもたらす、培養することと、（ｄ）凝集陽性細胞集団および凝集陰性細胞集団を同定することと、（ｅ）ステップ（ｄ）で同定された凝集陰性細胞集団および／もしくはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）で同定された凝集陽性細胞集団における複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定すること、ならびに／またはステップ（ｄ）で同定された凝集陽性細胞集団および／もしくはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）で同定された凝集陰性細胞集団における複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することとを含み、ステップ（ｄ）で同定された凝集陽性細胞集団および／もしくはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）で同定された凝集陰性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮、またはステップ（ｄ）で同定された凝集陰性細胞集団および／もしくはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）で同定された凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ脱凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊は、タウ脱凝集を促進するか、またはタウ脱凝集の候補遺伝的修飾因子であり（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊は、タウ脱凝集を促進すると予期され、かつ／またはステップ（ｄ）で同定された凝集陰性細胞集団および／もしくはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）で同定された凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮、またはステップ（ｄ）で同定された凝集陽性細胞集団および／もしくはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）で同定された凝集陰性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊は、タウ凝集を促進もしくは増強するか、またはタウ凝集の候補遺伝的修飾因子であり（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊は、タウ凝集を促進または増強すると予期される。
いくつかのそのような方法では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。任意に、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である。いくつかのそのような方法では、Ｃａｓタンパク質は、配列番号２１を含み、任意に、Ｃａｓタンパク質は、配列番号２２に示される配列を含むコード配列によってコードされる。
いくつかのそのような方法では、Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインは、細胞集団において安定して発現される。いくつかのそのような方法では、Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインをコードする核酸は、細胞集団においてゲノム的に組み込まれる。
いくつかのそのような方法では、各ガイドＲＮＡは、構成的エクソンを標的とする。任意に、各ガイドＲＮＡは、５’構成的エクソンを標的とする。いくつかのそのような方法では、各ガイドＲＮＡは、第１のエクソン、第２のエクソン、または第３のエクソンを標的とする。
いくつかのそのような方法（ＣＲＩＳＰＲａ）は、（ａ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラＣａｓタンパク質と、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質と、第１のレポーター連結された第１のタウリピートドメインと、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインとを含む細胞集団を提供することであって、細胞が、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在するタウ凝集陽性細胞である、提供することと、（ｂ）複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを細胞集団に導入することと、（ｃ）転写活性化および拡大を可能にするために細胞集団を培養することであって、複数の固有のガイドＲＮＡが、キメラＣａｓタンパク質およびキメラアダプタータンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質が、複合体が、複数の遺伝子の転写を活性化して遺伝子発現の増加をもたらし、遺伝子修飾された細胞集団を生成し、培養することが、凝集陽性細胞集団および凝集陰性細胞集団をもたらす、培養することと、（ｄ）凝集陽性細胞集団および凝集陰性細胞集団を同定することと、（ｅ）ステップ（ｄ）で同定された凝集陰性細胞集団および／もしくはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）で同定された凝集陽性細胞集団における複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定すること、ならびに／またはステップ（ｄ）で同定された凝集陽性細胞集団および／もしくはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）で同定された凝集陰性細胞集団における複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することとを含み、ステップ（ｄ）で同定された凝集陽性細胞集団および／もしくはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）で同定された凝集陰性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮、またはステップ（ｄ）で同定された凝集陰性細胞集団および／もしくはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）で同定された凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ脱凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウ脱凝集を促進するか、またはタウ脱凝集の候補遺伝的修飾因子であり（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウ脱凝集を促進すると予期され、かつ／またはステップ（ｄ）で同定された凝集陰性細胞集団および／もしくはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）で同定された凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮、またはステップ（ｄ）で同定された凝集陽性細胞集団および／もしくはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）で同定された凝集陰性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウ凝集を促進もしくは増強するか、またはタウ凝集の候補遺伝的修飾因子であり（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウ凝集を促進または増強すると予期される。
いくつかのそのような方法では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。任意に、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である。いくつかのそのような方法では、キメラＣａｓタンパク質は、ＶＰ６４転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含み、任意に、キメラＣａｓタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、核局在化シグナル、およびＶＰ６４転写活性化因子ドメインを含む。いくつかのそのような方法では、アダプタータンパク質は、ＭＳ２コートタンパク質であり、キメラアダプタータンパク質中の１つ以上の転写活性化ドメインは、ｐ６５転写活性化ドメインおよびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み、任意に、キメラアダプタータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、ＭＳ２コートタンパク質、核局在化シグナル、ｐ６５転写活性化ドメイン、およびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含む。いくつかのそのような方法では、キメラＣａｓタンパク質は、配列番号３６を含み、任意に、キメラＣａｓタンパク質は、配列番号３８に示される配列を含むコード配列によってコードされる。いくつかのそのような方法では、キメラアダプタータンパク質は、配列番号３７を含み、任意に、キメラアダプタータンパク質は、配列番号３９に示される配列を含むコード配列によってコードされる。
いくつかのそのような方法では、キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインは、細胞集団において安定して発現される。いくつかのそのような方法では、キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインをコードする核酸は、細胞集団においてゲノム的に組み込まれる。
いくつかのそのような方法では、各ガイドＲＮＡは、転写開始部位の２００ｂｐ上流内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする。いくつかのそのような方法では、各ガイドＲＮＡは、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つ以上のアダプター結合エレメントを含む。任意に、各ガイドＲＮＡは、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる２つのアダプター結合エレメントを含む。任意に、第１のアダプター結合エレメントは、１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第１のループ内にあり、第２のアダプター結合エレメントは、１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第２のループ内にある。任意に、アダプター結合エレメントは、配列番号３３に示される配列を含む。任意に、１つ以上のガイドＲＮＡの各々は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）部分に融合したＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）部分を含む単一のガイドＲＮＡであり、第１のループは、配列番号１７の残基１３～１６に対応するテトラループであり、第２のループは、配列番号１７の残基５３～５６に対応するステムループ２である。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｃ）は、約３日～約１４日である。任意に、ステップ（ｃ）は、約１０日～約１４日または約１２日～約１４日である。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｄ）は、細胞周期の進行を同期させて、主にＳ期に濃縮された細胞集団を得ることを含む。任意に、同期は、二重チミジンブロックによって達成される。
いくつかのそのような方法では、第１のレポーターおよび第２のレポーターは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対であり、ステップ（ｄ）での凝集陽性細胞集団および凝集陰性細胞集団は、フローサイトメトリーによって同定される。いくつかのそのような方法では、存在量は、次世代シーケンシングによって決定される。
いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対するガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｄ）での凝集陽性細胞集団および／またはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）での凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ガイドＲＮＡはステップ（ｄ）での凝集陰性細胞集団において濃縮されているとみなされ、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対するガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｄ）での凝集陰性細胞集団および／またはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）での凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合、ガイドＲＮＡはステップ（ｄ）での凝集陽性細胞集団において枯渇しているとみなされ、あるいは複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対するガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｄ）での凝集陰性細胞集団および／またはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）での凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ガイドＲＮＡがステップ（ｄ）での凝集陽性細胞集団において濃縮されているとみなされ、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対するガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｄ）での凝集陽性細胞集団および／またはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）での凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合、ガイドＲＮＡがステップ（ｄ）での凝集陰性細胞集団において枯渇しているとみなされる。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｅ）は、ステップ（ｄ）での凝集陽性細胞集団、ステップ（ｃ）の第１の時点での培養された細胞集団、およびステップ（ｃ）の第２の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）での凝集陰性細胞集団における複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することを含み、かつ／またはステップ（ｅ）が、ステップ（ｅ）での凝集陰性細胞集団、ステップ（ｃ）の第１の時点での培養された細胞集団、およびステップ（ｃ）の第２の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）での凝集陽性細胞集団における複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することを含む。任意に、ステップ（ｃ）の第１の時点は、細胞集団を培養する第１の継代であり、第２の時点は、ゲノム編集および拡大または転写活性化および拡大を可能にするために、細胞集団の培養の途中である。任意に、ステップ（ｃ）の第１の時点は、培養の約７日後であり、ステップ（ｃ）の第２の時点は、培養の約１０日後である。
いくつかのそのような方法では、遺伝子は、タウ脱凝集の遺伝的修飾因子であるとみなされ、遺伝子の破壊（ＣＲＩＳＰＲｎ）または転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）は、（１）複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｄ）での凝集陽性細胞集団、ステップ（ｃ）の第１の時点での培養された細胞集団、およびステップ（ｃ）の第２の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）での凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ならびに／または（２）複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｄ）での凝集陽性細胞集団およびステップ（ｃ）の第２の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）での凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ならびに／または（３）複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｄ）での凝集陰性細胞集団、ステップ（ｃ）の第１の時点での培養された細胞集団、およびステップ（ｃ）の第２の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）での凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合、ならびに／または、（４）複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｄ）での凝集陰性細胞集団およびステップ（ｃ）の第２の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）での凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合に、タウ脱凝集を促進する（またはダウ脱凝集の候補遺伝的修飾因子であり、遺伝子の破壊または転写活性化は、タウ脱凝集を促進することが予期される）。いくつかのそのような方法では、遺伝子は、タウ凝集の遺伝的修飾因子であるとみなされ、遺伝子の破壊（ＣＲＩＳＰＲｎ）または転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）は、（１）複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｄ）での凝集陰性細胞集団、ステップ（ｃ）の第１の時点での培養された細胞集団、およびステップ（ｃ）の第２の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）での凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ならびに／または（２）複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｄ）での凝集陰性細胞集団およびステップ（ｃ）の第２の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）での凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ならびに／または（３）複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｄ）での凝集陽性細胞集団、ステップ（ｃ）の第１の時点での培養された細胞集団、およびステップ（ｃ）の第２の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）での凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合、ならびに／または、（４）複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｄ）での凝集陽性細胞集団およびステップ（ｃ）の第２の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）での凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合に、タウ凝集を促進または増強する（またはダウ凝集の候補遺伝的修飾因子であり、遺伝子の破壊または転写活性化は、タウ凝集を促進または増強することが予期される）。
いくつかのそのような方法では、以下のステップ：（１）ステップ（ｄ）で同定された凝集陰性細胞集団に、複数の固有のガイドＲＮＡのうちのどれが存在するかを同定すること、（２）式ｎＣｎ’＊（ｘ－ｎ’）Ｃ（ｍ－ｎ）／ｘＣｍを使用して、ステップ（ｅ）（１）で同定されたガイドＲＮＡが存在するランダム確率を計算することであって、式中、ｘが、ステップ（ｂ）で細胞集団に導入された様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｍが、ステップ（ｅ）（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｎが、遺伝子を標的とするステップ（ｂ）で細胞集団に導入され様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｎ’が、遺伝子を標的とする、ステップ（ｅ）（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡである、計算すること、（３）ステップ（ｅ）（１）で同定されたガイドＲＮＡの平均濃縮スコアを計算することであって、ガイドＲＮＡの濃縮スコアが、ステップ（ｄ）で同定された凝集陰性細胞集団におけるガイドＲＮＡの相対存在量を、ステップ（ｄ）で同定された凝集陽性細胞集団またはステップ（ｃ）の第１の時点もしくは第２の時点での培養された細胞集団におけるガイドＲＮＡの相対存在量で割ったものであり、相対存在量が、ガイドＲＮＡの読み取りカウントを、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団の読み取りカウントで割ったものである、計算すること、および（４）遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが、存在するランダム確率を大幅に下回り、濃縮スコアの閾値を上回っている場合に遺伝子を選択することは、タウ脱凝集の遺伝的修飾因子として遺伝子を同定するためにステップ（ｅ）で施され、遺伝子の破壊（ＣＲＩＳＰＲｎ）または転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）は、タウ脱凝集を促進する（またはタウ脱凝集の候補遺伝的修飾因子であり、遺伝子の破壊または転写活性化は、タウ脱凝集を促進することが予期される）。いくつかのそのような方法では、以下のステップ：（１）ステップ（ｄ）で同定された凝集陽性細胞集団に、複数の固有のガイドＲＮＡのうちのどれが存在するかを同定すること、（２）式ｎＣｎ’＊（ｘ－ｎ’）Ｃ（ｍ－ｎ）／ｘＣｍを使用して、ステップ（ｅ）（１）で同定されたガイドＲＮＡが存在するランダム確率を計算することであって、式中、ｘが、ステップ（ｂ）で細胞集団に導入された様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｍが、ステップ（ｅ）（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｎが、遺伝子を標的とするステップ（ｂ）で細胞集団に導入され様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｎ’が、遺伝子を標的とする、ステップ（ｅ）（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡである、計算すること、（３）ステップ（ｅ）（１）で同定されたガイドＲＮＡの平均濃縮スコアを計算することであって、ガイドＲＮＡの濃縮スコアが、ステップ（ｄ）で同定された凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの相対存在量を、ステップ（ｄ）で同定された凝集陰性細胞集団またはステップ（ｃ）の第１の時点もしくは第２の時点での培養された細胞集団におけるガイドＲＮＡの相対存在量で割ったものであり、相対存在量が、ガイドＲＮＡの読み取りカウントを、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団の読み取りカウントで割ったものである、計算すること、および（４）遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが、存在するランダム確率を大幅に下回り、濃縮スコアの閾値を上回っている場合に遺伝子を選択することは、タウ凝集の遺伝的修飾因子として遺伝子を同定するためにステップ（ｅ）で施され、遺伝子の破壊（ＣＲＩＳＰＲｎ）または転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）は、タウ凝集を促進または増強する（またはタウ凝集の候補遺伝的修飾因子であり、遺伝子の破壊または転写活性化は、タウ凝集を促進または増強することが予期される）。
いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、ヒトタウリピートドメインである。いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、凝集促進変異を含む。任意に、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、タウＰ３０１Ｓ変異を含む。
いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、タウ４リピートドメインを含む。いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、配列番号１１を含む。いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインは、同じである。いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインは、同じであり、各々が、タウＰ３０１Ｓ変異を含むタウ４リピートドメインを含む。
いくつかのそのような方法では、第１のレポーターおよび第２のレポーターは、蛍光タンパク質である。任意に、第１のレポーターおよび第２のレポーターは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対である。任意に、第１のレポーターは、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）であり、第２のレポーターは、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）である。
いくつかのそのような方法では、細胞は、真核細胞である。任意に、細胞は、哺乳動物細胞である。任意に、細胞は、ヒト細胞である。任意に、細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。
いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、細胞の大部分が固有のガイドＲＮＡのうちの１つのみを受け取るように選択された濃度で導入される。いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、１００以上の遺伝子、１０００以上の遺伝子、または１００００以上の遺伝子を標的とする。いくつかのそのような方法では、ライブラリは、ゲノムワイドライブラリである。
いくつかのそのような方法では、複数の標的配列は、標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される。任意に、少なくとも３つの標的配列は、標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される。任意に、約３～約６個の標的配列（例えば、約３、約４、または約６個）は、標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される。任意に、約３つの標的配列は、標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される。
いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、ウイルス形質導入によって細胞集団に導入される。任意に、複数の固有のガイドＲＮＡの各々は、別個のウイルスベクター内にある。任意に、複数の固有のガイドＲＮＡは、レンチウイルス形質導入によって細胞集団に導入される。いくつかのそのような方法では、細胞集団は、約０．３未満の感染多重度で感染する。
いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、選択マーカーと共に細胞集団に導入され、ステップ（ｂ）が、選択マーカーを含む細胞を選択することをさらに含む。任意に、選択マーカーは、薬物に対する耐性を付与する。任意に、選択マーカーは、ピューロマイシンまたはゼオシンに対する耐性を付与する。任意に、選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、およびブラストサイジンＳデアミナーゼから選択される。任意に、選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、ブラストサイジンＳデアミナーゼ、およびブレオマイシン耐性タンパク質から選択される。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｂ）において複数の固有のガイドＲＮＡが導入される細胞集団は、固有のガイドＲＮＡあたり約３００個を超える細胞を含む。
別の態様では、Ｃａｓ－タウバイオセンサー細胞またはそのような細胞の集団が提供される。いくつかのそのような細胞は、Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインを含む、１つ以上の細胞の集団を含む。
いくつかのそのような細胞では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、ヒトタウリピートドメインである。いくつかのそのような細胞では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、凝集促進変異を含む。任意に、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、タウＰ３０１Ｓ変異を含む。
いくつかのそのような細胞では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、タウ４リピートドメインを含む。いくつかのそのような細胞では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、配列番号１１を含む。いくつかのそのような細胞では、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインは、同じである。いくつかのそのような細胞では、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインは、同じであり、各々が、タウＰ３０１Ｓ変異を含むタウ４リピートドメインを含む。
いくつかのそのような細胞では、第１のレポーターおよび第２のレポーターは、蛍光タンパク質である。任意に、第１のレポーターおよび第２のレポーターは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対である。任意に、第１のレポーターは、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）であり、第２のレポーターは、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）である。
いくつかのそのような細胞では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。任意に、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である。任意に、Ｃａｓタンパク質は、配列番号２１を含む。任意に、Ｃａｓタンパク質は、配列番号２２に示される配列を含むコード配列によってコードされる。
いくつかのそのような細胞では、Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインは、細胞において安定して発現される。いくつかのそのような細胞では、Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインをコードする核酸は、細胞においてゲノム的に組み込まれる。
いくつかのそのような細胞では、細胞は、真核細胞である。任意に、細胞は、哺乳動物細胞である。任意に、細胞は、ヒト細胞である。任意に、細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。そのような細胞では、インビトロである。
いくつかのそのような細胞では、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインおよび第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインは、凝集状態で安定して存在していない。いくつかのそのような細胞では、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインおよび第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインは、凝集状態で安定して存在する。
別の態様では、Ｃａｓ－タウバイオセンサー細胞および馴化培地のインビトロ培養物が提供される。いくつかのそのようなインビトロ培養物は、上記または本明細書の他の場所に記載の細胞集団のうちのいずれか、およびタウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する培養されたタウ凝集陽性細胞から採取された馴化培地を含む培養培地を含む。
いくつかのそのようなインビトロ培養物では、馴化培地は、コンフルエントなタウ凝集陽性細胞上に約１日～約７日間置いた後に採取された。任意に、馴化培地は、コンフルエントなタウ凝集陽性細胞上に約４日間置いた後に採取された。
いくつかのそのようなインビトロ培養物では、培養培地は、約７５％の馴化培地および約２５％の新鮮な培地を含む。いくつかのそのようなインビトロ培養物では、細胞集団は、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する培養されたタウ凝集陽性細胞と共培養されない。
別の態様では、ＳＡＭ－タウバイオセンサー細胞またはそのような細胞の集団が提供される。いくつかのそのような細胞は、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラＣａｓタンパク質と、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質と、第１のレポーター連結された第１のタウリピートドメインと、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインとを含む１つ以上の細胞の集団を含む。
いくつかのそのような細胞では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、ヒトタウリピートドメインである。いくつかのそのような細胞では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、凝集促進変異を含む。任意に、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、タウＰ３０１Ｓ変異を含む。
いくつかのそのような細胞では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、タウ４リピートドメインを含む。いくつかのそのような細胞では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、配列番号１１を含む。いくつかのそのような細胞では、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインは、同じである。いくつかのそのような細胞では、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインは、同じであり、各々が、タウＰ３０１Ｓ変異を含むタウ４リピートドメインを含む。
いくつかのそのような細胞では、第１のレポーターおよび第２のレポーターは、蛍光タンパク質である。任意に、第１のレポーターおよび第２のレポーターは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対である。任意に、第１のレポーターは、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）であり、第２のレポーターは、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）である。
いくつかのそのような細胞では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。任意に、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である。いくつかのそのような細胞では、キメラＣａｓタンパク質は、ＶＰ６４転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含み、任意に、キメラＣａｓタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、核局在化シグナル、およびＶＰ６４転写活性化因子ドメインを含む。いくつかのそのような細胞では、アダプタータンパク質は、ＭＳ２コートタンパク質であり、キメラアダプタータンパク質中の１つ以上の転写活性化ドメインは、ｐ６５転写活性化ドメインおよびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み、任意に、キメラアダプタータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、ＭＳ２コートタンパク質、核局在化シグナル、ｐ６５転写活性化ドメイン、およびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含む。いくつかのそのような細胞では、キメラＣａｓタンパク質は、配列番号３６を含み、任意に、キメラＣａｓタンパク質は、配列番号３８に示される配列を含むコード配列によってコードされる。いくつかのそのような細胞では、キメラアダプタータンパク質は、配列番号３７を含み、任意に、キメラアダプタータンパク質は、配列番号３９に示される配列を含むコード配列によってコードされる。
いくつかのそのような細胞では、キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインは、細胞において安定して発現される。いくつかのそのような細胞では、キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインをコードする核酸は、細胞においてゲノム的に組み込まれる。
いくつかのそのような細胞では、細胞は、真核細胞である。任意に、細胞は、哺乳動物細胞である。任意に、細胞は、ヒト細胞である。任意に、細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。そのような細胞では、インビトロである。
いくつかのそのような細胞では、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインおよび第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインは、凝集状態で安定して存在していない。いくつかのそのような細胞では、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインおよび第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインは、凝集状態で安定して存在する。
別の態様では、ＳＡＭ－タウバイオセンサー細胞および馴化培地のインビトロ培養物が提供される。いくつかのそのようなインビトロ培養物は、上記または本明細書の他の場所に記載の細胞集団のうちのいずれか、およびタウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する培養されたタウ凝集陽性細胞から採取された馴化培地を含む培養培地を含む。
いくつかのそのようなインビトロ培養物では、馴化培地は、コンフルエントなタウ凝集陽性細胞上に約１日～約７日間置いた後に採取された。任意に、馴化培地は、コンフルエントなタウ凝集陽性細胞上に約４日間置いた後に採取された。
いくつかのそのようなインビトロ培養物では、培養培地は、約７５％の馴化培地および約２５％の新鮮な培地を含む。いくつかのそのようなインビトロ培養物では、細胞集団は、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する培養されたタウ凝集陽性細胞と共培養されない。
別の態様では、Ｃａｓ－タウバイオセンサー細胞またはそのような細胞の集団またはＳＡＭ－タウバイオセンサー細胞、ならびにタウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する培養されたタウ凝集陽性細胞集団からの細胞溶解物を含む培養培地のインビトロ培養物が提供される。いくつかのそのようなインビトロ培養物は、上記または本明細書の他の場所に記載の細胞集団のうちのいずれかを含む。
いくつかのそのようなインビトロ培養物では、培地中の細胞溶解物は、約１～約５μｇ／ｍＬの濃度である。いくつかのそのようなインビトロ培養物では、細胞溶解物を含む培地は、リポフェクタミンまたは別のトランスフェクション試薬をさらに含む。任意に、細胞溶解物を含む培地は、約１．５～約４μＬ／ｍＬの濃度でリポフェクタミンを含む。いくつかのそのようなインビトロ培養物では、細胞溶解物は、プロテアーゼ阻害剤を含む緩衝液中に細胞を収集した後、約２分～約４分間のタウ凝集陽性細胞の超音波処理によって生成された。
別の態様では、タウ凝集を誘導または感作するための馴化培地を生成する方法が提供される。いくつかのそのような方法は、（ａ）タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在するタウ凝集陽性細胞集団を提供することと、（ｂ）培地中でタウ凝集陽性細胞集団を培養して、馴化培地を生成することと、（ｃ）馴化培地を採取することとを含む。
いくつかのそのような方法では、タウ凝集陽性細胞は、ステップ（ｂ）でコンフルエントになるまで培養される。任意に、馴化培地は、ステップ（ｃ）においてコンフルエントなタウ凝集陽性細胞上に約１日～約７日間置いた後に採取される。任意に、馴化培地は、ステップ（ｃ）においてコンフルエントなタウ凝集陽性細胞上に約４日置いた後に採取される。
別の態様では、タウ凝集陽性細胞集団を生成する方法が提供される。いくつかのそのような方法は、（ａ）上記または本明細書の他の場所に記載の方法のうちのいずれか従ってタウ凝集を誘導するために馴化培地を生成することと、（ｂ）馴化培地を含む培養培地中でタウリピートドメインを含むタンパク質を含む細胞集団を培養して、タウ凝集陽性細胞集団を生成することとを含む。
いくつかのそのような方法では、培養培地は、約７５％の馴化培地および約２５％の新鮮な培地を含む。いくつかのそのような方法では、細胞集団は、馴化培地を生成するための方法で使用されるタウ凝集陽性細胞と共培養されない。
いくつかのそのような方法では、タウリピートドメインは、凝集促進変異を含む。いくつかのそのような方法では、タウリピートドメインは、タウＰ３０１Ｓ変異を含む。いくつかのそのような方法では、タウリピートドメインは、タウ４リピートドメインを含む。いくつかのそのような方法では、タウリピートドメインは、配列番号１１を含む。
別の態様では、タウ凝集を誘導するための培養されたタウ凝集陽性細胞から細胞溶解物を含む培地を生成する方法が提供される。いくつかのそのような方法は、（ａ）タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在するタウ凝集陽性細胞集団を提供することと、（ｂ）プロテアーゼ阻害剤を含む緩衝液にタウ凝集陽性細胞を収集することと、（ｃ）タウ凝集陽性細胞を約２分～約４分間超音波処理して、細胞溶解物を生成することと、（ｄ）細胞溶解物を増殖培地に添加することとを含む。
いくつかのそのような方法では、増殖培地中の細胞溶解物は、約１～約５μｇ／ｍＬの濃度である。いくつかのそのような方法は、ステップ（ｄ）において、リポフェクタミンまたは別のトランスフェクション試薬を増殖培地に添加することをさらに含む。任意に、ステップ（ｄ）は、約１．５～約４μＬ／ｍＬの濃度でリポフェクタミンを添加することを含む。
別の態様では、タウ凝集陽性細胞集団を生成する方法が提供される。いくつかのそのような方法は、（ａ）上記の方法のうちのいずれかに従って、培養されたタウ凝集陽性細胞から細胞溶解物を含む培地を生成することと、（ｂ）培養されたタウ凝集陽性細胞からの細胞溶解物を含む前記培地中でタウリピートドメインを含むタンパク質を含む細胞集団を培養することとを含む。
いくつかのそのような方法では、細胞集団は、馴化培地を生成するための方法で使用されるタウ凝集陽性細胞と共培養されない。
いくつかのそのような方法では、タウリピートドメインは、凝集促進変異を含む。いくつかのそのような方法では、タウリピートドメインは、タウＰ３０１Ｓ変異を含む。いくつかのそのような方法では、タウリピートドメインは、タウ４リピートドメインを含む。いくつかのそのような方法では、タウリピートドメインは、配列番号１１を含む。
（原寸に比例していない）タウアイソフォーム２Ｎ４Ｒの概略図を示す。タウバイオセンサー株は、完全な２Ｎ４Ｒではなく、導入遺伝子としてｔａｕ４ＲＤ－ＹＦＰおよびｔａｕ４ＲＤ－ＣＦＰのみを含む。 タウバイオセンサー細胞株において、凝集体形成が蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によってどのように監視されるかについての概略図を示す。タウ４ＲＤ－ＣＦＰタンパク質は紫色の光で励起され、青色の光を発する。タウ４ＲＤ－ＹＦＰ融合タンパク質は青色の光で励起され、黄色の光を発する。凝集がない場合、紫色の光による励起はＦＲＥＴをもたらさない。タウ凝集がある場合、紫色の光による励起はＦＲＥＴおよび黄色の発光をもたらす。 以前に単離された期待以下の対照Ｃａｓ９－発現ＴＣＹクローンである、クローンＣａｓ９Ｈ１に対してレンチウイルスＣａｓ９発現構築物を形質導入したタウ４ＲＤ－ＣＦＰ／タウ４ＲＤ－ＹＦＰ（ＴＣＹ）バイオセンサー細胞クローンにおける相対Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ発現を示す。 ＰＥＲＫおよびＳＮＣＡをそれぞれ標的とするｓｇＲＮＡを形質導入してから３日後および７日後のＣａｓ９ ＴＣＹクローンにおけるＰＥＲＫ遺伝子座およびＳＮＣＡ遺伝子座での切断効率を示す。 ゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡライブラリを使用して、Ｃａｓ９ ＴＣＹバイオセンサー細胞内の標的遺伝子を破壊するための戦略の概略図を示す。 タウ４ＲＤ－ＹＦＰ細胞にタウ４ＲＤ線維を播種した場合の、安定して増殖するタウ凝集体を含むタウ４ＲＤ－ＹＦＰ Ａｇｇ［＋］サブクローンの誘導を示す概略図である。タウ凝集体を含むサブクローンを示す蛍光顕微鏡画像も示される。 コンフルエントな細胞で３日後に収集されたタウ４ＲＤ－ＹＦＰ Ａｇｇ［＋］サブクローンからの馴化培地が、タウ凝集活性の源を提供することができるのに対し、タウ４ＲＤ－ＹＦＰ Ａｇｇ［－］サブクローンからの培地は提供しないことを示す概略図である。馴化培地は、７５％の馴化培地および２５％の新鮮な培地としてレシピエント細胞に適用された。それぞれの蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析画像が示される。ｘ軸は、ＣＦＰ（４０５ｎｍレーザー励起）を示し、ｙ軸は、ＦＲＥＴ（ＣＦＰ発光からの励起）を示す。右上の象限はＦＲＥＴ［＋］であり、右下の象限はＣＦＰ［＋］であり、左下の象限は二重陰性である。 タウ凝集を促進する修飾因子遺伝子を同定するためのゲノムワイドＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲｎ）スクリーニングの戦略を示す概略図である。 ゲノムワイドＣＲＩＳＰＲｎスクリーニングを使用した次世代シーケンシング（ＮＧＳ）分析のための存在量および濃縮の概念を示す概略図である。 タウ凝集を促進する修飾因子遺伝子のゲノムワイドスクリーニングで同定された標的遺伝子１～１４の二次スクリーニングの概略図を示す。 標的遺伝子１～１４を標的とするｓｇＲＮＡのレンチウイルス発現構築物を形質導入したＣａｓ９ ＴＣＹバイオセンサー細胞におけるタウ凝集体馴化培地によるＦＲＥＴ誘導を示すグラフである。二次スクリーニングにより、標的遺伝子２および８が、タウの播種／凝集に対する細胞の感受性を調節することが確認された。 標的遺伝子２ ｇＲＮＡ１、標的遺伝子８ ｇＲＮＡ５、非標的ｇＲＮＡ、およびｇＲＮＡなしのレンチウイルス発現構築物を形質導入したＣａｓ９ ＴＣＹバイオセンサー細胞のＦＡＣＳ分析画像を示す。細胞は、馴化培地または新鮮な培地で培養された。ｘ軸は、ＣＦＰ（４０５ｎｍレーザー励起）を示し、ｙ軸は、ＦＲＥＴ（ＣＦＰ発光からの励起）を示す。右上の象限はＦＲＥＴ［＋］であり、右下の象限はＣＦＰ［＋］であり、左下の象限は二重陰性である。標的遺伝子２または８の破壊は、タウ凝集体馴化培地に応答してタウ凝集体の形成を増加させるが、新鮮な培地には応答しない。 ｍＲＮＡ発現分析、タンパク質発現分析、およびＦＲＥＴ分析を含む、標的遺伝子２および８を標的とするｓｇＲＮＡのレンチウイルス発現構築物を形質導入したＣａｓ９ ＴＣＹバイオセンサー細胞における二次スクリーニングの概略図を示す。標的遺伝子２（ｇ１およびｇ３）に対して２つのｓｇＲＮＡを使用し、標的遺伝子８（ｇ５）に対して１つのｓｇＲＮＡを使用し、非標的対照として非標的ｓｇＲＮＡ（ｇ３）を使用した。 レンチウイルスｓｇＲＮＡ発現構築物の形質導入後６日目にｑＲＴ－ＰＣＲにより評価された場合の、Ｃａｓ９ ＴＣＹバイオセンサー細胞における標的遺伝子２および標的遺伝子８の相対的発現を示す。 レンチウイルスｓｇＲＮＡ発現構築物の形質導入後１３日目にウエスタンブロットにより評価された場合の、Ｃａｓ９ ＴＣＹバイオセンサー細胞におけるタンパク質２（標的遺伝子２によってコードされた）およびタンパク質８（標的遺伝子８によってコードされた）の発現を示す。 レンチウイルスｓｇＲＮＡ発現構築物の形質導入後１０日目の、Ｃａｓ９ ＴＣＹバイオセンサー細胞におけるＦＲＥＴ［＋］細胞パーセントで測定した場合のタウ凝集を示す。リポフェクタミンは使用されなかった。 ウエスタンブロットにより評価された場合の、ノックダウンＣａｓ９ ＴＣＹ細胞クローンにおける標的遺伝子２および標的遺伝子８の発現を示す。 ＦＲＥＴにより評価された場合の、標的遺伝子２および標的遺伝子８のノックダウンＣａｓ９ ＴＣＹ細胞クローンにおけるタウ凝集の発現を示す。 ウエスタンブロットにより評価された場合の、ノックダウンＣａｓ９ ＴＣＹ細胞クローンにおける標的遺伝子２および標的遺伝子８の発現、ならびにウエスタンブロットにより評価された場合の、それらのクローンの位置Ｓ２６２およびＳ３５６でのタウのリン酸化を示す。 タウ－ＹＦＰ Ａｇｇ［＋］クローン１８からの全細胞溶解物が、タウバイオセンサー細胞においてタウ凝集およびＦＲＥＴシグナルを誘導することができることを示す。異なる量の全細胞溶解物を試験し、溶解物を生成するための異なる超音波条件を試験した。 タウ－ＹＦＰ Ａｇｇ［＋］クローン１８からの全細胞溶解物が、タウバイオセンサー細胞においてタウ凝集およびＦＲＥＴシグナルを誘導することができることを示す。異なる量の全細胞溶解物を試験し、異なる量のリポフェクタミンを試験した。 タウ－ＹＦＰ Ａｇｇ［＋］ｃｌｏｎｅ１８からの全細胞溶解物は、タウバイオセンサー細胞においてタウ凝集およびＦＲＥＴシグナルを誘導することができるが、Ａｇｇ［－］クローンからの全細胞溶解物は誘導することができないことを示す。異なる量の全細胞溶解物を試験し、異なる量のリポフェクタミンを試験した。 タウ凝集を防止する修飾因子遺伝子を同定するためのゲノムワイドＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲｎ）スクリーニングの戦略を示す概略図を示す。 ＦＲＥＴ［－］試料中のｓｇＲＮＡが特異的に濃縮した遺伝子の同定を示すグラフである。 ＦＲＥＴ［－］試料中のｓｇＲＮＡが特異的に枯渇した遺伝子の同定を示すグラフである。 タウ凝集を防止する同定された修飾因子遺伝子を確認するための二次スクリーニングの戦略を示す概略図を示す。 タウ凝集を防止する修飾因子遺伝子を同定するためのゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）スクリーニングの戦略を示す概略図を示す。 タウ脱凝集を促進する修飾因子遺伝子を同定するためのゲノムワイドＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲｎ）スクリーニングの戦略を示す概略図を示す。 Ａｇｇ［＋］、スペックル［＋］、およびＡｇｇ［－］細胞集団を選別するのに使用されるゲーティングを示す。 タウ脱凝集を促進する修飾因子遺伝子を同定するために、ゲノムワイドＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲｎ）スクリーニングで使用されるチミジンブロック戦略の概略図を示す。
定義
本明細書で互換的に使用される、「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、コード化および非コード化アミノ酸ならびに化学的または生化学的に修飾または誘導体化したアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を含む。これらの用語には、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドなどの修飾されたポリマーも含まれる。「ドメイン」という用語は、特定の機能または構造を有するタンパク質またはポリペプチドの任意の部分を指す。
タンパク質は、「Ｎ末端」および「Ｃ末端」を有すると言われている。「Ｎ末端」という用語は、遊離アミン基（－ＮＨ２）を有するアミノ酸によって終端されたタンパク質またはポリペプチドの開始部に関する。「Ｃ末端」という用語は、遊離カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）によって終端されたアミノ酸鎖（タンパク質またはポリペプチド）の末端部に関する。
本明細書で互換的に使用される、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはそれらの類似体もしくは修飾バージョンを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含む。これらには、一本鎖、二本鎖、および多重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、およびプリン塩基、ピリミジン塩基、または他の天然、化学修飾、生化学修飾、非天然、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。
１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸塩がホスホジエステル結合を介して一方向で、その隣の３’酸素に結合する手法でオリゴヌクレオチドを作製するように、モノヌクレオチドが反応するため、核酸は、「５’末端」および「３’末端」を有すると言われている。オリゴヌクレオチドの末端は、モノヌクレオチドペントース環の５’リン酸塩がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に連結されていない場合、「５’末端」と呼ばれる。オリゴヌクレオチドの末端は、その３’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸塩に連結されていない場合、「３’末端」と呼ばれる。核酸配列は、より大きなオリゴヌクレオチドの内部に存在するとしても、５’および３’末端を有するとも言われ得る。線状または環状ＤＮＡ分子のいずれかにおいて、別個のエレメントは、「上流」または「下流」の５’もしくは３’エレメントであると呼ばれる。
「ゲノム的に組み込まれる」という用語は、ヌクレオチド配列が細胞のゲノムに組み込まれるように、細胞に導入されている核酸を指す。細胞のゲノムへの核酸の安定した組み込みのために、任意のプロトコルを使用してよい。
「標的化ベクター」という用語は、相同組換え、非相同末端結合媒介ライゲーション、または細胞のゲノム中の標的位置への組換えの任意の他の手段によって導入され得る組換え核酸を指す。
「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも１つの要素を含み、かつウイルスベクター粒子へのパッケージングに十分な、またはそれを許容する要素を含む、組換え核酸を指す。ベクターおよび／または粒子は、エクスビボまたはインビボのいずれかで、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の核酸を細胞に移す目的で利用され得る。ウイルスベクターの多くの形態が既知である。
「野生型」という用語は、（変異型、病変した、改変したなどとは対照的に）正常な状態または文脈に見られるような構造および／または活性を有する実体を含む。野生型遺伝子およびポリペプチドは、多くの場合、複数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）で存在する。
「内因性配列」という用語は、細胞または生物内で自然に発生する核酸配列を指す。例えば、細胞または生物の内因性ＭＡＰＴ配列は、細胞または生物のＭＡＰＴ遺伝子座で自然に発生するネイティブＭＡＰＴ配列を指す。
「外因性」分子または配列には、その形態の細胞には通常存在しない分子または配列が含まれる。通常の存在には、細胞の特定の発生段階および環境条件に関する存在が含まれる。外因性分子または配列には、例えば、内因性配列のヒト化バージョンなど、細胞内の対応する内因性配列の変異バージョンが含まれ得るか、または細胞内であるが、異なる形態の（すなわち、染色体内ではない）内因性配列に対応する配列が含まれ得る。対照的に、内因性分子または配列は、その形態で、特定の細胞において、特定の発生段階で、特定の環境条件下で通常存在する分子または配列を含む。
核酸またはタンパク質の文脈で使用される場合の「異種」という用語は、核酸またはタンパク質が、同じ分子内で一緒に自然に発生しない少なくとも２つのセグメントを含むことを示す。例えば、「異種」という用語は、核酸のセグメントまたはタンパク質のセグメントに関して使用される場合、核酸またはタンパク質が、自然界で互いに同じ関係（例えば、一緒に結合）で見出されない２つ以上のサブ配列を含むことを示す。一例として、核酸ベクターの「異種」領域は、自然界で他の分子と関連して見出されない、別の核酸分子内の、または別の核酸分子に結合した核酸のセグメントである。例えば、核酸ベクターの異種領域は、自然界のコード配列に関連して見出されない配列に隣接するコード配列を含み得る。同様に、タンパク質の「異種」領域は、別のペプチド分子内にあるか、またはそれに結合しているアミノ酸のセグメントであり、別のペプチド分子は自然界の他のペプチド分子（例えば、融合タンパク質、またはタグ付きタンパク質）に関連して見出されない。同様に、核酸またはタンパク質は、異種標識または異種分泌または局在化配列を含み得る。
「遺伝子座」という用語は、遺伝子（または重要な配列）、ＤＮＡ配列、ポリペプチドコード配列、または生物のゲノムの染色体上の位置の特定の位置を指す。例えば、「ＭＡＰＴ遺伝子座」は、ＭＡＰＴ遺伝子の特定の位置、ＭＡＰＴ ＤＮＡ配列、微小管関連タンパク質タウコード配列、またはそのような配列がどこに存するかに関して同定された生物のゲノムの染色体上のＭＡＰＴ位置を指し得る。「ＭＡＰＴ遺伝子座」は、例えば、エンハンサー、プロモーター、５’および／もしくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、またはそれらの組み合わせを含む、ＭＡＰＴ遺伝子の調節エレメントを含み得る。
「遺伝子」という用語は、生成物（例えば、ＲＮＡ生成物および／またはポリペプチド生成物）をコードする染色体中のＤＮＡ配列を指し、遺伝子が完全長ｍＲＮＡ（５’および３’非翻訳配列を含む）に対応するように、５’および３’末端の両方で、非コードイントロンで中断されたコード領域およびコード領域に隣接して位置する配列を含む。「遺伝子」という用語はまた、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、および転写因子結合部位）、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム侵入部位、サイレンサー、絶縁配列、およびマトリックス結合領域を含む他の非コード配列を含む。これらの配列は、遺伝子のコード領域に近い場合（例えば、１０ｋｂ以内）または離れた部位にある場合があり、それらは遺伝子の転写および翻訳のレベルまたは速度に影響する。
「対立遺伝子」という用語は、遺伝子のバリアント形態を指す。いくつかの遺伝子は、染色体上の同じ位置、または遺伝子座に位置する様々な異なる形態を有する。二倍体生物は、各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各対は、特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２つの同一の対立遺伝子がある場合はホモ接合として、および２つの対立遺伝子が異なる場合はヘテロ接合として記載されている。
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが特定のポリヌクレオチド配列のための適切な転写開始部位でＲＮＡ合成を開始することを指示することができるＴＡＴＡボックスを通常含むＤＮＡの調節領域である。プロモーターは、転写開始速度に影響を及ぼす他の領域をさらに含み得る。本明細書に開示されるプロモーター配列は、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写を調節する。プロモーターは、本明細書に開示される１つ以上の細胞型（例えば、ヒト細胞、多能性細胞、一細胞期胚、分化細胞、またはそれらの組み合わせ）において活性であり得る。プロモーターは、例えば、構成的に活性なプロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生的に調節されたプロモーター）、または空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的または組織特異的プロモーター）であり得る。プロモーターの例は、例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２において見出すことができ、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
「作動可能な連結」または「作動可能に連結されている」とは、その両方の成分が正常に機能し、かつ成分の少なくとも１つが他の成分のうちの少なくとも１つに及ぶ機能を媒介し得る可能性を許すような、２つ以上の成分（例えば、プロモーターおよび別の配列要素）の並列を含む。例えば、プロモーターが、１つ以上の転写調節因子の存在または非存在に応じてコード配列の転写のレベルを制御する場合、そのプロモーターは、コード配列に作動可能に連結され得る。作動可能な連結は、そのような配列が相互に近接していること、またはトランスに作用する（例えば、制御配列が、コード配列の転写を制御するために離れて作用し得る）ことを含み得る。
「バリアント」という用語は、集団において最も一般的な配列とは異なるヌクレオチド配列（例えば、１ヌクレオチド）、または集団において最も一般的な配列とは異なるタンパク質配列（例えば、１アミノ酸）を指す。
「断片」という用語は、タンパク質に言及する場合、完全長タンパク質よりも短いか、または少ないアミノ酸を有するタンパク質を意味する。「断片」という用語は、核酸に言及する場合、完全長核酸よりも短いか、または少ないヌクレオチドを有する核酸を意味する。断片は、例えば、Ｎ末端断片（すなわち、タンパク質のＣ末端の一部の除去）、Ｃ末端断片（すなわち、タンパク質のＮ末端の一部の除去）、または内部断片であり得る。
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウで最大の一致のためにアラインさせる場合、同じである２つの配列の残基を指す。タンパク質に関して、配列同一性のパーセンテージを使用する場合、同一ではない残基位置は多くの場合に、保存的アミノ酸置換によって異なり、その保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基は同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されており、したがって、分子の機能特性を変化させない。配列が保存的置換で異なる場合、配列同一性パーセントを、置換の保存的性質について補正するために、上方に調整してもよい。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われている。この調整を行う手段は、周知である。典型的には、これは、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコアリングして、それによって、配列同一性パーセンテージを増加させることを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、非保存的置換がゼロのスコアを与えられる場合に、保存的置換は、ゼロから１の間のスコアを与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，マウンテンビュー、カリフォルニア）で実行されるように計算される。
「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインされた配列（完全にマッチする残基の数が最大）を比較することによって決定される値を含み、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのための（付加また欠失を含まない）参照配列と比較した場合に、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に発生する位置の数を決定して一致した位置の数を得ること、一致した位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割ること、および結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。特に明記しない限り（例えば、短い方の配列が、連結された非相同配列を含む）、比較ウィンドウは、比較される２つの配列のうちの短い方の全長である。
特に明記しない限り、配列同一性／類似性の値は、次のパラメータ：５０のＧＡＰ重量および３の長さ重量、およびｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用するヌクレオチド配列の同一性％および類似性％；８のＧＡＰ重量および２の長さ重量、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用するアミノ酸配列の同一性％および類似性％；またはその任意の同等のプログラムを使用し、ＧＡＰバージョン１０を使用して得られた値を含む。「同等のプログラム」は、問題の任意の２つの配列について、ＧＡＰバージョン１０によって生成された対応するアラインメントと比較した場合、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の一致および同一のパーセント配列同一性を有するアラインメントを生成する任意の配列比較プログラムを含む。
「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列中に通常存在するアミノ酸の、類似のサイズ、電荷、または極性の、異なるアミノ酸との置換を指す。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、またはロイシンなどの非極性（疎水性）残基の、別の非極性残基との置換が含まれる。同様に、保存的置換の例には、アルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、またはグリシンとセリンの間などの、１つの極性（親水性）残基の別のものとの置換が含まれる。加えて、リシン、アルギニン、もしくはヒスチジンなどの塩基性残基から別のものへの置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などのある酸性残基から別の酸性残基への置換は、保存的置換の追加の例である。非保存的置換の例には、非極性（疎水性）アミノ酸残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、またはメチオニンから極性（親水性）残基、例えば、システイン、グルタミン、グルタミン酸、またはリシンへの、および／または極性残基から非極性残基への置換が含まれる。典型的なアミノ酸の分類を以下で要約する。
「相同」配列（例えば、核酸配列）は、例えば、既知の参照配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるような、既知の参照配列と同一であるか、または実質的に同様である配列を含む。相同配列は、例えば、オルソログ配列およびパラロガス配列を含み得る。例えば、相同遺伝子は通常、種分化事象（オルソログ遺伝子）または遺伝子重複事象（パラロガス遺伝子）のいずれかを介して、共通の祖先ＤＮＡ配列に由来する。「オルソログ」遺伝子には、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した様々な種の遺伝子が含まれる。オルソログは典型的には、進化の過程で同じ機能を保持する。「パラロガス」遺伝子には、ゲノム内の重複によって関連する遺伝子が含まれる。パラログは、進化の過程で新しい機能を進化させることができる。
「インビトロ」という用語は、人工環境、および人工環境（例えば、試験管または単離された細胞もしくは細胞株）内で生じるプロセスまたは反応を含む。「インビボ」という用語は、天然環境（例えば、細胞または生物または身体）、および天然環境内で生じるプロセスまたは反応を含む。「エクスビボ」という用語は、個体の身体から除去された細胞、およびそのような細胞内で生じるプロセスまたは反応を含む。
「レポーター遺伝子」という用語は、異種プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントに作動可能に連結されたレポーター遺伝子配列を含む構築物が、プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントの活性化に必要な因子を含む（または含むように作製され得る）細胞に導入された場合に容易かつ定量的にアッセイされる遺伝子産物（典型的には酵素）をコードする配列を有する核酸を指す。レポーター遺伝子の例には、これらに限定されないが、ベータガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）をコードする遺伝子、細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする遺伝子、および蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。「レポータータンパク質」は、レポーター遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。
本明細書で使用される「蛍光レポータータンパク質」という用語は、蛍光に基づいて検出可能なレポータータンパク質を意味し、蛍光は、レポータータンパク質から直接、レポータータンパク質の蛍光発生基質上の活性、または蛍光タグ付き化合物への結合に親和性のあるタンパク質のいずれかからのものであり得る。蛍光タンパク質の例には、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、およびＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、およびＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＢＦＰ、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、およびＴ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＣＦＰ、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、およびＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ＲＦＰ、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄモノマー、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、およびＪｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、およびｔｄＴｏｍａｔｏ）、およびフローサイトメトリー方法により細胞内の存在を検出することができる任意の他の好適な蛍光タンパク質が挙げられる。
二本鎖切断（ＤＳＢ）に応答する修復は、主に２つの保存されたＤＮＡ修復経路（相同組換え（ＨＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ））による生じる。Ｋａｓｐａｒｅｋ＆Ｈｕｍｐｈｒｅｙ（２０１１）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ＆Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２２：８８６－８９７を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。同様に、外因性ドナー核酸によって媒介された標的核酸の修復は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝的情報の交換の任意のプロセスを含み得る。
「組換え」という用語は、２つのポリヌクレオチド間で遺伝的情報を交換する任意のプロセスを含み、任意のメカニズムによって起こり得る。組換えは、相同性指向修復（ＨＤＲ）または相同組換え（ＨＲ）を介して起こり得る。ＨＤＲまたはＨＲには、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし得る核酸修復の形式が含まれ、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）の修復のテンプレートとして「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝的情報の伝達をもたらす。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、そのような伝達は、壊れた標的とドナーとの間に形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／またはドナーが標的の一部となる遺伝的情報を再合成するために使用される合成依存性鎖アニーリング、および／または関連するプロセスを含み得る。いくつかの場合、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が標的ＤＮＡに組み込まれる。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ １５３：９１０－９１８、Ｍａｎｄａｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬＯＳ ＯＮＥ ７：ｅ４５７６８：１－９、およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０－５３２を参照されたく、これらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＮＨＥＪには、相同テンプレートを必要とせずに、切断末端を相互に、または外因性配列に直接ライゲーションすることによる、核酸における二本鎖切断の修復が含まれる。ＮＨＥＪによる非隣接配列のライゲーションは、しばしば、二本鎖切断の部位の近くで欠失、挿入、または転座をもたらし得る。例えば、ＮＨＥＪはまた、切断末端を外因性ドナー核酸の末端と直接ライゲーションすることにより、外因性ドナー核酸の標的化組み込みをもたらすことができる（すなわち、ＮＨＥＪベースの捕捉）。そのようなＮＨＥＪ媒介標的化組み込みは、相同性指向修復（ＨＤＲ）経路が容易に使用することができない場合（例えば、非***細胞、一次細胞、および相同性に基づくＤＮＡ修復を不十分に行う細胞）、外因性ドナー核酸の挿入に好ましい場合がある。さらに、相同性指向修復とは対照的に、切断部位に隣接する配列同一性の大きな領域に関する知識は必要なく、これは、ゲノム配列の知識が限られているゲノムを有する生物への標的化挿入を試みるときに有益であり得る。組み込みは、外因性ドナー核酸と切断されたゲノム配列との間の平滑末端のライゲーションを介して、または切断されたゲノム配列においてヌクレアーゼ剤によって生成されたものに適合するオーバーハングに隣接する外因性ドナー核酸を使用する粘着末端（すなわち、５’または３’オーバーハングを有する）のライゲーションを介して進行することができる。例えば、ＵＳ２０１１／０２０７２２、ＷＯ２０１４／０３３６４４、ＷＯ２０１４／０８９２９０、およびＭａｒｅｓｃａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２３（３）：５３９－５４６を参照されたく、これらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。平滑末端がライゲーションされている場合、断片結合に必要なマイクロホモロジーの生成領域のために、標的および／またはドナーの切除が必要になる場合があり、これにより、標的配列に望ましくない変化が生じ得る。
１つ以上の列挙された要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に列挙されていない他の要素を含み得る。例えば、タンパク質を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」組成物は、タンパク質を単独で、または他の成分との組み合わせで含有し得る。「から本質的になる」という移行句は、請求項の範囲が、特許請求の範囲に記載された特定の要素、および特許請求された発明の基本的かつ新規の特性に実質的に影響をしない要素を包含すると解釈されることを意味する。したがって、本発明の請求項で使用される場合の「から本質的になる」という用語は、「含む」と同等であると解釈されることを意図するものではない。
「任意の」または「任意に」は、後に記載された事象または状況が生じ得るかどうかを意味し、その記載が、その事象または状況が生じる場合の例およびそれが生じない場合の例を含むことを意味する。
値の範囲の指定は、その範囲内の、またはその範囲を定義するすべての整数、およびその範囲内の整数によって定義されるすべての部分範囲を含む。
文脈から別段に明確ではない限り、「約」という用語は、規定の値の測定の標準誤差（例えば、ＳＥＭ）内の値を包含する。
「および／または」という用語は、関連する列挙された項目のうちの１つ以上のあらゆる可能な組み合わせ、ならびに代替物（「または」）で解釈されるときの組み合わせの欠如を指し、これらを包含する。
「または」という用語は、特定のリストの任意の１つのメンバーを指し、そのリストのメンバーの任意の組み合わせも含む。
冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の単数形は、文脈が別段に明確に規定していない限り、複数形の言及を含む。例えば、「タンパク質」または「少なくとも１つのタンパク質」という用語は、それらの混合物を含む複数のタンパク質を含み得る。
統計的に有意とは、ｐ≦０．０５を意味する。
［発明を実施するための形態］
Ｉ．概要
Ｃａｓタンパク質対応タウバイオセンサー細胞、ならびにタウの播種または凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングするためにそのような細胞を作成および使用する方法が提供される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）対応タウバイオセンサー細胞、ならびにタウの播種または凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングするためにそのような細胞を作成および使用する方法が提供される。Ｃａｓタンパク質対応タウバイオセンサー細胞、ならびにタウ脱凝集または凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングするためにそのような細胞を作成および使用する方法が提供される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）対応タウバイオセンサー細胞、ならびにタウ脱凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングするためのそのような細胞を作製および使用する方法が提供される。そのような細胞をタウ播種活性またはタウ凝集に感作するための試薬および方法もまた提供される。タウ凝集を誘導するための試薬および方法もまた提供される。
異常なタウタンパク質凝集のプロセスを変更する遺伝子および経路を同定するために、ＣＲＩＳＰＲ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲｎ）ｓｇＲＮＡライブラリを使用してスクリーニングを行い、タウ疾患関連タンパク質凝集体によって「播種される」細胞の可能性を調節する遺伝子（例えば、破壊された場合に、タウ線維化タンパク質の供給源に曝露されたときに細胞をタウ凝集体形成により感受性にさせる遺伝子）を同定するためのプラットフォームが開発された。異常なタウタンパク質凝集のプロセスを変更する遺伝子および経路をさらに同定するために、ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）ｓｇＲＮＡライブラリを使用してスクリーニングを行い、タウ疾患関連タンパク質凝集体によって「播種される」細胞の可能性を調節する遺伝子（例えば、転写活性化された場合に、タウ線維化タンパク質の供給源に曝露されたときに細胞をタウ凝集体形成により感受性にさせる遺伝子）を同定するためのプラットフォームが開発された。同様に、ＣＲＩＳＰＲ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲｎ）ｓｇＲＮＡライブラリを使用してスクリーニングを行い、破壊された場合に、タウ凝集を防止するか、またはタウ脱凝集を促進する遺伝子を同定するためのプラットフォームが開発された。同様に、ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）ｓｇＲＮＡライブラリを使用してスクリーニングを行い、転写活性化された場合に、タウ凝集を防止するか、またはタウ脱凝集を促進する遺伝子を同定するためのプラットフォームが開発された。「種」とは、同様の凝集ドメインを有する他のタンパク質の凝集を核形成する１つ以上のタンパク質を指す。試料の播種活性とは、同様の凝集ドメインを有するタンパク質の凝集を核形成（すなわち、誘導）する試料の能力を指す。そのような遺伝子の同定は、神経変性疾患の状況においてタウ凝集体を形成するニューロンの感受性を支配するタウ細胞間凝集体増殖のメカニズムおよび遺伝的経路を解明し得る。
スクリーニングは、凝集したときに検出可能なシグナルを生成する細胞内バイオセンサーとして一緒に作用し得る固有のレポーターに連結された、病原性変異（例えば、Ｐ３０１Ｓ病原性変異）を有するタウリピートドメイン（例えば、タウ４リピートドメイン、ｔａｕ＿４ＲＤ）を安定して発現する細胞からなるタウバイオセンサー細胞株（例えば、ヒト細胞株、またはＨＥＫ２９３Ｔ）を用いる。非限定的な一例では、細胞株は、蛍光タンパク質ＣＦＰ（例えば、ｅＣＦＰ）または蛍光タンパク質ＹＦＰ（例えば、ｅＹＦＰ）に融合した疾患関連タンパク質バリアントを安定して発現する２つの導入遺伝子：タウ４ＲＤ－ＣＦＰ／タウ４ＲＤ－ＹＦＰ（ＴＣＹ）を含み、タウリピートドメイン（４ＲＤ）は、Ｐ３０１Ｓ病原性変異を含む。これらのバイオセンサー株では、タウ－ＣＦＰ／タウ－ＹＦＰタンパク質の凝集により、ドナーＣＦＰからアクセプターＹＦＰへの蛍光エネルギーの移動の結果である蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）シグナルが生成される。本明細書で使用される場合のＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）という用語は、ｅＣＦＰ（増強されたシアン蛍光タンパク質）を含み、本明細書で使用される場合のＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）という用語は、ｅＹＦＰ（増強された黄色蛍光タンパク質）を含む。タウ凝集体を含むＦＲＥＴ陽性細胞は、フローサイトメトリーによって選別および単離され得る。ベースラインでは、刺激されていない細胞は、最小限のＦＲＥＴシグナルで安定した可溶性状態でレポーターを発現する。刺激（例えば、種粒子のリポソームトランスフェクション）により、レポータータンパク質は凝集体を形成し、ＦＲＥＴシグナルを生成する。凝集体含有細胞はＦＡＣＳによって単離され得る。安定して増殖する凝集体含有細胞株Ａｇｇ［＋］は、Ａｇｇ［－］細胞株のクローン連続希釈によって単離され得る。
このタウバイオセンサー細胞株には、ＣＲＩＳＰＲｎライブラリを使用する遺伝子スクリーニングに役立つようにいくつかの修飾がなされた。最初に、これらのタウバイオセンサー細胞は、ＣＲＩＳＰＲｎスクリーニングで使用するためにＣａｓ発現導入遺伝子（例えば、Ｃａｓ９またはＳｐＣａｓ９）を導入することによって修飾された。次に、細胞をタウ播種活性およびタウ凝集に感作するための試薬および方法が開発された。タウ凝集体がすべての細胞において安定して持続し、経時的に増殖および複数回継代する細胞株が開発された。これらの細胞は、コンフルエントな細胞上に一定期間存在している培地を収集することにより、馴化培地を生成するために使用された。次いで、これらのレシピエント細胞のごく一部の割合でタウ凝集が誘導され、それによってそれらをタウ播種活性およびタウ凝集に感作することができる比率で、この馴化培地を、ナイーブタウバイオセンサータウ細胞に適用することができる。共培養のない馴化培地は、これまで播種剤としてこの状況で使用されたことがない。しかしながら、インビトロで生成されたタウ線維は限られた供給源であるため、馴化培地は大規模なゲノムワイドスクリーニングに特に有用である。さらに、馴化培地は、インビトロではなく細胞によって生成および分泌されるため、より生理学的に適切である。
凝集体のないＣａｓ発現タウバイオセンサー細胞（Ａｇｇ［－］）にＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡライブラリを導入し、各標的遺伝子にノックアウト変異を導入するスクリーニング方法を開発するために、これらの細胞株を使用した。細胞を培養してゲノム編集および拡大を可能にした後、細胞を馴化培地で増殖させて、それらを播種活性に感作し、タウ凝集が生じた細胞を同定した。タウ播種活性の外部供給源に曝露されたときにタウ播種に対する細胞の感受性を調節することができる遺伝子を同定するために、ゲノム編集および拡大中の初期の時点に対して、凝集陽性亜集団が豊富なガイドＲＮＡを同定した。
同様に、このタウバイオセンサー細胞株にいくつかの修飾を行い、ＣＲＩＳＰＲａライブラリを使用した遺伝子スクリーニングに役立つようにした（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ相乗活性化メディエーター（ＳＡＭ）系で使用するため）。例示的なＳＡＭ系では、いくつかの活性化ドメインが相互作用して、任意の１つの因子のみによって誘導され得るよりも大きな転写活性化を引き起こす。例えば、例示的なＳＡＭ系は、１つ以上の転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４）に融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラＣａｓタンパク質、および１つ以上の転写活性化ドメインに融合された（例えば、ｐ６５およびＨＳＦ１に融合された）アダプタータンパク質（例えば、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ））を含むキメラアダプタータンパク質を含む。ＭＣＰは、ＭＳ２ステムループに自然に結合する。例示的なＳＡＭ系では、ＭＣＰは、ＣＲＩＳＰＲ関連ｓｇＲＮＡに操作されたＭＳ２ステムループと相互作用し、それにより、結合した転写因子を適切なゲノム位置にシャトルする。
まず、これらのタウバイオセンサー細胞は、１つ以上の転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４）に融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラＣａｓタンパク質と、１つ以上の転写活性化ドメインに融合した（例えば、ｐ６５およびＨＳＦ１に融合した）アダプタータンパク質（例えば、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ））を含むキメラアダプタータンパク質とを発現する１つ以上の導入遺伝子を導入することによって修飾された。ＳＡＭ系が本明細書に記載されているが、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質などの他のＣＲＩＳＰＲａ系も使用することができ、そのような系はまたキメラアダプタータンパク質を含まない。そのような場合、タウバイオセンサー細胞は、キメラＣａｓタンパク質を発現する導入遺伝子を導入することによって修飾されるであろう。
次に、細胞をタウ播種活性およびタウ凝集に感作するための試薬および方法が開発された。タウ凝集体がすべての細胞において安定して持続し、経時的に増殖および複数回継代する細胞株が開発された。これらの細胞は、コンフルエントな細胞上に一定期間存在している培地を収集することにより、馴化培地を生成するために使用された。次いで、これらのレシピエント細胞のごく一部の割合でタウ凝集が誘導され、それによってそれらをタウ播種活性およびタウ凝集に感作することができる比率で、この馴化培地を、ナイーブタウバイオセンサータウ細胞に適用することができる。共培養のない馴化培地は、これまで播種剤としてこの状況で使用されたことがない。しかしながら、インビトロで生成されたタウ線維は限られた供給源であるため、馴化培地は大規模なゲノムワイドスクリーニングに特に有用である。さらに、馴化培地は、インビトロではなく細胞によって生成および分泌されるため、より生理学的に適切である。
凝集体のないＳＡＭ発現タウバイオセンサー細胞（Ａｇｇ［－］）にＣＲＩＳＰＲａガイドＲＮＡライブラリを導入し、各標的遺伝子を転写活性化するスクリーニング方法を開発するために、これらの細胞株を使用した。細胞を培養してゲノム編集および拡大を可能にした後、細胞を馴化培地で増殖させて、それらを播種活性に感作し、タウ凝集が生じた細胞を同定した。タウ播種活性の外部供給源に曝露されたときにタウ播種に対する細胞の感受性を調節することができる遺伝子を同定するために、ゲノム編集および拡大中の初期の時点に対して、凝集陽性亜集団が豊富なガイドＲＮＡを同定した。
ＩＩ．Ｃａｓ／タウバイオセンサーおよびＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞株ならびに生成方法
Ａ．Ｃａｓ／Ｔａｕバイオセンサー細胞およびＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞
第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン（例えば、タウ微小管結合ドメイン（ＭＢＤ）を含む）および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインを発現するだけでなく、Ｃａｓ９などのＣａｓタンパク質も発現する細胞が本明細書に開示される。第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン（例えば、タウ微小管結合ドメイン（ＭＢＤ）を含む）および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインを発現するだけでなく、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラＣａｓタンパク質、および１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質も発現する細胞もまた本明細書に開示される。第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインは、安定して発現され得、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインは、安定して発現され得る。例えば、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインをコードするＤＮＡは、ゲノム的に組み込むことができ、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインをコードするＤＮＡは、ゲノム的に組み込むことができる。同様に、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞において安定して発現され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡは、ゲノム的に組み込むことができる。同様に、キメラＣａｓタンパク質および／またはキメラアダプタータンパク質は、ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞において安定して発現され得る。例えば、キメラＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡは、ゲノム的に組み込むことができ、かつ／またはキメラアダプタータンパク質をコードするＤＮＡは、ゲノム的に組み込むことができる。細胞は、タウ凝集陰性であり得るか、またはタウ凝集陽性であり得る。
１．レポーターに連結されたタウおよびタウリピートドメイン
微小管関連タンパク質タウは、微小管の集合および安定性を促進するタンパク質であり、主にニューロンにおいて発現される。タウは、ニューロンの微小管を安定させ、したがって軸索伸長を促進する役割を果たす。アルツハイマー病（ＡＤ）およびタウオパチーと呼ばれる関連する神経変性疾患のファミリーでは、タウタンパク質は、異常に過剰リン酸化され、神経原線維変化として現れるフィラメントの束（対らせん状フィラメント）に凝集する。タウオパチーは、脳内の異常なタウ沈着を特徴とする不均一な神経変性状態のグループである。
タウリピートドメインは、ヒト、マウス、またはラットなどの任意の動物または哺乳動物からのタウタンパク質に由来し得る。１つの特定の例では、タウリピートドメインは、ヒトタウタンパク質に由来する。例示的なヒトタウタンパク質には、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１０６３６が割り当てられている。タウタンパク質は、ヒトではＭＡＰＴ（微小管関連タンパク質タウ）と呼ばれる単一遺伝子からの選択的スプライシングの生成物である。タウリピートドメインは、凝集に関与する配列モチーフを運ぶ（すなわち、それはタウからの凝集しやすいドメインである）。スプライシングに応じて、タウタンパク質のリピートドメインは、タンパク質の凝集しやすいコアを構成する３つまたは４つのリピート領域のいずれかを有し、これはしばしば、リピートドメイン（ＲＤ）と呼ばれる。具体的には、タウのリピートドメインは、微小管結合領域のコアを表し、タウ凝集に関与するＲ２およびＲ３のヘキサペプチドモチーフを内包する。ヒトの脳には、３５２～４４１アミノ酸長の範囲の６つのタウアイソフォームがある。これらのアイソフォームは、アミノ末端での１つまたは２つの挿入ドメインの存在または不在に加えて、３つのリピートドメインまたは４つのリピートドメイン（Ｒ１～Ｒ４）のいずれかの存在に従ってカルボキシル末端で変化する。タウのカルボキシル末端の半分に位置するリピートドメインは、微小管結合、ならびにタウオパチーに見られる神経原線維変化のコア構成要素である対らせん状フィラメント（ＰＨＦ）へのタウの病理学的凝集に重要であると考えられている。４つのリピートドメイン（Ｒ１～Ｒ４）の例示的な配列は、それぞれ、配列番号１～４に提供される。４つのリピートドメイン（Ｒ１～Ｒ４）の例示的なコード配列は、配列番号５～８に提供される。タウ４リピートドメインの例示的な配列は、配列番号９に提供される。タウ４リピートドメインの例示的なコード配列は、配列番号１０に提供される。Ｐ３０１Ｓ変異を有するタウ４リピートドメインの例示的な配列は、配列番号１１に提供される。Ｐ３０１Ｓ変異を有するタウ４リピートドメインの例示的なコード配列は、配列番号１２に提供される。
Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞またはＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞で使用されるタウリピートドメインは、タウ微小管結合ドメイン（ＭＢＤ）を含み得る。Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞またはＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞で使用されるタウリピートドメインは、４つのリピートドメイン（Ｒ１～Ｒ４）のうちの１つ以上またはすべてを含み得る。例えば、タウリピートドメインは、配列番号１、２、３、および４のうちの１つ以上もしくはすべて、または配列番号１、２、３、および４と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。１つの特定の例では、タウリピートドメインは、いくつかのタウアイソフォームに見られるタウ４リピートドメイン（Ｒ１～Ｒ４）である。タウ４リピートドメインは、培養細胞において確実に線維を形成するため、完全長タウの代わりに使用され得る。例えば、タウリピートドメインは、配列番号９もしくは配列番号１１、または配列番号９もしくは配列番号１１と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。１つの特定の例では、タウリピートドメインをコードする核酸は、配列番号１２または配列番号１２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得、任意に、核酸は、配列番号１１を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。別の特定の例では、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインをコードする核酸は、配列番号１０または配列番号１０と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得、任意に、核酸は、配列番号９を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。本明細書に開示される細胞における第１および第２のタウリピートドメインは、同じであるか、類似であるか、または異なり得る。
第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインのうちの一方または両方は、細胞において安定して発現され得る。例えば、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインの一方または両方をコードする核酸は、細胞集団においてゲノム的に組み込まれ、細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結され得る。
本明細書に開示される細胞において使用されるタウリピートドメインはまた、凝集促進変異などのタウ病原性変異を含み得る。そのような変異は、例えば、タウオパチーに関連する（例えば、分離する）か、またはタウオパチーを引き起こす変異であり得る。一例として、変異は、タウを播種に感作するが、タウがそれ自体で容易に凝集することをもたらさない凝集感作変異であり得る。例えば、変異は、疾患関連Ｐ３０１Ｓ変異であり得る。Ｐ３０１Ｓ変異とは、ヒトタウＰ３０１Ｓ変異、またはヒトタウタンパク質と最適にアラインされた場合の別のタウタンパク質の対応する変異を意味する。タウのＰ３０１Ｓ変異は、播種に高い感受性を呈するが、それ自体では容易に凝集しない。したがって、ベースラインでは、Ｐ３０１Ｓ変異を含むタウレポータータンパク質は、細胞内に安定した可溶性の形態で存在するが、外因性のタウ種への曝露はタウレポータータンパク質の凝集を引き起こす。他のタウ変異には、例えば、Ｋ２８０ｄｅｌ、Ｐ３０１Ｌ、Ｖ３３７Ｍ、Ｐ３０１Ｌ／Ｖ３３７Ｍ、およびＫ２８０ｄｅｌ／Ｉ２２７Ｐ／Ｉ３０８Ｐが含まれる。
任意の手段によって、第１のタウリピートドメインは、第１のレポーターに連結され得、第２のタウリピートドメインは、第２のレポーターに連結され得る。例えば、レポーターは、タウリピートドメインに融合され得る（例えば、融合タンパク質の一部として）。
第１のレポーターおよび第２のレポーターは、第１および第２のタンパク質が凝集したときに検出可能なシグナルを生成する細胞内バイオセンサーとして一緒に作用し得る固有のレポーターの対であり得る。一例として、レポーターは、蛍光タンパク質であり得、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用してタンパク質凝集を測定することができる。具体的には、第１および第２のレポーターは、ＦＲＥＴ対であり得る。ＦＲＥＴ対（ドナーおよびアクセプターフルオロフォア）の例は周知である。例えば、Ｂａｊａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｅｎｓｏｒｓ（Ｂａｓｅｌ）１６（９）：１４８８を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。典型的な蛍光顕微鏡技術は、ある波長の光のフルオロフォアによる吸収（励起）、それに続くより長い波長の二次蛍光のその後の発光に依存する。蛍光共鳴エネルギー移動のメカニズムは、励起された電子状態のドナーフルオロフォアを含み、これは、その励起エネルギーを、長距離双極子－双極子相互作用を介して非放射様式で近くのアクセプター発色団に移動させ得る。例えば、ＦＲＥＴエネルギードナーは、第１のレポーターであり得、ＦＲＥＴエネルギーアクセプターは、第２のレポーターであり得る。あるいは、ＦＲＥＴエネルギードナーは、第２のレポーターであり得、ＦＲＥＴエネルギーアクセプターは、第１のレポーターであり得る。特定の例では、第１および第２のレポーターは、ＣＦＰおよびＹＦＰである。ＣＦＰの例示的なタンパク質およびコード配列は、例えば、それぞれ配列番号１３および１４に提供される。ＹＦＰの例示的なタンパク質およびコード配列は、例えば、それぞれ配列番号１５および１６に提供される。特定の例として、ＣＦＰは、配列番号１３または配列番号１３と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。別の特定の例として、ＹＦＰは、配列番号１５または配列番号１５と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
別の例として、タンパク質断片相補戦略を使用して、凝集を検出することができる。例えば、スプリットルシフェラーゼを使用して基質から生物発光を生成することができ、第１および第２のレポーターは、ルシフェラーゼのアミノ－（ＮＬｕｃ）およびカルボキシ－（ＣＬｕｃ）末端断片であり得る。ルシフェラーゼの例には、レニラ、ホタル、コメツキムシ、およびメトリディアルシフェラーゼが挙げられる。
１つの非限定的な例では、本明細書に開示されるバイオセンサー細胞は、それぞれ、蛍光タンパク質ＣＦＰまたは蛍光タンパク質ＹＦＰに融合した疾患関連タウタンパク質バリアントを安定して発現する２つの導入遺伝子（タウ４ＲＤ－ＣＦＰ／タウ４ＲＤ－ＹＦＰ（ＴＣＹ））を含み、タウリピートドメイン（４ＲＤ）は、Ｐ３０１Ｓ病原性変異を含む。これらのバイオセンサー株では、タウ－ＣＦＰ／タウ－ＹＦＰタンパク質の凝集により、ドナーＣＦＰからアクセプターＹＦＰへの蛍光エネルギーの移動の結果であるＦＲＥＴシグナルが生成される。タウ凝集体を含むＦＲＥＴ陽性細胞は、フローサイトメトリーによって選別および単離され得る。ベースラインでは、刺激されていない細胞は、最小限のＦＲＥＴシグナルで安定した可溶性状態でレポーターを発現する。刺激（例えば、種粒子のリポソームトランスフェクション）により、レポータータンパク質は凝集体を形成し、ＦＲＥＴシグナルを生成する。
本明細書に開示されるＣａｓ／タウバイオセンサー細胞は、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する凝集陽性（Ａｇｇ［＋］）細胞であり得、タウリピートドメインが、すべての細胞において安定して持続し、経時的に増殖および複数回継代することを意味する。あるいは、本明細書に開示されるＣａｓ／タウバイオセンサー細胞は、凝集陰性（Ａｇｇ［－］）であり得る。
２．Ｃａｓタンパク質およびキメラＣａｓタンパク質
本明細書に開示されるＣａｓ／タウバイオセンサー細胞はまた、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む。任意に、Ｃａｓタンパク質は、安定して発現される。任意に、細胞は、ゲノム的に組み込まれたＣａｓコード配列を含む。同様に、本明細書に開示されるＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞はまた、１つ以上の転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４）に融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラＣａｓタンパク質をコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）も含む。任意に、キメラＣａｓタンパク質は、安定して発現される。任意に、細胞は、ゲノム的に組み込まれたキメラＣａｓコード配列を含む。
Ｃａｓタンパク質は、クラスター化された規則的に散在した短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系の一部である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系には、Ｃａｓ遺伝子の発現に関与する、またはその活性を指示する転写産物および他のエレメントが含まれる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、例えば、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ系、またはタイプＶ系（例えば、サブタイプＶ－ＡまたはサブタイプＶ－Ｂ）であり得る。本明細書に開示される方法および組成物は、核酸の部位特異的結合または切断のためにＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓタンパク質と複合体化したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む）を利用することによってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いることができる。
本明細書に開示される組成物および方法で使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、非天然発生型であり得る。「非天然発生型」系には、自然発生状態から改変もしくは変異されているか、それらが本質的に自然に関連付けられている少なくとも１つの他のコンポーネントから少なくとも実質的に自由であるか、またはそれらが自然に関連付けられていない少なくとも１つの他のコンポーネントに関連付けられている、系の１つ以上のコンポーネントなど、人間の助けの関与を示すものが含まれる。例えば、一部のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、天然に発生しないｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を一緒に含む非天然発生型ＣＲＩＳＰＲ複合体を用いるか、天然に発生しないＣａｓタンパク質を用いるか、または天然に発生しないｇＲＮＡを用いる。
Ｃａｓタンパク質は一般に、ガイドＲＮＡと相互作用し得る少なくとも１つのＲＮＡ認識または結合ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅドメインまたはＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質－タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、および他のドメインを含み得る。いくつかのそのようなドメイン（例えば、ＤＮａｓｅドメイン）は、ネイティブのＣａｓタンパク質に由来し得る。他のそのようなドメインを追加して、修飾されたＣａｓタンパク質を作製することができる。ヌクレアーゼドメインは、核酸分子の共有結合の切断を含む、核酸切断に対する触媒活性を有する。切断は、平滑末端または千鳥状の末端を生成することができ、それは一本鎖または二本鎖であり得る。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、典型的には、平滑切断生成物を生成する。あるいは、野生型Ｃｐｆ１タンパク質（例、ＦｎＣｐｆ１）は、５ヌクレオチドの５’オーバーハングを含む切断生成物をもたらすことができ、切断は、非標的化鎖のＰＡＭ配列から１８番目の塩基対の後および標的化鎖の２３番目の塩基後に発生する。Ｃａｓタンパク質は、完全な切断活性を有し、標的ゲノム遺伝子座で二本鎖切断を作成することができるか（例えば、平滑末端を含む二本鎖切断）、またはそれは標的ゲノム遺伝子座で一本鎖切断を作成するニッカーゼであり得る。
Ｃａｓタンパク質の例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｕ１９６６、ならびにそれらの相同体または修飾バージョンが挙げられる。
例示的なＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質に由来するタンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質は、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来するものであり、典型的には、保存されたアーキテクチャを有する４つの重要なモチーフを共有する。モチーフ１、２、および４は、ＲｕｖＣ様モチーフであり、モチーフ３は、ＨＮＨモチーフである。例示的なＣａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、またはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉに由来する。Ｃａｓ９ファミリーメンバーの追加の例は、ＷＯ２０１４／１３１８３３に記載されており、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐＣａｓ９）由来のＣａｓ９（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２が割り当てられている）は、例示的なＣａｓ９タンパク質である。例示的なＳｐＣａｓ９タンパク質およびコード配列は、それぞれ、配列番号２１および２２に示されている。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＳａＣａｓ９）由来のＣａｓ９（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｊ７ＲＵＡ５が割り当てられている）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（ＣｊＣａｓ９）のＣａｓ９（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ０Ｐ８９７が割り当てられている）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．８：１４５００を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＳａＣａｓ９は、ＳｐＣａｓ９よりも小さく、ＣｊＣａｓ９は、ＳａＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９の両方よりも小さい。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｎｍｅ２Ｃａｓ９）由来のＣａｓ９は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。例えば、Ｅｄｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ７３（４）：７１４－７２６を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座（Ｓｔ１Ｃａｓ９）によってコードされるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９ Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ３遺伝子座（Ｓｔ３Ｃａｓ９）由来のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９）は、他の例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣａｓ９（ＦｎＣａｓ９）または代替ＰＡＭを認識するＲＨＡ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃａｓ９バリアント（Ｅ１３６９Ｒ／Ｅ１４４９Ｈ／Ｒ１５５６Ａ置換）は、他の例示的なＣａｓ９タンパク質である。これらおよび他の例示的なＣａｓ９タンパク質は、例えば、Ｃｅｂｒｉａｎ－Ｓｅｒｒａｎｏ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ（２０１７）Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ２８（７）：２４７－２６１で概説されており、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一例として、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であり得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質であり得る。１つの特定の例として、Ｃａｓタンパク質は、配列番号２１または配列番号２１と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。別の特定の例として、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質および１つ以上の転写活性化ドメインを含むキメラＣａｓタンパク質は、配列番号３６または配列番号３６と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
Ｃａｓタンパク質の別の例は、Ｃｐｆ１（ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １のＣＲＩＳＰＲ）タンパク質である。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９の対応するドメインに相同なＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを、Ｃａｓ９の特徴的なアルギニンに富むクラスターの対応物とともに含む大きなタンパク質（約１３００アミノ酸）である。しかしながら、Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９タンパク質に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインを欠いており、ＨＮＨドメインを含む長い挿入を含むＣａｓ９とは対照的に、ＲｕｖＣ様ドメインは、Ｃｐｆ１配列において隣接している。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ １６３（３）：７５９－７７１を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。例示的なＣｐｆ１タンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ １、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７ １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ細菌ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ細菌ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、およびＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅに由来する。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２由来のＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１；ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ａ０Ｑ７Ｑ２が割り当てられている）は、例示的なＣｐｆ１タンパク質である。
Ｃａｓタンパク質は、野生型タンパク質（すなわち、本質的に発生するもの）、修飾Ｃａｓタンパク質（すなわち、Ｃａｓタンパク質バリアント）、または野生型もしくは修飾Ｃａｓタンパク質の断片であり得る。Ｃａｓタンパク質はまた、野生型または修飾Ｃａｓタンパク質の触媒活性に関して、活性なバリアントまたは断片であり得る。触媒活性に関する活性バリアントまたは断片は、野生型もしくは修飾Ｃａｓタンパク質またはその一部と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を含み得、活性バリアントは、所望の切断部位で切断する能力を保持し、したがって、二本鎖切断誘導活性を保持する。二本鎖切断誘導活性のアッセイは既知であり、一般に、切断部位を含むＤＮＡ基質上のＣａｓタンパク質の全体的な活性および特異性を測定する。
修飾Ｃａｓタンパク質の一例は、修飾ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１タンパク質であり、これは、非特異的ＤＮＡ接触を低減するように設計された改変を含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の忠実度の高いバリアント（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）である。例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ ５２９（７５８７）：４９０－４９５を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。修飾Ｃａｓタンパク質の別の例は、オフターゲット効果を低減するように設計された修飾ｅＳｐＣａｓ９バリアント（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）である。例えば、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１（６２６８）：８４－８８を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。他のＳｐＣａｓ９バリアントには、Ｋ８５５ＡおよびＫ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａが含まれる。これらおよび他の修飾Ｃａｓタンパク質は、例えば、Ｃｅｂｒｉａｎ－Ｓｅｒｒａｎｏ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ（２０１７）Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ２８（７）：２４７－２６１で概説されており、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。修飾Ｃａｓ９タンパク質の別の例は、ｘＣａｓ９であり、これは拡張された範囲のＰＡＭ配列を認識することができるＳｐＣａｓ９バリアントである。例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｎａｔｕｒｅ ５５６：５７－６３を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ｃａｓタンパク質は、核酸結合親和性、核酸結合特異性、および酵素活性のうちの１つ以上を増加または減少させるように修飾され得る。Ｃａｓタンパク質はまた、安定性など、タンパク質の任意の他の活性または特性を変更するように修飾され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、タンパク質の機能に必須ではないドメインを除去するために、またはＣａｓタンパク質の活性または特性を最適化（例えば、増強または低減）するために切り詰めることができる。別の例として、Ｃａｓタンパク質の１つ以上のヌクレアーゼドメインは、修飾、削除、または不活性化され得る（例えば、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞で使用するため）。
Ｃａｓタンパク質は、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含み得る。例えば、野生型Ｃｐｆ１タンパク質は、一般に、おそらく二量体立体配座で、標的ＤＮＡの両方の鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを含み得る。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、一般に、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインはそれぞれ、二本鎖ＤＮＡの異なる鎖を切断して、ＤＮＡに二本鎖切断を行うことができる。例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－８２１を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ヌクレアーゼドメインの１つ以上またはすべては、削除または変異され得、それによりそれらが機能しなくなるか、または低減されたヌクレアーゼ活性を有する。例えば、Ｃａｓ９タンパク質でヌクレアーゼドメインの１つが削除または変異されている場合、得られたＣａｓ９タンパク質はニッカーゼと称され、二本鎖標的ＤＮＡ内で一本鎖切断を生成することができるが、二本鎖切断では生成することができない（すなわち、相補鎖または非相補鎖を切断することができるが、両方を切断することはできない）。ヌクレアーゼドメインの両方が削除または変異された場合、得られたＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖（例えば、ヌクレアーゼヌルまたはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、または触媒活性を伴わないＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ））を切断する能力が低減される。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の例は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣドメインにおけるＤ１０Ａ（Ｃａｓ９の１０位でのアスパラギン酸塩からアラニンへ）変異である。同様に、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＨＮＨドメインにあるＨ９３９Ａ（アミノ酸８３９位でのヒスチジンからアラニンへ）、Ｈ８４０Ａ（アミノ酸８４０位でのヒスチジンからアラニンへ）、またはＮ８６３Ａ（アミノ酸Ｎ８６３位でのアスパラギンからアラニンへ）は、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換し得る。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の他の例には、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９への対応する変異が挙げられる。例えば、Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９（２１）：９２７５－９２８２およびＷＯ２０１３／１４１６８０を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。そのような変異は、部位特異的変異導入、ＰＣＲを介した変異導入、または全遺伝子合成などの方法を使用して生成され得る。ニッカーゼを作る他の変異の例は、例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２およびＷＯ２０１３／１４２５７８において見出すことができ、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ヌクレアーゼドメインのすべてがＣａｓタンパク質で削除または変異された場合（例えば、ヌクレアーゼドメインの両方がＣａｓ９タンパク質で削除または変異された場合）、得られたＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖（例えば、ヌクレアーゼヌルまたはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質）を切断する能力が低減される。１つの特定の例は、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９二重変異体、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９と最適にアラインされた場合の別の種からのＣａｓ９の対応する二重変異体である。別の特定の例は、Ｄ１０Ａ／Ｎ８６３Ａ Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９二重変異体、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９と最適にアラインされた場合の別の種からのＣａｓ９の対応する二重変異体である。
ｘＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例は、ＳｐＣａｓ９について上に記載されるものと同じである。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９酵素（ＳａＣａｓ９）は、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を生成するために、Ｎ５８０位での置換（例えば、Ｎ５８０Ａ置換）およびＤ１０位での置換（例えば、Ｄ１０Ａ置換）を含み得る。例えば、ＷＯ２０１６／１０６２３６を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である（例えば、Ｄ１６ＡおよびＨ５８８Ａの組み合わせ）。Ｓｔ１Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である（例えば、Ｄ９Ａ、Ｄ５９８Ａ、Ｈ５９９Ａ、およびＮ６２２Ａの組み合わせ）。Ｓｔ３Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である（例えば、Ｄ１０ＡおよびＮ８７０Ａの組み合わせ）。ＣｊＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である（例えば、Ｄ８ＡおよびＨ５５９Ａの組み合わせ）。ＦｎＣａｓ９およびＲＨＡ ＦｎＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である（例えば、Ｎ９９５Ａ）。
Ｃｐｆ１タンパク質の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）、およびＭｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７（ＭｂＣｐｆ１ Ｃｐｆ１）由来のＣｐｆ１タンパク質に関して、そのような変異には、ＡｓＣｐｆ１の９０８、９９３、もしくは１２６３位またはＣｐｆ１オルソログの対応する位置、あるいはＬｂＣｐｆ１の８３２、９２５、９４７、もしくは１１８０位またはＣｐｆ１オルソログの対応する位置での変異が含まれ得る。そのような変異は、例えば、ＡｓＣｐｆ１の変異Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、およびＤ１２６３ＡもしくはＣｐｆ１オルソログの対応する変異、またはＬｂＣｐｆ１のＤ８３２Ａ、Ｅ９２５Ａ、Ｄ９４７Ａ、およびＤ１１８０ＡもしくはＣｐｆ１オルソログの対応する変異のうちの１つ以上を含み得る。例えば、ＵＳ２０１６／０２０８２４３を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ｃａｓタンパク質はまた、融合タンパク質として異種ポリペプチドに作動可能に連結され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、切断ドメイン、エピジェネティック修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写リプレッサードメインに融合され得る。ＷＯ２０１４／０８９２９０を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞で使用するために、転写活性化ドメインに作動可能に連結または融合され得る。転写活性化ドメインの例には、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６活性化ドメイン、ＶＰ６４（ＶＰ１６の四量体誘導体）、ＮＦκＢ ｐ６５活性化ドメイン、ｐ５３活性化ドメイン１および２、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質）活性化ドメイン、Ｅ２Ａ活性化ドメイン、およびＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子）活性化ドメインが挙げられる。他の例には、Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ－２Ａ、ＳＰ１、ＡＰ－２、ＣＴＦ１、Ｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１、ＰｖＡＬＦ、ＥＲＦ－２、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ－１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ－５、ＡＲＦ－６、ＡＲＦ－７、ＡＲＦ－８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ－ＲＰ／ＧＰ、ＴＲＡＢ１ＰＣ４、およびＨＳＦ１由来の活性化ドメインが挙げられる。例えば、ＵＳ２０１６／０２３７４５６、ＥＰ３０４５５３７、およびＷＯ２０１１／１４６１２１を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。いくつかの場合では、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１と対になったｄＣａｓ９－ＶＰ６４融合タンパク質を含む転写活性化系を使用することができる。そのような系のガイドＲＮＡは、二量体化ＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質に結合するように設計されたｓｇＲＮＡテトラループおよびステムループ２に付加されたアプタマー配列を使用して設計され得る。例えば、Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ ５１７（７５３６）：５８３－５８８を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。転写リプレッサードメインの例には、誘導性ｃＡＭＰ初期リプレッサー（ＩＣＥＲ）ドメイン、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックスＡ（ＫＲＡＢ－Ａ）リプレッサードメイン、ＹＹ１グリシンリッチリプレッサードメイン、Ｓｐ１様リプレッサー、Ｅ（ｓｐｌ）リプレッサー、ΙκΒリプレッサー、およびＭｅＣＰ２が挙げられる。他の例には、Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ－ベータ誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ－ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＳＩＤ４Ｘ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＧ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、Ｒｂ、ＲＯＭ２由来の転写リプレッサードメインが挙げられる。例えば、ＥＰ３０４５５３７およびＷＯ２０１１／１４６１２１を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。Ｃａｓタンパク質はまた、安定性の増加または減少を提供する異種ポリペプチドに融合され得る。融合ドメインまたは異種ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質の内部に位置し得る。
Ｃａｓタンパク質はまた、融合タンパク質として異種ポリペプチドに作動可能に連結され得る。一例として、Ｃａｓタンパク質は、細胞内局在化を提供する１つ以上の異種ポリペプチドに融合され得る。そのような異種ポリペプチドには、例えば、核を標的とするための単節型（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）ＳＶ４０ ＮＬＳおよび／または双節型（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）アルファ－インポーチンＮＬＳなどの１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアを標的とするためのミトコンドリア局在化シグナル、ＥＲ保持シグナルなどが含まれる。例えば、Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：５１０１－５１０５を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。そのような細胞内局在化シグナルは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質内の任意の場所に位置し得る。ＮＬＳは、一続きの塩基性アミノ酸を含むことができ、単節型配列または双節型配列であり得る。任意に、Ｃａｓタンパク質は、Ｎ末端にＮＬＳ（例えば、アルファ－インポーチンＮＬＳまたは単節型ＮＬＳ）およびＣ末端にＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳまたは双節型ＮＬＳ）を含む２つ以上のＮＬＳを含み得る。Ｃａｓタンパク質はまた、Ｎ末端に２つ以上のＮＬＳおよび／またはＣ末端に２つ以上のＮＬＳを含み得る。
Ｃａｓタンパク質はまた、細胞透過性ドメインまたはタンパク質導入ドメインに操作可能に連結され得る。例えば、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ－１ ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルスからのＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ－１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルスからの細胞透過性ペプチド、またはポリアルギニンペプチド配列に由来し得る。例えば、ＷＯ２０１４／０８９２９０およびＷＯ２０１３／１７６７７２を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。細胞透過性ドメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質内の任意の場所に位置し得る。
Ｃａｓタンパク質はまた、追跡または精製を容易にするために、蛍光タンパク質、精製タグ、またはエピトープタグなどの異種ポリペプチドに作動可能に連結され得る。蛍光タンパク質の例には、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄモノマー、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、および任意の他の好適な蛍光タンパク質が挙げられる。タグの例には、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、およびカルモジュリンが挙げられる。
Ｃａｓタンパク質は、任意の形態で提供され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、タンパク質の形態で提供され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡと複合体化したＣａｓタンパク質として提供され得る。あるいは、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））またはＤＮＡなどの、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態で提供され得る。任意に、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、特定の細胞または生物におけるタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、天然発生型ポリヌクレオチド配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、任意の他の目的の宿主細胞において、より高い使用頻度を有するコドンを置換するように修飾され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ヒト細胞での発現のためにコドン最適化することができる。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸が細胞に導入されると、Ｃａｓタンパク質は、一時的、条件付き、または構成的に細胞内で発現され得る。
ｍＲＮＡとして提供されるＣａｓタンパク質は、安定性および／または免疫原性の特性の改善のために修飾され得る。修飾は、ｍＲＮＡ内の１つ以上のヌクレオシドに対して行われ得る。ｍＲＮＡ核酸塩基への化学修飾の例には、シュードウリジン、１－メチル－シュードウリジン、および５－メチル－シチジンが挙げられる。例えば、Ｎ１－メチルシュードウリジンを含むキャップされポリアデニル化されたＣａｓ ｍＲＮＡを使用することができる。同様に、Ｃａｓ ｍＲＮＡは、同義コドンを使用してウリジンを枯渇させることによって修飾され得る。
Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、細胞のゲノムにおいて安定して組み込まれ、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結され得る。１つの特定の例では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、配列番号２２または配列番号２２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得、任意に、核酸は、配列番号２１を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。別の特定の例では、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質および１つ以上の転写活性化ドメインを含むキメラＣａｓタンパク質をコードする核酸は、配列番号３８または配列番号３８と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得、任意に、核酸は、配列番号３６を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。あるいは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、発現構築物中のプロモーターに作動可能に連結され得る。発現構築物は、遺伝子または他の目的の核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を指示することができ、かつそのような目的の核酸配列を標的細胞に移すことができる任意の核酸構築物を含む。発現構築物において使用され得るプロモーターには、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発達的に制限された前駆細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚のうちの１つ以上において活性なプロモーターが含まれる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであり得る。
３．キメラアダプタータンパク質
本明細書に開示されるＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞は、１つ以上の転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４）に融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラＣａｓタンパク質をコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）だけでなく、任意に、１つ以上の転写活性化ドメインに融合された（例えば、ｐ６５およびＨＳＦ１に融合された）アダプタータンパク質（例えば、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ））を含むキメラアダプタータンパク質をコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）も含み得る。任意に、キメラＣａｓタンパク質および／またはキメラアダプタータンパク質は、安定して発現される。任意に、細胞は、ゲノム的に組み込まれたキメラＣａｓタンパク質コード配列および／またはゲノム的に組み込まれたキメラアダプタータンパク質コード配列を含む。
そのようなキメラアダプタータンパク質は、（ａ）ガイドＲＮＡ内のアダプター結合エレメントに特異的に結合するアダプター（すなわち、アダプタードメインまたはアダプタータンパク質）、および（ｂ）１つ以上の異種転写活性化ドメインを含む。例えば、そのような融合タンパク質は、１、２、３、４、５、またはそれ以上の転写活性化ドメイン（例えば、２つ以上の異種転写活性化ドメインまたは３つ以上の異種転写活性化ドメイン）を含み得る。一例では、そのようなキメラアダプタータンパク質は、（ａ）ガイドＲＮＡのアダプター結合エレメントに特異的に結合するアダプター（すなわち、アダプタードメインまたはアダプタータンパク質）、および（ｂ）２つ以上の転写活性化ドメインを含み得る。例えば、キメラアダプタータンパク質は、（ａ）ガイドＲＮＡの１つ以上のＭＳ２アプタマー（例えば、ガイドＲＮＡの別々の位置にある２つのＭＳ２アプタマー）に特異的に結合するＭＳ２コートタンパク質アダプター、および（ｂ）１つ以上（例えば、２つ以上の転写活性化ドメイン）を含み得る。例えば、２つの転写活性化ドメインは、ｐ６５およびＨＳＦ１転写活性化ドメインまたはそれらの機能的断片もしくはバリアントであり得る。しかしながら、転写活性化ドメインが他の転写活性化ドメインまたはその機能的断片もしくはバリアントを含むキメラアダプタータンパク質もまた提供される。
１つ以上の転写活性化ドメインは、アダプターに直接融合され得る。あるいは、１つ以上の転写活性化ドメインは、リンカーもしくはリンカーの組み合わせを介して、または１つ以上の追加のドメインを介してアダプターに連結され得る。同様に、２つ以上の転写活性化ドメインが存在する場合、それらは互いに直接融合され得るか、またはリンカーもしくはリンカーの組み合わせを介して、または１つ以上の追加のドメインを介して互いに連結され得る。これらの融合タンパク質で使用され得るリンカーには、融合タンパク質の機能を干渉しない任意の配列を含み得る。例示的なリンカーは短く（例えば、２～２０アミノ酸）、典型的には、柔軟である（例えば、グリシン、アラニン、およびセリンなどの自由度の高いアミノ酸を含む）。
１つ以上の転写活性化ドメインおよびアダプターは、キメラアダプタータンパク質内で任意の順序であり得る。１つの選択肢として、１つ以上の転写活性化ドメインは、アダプターのＣ末端であり得、アダプターは、１つ以上の転写活性化ドメインのＮ末端であり得る。例えば、１つ以上の転写活性化ドメインは、キメラアダプタータンパク質のＣ末端にあり得、アダプターは、キメラアダプタータンパク質のＮ末端にあり得る。しかしながら、１つ以上の転写活性化ドメインは、キメラアダプタータンパク質のＣ末端になくても、アダプターのＣ末端にあり得る（例えば、核局在化シグナルがキメラアダプタータンパク質のＣ末端にある場合）。同様に、アダプターは、キメラアダプタータンパク質のＮ末端になくても、１つ以上の転写活性化ドメインのＮ末端にあり得る（例えば、核局在化シグナルがキメラアダプタータンパク質のＮ末端にある場合）。別の選択肢として、１つ以上の転写活性化ドメインは、アダプターのＮ末端であり得、アダプターは、１つ以上の転写活性化ドメインのＣ末端であり得る。例えば、１つ以上の転写活性化ドメインは、キメラアダプタータンパク質のＮ末端にあり得、アダプターは、キメラアダプタータンパク質のＣ末端にあり得る。さらに別の選択肢として、キメラアダプタータンパク質が２つ以上の転写活性化ドメインを含む場合、２つ以上の転写活性化ドメインは、アダプターに隣接し得る。
キメラアダプタータンパク質はまた、追加の異種ポリペプチドに作動可能に連結または融合され得る。融合または連結された異種ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはキメラアダプタータンパク質の内部の任意の場所に位置し得る。例えば、キメラアダプタータンパク質は、核局在化シグナルをさらに含み得る。そのようなタンパク質の特定の例は、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）のｐ６５転写活性化ドメインのＣ末端、およびｐ６５転写活性化ドメインのＨＳＦ１転写活性化ドメインのＣ末端に（直接またはＮＬＳを介してのいずれかで）連結されたＭＳ２コートタンパク質（アダプター）を含む。そのようなタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、ＭＣＰ、核局在化シグナル、ｐ６５転写活性化ドメイン、およびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み得る。例えば、キメラアダプタータンパク質は、配列番号３７に示されるＭＣＰ－ｐ６５－ＨＳＦ１キメラアダプタータンパク質配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。同様に、キメラアダプタータンパク質をコードする核酸は、配列番号３９に示されるＭＣＰ－ｐ６５－ＨＳＦ１キメラアダプタータンパク質コード配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
アダプター（すなわち、アダプタードメインまたはアダプタータンパク質）は、別個の配列を特異的に認識および結合する（例えば、配列特異的様式でのアプタマーなどの別個のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ配列に結合する）核酸結合ドメイン（例えば、ＤＮＡ結合ドメインおよび／またはＲＮＡ結合ドメイン）である。アプタマーには、特定の三次元立体配座を採用する能力を通じて、高い親和性および特異性で標的分子に結合し得る核酸が含まれる。そのようなアダプターは、例えば、特定のＲＮＡ配列および二次構造に結合し得る。これらの配列（すなわち、アダプター結合エレメント）は、ガイドＲＮＡに操作され得る。例えば、ＭＳ２アプタマーは、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）に特異的に結合するようにガイドＲＮＡに操作され得る。例えば、アダプターは、配列番号４０に示されるＭＣＰ配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。同様に、アダプターをコードする核酸は、配列番号４１に示されるＭＣＰコード配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。アダプターおよび標的の特定の例には、例えば、バクテリオファージコートタンパク質の多様性の中に存在するＲＮＡ結合タンパク質／アプタマーの組み合わせが挙げられる。例えば、ＵＳ２０１９－０２８４５７２およびＷＯ２０１９／１８３１２３を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示されるキメラアダプタータンパク質は、１つ以上の転写活性化ドメインを含む。そのような転写活性化ドメインは、天然発生型転写活性化ドメインであり得るか、天然発生型転写活性化ドメインの機能的断片もしくは機能的バリアントであり得るか、または操作もしくは合成転写活性化ドメインであり得る。使用され得る転写活性化ドメインには、例えば、ＵＳ２０１９－０２８４５７２およびＷＯ２０１９／１８３１２３に記載されているものが含まれ、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
４．細胞型
本明細書に開示されるＣａｓ／タウバイオセンサー細胞は、任意の細胞型であり得、インビトロ、エクスビボ、またはインビボであり得る。Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞株または細胞集団は、モノクローナル細胞株または細胞集団であり得る。同様に、本明細書に開示されるＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞は、任意の細胞型であり得、インビトロ、エクスビボ、またはインビボであり得る。ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞株または細胞集団は、モノクローナル細胞株または細胞集団であり得る。細胞は、任意の供給源からのものであり得る。例えば、細胞は、真核細胞、動物細胞、植物細胞、または真菌（例えば、酵母）細胞であり得る。そのような細胞は、魚細胞もしくは鳥細胞であり得るか、またはそのような細胞は、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、もしくはラット細胞などの哺乳動物細胞であり得る。哺乳動物には、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウマ、雄牛、シカ、バイソン、ヒツジ、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ギニアブタ）、家畜（例えば、雌牛および去勢雄牛などのウシ種、ヒツジおよびヤギなどのヒツジ種、ブタおよびイノシシなどのブタ種）が含まれる。鳥には、例えば、鶏、七面鳥、ダチョウ、ガチョウ、およびアヒルが含まれる。家畜および農業動物も含まれる。「非ヒト動物」という用語は、ヒトを除外する。特定の例では、Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞は、ヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）である。同様に、特定の例では、ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞は、ヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）である。
細胞は、例えば、全能性細胞または多能性細胞（例えば、げっ歯類ＥＳ細胞、マウスＥＳ細胞、またはラットＥＳ細胞などの胚性幹（ＥＳ）細胞）であり得る。全能性細胞には、任意の細胞型を生じさせることができる未分化細胞が含まれ、多能性細胞には、複数の分化細胞型に発達する能力を有する未分化細胞が含まれる。そのような多能性および／または全能性細胞は、例えば、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞などのＥＳ細胞またはＥＳ様細胞であり得る。ＥＳ細胞には、胚への導入時に発達中の胚の任意の組織に寄与することができる胚由来の全能性または多能性細胞が含まれる。ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来するものであり得、３つの脊椎動物胚葉（内胚葉、外胚葉、および中胚葉）のうちのいずれかの細胞に分化することができる。
細胞はまた、一次体細胞、または一次体細胞ではない細胞であり得る。体細胞には、配偶子、生殖細胞、配偶子細胞、または未分化幹細胞ではない任意の細胞が含まれ得る。細胞はまた、一次細胞であり得る。一次細胞には、生物、器官、または組織から直接単離された細胞または細胞の培養物が含まれる。一次細胞には、形質転換も不死化もされていない細胞が含まれる。それらには、以前に組織培養で継代されなかったか、または以前に組織培養で継代されたが、組織培養で無限に継代することができない生物、器官、または組織から得られたあらゆる細胞が含まれる。そのような細胞は、従来の技術によって単離することができ、例えば、体細胞、造血細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、間葉系細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、単球、単核細胞、脂肪細胞、脂肪前駆細胞、ニューロン、グリア細胞、肝細胞、骨格筋芽細胞、および平滑筋細胞が含まれる。例えば、一次細胞は、結合組織、筋肉組織、神経系組織、または上皮組織に由来し得る。
そのような細胞には、通常は無限に増殖することはないが、変異または改変に起因して、正常な細胞老化を回避し、代わりに***を続けることができるものも含まれる。そのような変異または変化は、自然に発生し得るか、または意図的に誘発され得る。不死化細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）、およびマウス胎児線維芽細胞（例えば、３Ｔ３細胞）が挙げられる。多くの種類の不死化細胞が周知である。不死化細胞または初代細胞には、典型的には、組換え遺伝子またはタンパク質の培養または発現に使用される細胞が含まれる。
細胞はまた、神経細胞（例えば、ヒト神経細胞）などの分化細胞であり得る。
Ｂ．Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞およびＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞を生成する方法
本明細書に開示されるＣａｓ／タウバイオセンサー細胞は、任意の既知の手段によって生成され得る。第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメイン、およびＣａｓタンパク質は、任意の既知の手段によって任意の形態（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質）で細胞に導入され得る。同様に、本明細書に開示されるＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞は、任意の既知の手段によって生成され得る。第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメイン、キメラＣａｓタンパク質、およびキメラアダプタータンパク質は、任意の既知の手段によって任意の形態（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質）で細胞に導入され得る。「導入すること」は、配列が細胞の内部にアクセスできるように、核酸またはタンパク質を細胞に提示することを含む。本明細書で提供される方法は、核酸またはタンパク質を細胞に導入するための特定の方法に依存せず、核酸またはタンパク質が少なくとも１つの細胞の内部にアクセスできることのみに依存する。核酸およびタンパク質を様々な細胞型に導入するための方法は既知であり、例えば、安定したトランスフェクション法、一過性トランスフェクション法、およびウイルス媒介法が含まれる。任意に、標的化ベクターを使用することができる。
トランスフェクションプロトコル、ならびに核酸またはタンパク質を細胞に導入するためのプロトコルは異なり得る。非限定的なトランスフェクション法には、リポソーム、ナノ粒子、リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（２）：４５６－６７、Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４（４）：１５９０－４、およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ（１９９１）．Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ．ｐｐ．９６－９７）、デンドリマー、またはＤＥＡＥ－デキストランもしくはポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーを使用する化学物質ベースのトランスフェクション法が含まれる。非化学的方法には、電気穿孔法、ソノポレーション、および光トランスフェクションが含まれる。粒子ベースのトランスフェクションには、遺伝子銃の使用、またはマグネットアシストトランスフェクション（Ｂｅｒｔｒａｍ（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７，２７７－２８）が含まれる。ウイルス法もトランスフェクションに使用することができる。
細胞への核酸またはタンパク質の導入はまた、電気穿孔法、細胞質内注射、ウイルス感染、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、トランスフェクション、脂質媒介トランスフェクション、またはヌクレオフェクションによって媒介され得る。ヌクレオフェクションは、核酸基質を細胞質だけでなく核膜を介して核に送達することを可能にする改善された電気穿孔法技術である。さらに、本明細書に開示される方法でのヌクレオフェクションの使用は、典型的には、通常の電気穿孔法よりもはるかに少ない細胞を必要とする（例えば、通常の電気穿孔法による７００万に対してわずか約２００万）。一例では、ヌクレオフェクションは、ＬＯＮＺＡ（登録商標）ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）システムを使用して行われる。
細胞への核酸またはタンパク質の導入は、マイクロインジェクションによっても達成され得る。ｍＲＮＡのマイクロインジェクションは、好ましくは細胞質へ（例えば、ｍＲＮＡを翻訳機構に直接送達するために）のものであるが、一方で、タンパク質またはタンパク質をコードするＤＮＡのマイクロインジェクションは、好ましくは、核へのものである。あるいは、マイクロインジェクションは、核および細胞質の両方への注射によって実施することができ、針を最初に核に導入し、最初の量を注射することができ、細胞から針を取り除きながら、２番目の量を細胞質に注射することができる。マイクロインジェクションを実施する方法は周知である。例えば、Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｇｙ Ａ，Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ Ｍ，Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ Ｋ，Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｒ．，２００３，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０７：１５０２２－１５０２６、およびＭｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０９：９３５４－９３５９を参照されたい。
核酸またはタンパク質を細胞に導入するための他の方法には、例えば、ベクター送達、粒子媒介送達、エクソソーム媒介送達、脂質ナノ粒子媒介送達、細胞透過性ペプチド媒介送達、または埋め込み型デバイス媒介配達が含まれ得る。インビボで細胞を修飾するために対象に核酸またはタンパク質を投与する方法は、本明細書の他の場所に開示されている。
一例では、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメイン、およびＣａｓタンパク質は、レンチウイルス形質導入などのウイルス形質導入を介して導入され得る。
第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメイン、およびＣａｓタンパク質を含む細胞のスクリーニングは、任意の既知の手段によって行われ得る。
一例として、レポーター遺伝子は、Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、または第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインを有する細胞をスクリーニングするために使用され得る。例示的なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、強化青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＭｍＧＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－Ｒｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、およびアルカリホスファターゼをコードするものが含まれる。例えば、第１のレポーターおよび第２のレポーターが蛍光タンパク質（例えば、ＣＦＰおよびＹＦＰ）である場合、これらのレポーターを含む細胞は、二重陽性細胞を選択するためにフローサイトメトリーによって選択され得る。次いで、二重陽性細胞を組み合わせて、ポリクローナル統を生成するか、またはモノクローナル株は、単一の二重陽性細胞から生成され得る。
別の例として、選択マーカーは、Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、または第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインを有する細胞をスクリーニングするために使用され得る。例示的な選択マーカーには、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラスチシジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｋ）が含まれる。別の例示的な選択マーカーは、Ｓｈ ｂｌｅ遺伝子（Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン遺伝子）によってコードされるブレオマイシン耐性タンパク質であり、これは、ゼオシン（フレオマイシンＤ１）耐性を付与する。
タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する、つまりタウリピートドメインが、すべての細胞において安定して持続し、経時的に増殖および複数回継代することを意味する、凝集陽性（Ａｇｇ［＋］）細胞は、例えば、タウ凝集体を播種することによって、生成され得る。例えば、本明細書に開示されるナイーブ凝集陰性（Ａｇｇ［－］）Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞は、組換え線維化タウ（例えば、組換え線維化タウリピートドメイン）で処理されて、これらの細胞によって安定して発現されるタウリピートドメインタンパク質の凝集を播種することができる。同様に、本明細書に開示されるナイーブ凝集陰性（Ａｇｇ［－］）ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞は、組換え線維化タウ（例えば、組換え線維化タウリピートドメイン）で処理されて、これらの細胞によって安定して発現されるタウリピートドメインタンパク質の凝集を播種することができる。線維化タウリピートドメインは、細胞によって安定して発現されるタウリピートドメインと同じであるか、類似しているか、または異なり得る。任意に、組換え線維化タウは、リポフェクタミン試薬と混合され得る。次いで、播種した細胞を連続希釈して、単一細胞由来のクローンを得ることができ、タウリピートドメイン凝集体がすべての細胞において安定して持続し、経時的に増殖および複数回継代するクローン細胞株を同定することができる。
別の例として、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する、つまりタウリピートドメインが、すべての細胞において安定して持続し、経時的に増殖および複数回継代することを意味する、凝集陽性（Ａｇｇ［＋］）細胞は、例えば、細胞（例えば、タウ凝集陰性細胞）にタウ凝集陽性細胞からの細胞溶解物を播種することによって、生成され得る。これは、本明細書の実施例に記載されている「最大播種」である。例えば、細胞は、細胞溶解物を含む培地（例えば、細胞溶解物を含む新鮮な培地）を使用して播種することができる。「最大播種」は、それ自体で、凝集陰性タウバイオセンサー細胞の大部分においてタウ凝集を誘導する播種を指すことができる。「最小播種」は、それ自体で、凝集陰性タウバイオセンサー細胞においてタウ凝集を誘導するには不十分であるが（またはタウ凝集を最小限に誘導するだけである）、そのような細胞を凝集の誘導に対して感作する播種を指すことができる。
培地中の細胞溶解物の量または濃度は、任意の好適な量または濃度であり得る。例えば、培地中の細胞溶解物の濃度は、培地（例えば、新鮮な培養培地）の約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約４．５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約４μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約３．５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約３μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約２．５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約２μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約１．５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約４．５μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約４μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約３．５μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約３μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約２．５μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約２μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約１．５μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４．５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３．５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２．５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１．５μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約４．５μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約４μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約３．５μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約３μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約２．５μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約２μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約４．５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約４μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約３．５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約３μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約２．５μｇ／ｍＬ、約２．５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約２．５μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約２．５μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約２．５μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約２．５μｇ／ｍＬ～約４．５μｇ／ｍＬ、約２．５μｇ／ｍＬ～約４μｇ／ｍＬ、約２．５μｇ／ｍＬ～約３．５μｇ／ｍＬ、または約２．５μｇ／ｍＬ～約３μｇ／ｍＬであり得る。例えば、培養培地中の細胞溶解物は、約１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬの濃度であり得るか、または約１．５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ、約２．５μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ、約３．５μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ、約４．５μｇ／ｍＬ、もしくは約５μｇ／ｍＬの濃度であり得る。任意に、細胞溶解物は、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液中にあり得る。任意に、緩衝液は、プロテアーゼ阻害剤を含み得る。プロテアーゼ阻害剤の例には、これらに限定されないが、ＡＥＢＳＦ、アプロチニン、ベスタチン、Ｅ－６４、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられる。緩衝液は、これらの阻害剤のうちのいずれかまたはそれらの任意の組み合わせを含み得る（例えば、緩衝液は、これらのプロテアーゼ阻害剤のすべてを含み得る）。
溶解物を生成するための細胞は、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液に収集され得る。任意に、緩衝液は、プロテアーゼ阻害剤を含み得る。プロテアーゼ阻害剤の例には、これらに限定されないが、ＡＥＢＳＦ、アプロチニン、ベスタチン、Ｅ－６４、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられる。緩衝液は、これらの阻害剤のうちのいずれかまたはそれらの任意の組み合わせを含み得る（例えば、緩衝液は、これらのプロテアーゼ阻害剤のすべてを含み得る）。
細胞溶解物は、例えば、タウ凝集陽性細胞（例えば、上記のように緩衝液およびプロテアーゼ阻害剤に収集された細胞）を任意の好適な時間超音波処理することによって収集され得る。例えば、細胞は、約１分～約６分、約１分～約５分、約１分～約４分、約１分～約３分、約２分～約６分、約２分～約５分、約２分～約４分、約２分～約３分、約２分～約６分、約３分～約５分、または約３分～約４分間超音波処理され得る。例えば、細胞は、約２分～約４分間、または約３分間超音波処理され得る。
任意に、培地は、リポフェクタミンまたはリポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）またはリン脂質または別のトランスフェクション剤を含む。任意に、培地は、リポフェクタミンを含む。任意に、培地は、リポフェクタミンまたはリポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）またはリン脂質または別のトランスフェクション剤を含まない。任意に、培地は、リポフェクタミンを含まない。培地中のリポフェクタミンまたはリポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）またはリン脂質または他のトランスフェクション剤の量もしくは濃度は、任意の好適な量または濃度であり得る。例えば、培地中のリポフェクタミンまたはリポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）またはリン脂質または他のトランスフェクション剤の濃度は、培地（例えば、新鮮な培地）の約０．５μＬ／ｍＬ～約１０μＬ／ｍＬ、約０．５μＬ／ｍＬ～約５μＬ／ｍＬ、約０．５μＬ／ｍＬ～約４．５μＬ／ｍＬ、約０．５μＬ／ｍＬ～約４μＬ／ｍＬ、約０．５μＬ／ｍＬ～約３．５μＬ／ｍＬ、約０．５μＬ／ｍＬ～約３μＬ／ｍＬ、約０．５μＬ／ｍＬ～約２．５μＬ／ｍＬ、約０．５μＬ／ｍＬ～約２μＬ／ｍＬ、約０．５μＬ／ｍＬ～約１．５μＬ／ｍＬ、約０．５μＬ／ｍＬ～約１μＬ／ｍＬ、約１μＬ／ｍＬ～約１０μＬ／ｍＬ、約１μＬ／ｍＬ～約５μＬ／ｍＬ、約１μＬ／ｍＬ～約４．５μＬ／ｍＬ、約１μＬ／ｍＬ～約４μＬ／ｍＬ、約１μＬ／ｍＬ～約３．５μＬ／ｍＬ、約１μＬ／ｍＬ～約３μＬ／ｍＬ、約１μＬ／ｍＬ～約２．５μＬ／ｍＬ、約１μＬ／ｍＬ～約２μＬ／ｍＬ、約１μＬ／ｍＬ～約１．５μＬ／ｍＬ、約１．５μＬ／ｍＬ～約１０μＬ／ｍＬ、約１．５μＬ／ｍＬ～約５μＬ／ｍＬ、約１．５μＬ／ｍＬ～約４．５μＬ／ｍＬ、約１．５μＬ／ｍＬ～約４μＬ／ｍＬ、約１．５μＬ／ｍＬ～約３．５μＬ／ｍＬ、約１．５μＬ／ｍＬ～約３μＬ／ｍＬ、約１．５μＬ／ｍＬ～約２．５μＬ／ｍＬ、約１．５μＬ／ｍＬ～約２μＬ／ｍＬ、約２μＬ／ｍＬ～約１０μＬ／ｍＬ、約２μＬ／ｍＬ～約５μＬ／ｍＬ、約２μＬ／ｍＬ～約４．５μＬ／ｍＬ、約２μＬ／ｍＬ～約４μＬ／ｍＬ、約２μＬ／ｍＬ～約３．５μＬ／ｍＬ、約２μＬ／ｍＬ～約３μＬ／ｍＬ、または約２μＬ／ｍＬ～約２．５μＬ／ｍＬであり得る。例えば、培地中のリポフェクタミンまたはリポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）またはリン脂質または他のトランスフェクション剤の濃度は、約１．５μＬ／ｍＬ～約４μＬ／ｍＬであり得るか、またはそれは約１．５μＬ／ｍＬ、約２μＬ／ｍＬ、約２．５μＬ／ｍＬ、約３μＬ／ｍＬ、約３．５μＬ／ｍＬ、約もしくは４μＬ／ｍＬであり得る。
タウの細胞間増殖はまた、凝集体含有細胞によって分泌されるタウ凝集活性からも生じ得る。例えば、Ａｇｇ［＋］細胞、またはＡｇｇ［＋］細胞になることに感作された（例えば、タウ播種またはタウ凝集活性に感作された）細胞は、Ａｇｇ［－］Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞をＡｇｇ［＋］細胞と共培養することによって生成され得る。同様に、Ａｇｇ［＋］細胞、またはＡｇｇ［＋］細胞になることに感作された（例えば、タウ播種またはタウ凝集活性に感作された）細胞は、Ａｇｇ［－］ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞をＡｇｇ［＋］細胞と共培養することによって生成され得る。
Ａｇｇ［＋］細胞、またはＡｇｇ［＋］細胞になることに感作された細胞（例えば、タウ播種またはタウ凝集活性に感作された）はまた、本明細書に記載されるように、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する培養されたタウ凝集陽性細胞から採取された馴化培地を使用して生成され得る。これは、本明細書の実施例に開示されている「最小播種」である。馴化培地とは、培養された細胞から採取された使用済み培地を指す。それは、培養された細胞から培地に分泌される代謝物、成長因子、および細胞外マトリックスタンパク質が含まれる。馴化培地の使用は、Ａｇｇ［＋］細胞との共培養を含まない（すなわち、ナイーブＡｇｇ［－］細胞はＡｇｇ［＋］細胞と共培養されない）。一例として、馴化培地は、コンフルエントなＡｇｇ［＋］細胞上にある培地を収集することにより生成され得る。培地は、約１２時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、または約１０日間、コンフルエントなＡｇｇ［＋］細胞上にあり得る。例えば、培地は、約１～約７、約２～約６、約３～約５、または約４日間、コンフルエントなＡｇｇ［＋］細胞上にあり得る。馴化培地は、次いで新鮮な培地と組み合わせて、ナイーブ（Ａｇｇ［－］）Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞に適用され得る。同様に、馴化培地は、次いで新鮮な培地と組み合わせて、ナイーブ（Ａｇｇ［－］）ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞に適用され得る。馴化培地と新鮮な培地との比は、例えば、約１０：１、約９：１、約８：１、約７：１、約６：１、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０であり得る。例えば、馴化培地と新鮮な培地との比率は、約５：１～約１：１、約４：１～約２：１、または約３：１であり得る。例えば、それは、約９０％の馴化培地および約１０％の新鮮な培地、約８５％の馴化培地および約１５％の新鮮な培地、約８０％の馴化培地および約２０％の新鮮な培地、約７５％の馴化培地および約２５％の新鮮な培地、約７０％の馴化培地および約３０％の新鮮な培地、約６５％の馴化培地および約３５％の新鮮な培地、約６０％の馴化培地および約４０％の新鮮な培地、約５５％の馴化培地および約４５％の新鮮な培地、約５０％の馴化培地および約５０％の新鮮な培地、約４５％の馴化培地および約５５％の新鮮な培地、約４０％の馴化培地および約６０％の新鮮な培地、約３５％の馴化培地および約６５％の新鮮な培地、約３０％の馴化培地および約７０％の新鮮な培地、約２５％の馴化培地および約７５％の新鮮な培地、約２０％の馴化培地および約８０％の新鮮な培地、約１５％の馴化培地および約８５％の新鮮な培地、または約１０％の馴化培地および約９０％の新鮮な培地で、遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含み得る。一例では、それは、少なくとも約５０％の馴化培地および約５０％以下の新鮮な培地を含む培地で、遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含み得る。特定の例では、それは、約７５％の馴化培地および約２５％の新鮮な培地で、遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含み得る。任意に、馴化培地は、リポフェクタミンなしで、またはリポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）なしで、またはリン脂質なしで、ナイーブＡｇｇ［－］細胞に適用される。任意に、遺伝子修飾された細胞集団は、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在するタウ凝集陽性細胞と共培養されない。
共培養のない馴化培地は、これまで播種剤としてこの状況で使用されたことがない。しかしながら、インビトロで生成されたタウ線維は限られた供給源であるため、馴化培地は大規模なゲノムワイドスクリーニングに特に有用である。さらに、馴化培地は、インビトロではなく細胞によって生成および分泌されるため、より生理学的に適切である。本明細書に記載されるような馴化培地の使用は、細胞をタウ凝集に感作するためのタウ播種活性のブースト（例えば、本明細書の他の場所に開示されるようにＦＲＥＴ誘導によって測定される場合、約０．１％）を提供する。
Ｃ．インビトロ培養物および馴化培地
本明細書に開示されるＣａｓ／タウバイオセンサー細胞およびそれらの細胞を培養するための培地を含むインビトロ培養物または組成物もまた、本明細書に開示される。本明細書に開示されるＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞およびそれらの細胞を培養するための培地を含むインビトロ培養物または組成物もまた、本明細書に開示される。細胞は、Ａｇｇ［－］細胞またはＡｇｇ［＋］細胞であり得る。例えば、培養物または組成物は、Ａｇｇ［－］細胞を含み得る。一例では、培地は、本明細書の他の場所に開示されているように、Ａｇｇ［＋］細胞からの馴化培地を含む。任意に、培養物または組成物中の細胞は、Ａｇｇ［－］細胞であり、Ａｇｇ［＋］細胞と共培養されていない。培地は、馴化培地および新鮮な培地の混合物を含み得る。一例として、馴化培地と新鮮な培地との比は、例えば、約１０：１、約９：１、約８：１、約７：１、約６：１、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０であり得る。例えば、馴化培地と新鮮な培地との比率は、約５：１～約１：１、約４：１～約２：１、または約３：１であり得る。例えば、それは、約９０％の馴化培地および約１０％の新鮮な培地、約８５％の馴化培地および約１５％の新鮮な培地、約８０％の馴化培地および約２０％の新鮮な培地、約７５％の馴化培地および約２５％の新鮮な培地、約７０％の馴化培地および約３０％の新鮮な培地、約６５％の馴化培地および約３５％の新鮮な培地、約６０％の馴化培地および約４０％の新鮮な培地、約５５％の馴化培地および約４５％の新鮮な培地、約５０％の馴化培地および約５０％の新鮮な培地、約４５％の馴化培地および約５５％の新鮮な培地、約４０％の馴化培地および約６０％の新鮮な培地、約３５％の馴化培地および約６５％の新鮮な培地、約３０％の馴化培地および約７０％の新鮮な培地、約２５％の馴化培地および約７５％の新鮮な培地、約２０％の馴化培地および約８０％の新鮮な培地、約１５％の馴化培地および約８５％の新鮮な培地、または約１０％の馴化培地および約９０％の新鮮な培地で、遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含み得る。一例では、それは、少なくとも約５０％の馴化培地および約５０％以下の新鮮な培地を含む培地で、遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含み得る。特定の例では、それは、約７５％の馴化培地および約２５％の新鮮な培地で、遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含み得る。任意に、培地は、リポフェクタミンまたはリポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）またはリン脂質を含む。任意に、培地は、リポフェクタミンまたはリポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）またはリン脂質を含まない。任意に、培地は、リポフェクタミンを含まない。
Ｄ．タウ凝集陽性細胞からの溶解物を含むインビトロ培養物および培地
本明細書に開示されるＣａｓ／タウバイオセンサー細胞およびそれらの細胞を培養するための培地を含むインビトロ培養物または組成物もまた、本明細書に開示される。本明細書に開示されるＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞およびそれらの細胞を培養するための培地を含むインビトロ培養物または組成物もまた、本明細書に開示される。一例では、培地は、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する培養されたタウ凝集陽性細胞からの細胞溶解物を含む。細胞は、Ａｇｇ［－］細胞またはＡｇｇ［＋］細胞であり得る。例えば、培養物または組成物は、Ａｇｇ［－］細胞を含み得る。任意に、培養物または組成物中の細胞は、Ａｇｇ［－］細胞であり、Ａｇｇ［＋］細胞と共培養されていない。培地は、新鮮な培地および細胞溶解物の混合物を含み得る。
培地中の細胞溶解物の量または濃度は、任意の好適な量または濃度であり得る。例えば、培地中の細胞溶解物の濃度は、培地（例えば、新鮮な培養培地）の約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約４．５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約４μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約３．５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約３μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約２．５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約２μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約１．５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約４．５μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約４μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約３．５μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約３μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約２．５μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約２μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約１．５μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４．５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３．５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２．５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１．５μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約４．５μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約４μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約３．５μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約３μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約２．５μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約２μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約４．５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約４μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約３．５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約３μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約２．５μｇ／ｍＬ、約２．５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約２．５μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約２．５μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約２．５μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約２．５μｇ／ｍＬ～約４．５μｇ／ｍＬ、約２．５μｇ／ｍＬ～約４μｇ／ｍＬ、約２．５μｇ／ｍＬ～約３．５μｇ／ｍＬ、または約２．５μｇ／ｍＬ～約３μｇ／ｍＬであり得る。例えば、培養培地中の細胞溶解物は、約１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬの濃度であり得るか、または約１．５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ、約２．５μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ、約３．５μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ、約４．５μｇ／ｍＬ、もしくは約５μｇ／ｍＬの濃度であり得る。任意に、細胞溶解物は、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液中にあり得る。任意に、緩衝液は、プロテアーゼ阻害剤を含み得る。プロテアーゼ阻害剤の例には、これらに限定されないが、ＡＥＢＳＦ、アプロチニン、ベスタチン、Ｅ－６４、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられる。緩衝液は、これらの阻害剤のうちのいずれかまたはそれらの任意の組み合わせを含み得る（例えば、緩衝液は、これらのプロテアーゼ阻害剤のすべてを含み得る）。
溶解物を生成するための細胞は、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液に収集され得る。任意に、緩衝液は、プロテアーゼ阻害剤を含み得る。プロテアーゼ阻害剤の例には、これらに限定されないが、ＡＥＢＳＦ、アプロチニン、ベスタチン、Ｅ－６４、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられる。緩衝液は、これらの阻害剤のうちのいずれかまたはそれらの任意の組み合わせを含み得る（例えば、緩衝液は、これらのプロテアーゼ阻害剤のすべてを含み得る）。
細胞溶解物は、例えば、タウ凝集陽性細胞（例えば、上記のように緩衝液およびプロテアーゼ阻害剤に収集された細胞）を任意の好適な時間超音波処理することによって収集され得る。例えば、細胞は、約１分～約６分、約１分～約５分、約１分～約４分、約１分～約３分、約２分～約６分、約２分～約５分、約２分～約４分、約２分～約３分、約２分～約６分、約３分～約５分、または約３分～約４分間超音波処理され得る。例えば、細胞は、約２分～約４分間、または約３分間超音波処理され得る。
任意に、培地は、リポフェクタミンまたはリポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）またはリン脂質または別のトランスフェクション剤を含む。任意に、培地は、リポフェクタミンを含む。任意に、培地は、リポフェクタミンまたはリポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）またはリン脂質または別のトランスフェクション剤を含まない。任意に、培地は、リポフェクタミンを含まない。培地中のリポフェクタミンまたはリポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）またはリン脂質または他のトランスフェクション剤の量もしくは濃度は、任意の好適な量または濃度であり得る。例えば、培地中のリポフェクタミンまたはリポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）またはリン脂質または他のトランスフェクション剤の濃度は、培地（例えば、新鮮な培地）の約０．５μＬ／ｍＬ～約１０μＬ／ｍＬ、約０．５μＬ／ｍＬ～約５μＬ／ｍＬ、約０．５μＬ／ｍＬ～約４．５μＬ／ｍＬ、約０．５μＬ／ｍＬ～約４μＬ／ｍＬ、約０．５μＬ／ｍＬ～約３．５μＬ／ｍＬ、約０．５μＬ／ｍＬ～約３μＬ／ｍＬ、約０．５μＬ／ｍＬ～約２．５μＬ／ｍＬ、約０．５μＬ／ｍＬ～約２μＬ／ｍＬ、約０．５μＬ／ｍＬ～約１．５μＬ／ｍＬ、約０．５μＬ／ｍＬ～約１μＬ／ｍＬ、約１μＬ／ｍＬ～約１０μＬ／ｍＬ、約１μＬ／ｍＬ～約５μＬ／ｍＬ、約１μＬ／ｍＬ～約４．５μＬ／ｍＬ、約１μＬ／ｍＬ～約４μＬ／ｍＬ、約１μＬ／ｍＬ～約３．５μＬ／ｍＬ、約１μＬ／ｍＬ～約３μＬ／ｍＬ、約１μＬ／ｍＬ～約２．５μＬ／ｍＬ、約１μＬ／ｍＬ～約２μＬ／ｍＬ、約１μＬ／ｍＬ～約１．５μＬ／ｍＬ、約１．５μＬ／ｍＬ～約１０μＬ／ｍＬ、約１．５μＬ／ｍＬ～約５μＬ／ｍＬ、約１．５μＬ／ｍＬ～約４．５μＬ／ｍＬ、約１．５μＬ／ｍＬ～約４μＬ／ｍＬ、約１．５μＬ／ｍＬ～約３．５μＬ／ｍＬ、約１．５μＬ／ｍＬ～約３μＬ／ｍＬ、約１．５μＬ／ｍＬ～約２．５μＬ／ｍＬ、約１．５μＬ／ｍＬ～約２μＬ／ｍＬ、約２μＬ／ｍＬ～約１０μＬ／ｍＬ、約２μＬ／ｍＬ～約５μＬ／ｍＬ、約２μＬ／ｍＬ～約４．５μＬ／ｍＬ、約２μＬ／ｍＬ～約４μＬ／ｍＬ、約２μＬ／ｍＬ～約３．５μＬ／ｍＬ、約２μＬ／ｍＬ～約３μＬ／ｍＬ、または約２μＬ／ｍＬ～約２．５μＬ／ｍＬであり得る。例えば、培地中のリポフェクタミンまたはリポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）またはリン脂質または他のトランスフェクション剤の濃度は、約１．５μＬ／ｍＬ～約４μＬ／ｍＬであり得るか、またはそれは約１．５μＬ／ｍＬ、約２μＬ／ｍＬ、約２．５μＬ／ｍＬ、約３μＬ／ｍＬ、約３．５μＬ／ｍＬ、約もしくは４μＬ／ｍＬであり得る。
ＩＩＩ．ガイドＲＮＡノックアウトライブラリ
本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲｎスクリーニング方法は、ゲノムワイドｇＲＮＡノックアウトライブラリなどのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）ノックアウトライブラリを利用する。Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼは、特定の標的配列を標的とするように設計されたｇＲＮＡを介して、特定のゲノム遺伝子座で二本鎖切断を誘導するようにプログラムされ得る。Ｃａｓタンパク質の標的化特異性は短いｇＲＮＡによって付与されるため、プールされたゲノムスケールの機能的スクリーニングが可能である。そのようなライブラリは、ｍＲＮＡを標的化することによりタンパク質発現を低減するｓｈＲＮＡライブラリなどのライブラリに比べていくつかの利点を有する。対照的に、ｇＲＮＡライブラリは、遺伝子のゲノムコード領域に導入されたフレームシフト変異を介してノックアウトを達成する。
本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲａスクリーニング方法は、ゲノムワイドｇＲＮＡ転写活性化トライブラリなどのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）転写活性化ライブラリを利用する。ＳＡＭシステムは、特定の標的配列を標的とするように設計されたｇＲＮＡを介して、特定のゲノム遺伝子座で遺伝子の転写を活性化するようにプログラムされ得る。Ｃａｓタンパク質の標的化特異性は短いｇＲＮＡによって付与されるため、プールされたゲノムスケールの機能的スクリーニングが可能である。
ライブラリのｇＲＮＡは、任意の数の遺伝子を標的とすることができる。例えば、ｇＲＮＡは、約５０以上の遺伝子、約１００以上の遺伝子、約２００以上の遺伝子、約３００以上の遺伝子、約４００以上の遺伝子、約５００以上の遺伝子、約１０００以上の遺伝子、約２０００以上の遺伝子、約３０００以上の遺伝子、約４０００以上の遺伝子、約５０００以上の遺伝子、約１００００以上の遺伝子、または約２００００以上の遺伝子を標的とすることができる。一部のライブラリでは、ｇＲＮＡは、特定のシグナル伝達経路の遺伝子を標的とするように選択され得る。一部のライブラリは、ゲノムワイドライブラリである。
ゲノムワイドライブラリには、ゲノム内の各遺伝子を標的化する１つ以上のｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）が含まれる。標的化されているゲノムは、あらゆるタイプのゲノムであり得る。例えば、ゲノムは、真核生物ゲノム、哺乳動物ゲノム、非ヒト哺乳動物ゲノム、げっ歯類ゲノム、マウスゲノム、ラットゲノム、またはヒトゲノムであり得る。一例では、標的化ゲノムは、ヒトゲノムである。
ｇＲＮＡは、各個々の標的化遺伝子内の任意の数の配列を標的とすることができる。一部のライブラリでは、複数の標的配列は、標的とされる複数の遺伝子の各々において平均して標的化される。例えば、標的化された複数の遺伝子の各々において、平均して約２～約１０、約２～約９、約２～約８、約２～約７、約２～約６、約２～約５、約２～約４、または約２～３の固有の標的配列が標的化され得る。例えば、標的化された複数の遺伝子の各々において、平均して少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、または少なくとも約６の固有の標的配列が標的化され得る。特定の例として、標的化された複数の遺伝子の各々において、平均して約６つの標的配列が標的化され得る。別の特定の例として、標的化された複数の遺伝子の各々において、平均して約３～約６または約４～約６の標的配列が標的化される。
例えば、ライブラリは、遺伝子あたり約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０のｇＲＮＡの平均カバレッジで遺伝子を標的とすることができる。特定の例では、ライブラリは、遺伝子あたり約３～４のｇＲＮＡ、または遺伝子あたり約６のｇＲＮＡの平均カバレッジで遺伝子を標的とすることができる。
ｇＲＮＡは、標的遺伝子内の任意の所望の位置を標的とすることができる。ＣＲＩＳＰＲｎ ｇＲＮＡは、対応するＣａｓタンパク質による切断が、機能喪失対立遺伝子をもたらすフレームシフト挿入／欠失（インデル）変異をもたらすように、遺伝子のコード領域を標的とするように設計され得る。より具体的には、フレームシフト変異は、標的化ＤＮＡ二本鎖切断と、それに続く非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介した変異原性修復によって達成することができ、これにより、切断部位にインデルが生成される。ＤＳＢに導入されているインデルはランダムであり、一部のインデルは遺伝子の早期終了を引き起こすフレームシフト変異をもたらす。
一部のＣＲＩＳＰＲｎライブラリでは、可能な場合、各ｇＲＮＡは構成的エクソンを標的とする。一部のＣＲＩＳＰＲｎライブラリでは、可能な場合、各ｇＲＮＡは５’構成的エクソンを標的とする。いくつかの方法では、各ｇＲＮＡは、可能な場合、第１のエクソン、第２のエクソン、または第３のエクソン（遺伝子の５’末端から）を標的とする。
一例として、ＣＲＩＳＰＲｎライブラリのｇＲＮＡは、構成的エクソンを標的とすることができる。構成的エクソンは、スプライシング後に一貫して保存されているエクソンである。すべての組織にわたって発現されるエクソンは、ｇＲＮＡ標的化の構成的エクソンと見なされ得る。ライブラリのｇＲＮＡは、各遺伝子の５’末端近くの構成的エクソンを標的とすることができる。任意に、各遺伝子の最初と最後のエクソンは、潜在的な標的として除外され得る。任意に、選択的スプライシング部位を含む任意のエクソンは、潜在的な標的として除外され得る。任意に、上記の基準を満たす最も早い２つのエクソンは、潜在的な標的として選択される。任意に、エクソン２および３は、潜在的な標的として選択される（例えば、構成的エクソンが同定されない場合）。さらに、ライブラリ内のｇＲＮＡは、オフターゲット効果を最小化するように選および設計され得る。
特定の例では、ゲノムワイドＣＲＩＳＰＲｎ ｇＲＮＡライブラリは、ヒトゲノム内の＞１８，０００の遺伝子の５’構成的エクソンを標的化するｓｇＲＮＡを含み、遺伝子あたりの平均カバレッジは約６のｓｇＲＮＡであり、各標的部位はオフターゲット修飾を最小化するように選択された。
ＣＲＩＳＰＲａ ｇＲＮＡは、遺伝子の転写開始部位に隣接する配列を標的とするように設計され得る。例えば、標的配列は、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、または１塩基対の転写開始部位内にあり得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲａライブラリの各ｇＲＮＡは、転写開始部位の２００ｂｐ上流内の配列を標的とすることができる。任意に、標的配列は、転写開始部位の上流の２００塩基対上流および転写開始部位の１塩基対下流（－２００～＋１）の領域内にある。
ゲノムワイドライブラリのｇＲＮＡは、任意の形態であり得る。例えば、ｇＲＮＡライブラリは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはアデノウイルスベクターなどのウイルスベクターにパッケージングすることができる。特定の例では、ｇＲＮＡライブラリは、レンチウイルスベクターにパッケージングされる。ベクターは、ベクターを受け取る細胞の選択を容易にするために、レポーター遺伝子または選択マーカーをさらに含み得る。そのようなレポーター遺伝子および選択マーカーの例は、本明細書の他の場所に開示されている。一例として、選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、およびブラストサイジンＳデアミナーゼなどの薬物に対する耐性を付与するものであり得る。別の例示的な選択マーカーは、Ｓｈ ｂｌｅ遺伝子（Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン遺伝子）によってコードされるブレオマイシン耐性タンパク質であり、これは、ゼオシン（フレオマイシンＤ１）耐性を付与する。例えば、細胞は、ガイドＲＮＡ構築物で形質導入された細胞のみがスクリーニングを実施するために使用するために保存されるように、薬物（例えば、ピューロマイシン）で選択され得る。
Ａ．ガイドＲＮＡ
「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）に結合し、かつＣａｓタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定の位置に標的化するＲＮＡ分子である。ガイドＲＮＡは、「ＤＮＡ標的化セグメント」および「タンパク質結合セグメント」の２つのセグメントを含み得る。「セグメント」は、ＲＮＡ中のヌクレオチドの連続したストレッチなどの、分子のセクションまたは領域を含む。Ｃａｓ９のものなど、いくつかのｇＲＮＡは、「アクチベーターＲＮＡ」（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）および「ターゲッターＲＮＡ」（例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）の２つの別個のＲＮＡ分子を含み得る。他のｇＲＮＡは、単一ＲＮＡ分子（単一ＲＮＡポリヌクレオチド）であり、これはまた「単一分子ｇＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」、または「ｓｇＲＮＡ」と称され得る。例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２、ＷＯ２０１４／０６５５９６、ＷＯ２０１４／０８９２９０、ＷＯ２０１４／０９３６２２、ＷＯ２０１４／０９９７５０、ＷＯ２０１３／１４２５７８、およびＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、Ｃａｓ９の場合、シングルガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡに融合したｃｒＲＮＡを含み得る（例えば、リンカーを介して）。例えば、Ｃｐｆ１の場合、標的配列への結合を達成するためにｃｒＲＮＡのみが必要とされる。「ガイドＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」という用語は、二重分子（すなわち、モジュラー）ｇＲＮＡおよび単一分子ｇＲＮＡの両方を含む。
例示的な２分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「ターゲッターＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡリピート」）分子および対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「アクチベーターＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含む。ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（一本鎖）と、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の半分を形成するヌクレオチドのストレッチの両方を含む。ＤＮＡ標的化セグメントの下流（３’）に位置するｃｒＲＮＡテールの例は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号２３）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。本明細書に開示されるＤＮＡ標的化セグメントのいずれも、配列番号２３の５’末端に結合して、ｃｒＲＮＡを形成することができる。
対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（アクチベーターＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の残りの半分を形成するヌクレオチドのストレッチを含む。ｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチは、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチと相補的であり、それをハイブリダイズして、ｇＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する。したがって、各ｃｒＲＮＡは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有すると言われ得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例は、ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ（配列番号２４）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。他のｔｒａｃｒＲＮＡ配列の他の例は、ＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号２８）、またはＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２９）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方が必要とされる系では、ｃｒＲＮＡおよび対応するｔｒａｃｒＲＮＡは、ハイブリダイズしてｇＲＮＡを形成する。ｃｒＲＮＡのみが必要とされる系では、ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡであり得る。ｃｒＲＮＡはさらに、標的ＤＮＡの相補鎖にハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡ標的化セグメントを提供する。細胞内での修飾に使用される場合、所与のｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、ＲＮＡ分子が使用される種に特異的になるように設計され得る。例えば、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８２３－８２６、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－８２１、Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２２７－２２９、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２３３－２３９、およびＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９－８２３を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
所与のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（ｃｒＲＮＡ）は、以下により詳細に記載されるように、標的ＤＮＡの相補鎖上の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）を介して配列特異的様式で標的ＤＮＡと相互作用する。したがって、ＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は変化してもよく、ｇＲＮＡおよび標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の位置を決定する。目的のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列にハイブリダイズするように修飾され得る。天然発生型ｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および生物によって異なるが、２１～４６ヌクレオチド長の２つのダイレクトリピート（ＤＲ）が隣接する、２１～７２ヌクレオチド長の標的化セグメントを含むことが多い（例えば、ＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの場合、ＤＲは３６ヌクレオチド長であり、標的化セグメントは３０ヌクレオチド長である。３’に位置するＤＲは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡと相補的であり、それをハイブリダイズし、それは順にＣａｓタンパク質と結合する。
ＤＮＡ標的化セグメントは、例えば、少なくとも約１２、１５、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、または４０ヌクレオチドの長さを有し得る。そのようなＤＮＡ標的化セグメントは、例えば、約１２～約１００、約１２～約８０、約１２～約５０、約１２～約４０、約１２～約３０、約１２～約２５、または約１２～約２０ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは、約１５～約２５ヌクレオチド（例えば、約１７～約２０ヌクレオチド、または約１７、１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド）であり得る。例えば、ＵＳ２０１６／００２４５２３を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９の場合、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、１６～２０ヌクレオチド長、または１７～２０ヌクレオチド長である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９の場合、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、２１～２３ヌクレオチド長である。Ｃｐｆ１の場合、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、少なくとも１６ヌクレオチド長または少なくとも１８ヌクレオチド長さである。
ＴｒａｃｒＲＮＡは、任意の形態（例えば、完全長ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性な部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、および様々な長さであり得る。それらには、一次転写物または処理された形態が含まれる。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ（シングルガイドＲＮＡの一部として、または２分子ｇＲＮＡの一部としての別個の分子として）は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５、またはそれ以上のヌクレオチド）のすべてまたは一部を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例には、１７１ヌクレオチド、８９ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、および６５ヌクレオチドのバージョンが挙げられる。例えば、Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７１：６０２－６０７、ＷＯ２０１４／０９３６６１を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内のｔｒａｃｒＲＮＡの例には、ｓｇＲＮＡの＋４８、＋５４、＋６７、および＋８５のバージョン内に見出されるｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが挙げられ、「＋ｎ」は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡの最大＋ｎヌクレオチドがｓｇＲＮＡに含まれることを示す。ＵＳ８，６９７，３５９を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間の相補性パーセントは、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であり得る。ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間の相補性パーセントは、約２０個の連続するヌクレオチドにわたって少なくとも６０％であり得る。一例として、ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補鎖の５’末端にある１４個の連続するヌクレオチドにわたって１００％であり得、残りの部分にわたって０％まで低くなり得る。そのような場合、ＤＮＡ標的化セグメントは、１４ヌクレオチド長であると見なされ得る。別の例として、ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補鎖の５’末端にある７個の連続するヌクレオチドにわたって１００％であり得、残りの部分にわたって０％まで低くなり得る。そのような場合、ＤＮＡ標的化セグメントは、７ヌクレオチド長であると見なされ得る。いくつかのガイドＲＮＡでは、ＤＮＡ標的化セグメント内の少なくとも１７ヌクレオチドは、標的ＤＮＡの相補鎖に相補的である。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは、２０ヌクレオチド長であり得、標的ＤＮＡの相補鎖との１、２、または３つのミスマッチを含み得る。一例では、ミスマッチは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に対応する相補鎖（すなわち、ＰＡＭ配列の逆相補体）の領域に隣接していない（例えば、ミスマッチは、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントの５’末端にあるか、またはミスマッチは、ＰＡＭ配列に対応する相補鎖の領域から、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、もしくは１９塩基対離れている）。
ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的であるヌクレオチドの２つのストレッチを含み得る。タンパク質結合セグメントの相補的ヌクレオチドは、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ）を形成する。目的のｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、Ｃａｓタンパク質と相互作用し、ｇＲＮＡは、結合したＣａｓタンパク質を、ＤＮＡ標的化セグメントを介して標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に配向する。
シングルガイドＲＮＡは、ＤＮＡ標的化セグメントおよび足場配列（すなわち、ガイドＲＮＡのタンパク質結合またはＣａｓ結合配列）を含み得る。例えば、そのようなガイドＲＮＡは、３’足場配列に結合された５’ＤＮＡ標的化セグメントを有することができる。例示的な足場配列は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ（バージョン１；配列番号１７）、ＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン２；配列番号１８）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン３；配列番号１９）、およびＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン４；配列番号２０）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。他の例示的な足場配列は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（バージョン５；配列番号：３０）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（バージョン６；配列番号３１）、またはＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵ（バージョン７；配列番号３２）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。本明細書に開示されるガイドＲＮＡ標的配列のうちのいずれかを標的化するガイドＲＮＡは、例えば、ガイドＲＮＡの３’末端の例示的なガイドＲＮＡ足場配列のうちのいずれかに融合したガイドＲＮＡの５’末端のＤＮＡ標的化セグメントを含み得る。すなわち、本明細書に開示されるＤＮＡ標的化セグメントのうちのいずれかは、上記の足場配列のうちのいずれか１つの５’末端に結合して、シングルガイドＲＮＡ（キメラガイドＲＮＡ）を形成することができる。
ガイドＲＮＡは、追加の望ましい特徴（例えば、修飾または調節された安定性；細胞内標的化；蛍光標識による追跡；タンパク質またはタンパク質複合体の結合部位など）を提供する修飾または配列を含み得る。そのような修飾の例には、例えば、５’キャップ（例えば、７－メチルグアニレートキャップ（ｍ７Ｇ））、３’ポリアデニル化テール（すなわち、３’ポリ（Ａ）テール）、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質および／またはタンパク質複合体による調節された安定性および／または調節されたアクセス可能性を可能にするため）、安定性制御配列、ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを細胞内の位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する修飾または配列、追跡を提供する修飾または配列（例えば、蛍光分子への直接結合、蛍光検出を容易にする部分への複合体化、蛍光検出を可能にする配列など）、タンパク質（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）の結合部位を提供する修飾または配列、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。修飾の他の例には、操作されたステムループ二重構造、操作されたバルジ領域、ステムループ二重構造の操作されたヘアピン３’、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。例えば、ＵＳ２０１５／０３７６５８６を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。バルジは、ｃｒＲＮＡ様領域と最小のｔｒａｃｒＲＮＡ様領域で構成される二重鎖内のヌクレオチドの対になっていない領域であり得る。バルジは、二重鎖の片側に、対になっていない５’－ＸＸＸＹ－３’を含むことができ、Ｘは、任意のプリンであり、Ｙは、反対側の鎖のヌクレオチドおよび二重鎖の反対側の対になっていないヌクレオチドの領域とゆらぎ対を形成し得るヌクレオチドであり得る。
いくつかの場合では、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１と対になったｄＣａｓ９－ＶＰ６４融合タンパク質を含む転写活性化系を使用することができる。そのような系のガイドＲＮＡは、二量体化ＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質に結合するように設計されたｓｇＲＮＡテトラループおよびステムループ２に付加されたアプタマー配列を使用して設計され得る。例えば、Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ ５１７（７５３６）：５８３－５８８を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
修飾されていない核酸は、分解されやすい場合がある。外因性核酸はまた、自然免疫応答を誘発し得る。修飾は、安定性を導入し、免疫原性を低減するのに役立ち得る。ガイドＲＮＡは、例えば、以下：（１）ホスホジエステル骨格結合において、非結合リン酸酸素の一方または両方および／もしくは結合リン酸酸素の１つ以上の改変または置換、（２）リボース糖の２’ヒドロキシルの改変または置換などのリボース糖の構成要素の改変または置換、（３）リン酸部分のデホスホリンカーによる置換、（４）天然発生型核酸塩基の修飾または置換、（５）リボース－リン酸骨格の置換または修飾、（６）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾（例えば、末端リン酸基の除去、修飾、もしくは置換、または部分の複合体化）、ならびに（７）糖の修飾のうちの１つ以上を含む修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドを含み得る。他の可能なガイドＲＮＡ修飾には、ウラシルまたはポリ－ウラシルトラクトの修飾または置換が含まれる。例えば、ＷＯ２０１５／０４８５７７およびＵＳ２０１６／０２３７４５５を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。同様の修飾を、ＣａｓｍＲＮＡなどのＣａｓコード核酸に行うことができる。例えば、Ｃａｓ ｍＲＮＡは、同義コドンを使用してウリジンを枯渇させることによって修飾され得る。
一例として、ガイドＲＮＡの５’または３’末端のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を含み得る（例えば、塩基は、ホスホロチオエート基である修飾リン酸基を有し得る）。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’または３’末端の２、３、または４つの末端ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含み得る。別の例として、ガイドＲＮＡの５’および／または３’末端のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を有し得る。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’および／または３’末端（例えば、５’末端）の２、３、または４つの末端ヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾を含み得る。例えば、ＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１およびＦｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２２：１－９を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。他の可能な修飾は、本明細書の他の場所でより詳細に説明されている。特定の例では、ガイドＲＮＡには、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡ残基に２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間結合が含まれる。そのような化学修飾は、例えば、エキソヌクレアーゼからガイドＲＮＡへのより優れた安定性および保護を提供し、それらが修飾されていないガイドＲＮＡよりも長く細胞内に持続することを可能にする。そのような化学修飾はまた、例えば、ＲＮＡを積極的に分解し得るかまたは細胞死につながる免疫カスケードを引き起こし得る自然細胞内免疫応答から保護することもできる。
いくつかのガイドＲＮＡ（例えば、シングルガイドＲＮＡ）では、ガイドＲＮＡの少なくとも１つのループ（例えば、２つのループ）は、１つ以上のアダプター（すなわち、アダプタータンパク質またはドメイン）に結合する別個のＲＮＡ配列の挿入によって修飾される。そのようなアダプタータンパク質は、転写活性化ドメインなどの１つ以上の異種機能ドメインをさらに動員するために使用され得る（例えば、ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞でのＣＲＩＳＰＲａスクリーニングで使用するため）。そのようなアダプタータンパク質（すなわち、キメラアダプタータンパク質）を含む融合タンパク質の例は、本明細書の他の場所に開示されている。例えば、ＭＳ２結合ループｇｇｃｃＡＡＣＡＵＧＡＧＧＡＵＣＡＣＣＣＡＵＧＵＣＵＧＣＡＧｇｇｃｃ（配列番号３３）は、ＷＯ２０１６／０４９２５８およびＫｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ ５１７（７５３６）：５８３－５８８に記載されているＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系について、配列番号１７もしくは配列番号１９（または配列番号３０もしくは３１）またはｓｇＲＮＡ骨格に示されるｓｇＲＮＡ足場（骨格）のヌクレオチド＋１３～＋１６およびヌクレオチド＋５３～＋５６を置き換えることができ、参考文献の各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＵＳ２０１９－０２８４５７２およびＷＯ２０１９／１８３１２３もまた参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で使用されるガイドＲＮＡの番号付けは、ガイドＲＮＡ足場配列（すなわち、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントの下流の配列）におけるヌクレオチドの番号付けを指す。例えば、ガイドＲＮＡ足場の最初のヌクレオチドは＋１であり、足場の２番目のヌクレオチドは＋２というようになる。配列番号１７もしくは配列番号１９（または配列番号３０もしくは３１）のヌクレオチド＋１３～＋１６に対応する残基は、本明細書ではテトラループと称される領域である、配列番号１７もしくは配列番号１９（または配列番号３０もしくは３１）のヌクレオチド＋９～＋２１にまたがる領域のループ配列である。配列番号１７もしくは配列番号１９（または配列番号３０もしくは３１）のヌクレオチド＋５３～＋５６に対応する残基は、本明細書ではステムループ２と称される領域である、配列番号１７もしくは配列番号１９（または配列番号３０もしくは３１）のヌクレオチド＋４８～＋６１にまたがる領域のループ配列である。配列番号１７もしくは配列番号１９（または配列番号３０もしくは３１）にある他のステムループ配列は、ステムループ１（ヌクレオチド＋３３～＋４１）およびステムループ３（ヌクレオチド＋６３～＋７５）を含む。得られる構造は、テトラループおよびステムループ２配列の各々がＭＳ２結合ループにより置き換えられているｓｇＲＮＡ足場である。テトラループおよびステムループ２は、ＭＳ２結合ループを追加することがいかなるＣａｓ９残基にも干渉すべきでないように、Ｃａｓ９タンパク質から突出する。さらに、テトラループおよびステムループ２部位のＤＮＡへの近接は、これらの位置への局在化により、ＤＮＡと転写活性化因子などの任意の動員されたタンパク質との間に高度な相互作用がもたらされ得るあることを示す。したがって、いくつかのｓｇＲＮＡでは、配列番号１７もしくは配列番号１９（または配列番号３０もしくは３１）に示されるガイドＲＮＡ足場の＋１３～＋１６に対応するヌクレオチドおよび／もしくは＋５３～＋５６に対応するヌクレオチド、またはこれらの足場／骨格のいずれかと最適にアラインされた場合の対応する残基は、１つ以上のアダプタータンパク質またはドメインに結合することができる別個のＲＮＡ配列によって置き換えられる。代替的または追加的に、アダプター結合配列は、ガイドＲＮＡの５’末端または３’末端に付加され得る。テトラループおよびステムループ２領域にＭＳ２結合ループを含む例示的なガイドＲＮＡ足場は、配列番号３４に示される配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。テトラループおよびステムループ２領域にＭＳ２結合ループを含む例示的な一般的なシングルガイドＲＮＡは、配列番号３５に示される配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
ガイドＲＮＡは、任意の形態で提供され得る。例えば、ｇＲＮＡは、２つの分子（別個のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）または１つの分子（ｓｇＲＮＡ）のいずれかとしてＲＮＡの形態で、および任意にＣａｓタンパク質との複合体の形態で提供され得る。ｇＲＮＡはまた、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で提供され得る。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、単一のＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）または別個のＲＮＡ分子（例えば、別個のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードすることができる。後者の場合、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、１つのＤＮＡ分子として、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをそれぞれコードする別個のＤＮＡ分子として提供され得る。
ｇＲＮＡがＤＮＡの形態で提供される場合、ｇＲＮＡは、一時的、条件付き、または構成的に細胞内で発現され得る。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、細胞のゲノムにおいて安定して組み込まれ、細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結され得る。あるいは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、発現構築物中のプロモーターに作動可能に連結され得る。例えば、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸などの異種核酸を含むベクター内にあり得る。あるいは、それは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含むベクターとは別個のベクターまたはプラスミドであり得る。そのような発現構築物において使用され得るプロモーターには、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発達的に制限された前駆細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚のうちの１つ以上において活性なプロモーターが含まれる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであり得る。そのようなプロモーターはまた、例えば、双方向プロモーターであり得る。好適なプロモーターの特定の例には、ヒトＵ６プロモーター、ラットＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、またはマウスＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを挙げられる。
あるいは、ｇＲＮＡは、他の様々な方法で調製され得る。例えば、ｇＲＮＡは、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写によって調製され得る（例えば、ＷＯ２０１４／０８９２９０およびＷＯ２０１４／０６５５９６を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ガイドＲＮＡはまた、化学的合成によって調製された合成的に生成された分子であり得る。例えば、ガイドＲＮＡは、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡ残基に２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むように化学的に合成され得る。
ガイドＲＮＡ（またはガイドＲＮＡをコードする核酸）は、１つ以上のガイドＲＮＡ（例えば、１、２、３、４、またはそれ以上のガイドＲＮＡ）およびガイドＲＮＡの安定性を増加させる（例えば、所与の貯蔵条件下（例えば、－２０℃、４℃、または周囲温度）で、分解生成物が、出発核酸またはタンパク質の０．５重量％を下回るままであるような、閾値を下回る期間を延長するか、またはインビボで安定性を増加させる）担体を含む組成物中にあり得る。そのような担体の非限定的な例には、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）ミクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－コグリコール－酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コキレート（ｃｏｃｈｌｅａｔｅｓ）、および脂質微小管が挙げられる。そのような組成物は、Ｃａｓ９タンパク質などのＣａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードする核酸をさらに含み得る。
Ｂ．ガイドＲＮＡ標的配列
ガイドＲＮＡの標的ＤＮＡには、結合に十分な条件が存在する場合に、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントが結合するＤＮＡに存在する核酸配列が含まれる。好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件には、細胞に通常存在する生理学的条件が含まれる。他の好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）は、当該技術分野で知られている（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ｇＲＮＡに相補的であり、かつそれとハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖は、「相補的鎖」と呼ばれることができ、「相補的鎖」に相補的である（したがって、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡに相補的ではない）標的ＤＮＡの鎖は、「非相補鎖」または「テンプレート鎖」と呼ばれることができる。
標的ＤＮＡは、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補鎖上の配列と非相補鎖上の対応する配列（例えば、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する）の両方を含む。本明細書で使用される「ガイドＲＮＡ標的配列」という用語は、具体的には、特に、ガイドＲＮＡが相補鎖上でハイブリダイズする配列に対応する（すなわち、その逆相補体）非相補鎖上の配列を指す。すなわち、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＰＡＭに隣接する非相補鎖上の配列を指す（例えば、Ｃａｓ９の場合、ＰＡＭの上流または５’）。ガイドＲＮＡ標的配列は、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと同等であるが、ウラシルの代わりにチミンを含む。一例として、ＳｐＣａｓ９酵素のガイドＲＮＡ標的配列は、非相補鎖上の５’－ＮＧＧ－３’ ＰＡＭの上流の配列を指し得る。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡの相補鎖に対して相補性を有するように設計されており、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間のハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも必要ではない。ガイドＲＮＡが本明細書でガイドＲＮＡ標的配列を標的とするものとして言及される場合、それは、ガイドＲＮＡが、非相補鎖上のガイドＲＮＡ標的配列の逆相補体である標的ＤＮＡの相補鎖配列にハイブリダイズすることを意味する。
標的ＤＮＡまたはガイドＲＮＡ標的配列は、任意のポリヌクレオチドを含むことができ、例えば、細胞の核もしくは細胞質内、またはミトコンドリアもしくは葉緑体などの細胞の細胞小器官内に位置し得る。標的ＤＮＡまたはガイドＲＮＡ標的配列は、細胞に対して内因性または外因性の任意の核酸配列であり得る。ガイドＲＮＡ標的配列は、遺伝子生成物（例えば、タンパク質）をコードする配列もしくは非コード配列（例えば、調節配列）であり得るか、または両方を含み得る。
ＣＲＩＳＰＲａおよびＳＡＭ系システムの場合、標的配列が遺伝子の転写開始部位に隣接していることが好ましい場合がある。例えば、標的配列は、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、または１塩基対の転写開始部位内にあり得る。任意に、標的配列は、転写開始部位の上流の２００塩基対上流および転写開始部位の１塩基対下流（－２００～＋１）の領域内にある。
Ｃａｓタンパク質による標的ＤＮＡの部位特異的結合および切断は、（ｉ）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡの相補鎖との間の塩基対合相補性、および（ｉｉ）標的ＤＮＡの非相補鎖にある、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短いモチーフの両方によって決定される位置で起こり得る。ＰＡＭは、ガイドＲＮＡ標的配列に隣接し得る。任意に、ガイドＲＮＡ標的配列は、３’末端でＰＡＭが隣接し得る（例えば、Ｃａｓ９の場合）。あるいは、ガイドＲＮＡ標的配列は、５’末端でＰＡＭが隣接し得る（例えば、Ｃｐｆ１の場合）。例えば、Ｃａｓタンパク質の切断部位は、ＰＡＭ配列の上流または下流（例えば、ガイドＲＮＡ標的配列内）の約１～約１０または約２～約５塩基対（例えば、３塩基対）であり得る。ＳｐＣａｓ９の場合、ＰＡＭ配列（すなわち、非相補鎖上）は、５’－Ｎ１ＧＧ－３’であり得、Ｎ１は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、ＰＡＭは、標的ＤＮＡの非相補鎖上のガイドＲＮＡ標的配列の３’のすぐ近くである。したがって、相補鎖上のＰＡＭに対応する（すなわち、逆相補体）配列は、５’－ＣＣＮ２－３’であり、Ｎ２は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが標的ＤＮＡの相補鎖にハイブリダイズする配列の５’のすぐ近くである。いくつかのそのような場合、Ｎ１及びＮ２は、相補的であることができ、Ｎ１～Ｎ２塩基対は、任意の塩基対であり得る（例えば、Ｎ１＝ＣおよびＮ２＝Ｇ、Ｎ１＝ＧおよびＮ２＝Ｃ、Ｎ１＝ＡおよびＮ２＝Ｔ、またはＮ１＝ＴおよびＮ２＝Ａ）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９の場合、ＰＡＭは、ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲであり得、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴであり得、Ｒは、ＧまたはＡであり得る。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来のＣａｓ９の場合、ＰＡＭは、例えば、ＮＮＮＮＡＣＡＣまたはＮＮＮＮＲＹＡＣであり得、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴであり得、Ｒは、ＧまたはＡであり得る。いくつかの場合（例えば、ＦｎＣｐｆ１の場合）、ＰＡＭ配列は、５’の上流にあり、配列５’－ＴＴＮ－３’を有し得る。
ガイドＲＮＡ標的配列の例は、ＳｐＣａｓ９タンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前の２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列とＰＡＭの２つの例は、ＧＮ１９ＮＧＧ（配列番号２５）またはＮ２０ＮＧＧ（配列番号２６）である。例えば、ＷＯ２０１４／１６５８２５を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。５’末端のグアニンは、細胞内のＲＮＡポリメラーゼによる転写を促進することができる。ガイドＲＮＡ標的配列およびＰＡＭの他の例は、インビトロでのＴ７ポリメラーゼによる効率的な転写を促進するために、５’末端の２つのグアニンヌクレオチド（例えば、ＧＧＮ２０ＮＧＧ；配列番号２７）が挙げられ得る。例えば、ＷＯ２０１４／０６５５９６を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。他のガイドＲＮＡ標的配列およびＰＡＭは、５’ＧまたはＧＧおよび３’ＧＧまたはＮＧＧを含む、配列番号２５～２７の４～２２ヌクレオチド長を有し得る。さらに他のガイドＲＮＡ標的配列およびＰＡＭは、配列番号２５～２７の１４～２０ヌクレオチド長を有し得る。
標的ＤＮＡにハイブリダイズしたＣＲＩＳＰＲ複合体の形成は、ガイドＲＮＡ標的配列（すなわち、標的ＤＮＡの非相補鎖上のガイドＲＮＡ標的配列およびガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補鎖上の逆相補体）に対応する領域内または領域の近くの標的ＤＮＡの一方または両方の鎖の切断をもたらし得る。例えば、切断部位は、ガイドＲＮＡ標的配列内にあり得る（例えば、ＰＡＭ配列に対して定義された位置に）。「切断部位」は、Ｃａｓタンパク質が一本鎖切断または二本鎖切断を生成する標的ＤＮＡの位置を含む。切断部位は、一本鎖のみ（例えば、ニッカーゼが使用される場合）または二本鎖ＤＮＡの両方の鎖上にあり得る。切断部位は、両方の鎖上の同じ位置にあり得るか（平滑末端を生成する；例えば、Ｃａｓ９）、または各鎖上の異なる部位にあり得る（千鳥状の末端を生成する（すなわち、オーバーハング）；例えば、Ｃｐｆ１）。千鳥状の末端は、例えば、各々が異なる鎖上の異なる切断部位で一本鎖切断を生成し、それによって二本鎖切断を生成する２つのＣａｓタンパク質を使用することによって生成され得る。例えば、第１のニッカーゼは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の第１の鎖上に一本鎖切断を作成することができ、第２のニッカーゼは、オーバーハング配列が作成されるようにｄｓＤＮＡの第２の鎖上に一本鎖切断を作成することができる。いくつかの場合では、第１の鎖のニッカーゼのガイドＲＮＡ標的配列または切断部位は、第２の鎖のニッカーゼのガイドＲＮＡ標的配列または切断部位から少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、または１，０００塩基対分離されている。
ＩＶ．タウの播種または凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングする方法
本明細書に開示されるＣａｓ／タウバイオセンサー細胞株は、タウの播種または凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングする方法で使用され得る。そのような方法は、本明細書の他の場所に開示されるようなＣａｓ／タウバイオセンサー細胞の集団を提供すること、複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを導入すること、および標的細胞におけるタウの播種または凝集を評価することを含み得る。
一例として、方法は、Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞の集団（例えば、Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインを含む細胞集団）を提供することと、複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを細胞集団に導入することと、ゲノム編集および拡大を可能にするために細胞集団を培養することとを含み得る。複数の固有のガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質は、複数の遺伝子を切断して遺伝子機能のノックアウトをもたらし、遺伝子修飾された細胞集団を生成する。次いで、遺伝子修飾された細胞集団を、タウ播種剤と接触させて、播種された細胞集団を生成することができる。播種された細胞集団は、タウ凝集体の形成を可能にするために培養することができ、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインの凝集体は、播種された細胞集団のサブセットに形成されて、凝集陽性細胞集団を生成する。最後に、複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量は、ガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養されている細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団において決定することができる。ガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養されている細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊は、タウ凝集を増強するか、またはタウ凝集の候補遺伝的修飾因子であり（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊は、タウ凝集を増強すると予期される。
同様に、本明細書に開示されるＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞株は、タウの播種または凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングする方法で使用され得る。そのような方法は、本明細書の他の場所に開示されるようなＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞の集団を提供すること、複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを導入すること、および標的細胞におけるタウの播種または凝集を評価することを含み得る。
一例として、方法は、ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞の集団（例えば、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラＣａｓタンパク質と、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質と、第１のレポーター連結された第１のタウリピートドメインと、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインと、を含む細胞集団）を提供することと、複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを細胞集団に導入することと、転写活性化および拡大を可能にするために細胞集団を培養することとを含み得る。複数の固有のガイドＲＮＡは、キメラＣａｓタンパク質およびキメラアダプタータンパク質と複合体を形成し、複合体は、複数の遺伝子の転写を活性化して遺伝子発現および修飾された細胞集団の増加をもたらす。次いで、修飾された細胞集団を、タウ播種剤と接触させて、播種された細胞集団を生成することができる。播種された細胞集団は、タウ凝集体の形成を可能にするために培養することができ、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインの凝集体は、播種された細胞集団のサブセットに形成されて、凝集陽性細胞集団を生成する。最後に、複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量は、ガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養されている細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団において決定することができる。ガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養されている細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウ凝集を増強するか、またはタウ凝集の候補遺伝的修飾因子であり（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウ凝集を増強すると予期される。
この方法で使用されるＣａｓ／タウバイオセンサー細胞は、本明細書の他の場所に開示されているＣａｓ／タウバイオセンサー細胞のうちのいずれかであり得る。同様に、この方法で使用されるＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞は、本明細書の他の場所に開示されているＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞のうちのいずれかであり得る。第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインは、異なり得るか、または類似もしくは同じであり得る。タウリピートドメインは、本明細書の他の場所に開示されているタウリピートドメインのうちのいずれかであり得る。例えば、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、野生型タウリピートドメインであり得るか、またはタウＰ３０１Ｓ変異などの凝集促進変異（例えば、病原性、凝集促進変異）を含み得る。第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、タウ４リピートドメインを含み得る。１つの特定の例として、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、配列番号１１または配列番号１１と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。１つの特定の例では、タウリピートドメインをコードする核酸は、配列番号１２または配列番号１２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得、任意に、核酸は、配列番号１１を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。
任意の手段によって、第１のタウリピートドメインは、第１のレポーターに連結され得、第２のタウリピートドメインは、第２のレポーターに連結され得る。例えば、レポーターは、タウリピートドメインに融合され得る（例えば、融合タンパク質の一部として）。レポータータンパク質は、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインが、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインと凝集したときに検出可能なシグナルを生成するレポータータンパク質の任意の対であり得る。一例として、第１および第２のレポーターは、スプリットルシフェラーゼタンパク質であり得る。別の例として、第１および第２のレポータータンパク質は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対であり得る。ＦＲＥＴは、励起状態のドナーフルオロフォアがその励起エネルギーを隣接するアクセプターフルオロフォアに非放射的に伝達し、それによってアクセプターにその特徴的な蛍光を発させる物理的現象である。ＦＲＥＴ対（ドナーおよびアクセプターフルオロフォア）の例は周知である。例えば、Ｂａｊａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｅｎｓｏｒｓ（Ｂａｓｅｌ）１６（９）：１４８８を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＦＲＥＴ対の１つの特定の例として、第１のレポーターは、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）であり得、第２のレポーターは、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）であり得る。特定の例として、ＣＦＰは、配列番号１３または配列番号１３と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。別の特定の例として、ＹＦＰは、配列番号１５または配列番号１５と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞の場合、Ｃａｓタンパク質は、本明細書の他の場所に開示されている任意のＣａｓタンパク質であり得る。一例として、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であり得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質であり得る。１つの特定の例として、Ｃａｓタンパク質は、配列番号２１または配列番号２１と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインのうちの１つ以上またはすべては、細胞集団において安定して発現され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインのうちの１つ以上またはすべてをコードする核酸は、細胞集団においてゲノム的に組み込まれ得る。１つの特定の例では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、配列番号２２または配列番号２２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得、任意に、核酸は、配列番号２１を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。
ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞の場合、Ｃａｓタンパク質は、本明細書の他の場所に開示されている任意のＣａｓタンパク質であり得る。一例として、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であり得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質であり得る。１つの特定の例として、キメラＣａｓタンパク質は、ＶＰ６４転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含み得る。例えば、キメラＣａｓタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、核局在化シグナル、およびＶＰ６４転写活性化因子ドメインを含み得る。１つの特定の例として、アダプタータンパク質は、ＭＳ２コートタンパク質であり得、キメラアダプタータンパク質中の１つ以上の転写活性化ドメインは、ｐ６５転写活性化ドメインおよびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み得る。例えば、キメラアダプタータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＭＳ２コートタンパク質、核局在化シグナル、ｐ６５転写活性化ドメイン、およびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み得る。１つの特定の例では、キメラＣａｓタンパク質をコードする核酸は、配列番号３８または配列番号３８と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得、任意に、核酸は、配列番号３６を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。１つの特定の例では、キメラアダプタータンパク質をコードする核酸は、配列番号３９または配列番号３９と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得、任意に、核酸は、配列番号３７を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。
キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインのうちの１つ以上またはすべては、細胞集団において安定して発現され得る。例えば、キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインのうちの１つ以上またはすべてをコードする核酸は、細胞集団においてゲノム的に組み込まれ得る。
本明細書の他の場所に開示されているように、細胞は、任意の細胞型であり得る。例えば、細胞は、真核細胞、哺乳動物細胞、またはヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞または神経細胞）であり得る。
複数の固有のガイドＲＮＡは、任意の既知の手段によって細胞集団に導入され得る。いくつかの方法では、ガイドＲＮＡは、レトロウイルス、アデノウイルス、またはレンチウイルス形質導入などのウイルス形質導入によって細胞集団に導入される。特定の例では、ガイドＲＮＡは、レンチウイルス形質導入によって導入され得る。複数の固有のガイドＲＮＡの各々は、別個のウイルスベクター内にあり得る。細胞集団は、任意の感染多重度で感染し得る。例えば、感染の多重度は、約０．１～約１．０、約０．１～約０．９、約０．１～約０．８、約０．１～約０．７、約０．１～約０．６、約０．１～約０．５、約０．１～約０．４、または約０．１～約０．３であり得る。あるいは、感染の多重度は、約１．０未満、約０．９未満、約０．８未満、約０．７未満、約０．６未満、約０．５未満、約０．４未満、約０．３未満、または約０．２未満であり得る。特定の例では、感染の多重度は、約０．３未満であり得る。
ガイドＲＮＡは、選択マーカーまたはレポーター遺伝子と一緒に細胞集団に導入されて、ガイドＲＮＡを有する細胞を選択することができ、方法は、選択マーカーまたはレポーター遺伝子を含む細胞を選択することをさらに含み得る。選択マーカーおよびレポーター遺伝子の例は、本明細書の他の場所に提供されている。一例として、選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、およびブラストサイジンＳデアミナーゼなどの薬物に対する耐性を付与するものであり得る。別の例示的な選択マーカーは、Ｓｈ ｂｌｅ遺伝子（Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン遺伝子）によってコードされるブレオマイシン耐性タンパク質であり、これは、ゼオシン（フレオマイシンＤ１）耐性を付与する。例えば、細胞は、ガイドＲＮＡ構築物で形質導入された細胞のみがスクリーニングを実施するために使用するために保存されるように、薬物（例えば、ピューロマイシン）で選択され得る。例えば、薬物は、ピューロマイシンまたはゼオシン（フレオマイシンＤ１）であり得る。
いくつかの方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、細胞の大部分が固有のガイドＲＮＡのうちの１つのみを受け取るように選択された濃度で導入される。例えば、ガイドＲＮＡがウイルス形質導入によって導入されている場合、細胞は、低い感染多重度で感染し、ほとんどの細胞が高い確率で１つのウイルス構築物のみを受け取ることを確実にすることができる。１つの特定の例として、感染の多重度は、約０．３未満であり得る。
複数の固有のガイドＲＮＡが導入される細胞集団は、任意の好適な数の細胞であり得る。例えば、細胞集団は、固有のガイドＲＮＡあたり約５０を超える、約１００を超える、約２００を超える、約３００を超える、約４００を超える、約５００を超える、約６００を超える、約７００を超える、約８００を超える、約９００を超える、または約１０００を超える細胞を含み得る。特定の例では、細胞集団は、固有のガイドＲＮＡあたり約３００個を超える細胞または約５００個を超える細胞を含む。
複数の固有のガイドＲＮＡは、任意の数の遺伝子を標的とすることができる。例えば、複数の固有のガイドＲＮＡは、約５０以上の遺伝子、約１００以上の遺伝子、約２００以上の遺伝子、約３００以上の遺伝子、約４００以上の遺伝子、約５００以上の遺伝子、約１０００以上の遺伝子、約２０００以上の遺伝子、約３０００以上の遺伝子、約４０００以上の遺伝子、約５０００以上の遺伝子、約１００００以上の遺伝子、または約２００００以上の遺伝子を標的とすることができる。いくつかの方法では、ガイドＲＮＡは、特定のシグナル伝達経路の遺伝子を標的とするように選択され得る。いくつかの方法では、固有のガイドＲＮＡのライブラリは、ゲノムワイドライブラリである。
複数の固有のガイドＲＮＡは、各個々の標的化遺伝子内の任意の数の配列を標的とすることができる。いくつかの方法では、複数の標的配列は、標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される。例えば、標的化された複数の遺伝子の各々において、平均して約２～約１０、約２～約９、約２～約８、約２～約７、約２～約６、約２～約５、約２～約４、または約２～３の固有の標的配列が標的化され得る。例えば、標的化された複数の遺伝子の各々において、平均して少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、または少なくとも約６の固有の標的配列が標的化され得る。特定の例として、標的化された複数の遺伝子の各々において、平均して約６つの標的配列が標的化され得る。別の特定の例として、標的化された複数の遺伝子の各々において、平均して約３～約６または約４～約６の標的配列が標的化される。
ガイドＲＮＡは、標的遺伝子内の任意の所望の位置を標的とすることができる。Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞を使用するいくつかのＣＲＩＳＰＲｎ方法では、可能な場合、各ガイドＲＮＡは、構成的エクソンを標的とする。いくつかの方法では、可能な場合、各ガイドＲＮＡは、５’構成的エクソンを標的とする。いくつかの方法では、各ガイドＲＮＡは、可能な場合、第１のエクソン、第２のエクソン、または第３のエクソン（遺伝子の５’末端から）を標的とする。ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞を使用するいくつかのＣＲＩＳＰＲａ方法では、可能な場合、各ガイドＲＮＡは、転写開始部位の２００ｂｐ上流内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とすることができる。ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞を使用するいくつかのＣＲＩＳＰＲａ方法では、各ガイドＲＮＡは、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つ以上のアダプター結合エレメントを含み得る。一例では、各ガイドＲＮＡは、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる２つのアダプター結合エレメントを含み、任意に、第１のアダプター結合エレメントは、１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第１のループ内にあり、第２のアダプター結合エレメントは、１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第２のループ内にある。例えば、アダプター結合エレメントは、配列番号３３に示される配列を含み得る。特定の例では、１つ以上のガイドＲＮＡの各々は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）部分に融合したＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）部分を含む単一のガイドＲＮＡであり、第１のループは、配列番号１７、１９、３０、または３１の残基１３～１６に対応するテトラループであり、第２のループは、配列番号１７、１９、３０、または３１の残基５３～５６に対応するステムループ２である。
ゲノム編集および拡大を可能にするために細胞集団を培養するステップは、任意の好適な期間であり得る。例えば、培養は、約２日～約１０日、約３日～約９日、約４日～約８日、約５日～約７日、または約６日間であり得る。同様に、転写活性化および拡大を可能にするために細胞集団を培養するステップは、任意の好適な期間であり得る。例えば、培養は、約２日～約１０日、約３日～約９日、約４日～約８日、約５日～約７日、または約６日間であり得る。
任意の好適なタウ播種剤を使用して、播種された細胞集団を生成することができる。好適なタウ播種剤は、本明細書の他の場所に開示されている。いくつかの好適な播種剤は、例えば、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインとは異なるか、または類似しているか、または同じであり得るタウリピートドメインを含む。一例では、播種するステップは、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する培養されたタウ凝集陽性細胞から採取された馴化培地の存在下で、遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含む。例えば、馴化培地は、約１～約７日、約２～約６日、約３～約５日、または約４日間、コンフルエントな細胞上に置かれた後、コンフルエントなタウ凝集陽性細胞から採取され得る。播種工するステップは、任意の好適な比率の馴化培地および新鮮培地で、遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含み得る。例えば、それは、約９０％の馴化培地および約１０％の新鮮な培地、約８５％の馴化培地および約１５％の新鮮な培地、約８０％の馴化培地および約２０％の新鮮な培地、約７５％の馴化培地および約２５％の新鮮な培地、約７０％の馴化培地および約３０％の新鮮な培地、約６５％の馴化培地および約３５％の新鮮な培地、約６０％の馴化培地および約４０％の新鮮な培地、約５５％の馴化培地および約４５％の新鮮な培地、約５０％の馴化培地および約５０％の新鮮な培地、約４５％の馴化培地および約５５％の新鮮な培地、約４０％の馴化培地および約６０％の新鮮な培地、約３５％の馴化培地および約６５％の新鮮な培地、約３０％の馴化培地および約７０％の新鮮な培地、約２５％の馴化培地および約７５％の新鮮な培地、約２０％の馴化培地および約８０％の新鮮な培地、約１５％の馴化培地および約８５％の新鮮な培地、または約１０％の馴化培地および約９０％の新鮮な培地で、遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含み得る。一例では、それは、少なくとも約５０％の馴化培地および約５０％以下の新鮮な培地を含む培地で、遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含み得る。特定の例では、それは、約７５％の馴化培地および約２５％の新鮮な培地で、遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含み得る。任意に、遺伝子修飾された細胞集団は、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在するタウ凝集陽性細胞と共培養されない。
タウ凝集体の形成を可能にするために播種された細胞集団を培養するステップは、任意の好適な期間であることができ、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインの凝集体は、播種された細胞集団のサブセットに形成されて、凝集陽性細胞集団を生成する。例えば、培養は、約１日～約７日、約２日～約６日、約３日～約５日、または約４日間であり得る。凝集は、使用するレポーターに応じて、任意の好適な手段により決定され得る。例えば、第１のレポーターおよび第２のレポーターが蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対である方法では、凝集陽性細胞集団は、フローサイトメトリーにより同定され得る。
ガイドＲＮＡの存在量は、任意の好適な手段により決定され得る。特定の例では、存在量は、次世代シーケンシングによって決定される。次世代シーケンシングとは、サンガー法に基づかないハイスループットＤＮＡシーケンシング技術を指す。例えば、ガイドＲＮＡの存在量を決定することは、ガイドＲＮＡの読み取りカウントを測定することを含み得る。
いくつかの方法では、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対するガイドＲＮＡの存在量が、ガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養されている細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団において少なくとも約１．５倍高い場合、ガイドＲＮＡは、濃縮されているとみなされる。様々な濃縮閾値もまた使用することができる。例えば、濃縮閾値は、よりストリンジェントになるようにより高く設定することができる（例えば、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、または少なくとも約２．５倍）。あるいは、濃縮閾値は、よりストリンジェントにならないようにより低く設定することができる（例えば、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．３倍、または少なくとも約１．２倍）。
一例では、存在量を決定するステップは、培養中の第１の時点および／または培養中の第２の時点で、ガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養された細胞集団に対して、凝集陽性集団において複数の固有のガイドＲＮＡの存在量を決定することを含み得る。例えば、第１の時点は、細胞集団を培養する第１の継代であり得、第２の時点は、ゲノム編集および拡大を可能にするために、細胞集団の培養の途中であり得る。例えば、第１の時点は、ガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体を形成するのに十分な時間の後、およびＣａｓタンパク質が複数の遺伝子を切断して遺伝子機能のノックアウトをもたらすか（ＣＲＩＳＰＲｎ）または複数の遺伝子を転写活性化する（ＣＲＩＳＰＲａ）のに十分な時間の後であり得る。しかしながら、第１の時点は、理想的には、感染直後（すなわち、さらなる拡大およびゲノム編集の前）にｇＲＮＡライブラリ表現を決定するため、ならびに各ｇＲＮＡ表現が第１の時点から第２の時点および最終時点までのさらなる時点までに進化するかどうかを決定するために最初の細胞継代であるべきである。これにより、ｇＲＮＡの存在量が第１の時点と第２の時点との間で変化しないことを確認することにより、スクリーニングの過程で細胞増殖の利点により濃縮されたｇＲＮＡ／標的を除外することが可能である。特定の例として、第１の時点は、培養および拡大の約１日、約２日、約３日、または約４日後であり得、第２の時点は、培養および拡大の約３日、約４日、約４日、約５日、または約６日後であり得る。例えば、第１の時点は、培養および拡大の約３日後であり得、第２の時点は、培養および拡張の約６日後であり得る。いくつかの方法では、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、第１の時点および第２の時点の両方で、ガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養された細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い（または異なる選択された濃縮閾値より高い）場合、遺伝子は、次いで、タウ凝集の遺伝的修飾因子とみなされ得、遺伝子の破壊（ＣＲＩＳＰＲｎ）または転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）は、タウ凝集を増強する（または増強すると予期される）。代替的または追加的に、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とする少なくとも２つの固有のガイドＲＮＡの存在量が、第１の時点または第２の時点のいずれかで、ガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養された細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い（または異なる選択された濃縮閾値より高い）場合、遺伝子は、タウ凝集の遺伝的修飾因子とみなされ得、遺伝子の破壊（ＣＲＩＳＰＲｎ）または転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）は、タウ凝集を増強する（または増強すると予期される）。
いくつかのＣＲＩＳＰＲｎ方法では、タウ凝集の遺伝的修飾因子として遺伝子を同定するために以下のステップが施され、遺伝子の破壊（ＣＲＩＳＰＲｎ）または転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）は、タウ凝集を増強する（または増強すると予期される）。同様に、いくつかのＣＲＩＳＰＲａ方法では、タウ凝集の遺伝的修飾因子として遺伝子を同定するために以下のステップが施され、遺伝子の転写活性化は、タウ凝集を増強する。第１のステップは、凝集陽性細胞集団に、複数の固有のガイドＲＮＡのうちのどれが存在するかを同定することを含む。第２のステップは、式ｎＣｎ’＊（ｘ－ｎ’）Ｃ（ｍ－ｎ）／ｘＣｍを使用して、同定されたガイドＲＮＡが存在するランダム確率を計算することを含み、ｘは、細胞集団に導入された様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｍは、ステップ（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｎは、遺伝子を標的とする細胞集団に導入された様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｎ’は、遺伝子を標的とするステップ（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡである。第３のステップは、ステップ（１）で同定されたガイドＲＮＡの平均濃縮スコアを計算することを含む。ガイドＲＮＡの濃縮スコアは、凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの相対存在量を、ガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養された細胞集団におけるガイドＲＮＡの相対存在量で割ったものである。相対存在量は、ガイドＲＮＡの読み取りカウントを、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団の読み取りカウントで割ったものである。第４のステップは、遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが、存在するランダム確率を大幅に下回り、濃縮スコアの閾値を上回っている場合に遺伝子を選択することを含む。可能な閾値濃縮スコアは、上記で議論されている。特定の例として、閾値濃縮スコアは、約１．５倍に設定することができる。
様々な固有のガイドＲＮＡという句で使用される場合の多様性は、固有のガイドＲＮＡ配列の数を意味する。それは存在量ではなく、定性的な「存在する」または「存在しない」である。様々な固有のガイドＲＮＡとは、固有のガイドＲＮＡ配列の数を意味する。様々な固有のガイドＲＮＡは、細胞集団に存在するすべての固有のガイドＲＮＡを同定するために、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって決定される。これは、ウイルスベクターの定常領域を認識して定常領域の間にあるｇＲＮＡを増幅する２つのプライマー、およびシーケンシングのために１つの定常領域を認識するプライマーを使用することによって行われる。試料に存在する各々の固有のガイドＲＮＡは、シーケンシングプライマーを使用して読み取りカウントを生成する。ＮＧＳの結果には、配列および配列に対応する読み取りの数もまた含まれる。リード数は各ガイドＲＮＡの濃縮スコアの計算に使用され、各固有の配列の存在により、どのガイドＲＮＡが存在するかがわかる。例えば、選択前に遺伝子に３つの固有のガイドＲＮＡがあり、３つすべてが選択後に保持される場合、ｎおよびｎ’の両方は３である。これらの数値は統計の計算に使用されるが、実際の読み取りカウントには使用されない。しかしながら、各ガイドＲＮＡの読み取りカウント（一例では、３つの固有のガイドＲＮＡの各々に対応する１００、２００、５０）は、濃縮スコアの計算に使用される。
Ｖ．タウ凝集を防止するタウ凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングする方法
本明細書に開示されるＣａｓ／タウバイオセンサー細胞株は、タウ凝集の遺伝的修飾因子（例えば、タウ凝集を防止するか、またはタウ凝集を防止すると予期される）をスクリーニングする方法で使用され得る。そのような方法は、本明細書の他の場所に開示されるようなＣａｓ／タウバイオセンサー細胞の集団を提供すること、複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを導入すること、および標的細胞におけるタウ凝集を評価することを含み得る。
一例として、方法は、Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞の集団（例えば、Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインを含む細胞集団）を提供することと、複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを細胞集団に導入することと、ゲノム編集および拡大を可能にするために細胞集団を培養することとを含み得る。複数の固有のガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質は、複数の遺伝子を切断して遺伝子機能のノックアウトをもたらし、遺伝子修飾された細胞集団を生成する。次いで、遺伝子修飾された細胞集団を、タウ播種剤と接触させて、播種された細胞集団を生成することができる。例えば、タウ播種剤は、タウ凝集陽性細胞からの細胞溶解物など、本明細書の他の場所に記載されるような「最大播種」剤であり得る。播種された細胞集団は、タウ凝集体の形成を可能にするために培養することができ、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインの凝集体は、播種された細胞集団のサブセットに形成されて、凝集陽性細胞集団を生成し、凝集体は、凝集陰性細胞集団を生成するために播種された細胞集団の第２のサブセットに形成されない。最後に、複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量は、凝集陰性細胞集団に対して、および／または播種されている細胞集団に対して、および／またはガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養されている細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団において決定され得る。凝集陽性細胞集団に対して、および／または播種されている細胞集団に対して、および／またはガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養されている細胞集団に対して、凝集陰性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊は、タウ凝集を防止するか、またはタウ凝集の候補遺伝的修飾因子であり（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊は、タウ凝集を防止すると予期される。同様に、凝集陰性細胞集団に対して、および／または播種されている細胞集団に対して、および／またはガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養されている細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊は、タウ凝集を防止するか、またはタウ凝集の候補遺伝的修飾因子であり（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊は、タウ凝集を防止すると予期される。凝集陰性細胞集団に対して、および／または播種されている細胞集団に対して、および／またはガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養されている細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊は、タウ凝集を促進もしくは増強するか、またはタウ凝集の候補遺伝的修飾因子であり（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊は、タウ凝集を促進または増強すると予期される。同様に、凝集陽性細胞集団に対して、および／または播種されている細胞集団に対して、および／またはガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養されている細胞集団に対して、凝集陰性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊は、タウ凝集を促進もしくは増強するか、またはタウ凝集の候補遺伝的修飾因子であり（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊は、タウ凝集を促進または増強すると予期される。
同様に、本明細書に開示されるＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞株は、タウ凝集の遺伝的修飾因子（例えば、タウ凝集を防止するか、またはタウ凝集を防止すると予期される）をスクリーニングする方法で使用され得る。そのような方法は、本明細書の他の場所に開示されるようなＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞の集団を提供すること、複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを導入すること、および標的細胞におけるタウ凝集を評価することを含み得る。
一例として、方法は、ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞の集団（例えば、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラＣａｓタンパク質と、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質と、第１のレポーター連結された第１のタウリピートドメインと、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインと、を含む細胞集団）を提供することと、複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを細胞集団に導入することと、転写活性化および拡大を可能にするために細胞集団を培養することとを含み得る。複数の固有のガイドＲＮＡは、キメラＣａｓタンパク質およびキメラアダプタータンパク質と複合体を形成し、複合体は、複数の遺伝子の転写を活性化して遺伝子発現および修飾された細胞集団の増加をもたらす。次いで、修飾された細胞集団を、タウ播種剤と接触させて、播種された細胞集団を生成することができる。例えば、タウ播種剤は、タウ凝集陽性細胞からの細胞溶解物など、本明細書の他の場所に記載されるような「最大播種」剤であり得る。播種された細胞集団は、タウ凝集体の形成を可能にするために培養することができ、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインの凝集体は、播種された細胞集団のサブセットに形成されて、凝集陽性細胞集団を生成し、凝集体は、凝集陰性細胞集団を生成するために播種された細胞集団の第２のサブセットに形成されない。最後に、複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量は、凝集陰性細胞集団に対して、および／または播種されている細胞集団に対して、および／またはガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養されている細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団において決定され得る。凝集陽性細胞集団に対して、および／または播種されている細胞集団に対して、および／またはガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養されている細胞集団に対して、凝集陰性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウ凝集を防止するか、またはタウ凝集の候補遺伝的修飾因子であり（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウ凝集を防止すると予期される。同様に、凝集陰性細胞集団に対して、および／または播種されている細胞集団に対して、および／またはガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養されている細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウ凝集を防止するか、またはタウ凝集の候補遺伝的修飾因子であり（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウ凝集を防止すると予期される。凝集陰性細胞集団に対して、および／または播種されている細胞集団に対して、および／またはガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養されている細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウ凝集を促進もしくは増強するか、またはタウ凝集の候補遺伝的修飾因子であり（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウ凝集を促進または増強すると予期される。同様に、凝集陽性細胞集団に対して、および／または播種されている細胞集団に対して、および／またはガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養されている細胞集団に対して、凝集陰性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウ凝集を促進もしくは増強するか、またはタウ凝集の候補遺伝的修飾因子であり（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウ凝集を促進または増強すると予期される。
この方法で使用されるＣａｓ／タウバイオセンサー細胞は、本明細書の他の場所に開示されているＣａｓ／タウバイオセンサー細胞のうちのいずれかであり得る。同様に、この方法で使用されるＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞は、本明細書の他の場所に開示されているＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞のうちのいずれかであり得る。第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインは、異なり得るか、または類似もしくは同じであり得る。タウリピートドメインは、本明細書の他の場所に開示されているタウリピートドメインのうちのいずれかであり得る。例えば、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、野生型タウリピートドメインであり得るか、またはタウＰ３０１Ｓ変異などの凝集促進変異（例えば、病原性、凝集促進変異）を含み得る。第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、タウ４リピートドメインを含み得る。１つの特定の例として、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、配列番号１１または配列番号１１と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。１つの特定の例では、タウリピートドメインをコードする核酸は、配列番号１２または配列番号１２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得、任意に、核酸は、配列番号１１を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。
任意の手段によって、第１のタウリピートドメインは、第１のレポーターに連結され得、第２のタウリピートドメインは、第２のレポーターに連結され得る。例えば、レポーターは、タウリピートドメインに融合され得る（例えば、融合タンパク質の一部として）。レポータータンパク質は、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインが、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインと凝集したときに検出可能なシグナルを生成するレポータータンパク質の任意の対であり得る。一例として、第１および第２のレポーターは、スプリットルシフェラーゼタンパク質であり得る。別の例として、第１および第２のレポータータンパク質は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対であり得る。ＦＲＥＴは、励起状態のドナーフルオロフォアがその励起エネルギーを隣接するアクセプターフルオロフォアに非放射的に伝達し、それによってアクセプターにその特徴的な蛍光を発させる物理的現象である。ＦＲＥＴ対（ドナーおよびアクセプターフルオロフォア）の例は周知である。例えば、Ｂａｊａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｅｎｓｏｒｓ（Ｂａｓｅｌ）１６（９）：１４８８を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＦＲＥＴ対の１つの特定の例として、第１のレポーターは、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）であり得、第２のレポーターは、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）であり得る。特定の例として、ＣＦＰは、配列番号１３または配列番号１３と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。別の特定の例として、ＹＦＰは、配列番号１５または配列番号１５と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞の場合、Ｃａｓタンパク質は、本明細書の他の場所に開示されている任意のＣａｓタンパク質であり得る。一例として、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であり得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質であり得る。１つの特定の例として、Ｃａｓタンパク質は、配列番号２１または配列番号２１と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインのうちの１つ以上またはすべては、細胞集団において安定して発現され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインのうちの１つ以上またはすべてをコードする核酸は、細胞集団においてゲノム的に組み込まれ得る。１つの特定の例では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、配列番号２２または配列番号２２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得、任意に、核酸は、配列番号２１を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。
ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞の場合、Ｃａｓタンパク質は、本明細書の他の場所に開示されている任意のＣａｓタンパク質であり得る。一例として、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であり得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質であり得る。１つの特定の例として、キメラＣａｓタンパク質は、ＶＰ６４転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含み得る。例えば、キメラＣａｓタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、核局在化シグナル、およびＶＰ６４転写活性化因子ドメインを含み得る。１つの特定の例として、アダプタータンパク質は、ＭＳ２コートタンパク質であり得、キメラアダプタータンパク質中の１つ以上の転写活性化ドメインは、ｐ６５転写活性化ドメインおよびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み得る。例えば、キメラアダプタータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＭＳ２コートタンパク質、核局在化シグナル、ｐ６５転写活性化ドメイン、およびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み得る。１つの特定の例では、キメラＣａｓタンパク質をコードする核酸は、配列番号３８または配列番号３８と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得、任意に、核酸は、配列番号３６を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。１つの特定の例では、キメラアダプタータンパク質をコードする核酸は、配列番号３９または配列番号３９と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得、任意に、核酸は、配列番号３７を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。
キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインのうちの１つ以上またはすべては、細胞集団において安定して発現され得る。例えば、キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインのうちの１つ以上またはすべてをコードする核酸は、細胞集団においてゲノム的に組み込まれ得る。
本明細書の他の場所に開示されているように、細胞は、任意の細胞型であり得る。例えば、細胞は、真核細胞、哺乳動物細胞、またはヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞または神経細胞）であり得る。
複数の固有のガイドＲＮＡは、任意の既知の手段によって細胞集団に導入され得る。いくつかの方法では、ガイドＲＮＡは、レトロウイルス、アデノウイルス、またはレンチウイルス形質導入などのウイルス形質導入によって細胞集団に導入される。特定の例では、ガイドＲＮＡは、レンチウイルス形質導入によって導入され得る。複数の固有のガイドＲＮＡの各々は、別個のウイルスベクター内にあり得る。細胞集団は、任意の感染多重度で感染し得る。例えば、感染の多重度は、約０．１～約１．０、約０．１～約０．９、約０．１～約０．８、約０．１～約０．７、約０．１～約０．６、約０．１～約０．５、約０．１～約０．４、または約０．１～約０．３であり得る。あるいは、感染の多重度は、約１．０未満、約０．９未満、約０．８未満、約０．７未満、約０．６未満、約０．５未満、約０．４未満、約０．３未満、または約０．２未満であり得る。特定の例では、感染の多重度は、約０．３未満であり得る。
ガイドＲＮＡは、選択マーカーまたはレポーター遺伝子と一緒に細胞集団に導入されて、ガイドＲＮＡを有する細胞を選択することができ、方法は、選択マーカーまたはレポーター遺伝子を含む細胞を選択することをさらに含み得る。選択マーカーおよびレポーター遺伝子の例は、本明細書の他の場所に提供されている。一例として、選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、およびブラストサイジンＳデアミナーゼなどの薬物に対する耐性を付与するものであり得る。別の例示的な選択マーカーは、Ｓｈ ｂｌｅ遺伝子（Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン遺伝子）によってコードされるブレオマイシン耐性タンパク質であり、これは、ゼオシン（フレオマイシンＤ１）耐性を付与する。例えば、細胞は、ガイドＲＮＡ構築物で形質導入された細胞のみがスクリーニングを実施するために使用するために保存されるように、薬物（例えば、ピューロマイシン）で選択され得る。例えば、薬物は、ピューロマイシンまたはゼオシン（フレオマイシンＤ１）であり得る。
いくつかの方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、細胞の大部分が固有のガイドＲＮＡのうちの１つのみを受け取るように選択された濃度で導入される。例えば、ガイドＲＮＡがウイルス形質導入によって導入されている場合、細胞は、低い感染多重度で感染し、ほとんどの細胞が高い確率で１つのウイルス構築物のみを受け取ることを確実にすることができる。１つの特定の例として、感染の多重度は、約０．３未満であり得る。
複数の固有のガイドＲＮＡが導入される細胞集団は、任意の好適な数の細胞であり得る。例えば、細胞集団は、固有のガイドＲＮＡあたり約５０を超える、約１００を超える、約２００を超える、約３００を超える、約４００を超える、約５００を超える、約６００を超える、約７００を超える、約８００を超える、約９００を超える、または約１０００を超える細胞を含み得る。特定の例では、細胞集団は、固有のガイドＲＮＡあたり約３００個を超える細胞または約５００個を超える細胞を含む。
複数の固有のガイドＲＮＡは、任意の数の遺伝子を標的とすることができる。例えば、複数の固有のガイドＲＮＡは、約５０以上の遺伝子、約１００以上の遺伝子、約２００以上の遺伝子、約３００以上の遺伝子、約４００以上の遺伝子、約５００以上の遺伝子、約１０００以上の遺伝子、約２０００以上の遺伝子、約３０００以上の遺伝子、約４０００以上の遺伝子、約５０００以上の遺伝子、約１００００以上の遺伝子、または約２００００以上の遺伝子を標的とすることができる。いくつかの方法では、ガイドＲＮＡは、特定のシグナル伝達経路の遺伝子を標的とするように選択され得る。いくつかの方法では、固有のガイドＲＮＡのライブラリは、ゲノムワイドライブラリである。
複数の固有のガイドＲＮＡは、各個々の標的化遺伝子内の任意の数の配列を標的とすることができる。いくつかの方法では、複数の標的配列は、標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される。例えば、標的化された複数の遺伝子の各々において、平均して約２～約１０、約２～約９、約２～約８、約２～約７、約２～約６、約２～約５、約２～約４、または約２～３の固有の標的配列が標的化され得る。例えば、標的化された複数の遺伝子の各々において、平均して少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、または少なくとも約６の固有の標的配列が標的化され得る。特定の例として、標的化された複数の遺伝子の各々において、平均して約６つの標的配列が標的化され得る。別の特定の例として、標的化された複数の遺伝子の各々において、平均して約３～約６または約４～約６の標的配列が標的化される。
ガイドＲＮＡは、標的遺伝子内の任意の所望の位置を標的とすることができる。Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞を使用するいくつかのＣＲＩＳＰＲｎ方法では、可能な場合、各ガイドＲＮＡは、構成的エクソンを標的とする。いくつかの方法では、可能な場合、各ガイドＲＮＡは、５’構成的エクソンを標的とする。いくつかの方法では、各ガイドＲＮＡは、可能な場合、第１のエクソン、第２のエクソン、または第３のエクソン（遺伝子の５’末端から）を標的とする。ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞を使用するいくつかのＣＲＩＳＰＲａ方法では、可能な場合、各ガイドＲＮＡは、転写開始部位の２００ｂｐ上流内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とすることができる。ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞を使用するいくつかのＣＲＩＳＰＲａ方法では、各ガイドＲＮＡは、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つ以上のアダプター結合エレメントを含み得る。一例では、各ガイドＲＮＡは、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる２つのアダプター結合エレメントを含み、任意に、第１のアダプター結合エレメントは、１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第１のループ内にあり、第２のアダプター結合エレメントは、１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第２のループ内にある。例えば、アダプター結合エレメントは、配列番号３３に示される配列を含み得る。特定の例では、１つ以上のガイドＲＮＡの各々は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）部分に融合したＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）部分を含む単一のガイドＲＮＡであり、第１のループは、配列番号１７、１９、３０、または３１の残基１３～１６に対応するテトラループであり、第２のループは、配列番号１７、１９、３０、または３１の残基５３～５６に対応するステムループ２である。
ゲノム編集および拡大を可能にするために細胞集団を培養するステップは、任意の好適な期間であり得る。例えば、培養は、約２日～約１５日、約３日～約１３日、約５日～約１２日、約７日～約１１日、または約７日もしくは約１１日間であり得る。別の例として、培養は、約２日～約１４日、約３日～約１２日、約５日～約１１日、約７日～約１０日、または約７日もしくは約１０日間であり得る。同様に、転写活性化および拡大を可能にするために細胞集団を培養するステップは、任意の好適な期間であり得る。例えば、培養は、約２日～約１５日、約３日～約１３日、約５日～約１２日、約７日～約１１日、または約７日もしくは約１１日間であり得る。同様に、転写活性化および拡大を可能にするために細胞集団を培養するステップは、任意の好適な期間であり得る。例えば、培養は、約２日～約１４日、約３日～約１２日、約５日～約１１日、約７日～約１０日、または約７日もしくは約１０日間であり得る。
任意の好適なタウ播種剤を使用して、播種された細胞集団を生成することができる。好適なタウ播種剤は、本明細書の他の場所に開示されている。いくつかの好適な播種剤は、例えば、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインとは異なるか、または類似しているか、または同じであり得るタウリピートドメインを含む。一例では、播種するステップは、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する培養されたタウ凝集陽性細胞からの細胞溶解物を含む存在下で、遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含む。任意に、遺伝子修飾された細胞集団は、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在するタウ凝集陽性細胞と共培養されない。
培地中の細胞溶解物の量または濃度は、任意の好適な量または濃度であり得る。例えば、培地中の細胞溶解物の濃度は、培地（例えば、新鮮な培養培地）の約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約４．５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約４μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約３．５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約３μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約２．５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約２μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約１．５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約４．５μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約４μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約３．５μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約３μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約２．５μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約２μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約１．５μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４．５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３．５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２．５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１．５μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約４．５μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約４μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約３．５μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約３μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約２．５μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ～約２μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約４．５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約４μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約３．５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約３μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約２．５μｇ／ｍＬ、約２．５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約２．５μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約２．５μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約２．５μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約２．５μｇ／ｍＬ～約４．５μｇ／ｍＬ、約２．５μｇ／ｍＬ～約４μｇ／ｍＬ、約２．５μｇ／ｍＬ～約３．５μｇ／ｍＬ、または約２．５μｇ／ｍＬ～約３μｇ／ｍＬであり得る。例えば、培養培地中の細胞溶解物は、約１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬの濃度であり得るか、または約１．５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ、約２．５μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ、約３．５μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ、約４．５μｇ／ｍＬ、もしくは約５μｇ／ｍＬの濃度であり得る。任意に、細胞溶解物は、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液中にあり得る。任意に、緩衝液は、プロテアーゼ阻害剤を含み得る。プロテアーゼ阻害剤の例には、これらに限定されないが、ＡＥＢＳＦ、アプロチニン、ベスタチン、Ｅ－６４、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられる。緩衝液は、これらの阻害剤のうちのいずれかまたはそれらの任意の組み合わせを含み得る（例えば、緩衝液は、これらのプロテアーゼ阻害剤のすべてを含み得る）。
溶解物を生成するための細胞は、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液に収集され得る。任意に、緩衝液は、プロテアーゼ阻害剤を含み得る。プロテアーゼ阻害剤の例には、これらに限定されないが、ＡＥＢＳＦ、アプロチニン、ベスタチン、Ｅ－６４、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられる。緩衝液は、これらの阻害剤のうちのいずれかまたはそれらの任意の組み合わせを含み得る（例えば、緩衝液は、これらのプロテアーゼ阻害剤のすべてを含み得る）。
細胞溶解物は、例えば、タウ凝集陽性細胞（例えば、上記のように緩衝液およびプロテアーゼ阻害剤に収集された細胞）を任意の好適な時間超音波処理することによって収集され得る。例えば、細胞は、約１分～約６分、約１分～約５分、約１分～約４分、約１分～約３分、約２分～約６分、約２分～約５分、約２分～約４分、約２分～約３分、約２分～約６分、約３分～約５分、または約３分～約４分間超音波処理され得る。例えば、細胞は、約２分～約４分間、または約３分間超音波処理され得る。
任意に、培地は、リポフェクタミンまたはリポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）またはリン脂質または別のトランスフェクション剤を含む。任意に、培地は、リポフェクタミンを含む。任意に、培地は、リポフェクタミンまたはリポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）またはリン脂質または別のトランスフェクション剤を含まない。任意に、培地は、リポフェクタミンを含まない。培地中のリポフェクタミンまたはリポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）またはリン脂質または他のトランスフェクション剤の量もしくは濃度は、任意の好適な量または濃度であり得る。例えば、培地中のリポフェクタミンまたはリポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）またはリン脂質または他のトランスフェクション剤の濃度は、培地（例えば、新鮮な培地）の約０．５μＬ／ｍＬ～約１０μＬ／ｍＬ、約０．５μＬ／ｍＬ～約５μＬ／ｍＬ、約０．５μＬ／ｍＬ～約４．５μＬ／ｍＬ、約０．５μＬ／ｍＬ～約４μＬ／ｍＬ、約０．５μＬ／ｍＬ～約３．５μＬ／ｍＬ、約０．５μＬ／ｍＬ～約３μＬ／ｍＬ、約０．５μＬ／ｍＬ～約２．５μＬ／ｍＬ、約０．５μＬ／ｍＬ～約２μＬ／ｍＬ、約０．５μＬ／ｍＬ～約１．５μＬ／ｍＬ、約０．５μＬ／ｍＬ～約１μＬ／ｍＬ、約１μＬ／ｍＬ～約１０μＬ／ｍＬ、約１μＬ／ｍＬ～約５μＬ／ｍＬ、約１μＬ／ｍＬ～約４．５μＬ／ｍＬ、約１μＬ／ｍＬ～約４μＬ／ｍＬ、約１μＬ／ｍＬ～約３．５μＬ／ｍＬ、約１μＬ／ｍＬ～約３μＬ／ｍＬ、約１μＬ／ｍＬ～約２．５μＬ／ｍＬ、約１μＬ／ｍＬ～約２μＬ／ｍＬ、約１μＬ／ｍＬ～約１．５μＬ／ｍＬ、約１．５μＬ／ｍＬ～約１０μＬ／ｍＬ、約１．５μＬ／ｍＬ～約５μＬ／ｍＬ、約１．５μＬ／ｍＬ～約４．５μＬ／ｍＬ、約１．５μＬ／ｍＬ～約４μＬ／ｍＬ、約１．５μＬ／ｍＬ～約３．５μＬ／ｍＬ、約１．５μＬ／ｍＬ～約３μＬ／ｍＬ、約１．５μＬ／ｍＬ～約２．５μＬ／ｍＬ、約１．５μＬ／ｍＬ～約２μＬ／ｍＬ、約２μＬ／ｍＬ～約１０μＬ／ｍＬ、約２μＬ／ｍＬ～約５μＬ／ｍＬ、約２μＬ／ｍＬ～約４．５μＬ／ｍＬ、約２μＬ／ｍＬ～約４μＬ／ｍＬ、約２μＬ／ｍＬ～約３．５μＬ／ｍＬ、約２μＬ／ｍＬ～約３μＬ／ｍＬ、または約２μＬ／ｍＬ～約２．５μＬ／ｍＬであり得る。例えば、培地中のリポフェクタミンまたはリポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）またはリン脂質または他のトランスフェクション剤の濃度は、約１．５μＬ／ｍＬ～約４μＬ／ｍＬであり得るか、またはそれは約１．５μＬ／ｍＬ、約２μＬ／ｍＬ、約２．５μＬ／ｍＬ、約３μＬ／ｍＬ、約３．５μＬ／ｍＬ、約もしくは４μＬ／ｍＬであり得る。
タウ凝集体の形成を可能にするために播種された細胞集団を培養するステップは、任意の好適な期間であることができ、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインの凝集体は、播種された細胞集団のサブセットに形成されて、凝集陽性細胞集団を生成する。例えば、培養は、約１日～約７日、約２日～約６日、約３日～約５日、約１日～約３日、または約２日間であり得る。凝集は、使用するレポーターに応じて、任意の好適な手段により決定され得る。例えば、第１のレポーターおよび第２のレポーターが蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対である方法では、凝集陽性細胞集団は、フローサイトメトリーにより同定され得る。
ガイドＲＮＡの存在量は、任意の好適な手段により決定され得る。特定の例では、存在量は、次世代シーケンシングによって決定される。次世代シーケンシングとは、サンガー法に基づかないハイスループットＤＮＡシーケンシング技術を指す。例えば、ガイドＲＮＡの存在量を決定することは、ガイドＲＮＡの読み取りカウントを測定することを含み得る。
いくつかの方法では、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対するガイドＲＮＡの存在量が、凝集陽性細胞集団および／または播種された細胞集団に対して凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ガイドＲＮＡは、凝集陰性細胞において濃縮されているとみなされる。いくつかの方法では、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対するガイドＲＮＡの存在量が、凝集陰性細胞集団および／または播種された細胞集団に対して凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合、ガイドＲＮＡは、凝集陽性細胞において枯渇しているとみなされる。様々な濃縮／枯渇閾値もまた使用することができる。例えば、濃縮／枯渇閾値は、よりストリンジェントになるようにより高く設定することができる（例えば、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、または少なくとも約２．５倍）。あるいは、濃縮／枯渇閾値は、よりストリンジェントにならないようにより低く設定することができる（例えば、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．３倍、または少なくとも約１．２倍）。
あるいは、いくつかの方法では、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対するガイドＲＮＡの存在量が、凝集陰性細胞集団および／または播種された細胞集団に対して凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ガイドＲＮＡは、凝集陽性細胞において濃縮されているとみなされる。いくつかの方法では、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対するガイドＲＮＡの存在量が、凝集陽性細胞集団および／または播種された細胞集団に対して凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合、ガイドＲＮＡは、凝集陰性細胞において枯渇しているとみなされる。様々な濃縮／枯渇閾値もまた使用することができる。例えば、濃縮／枯渇閾値は、よりストリンジェントになるようにより高く設定することができる（例えば、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、または少なくとも約２．５倍）。あるいは、濃縮／枯渇閾値は、よりストリンジェントにならないようにより低く設定することができる（例えば、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．３倍、または少なくとも約１．２倍）。
一例では、存在量を決定するステップは、凝集陰性細胞集団に対して、および／または第１の時点のガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養された細胞集団に対して、および／または第２の時点の播種された細胞集団に対して、凝集陽性集団において複数の固有のガイドＲＮＡの存在量を決定することを含み得る。同様に、存在量を決定するステップは、凝集陽性細胞集団に対して、および／または第１の時点のガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養された細胞集団に対して、および／または第２の時点の播種された細胞集団に対して、凝集陰性集団において複数の固有のガイドＲＮＡの存在量を決定することを含み得る。例えば、第１の時点は、細胞集団を培養する第１の継代、またはゲノム編集および拡大を可能にするために、細胞集団の培養の途中であり得る。例えば、第１の時点は、ガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体を形成するのに十分な時間の後、およびＣａｓタンパク質が複数の遺伝子を切断して遺伝子機能のノックアウトをもたらすか（ＣＲＩＳＰＲｎ）または複数の遺伝子を転写活性化する（ＣＲＩＳＰＲａ）のに十分な時間の後であり得る。しかしながら、いくつかの場合、第１の時点は、理想的には、感染直後（すなわち、さらなる拡大およびゲノム編集の前）にｇＲＮＡライブラリ表現を決定するため、ならびに各ｇＲＮＡ表現が第１の時点から第２の時点および最終時点までのさらなる時点までに進化するかどうかを決定するために最初の細胞継代であるべきである。これにより、ｇＲＮＡの存在量が第１の時点と第２の時点との間で変化しないことを確認することにより、スクリーニングの過程で細胞増殖の利点により濃縮されたｇＲＮＡ／標的を除外することが可能である。特定の例として、第１の時点は、培養および拡大の約１日、約２日、約３日、または約４日後（例えば、培養および拡大から約３日で）であり得、第２の時点は、培養および拡大の約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、または約１１日後であり得る。例えば、第１の時点は、培養および拡大の約３日後であり得、第２の時点は、培養および拡張の約７日または約１０日後であり得る。
いくつかの方法では、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、凝集陽性細胞集団、第１の時点での培養された細胞集団、および第２の時点での播種された細胞集団に対して、凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、遺伝子は、次いで、タウ凝集の遺伝的修飾因子とみなされ得、遺伝子の破壊（ＣＲＩＳＰＲｎ）または転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）は、タウ凝集を防止する（または防止すると予期される）。代替的または追加的に、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、凝集陽性細胞集団および第２の時点での播種された細胞集団に対して、凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、遺伝子は、次いで、タウ凝集の遺伝的修飾因子とみなされ得、遺伝子の破壊（ＣＲＩＳＰＲｎ）または転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）は、タウ凝集を防止する（または防止すると予期される）。代替的または追加的に、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、凝集陰性細胞集団、第１の時点での培養された細胞集団、および第２の時点での播種された細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合、遺伝子は、次いで、タウ凝集の遺伝的修飾因子とみなされ得、遺伝子の破壊（ＣＲＩＳＰＲｎ）または転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）は、タウ凝集を防止する（または防止すると予期される）。代替的または追加的に、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、凝集陰性細胞集団および第２の時点での播種された細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合、遺伝子は、次いで、タウ凝集の遺伝的修飾因子とみなされ得、遺伝子の破壊（ＣＲＩＳＰＲｎ）または転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）は、タウ凝集を防止する（または防止すると予期される）。
あるいは、一例では、存在量を決定するステップは、凝集陽性細胞集団に対して、および／または第１の時点のガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養された細胞集団に対して、および／または第２の時点の播種された細胞集団に対して、凝集陰性集団において複数の固有のガイドＲＮＡの存在量を決定することを含み得る。同様に、存在量を決定するステップは、凝集陰性細胞集団に対して、および／または第１の時点のガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養された細胞集団に対して、および／または第２の時点の播種された細胞集団に対して、凝集陽性集団において複数の固有のガイドＲＮＡの存在量を決定することを含み得る。例えば、第１の時点は、細胞集団を培養する第１の継代、またはゲノム編集および拡大を可能にするために、細胞集団の培養の途中であり得る。例えば、第１の時点は、ガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体を形成するのに十分な時間の後、およびＣａｓタンパク質が複数の遺伝子を切断して遺伝子機能のノックアウトをもたらすか（ＣＲＩＳＰＲｎ）または複数の遺伝子を転写活性化する（ＣＲＩＳＰＲａ）のに十分な時間の後であり得る。しかしながら、いくつかの場合、第１の時点は、理想的には、感染直後（すなわち、さらなる拡大およびゲノム編集の前）にｇＲＮＡライブラリ表現を決定するため、ならびに各ｇＲＮＡ表現が第１の時点から第２の時点および最終時点までのさらなる時点までに進化するかどうかを決定するために最初の細胞継代であるべきである。これにより、ｇＲＮＡの存在量が第１の時点と第２の時点との間で変化しないことを確認することにより、スクリーニングの過程で細胞増殖の利点により濃縮されたｇＲＮＡ／標的を除外することが可能である。特定の例として、第１の時点は、培養および拡大の約１日、約２日、約３日、または約４日後（例えば、培養および拡大から約３日で）であり得、第２の時点は、培養および拡大の約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、または約１１日後であり得る。例えば、第１の時点は、培養および拡大の約３日後であり得、第２の時点は、培養および拡張の約７日または約１０日後であり得る。
いくつかの方法では、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、凝集陰性細胞集団、第１の時点での培養された細胞集団、および第２の時点での播種された細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、遺伝子は、次いで、タウ凝集の遺伝的修飾因子とみなされ得、遺伝子の破壊（ＣＲＩＳＰＲｎ）または転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）は、タウ凝集を促進または増強する（またはタウ凝集を促進もしくは増強すると予期される）。代替的または追加的に、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、凝集陰性細胞集団および第２の時点での播種された細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、遺伝子は、次いで、タウ凝集の遺伝的修飾因子とみなされ得、遺伝子の破壊（ＣＲＩＳＰＲｎ）または転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）は、タウ凝集を促進または増強する（またはタウ凝集を促進もしくは増強すると予期される）。代替的または追加的に、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、凝集陽性細胞集団、第１の時点での培養された細胞集団、および第２の時点での播種された細胞集団に対して、凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合、遺伝子は、次いで、タウ凝集の遺伝的修飾因子とみなされ得、遺伝子の破壊（ＣＲＩＳＰＲｎ）または転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）は、タウ凝集を促進または増強する（またはタウ凝集を促進もしくは増強すると予期される）。代替的または追加的に、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、凝集陽性細胞集団および第２の時点での播種された細胞集団に対して、凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合、遺伝子は、次いで、タウ凝集の遺伝的修飾因子とみなされ得、遺伝子の破壊（ＣＲＩＳＰＲｎ）または転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）は、タウ凝集を促進または増強する（またはタウ凝集を促進もしくは増強すると予期される）。
いくつかのＣＲＩＳＰＲｎ方法では、タウ凝集の遺伝的修飾因子として遺伝子を同定するために以下のステップが施され、遺伝子の破壊は、タウ凝集を防止する（または防止すると予期される）。同様に、いくつかのＣＲＩＳＰＲａ方法では、タウ凝集の遺伝的修飾因子として遺伝子を同定するために以下のステップが施され、遺伝子の転写活性化は、タウ凝集を防止する（または防止すると予期される）。第１のステップは、凝集陰性細胞集団に、複数の固有のガイドＲＮＡのうちのどれが存在するかを同定することを含む。第２のステップは、式ｎＣｎ’＊（ｘ－ｎ’）Ｃ（ｍ－ｎ）／ｘＣｍを使用して、同定されたガイドＲＮＡが存在するランダム確率を計算することを含み、ｘは、細胞集団に導入された様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｍは、ステップ（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｎは、遺伝子を標的とする細胞集団に導入された様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｎ’は、遺伝子を標的とするステップ（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡである。第３のステップは、ステップ（１）で同定されたガイドＲＮＡの平均濃縮スコアを計算することを含む。ガイドＲＮＡの濃縮スコアは、凝集陰性細胞集団におけるガイドＲＮＡの相対存在量を、凝集陽性細胞、またはガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養された細胞集団、または播種された細胞集団におけるガイドＲＮＡの相対存在量で割ったものである。相対存在量は、ガイドＲＮＡの読み取りカウントを、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団の読み取りカウントで割ったものである。第４のステップは、遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが、存在するランダム確率を大幅に下回り、濃縮スコアの閾値を上回っている場合に遺伝子を選択することを含む。可能な閾値濃縮スコアは、上記で議論されている。特定の例として、閾値濃縮スコアは、約１．５倍に設定することができる。
あるいは、いくつかのＣＲＩＳＰＲｎ方法では、タウ凝集の遺伝的修飾因子として遺伝子を同定するために以下のステップが施され、遺伝子の破壊は、タウ凝集を促進または増強する（または促進もしくは増強すると予期される）。同様に、いくつかのＣＲＩＳＰＲａ方法では、タウ凝集の遺伝的修飾因子として遺伝子を同定するために以下のステップが施され、遺伝子の転写活性化は、タウ凝集を促進または増強する（または促進もしくは増強すると予期される）。第１のステップは、凝集陽性細胞集団に、複数の固有のガイドＲＮＡのうちのどれが存在するかを同定することを含む。第２のステップは、式ｎＣｎ’＊（ｘ－ｎ’）Ｃ（ｍ－ｎ）／ｘＣｍを使用して、同定されたガイドＲＮＡが存在するランダム確率を計算することを含み、ｘは、細胞集団に導入された様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｍは、ステップ（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｎは、遺伝子を標的とする細胞集団に導入された様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｎ’は、遺伝子を標的とするステップ（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡである。第３のステップは、ステップ（１）で同定されたガイドＲＮＡの平均濃縮スコアを計算することを含む。ガイドＲＮＡの濃縮スコアは、凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの相対存在量を、凝集陰性細胞、またはガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養された細胞集団、または播種された細胞集団におけるガイドＲＮＡの相対存在量で割ったものである。相対存在量は、ガイドＲＮＡの読み取りカウントを、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団の読み取りカウントで割ったものである。第４のステップは、遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが、存在するランダム確率を大幅に下回り、濃縮スコアの閾値を上回っている場合に遺伝子を選択することを含む。可能な閾値濃縮スコアは、上記で議論されている。特定の例として、閾値濃縮スコアは、約１．５倍に設定することができる。
様々な固有のガイドＲＮＡという句で使用される場合の多様性は、固有のガイドＲＮＡ配列の数を意味する。それは存在量ではなく、定性的な「存在する」または「存在しない」である。様々な固有のガイドＲＮＡとは、固有のガイドＲＮＡ配列の数を意味する。様々な固有のガイドＲＮＡは、細胞集団に存在するすべての固有のガイドＲＮＡを同定するために、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって決定される。これは、ウイルスベクターの定常領域を認識して定常領域の間にあるｇＲＮＡを増幅する２つのプライマー、およびシーケンシングのために１つの定常領域を認識するプライマーを使用することによって行われる。試料に存在する各々の固有のガイドＲＮＡは、シーケンシングプライマーを使用して読み取りカウントを生成する。ＮＧＳの結果には、配列および配列に対応する読み取りの数もまた含まれる。リード数は各ガイドＲＮＡの濃縮スコアの計算に使用され、各固有の配列の存在により、どのガイドＲＮＡが存在するかがわかる。例えば、選択前に遺伝子に３つの固有のガイドＲＮＡがあり、３つすべてが選択後に保持される場合、ｎおよびｎ’の両方は３である。これらの数値は統計の計算に使用されるが、実際の読み取りカウントには使用されない。しかしながら、各ガイドＲＮＡの読み取りカウント（一例では、３つの固有のガイドＲＮＡの各々に対応する１００、２００、５０）は、濃縮スコアの計算に使用される。
ＶＩ．タウ脱凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングする方法
本明細書に開示されるＣａｓ／タウバイオセンサー細胞株は、タウ脱凝集の遺伝的修飾因子（例えば、タウ脱凝集を促進する）をスクリーニングする方法で使用され得る。そのような方法は、本明細書の他の場所に開示されるようなタウ凝集陽性Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞の集団を提供すること、複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを導入すること、および標的細胞におけるタウ脱凝集を評価することを含み得る。
一例として、方法は、Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞の集団（例えば、Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインを含む細胞集団）を提供することであって、細胞が、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在するタウ凝集陽性細胞である、提供することと、複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを細胞集団に導入することと、ゲノム編集および拡大を可能にするために細胞集団を培養することとを含み得る。複数の固有のガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質は、複数の遺伝子を切断して遺伝子機能のノックアウトをもたらし、遺伝子修飾された細胞集団を生成する。培養することにより、凝集陽性細胞集団および凝集陰性細胞集団がもたらされ、それは次いで同定され得る。最後に、複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量は、凝集陰性細胞集団に対して、および／または１つ以上の時点でのガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養されている細胞集団に対して、および／または培養されている細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団において決定され得る。凝集陽性細胞集団に対して、および／または１つ以上の時点でのガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養されている細胞集団に対して、凝集陰性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ脱凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊は、タウ脱凝集を促進するか、またはタウ脱凝集の候補遺伝的修飾因子であり（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊は、タウ脱凝集を促進すると予期される。同様に、凝集陰性細胞集団に対して、および／または１つ以上の時点でのガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養されている細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ脱凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊は、タウ脱凝集を促進するか、またはタウ脱凝集の候補遺伝的修飾因子であり（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊は、タウ脱凝集を促進すると予期される。凝集陰性細胞集団に対して、および／または１つ以上の時点でのガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養されている細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊は、タウ凝集を促進もしくは増強するか、またはタウ凝集の候補遺伝的修飾因子であり（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊は、タウ凝集を促進または増強すると予期される。同様に、凝集陽性細胞集団に対して、および／または１つ以上の時点でのガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養されている細胞集団に対して、凝集陰性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊は、タウ凝集を促進もしくは増強するか、またはタウ凝集の候補遺伝的修飾因子であり（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊は、タウ凝集を促進または増強すると予期される。
同様に、本明細書に開示されるＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞株は、タウ脱凝集の遺伝的修飾因子（例えば、タウ脱凝集を促進する）をスクリーニングする方法で使用され得る。そのような方法は、本明細書の他の場所に開示されるようなタウ凝集陽性ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞の集団を提供すること、複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを導入すること、および標的細胞におけるタウ脱凝集を評価することを含み得る。
一例として、方法は、ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞の集団（例えば、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラＣａｓタンパク質と、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質と、第１のレポーター連結された第１のタウリピートドメインと、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインと、を含む細胞集団）を提供することであって、細胞が、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在するタウ凝集陽性細胞である、提供することと、複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを細胞集団に導入することと、転写活性化および拡大を可能にするために細胞集団を培養することとを含み得る。複数の固有のガイドＲＮＡは、キメラＣａｓタンパク質およびキメラアダプタータンパク質と複合体を形成し、複合体は、複数の遺伝子の転写を活性化して遺伝子発現および修飾された細胞集団の増加をもたらす。培養することにより、凝集陽性細胞集団および凝集陰性細胞集団がもたらされ、それは次いで同定され得る。最後に、複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量は、凝集陰性細胞集団に対して、および／または１つ以上の時点でのガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養されている細胞集団に対して、および／または培養されている細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団において決定され得る。凝集陽性細胞集団に対して、および／または１つ以上の時点でのガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養されている細胞集団に対して、凝集陰性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ脱凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウ脱凝集を促進するか、またはタウ脱凝集の候補遺伝的修飾因子であり（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウ脱凝集を促進すると予期される。同様に、凝集陰性細胞集団に対して、および／または１つ以上の時点でのガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養されている細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ脱凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウ脱凝集を促進するか、またはタウ脱凝集の候補遺伝的修飾因子であり（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウ脱凝集を促進すると予期される。凝集陰性細胞集団に対して、および／または１つ以上の時点でのガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養されている細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウ凝集を促進もしくは増強するか、またはタウ凝集の候補遺伝的修飾因子であり（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウ凝集を促進または増強すると予期される。同様に、凝集陽性細胞集団に対して、および／または１つ以上の時点でのガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養されている細胞集団に対して、凝集陰性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウ凝集を促進もしくは増強するか、またはタウ凝集の候補遺伝的修飾因子であり（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウ凝集を促進または増強すると予期される。
この方法で使用されるＣａｓ／タウバイオセンサー細胞は、本明細書の他の場所に開示されているＣａｓ／タウバイオセンサー細胞のうちのいずれかであり得る。同様に、この方法で使用されるＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞は、本明細書の他の場所に開示されているＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞のうちのいずれかであり得る。第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインは、異なり得るか、または類似もしくは同じであり得る。タウリピートドメインは、本明細書の他の場所に開示されているタウリピートドメインのうちのいずれかであり得る。例えば、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、野生型タウリピートドメインであり得るか、またはタウＰ３０１Ｓ変異などの凝集促進変異（例えば、病原性、凝集促進変異）を含み得る。第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、タウ４リピートドメインを含み得る。１つの特定の例として、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、配列番号１１または配列番号１１と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。１つの特定の例では、タウリピートドメインをコードする核酸は、配列番号１２または配列番号１２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得、任意に、核酸は、配列番号１１を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。
任意の手段によって、第１のタウリピートドメインは、第１のレポーターに連結され得、第２のタウリピートドメインは、第２のレポーターに連結され得る。例えば、レポーターは、タウリピートドメインに融合され得る（例えば、融合タンパク質の一部として）。レポータータンパク質は、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインが、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインと凝集したときに検出可能なシグナルを生成するレポータータンパク質の任意の対であり得る。一例として、第１および第２のレポーターは、スプリットルシフェラーゼタンパク質であり得る。別の例として、第１および第２のレポータータンパク質は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対であり得る。ＦＲＥＴは、励起状態のドナーフルオロフォアがその励起エネルギーを隣接するアクセプターフルオロフォアに非放射的に伝達し、それによってアクセプターにその特徴的な蛍光を発させる物理的現象である。ＦＲＥＴ対（ドナーおよびアクセプターフルオロフォア）の例は周知である。例えば、Ｂａｊａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｅｎｓｏｒｓ（Ｂａｓｅｌ）１６（９）：１４８８を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＦＲＥＴ対の１つの特定の例として、第１のレポーターは、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）であり得、第２のレポーターは、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）であり得る。特定の例として、ＣＦＰは、配列番号１３または配列番号１３と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。別の特定の例として、ＹＦＰは、配列番号１５または配列番号１５と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞の場合、Ｃａｓタンパク質は、本明細書の他の場所に開示されている任意のＣａｓタンパク質であり得る。一例として、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であり得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質であり得る。１つの特定の例として、Ｃａｓタンパク質は、配列番号２１または配列番号２１と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインのうちの１つ以上またはすべては、細胞集団において安定して発現され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインのうちの１つ以上またはすべてをコードする核酸は、細胞集団においてゲノム的に組み込まれ得る。１つの特定の例では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、配列番号２２または配列番号２２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得、任意に、核酸は、配列番号２１を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。
ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞の場合、Ｃａｓタンパク質は、本明細書の他の場所に開示されている任意のＣａｓタンパク質であり得る。一例として、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であり得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質であり得る。１つの特定の例として、キメラＣａｓタンパク質は、ＶＰ６４転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含み得る。例えば、キメラＣａｓタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、核局在化シグナル、およびＶＰ６４転写活性化因子ドメインを含み得る。１つの特定の例として、アダプタータンパク質は、ＭＳ２コートタンパク質であり得、キメラアダプタータンパク質中の１つ以上の転写活性化ドメインは、ｐ６５転写活性化ドメインおよびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み得る。例えば、キメラアダプタータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＭＳ２コートタンパク質、核局在化シグナル、ｐ６５転写活性化ドメイン、およびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み得る。１つの特定の例では、キメラＣａｓタンパク質をコードする核酸は、配列番号３８または配列番号３８と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得、任意に、核酸は、配列番号３６を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。１つの特定の例では、キメラアダプタータンパク質をコードする核酸は、配列番号３９または配列番号３９と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得、任意に、核酸は、配列番号３７を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。
キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインのうちの１つ以上またはすべては、細胞集団において安定して発現され得る。例えば、キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインのうちの１つ以上またはすべてをコードする核酸は、細胞集団においてゲノム的に組み込まれ得る。
本明細書の他の場所に開示されているように、細胞は、任意の細胞型であり得る。例えば、細胞は、真核細胞、哺乳動物細胞、またはヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞または神経細胞）であり得る。
複数の固有のガイドＲＮＡは、任意の既知の手段によって細胞集団に導入され得る。いくつかの方法では、ガイドＲＮＡは、レトロウイルス、アデノウイルス、またはレンチウイルス形質導入などのウイルス形質導入によって細胞集団に導入される。特定の例では、ガイドＲＮＡは、レンチウイルス形質導入によって導入され得る。複数の固有のガイドＲＮＡの各々は、別個のウイルスベクター内にあり得る。細胞集団は、任意の感染多重度で感染し得る。例えば、感染の多重度は、約０．１～約１．０、約０．１～約０．９、約０．１～約０．８、約０．１～約０．７、約０．１～約０．６、約０．１～約０．５、約０．１～約０．４、または約０．１～約０．３であり得る。あるいは、感染の多重度は、約１．０未満、約０．９未満、約０．８未満、約０．７未満、約０．６未満、約０．５未満、約０．４未満、約０．３未満、または約０．２未満であり得る。特定の例では、感染の多重度は、約０．３未満であり得る。
ガイドＲＮＡは、選択マーカーまたはレポーター遺伝子と一緒に細胞集団に導入されて、ガイドＲＮＡを有する細胞を選択することができ、方法は、選択マーカーまたはレポーター遺伝子を含む細胞を選択することをさらに含み得る。選択マーカーおよびレポーター遺伝子の例は、本明細書の他の場所に提供されている。一例として、選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、およびブラストサイジンＳデアミナーゼなどの薬物に対する耐性を付与するものであり得る。別の例示的な選択マーカーは、Ｓｈ ｂｌｅ遺伝子（Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン遺伝子）によってコードされるブレオマイシン耐性タンパク質であり、これは、ゼオシン（フレオマイシンＤ１）耐性を付与する。例えば、細胞は、ガイドＲＮＡ構築物で形質導入された細胞のみがスクリーニングを実施するために使用するために保存されるように、薬物（例えば、ピューロマイシン）で選択され得る。例えば、薬物は、ピューロマイシンまたはゼオシン（フレオマイシンＤ１）であり得る。
いくつかの方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、細胞の大部分が固有のガイドＲＮＡのうちの１つのみを受け取るように選択された濃度で導入される。例えば、ガイドＲＮＡがウイルス形質導入によって導入されている場合、細胞は、低い感染多重度で感染し、ほとんどの細胞が高い確率で１つのウイルス構築物のみを受け取ることを確実にすることができる。１つの特定の例として、感染の多重度は、約０．３未満であり得る。
複数の固有のガイドＲＮＡが導入される細胞集団は、任意の好適な数の細胞であり得る。例えば、細胞集団は、固有のガイドＲＮＡあたり約５０を超える、約１００を超える、約２００を超える、約３００を超える、約４００を超える、約５００を超える、約６００を超える、約７００を超える、約８００を超える、約９００を超える、または約１０００を超える細胞を含み得る。特定の例では、細胞集団は、固有のガイドＲＮＡあたり約３００個を超える細胞または約５００個を超える細胞を含む。
複数の固有のガイドＲＮＡは、任意の数の遺伝子を標的とすることができる。例えば、複数の固有のガイドＲＮＡは、約５０以上の遺伝子、約１００以上の遺伝子、約２００以上の遺伝子、約３００以上の遺伝子、約４００以上の遺伝子、約５００以上の遺伝子、約１０００以上の遺伝子、約２０００以上の遺伝子、約３０００以上の遺伝子、約４０００以上の遺伝子、約５０００以上の遺伝子、約１００００以上の遺伝子、または約２００００以上の遺伝子を標的とすることができる。いくつかの方法では、ガイドＲＮＡは、特定のシグナル伝達経路の遺伝子を標的とするように選択され得る。いくつかの方法では、固有のガイドＲＮＡのライブラリは、ゲノムワイドライブラリである。
複数の固有のガイドＲＮＡは、各個々の標的化遺伝子内の任意の数の配列を標的とすることができる。いくつかの方法では、複数の標的配列は、標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される。例えば、標的化された複数の遺伝子の各々において、平均して約２～約１０、約２～約９、約２～約８、約２～約７、約２～約６、約２～約５、約２～約４、または約２～３の固有の標的配列が標的化され得る。例えば、標的化された複数の遺伝子の各々において、平均して少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、または少なくとも約６の固有の標的配列が標的化され得る。特定の例として、標的化された複数の遺伝子の各々において、平均して約６つの標的配列が標的化され得る。別の特定の例として、標的化された複数の遺伝子の各々において、平均して約３～約６または約４～約６の標的配列が標的化される。
ガイドＲＮＡは、標的遺伝子内の任意の所望の位置を標的とすることができる。Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞を使用するいくつかのＣＲＩＳＰＲｎ方法では、可能な場合、各ガイドＲＮＡは、構成的エクソンを標的とする。いくつかの方法では、可能な場合、各ガイドＲＮＡは、５’構成的エクソンを標的とする。いくつかの方法では、各ガイドＲＮＡは、可能な場合、第１のエクソン、第２のエクソン、または第３のエクソン（遺伝子の５’末端から）を標的とする。ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞を使用するいくつかのＣＲＩＳＰＲａ方法では、可能な場合、各ガイドＲＮＡは、転写開始部位の２００ｂｐ上流内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とすることができる。ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞を使用するいくつかのＣＲＩＳＰＲａ方法では、各ガイドＲＮＡは、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つ以上のアダプター結合エレメントを含み得る。一例では、各ガイドＲＮＡは、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる２つのアダプター結合エレメントを含み、任意に、第１のアダプター結合エレメントは、１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第１のループ内にあり、第２のアダプター結合エレメントは、１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第２のループ内にある。例えば、アダプター結合エレメントは、配列番号３３に示される配列を含み得る。特定の例では、１つ以上のガイドＲＮＡの各々は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）部分に融合したＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）部分を含む単一のガイドＲＮＡであり、第１のループは、配列番号１７、１９、３０、または３１の残基１３～１６に対応するテトラループであり、第２のループは、配列番号１７、１９、３０、または３１の残基５３～５６に対応するステムループ２である。
ゲノム編集および拡大を可能にするために細胞集団を培養するステップは、任意の好適な期間であり得る。例えば、培養は、約２日～約１５日、約３日～約１４日、約５日～約１４日、約７日～約１４日、約９日～１４日、約１０日～約１４日、約１１日～約１４日、または約１２日～約１４日間であり得る。同様に、転写活性化および拡大を可能にするために細胞集団を培養するステップは、任意の好適な期間であり得る。例えば、培養は、約２日～約１５日、約３日～約１４日、約５日～約１４日、約７日～約１４日、約９日～１４日、約１０日～約１４日、約１１日～約１４日、または約１２日～約１４日間であり得る。
凝集陽性細胞集団および凝集陰性細胞集団を同定するステップは、細胞周期の進行を同期させることを含み得る。例えば、これを使用して、主にＳ期に濃縮されるか、または主にＧ２期に濃縮される細胞集団を得ることができる。特定の例として、同期は、二重チミジンブロックによって達成され得る。
凝集は、使用するレポーターに応じて、任意の好適な手段により決定され得る。例えば、第１のレポーターおよび第２のレポーターが蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対である方法では、凝集陽性細胞集団は、フローサイトメトリーにより同定され得る。
ガイドＲＮＡの存在量は、任意の好適な手段により決定され得る。特定の例では、存在量は、次世代シーケンシングによって決定される。次世代シーケンシングとは、サンガー法に基づかないハイスループットＤＮＡシーケンシング技術を指す。例えば、ガイドＲＮＡの存在量を決定することは、ガイドＲＮＡの読み取りカウントを測定することを含み得る。
いくつかの方法では、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対するガイドＲＮＡの存在量が、凝集陽性細胞集団および／または１つ以上の時点での培養された細胞集団に対して、凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ガイドＲＮＡは、凝集陰性細胞において濃縮されているとみなされる。いくつかの方法では、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対するガイドＲＮＡの存在量が、凝集陰性細胞集団および／または１つ以上の時点での培養された細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合、ガイドＲＮＡは、凝集陽性細胞において枯渇しているとみなされる。様々な濃縮／枯渇閾値もまた使用することができる。例えば、濃縮／枯渇閾値は、よりストリンジェントになるようにより高く設定することができる（例えば、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、または少なくとも約２．５倍）。あるいは、濃縮／枯渇閾値は、よりストリンジェントにならないようにより低く設定することができる（例えば、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．３倍、または少なくとも約１．２倍）。
いくつかの方法では、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対するガイドＲＮＡの存在量が、凝集陰性細胞集団および／または１つ以上の時点での培養された細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ガイドＲＮＡは、凝集陽性細胞において濃縮されているとみなされる。いくつかの方法では、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対するガイドＲＮＡの存在量が、凝集陽性細胞集団および／または１つ以上の時点での培養された細胞集団に対して、凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合、ガイドＲＮＡは、凝集陰性細胞において枯渇しているとみなされる。様々な濃縮／枯渇閾値もまた使用することができる。例えば、濃縮／枯渇閾値は、よりストリンジェントになるようにより高く設定することができる（例えば、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、または少なくとも約２．５倍）。あるいは、濃縮／枯渇閾値は、よりストリンジェントにならないようにより低く設定することができる（例えば、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．３倍、または少なくとも約１．２倍）。
一例では、存在量を決定するステップは、凝集陰性細胞集団に対して、および／または第１の時点のガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養された細胞集団に対して、および／または第２の時点のガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養された細胞集団に対して、凝集陽性集団において複数の固有のガイドＲＮＡの存在量を決定することを含み得る。同様に、存在量を決定するステップは、凝集陽性細胞集団に対して、および／または第１の時点のガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養された細胞集団に対して、および／または第２の時点のガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養された細胞集団に対して、凝集陰性集団において複数の固有のガイドＲＮＡの存在量を決定することを含み得る。例えば、第１の時点は、ゲノム編集および拡大を可能にするために、細胞集団を培養する第１の継代または細胞集団の培養の途中であり得、第２の時点は、ゲノム編集および拡大を可能にするために、細胞集団の培養の途中であり得る。例えば、第１の時点は、ガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体を形成するのに十分な時間の後、およびＣａｓタンパク質が複数の遺伝子を切断して遺伝子機能のノックアウトをもたらすか（ＣＲＩＳＰＲｎ）または複数の遺伝子を転写活性化する（ＣＲＩＳＰＲａ）のに十分な時間の後であり得る。しかしながら、いくつかの場合、第１の時点は、理想的には、感染直後（すなわち、さらなる拡大およびゲノム編集の前）にｇＲＮＡライブラリ表現を決定するため、ならびに各ｇＲＮＡ表現が第１の時点から第２の時点および最終時点までのさらなる時点までに進化するかどうかを決定するために最初の細胞継代であるべきである。これにより、ｇＲＮＡの存在量が第１の時点と第２の時点との間で変化しないことを確認することにより、スクリーニングの過程で細胞増殖の利点により濃縮されたｇＲＮＡ／標的を除外することが可能である。特定の例として、第１の時点は、培養および拡大の約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、または約８日後（例えば、培養および拡大から約７日で）であり得、第２の時点は、培養および拡大の約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、または約１２日後（例えば、約１０日）であり得る。例えば、第１の時点は、培養および拡大の約７日後であり得、第２の時点は、培養および拡張の約１０日後であり得る。
いくつかの方法では、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、凝集陽性細胞集団、第１の時点での培養された細胞集団、および第２の時点での培養された細胞集団に対して、凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、遺伝子は、次いで、タウ脱凝集の遺伝的修飾因子とみなされ得、遺伝子の破壊（ＣＲＩＳＰＲｎ）または転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）は、タウ脱凝集を促進する（または促進すると予期される）。代替的または追加的に、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、凝集陽性細胞集団および第２の時点での培養された細胞集団に対して、凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、遺伝子は、次いで、タウ脱凝集の遺伝的修飾因子とみなされ得、遺伝子の破壊（ＣＲＩＳＰＲｎ）または転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）は、タウ脱凝集を促進する（または促進すると予期される）。代替的または追加的に、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、凝集陰性細胞集団、第１の時点での培養された細胞集団、および第２の時点での培養された細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合、遺伝子は、次いで、タウ脱凝集の遺伝的修飾因子とみなされ得、遺伝子の破壊（ＣＲＩＳＰＲｎ）または転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）は、タウ脱凝集を促進する（または促進すると予期される）。代替的または追加的に、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、凝集陰性細胞集団および第２の時点での培養された細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合、遺伝子は、次いで、タウ脱凝集の遺伝的修飾因子とみなされ得、遺伝子の破壊（ＣＲＩＳＰＲｎ）または転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）は、タウ脱凝集を促進する（または促進すると予期される）。
いくつかの方法では、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、凝集陰性細胞集団、第１の時点での培養された細胞集団、および第２の時点での培養された細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、遺伝子は、次いで、タウ凝集の遺伝的修飾因子とみなされ得、遺伝子の破壊（ＣＲＩＳＰＲｎ）または転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）は、タウ凝集を促進または増強する（または促進もしくは増強すると予期される）。代替的または追加的に、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、凝集陰性細胞集団および第２の時点での培養された細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、遺伝子は、次いで、タウ凝集の遺伝的修飾因子とみなされ得、遺伝子の破壊（ＣＲＩＳＰＲｎ）または転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）は、タウ凝集を促進または増強する（または促進もしくは増強すると予期される）。代替的または追加的に、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、凝集陽性細胞集団、第１の時点での培養された細胞集団、および第２の時点での培養された細胞集団に対して、凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合、遺伝子は、次いで、タウ凝集の遺伝的修飾因子とみなされ得、遺伝子の破壊（ＣＲＩＳＰＲｎ）または転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）は、タウ凝集を促進または増強する（または促進もしくは増強すると予期される）。代替的または追加的に、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、凝集陽性細胞集団および第２の時点での培養された細胞集団に対して、凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合、遺伝子は、次いで、タウ凝集の遺伝的修飾因子とみなされ得、遺伝子の破壊（ＣＲＩＳＰＲｎ）または転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）は、タウ凝集を促進または増強する（または促進もしくは増強すると予期される）。
いくつかのＣＲＩＳＰＲｎ方法では、タウ脱凝集の遺伝的修飾因子として遺伝子を同定するために以下のステップが施され、遺伝子の破壊は、タウ脱凝集を促進する（または促進すると予期される）。同様に、いくつかのＣＲＩＳＰＲａ方法では、タウ脱凝集の遺伝的修飾因子として遺伝子を同定するために以下のステップが施され、遺伝子の転写活性化は、タウ脱凝集を促進する（または促進すると予期される）。第１のステップは、凝集陰性細胞集団に、複数の固有のガイドＲＮＡのうちのどれが存在するかを同定することを含む。第２のステップは、式ｎＣｎ’＊（ｘ－ｎ’）Ｃ（ｍ－ｎ）／ｘＣｍを使用して、同定されたガイドＲＮＡが存在するランダム確率を計算することを含み、ｘは、細胞集団に導入された様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｍは、ステップ（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｎは、遺伝子を標的とする細胞集団に導入された様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｎ’は、遺伝子を標的とするステップ（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡである。第３のステップは、ステップ（１）で同定されたガイドＲＮＡの平均濃縮スコアを計算することを含む。ガイドＲＮＡの濃縮スコアは、凝集陰性細胞集団におけるガイドＲＮＡの相対存在量を、凝集陽性細胞または第１もしくは第２の時点でのガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養された細胞集団におけるガイドＲＮＡの相対存在量で割ったものである。相対存在量は、ガイドＲＮＡの読み取りカウントを、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団の読み取りカウントで割ったものである。第４のステップは、遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが、存在するランダム確率を大幅に下回り、濃縮スコアの閾値を上回っている場合に遺伝子を選択することを含む。可能な閾値濃縮スコアは、上記で議論されている。特定の例として、閾値濃縮スコアは、約１．５倍に設定することができる。
いくつかのＣＲＩＳＰＲｎ方法では、タウ凝集の遺伝的修飾因子として遺伝子を同定するために以下のステップが施され、遺伝子の破壊は、タウ凝集を促進または増強する（または促進もしくは増強すると予期される）。同様に、いくつかのＣＲＩＳＰＲａ方法では、タウ凝集の遺伝的修飾因子として遺伝子を同定するために以下のステップが施され、遺伝子の転写活性化は、タウ凝集を促進または増強する（または促進もしくは増強すると予期される）。第１のステップは、凝集陽性細胞集団に、複数の固有のガイドＲＮＡのうちのどれが存在するかを同定することを含む。第２のステップは、式ｎＣｎ’＊（ｘ－ｎ’）Ｃ（ｍ－ｎ）／ｘＣｍを使用して、同定されたガイドＲＮＡが存在するランダム確率を計算することを含み、ｘは、細胞集団に導入された様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｍは、ステップ（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｎは、遺伝子を標的とする細胞集団に導入された様々な固有のガイドＲＮＡであり、ｎ’は、遺伝子を標的とするステップ（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡである。第３のステップは、ステップ（１）で同定されたガイドＲＮＡの平均濃縮スコアを計算することを含む。ガイドＲＮＡの濃縮スコアは、凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの相対存在量を、凝集陰性細胞または第１もしくは第２の時点でのガイドＲＮＡライブラリの導入後に培養された細胞集団におけるガイドＲＮＡの相対存在量で割ったものである。相対存在量は、ガイドＲＮＡの読み取りカウントを、複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団の読み取りカウントで割ったものである。第４のステップは、遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが、存在するランダム確率を大幅に下回り、濃縮スコアの閾値を上回っている場合に遺伝子を選択することを含む。可能な閾値濃縮スコアは、上記で議論されている。特定の例として、閾値濃縮スコアは、約１．５倍に設定することができる。
様々な固有のガイドＲＮＡという句で使用される場合の多様性は、固有のガイドＲＮＡ配列の数を意味する。それは存在量ではなく、定性的な「存在する」または「存在しない」である。様々な固有のガイドＲＮＡとは、固有のガイドＲＮＡ配列の数を意味する。様々な固有のガイドＲＮＡは、細胞集団に存在するすべての固有のガイドＲＮＡを同定するために、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって決定される。これは、ウイルスベクターの定常領域を認識して定常領域の間にあるｇＲＮＡを増幅する２つのプライマー、およびシーケンシングのために１つの定常領域を認識するプライマーを使用することによって行われる。試料に存在する各々の固有のガイドＲＮＡは、シーケンシングプライマーを使用して読み取りカウントを生成する。ＮＧＳの結果には、配列および配列に対応する読み取りの数もまた含まれる。リード数は各ガイドＲＮＡの濃縮スコアの計算に使用され、各固有の配列の存在により、どのガイドＲＮＡが存在するかがわかる。例えば、選択前に遺伝子に３つの固有のガイドＲＮＡがあり、３つすべてが選択後に保持される場合、ｎおよびｎ’の両方は３である。これらの数値は統計の計算に使用されるが、実際の読み取りカウントには使用されない。しかしながら、各ガイドＲＮＡの読み取りカウント（一例では、３つの固有のガイドＲＮＡの各々に対応する１００、２００、５０）は、濃縮スコアの計算に使用される。
上記または下記で引用されているすべての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、アクセッション番号などは、各項目が、参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されたのと同じ程度に、すべての目的に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列の異なるバージョンが違う時間にアクセッション番号に関連付けられている場合、本出願の有効な出願日においてアクセッション番号に関連付けられるバージョンを意味する。有効な出願日とは、該当する場合、アクセッション番号に関する実際の出願日以前または優先出願の出願日を意味する。同様に、刊行物、ウェブサイトなどの異なるバージョンが違う時間に公開されている場合、別段の指定のない限り、本出願の有効な出願日の直近に公開されたバージョンを意味する。別段に他の指示がない限り、本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様を、任意の他のものと組み合わせて使用することができる。本発明は、明瞭さおよび理解の目的に対し図表および例を介していくつかの詳細が記載されているが、添付の特許請求の範囲内で、ある特定の変化および改変を実施することができることが明らかになろう。
配列の簡単な説明
添付の配列表に列記されているヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基のための標準的な文字略語、およびアミノ酸のための三文字表記を使用して示されている。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端から始まって先へ（すなわち、各行で左から右へ）進み３’末端に至る標準規則に従っている。各ヌクレオチド配列の１本の鎖のみが示されているが、相補鎖は、示されている鎖を任意に参照することによって含まれると理解される。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が提供される場合、同じアミノ酸配列をコードするそのコドン縮重バリアントもまた提供されることが理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まって先へ（すなわち、各行で左から右へ）進みカルボキシ末端に至る標準規則に従っている。
実施例１．タウ凝集の遺伝的修飾因子を同定するためのゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクリーニングプラットフォームの開発
タンパク質の異常な凝集または線維化は、特にアルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）などのいくつかの神経変性疾患を含む、多くの疾患の決定的な特徴である。これらの疾患の多くでは、ある特定のタンパク質の不溶性凝集体への線維化は、疾患の特徴であるだけでなく、神経毒性の原因因子としても関係している。さらに、これらの疾患は、ステレオタイプのパターンに従って中枢神経系を介する凝集の病状の伝播によって特徴付けられ、このプロセスは疾患の進行と相関している。したがって、異常なタンパク質凝集のプロセス、または凝集体の細胞間増殖を変更する遺伝子および遺伝子経路の同定は、神経変性疾患の病因をよりよく理解する上で、ならびに治療的介入のための戦略を考案する上で大いに価値がある。
異常なタウタンパク質凝集のプロセスを変更する遺伝子および経路を同定するために、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲｎ）ｓｇＲＮＡライブラリを使用してゲノムワイドスクリーニングを行い、タウ疾患関連タンパク質凝集体によって「播種される」細胞の可能性を調節する遺伝子（すなわち、破壊された場合に、タウ線維化タンパク質の供給源に曝露されたときに細胞をタウ凝集体形成により感受性にさせる遺伝子）を同定するためのプラットフォームが開発された。そのような遺伝子の同定は、神経変性疾患の状況においてタウ凝集体を形成するニューロンの感受性を支配するタウ細胞間凝集体増殖のメカニズムおよび遺伝的経路を解明し得る。
スクリーニングは、ＣＦＰまたはＹＦＰのいずれかに融合したＰ３０１Ｓ病原性変異を有するタウ微小管結合ドメイン（ＭＢＤ）を含む、タウ４リピートドメインであるｔａｕ＿４ＲＤを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞からなるタウバイオセンサーヒト細胞株を用いた。つまり、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、蛍光タンパク質ＣＦＰまたは蛍光タンパク質ＹＦＰに融合した疾患関連タンパク質バリアントを安定して発現する２つの導入遺伝子：タウ４ＲＤ－ＣＦＰ／タウ４ＲＤ－ＹＦＰ（ＴＣＹ）を含み、タウリピートドメイン（４ＲＤ）は、Ｐ３０１Ｓ病原性変異を含む。図１を参照されたい。これらのバイオセンサー株では、タウ－ＣＦＰ／タウ－ＹＦＰタンパク質の凝集により、ドナーＣＦＰからアクセプターＹＦＰへの蛍光エネルギーの移動の結果であるＦＲＥＴシグナルが生成される。図２を参照されたい。タウ凝集体を含むＦＲＥＴ陽性細胞は、フローサイトメトリーによって選別および単離され得る。ベースラインでは、刺激されていない細胞は、最小限のＦＲＥＴシグナルで安定した可溶性状態でレポーターを発現する。刺激（例えば、種粒子のリポソームトランスフェクション）により、レポータータンパク質は凝集体を形成し、ＦＲＥＴシグナルを生成する。凝集体含有細胞はＦＡＣＳによって単離され得る。安定して増殖する凝集体含有細胞株Ａｇｇ［＋］は、Ａｇｇ［－］細胞株のクローン連続希釈によって単離され得る。
このタウバイオセンサー細胞株には、遺伝子スクリーニングに役立つようにいくつかの修飾がなされた。まず、これらのタウバイオセンサー細胞を、レンチウイルスベクターを介してＣａｓ９発現導入遺伝子（ＳｐＣａｓ９）を導入することによって修飾した。Ｃａｓ９を発現するクローントランスジェニック細胞株をブラストサイジンで選択し、クローン連続希釈によって単離して、単一細胞由来のクローンを得た。クローンを、ｑＲＴ－ＰＣＲによるＣａｓ９発現のレベル（図３Ａ）およびデジタルＰＣＲによるＤＮＡ切断活性（図３Ｂ）について評価した。相対Ｃａｓ９発現レベルも表３に示される。
具体的には、Ｃａｓ９変異効率を、２つの選択された標的遺伝子に対するｇＲＮＡをコードするレンチウイルスの形質導入の３日後および７日後にデジタルＰＣＲによって評価した。切断効率は、低発現クローンのＣａｓ９レベルによって制限された。最大活性を達成するには、適切なレベルのＣａｓ９発現を伴うクローンが必要であった。Ｃａｓ９発現がより低いいくつかの派生クローンは、標的配列を効率的に切断することはできなかったが、発現がより高いクローン（スクリーニングに使用されたものを含む）は、培養物において３日後に約８０％の効率で、ＰＥＲＫおよびＳＮＣＡ遺伝子における標的配列に変異を生成することができた。効率的な切断は、ｇＲＮＡ形質導入の３日後にすでに観察され、７日後にはわずかな改善しかなかった。クローン７Ｂ１０－Ｃ３を、後続のライブラリスクリーニングで使用する高性能クローンとして選択した。
次に、細胞をタウ播種活性に感作するための試薬および方法が開発された。タウの細胞間増殖は、凝集体含有細胞によって分泌されるタウ凝集活性からも生じ得る。タウ凝集の細胞増殖を研究するために、ＹＦＰに融合したＰ３０１Ｓ病原性変異を有するタウ微小管結合ドメイン（ＭＢＤ）を含む、タウリピートドメインであるｔａｕ＿４ＲＤを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞からなるタウ－ＹＦＰ細胞株のサブクローンを得た。図５を参照されたい。タウ－ＹＦＰタンパク質が凝集状態で安定して存在する細胞（Ａｇｇ［＋］）は、これらの細胞によって安定して発現されるタウ－ＹＦＰタンパク質の凝集を播種するために、リポフェクタミン試薬と混合した組換え線維化タウでこれらのタウ－ＹＦＰ細胞を処理することによって得た。次いで、「播種された」細胞を連続希釈して、単一細胞由来のクローンを得た。次いで、これらのクローンを拡大させて、タウ－ＹＦＰ凝集体がすべての細胞において安定して持続し、経時的に増殖および複数回継代するクローン細胞株を同定した。これらのｔａｕ－ＹＦＰ＿Ａｇｇ［＋］クローンの１つであるＣｌｏｎｅ＿１８を使用して、コンフルエントなｔａｕ－ＹＦＰ＿Ａｇｇ［＋］細胞上に４日間存在している培地を収集することにより、馴化培地を生成した。次いで、馴化培地（ＣＭ）をナイーブバイオセンサータウ－ＣＦＰ／タウ－ＹＦＰ細胞に３：１のＣＭ：新鮮な培地の比率で適用し、これらのレシピエント細胞のごく一部の割合でタウ凝集が誘導され得るようにした。リポフェクタミンは使用されなかった。リポフェクタミンは、レシピエント細胞をだましてリポフェクタミンを使用してタウ凝集を強制／増加させることなく、可能な限り生理学的であるアッセイを行うために使用されなかった。フローサイトメトリーを使用して凝集の尺度としてＦＲＥＴシグナルを生成する細胞の割合を評価することによって測定されるように、馴化培地は一貫して約０．１％の細胞においてＦＲＥＴを誘導した。図６を参照されたい。結論として、タウ－ＹＦＰ＿Ａｇｇ［＋］細胞は、ＦＲＥＴシグナルを生成することができないが、それらはタウの播種の供給源を提供することができる。
実施例２．タウ凝集の遺伝的修飾因子を同定するためのゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクリーニング
ＦＲＥＴ［＋］細胞における濃縮ｓｇＲＮＡとしてのタウ凝集の修飾因子遺伝子を明らかにするために、凝集物のないＣａｓ９発現タウ－ＣＦＰ／タウ－ＹＦＰバイオセンサー細胞（Ａｇｇ［－］）に、各標的遺伝子にノックアウト変異を導入するためのレンチウイルス送達アプローチを使用して、２つのヒトゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡライブラリで形質導入した。図４を参照されたい。各ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡライブラリは、機能的ノックアウトのために５’構成的エクソンを標的とし、遺伝子あたり平均約３のｓｇＲＮＡをカバーする（組み合わせた２つのライブラリにおいて遺伝子あたり合計６のｇＲＮＡ）。読み取りカウントの分布（つまり、ライブラリ内の各ｇＲＮＡの表現）は正常であり、各ライブラリで同様であった。ｓｇＲＮＡは、オフターゲットゲノム配列とのミスマッチが２つ以下のｓｇＲＮＡを回避することにより、オフターゲット効果を回避するように設計された。ライブラリは、１０００の非標的化対照ｓｇＲＮＡを含む１９，０５０のヒト遺伝子および１８６４のｍｉＲＮＡをカバーする。ライブラリを、感染多重度（ＭＯＩ）＜０．３で、ｓｇＲＮＡあたり＞３００細胞のカバレッジで形質導入した。タウバイオセンサー細胞は、ピューロマイシンの選択の下で増殖し、細胞ごとに固有のｓｇＲＮＡの組み込みおよび発現を含む細胞を選択した。ピューロマイシンの選択は、１μｇ／ｍＬでの形質導入の２４時間後に開始した。５つの独立したスクリーニング複製を一次スクリーニングで使用した。
完全な形質導入細胞集団の試料を、形質導入後３日目および６日目の細胞継代時に収集した。６日目の継代後、細胞を馴化培地で増殖させて、播種活性に感作させた。１０日目に、蛍光アシスト細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、ＦＲＥＴ［＋］細胞の亜集団を特異的に単離した。図７を参照されたい。スクリーニングは、５回の反復実験で構成された。組み込まれたｓｇＲＮＡ構築物のＤＮＡ単離およびＰＣＲ増幅により、各時点でのｓｇＲＮＡレパートリーの次世代シーケンシング（ＮＧＳ）による特徴付けが可能になった。
ＮＧＳデータの統計分析により、３日目および６日目の初期の時点でのｓｇＲＮＡレパートリーと比較して、５回の実験の１０日目のＦＲＥＴ［＋］亜集団で濃縮されたｓｇＲＮＡの同定が可能になった。ＮＧＳ分析のための相対存在量および濃縮の概念は図８に例示される。潜在的なタウ修飾因子を同定する第１の戦略は、ＤＮＡシーケンシングを使用して、ＤＥＳｅｑアルゴリズムを使用して各試料のｓｇＲＮＡ読み取りカウントを生成し、１０日目対３日目または１０日目対６日目で（しかし、６日目対３日目ではない）より豊富なｓｇＲＮＡを見つけることであった（倍率変化（ｆｃ）≧１．５および負の二項検定ｐ＜０．０１）。Ｆｃ≧１．５は、（１０日目のカウントの平均）／（３日目または６日目のカウントの平均）≧１．５の比率を意味する。Ｐ＜０．０１は、１０日目および３日目または６日目のカウント＜０．０１の間に統計的差異がない可能性を意味する。ＤＥＳｅｑアルゴリズムは、「配列カウントデータの差次的発現解析」に広く使用されているアルゴリズムである。例えば、Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１：Ｒ１０６を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
具体的には、各ライブラリで２つの比較１０日目対３日目、および１０日目対６日目を使用して、有意なｓｇＲＮＡを同定した。これら４つの比較の各々について、ＤＥＳｅｑアルゴリズムを使用し、有意であるとみなされるカットオフ閾値は、倍率変化≧１．５ならびに負の二項検定ｐ＜０．０１であった。各ライブラリのこれらの比較の各々で有意なガイドが同定されると、次の２つの基準のいずれかを満たす場合、遺伝子は重要であるとみなされました：（１）１つの比較（１０日目対３日目または１０日目対６日目のいずれか）でその遺伝子に対応する少なくとも２つのｓｇＲＮＡが有意であるとみなされた；および（２）両方の比較（１０日目対３日目および１０日目対６日目）で少なくとも１つのｓｇＲＮＡが有意であった。このアルゴリズムを使用して、第１のライブラリから５つの遺伝子が重要であり、第２のライブラリから４つの遺伝子が有意であると同定した。表４を参照されたい。
しかしながら、第１の戦略では、あるレベルの読み取りカウントを必要とし、各実験グループ内の均一性はストリンジェントでありすぎる場合がある。同じｓｇＲＮＡの場合、スクリーニングライブラリの初期ウイルスカウント、感染または遺伝子編集効率、および遺伝子編集後の相対増殖率など、多くの要因により、各実験グループ内の試料（３日目、６日目、または１０日目の試料）間で読み取りカウントのばらつきが生成され得た。したがって、正確な読み取りカウントではなく、１０日目（選択後）の各試料における遺伝子あたりのガイドの陽性発生（読み取りカウント＞３０）に基づいて、第２の戦略も使用した。ライブラリサイズ（ｘ）、遺伝子あたりのガイド数（ｎ）、および選択後の試料における陽性ガイドの総数（ｍ）を考慮して、選択後の試料におけるガイドの数（ｎ’）を積極的に観察するための正式な統計的ｐ値を計算した（「数」はｓｇＲＮＡタイプ（すなわち、固有のガイドＲＮＡ配列）を指し、読み取りカウントではない）（ｐｎ’＝ｎＣｎ’＊（ｘ－ｎ’）Ｃ（ｍ－ｎ）／ｘＣｍ）。偶然存在しているｎ’ガイドの確率は、ｐｎ’＝ｎＣｎ’＊（ｘ－ｎ’）Ｃ（ｍ－ｎ）／ｘＣｍである。遺伝子ｇが偶然存在するｎ’ガイド以上の確率は次のように計算された。
Figure 0007461368000006
 選択前と比較した選択後の遺伝子の読み取りカウントの全体的な濃縮を、陽性遺伝子を同定するための追加のパラメータとして使用した：（相対存在量＝［遺伝子の読み取りカウント］／［すべての遺伝子の読み取りカウント］および選択後の濃縮＝［選択後の相対存在量］／［選択前の相対存在量］）。
より具体的には、第２の戦略は、ＣＲＩＳＰＲ陽性選択のための新しくより感度の高い分析方法である。ＣＲＩＳＰＲ陽性選択の目標は、ＤＮＡシーケンシングを使用して、ｓｇＲＮＡによる摂動が表現型と相関している遺伝子を同定することである。ノイズバックグラウンドを低減するために、これらの実験では通常、同じ遺伝子の複数のｓｇＲＮＡと実験の複製が一緒に使用される。しかしながら、現在一般的に使用されている統計分析方法は、同じ遺伝子のｓｇＲＮＡ間ならびに技術的な繰り返し間である程度の均一性／一致を必要とし、良好に機能しない。これは、多くの考えられる理由（例えば、異なる感染または遺伝子編集効率、スクリーニングライブラリにおける初期ウイルスカウント、および同じ表現型を有する他のｓｇＲＮＡの存在）により、これらの方法では同じ遺伝子のｓｇＲＮＡおよび繰り返し間の大きな変動を処理できないためである。対照的に、大きな変動に対してロバストな方法を開発した。これは、各ｓｇＲＮＡの正確な読み取りカウントではなく、個々の実験における遺伝子あたりのガイドの陽性発生に基づいている。各実験におけるライブラリのサイズ、遺伝子あたりのｓｇＲＮＡの数、および陽性ｓｇＲＮＡの総数を考慮して、実験の繰り返しにわたってｓｇＲＮＡの数を積極的に観察するための正式な統計的ｐ値を計算する。表現型の選択前後の相対ｓｇＲＮＡ配列読み取り濃縮もパラメータとして使用される。本方法は、ＤＥＳｅｑ、ＭＡＧＥＣＫなどの最新の広く使用されている方法よりも良好に成し遂げられる。具体的には、この方法には以下の手順が含まれる。
（１）各実験について、表現型が陽性の細胞に存在するあらゆるガイドを同定する。
（２）遺伝子レベルで、各実験にガイドが存在するランダム確率を計算する：ｎＣｎ’＊（ｘ－ｎ’）Ｃ（ｍ－ｎ）／ｘＣｍ（ｘは、表現型選択前の様々なガイドであり、ｍは、表現型選択後の様々なガイドであり、ｎは、表現型選択前の遺伝子の様々なガイドであり、ｎ’は、表現型選択後の遺伝子の様々なガイドである）。複数の実験にわたって存在する全体的な確率（いくつかの実験から生成されたｐ値に対して単一のｐ値を生成する）は、フィッシャーの組み合わせ確率検定によって計算される（参照：Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒ．Ａ．；Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒ．Ａ（１９４８）“Ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ ａｎｄ ａｎｓｗｅｒｓ ＃１４”Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｉａｎ）。すなわち、検定統計量φは、最初に複数の実験からのｐ値を使用して計算され：
Figure 0007461368000007
 、ｐｋは、ｋ番目の実験で計算されたｐ値であり、Ｋは、実験の総数である。次いで、Ｋ回の実験で合計されたｐ値は、２＊Ｋの自由度でカイ２乗分布の下でφの値を観測する確率に等しくなる。あるいは、複数の実験にわたって存在する全体的な可能性は、各実験から得られた上記の計算された可能性を乗算することによって計算される。
（３）遺伝子レベルでのガイドの平均濃縮の計算：濃縮スコア＝選択後の相対存在量／選択前の相対存在量。相対存在量＝遺伝子のガイドの読み取りカウント／すべてのガイドの読み取りカウント。
（４）存在するランダム確率よりも大幅に下回り、かつある特定の濃縮スコアを上回っている遺伝子を選択する。
２つの異なるアプローチ（いずれかまたは両方）によってＦＲＥＴ［＋］細胞が濃縮されていると同定された標的遺伝子のうちの１４個を、読み取りカウントデータに基づく目視検査後のさらなる検証のための上位の候補として選択した。表５を参照されたい。３０の個々のｓｇＲＮＡを、検証のために二次スクリーニングで試験した。二次スクリーニングの概略図を図９に示し、結果を図１０に示す。複数の試験されたｓｇＲＮＡによる標的遺伝子２または標的遺伝子８のいずれかの破壊は、タウ播種活性の供給源（馴化培地）に応答してタウ凝集体を形成する細胞の感受性を増加させた。ＦＲＥＴシグナルの誘導は、これら２つの標的のいずれかの破壊とともに、細胞内で１５～２０倍増加した。これらの２つの標的遺伝子の破壊は、馴化培地に応答してタウ凝集体の形成を増加させましたが、新鮮な培地には応答しなかった。図１１を参照されたい。
次いで、標的遺伝子２および８を用いたさらなる実験を行い、各遺伝子の標的化がタウ凝集を促進することをさらに検証した。図１２を参照されたい。標的遺伝子２に対する２つの異なるｓｇＲＮＡを試験し、標的遺伝子８に対する１つのｓｇＲＮＡを使用した。非標的化ｓｇＲＮＡを陰性対照として使用した。０日目に各ガイドＲＮＡに対して４つの独立したレンチウイルス形質導入を行った。６日目に、馴化培地を用いたタウ播種を、リポフェクタミンありまたはなしで行い、ｑＲＴ－ＰＣＲのために試料を収集した。ｑＲＴ－ＰＣＲのデータを図１３に示す。標的遺伝子２を標的化する２つのｓｇＲＮＡの各々は、標的遺伝子２のｍＲＮＡ発現を低減し、標的遺伝子８を標的化するｇＲＮＡは、標的遺伝子８の発現を低減した。１０日目に、ＦＲＥＴシグナルの誘導を評価するためにＦＡＣＳ分析を行った。タウ凝集は、標的遺伝子２を標的化する２つのｓｇＲＮＡおよび標的遺伝子８を標的化するｇＲＮＡの各々によって増加された。図１５を参照されたい。１３日目に、ウエスタンブロット分析のために試料を収集した。ウエスタンブロットの結果を図１４に示す。ｍＲＮＡ発現を評価するｑＲＴ－ＰＣＲ実験と同様に、タンパク質２の発現は、標的遺伝子２を標的化する２つのｓｇＲＮＡによって低減され、タンパク質８の発現は、標的遺伝子８を標的化するｓｇＲＮＡによって低減された。
タウ凝集の修飾因子としての標的遺伝子２および８のさらなる検証を、検証のために個々の標的遺伝子２ノックダウンクローンおよび個々の標的遺伝子８ノックダウンクローンを単離することによって行った。凝集体を含まないＣａｓ９発現タウ－ＣＦＰ／タウ－ＹＦＰバイオセンサー細胞（Ａｇｇ［－］）に、標的遺伝子２のｓｇＲＮＡ １、標的遺伝子８のｓｇＲＮＡ ５、または非標的化ｓｇＲＮＡを発現するレンチウイルスを形質導入した。次いで、連続的なクローン希釈を行い、個々のクローンを選択した。標的遺伝子２のｍＲＮＡおよび標的遺伝子８のｍＲＮＡのレベルを、ｑＲＴ－ＰＣＲによって評価し、タンパク質２およびタンパク質８のレベルを、ウエスタンブロットによって評価した。各標的遺伝子２のｓｇＲＮＡクローンは、標的遺伝子２のｍＲＮＡ発現（データには示さず）およびタンパク質２発現を低減し（図１６）、各標的遺伝子８のｓｇＲＮＡクローンは、標的遺伝子８のｍＲＮＡ発現（データには示さず）およびタンパク質８を低減した（図１６）。
次に、各クローンを馴化培地で４日間播種し、ＦＲＥＴ分析を行い、タウ凝集を評価した。ノックダウンクローンは、タウ凝集の修飾因子として標的遺伝子２および８を検証する。図１７を参照されたい。
次いで、個々のクローンを次世代シーケンシングによってさらに特徴付けし、標的遺伝子２および標的遺伝子８の遺伝子座にどのような修飾がなされたかを判定した。修飾を、以下の表６に要約する。ほとんどすべての変異クローンには、いくらかの割合の野生型対立遺伝子が含まれる。ＦＲＥＴ［＋］細胞（タウ凝集活性）の割合は、切断部位での非相同末端結合によって引き起こされる挿入／欠失の割合と相関していた（すなわち、タウ凝集は、野生型対立遺伝子の割合と逆相関し、野生型対立遺伝子の割合が低いほど、Ｆｒｅｔ［＋］細胞の割合が高くなる）。図１６および表６を参照されたい。
タウのリン酸化もまた、ウエスタンブロットによって各クローンにおいて評価した。タウは、標的遺伝子８ｓｇＲＮＡクローン５．７のＳ２６２およびＳ３５６で高リン酸化されることが見出された。図１８を参照のこと。この実験では、タウが過剰リン酸化されていないクローンでも依然としてＦＲＥＴ誘導が増強されるように見えたが、クローン５．７は非常に不安定であり、標的遺伝子８は多くの生物学的プロセスに関与しているため、一般的な結論を導き出すことはできなかった。マウス一次皮質ニューロンでのさらなる実験は、レンチウイルス送達を介してＣａｓ９および標的遺伝子２のｓｇＲＮＡで処理され、培養物中で１４日間維持されたマウス一次皮質ニューロンの細胞体樹状突起コンパートメントでホスホ－タウ（Ｓ３５６）染色が増加することを示した（データには示さず）。
この検証により、タウ播種活性の外部供給源に曝露されたときにタウ播種に対する細胞の感受性を調節することができる遺伝子の同定における一次スクリーニングアプローチの価値が確認された。したがって、スクリーニングによって同定された標的は、神経変性疾患の状況でタウ病理の細胞間増殖における関連する標的であり得、さらに調査される。
実施例３．転写活性化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ライブラリを使用してタウ凝集の遺伝的修飾因子を同定するためのゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクリーニングプラットフォームの開発
異常なタウタンパク質凝集のプロセスを変更する遺伝子および経路をさらに同定するために、転写活性化（ｈＳＡＭ）ＣＲＩＳＰＲａ ｓｇＲＮＡライブラリを使用してゲノムワイドスクリーニングを行い、タウ疾患関連タンパク質凝集体によって「播種される」細胞の可能性を調節する遺伝子（すなわち、転写活性化された場合に、タウ線維化タンパク質の供給源に曝露されたときに細胞をタウ凝集体形成により感受性にさせる遺伝子）を同定するためのプラットフォームが開発された。そのような遺伝子の同定は、神経変性疾患の状況においてタウ凝集体を形成するニューロンの感受性を支配するタウ細胞間凝集体増殖のメカニズムおよび遺伝的経路を解明し得る。
スクリーニングは、ＣＦＰまたはＹＦＰのいずれかに融合したＰ３０１Ｓ病原性変異を有するタウ微小管結合ドメイン（ＭＢＤ）を含む、タウ４リピートドメインであるｔａｕ＿４ＲＤを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞からなるタウバイオセンサーヒト細胞株を用いた。つまり、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、蛍光タンパク質ＣＦＰまたは蛍光タンパク質ＹＦＰに融合した疾患関連タンパク質バリアントを安定して発現する２つの導入遺伝子：タウ４ＲＤ－ＣＦＰ／タウ４ＲＤ－ＹＦＰ（ＴＣＹ）を含み、タウリピートドメイン（４ＲＤ）は、Ｐ３０１Ｓ病原性変異を含む。図１を参照されたい。これらのバイオセンサー株では、タウ－ＣＦＰ／タウ－ＹＦＰタンパク質の凝集により、ドナーＣＦＰからアクセプターＹＦＰへの蛍光エネルギーの移動の結果であるＦＲＥＴシグナルが生成される。図２を参照されたい。タウ凝集体を含むＦＲＥＴ陽性細胞は、フローサイトメトリーによって選別および単離され得る。ベースラインでは、刺激されていない細胞は、最小限のＦＲＥＴシグナルで安定した可溶性状態でレポーターを発現する。刺激（例えば、種粒子のリポソームトランスフェクション）により、レポータータンパク質は凝集体を形成し、ＦＲＥＴシグナルを生成する。凝集体含有細胞はＦＡＣＳによって単離され得る。安定して増殖する凝集体含有細胞株Ａｇｇ［＋］は、Ａｇｇ［－］細胞株のクローン連続希釈によって単離され得る。
このタウバイオセンサー細胞株には、遺伝子スクリーニングに役立つようにいくつかの修飾がなされた。まず、このバイオセンサー細胞株は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＳＡＭ転写活性化系の構成要素であるｄＣａｓ９－ＶＰ６４およびＭＳ２－Ｐ６５－ＨＳＦ１を発現するように、さらにトランスジェニックに修飾された。レンチウイルスｄＣａｓ９－ＶＰ６４およびＭＳ２－Ｐ６５－ＨＳＦ１構築物は、それぞれ配列番号４２および４３に提供される。クローンを、後続のライブラリスクリーニングで使用する高性能クローンとして選択した。このクローンを、選択された標的遺伝子の活性化におけるその有効性について検証した。
次に、実施例１のように細胞をタウ播種活性に感作するための試薬および方法が開発された。あるいは、より多くの凝集が必要な場合、実施例５のように、Ａｇｇ［＋］クローンからの細胞溶解物の使用が用いられ得る。
実施例４．転写活性化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ライブラリを使用してタウ凝集の遺伝的修飾因子を同定するためのゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクリーニング
ＦＲＥＴ［＋］細胞における濃縮ｓｇＲＮＡとしてのタウ凝集の修飾因子遺伝子をさらに明らかにするために、凝集物のないＳＡＭ発現タウ－ＣＦＰ／タウ－ＹＦＰバイオセンサー細胞（Ａｇｇ［－］）に、各標的遺伝子を転写活性化するためのレンチウイルス送達アプローチを使用して、ヒトゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ ｈＳＡＭ ｓｇＲＮＡライブラリで形質導入した。ライブラリのｓｇＲＮＡは、転写開始部位の２００ｂｐ上流内の部位を標的とし、遺伝子あたりの平均カバレッジは約３のｓｇＲＮＡである。ｓｇＲＮＡは、オフターゲットゲノム配列とのミスマッチが２つ以下のｓｇＲＮＡを回避することにより、オフターゲット効果を回避するように設計された。ライブラリは１８，９４６のヒト遺伝子をカバーする。ライブラリを、感染多重度（ＭＯＩ）＜０．３で、ｓｇＲＮＡあたり＞３００細胞のカバレッジで形質導入した。タウバイオセンサー細胞は、ゼオシンの選択の下で増殖し、細胞ごとに固有のｓｇＲＮＡの組み込みおよび発現を含む細胞を選択した。５つの独立したスクリーニング複製を一次スクリーニングで使用した。
完全な形質導入細胞集団の試料を、形質導入後３日目および６日目の細胞継代時に収集した。６日目の継代後、細胞を馴化培地で増殖させて、播種活性に感作させた。１０日目に、蛍光アシスト細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、ＦＲＥＴ［＋］細胞の亜集団を特異的に単離した。組み込まれたｓｇＲＮＡ構築物のＤＮＡ単離およびＰＣＲ増幅により、各時点でのｓｇＲＮＡレパートリーの次世代シーケンシング（ＮＧＳ）による特徴付けが可能になった。
データ分析および統計分析は実施例２で使用されたアプローチを反映しているため、実施例２のすべての詳細がここで繰り返されるわけではない。ＮＧＳデータの統計分析により、３日目および６日目の初期の時点でのｓｇＲＮＡレパートリーと比較して、複数の実験の１０日目のＦＲＥＴ［＋］亜集団で濃縮されたｓｇＲＮＡの同定が可能になった。潜在的なタウ修飾因子を同定する第１の戦略は、ＤＮＡシーケンシングを使用して、ＤＥＳｅｑアルゴリズムを使用して各試料のｓｇＲＮＡ読み取りカウントを生成し、１０日目対３日目または１０日目対６日目で（しかし、６日目対３日目ではない）より豊富なｓｇＲＮＡを見つけることであった（倍率変化（ｆｃ）≧１．５および負の二項検定ｐ＜０．０１）。Ｆｃ≧１．５は、（１０日目のカウントの平均）／（３日目または６日目のカウントの平均）≧１．５の比率を意味する。Ｐ＜０．０１は、１０日目および３日目または６日目のカウント＜０．０１の間に統計的差異がない可能性を意味する。ＤＥＳｅｑアルゴリズムは、「配列カウントデータの差次的発現解析」に広く使用されているアルゴリズムである。例えば、Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１：Ｒ１０６を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
具体的には、各ライブラリで２つの比較１０日目対３日目、および１０日目対６日目を使用して、有意なｓｇＲＮＡを同定した。これら４つの比較の各々について、ＤＥＳｅｑアルゴリズムを使用し、有意であるとみなされるカットオフ閾値は、倍率変化≧１．５ならびに負の二項検定ｐ＜０．０１であった。各ライブラリのこれらの比較の各々で有意なガイドが同定されると、次の２つの基準のいずれかを満たす場合、遺伝子は重要であるとみなされました：（１）１つの比較（１０日目対３日目または１０日目対６日目のいずれか）でその遺伝子に対応する少なくとも２つのｓｇＲＮＡが有意であるとみなされた；および（２）両方の比較（１０日目対３日目および１０日目対６日目）で少なくとも１つのｓｇＲＮＡが有意であった。
しかしながら、第１の戦略では、あるレベルの読み取りカウントを必要とし、各実験グループ内の均一性はストリンジェントでありすぎる場合がある。同じｓｇＲＮＡの場合、スクリーニングライブラリの初期ウイルスカウント、感染または遺伝子編集効率、および遺伝子編集後の相対増殖率など、多くの要因により、各実験グループ内の試料（３日目、６日目、または１０日目の試料）間で読み取りカウントのばらつきが生成され得た。したがって、正確な読み取りカウントではなく、１０日目（選択後）の各試料における遺伝子あたりのガイドの陽性発生（読み取りカウント＞３０）に基づいて、第２の戦略も使用した。ライブラリサイズ（ｘ）、遺伝子あたりのガイド数（ｎ）、および選択後の試料における陽性ガイドの総数（ｍ）を考慮して、選択後の試料におけるガイドの数（ｎ’）を積極的に観察するための正式な統計的ｐ値を計算した（「数」はｓｇＲＮＡタイプ（すなわち、固有のガイドＲＮＡ配列）を指し、読み取りカウントではない）（ｐｎ’＝ｎＣｎ’＊（ｘ－ｎ’）Ｃ（ｍ－ｎ）／ｘＣｍ）。偶然存在しているｎ’ガイドの確率は、ｐｎ’＝ｎＣｎ’＊（ｘ－ｎ’）Ｃ（ｍ－ｎ）／ｘＣｍである。遺伝子ｇが偶然存在するｎ’ガイド以上の確率は次のように計算された。
Figure 0007461368000010
 選択前と比較した選択後の遺伝子の読み取りカウントの全体的な濃縮を、陽性遺伝子を同定するための追加のパラメータとして使用した：（相対存在量＝［遺伝子の読み取りカウント］／［すべての遺伝子の読み取りカウント］および選択後の濃縮＝［選択後の相対存在量］／［選択前の相対存在量］）。
より具体的には、第２の戦略は、ＣＲＩＳＰＲ陽性選択のための新しくより感度の高い分析方法である。ＣＲＩＳＰＲ陽性選択の目標は、ＤＮＡシーケンシングを使用して、ｓｇＲＮＡによる転写活性化が表現型と相関している遺伝子を同定することである。ノイズバックグラウンドを低減するために、これらの実験では通常、同じ遺伝子の複数のｓｇＲＮＡと実験の複製が一緒に使用される。しかしながら、現在一般的に使用されている統計分析方法は、同じ遺伝子のｓｇＲＮＡ間ならびに技術的な繰り返し間である程度の均一性／一致を必要とし、良好に機能しない。これは、多くの考えられる理由（例えば、異なる感染または遺伝子編集効率、スクリーニングライブラリにおける初期ウイルスカウント、および同じ表現型を有する他のｓｇＲＮＡの存在）により、これらの方法では同じ遺伝子のｓｇＲＮＡおよび繰り返し間の大きな変動を処理できないためである。対照的に、大きな変動に対してロバストな方法を開発した。これは、各ｓｇＲＮＡの正確な読み取りカウントではなく、個々の実験における遺伝子あたりのガイドの陽性発生に基づいている。各実験におけるライブラリのサイズ、遺伝子あたりのｓｇＲＮＡの数、および陽性ｓｇＲＮＡの総数を考慮して、実験の繰り返しにわたってｓｇＲＮＡの数を積極的に観察するための正式な統計的ｐ値を計算する。表現型の選択前後の相対ｓｇＲＮＡ配列読み取り濃縮もパラメータとして使用される。本方法は、ＤＥＳｅｑ、ＭＡＧＥＣＫなどの最新の広く使用されている方法よりも良好に成し遂げられる。具体的には、この方法には以下の手順が含まれる。
（１）各実験について、表現型が陽性の細胞に存在するあらゆるガイドを同定する。
（２）遺伝子レベルで、各実験にガイドが存在するランダム確率を計算する：ｎＣｎ’＊（ｘ－ｎ’）Ｃ（ｍ－ｎ）／ｘＣｍ（ｘは、表現型選択前の様々なガイドであり、ｍは、表現型選択後の様々なガイドであり、ｎは、表現型選択前の遺伝子の様々なガイドであり、ｎ’は、表現型選択後の遺伝子の様々なガイドである）。複数の実験にわたって存在する全体的な確率（いくつかの実験から生成されたｐ値に対して単一のｐ値を生成する）は、フィッシャーの組み合わせ確率検定によって計算される（参照：Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒ．Ａ．；Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒ．Ａ（１９４８）“Ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ ａｎｄ ａｎｓｗｅｒｓ ＃１４”Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｉａｎ）。すなわち、検定統計量φは、最初に複数の実験からのｐ値を使用して計算され：
Figure 0007461368000011
 、ｐｋは、ｋ番目の実験で計算されたｐ値であり、Ｋは、実験の総数である。次いで、Ｋ回の実験で合計されたｐ値は、２＊Ｋの自由度でカイ２乗分布の下でφの値を観測する確率に等しくなる。あるいは、複数の実験にわたって存在する全体的な可能性は、各実験から得られた上記の計算された可能性を乗算することによって計算される。
（３）遺伝子レベルでのガイドの平均濃縮の計算：濃縮スコア＝選択後の相対存在量／選択前の相対存在量。相対存在量＝遺伝子のガイドの読み取りカウント／すべてのガイドの読み取りカウント。
（４）存在するランダム確率よりも大幅に下回り、かつある特定の濃縮スコアを上回っている遺伝子を選択する。
合計３４個の標的遺伝子（４２個の異なるｓｇＲＮＡにより標的とされる）は、２つの異なるアプローチ（いずれかのアプローチまたは両方）によってＦＲＥＴ［＋］細胞が濃縮されていると同定された。
実施例５．タウ播種用のタウ－ＹＦＰクローン１８ Ａｇｇ［＋］細胞溶解物の調製および検証
次に、破壊されたときにタウの凝集を低減する標的遺伝子を同定したかった（種の取り込みをブロックする、オリゴマーまたは線維の形成を阻害する、それらの分解を促進することによって、またはいくつかの他のメカニズムによって）。タウの凝集を防止するｓｇＲＮＡのそのようなスクリーニングを開発するには、強力で大量に簡単に生成することができる播種活性の供給源が必要であった。この実施例に記載されるように、タウ－ＹＦＰ Ａｇｇ［＋］クローン１８からの全細胞溶解物が、タウ凝集およびＦＲＥＴシグナルを誘導することができるが、タウ－ＹＦＰ Ａｇｇ［－］からの溶解物は誘導しないことを発見した。全細胞溶解物は、馴化培地または組換えタウ線維よりも（リポフェクタミンを含まない）タウ活性の播種においてはるかにより強力である。より大きな割合の細胞（例えば、＞５０％）で凝集（ＦＲＥＴ）を誘導するために、全細胞溶解物をリポフェクタミンと組み合わせて使用してみた。また、それ自体が細胞に対して毒性のない緩衝液中に細胞溶解物を収集する方法を開発する必要があった。本明細書に記載される実験では、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）＋プロテアーゼ阻害剤を使用して細胞を収集し、超音波処理して細胞を溶解した。３分間超音波処理した細胞溶解物が最良に働いた。
細胞を次のように超音波処理用に調製した：（１）タウ－ＹＦＰ Ａｇｇ［－］細胞の６ｘＴ１７５プレートおよびタウ－ＹＦＰクローン１８ Ａｇｇ［＋］細胞の６ｘＴ１７５プレート（約５０００万個の細胞／Ｔ１７５）を取る；（２）フラスコを１０ｍＬのＰＢＳですすぎ、次いで細胞を５ｍＬのＰＢＳにこすり取る；（３）２ｘＴ１７５を１５ｍＬチューブに収集し、次いでこれらの２ｘＴ１７５を合計５ｍＬのＰＢＳですすぎ、それを１５ｍＬチューブに添加して最終体積を１５ｍＬにする（３つのチューブのタウ－ＹＦＰ Ａｇｇ［－］細胞および３つのチューブのタウ－ＹＦＰクローン１８ Ａｇｇ［＋］細胞を有するべきである）；（４）チューブを１０００ｒｐｍで５分間スピンし、吸引し、４ｍＬのＰＢＳ／チューブ＋４０μＬのＨＡＬＴ（商標）（６つの広域スペクトルプロテアーゼ阻害剤である、高品質のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で安定化されたＡＥＢＳＦ、アプロチニン、ベスタチン、Ｅ－６４、ロイペプチン、およびペプスタチンＡ）＋４０μＬのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）／チューブ（プロテアーゼ阻害剤）を添加する；ならびに（５）細胞懸濁液を５０ｍＬチューブに移し（超音波処理チューブホルダーは５０ｍＬチューブのみ保持することができる）、超音波処理するまで－８０℃で凍結する。
細胞溶解物を作成するための超音波処理を次のように行った：（１）温水浴で細胞懸濁液を解凍する；（２）１分、３分、または６分間超音波処理する；（３）超音波処理した試料を１０００ｒｐｍで５分間スピンダウンし、３００μＬのアリコートを作成し、－８０℃で凍結する。
タウバイオセンサー細胞タウ－ＣＦＰ／タウ－ＹＦＰ／Ｃａｓ９クローン７Ｂ１０Ｃ３ Ａｇｇ［－］（Ｃ３）およびＦＲＥＴ／ＦＡＣＳ対照細胞タウ－ＣＦＰ、タウ－ＹＦＰ、ＨＥＫ－ＨＺ、タウ－ＣＦＰ／タウ－ＹＦＰ／Ｃａｓ９クローン７Ｂ１０Ｃ３－Ｂ２ Ａｇｇ［＋］（Ｂ２）を解凍し、１２ウェルプレートに播種し、上記で生成した１０μｇ、３０μｇ、または１００μｇの細胞溶解物で処理した。結果を図１９に示す。用量依存的応答が観察され、３分間の超音波処理が最良に働いた。
後続の実験で、ウェルあたり１５０，０００個の７Ｂ１０Ｃ３ Ａｇｇ［－］細胞を２４ウェルプレートに二重で播種した。ウェルあたり１ｍＬの新鮮な培地を使用した。０（対照）、１０、２５、または５０μｇの３分のタウ－ＹＦＰ Ａｇｇ［＋］クローン１８細胞溶解物＋／－リポフェクタミン（培地１ｍＬあたり１０μＬ）を追加した。リポフェクタミンでは、すべての細胞がＡｇｇ［＋］であったが、２５および５０μｇの溶解物試料では２４時間後に、ならびに１０μｇの溶解物試料では４８時間後にすべての細胞が死んでいた。
次に、使用する溶解物の量を減らすことを試みた。ウェルあたり１５０，０００個の７Ｂ１０Ｃ３ Ａｇｇ［－］細胞を２４ウェルプレートに二重で播種した。ウェルあたり１ｍＬの新鮮な培地を使用した。０（対照）、１、５、または１０μｇの３分のタウ－ＹＦＰ Ａｇｇ［＋］クローン１８細胞溶解物＋／－リポフェクタミン（培地１ｍＬあたり１０μＬ）を追加した。リポフェクタミンでは、すべての細胞がＡｇｇ［＋］であったが、５および１０μｇの溶解物試料では、細胞は２４時間後に不健康に見え、４８時間後に死んでいた。１μｇの溶解物試料では、細胞はすべてＡｇｇ［＋］であったが、２４時間でやや不健康に見えた。３日後、細胞はまだ生きており、Ａｇｇ［＋］であった。
次に、使用する溶解物の量を減らし、様々なリポフェクタミン濃度を試験することを試みた。ウェルあたり１５０，０００個の７Ｂ１０Ｃ３ Ａｇｇ［－］細胞を２４ウェルプレートに二重で播種した。ウェルあたり１ｍＬの新鮮な培地を使用した。０（対照）、０．１、０．５、または１μｇの３分のタウ－ＹＦＰ Ａｇｇ［＋］クローン１８細胞溶解物＋／－リポフェクタミン（培地１ｍＬあたり１、５、または１０μＬ）を追加した。１０μＬのリポフェクタミンでは、すべての試料で２４時間後にすべての細胞が死んでいた。５μＬのリポフェクタミンおよび０．５μｇの溶解物を使用すると、４８時間後に細胞は正常に見え、ほとんどがＡｇｇ［＋］であった。同様に、５μＬのリポフェクタミンおよび１μｇの溶解物を使用すると、４８時間後に細胞は正常に見え、すべてがＡｇｇ［＋］であった。しかしながら、５μＬのリポフェクタミンは、４８時間後に細胞が不健康に見えたように、０ｕｇおよび０．１μｇの試料では毒性があった。１μＬのリポフェクタミンを使用すると、細胞は４８時間後に正常に見え、０．１μｇの溶解物試料では約３０％のＡｇｇ［＋］であり、０．５μｇの溶解物試料では約４０％のＡｇｇ［＋］であり、１μｇの溶解物試料では約５０％のＡｇｇ［＋］であった。図２０を参照されたい。同様の実験を、３μｇ、５μｇ、または１０μｇの細胞溶解物および１μＬ、２μＬ、または３μＬのリポフェクタミンを試験して行った。結果を図２１に示す。さらに別の実験を、０．５μｇ、０．７μｇ、または１μｇの細胞溶解物および３．５μＬまたは４μＬのリポフェクタミンを試験して行った。各条件の凝集陽性細胞の割合は次のとおりである：０．５μｇの溶解物／３．５μＬのリポフェクタミン：７３．５％；０．７μｇの溶解物／３．５μＬのリポフェクタミン：７１．７％；１μｇの溶解物／３．５μＬのリポフェクタミン：７５．７％；０．５μｇの溶解物／４μＬのリポフェクタミン：７６．４％；０．７μｇの溶解物／４μＬのリポフェクタミン：７６．７％；および１μｇの溶解物／４μＬのリポフェクタミン：７８．０％。さらなる実験では、２μＬおよび２．５μＬのリポフェクタミンは、細胞に対して毒性がなかったが、３μＬ、３．５μＬ、４μＬ、４．５μＬ、および５μＬでは細胞に対して毒性があった。
次に、Ｔ２５フラスコに拡大し、２８０万個の７Ｂ１０Ｃ３細胞＋溶解物＋リポフェクタミンを播種した。ＦＡＣＳ／ＦＲＥＴ選別を、培養物において２日後に行った。２つの条件を試験した：（１）新鮮な培地１ｍＬあたり１．５μｇの溶解物＋２μＬのリポフェクタミン、および（２）新鮮な培地１ｍＬあたり２μｇの溶解物＋２μＬのリポフェクタミン。最初の実験では、９６５，８８０個の細胞がＦＲＥＴ［－］（すなわち、Ａｇｇ［－］）であり、９８４，７６０個の細胞がＦＲＥＴ［＋］（すなわち、Ａｇｇ［＋］）であった。２番目の実験では、５４７，９６０個の細胞がＦＲＥＴ［－］（すなわち、Ａｇｇ［－］）であり、８５５，９００個の細胞がＦＲＥＴ［＋］（すなわち、Ａｇｇ［＋］）であった。ゲノムワイドスクリーニングでは、新鮮な培地１ｍＬあたり２．５μＬのリポフェクタミンを使用し、２つの異なる用量のタウ－ＹＦＰ Ａｇｇ［＋］クローン１８細胞溶解物（１．５μｇおよび２μｇ）を比較し、それは細胞を健康に維持しながらＡｇｇ［＋］細胞の割合を増加する可能性があると結論付けた。
実施例６．タウ凝集を防止する遺伝的修飾因子を同定するためのゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクリーニング
実施例２のスクリーニングの目標は、破壊されたときに、弱いタウ播種材料で刺激されたときにタウ凝集体の形成を促進する修飾因子遺伝子を同定することであった。対照的に、この実施例でされるスクリーニングでは、通常、大部分の細胞でタウ凝集およびＦＲＥＴ誘導を引き起こす強力なタウ播種材料でバイオセンサー細胞を処理した。この「最大播種」材料は、タウ－ＹＦＰ Ａｇｇ［＋］クローン１８細胞からの超音波処理した全細胞溶解物で構成され、リポフェクタミントランスフェクション試薬が適用されている。このアプローチを採用して、破壊されたときにタウ凝集を低減する標的遺伝子を同定した（種の取り込みをブロックする、オリゴマーまたは線維の形成を阻害する、それらの分解を促進することによって、またはいくつかの他のメカニズムによって）。図２２を参照されたい。
凝集物のないＣａｓ９発現タウ－ＣＦＰ／タウ－ＹＦＰバイオセンサー細胞（Ａｇｇ［－］）に、各標的遺伝子にノックアウト変異を導入するためのレンチウイルス送達アプローチを使用して、２つのヒトゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡライブラリで形質導入した。各ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡライブラリは、機能的ノックアウトのために５’構成的エクソンを標的とし、遺伝子あたり平均約３のｓｇＲＮＡをカバーする（組み合わせた２つのライブラリにおいて遺伝子あたり合計６のｇＲＮＡ）。読み取りカウントの分布（つまり、ライブラリ内の各ｇＲＮＡの表現）は正常であり、各ライブラリで同様であった。ｓｇＲＮＡは、オフターゲットゲノム配列とのミスマッチが２つ以下のｓｇＲＮＡを回避することにより、オフターゲット効果を回避するように設計された。ライブラリは、１０００の非標的化対照ｓｇＲＮＡを含む１９，０５０のヒト遺伝子および１８６４のｍｉＲＮＡをカバーする。ライブラリを、感染多重度（ＭＯＩ）＜０．３で、ｓｇＲＮＡあたり＞３００細胞のカバレッジで形質導入した。タウバイオセンサー細胞は、ピューロマイシンの選択の下で増殖し、細胞ごとに固有のｓｇＲＮＡの組み込みおよび発現を含む細胞を選択した。ピューロマイシンの選択は、１μｇ／ｍＬでの形質導入の２４時間後に開始した。５つの独立したスクリーニング複製を一次スクリーニングで使用した。
各複製において、７Ｂ１０Ｃ３バイオセンサー細胞の試料を、レンチウイルスでパッケージングされたＣＲＩＳＰＲライブラリの形質導入後３日目および７日目に収集した。７日目の継代で、「最大播種」材料を細胞に添加し、４８時間後（９日目）にＦＡＣＳを行い、ＦＲＥＴ［－］およびＦＲＥＴ［＋］集団を分離および収集した。スクリーニングは、５回の反復実験で構成された。組み込まれたｓｇＲＮＡ構築物のＤＮＡ単離およびＰＣＲ増幅により、各時点でのｓｇＲＮＡレパートリーの次世代シーケンシング（ＮＧＳ）による特徴付けが可能になった。合計４０の試料が存在する：５つの複製スクリーニング＊２つのライブラリ＊それぞれに４つの試料（３日目、７日目、９日目のＦＲＥＴ［－］、および９日目のＦＲＥＴ［＋］）。「最大播種」では、新鮮な培地１ｍＬあたり２．５μＬのリポフェクタミンを使用し、新鮮な培地１ｍＬあたり様々な量（２μｇ、４μｇ、および５μｇ）の細胞溶解物を試験した。
データ分析および統計分析は実施例２で使用されたアプローチを反映しているため、実施例２の詳細はここで繰り返されない。（ペア分析）ＦＲＥＴ（－）対ＦＲＥＴ（＋）対７日目を比較した。また、３日目（よりストリンジェント）と比較してペア分析を行った。９日目のＦＲＥＴ［－］およびＦＲＥＴ［＋］試料を、その濃縮または枯渇がタウ凝集表現型への影響を示し得るｓｇＲＮＡについて分析した。９日目のＦＲＥＴ［＋］、３日目、および７日目に対して９日目のＦＲＥＴ［－］細胞で濃縮されている、かつ／または９日目のＦＲＥＴ［－］、３日目、および７日目に対して９日目のＦＲＥＴ［＋］細胞で枯渇しているｓｇＲＮＡ、は、破壊されたときにタウ凝集を低減または防止し得る標的遺伝子を示す。これらのｓｇＲＮＡヒットは、治療的介入の潜在的な標的として特に興味深いものである。９日目のＦＲＥＴ［－］、３日目、および７日目に対して９日目のＦＲＥＴ［＋］細胞で濃縮されている、かつ／または９日目のＦＲＥＴ［＋］、３日目、および７日目に対して９日目のＦＲＥＴ［－］細胞で枯渇しているｓｇＲＮＡは、破壊されたときにタウ凝集を促進または増強し得る標的遺伝子を示す。以前の時点に対して９日目のＦＲＥＴ［＋］およびＦＲＥＴ［－］の両方で枯渇したｓｇＲＮＡは、破壊されたときに細胞の生存率を経時的に低減する必須遺伝子を表す可能性が高い。
ＦＲＥＴ［－］細胞で濃縮または枯渇した１４２個の重要なｇＲＮＡを同定した（ＦＲＥＴ［＋］細胞および７日目の細胞と比較して）。これらのうち、７日目と比較して、４６個のｇＲＮＡはＦＲＥＴ［－］細胞で枯渇し、７７個のｇＲＮＡはＦＲＥＴ［－］細胞で濃縮され、２０個のｇＲＮＡはＦＲＥＴ［－］細胞で濃縮された（３日目と比較して有意ではない）。図２３および２４を参照されたい。
次に、４０５の個々のｓｇＲＮＡを、検証のために二次スクリーニングで試験した。二次スクリーニングの概略図を図２５に示す。４つの実験を行った。各々に使用された細胞溶解物の量は、新鮮な培地の５μｇ／ｍＬであった。４つの異なる量のリポフェクタミン（新鮮な培地１ｍＬあたり）：１．５μＬ、２μＬ、２．５μＬ、および３．５μＬを試験した。この検証は、タウ凝集の正および負の修飾因子として作用し得る遺伝子の同定における一次スクリーニングアプローチの価値を確認する。
実施例７．転写活性化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ライブラリを使用してタウ凝集を防止する遺伝的修飾因子を同定するためのゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクリーニング
実施例６と同様に、この実施例でされるスクリーニングでは、通常、大部分の細胞でタウ凝集およびＦＲＥＴ誘導を引き起こす強力なタウ播種材料でバイオセンサー細胞を処理した。この「最大播種」材料は、タウ－ＹＦＰ Ａｇｇ［＋］クローン１８細胞からの超音波処理した全細胞溶解物で構成され、リポフェクタミントランスフェクション試薬が適用されている。このアプローチを採用して、転写活性化されたときにタウ凝集を低減する標的遺伝子を同定した（種の取り込みをブロックする、オリゴマーまたは線維の形成を阻害する、それらの分解を促進することによって、またはいくつかの他のメカニズムによって）。図２６を参照されたい。
凝集物のないＳＡＭ発現タウ－ＣＦＰ／タウ－ＹＦＰバイオセンサー細胞（Ａｇｇ［－］）に、各標的遺伝子を転写活性化するためのレンチウイルス送達アプローチを使用して、ヒトゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ ｈＳＡＭ ｓｇＲＮＡライブラリで形質導入した。ライブラリのｓｇＲＮＡは、転写開始部位の２００ｂｐ上流内の部位を標的とし、遺伝子あたりの平均カバレッジは約３のｓｇＲＮＡである。ｓｇＲＮＡは、オフターゲットゲノム配列とのミスマッチが２つ以下のｓｇＲＮＡを回避することにより、オフターゲット効果を回避するように設計された。ライブラリは１８，９４６のヒト遺伝子をカバーする。ライブラリを、感染多重度（ＭＯＩ）＜０．３で、ｓｇＲＮＡあたり＞３００細胞のカバレッジで形質導入した。タウバイオセンサー細胞は、ゼオシンの選択の下で増殖し、細胞ごとに固有のｓｇＲＮＡの組み込みおよび発現を含む細胞を選択した。５つの独立したスクリーニング複製を一次スクリーニングで使用した。
レンチウイルスでパッケージングされたＣＲＩＳＰＲライブラリの形質導入後１０日目（ＰＭ）に、「最大播種」材料を細胞に添加し、１３日目（ＡＭ）にＦＡＣＳを行い、ＦＲＥＴ［－］およびＦＲＥＴ［＋］の集団を分離および収集した。図２６を参照されたい。スクリーニングは、５回の反復実験で構成された。組み込まれたｓｇＲＮＡ構築物のＤＮＡ単離およびＰＣＲ増幅により、各時点でのｓｇＲＮＡレパートリーの次世代シーケンシング（ＮＧＳ）による特徴付けが可能になった。「最大播種」では、新鮮な培地１ｍＬあたり３つの量（２．５μＬ、３．５μＬ、および４μＬ）のリポフェクタミンを使用し、新鮮な培地１ｍＬあたり様々な量（３μｇ、４μｇ、および５μｇ）の細胞溶解物を試験した。
１３日目のＦＲＥＴ［－］およびＦＲＥＴ［＋］試料を、その濃縮または枯渇がタウ凝集表現型への影響を示し得るｓｇＲＮＡについて分析した。１３日目のＦＲＥＴ［＋］および１０日目に対して１３日目のＦＲＥＴ［－］細胞で濃縮されている、かつ／または１３日目のＦＲＥＴ［－］および１０日目に対して１３日目のＦＲＥＴ［＋］細胞で枯渇しているｓｇＲＮＡ、は、転写活性化されたときにタウ凝集を低減または防止し得る標的遺伝子を示す。これらのｓｇＲＮＡヒットは、治療的介入の潜在的な標的として特に興味深いものである。１３日目のＦＲＥＴ［－］および１０日目に対して１３日目のＦＲＥＴ［＋］細胞が濃縮されている、かつ／または１３日目のＦＲＥＴ［＋］および１０日目に対して１３日目のＦＲＥＴ［－］細胞で枯渇しているｓｇＲＮＡは、転写活性化されたときにタウ凝集を促進または増強する標的遺伝子を示す。データを、実施例６のように、検証のために二次スクリーニングで分析および試験する。統計分析は、実施例２で使用されたアプローチを反映している。（ペア分析）ＦＲＥＴ（－）対ＦＲＥＴ（＋）対１０日目を比較する。
実施例８．タウ脱凝集の遺伝的修飾因子を同定するためのゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクリーニング
上記の実施例では、タウ凝集の正および負の調節因子の同定を目的として、２つの一連のゲノムワイドスクリーニングを実施した。最初のスクリーニングでは、破壊されたときに、弱いタウ播種材料で刺激されたときにタウ凝集体の形成を促進する修飾因子遺伝子を同定した。この「最小播種」材料は、タウ－ＹＦＰ凝集体［＋］細胞から収集された馴化培地で構成され、７Ｂ１０Ｃ３細胞に直接適用され、３日間のインビトロ（ＤＩＶ）後に約０．１％のＦＲＥＴ［＋］細胞を誘発する。対照的に、２番目のスクリーニングでは、通常、大部分の細胞でタウ凝集およびＦＲＥＴ誘導を引き起こす強力または最大のタウ播種材料でバイオセンサー細胞を処理した。この「最大播種」材料は、タウ－ＹＦＰ凝集体［＋］細胞からの超音波処理された全細胞溶解物で構成され、リポフェクタミントランスフェクション試薬が適用されている。
ここでは、レンチウイルスでパッケージングされたＣＲＩＳＰＲライブラリを使用して凝集体［＋］７Ｂ１０Ｃ３－Ｂ２またはＤＣ１１－Ｂ６細胞を形質導入した。７Ｂ１０Ｃ３－Ｂ２およびＤＣ１１－Ｂ６は、安定して増殖するタウ凝集体を含むクローンである。タウ凝集がＦＡＣＳによる細胞選別の手段として検出および使用され得るＦＲＥＴシグナルが生成する、Ｃａｓ９（クローン７Ｂ１０Ｃ３）またはｄＣａｓ９－ＳＡＭ（クローンＤＣ１１）を発現するＨＥＫ２９３タウバイオセンサー細胞でこのスクリーニングを行なった。７Ｂ１０Ｃ３およびＤＣ１１クローンを、安定して増殖するタウ凝集体を含むサブクローンを誘導するために、タウ線維でさらに処理した。７Ｂ１０Ｃ３－Ｂ２およびＤＣ１１－Ｂ６と呼ばれるこれらの凝集陽性凝集体［＋］安定サブクローンのうちの２つが拡大のために選択され、スクリーニングに使用された。
培養物中での２週間後、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって単離およびシーケンシングを行い、それらの特定の標的の破壊によりタウ凝集の喪失を引き起こすｓｇＲＮＡがＦＲＥＴ［－］集団で濃縮されるであろうという仮説に基づいて、ＦＲＥＴ［－］細胞での枯渇／濃縮されたシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を明らかした。ＦＲＥＴ［－］細胞集団は、主に凝集体のない細胞で構成されていた。しかしながら、ＦＲＥＴを放出するのに十分ではなく、したがってＦＡＣＳによってＦＲＥＴ［＋］として認識されない小さな凝集体で構成される、スペックルを示すいくつかのＦＲＥＴ［－］細胞を観察した。
ＦＲＥＴ［－］集団の偽陽性を低減し、有糸***後のＧ１期に主に観察されるスペックル［＋］細胞の数を最小化するために（図２８を参照されたい）、細胞周期の進行を二重チミジンブロック、ＤＮＡ合成阻害剤によって同期した（図２９を参照されたい）。この同期方法のこの新規の用途により、主にＳ期に濃縮された細胞集団を得て、有糸***後の凝集体の蓄積を同期させることを可能にした。
各ライブラリ（２つのＣＲＩＳＰＲｎライブラリおよび１つのＣＲＩＳＰＲａライブラリ）に対して５つの複製スクリーニングを行う。各複製において、７Ｂ１０Ｃ３－Ｂ２およびＤＣ１１－Ｂ６バイオセンサー細胞の試料を、レンチウイルスでパッケージングされたＣＲＩＳＰＲライブラリの形質導入後７日目および１０日目に収集する。１２日目に、細胞をチミジンの存在下で２１時間増殖させる。最初のブロックのチミジンが除去された後（１３日目）、細胞を洗浄し、新鮮な培地で８時間増殖させて、細胞をブロックから放出し、２番目のブロックで再びチミジンとともにインキュベートする。この同期の結果として、細胞はＧ２期および有糸***期を同期的に進行し、Ｓ期の開始時に停止する。１４日目に、細胞は２番目のチミジンブロックによって放出され、新鮮な培地で３時間増殖され、Ｇ２期を同期的に進行させる。ＦＡＣＳを行い、ＦＲＥＴ［－］およびＦＲＥＴ［＋］の集団を分離および収集する。図２７を参照のこと。
ゲノムＤＮＡを各試料から収集し、ｓｇＲＮＡレパートリーはＰＣＲによって各々から増幅される。合計６０の試料が存在する：５つの複製スクリーニング＊３つのライブラリ＊それぞれに４つの試料（７日目、１０日目、１４日目のＦＲＥＴ［－］、および１４日目のＦＲＥＴ［＋］）。
データ分析および統計分析は、実施例２で使用されたアプローチを反映しているため、実施例２の詳細はここでは繰り返されない。１４日目のＦＲＥＴ［＋］、７日目、および１０日目に対して１４日目のＦＲＥＴ［－］細胞で濃縮されている、かつ／または１４日目のＦＲＥＴ［－］、７日目、および１０日目に対して１４日目のＦＲＥＴ［＋］細胞で枯渇しているｓｇＲＮＡは、破壊された（またはＣＲＩＳＰＲａスクリーニングの場合は転写活性化された）ときにタウ脱凝集を誘導する標的遺伝子を示し得る。これらのｓｇＲＮＡヒットは、治療的介入の潜在的な標的として特に興味深いものである。１４日目のＦＲＥＴ［－］、７日目、および１０日目に対して１４日目のＦＲＥＴ［＋］細胞で濃縮されている、かつ／または１４日目のＦＲＥＴ［＋］、７日目、および１０日目に対して１４日目のＦＲＥＴ［－］細胞で枯渇しているｓｇＲＮＡは、破壊された（またはＣＲＩＳＰＲａスクリーニングの場合は転写活性化された）ときにタウ凝集を促進または増強する標的遺伝子を示し得る。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
タウ凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインを含む細胞集団を提供することと、
（ｂ）複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを前記細胞集団に導入することと、
（ｃ）ゲノムの編集および拡大を可能にするために前記細胞集団を培養することであって、前記複数の固有のガイドＲＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、前記Ｃａｓタンパク質が、前記複数の遺伝子を切断して遺伝子機能のノックアウトをもたらし、遺伝子修飾された細胞集団を生成する、培養することと、
（ｄ）前記遺伝子修飾された細胞集団をタウ播種剤と接触させて、播種された細胞集団を生成することと、
（ｅ）タウ凝集体の形成を可能にするために前記播種された細胞集団を培養することであって、前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のタウリピートドメインの凝集体が、前記播種された細胞集団のサブセットに形成されて、凝集陽性細胞集団を生成する、培養することと、
（ｆ）ステップ（ｃ）での前記遺伝子修飾された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された前記凝集陽性細胞集団における前記複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することと、を含み、
ステップ（ｃ）での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された前記凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮が、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた前記遺伝子の破壊が、タウ凝集を増強する、方法。
（項目２）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号２１を含み、任意に、前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号２２に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記Ｃａｓタンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、前記細胞集団において安定して発現される、項目１～４のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記Ｃａｓタンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞集団においてゲノム的に組み込まれる、項目１～５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
各ガイドＲＮＡが、構成的エクソンを標的とする、項目１～６のいずれかに記載の方法。
（項目８）
各ガイドＲＮＡが、５’構成的エクソンを標的とする、項目７に記載の方法。
（項目９）
各ガイドＲＮＡが、第１のエクソン、第２のエクソン、または第３のエクソンを標的とする、項目１～８のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
タウ凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラＣａｓタンパク質と、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質と、第１のレポーター連結された第１のタウリピートドメインと、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインと、を含む細胞集団を提供することと、
（ｂ）複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを前記細胞集団に導入することと、
（ｃ）転写活性化および拡大を可能にするために前記細胞集団を培養することであって、前記複数の固有のガイドＲＮＡが、前記キメラＣａｓタンパク質および前記キメラアダプタータンパク質と複合体を形成し、前記複合体が、前記複数の遺伝子の転写を活性化して遺伝子発現の増加をもたらし、遺伝子修飾された細胞集団を生成する、培養することと、
（ｄ）前記遺伝子修飾された細胞集団をタウ播種剤と接触させて、播種された細胞集団を生成することと、
（ｅ）タウ凝集体の形成を可能にするために前記播種された細胞集団を培養することであって、前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のタウリピートドメインの凝集体が、前記播種された細胞集団のサブセットに形成されて、凝集陽性細胞集団を生成する、培養することと、
（ｆ）ステップ（ｃ）での前記遺伝子修飾された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された前記凝集陽性細胞集団における前記複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することと、を含み、
ステップ（ｃ）での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された前記凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮が、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた前記遺伝子の転写活性化が、タウ凝集を増強する、方法。
（項目１１）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記キメラＣａｓタンパク質が、ＶＰ６４転写活性化ドメインに融合した前記ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含み、任意に、前記キメラＣａｓタンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に、前記ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、核局在化シグナル、および前記ＶＰ６４転写活性化因子ドメインを含む、項目１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記アダプタータンパク質が、ＭＳ２コートタンパク質であり、前記キメラアダプタータンパク質中の前記１つ以上の転写活性化ドメインが、ｐ６５転写活性化ドメインおよびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に、前記ＭＳ２コートタンパク質、核局在化シグナル、前記ｐ６５転写活性化ドメイン、および前記ＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み、項目１０～１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記キメラＣａｓタンパク質が、配列番号３６を含み、任意に、前記キメラＣａｓタンパク質が、配列番号３８に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目１０～１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号３７を含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号３９に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目１０～１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記キメラＣａｓタンパク質、前記キメラアダプタータンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、前記細胞集団において安定して発現される、項目１０～１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記キメラＣａｓタンパク質、前記キメラアダプタータンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞集団においてゲノム的に組み込まれる、項目１０～１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
各ガイドＲＮＡが、転写開始部位の２００ｂｐ上流内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする、項目１０～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
各ガイドＲＮＡが、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つ以上のアダプター結合エレメントを含み、任意に、各ガイドＲＮＡが、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる２つのアダプター結合エレメントを含み、任意に、第１のアダプター結合エレメントが、前記１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第１のループ内にあり、第２のアダプター結合エレメントが、前記１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第２のループ内にあり、任意に、前記アダプター結合エレメントが、配列番号３３に示される配列を含み、
任意に、１つ以上のガイドＲＮＡの各々が、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）部分に融合したＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）部分を含む単一のガイドＲＮＡであり、前記第１のループが、配列番号１７の残基１３～１６に対応するテトラループであり、前記第２のループが、配列番号１７の残基５３～５６に対応するステムループ２である、項目１０～１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
ステップ（ｃ）が約３日～約９日である、項目１～２０のいずれかに記載の方法。
（項目２２）
ステップ（ｃ）が約６日である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
ステップ（ｄ）が、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する培養されたタウ凝集陽性細胞から採取された馴化培地の存在下で、前記遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含む、項目１～２２のいずれかに記載の方法。
（項目２４）
前記馴化培地が、コンフルエントなタウ凝集陽性細胞上に約１日～約７日間置いた後に採取された、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記馴化培地が、コンフルエントなタウ凝集陽性細胞上に約４日間置いた後に採取された、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
ステップ（ｄ）が、約７５％の馴化培地および約２５％の新鮮な培地中で前記遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含む、項目２３～２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記遺伝子修飾された細胞集団が、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する前記タウ凝集陽性細胞と共培養されない、項目２３～２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
ステップ（ｅ）が約２日～約６日である、項目１～２７のいずれかに記載の方法。
（項目２９）
ステップ（ｅ）が約４日である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記第１のレポーターおよび前記第２のレポーターが、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対であり、ステップ（ｅ）での前記凝集陽性細胞集団が、フローサイトメトリーによって同定される、項目１～２９のいずれかに記載の方法。
（項目３１）
存在量が次世代シーケンシングによって決定される、項目１～３０のいずれかに記載の方法。
（項目３２）
前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記ガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｃ）での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ガイドＲＮＡが濃縮されているとみなされる、項目１～３１のいずかに記載の方法。
（項目３３）
ステップ（ｆ）が、ステップ（ｃ）の第１の時点および／またはステップ（ｃ）の第２の時点で、ステップ（ｃ）での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での前記凝集陽性細胞集団において前記複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することを含む、項目１～３２のいずれかに記載の方法。
（項目３４）
ステップ（ｃ）の前記第１の時点が、前記細胞集団を培養する第１の継代であり、前記第２の時点が、ゲノム編集および拡大または転写活性化および拡大を可能にするために、前記細胞集団の培養の途中である、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
ステップ（ｃ）の前記第１の時点が、培養の約３日後であり、ステップ（ｃ）の前記第２の時点が、培養の約６日後である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
（１）前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｃ）の前記第１の時点およびステップ（ｃ）の前記第２の時点の両方で、ステップ（ｃ）での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、および／または
（２）前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記遺伝子を標的とする少なくとも２つの固有のガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｃ）の前記第１の時点またはステップ（ｃ）の前記第２の時点のいずれかで、ステップ（ｃ）での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子とみなされ、前記遺伝子の破壊または転写活性化がタウ凝集を増強する、項目３３～３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
以下のステップ：
（１）ステップ（ｅ）で生成された前記凝集陽性細胞集団に、前記複数の固有のガイドＲＮＡのうちのどれが存在するかを同定すること、
（２）式ｎＣｎ’＊（ｘ－ｎ’）Ｃ（ｍ－ｎ）／ｘＣｍを使用して、ステップ（ｆ）（１）で同定された前記ガイドＲＮＡが存在するランダム確率を計算することであって、
式中、ｘが、ステップ（ｂ）で前記細胞集団に導入された様々な固有のガイドＲＮＡであり、
ｍが、ステップ（ｆ）（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡであり、
ｎが、前記遺伝子を標的とするステップ（ｂ）で前記細胞集団に導入され様々な固有のガイドＲＮＡであり、
ｎ’が、前記遺伝子を標的とする、ステップ（ｆ）（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡである、計算すること、
（３）ステップ（ｆ）（１）で同定された前記ガイドＲＮＡの平均濃縮スコアを計算することであって、
ガイドＲＮＡの前記濃縮スコアが、ステップ（ｅ）で生成された前記凝集陽性細胞集団における前記ガイドＲＮＡの相対存在量を、ステップ（ｃ）での前記培養された細胞集団における前記ガイドＲＮＡの相対存在量で割ったものであり、
相対存在量が、前記ガイドＲＮＡの読み取りカウントを、前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団の読み取りカウントで割ったものである、計算すること、および
（４）前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが、存在する前記ランダム確率を大幅に下回り、濃縮スコアの閾値を上回っている場合に前記遺伝子を選択することが、タウ凝集の遺伝的修飾因子として遺伝子を同定するためにステップ（ｆ）で施され、前記遺伝子の破壊または転写活性化が、タウ凝集を増強する、項目１～３６のいずれかに記載の方法。
（項目３８）
タウ凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインを含む細胞集団を提供することと、
（ｂ）複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを前記細胞集団に導入することと、
（ｃ）ゲノムの編集および拡大を可能にするために前記細胞集団を培養することであって、前記複数の固有のガイドＲＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、前記Ｃａｓタンパク質が、前記複数の遺伝子を切断して遺伝子機能のノックアウトをもたらし、遺伝子修飾された細胞集団を生成する、培養することと、
（ｄ）前記遺伝子修飾された細胞集団をタウ播種剤と接触させて、播種された細胞集団を生成することと、
（ｅ）タウ凝集体の形成を可能にするために前記播種された細胞集団を培養することであって、前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のタウリピートドメインの凝集体が、前記播種された細胞集団の第１のサブセットに形成されて、凝集陽性細胞集団を生成し、前記播種された細胞集団の第２のサブセットに形成せず、凝集陰性細胞集団を生成する、培養することと、
（ｆ）ステップ（ｅ）で同定された前記凝集陰性細胞集団および／もしくはステップ（ｄ）での前記播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された前記凝集陽性細胞集団における前記複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定すること、ならびに／またはステップ（ｅ）で同定された前記凝集陽性細胞集団および／もしくはステップ（ｄ）での前記播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された前記凝集陰性細胞集団における前記複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することと、を含み、
ステップ（ｅ）で同定された前記凝集陽性細胞集団および／もしくはステップ（ｄ）での前記播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された前記凝集陰性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮、またはステップ（ｅ）で同定された前記凝集陰性細胞集団および／もしくはステップ（ｄ）での前記播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された前記凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇が、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた前記遺伝子の破壊が、タウ凝集を防止し、かつ／または
ステップ（ｅ）で同定された前記凝集陰性細胞集団および／もしくはステップ（ｄ）での前記播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された前記凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮、またはステップ（ｅ）で同定された前記凝集陽性細胞集団および／もしくはステップ（ｄ）での前記播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された前記凝集陰性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇が、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた前記遺伝子の破壊が、タウ凝集を促進または増強する、方法。
（項目３９）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号２１を含み、任意に、前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号２２に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記Ｃａｓタンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、前記細胞集団において安定して発現される、項目３８～４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記Ｃａｓタンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞集団においてゲノム的に組み込まれる、項目３８～４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
各ガイドＲＮＡが、構成的エクソンを標的とする、項目３８～４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
各ガイドＲＮＡが、５’構成的エクソンを標的とする、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
各ガイドＲＮＡが、第１のエクソン、第２のエクソン、または第３のエクソンを標的とする、項目３８～４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
タウ凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラＣａｓタンパク質と、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質と、第１のレポーター連結された第１のタウリピートドメインと、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインと、を含む細胞集団を提供することと、
（ｂ）複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを前記細胞集団に導入することと、
（ｃ）転写活性化および拡大を可能にするために前記細胞集団を培養することであって、前記複数の固有のガイドＲＮＡが、前記キメラＣａｓタンパク質および前記キメラアダプタータンパク質と複合体を形成し、前記複合体が、前記複数の遺伝子の転写を活性化して遺伝子発現の増加をもたらし、遺伝子修飾された細胞集団を生成する、培養することと、
（ｄ）前記遺伝子修飾された細胞集団をタウ播種剤と接触させて、播種された細胞集団を生成することと、
（ｅ）タウ凝集体の形成を可能にするために前記播種された細胞集団を培養することであって、前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のタウリピートドメインの凝集体が、前記播種された細胞集団の第１のサブセットに形成されて、凝集陽性細胞集団を生成し、凝集陰性細胞集団を生成するために前記播種された細胞集団の第２のサブセットに形成されない、培養することと、
（ｆ）ステップ（ｅ）で同定された前記凝集陰性細胞集団および／もしくはステップ（ｄ）での前記播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された前記凝集陽性細胞集団における前記複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定すること、ならびに／またはステップ（ｅ）で同定された前記凝集陽性細胞集団および／もしくはステップ（ｄ）での前記播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された前記凝集陰性細胞集団における前記複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することと、を含み、
ステップ（ｅ）で同定された前記凝集陽性細胞集団および／もしくはステップ（ｄ）での前記播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された前記凝集陰性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮、またはステップ（ｅ）で同定された前記凝集陰性細胞集団および／もしくはステップ（ｄ）での前記播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された前記凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇が、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた前記遺伝子の転写活性化がタウ凝集を防止し、かつ／または
ステップ（ｅ）で同定された前記凝集陰性細胞集団および／もしくはステップ（ｄ）での前記播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された前記凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮、またはステップ（ｅ）で同定された前記凝集陽性細胞集団および／もしくはステップ（ｄ）での前記播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された前記凝集陰性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇が、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた前記遺伝子の転写活性化がタウ凝集を促進または増強する、方法。
（項目４８）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記キメラＣａｓタンパク質が、ＶＰ６４転写活性化ドメインに融合した前記ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含み、任意に、前記キメラＣａｓタンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に、前記ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、核局在化シグナル、および前記ＶＰ６４転写活性化因子ドメインを含む、項目４７～４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記アダプタータンパク質が、ＭＳ２コートタンパク質であり、前記キメラアダプタータンパク質中の前記１つ以上の転写活性化ドメインが、ｐ６５転写活性化ドメインおよびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に、前記ＭＳ２コートタンパク質、核局在化シグナル、前記ｐ６５転写活性化ドメイン、および前記ＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み、項目４７～５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記キメラＣａｓタンパク質が、配列番号３６を含み、任意に、前記キメラＣａｓタンパク質が、配列番号３８に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目４７～５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号３７を含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号３９に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目４７～５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記キメラＣａｓタンパク質、前記キメラアダプタータンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、前記細胞集団において安定して発現される、項目４７～５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記キメラＣａｓタンパク質、前記キメラアダプタータンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞集団においてゲノム的に組み込まれる、項目４７～５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
各ガイドＲＮＡが、転写開始部位の２００ｂｐ上流内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする、項目４７～５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
各ガイドＲＮＡが、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つ以上のアダプター結合エレメントを含み、任意に、各ガイドＲＮＡが、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる２つのアダプター結合エレメントを含み、任意に、第１のアダプター結合エレメントが、前記１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第１のループ内にあり、第２のアダプター結合エレメントが、前記１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第２のループ内にあり、任意に、前記アダプター結合エレメントが、配列番号３３に示される配列を含み、
任意に、１つ以上のガイドＲＮＡの各々が、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）部分に融合したＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）部分を含む単一のガイドＲＮＡであり、前記第１のループが、配列番号１７の残基１３～１６に対応するテトラループであり、前記第２のループが、配列番号１７の残基５３～５６に対応するステムループ２である、項目４７～５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
ステップ（ｃ）が約３日～約１３日である、項目３８～５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
ステップ（ｃ）が、約７日～約１０日であるか、約７日であるか、または約１０日である、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
ステップ（ｄ）が、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する培養されたタウ凝集陽性細胞からの細胞溶解物を含む培地の存在下で、前記遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含む、項目３８～５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
前記培地中の前記細胞溶解物が、約１～約５μｇ／ｍＬの濃度である、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記細胞溶解物を含む前記培地が、リポフェクタミンまたは別のトランスフェクション試薬をさらに含む、項目６０または６１に記載の方法。
（項目６３）
前記細胞溶解物を含む前記培地が、約１．５～約４μＬ／ｍＬの濃度でリポフェクタミンを含む、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記遺伝子修飾された細胞集団が、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する前記タウ凝集陽性細胞と共培養されない、項目６０～６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
ステップ（ｅ）が約１日～約３日である、項目３８～６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
ステップ（ｅ）が約２日である、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記第１のレポーターおよび前記第２のレポーターが、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対であり、ステップ（ｅ）での前記凝集陽性細胞集団および前記凝集陰性細胞集団が、フローサイトメトリーによって同定される、項目３８～６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６８）
存在量が次世代シーケンシングによって決定される、項目３８～６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記ガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｅ）での前記凝集陽性細胞集団および／またはステップ（ｄ）での前記播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での前記凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ガイドＲＮＡがステップ（ｅ）での前記凝集陰性細胞集団において濃縮されているとみなされ、前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記ガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｅ）での前記凝集陰性細胞集団および／またはステップ（ｄ）での前記播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合、ガイドＲＮＡがステップ（ｅ）での前記凝集陽性細胞集団において枯渇しているとみなされ、あるいは
前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記ガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｅ）での前記凝集陰性細胞集団および／またはステップ（ｄ）での前記播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ガイドＲＮＡがステップ（ｅ）での前記凝集陽性細胞集団において濃縮されているとみなされ、前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記ガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｅ）での前記凝集陽性細胞集団および／またはステップ（ｄ）での前記播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での前記凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合、ガイドＲＮＡがステップ（ｅ）での前記凝集陰性細胞集団において枯渇しているとみなされる、項目３８～６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
ステップ（ｆ）が、ステップ（ｅ）での前記凝集陽性細胞集団、ステップ（ｃ）の第１の時点での前記培養された細胞集団、およびステップ（ｄ）の第２の時点での前記播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での前記凝集陰性細胞集団における前記複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することを含み、かつ／またはステップ（ｆ）が、ステップ（ｅ）での前記凝集陰性細胞集団、ステップ（ｃ）の第１の時点での前記培養された細胞集団、およびステップ（ｄ）の第２の時点での前記播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での前記凝集陽性細胞集団における前記複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することを含む、項目３８～６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目７１）
ステップ（ｃ）の前記第１の時点が、前記細胞集団を培養する第１の継代である、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
ステップ（ｃ）の前記第１の時点が、培養の約３日後であり、ステップ（ｃ）の前記第２の時点が、培養の約７日後または培養の約１０日後である、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
（Ｉ）遺伝子が、タウ凝集の遺伝的修飾因子とみなされ、前記遺伝子の破壊または転写活性化が、
（１）前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｅ）での前記凝集陽性細胞集団、ステップ（ｃ）の前記第１の時点での前記培養された細胞集団、およびステップ（ｄ）の前記第２の時点での前記播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での前記凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ならびに／または
（２）前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｅ）での前記凝集陽性細胞集団およびステップ（ｄ）の前記第２の時点での前記播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での前記凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ならびに／または
（３）前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｅ）での前記凝集陰性細胞集団、ステップ（ｃ）の前記第３の時点での前記培養された細胞集団、およびステップ（ｄ）の前記第２の時点での前記播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合、ならびに／または
（４）前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｅ）での前記凝集陰性細胞集団およびステップ（ｄ）の前記第４の時点での前記播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合に、タウ凝集を防止し、あるいは
（ＩＩ）遺伝子が、タウ凝集の遺伝的修飾因子とみなされ、前記遺伝子の破壊または転写活性化が、
（１）前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｅ）での前記凝集陰性細胞集団、ステップ（ｃ）の前記第１の時点での前記培養された細胞集団、およびステップ（ｄ）の前記第２の時点での前記播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ならびに／または
（２）前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｅ）での前記凝集陰性細胞集団およびステップ（ｄ）の前記第２の時点での前記播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ならびに／または
（３）前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｅ）での前記凝集陽性細胞集団、ステップ（ｃ）の前記第３の時点での前記培養された細胞集団、およびステップ（ｄ）の前記第２の時点での前記播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での前記凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合、ならびに／または
（４）前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｅ）での前記凝集陽性細胞集団およびステップ（ｄ）の前記第４の時点での前記播種された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での前記凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合に、タウ凝集を促進または増強する、項目７０～７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
（Ｉ）以下のステップ：
（１）ステップ（ｅ）で生成された前記凝集陰性細胞集団に、前記複数の固有のガイドＲＮＡのうちのどれが存在するかを同定すること、
（２）式ｎＣｎ’＊（ｘ－ｎ’）Ｃ（ｍ－ｎ）／ｘＣｍを使用して、ステップ（ｆ）（１）で同定された前記ガイドＲＮＡが存在するランダム確率を計算することであって、
式中、ｘが、ステップ（ｂ）で前記細胞集団に導入された様々な固有のガイドＲＮＡであり、
ｍが、ステップ（ｆ）（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡであり、
ｎが、前記遺伝子を標的とするステップ（ｂ）で前記細胞集団に導入され様々な固有のガイドＲＮＡであり、
ｎ’が、前記遺伝子を標的とする、ステップ（ｆ）（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡである、計算すること、
（３）ステップ（ｆ）（１）で同定された前記ガイドＲＮＡの平均濃縮スコアを計算することであって、
ガイドＲＮＡの前記濃縮スコアが、ステップ（ｅ）で生成された前記凝集陰性細胞集団における前記ガイドＲＮＡの相対存在量を、ステップ（ｅ）で生成された前記凝集陽性細胞集団またはステップ（ｄ）での前記播種された細胞集団における前記ガイドＲＮＡの相対存在量で割ったものであり、
相対存在量が、前記ガイドＲＮＡの読み取りカウントを、前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団の読み取りカウントで割ったものである、計算すること、および
（４）前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが、存在する前記ランダム確率を大幅に下回り、濃縮スコアの閾値を上回っている場合に前記遺伝子を選択することが、タウ凝集の遺伝的修飾因子として遺伝子を同定するためにステップ（ｆ）で施され、前記遺伝子の破壊または転写活性化が、タウ凝集を予防し、あるいは
（ＩＩ）以下のステップ：
（１）ステップ（ｅ）で生成された前記凝集陽性細胞集団に、前記複数の固有のガイドＲＮＡのうちのどれが存在するかを同定すること、
（２）式ｎＣｎ’＊（ｘ－ｎ’）Ｃ（ｍ－ｎ）／ｘＣｍを使用して、ステップ（ｆ）（１）で同定された前記ガイドＲＮＡが存在するランダム確率を計算することであって、
式中、ｘが、ステップ（ｂ）で前記細胞集団に導入された様々な固有のガイドＲＮＡであり、
ｍが、ステップ（ｆ）（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡであり、
ｎが、前記遺伝子を標的とするステップ（ｂ）で前記細胞集団に導入され様々な固有のガイドＲＮＡであり、
ｎ’が、前記遺伝子を標的とする、ステップ（ｆ）（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡである、計算すること、
（３）ステップ（ｆ）（１）で同定された前記ガイドＲＮＡの平均濃縮スコアを計算することであって、
ガイドＲＮＡの前記濃縮スコアが、ステップ（ｅ）で生成された前記凝集陽性細胞集団における前記ガイドＲＮＡの相対存在量を、ステップ（ｅ）で生成された前記凝集陰性細胞集団またはステップ（ｄ）での前記播種された細胞集団における前記ガイドＲＮＡの相対存在量で割ったものであり、
相対存在量が、前記ガイドＲＮＡの読み取りカウントを、前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団の読み取りカウントで割ったものである、計算すること、および
（４）前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが、存在する前記ランダム確率を大幅に下回り、濃縮スコアの閾値を上回っている場合に前記遺伝子を選択することが、タウ凝集の遺伝的修飾因子として遺伝子を同定するためにステップ（ｆ）で施され、前記遺伝子の破壊または転写活性化が、タウ凝集を促進または増強する、項目３８～７３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７５）
タウ凝集および／または脱凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインを含む細胞集団を提供することであって、前記細胞が、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在するタウ凝集陽性細胞である、提供することと、
（ｂ）複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを前記細胞集団に導入することと、
（ｃ）ゲノムの編集および拡大を可能にするために前記細胞集団を培養することであって、前記複数の固有のガイドＲＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、前記Ｃａｓタンパク質が、前記複数の遺伝子を切断して遺伝子機能のノックアウトをもたらし、遺伝子修飾された細胞集団を生成し、前記培養することが、凝集陽性細胞集団および凝集陰性細胞集団をもたらす、培養することと、
（ｄ）前記凝集陽性細胞集団および前記凝集陰性細胞集団を同定することと、
（ｅ）ステップ（ｄ）で同定された前記凝集陰性細胞集団および／もしくはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）で同定された前記凝集陽性細胞集団における前記複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定すること、ならびに／またはステップ（ｄ）で同定された前記凝集陽性細胞集団および／もしくはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）で同定された前記凝集陰性細胞集団における前記複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することと、を含み、
ステップ（ｄ）で同定された前記凝集陽性細胞集団および／もしくはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）で同定された前記凝集陰性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮、またはステップ（ｄ）で同定された前記凝集陰性細胞集団および／もしくはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）で同定された前記凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇が、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ脱凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた前記遺伝子の破壊が、タウ脱凝集を促進し、かつ／または
ステップ（ｄ）で同定された前記凝集陰性細胞集団および／もしくはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）で同定された前記凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮、またはステップ（ｄ）で同定された前記凝集陽性細胞集団および／もしくはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）で同定された前記凝集陰性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇が、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた前記遺伝子の破壊が、タウ凝集を促進または増強する、方法。
（項目７６）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号２１を含み、任意に、前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号２２に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記Ｃａｓタンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、前記細胞集団において安定して発現される、項目７５～７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
前記Ｃａｓタンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞集団においてゲノム的に組み込まれる、項目７５～７９のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
各ガイドＲＮＡが、構成的エクソンを標的とする、項目７５～８０のいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
各ガイドＲＮＡが、５’構成的エクソンを標的とする、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
各ガイドＲＮＡが、第１のエクソン、第２のエクソン、または第３のエクソンを標的とする、項目７５～８２のいずれか一項に記載の方法。
（項目８４）
タウ凝集および／または脱凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラＣａｓタンパク質と、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質と、第１のレポーター連結された第１のタウリピートドメインと、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインと、を含む細胞集団を提供することであって、前記細胞が、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在するタウ凝集陽性細胞である、提供することと、
（ｂ）複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを前記細胞集団に導入することと、
（ｃ）転写活性化および拡大を可能にするために前記細胞集団を培養することであって、前記複数の固有のガイドＲＮＡが、前記キメラＣａｓタンパク質および前記キメラアダプタータンパク質と複合体を形成し、前記複合体が、前記複数の遺伝子の転写を活性化して遺伝子発現の増加をもたらし、遺伝子修飾された細胞集団を生成し、前記培養することが、凝集陽性細胞集団および凝集陰性細胞集団をもたらす、培養することと、
（ｄ）前記凝集陽性細胞集団および前記凝集陰性細胞集団を同定することと、
（ｅ）ステップ（ｄ）で同定された前記凝集陰性細胞集団および／もしくはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）で同定された前記凝集陽性細胞集団における前記複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定すること、ならびに／またはステップ（ｄ）で同定された前記凝集陽性細胞集団および／もしくはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）で同定された前記凝集陰性細胞集団における前記複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することと、を含み、
ステップ（ｄ）で同定された前記凝集陽性細胞集団および／もしくはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）で同定された前記凝集陰性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮、またはステップ（ｄ）で同定された前記凝集陰性細胞集団および／もしくはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）で同定された前記凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇が、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた前記遺伝子の転写活性化が、タウ脱凝集を促進し、かつ／または
ステップ（ｄ）で同定された前記凝集陰性細胞集団および／もしくはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）で同定された前記凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮、またはステップ（ｄ）で同定された前記凝集陽性細胞集団および／もしくはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）で同定された前記凝集陰性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇が、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた前記遺伝子の転写活性化が、タウ凝集を促進または増強する、方法。
（項目８５）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
前記キメラＣａｓタンパク質が、ＶＰ６４転写活性化ドメインに融合した前記ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含み、任意に、前記キメラＣａｓタンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に、前記ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、核局在化シグナル、および前記ＶＰ６４転写活性化因子ドメインを含む、項目８４～８６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８８）
前記アダプタータンパク質が、ＭＳ２コートタンパク質であり、前記キメラアダプタータンパク質中の前記１つ以上の転写活性化ドメインが、ｐ６５転写活性化ドメインおよびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に、前記ＭＳ２コートタンパク質、核局在化シグナル、前記ｐ６５転写活性化ドメイン、および前記ＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み、項目８４～８７のいずれか一項に記載の方法。
（項目８９）
前記キメラＣａｓタンパク質が、配列番号３６を含み、任意に、前記キメラＣａｓタンパク質が、配列番号３８に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目８４～８８のいずれか一項に記載の方法。
（項目９０）
前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号３７を含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号３９に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目８４～８９のいずれか一項に記載の方法。
（項目９１）
前記キメラＣａｓタンパク質、前記キメラアダプタータンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、前記細胞集団において安定して発現される、項目８４～９０のいずれか一項に記載の方法。
（項目９２）
前記キメラＣａｓタンパク質、前記キメラアダプタータンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞集団においてゲノム的に組み込まれる、項目８４～９１のいずれか一項に記載の方法。
（項目９３）
各ガイドＲＮＡが、転写開始部位の２００ｂｐ上流内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする、項目８４～９２のいずれか一項に記載の方法。
（項目９４）
各ガイドＲＮＡが、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つ以上のアダプター結合エレメントを含み、任意に、各ガイドＲＮＡが、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる２つのアダプター結合エレメントを含み、任意に、第１のアダプター結合エレメントが、前記１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第１のループ内にあり、第２のアダプター結合エレメントが、前記１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第２のループ内にあり、任意に、前記アダプター結合エレメントが、配列番号３３に示される配列を含み、
任意に、１つ以上のガイドＲＮＡの各々が、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）部分に融合したＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）部分を含む単一のガイドＲＮＡであり、前記第１のループが、配列番号１７の残基１３～１６に対応するテトラループであり、前記第２のループが、配列番号１７の残基５３～５６に対応するステムループ２である、項目８４～９３のいずれか一項に記載の方法。
（項目９５）
ステップ（ｃ）が約３日～約１４日である、項目７５～９４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９６）
ステップ（ｃ）が約１０日～約１４日である、項目９５に記載の方法。
（項目９７）
ステップ（ｄ）が、細胞周期の進行を同期させて、主にＳ期に濃縮された細胞集団を得ることを含む、項目７５～９６のいずれか一項に記載の方法。
（項目９８）
前記同期が、二重チミジンブロックによって達成される、項目９７に記載の方法。
（項目９９）
前記第１のレポーターおよび前記第２のレポーターが、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対であり、ステップ（ｄ）での前記凝集陽性細胞集団および前記凝集陰性細胞集団が、フローサイトメトリーによって同定される、項目７５～９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１００）
存在量が次世代シーケンシングによって決定される、項目７５～９９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０１）
前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記ガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｄ）での前記凝集陽性細胞集団および／またはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）での前記凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ガイドＲＮＡがステップ（ｄ）での前記凝集陰性細胞集団において濃縮されているとみなされ、前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記ガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｄ）での前記凝集陰性細胞集団および／またはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合、ガイドＲＮＡがステップ（ｄ）での前記凝集陽性細胞集団において枯渇しているとみなされ、あるいは
前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記ガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｄ）での前記凝集陰性細胞集団および／またはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ガイドＲＮＡがステップ（ｄ）での前記凝集陽性細胞集団において濃縮されているとみなされ、前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記ガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｄ）での前記凝集陽性細胞集団および／またはステップ（ｃ）の１つ以上の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）での前記凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合、ガイドＲＮＡがステップ（ｄ）での前記凝集陰性細胞集団において枯渇しているとみなされる、項目７５～１００のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０２）
ステップ（ｅ）が、ステップ（ｄ）での前記凝集陽性細胞集団、ステップ（ｃ）の第１の時点での前記培養された細胞集団、およびステップ（ｃ）の第２の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）での前記凝集陰性細胞集団における前記複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することを含み、かつ／またはステップ（ｅ）が、ステップ（ｅ）での前記凝集陰性細胞集団、ステップ（ｃ）の第１の時点での前記培養された細胞集団、およびステップ（ｃ）の第２の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）での前記凝集陽性細胞集団における前記複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することを含む、項目７５～１０１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０３）
ステップ（ｃ）の前記第１の時点が、前記細胞集団を培養する第１の継代であり、前記第２の時点が、ゲノム編集および拡大または転写活性化および拡大を可能にするために、前記細胞集団の培養の途中である、項目１０２に記載の方法。
（項目１０４）
ステップ（ｃ）の前記第１の時点が、培養の約７日後であり、ステップ（ｃ）の前記第２の時点が、培養の約１０日後である、項目１０３に記載の方法。
（項目１０５）
（Ｉ）遺伝子が、タウ脱凝集の遺伝的修飾因子とみなされ、前記遺伝子の破壊または転写活性化が、
（１）前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｄ）での前記凝集陽性細胞集団、ステップ（ｃ）の前記第１の時点での前記培養された細胞集団、およびステップ（ｃ）の前記第２の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）での前記凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ならびに／または
（２）前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｄ）での前記凝集陽性細胞集団およびステップ（ｃ）の前記第２の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）での前記凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ならびに／または
（３）前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｄ）での前記凝集陰性細胞集団、ステップ（ｃ）の前記第１の時点での前記培養された細胞集団、およびステップ（ｃ）の前記第２の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合、ならびに／または
（４）前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｄ）での前記凝集陰性細胞集団およびステップ（ｃ）の前記第２の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合に、タウ脱凝集を促進し、あるいは
（ＩＩ）遺伝子が、タウ凝集の遺伝的修飾因子とみなされ、前記遺伝子の破壊または転写活性化が、
（１）前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｄ）での前記凝集陰性細胞集団、ステップ（ｃ）の前記第１の時点での前記培養された細胞集団、およびステップ（ｃ）の前記第２の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ならびに／または
（２）前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｄ）での前記凝集陰性細胞集団およびステップ（ｃ）の前記第２の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ならびに／または
（３）前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｄ）での前記凝集陽性細胞集団、ステップ（ｃ）の前記第１の時点での前記培養された細胞集団、およびステップ（ｃ）の前記第２の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）での前記凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合、ならびに／または
（４）前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｄ）での前記凝集陽性細胞集団およびステップ（ｃ）の前記第２の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｄ）での前記凝集陰性細胞集団において少なくとも１．５倍低い場合に、タウ凝集を促進または増強する、項目１０２～１０４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０６）
（Ｉ）以下のステップ：
（１）ステップ（ｄ）で同定された前記凝集陰性細胞集団に、前記複数の固有のガイドＲＮＡのうちのどれが存在するかを同定すること、
（２）式ｎＣｎ’＊（ｘ－ｎ’）Ｃ（ｍ－ｎ）／ｘＣｍを使用して、ステップ（ｅ）（１）で同定された前記ガイドＲＮＡが存在するランダム確率を計算することであって、
式中、ｘが、ステップ（ｂ）で前記細胞集団に導入された様々な固有のガイドＲＮＡであり、
ｍが、ステップ（ｅ）（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡであり、
ｎが、前記遺伝子を標的とするステップ（ｂ）で前記細胞集団に導入され様々な固有のガイドＲＮＡであり、
ｎ’が、前記遺伝子を標的とする、ステップ（ｅ）（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡである、計算すること、
（３）ステップ（ｅ）（１）で同定された前記ガイドＲＮＡの平均濃縮スコアを計算することであって、
ガイドＲＮＡの前記濃縮スコアが、ステップ（ｄ）で同定された前記凝集陰性細胞集団における前記ガイドＲＮＡの相対存在量を、ステップ（ｄ）で同定された前記凝集陽性細胞集団またはステップ（ｃ）の前記第１の時点もしくは前記第２の時点での前記培養された細胞集団における前記ガイドＲＮＡの相対存在量で割ったものであり、
相対存在量が、前記ガイドＲＮＡの読み取りカウントを、前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団の読み取りカウントで割ったものである、計算すること、および
（４）前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが、存在する前記ランダム確率を大幅に下回り、濃縮スコアの閾値を上回っている場合に前記遺伝子を選択することが、タウ凝集の遺伝的修飾因子として遺伝子を同定するためにステップ（ｅ）で施され、前記遺伝子の破壊または転写活性化が、タウ凝集を予防し、あるいは
（ＩＩ）以下のステップ：
（１）ステップ（ｄ）で同定された前記凝集陽性細胞集団に、前記複数の固有のガイドＲＮＡのうちのどれが存在するかを同定すること、
（２）式ｎＣｎ’＊（ｘ－ｎ’）Ｃ（ｍ－ｎ）／ｘＣｍを使用して、ステップ（ｅ）（１）で同定された前記ガイドＲＮＡが存在するランダム確率を計算することであって、
式中、ｘが、ステップ（ｂ）で前記細胞集団に導入された様々な固有のガイドＲＮＡであり、
ｍが、ステップ（ｅ）（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡであり、
ｎが、前記遺伝子を標的とするステップ（ｂ）で前記細胞集団に導入され様々な固有のガイドＲＮＡであり、
ｎ’が、前記遺伝子を標的とする、ステップ（ｅ）（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡである、計算すること、
（３）ステップ（ｅ）（１）で同定された前記ガイドＲＮＡの平均濃縮スコアを計算することであって、
ガイドＲＮＡの前記濃縮スコアが、ステップ（ｄ）で同定された前記凝集陽性細胞集団における前記ガイドＲＮＡの相対存在量を、ステップ（ｄ）で同定された前記凝集陰性細胞集団またはステップ（ｃ）の前記第１の時点もしくは前記第２の時点での前記培養された細胞集団における前記ガイドＲＮＡの相対存在量で割ったものであり、
相対存在量が、前記ガイドＲＮＡの読み取りカウントを、前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団の読み取りカウントで割ったものである、計算すること、および
（４）前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが、存在する前記ランダム確率を大幅に下回り、濃縮スコアの閾値を上回っている場合に前記遺伝子を選択することが、タウ凝集の遺伝的修飾因子として遺伝子を同定するためにステップ（ｅ）で施され、前記遺伝子の破壊または転写活性化が、タウ凝集を促進または増強する、項目７５～１０５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０７）
前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、ヒトタウリピートドメインである、項目１～１０６のいずれかに記載の方法。
（項目１０８）
前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、凝集促進変異を含む、項目１～１０７のいずれかに記載の方法。
（項目１０９）
前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、タウＰ３０１Ｓ変異を含む、項目１０８に記載の方法。
（項目１１０）
前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、タウ４リピートドメインを含む、項目１～１０９のいずれかに記載の方法。
（項目１１１）
前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、配列番号１１を含む、項目１～１１０のいずれかに記載の方法。
（項目１１２）
前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のタウリピートドメインが、同じである、項目１～１１１のいずれかに記載の方法。
（項目１１３）
前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のタウリピートドメインが、同じであり、各々が、タウＰ３０１Ｓ変異を含むタウ４リピートドメインを含む、項目１～１１２のいずれかに記載の方法。
（項目１１４）
前記第１のレポーターおよび前記第２のレポーターが、蛍光タンパク質である、項目１～１１３のいずれかに記載の方法。
（項目１１５）
前記第１のレポーターおよび前記第２のレポーターが、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対である、項目１１４に記載の方法。
（項目１１６）
前記第１のレポーターが、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）であり、前記第２のレポーターが、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）である、項目１１５に記載の方法。
（項目１１７）
前記細胞が、真核細胞である、項目１～１１６のいずれかに記載の方法。
（項目１１８）
前記細胞が、哺乳動物細胞である、項目１１７に記載の方法。
（項目１１９）
前記細胞が、ヒト細胞である、項目１１８に記載の方法。
（項目１２０）
前記細胞が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、項目１１９に記載の方法。
（項目１２１）
前記複数の固有のガイドＲＮＡが、前記細胞の大部分が前記固有のガイドＲＮＡのうちの１つのみを受け取るように選択された濃度で導入される、項目１～１２０のいずれかに記載の方法。
（項目１２２）
前記複数の固有のガイドＲＮＡが、１００以上の遺伝子、１０００以上の遺伝子、または１００００以上の遺伝子を標的とする、項目１～１２１のいずれかに記載の方法。
（項目１２３）
前記ライブラリが、ゲノムワイドライブラリである、項目１～１２２のいずれかに記載の方法。
（項目１２４）
複数の標的配列が、前記標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される、項目１～１２３のいずれかに記載の方法。
（項目１２５）
少なくとも３つの標的配列が、前記標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される、項目１２４に記載の方法。
（項目１２６）
約３～約６個の標的配列が、前記標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される、項目１２５に記載の方法。
（項目１２７）
前記複数の固有のガイドＲＮＡが、ウイルス形質導入によって前記細胞集団に導入される、項目１～１２６のいずれかに記載の方法。
（項目１２８）
前記複数の固有のガイドＲＮＡの各々が、別個のウイルスベクター内にある、項目１２７に記載の方法。
（項目１２９）
前記複数の固有のガイドＲＮＡが、レンチウイルス形質導入によって前記細胞集団に導入される、項目１２７または１２８に記載の方法。
（項目１３０）
前記細胞集団が、約０．３未満の感染多重度で感染する、項目１２７～１２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３１）
前記複数の固有のガイドＲＮＡが、選択マーカーと共に前記細胞集団に導入され、ステップ（ｂ）が、前記選択マーカーを含む細胞を選択することをさらに含む、項目１～１３０のいずれかに記載の方法。
（項目１３２）
前記選択マーカーが、薬物に対する耐性を付与し、任意に、前記選択マーカーが、ピューロマイシンまたはゼオシンに対する耐性を付与する、項目１３１に記載の方法。
（項目１３３）
前記選択マーカーが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、およびブラストサイジンＳデアミナーゼから選択される、項目１３２に記載の方法。
（項目１３４）
ステップ（ｂ）において前記複数の固有のガイドＲＮＡが導入される前記細胞集団が、固有のガイドＲＮＡあたり約３００個を超える細胞を含む、項目１～１３３のいずれかに記載の方法。
（項目１３５）
Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインを含む、１つ以上の細胞の集団。
（項目１３６）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、項目１３５に記載の細胞集団。
（項目１３７）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である、項目１３６に記載の細胞集団。
（項目１３８）
前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号２１を含み、任意に、前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号２２に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目１３７に記載の細胞集団。
（項目１３９）
前記Ｃａｓタンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、前記細胞において安定して発現される、項目１３５～１３８のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目１４０）
前記Ｃａｓタンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞においてゲノム的に組み込まれる、項目１３５～１３９のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目１４１）
１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラＣａｓタンパク質と、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質と、第１のレポーター連結された第１のタウリピートドメインと、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインと、を含む、１つ以上の細胞の集団。
（項目１４２）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、項目１４１に記載の細胞集団。
（項目１４３）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である、項目１４２に記載の細胞集団。
（項目１４４）
前記キメラＣａｓタンパク質が、ＶＰ６４転写活性化ドメインに融合した前記ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含み、任意に、前記キメラＣａｓタンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に、前記ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、核局在化シグナル、および前記ＶＰ６４転写活性化因子ドメインを含む、項目１４１～１４３のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目１４５）
前記アダプタータンパク質が、ＭＳ２コートタンパク質であり、前記キメラアダプタータンパク質中の前記１つ以上の転写活性化ドメインが、ｐ６５転写活性化ドメインおよびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に、前記ＭＳ２コートタンパク質、核局在化シグナル、前記ｐ６５転写活性化ドメイン、および前記ＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み、項目１４１～１４４のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目１４６）
前記キメラＣａｓタンパク質が、配列番号３６を含み、任意に、前記キメラＣａｓタンパク質が、配列番号３８に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目１４１～１４５のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目１４７）
前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号３７を含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号３９に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目１４１～１４６のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目１４８）
前記キメラＣａｓタンパク質、前記キメラアダプタータンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、前記細胞において安定して発現される、項目１４１～１４７のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目１４９）
前記キメラＣａｓタンパク質、前記キメラアダプタータンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞においてゲノム的に組み込まれる、項目１４１～１４８のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目１５０）
前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、ヒトタウリピートドメインである、項目１３５～１４９のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目１５１）
前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、凝集促進変異を含む、項目１３５～１５０のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目１５２）
前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、タウＰ３０１Ｓ変異を含む、項目１５１に記載の細胞集団。
（項目１５３）
前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、タウ４リピートドメインを含む、項目１３５～１５２のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目１５４）
前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、配列番号１１を含む、項目１３５～１５３のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目１５５）
前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のタウリピートドメインが、同じである、項目１３５～１５４のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目１５６）
前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のタウリピートドメインが、同じであり、各々が、タウＰ３０１Ｓ変異を含むタウ４リピートドメインを含む、項目１３５～１５５のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目１５７）
前記第１のレポーターおよび前記第２のレポーターが、蛍光タンパク質である、項目１３５～１５６のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目１５８）
前記第１のレポーターおよび前記第２のレポーターが、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対である、項目１５７に記載の細胞集団。
（項目１５９）
前記第１のレポーターが、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）であり、前記第２のレポーターが、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）である、項目１５８に記載の細胞集団。
（項目１６０）
前記細胞が、真核細胞である、項目１３５～１５９のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目１６１）
前記細胞が、哺乳動物細胞である、項目１６０に記載の細胞集団。
（項目１６２）
前記細胞が、ヒト細胞である、項目１６１に記載の細胞集団。
（項目１６３）
前記細胞が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、項目１６２に記載の細胞集団。
（項目１６４）
前記細胞が、インビトロである、項目１３５～１６３のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目１６５）
前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、凝集状態で安定して存在していない、項目１３５～１６４のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目１６６）
前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、凝集状態で安定して存在する、項目１３５～１６５のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目１６７）
項目１３５～１６６のいずれか一項に記載の細胞集団、およびタウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する培養されたタウ凝集陽性細胞から採取された馴化培地を含む培養培地を含む、インビトロ培養物。
（項目１６８）
前記馴化培地が、コンフルエントなタウ凝集陽性細胞上に約１日～約７日間置いた後に採取された、項目１６７に記載のインビトロ培養物。
（項目１６９）
前記馴化培地が、コンフルエントなタウ凝集陽性細胞上に約４日間置いた後に採取された、項目１６８に記載のインビトロ培養物。
（項目１７０）
前記培養培地中に約７５％の馴化培地および約２５％の新鮮な培地を含む、項目１６７～１６９のいずれか一項に記載のインビトロ培養物。
（項目１７１）
前記細胞集団が、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する前記培養されたタウ凝集陽性細胞と共培養されない、項目１６７～１７０のいずれか一項に記載のインビトロ培養物。
（項目１７２）
項目１３５～１６６のいずれか一項に記載の細胞集団、およびタウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する培養されたタウ凝集陽性細胞からの細胞溶解物を含む培養培地を含む。インビトロ培養物。
（項目１７３）
前記培地中の前記細胞溶解物が、約１～約５μｇ／ｍＬの濃度である、項目１７２に記載のインビトロ培養物。
（項目１７４）
前記細胞溶解物を含む前記培地が、リポフェクタミンまたは別のトランスフェクション試薬をさらに含む、項目１７３に記載のインビトロ培養物。
（項目１７５）
前記細胞溶解物を含む前記培地が、約１．５～約４μＬ／ｍＬの濃度でリポフェクタミンを含む、項目１７４に記載のインビトロ培養物。
（項目１７６）
前記細胞溶解物が、プロテアーゼ阻害剤を含む緩衝液中に前記細胞を収集した後、約２分～約４分間の前記タウ凝集陽性細胞の超音波処理によって生成された、項目１７２～１７５のいずれか一項に記載のインビトロ培養物。
（項目１７７）
タウ凝集を誘導するための馴化培地を生成する方法であって、
（ａ）タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在するタウ凝集陽性細胞集団を提供することと、
（ｂ）培地中で前記タウ凝集陽性細胞集団を培養して、馴化培地を生成することと、
（ｃ）前記馴化培地を採取することと、を含む、方法。
（項目１７８）
前記タウ凝集陽性細胞が、ステップ（ｂ）でコンフルエントになるまで培養される、項目１７７に記載の方法。
（項目１７９）
前記馴化培地が、ステップ（ｃ）において前記コンフルエントなタウ凝集陽性細胞上に約１日～約７日間置いた後に採取される、項目１７８に記載の方法。
（項目１８０）
前記馴化培地が、ステップ（ｃ）において前記コンフルエントなタウ凝集陽性細胞上に約４日間置いた後に採取される、項目１７９に記載の方法。
（項目１８１）
タウ凝集陽性細胞の集団を生成する方法であって、
（ａ）項目１７７～１８０のいずれか一項に記載の方法に従ってタウ凝集を誘導するために馴化培地を生成することと、
（ｂ）前記馴化培地を含む培養培地中でタウリピートドメインを含むタンパク質を含む細胞集団を培養して、前記タウ凝集陽性細胞集団を生成することと、を含む、方法。
（項目１８２）
前記培養培地中に約７５％の馴化培地および約２５％の新鮮な培地を含む、項目１８１に記載の方法。
（項目１８３）
前記細胞集団が、前記馴化培地を生成するための前記方法で使用される前記タウ凝集陽性細胞と共培養されない、項目１８１または１８２に記載の方法。
（項目１８４）
前記タウリピートドメインが、凝集促進変異を含む、項目１８１～１８３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８５）
前記タウリピートドメインが、タウＰ３０１Ｓ変異を含む、項目１８１～１８４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８６）
前記タウリピートドメインが、タウ４リピートドメインを含む、項目１８１～１８５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８７）
前記タウリピートドメインが、配列番号１１を含む、項目１８１～１８６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８８）
タウ凝集を誘導するための培養されたタウ凝集陽性細胞から細胞溶解物を含む培地を生成する方法であって、
（ａ）タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在するタウ凝集陽性細胞集団を提供することと、
（ｂ）プロテアーゼ阻害剤を含む緩衝液に前記タウ凝集陽性細胞を収集することと、
（ｃ）前記タウ凝集陽性細胞を約２分～約４分間超音波処理して、前記細胞溶解物を生成することと、
（ｄ）前記細胞溶解物を増殖培地に添加することと、を含む、方法。
（項目１８９）
前記増殖培地中の前記細胞溶解物が、約１～約５μｇ／ｍＬの濃度である、項目１８８に記載の方法。
（項目１９０）
ステップ（ｄ）において、リポフェクタミンまたは別のトランスフェクション試薬を前記増殖培地に添加することをさらに含む、項目１８９に記載の方法。
（項目１９１）
ステップ（ｄ）が、約１．５～約４μＬ／ｍＬの濃度でリポフェクタミンを添加することを含む、項目１９０に記載の方法。
（項目１９２）
タウ凝集陽性細胞の集団を生成する方法であって、
（ａ）項目１８８～１９１のいずれか一項に記載の方法に従って、培養されたタウ凝集陽性細胞からの細胞溶解物を含む培地を生成することと、
（ｂ）培養されたタウ凝集陽性細胞からの細胞溶解物を含む前記培地中でタウリピートドメインを含むタンパク質を含む細胞集団を培養することと、を含む、方法。
（項目１９３）
前記細胞集団が、前記馴化培地を生成するための前記方法で使用される前記タウ凝集陽性細胞と共培養されない、項目１９２に記載の方法。
（項目１９４）
前記タウリピートドメインが、凝集促進変異を含む、項目１９２または１９３に記載の方法。
（項目１９５）
前記タウリピートドメインが、タウＰ３０１Ｓ変異を含む、項目１９２～１９４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９６）
前記タウリピートドメインが、タウ４リピートドメインを含む、項目１９２～１９５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９７）
前記タウリピートドメインが、配列番号１１を含む、項目１９２～１９６のいずれか一項に記載の方法。

Claims (28)

  1. タウ凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインを含む細胞集団を提供することであって、
    前記細胞が哺乳動物細胞であり、
    前記第１のレポーターおよび前記第２のレポーターが蛍光タンパク質であり、前記第１のレポーターおよび前記第２のレポーターが、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対である、提供すること、
    （ｂ）複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを前記細胞集団に導入することと、
    （ｃ）ゲノムの編集および拡大を可能にするために前記細胞集団を培養することであって、前記複数の固有のガイドＲＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、前記Ｃａｓタンパク質が、前記複数の遺伝子を切断して遺伝子機能のノックアウトをもたらし、遺伝子修飾された細胞集団を生成する、培養することと、
    （ｄ）前記遺伝子修飾された細胞集団をタウ播種剤と接触させて、播種された細胞集団を生成することと、
    （ｅ）タウ凝集体の形成を可能にするために前記播種された細胞集団を培養することであって、前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のタウリピートドメインの凝集体が、前記播種された細胞集団のサブセットに形成されて、凝集陽性細胞集団を生成する、培養することと、
    （ｆ）ステップ（ｃ）での前記遺伝子修飾された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された前記凝集陽性細胞集団における前記複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することと、を含み、
    前記接触が、前記タウ播種剤の存在下で、前記遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含み、前記タウ播種剤が、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する培養されたタウ凝集陽性細胞から採取された馴化培地を含み、前記馴化培地が、コンフルエントなタウ凝集陽性細胞上に１日～７日間置いた後に採取され、
    ステップ（ｃ）での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された前記凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮が、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた前記遺伝子の破壊が、タウ凝集を増強する、方法。
  2. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質であり、任意に、前記Ｃａｓタンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質であり、任意に、前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号２１を含み、任意に、前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号２２に示される配列を含むコード配列によってコードされる、請求項１に記載の方法。
  3. 前記Ｃａｓタンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、前記細胞集団において安定して発現される、または
    前記Ｃａｓタンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞集団においてゲノム的に組み込まれる、請求項１または２に記載の方法。
  4. 各ガイドＲＮＡが、構成的エクソンを標的とし、任意に、各ガイドＲＮＡが、５’構成的エクソンを標的とする、または
    各ガイドＲＮＡが、第１のエクソン、第２のエクソン、または第３のエクソンを標的とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. タウ凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラＣａｓタンパク質と、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質と、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインと、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインと、を含む細胞集団を提供することであって、
    前記細胞が哺乳動物細胞であり、
    前記第１のレポーターおよび前記第２のレポーターが蛍光タンパク質であり、前記第１のレポーターおよび前記第２のレポーターが、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対である、提供することと、
    （ｂ）複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを前記細胞集団に導入することと、
    （ｃ）転写活性化および拡大を可能にするために前記細胞集団を培養することであって、前記複数の固有のガイドＲＮＡが、前記キメラＣａｓタンパク質および前記キメラアダプタータンパク質と複合体を形成し、前記複合体が、前記複数の遺伝子の転写を活性化して遺伝子発現の増加をもたらし、遺伝子修飾された細胞集団を生成する、培養することと、
    （ｄ）前記遺伝子修飾された細胞集団をタウ播種剤と接触させて、播種された細胞集団を生成することと、
    （ｅ）タウ凝集体の形成を可能にするために前記播種された細胞集団を培養することであって、前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のタウリピートドメインの凝集体が、前記播種された細胞集団のサブセットに形成されて、凝集陽性細胞集団を生成する、培養することと、
    （ｆ）ステップ（ｃ）での前記遺伝子修飾された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された前記凝集陽性細胞集団における前記複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することと、を含み、
    前記接触が、前記タウ播種剤の存在下で、前記遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含み、前記タウ播種剤が、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する培養されたタウ凝集陽性細胞から採取された馴化培地を含み、前記馴化培地が、コンフルエントなタウ凝集陽性細胞上に１日～７日間置いた後に採取され、
    ステップ（ｃ）での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）で同定された前記凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの濃縮が、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた前記遺伝子の転写活性化が、タウ凝集を増強する、方法。
  6. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質であり、任意に、前記Ｃａｓタンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質であり、
    前記キメラＣａｓタンパク質が、ＶＰ６４転写活性化ドメインに融合した前記ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含み、任意に、前記キメラＣａｓタンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に、前記ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、核局在化シグナル、および前記ＶＰ６４転写活性化因子ドメインを含み、任意に、前記キメラＣａｓタンパク質が、配列番号３６を含み、任意に、前記キメラＣａｓタンパク質が、配列番号３８に示される配列を含むコード配列によってコードされ、
    前記アダプタータンパク質が、ＭＳ２コートタンパク質であり、前記キメラアダプタータンパク質中の前記１つ以上の転写活性化ドメインが、ｐ６５転写活性化ドメインおよびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に、前記ＭＳ２コートタンパク質、核局在化シグナル、前記ｐ６５転写活性化ドメイン、および前記ＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号３７を含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号３９に示される配列を含むコード配列によってコードされる、
    請求項５に記載の方法。
  7. 前記キメラＣａｓタンパク質、前記キメラアダプタータンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、前記細胞集団において安定して発現される、または
    前記キメラＣａｓタンパク質、前記キメラアダプタータンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞集団においてゲノム的に組み込まれる、請求項５または６に記載の方法。
  8. 各ガイドＲＮＡが、転写開始部位の２００ｂｐ上流内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とし、
    各ガイドＲＮＡが、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つ以上のアダプター結合エレメントを含み、任意に、各ガイドＲＮＡが、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる２つのアダプター結合エレメントを含み、任意に、第１のアダプター結合エレメントが、前記１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第１のループ内にあり、第２のアダプター結合エレメントが、前記１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第２のループ内にあり、任意に、前記アダプター結合エレメントが、配列番号３３に示される配列を含み、
    任意に、１つ以上のガイドＲＮＡの各々が、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）部分に融合したＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）部分を含む単一のガイドＲＮＡであり、前記第１のループが、配列番号１７の残基１３～１６に対応するテトラループであり、前記第２のループが、配列番号１７の残基５３～５６に対応するステムループ２である、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. ステップ（ｃ）が約３日～約９日であり、任意に、ステップ（ｃ）が約６日である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記馴化培地が、コンフルエントなタウ凝集陽性細胞上に約４日間置いた後に採取された、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. ステップ（ｄ）が、約７５％の馴化培地および約２５％の新鮮な培地中で前記遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記遺伝子修飾された細胞集団が、前記タウ凝集陽性細胞と共培養されない、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. ステップ（ｅ）が約２日～約６日であり、任意に、ステップ（ｅ）が約４日である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 存在量が次世代シーケンシングによって決定される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記ガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｃ）での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、ガイドＲＮＡが濃縮されているとみなされる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. ステップ（ｆ）が、ステップ（ｃ）の第１の時点および／またはステップ（ｃ）の第２の時点で、ステップ（ｃ）での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での前記凝集陽性細胞集団において前記複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することを含み、
    任意に、ステップ（ｃ）の前記第１の時点が、前記細胞集団を培養する第１の継代であり、前記第２の時点が、ゲノム編集および拡大または転写活性化および拡大を可能にするために、前記細胞集団の培養の途中であり、
    任意に、ステップ（ｃ）の前記第１の時点が、培養の約３日後であり、ステップ（ｃ）の前記第２の時点が、培養の約６日後である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. （１）前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｃ）の前記第１の時点およびステップ（ｃ）の前記第２の時点の両方で、ステップ（ｃ）での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、および／または
    （２）前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団に対する前記遺伝子を標的とする少なくとも２つの固有のガイドＲＮＡの存在量が、ステップ（ｃ）の前記第１の時点またはステップ（ｃ）の前記第２の時点のいずれかで、ステップ（ｃ）での前記培養された細胞集団に対して、ステップ（ｅ）での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも１．５倍高い場合、遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子とみなされ、前記遺伝子の破壊または転写活性化がタウ凝集を増強する、請求項１６に記載の方法。
  18. 以下のステップ：
    （１）ステップ（ｅ）で生成された前記凝集陽性細胞集団に、前記複数の固有のガイドＲＮＡのうちのどれが存在するかを同定すること、
    （２）式ｎＣｎ’＊（ｘ－ｎ’）Ｃ（ｍ－ｎ）／ｘＣｍを使用して、ステップ（ｆ）（１）で同定された前記ガイドＲＮＡが存在するランダム確率を計算することであって、
    式中、ｘが、ステップ（ｂ）で前記細胞集団に導入された様々な固有のガイドＲＮＡであり、
    ｍが、ステップ（ｆ）（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡであり、
    ｎが、前記遺伝子を標的とするステップ（ｂ）で前記細胞集団に導入された様々な固有のガイドＲＮＡであり、
    ｎ’が、前記遺伝子を標的とする、ステップ（ｆ）（１）で同定された様々な固有のガイドＲＮＡである、計算すること、
    （３）ステップ（ｆ）（１）で同定された前記ガイドＲＮＡの平均濃縮スコアを計算することであって、
    ガイドＲＮＡの前記濃縮スコアが、ステップ（ｅ）で生成された前記凝集陽性細胞集団における前記ガイドＲＮＡの相対存在量を、ステップ（ｃ）での前記培養された細胞集団における前記ガイドＲＮＡの相対存在量で割ったものであり、
    相対存在量が、前記ガイドＲＮＡの読み取りカウントを、前記複数の固有のガイドＲＮＡの合計集団の読み取りカウントで割ったものである、計算すること、および
    （４）前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが、存在する前記ランダム確率を大幅に下回り、濃縮スコアの閾値を上回っている場合に前記遺伝子を選択することが、タウ凝集の遺伝的修飾因子として遺伝子を同定するためにステップ（ｆ）で施され、前記遺伝子の破壊または転写活性化が、タウ凝集を増強する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、ヒトタウリピートドメインである、かつ／または
    前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、凝集促進変異を含み、任意に、前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、タウＰ３０１Ｓ変異を含む、かつ／または
    前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、タウ４リピートドメインを含む、かつ／または
    前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、配列番号１１を含む、かつ／または
    前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のタウリピートドメインが、同じである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のタウリピートドメインが、同じであり、各々が、タウＰ３０１Ｓ変異を含むタウ４リピートドメインを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記第１のレポーターが、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）であり、前記第２のレポーターが、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記細胞が、ヒト細胞であり、任意に、前記細胞が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記複数の固有のガイドＲＮＡが、前記細胞の大部分が前記固有のガイドＲＮＡのうちの１つのみを受け取るように選択された濃度で導入される、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記複数の固有のガイドＲＮＡが、１００以上の遺伝子、１０００以上の遺伝子、または１００００以上の遺伝子を標的とする、または
    前記ライブラリが、ゲノムワイドライブラリである、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 複数の標的配列が、前記標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化され、
    任意に、少なくとも３つの標的配列が、前記標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化され、
    任意に、約３～約６個の標的配列が、前記標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記複数の固有のガイドＲＮＡが、ウイルス形質導入によって前記細胞集団に導入され、
    任意に、前記複数の固有のガイドＲＮＡの各々が、別個のウイルスベクター内にあり、
    任意に、前記複数の固有のガイドＲＮＡが、レンチウイルス形質導入によって前記細胞集団に導入され、
    任意に、前記細胞集団が、約０．３未満の感染多重度で感染する、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記複数の固有のガイドＲＮＡが、選択マーカーと共に前記細胞集団に導入され、ステップ（ｂ）が、前記選択マーカーを含む細胞を選択することをさらに含み、
    任意に、前記選択マーカーが、薬物に対する耐性を付与し、任意に、前記選択マーカーが、ピューロマイシンまたはゼオシンに対する耐性を付与し、
    任意に、前記選択マーカーが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、およびブラストサイジンＳデアミナーゼから選択される、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. ステップ（ｂ）において前記複数の固有のガイドＲＮＡが導入される前記細胞集団が、固有のガイドＲＮＡあたり約３００個を超える細胞を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
JP2021556257A 2019-03-18 2020-03-17 タウの播種または凝集の遺伝的修飾因子を同定するためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓスクリーニングプラットフォーム Active JP7461368B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2024046338A JP2024071489A (ja) 2019-03-18 2024-03-22 タウの播種または凝集の遺伝的修飾因子を同定するためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓスクリーニングプラットフォーム

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962820086P 2019-03-18 2019-03-18
US62/820,086 2019-03-18
PCT/US2020/023131 WO2020190932A1 (en) 2019-03-18 2020-03-17 Crispr/cas screening platform to identify genetic modifiers of tau seeding or aggregation

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2024046338A Division JP2024071489A (ja) 2019-03-18 2024-03-22 タウの播種または凝集の遺伝的修飾因子を同定するためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓスクリーニングプラットフォーム

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2022526099A JP2022526099A (ja) 2022-05-23
JPWO2020190932A5 JPWO2020190932A5 (ja) 2023-09-27
JP7461368B2 true JP7461368B2 (ja) 2024-04-03

Family

ID=70285889

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021556257A Active JP7461368B2 (ja) 2019-03-18 2020-03-17 タウの播種または凝集の遺伝的修飾因子を同定するためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓスクリーニングプラットフォーム
JP2024046338A Pending JP2024071489A (ja) 2019-03-18 2024-03-22 タウの播種または凝集の遺伝的修飾因子を同定するためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓスクリーニングプラットフォーム

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2024046338A Pending JP2024071489A (ja) 2019-03-18 2024-03-22 タウの播種または凝集の遺伝的修飾因子を同定するためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓスクリーニングプラットフォーム

Country Status (11)

Country Link
US (2) US11845931B2 (ja)
EP (2) EP4317950A3 (ja)
JP (2) JP7461368B2 (ja)
KR (1) KR20210141522A (ja)
CN (1) CN113631700A (ja)
AU (1) AU2020241858A1 (ja)
CA (1) CA3127813A1 (ja)
ES (1) ES2970541T3 (ja)
IL (1) IL286357A (ja)
SG (1) SG11202108091YA (ja)
WO (1) WO2020190932A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3127814C (en) 2019-03-18 2024-05-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas dropout screening platform to reveal genetic vulnerabilities associated with tau aggregation
EP4317950A3 (en) 2019-03-18 2024-04-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas screening platform to identify genetic modifiers of tau seeding or aggregation
WO2020252340A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Models of tauopathy
WO2023046996A1 (en) * 2021-09-27 2023-03-30 Cemm - Forschungszentrum Für Molekulare Medizin Gmbh Method for improved intron tagging and automated clone recognition

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009126161A1 (en) 2008-04-11 2009-10-15 Utc Fuel Cells, Llc Fuel cell and bipolar plate having manifold sump
CA2798988C (en) 2010-05-17 2020-03-10 Sangamo Biosciences, Inc. Tal-effector (tale) dna-binding polypeptides and uses thereof
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
NZ728024A (en) 2012-05-25 2019-05-31 Univ California Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription
SG11201408626YA (en) * 2012-07-03 2015-03-30 Univ Washington Antibodies to tau
WO2014033644A2 (en) 2012-08-28 2014-03-06 Novartis Ag Methods of nuclease-based genetic engineering
EP3346003B1 (en) 2012-10-23 2021-06-09 Toolgen Incorporated Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof
WO2014089104A1 (en) 2012-12-03 2014-06-12 Washington University Method for detection of aggregates in biological samples
WO2014089290A1 (en) 2012-12-06 2014-06-12 Sigma-Aldrich Co. Llc Crispr-based genome modification and regulation
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
EP2840140B2 (en) 2012-12-12 2023-02-22 The Broad Institute, Inc. Crispr-Cas based method for mutation of prokaryotic cells
EP2940140B1 (en) 2012-12-12 2019-03-27 The Broad Institute, Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions for sequence manipulation
IL293526A (en) 2012-12-12 2022-08-01 Harvard College Providing, engineering and optimizing systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
EP2931899A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
WO2014099750A2 (en) 2012-12-17 2014-06-26 President And Fellows Of Harvard College Rna-guided human genome engineering
JP2016507244A (ja) 2013-02-27 2016-03-10 ヘルムホルツ・ツェントルム・ミュンヒェン・ドイチェス・フォルシュンクスツェントルム・フューア・ゲズントハイト・ウント・ウムベルト（ゲーエムベーハー）Ｈｅｌｍｈｏｌｔｚ Ｚｅｎｔｒｕｍ ＭｕｅｎｃｈｅｎＤｅｕｔｓｃｈｅｓ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ ｆｕｅｒ Ｇｅｓｕｎｄｈｅｉｔ ｕｎｄ Ｕｍｗｅｌｔ （ＧｍｂＨ） Ｃａｓ９ヌクレアーゼによる卵母細胞における遺伝子編集
KR102405549B1 (ko) 2013-03-15 2022-06-08 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 Rna-안내 게놈 편집을 위해 특이성을 증가시키기 위한 절단된 안내 rna(tru-grnas)의 이용
JP2016522679A (ja) 2013-04-04 2016-08-04 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いたゲノム編集の治療的使用
US9267135B2 (en) 2013-06-04 2016-02-23 President And Fellows Of Harvard College RNA-guided transcriptional regulation
WO2014204727A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
WO2015048577A2 (en) 2013-09-27 2015-04-02 Editas Medicine, Inc. Crispr-related methods and compositions
WO2015065964A1 (en) 2013-10-28 2015-05-07 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof
EP3104870A4 (en) * 2014-02-14 2017-09-13 Ipierian, Inc. Tau peptides, anti-tau antibodies, and methods of use thereof
US20150376586A1 (en) 2014-06-25 2015-12-31 Caribou Biosciences, Inc. RNA Modification to Engineer Cas9 Activity
CA2953559C (en) * 2014-06-26 2023-10-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for targeted genetic modifications and methods of use
WO2016011080A2 (en) 2014-07-14 2016-01-21 The Regents Of The University Of California Crispr/cas transcriptional modulation
WO2016049258A2 (en) 2014-09-25 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Functional screening with optimized functional crispr-cas systems
WO2016106236A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 The Broad Institute Inc. Rna-targeting system
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
WO2017015637A1 (en) 2015-07-22 2017-01-26 Duke University High-throughput screening of regulatory element function with epigenome editing technologies
CN109310784B (zh) 2015-12-07 2022-08-19 阿克生物公司 用于制备和使用指导核酸的方法和组合物
AU2017208094A1 (en) * 2016-01-14 2018-08-09 Upside Foods, Inc. Methods for extending the replicative capacity of somatic cells during an ex vivo cultivation process
AU2017244143A1 (en) 2016-03-30 2018-10-11 Intellia Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations for CRISPR/Cas components
WO2017172764A1 (en) 2016-04-01 2017-10-05 The Regents Of The University Of California Modified cell line and method of determining tauopathies
JP7217710B2 (ja) 2017-01-04 2023-02-03 ハー・ルンドベック・アクチエゼルスカベット 眼疾患の治療のための過リン酸化タウに特異的な抗体
GB201708998D0 (en) 2017-06-06 2017-07-19 Univ Leuven Kath Methods for identifying activators and suppressors
US20200202981A1 (en) 2017-07-07 2020-06-25 The Broad Institute, Inc. Methods for designing guide sequences for guided nucleases
US11130999B2 (en) 2017-07-31 2021-09-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cas-ready mouse embryonic stem cells and mice and uses thereof
CA3089331A1 (en) 2018-03-19 2019-09-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transcription modulation in animals using crispr/cas systems
EP4317950A3 (en) 2019-03-18 2024-04-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas screening platform to identify genetic modifiers of tau seeding or aggregation
JP2022525941A (ja) 2019-03-18 2022-05-20 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｃｒｉｓｐｒ選択のための方法およびシステム
CA3127814C (en) 2019-03-18 2024-05-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas dropout screening platform to reveal genetic vulnerabilities associated with tau aggregation
WO2020252340A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Models of tauopathy

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ACS Chem. Biol.，2018年，Vol.13，pp.406-416
Mol. Biol. Cell，2016年，Vol.27, No.5，p.4803 (B260)
PNAS，2014年，Vol.111, No.41，pp.E4376-4385

Also Published As

Publication number Publication date
EP3768826A1 (en) 2021-01-27
JP2024071489A (ja) 2024-05-24
EP3768826B1 (en) 2023-12-13
EP4317950A2 (en) 2024-02-07
IL286357A (en) 2021-10-31
AU2020241858A1 (en) 2021-08-12
EP3768826C0 (en) 2023-12-13
US20240084293A1 (en) 2024-03-14
US20200299682A1 (en) 2020-09-24
ES2970541T3 (es) 2024-05-29
WO2020190932A1 (en) 2020-09-24
JP2022526099A (ja) 2022-05-23
CN113631700A (zh) 2021-11-09
KR20210141522A (ko) 2021-11-23
US11845931B2 (en) 2023-12-19
CA3127813A1 (en) 2020-09-24
SG11202108091YA (en) 2021-08-30
EP4317950A3 (en) 2024-04-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7461368B2 (ja) タウの播種または凝集の遺伝的修飾因子を同定するためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓスクリーニングプラットフォーム
US11781131B2 (en) CRISPR/Cas dropout screening platform to reveal genetic vulnerabilities associated with tau aggregation
US20230083163A1 (en) Methods and compositions for studying cell evolution
US20240076613A1 (en) Models of tauopathy
US20030143597A1 (en) Methods for making polynucleotide libraries, polynucleotide arrays, and cell libraries for high-throughput genomics analysis
JP2022514567A (ja) ヌクレアーゼ媒介リピート伸長
RU2819350C2 (ru) Скрининговая платформа crispr/cas для идентификации генетических модификаторов засева или агрегации тау-белка
RU2808829C2 (ru) Платформа crispr/cas для исключающего скрининга для выявления генетических уязвимостей, связанных с агрегацией тау-белка
EP3896155A1 (en) Production method for genome-edited cells
US20040137490A1 (en) Methods for making polynucleotide libraries, polynucleotide arrays, and cell libraries for high-throughput genomics analysis
CN116254246A (zh) 工程化cas12b效应蛋白及其使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230306

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230306

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230919

A871 Explanation of circumstances concerning accelerated examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871

Effective date: 20230919

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20231025

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240115

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20240221

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20240322

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7461368

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150