JP7457653B2 - 新規crispr dnaターゲティング酵素及びシステム - Google Patents
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Description
本願は、2018年3月14日に出願された米国特許出願第62/642,919号明細書;2018年5月3日に出願された米国特許出願第62/666,397号明細書;2018年5月16日に出願された米国特許出願第62/672,489号明細書;2018年6月1日に出願された米国特許出願第62/679,628号明細書;2018年7月26日に出願された米国特許出願第62/703,857号明細書;2018年10月3日に出願された米国特許出願第62/740,856号明細書;2018年10月16日に出願された米国特許出願第62/746,528号明細書;2018年11月27日に出願された米国特許出願第62/772,038号明細書;及び2018年12月5日に出願された米国特許出願第62/775,885号明細書の優先権の利益を主張する。前述の出願の各々の内容は、本明細書によって全体として参照により援用される。
ここで複合体は、スペーサー配列の少なくとも15ヌクレオチドと相補的な標的核酸配列に結合し;及びここで複合体が標的核酸配列に結合したことに応じて、V-I型CRISPR-Casエフェクタータンパク質が標的核酸を切断し、それにより対象の病態又は疾患を治療する。例えば、病態又は疾患は癌又は感染性疾患であってもよい。例えば、病態又は疾患は癌であってもよく、ここで癌は、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、神経内分泌腫瘍、膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、皮膚癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、肝癌、腎癌、膵癌、肺癌、胆道癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、甲状腺髄様癌、卵巣癌、神経膠腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、及び膀胱癌からなる群から選択される。
a)標的核酸のターゲティング及び編集方法;
b)DNA標的核酸の認識に応じた一本鎖DNAの非特異的分解方法;
c)二本鎖標的DNAのスペーサー相補鎖の認識に応じた二本鎖標的DNAの非スペーサー相補鎖のターゲティング及びニッキング方法;
d)二本鎖標的DNAのターゲティング及び切断方法;
e)試料中の標的核酸の検出方法;
f)二本鎖核酸の特異的編集方法;
g)二本鎖核酸の塩基編集方法;
h)細胞における遺伝子型特異的又は転写状態特異的細胞死又は休眠の誘導方法、
i)二本鎖標的DNAにおけるインデルの作成方法;
j)二本鎖標的DNAへの配列の挿入方法、又は
k)二本鎖標的DNAにおける配列の欠失又は逆位形成方法
における本明細書に記載されるとおりのシステム又は細胞の使用も提供する。
a)標的核酸のターゲティング及び編集方法;
b)DNA標的核酸の認識に応じた一本鎖DNAの非特異的分解方法;
c)二本鎖標的DNAのスペーサー相補鎖の認識に応じた二本鎖標的DNAの非スペーサー相補鎖のターゲティング及びニッキング方法;
d)二本鎖標的DNAのターゲティング及び切断方法;
e)試料中の標的核酸の検出方法;
f)二本鎖核酸の特異的編集方法;
g)二本鎖核酸の塩基編集方法;
h)細胞における遺伝子型特異的又は転写状態特異的細胞死又は休眠の誘導方法;
i)二本鎖標的DNAにおけるインデルの作成方法;
j)二本鎖標的DNAへの配列の挿入方法、又は
k)二本鎖標的DNAにおける配列の欠失又は逆位形成方法
における本明細書に記載されるシステム又は細胞の使用を提供し、
ここでこの方法は、ヒトの生殖細胞系列遺伝子のアイデンティティを修飾するプロセスを含まず、且つヒト又は動物の生体の治療方法を含まない。
(i)少なくとも1つの遺伝子産物の発現の変化を含む真核細胞;
(ii)少なくとも1つの遺伝子産物の発現の変化を含む真核細胞であって、少なくとも1つの遺伝子産物の発現が増加するもの;
(iii)少なくとも1つの遺伝子産物の発現の変化を含む真核細胞であって、少なくとも1つの遺伝子産物の発現が減少するもの;又は
(iv)編集されたゲノムを含む真核細胞
を生じさせることができる。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される:
(項目1)
V-I型(CLUST.029130)RNAガイド又は前記V-I型RNAガイドをコードする核酸であって、ダイレクトリピート配列と標的核酸へのハイブリダイゼーション能を有するスペーサー配列とを含むRNAガイド;及び
V-I型(CLUST.029130)CRISPR-Casエフェクタータンパク質又は前記エフェクタータンパク質をコードする核酸であって、前記RNAガイドへの結合能を有し且つ前記スペーサー配列に相補的な前記標的核酸配列のターゲティング能を有するエフェクタータンパク質
を含み、前記標的核酸がDNAである、エンジニアリングされた天然に存在しないクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)関連(Cas)システム。
(項目2)
2つ以上のRNAガイドを含む、項目1に記載のシステム。
(項目3)
前記V-I型CRISPR-Casエフェクタータンパク質が約1100アミノ酸長未満であり、少なくとも1つのRuvCドメインを含む、項目1又は2に記載のシステム。
(項目4)
前記V-I型RNAガイドが、前記V-I型RNAガイド内に順番に配置されたダイレクトリピート配列と前記スペーサー配列と第2のダイレクトリピートとを含む、項目1又は2に記載のシステム。
(項目5)
前記V-I型CRISPR-Casエフェクタータンパク質が、
アミノ酸配列X 1 SHX 4 DX 6 X 7 (配列番号200)(式中、X 1 はS又はTであり、X 4 はQ又はLであり、X 6 はP又はSであり、及びX 7 はF又はLである)を含むRuvCドメイン、
アミノ酸配列X 1 XDXNX 6 X 7 XXXX 11 (配列番号201)(式中、X 1 はA、G、又はSであり、Xは任意のアミノ酸であり、X 6 はQ又はIであり、X 7 はT、S、又はVであり、及びX 10 はT又はAである)を含むRuvCドメイン;及び
アミノ酸配列X 1 X 2 X 3 E(配列番号210)(式中、X 1 はC、F、I、L、M、P、V、W、又はYであり、X 2 はC、F、I、L、M、P、R、V、W、又はYであり、及びX 3 はC、F、G、I、L、M、P、V、W、又はYである)を含むRuvCドメイン
のうちの1つ以上を含む、項目1~4のいずれか一項に記載のシステム。
(項目6)
前記V-I型CRISPR-Casエフェクタータンパク質が、表4にあるアミノ酸配列と少なくとも80%(例えば、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%)同一のアミノ酸配列を含む、項目1~4のいずれか一項に記載のシステム。
(項目7)
前記V-I型CRISPR-Casエフェクタータンパク質が、配列番号3又は配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%)の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目6に記載のシステム。
(項目8)
前記V-I型RNAガイドが、前記ダイレクトリピート配列の3’末端の近位にステム-ループ構造を含むダイレクトリピート配列を含み、前記ステム-ループ構造が、
第1のステムヌクレオチド鎖5ヌクレオチド長;
第2のステムヌクレオチド鎖5ヌクレオチド長(前記第1及び第2のステムヌクレオチド鎖は互いにハイブリダイズすることができる);及び
前記第1及び第2のステムヌクレオチド鎖間に配置されたループヌクレオチド鎖であって、6、7、又は8ヌクレオチドを含むループヌクレオチド鎖
を含む、項目1~7のいずれか一項に記載のシステム。
(項目9)
前記ダイレクトリピート配列が、
前記3’末端の近位にある5’-CCGUCNNNNNNUGACGG-3’(配列番号202)(式中、Nは任意の核酸塩基である);
前記3’末端の近位にある5’-GUGCCNNNNNNUGGCAC-3’(配列番号203)(式中、Nは任意の核酸塩基である);
前記3’末端の近位にある5’-GUGUCN 5-6 UGACAX 1 -3’(配列番号204)(式中、N 5-6 は任意の5又は6核酸塩基の連続配列であり、及びX 1 はC又はT又はUである);
前記3’末端の近位にある5’-UCX 3 UX 5 X 6 X 7 UUGACGG-3’(配列番号205)(式中、X 3 はC、T、又はUであり、X 5 はA、T、又はUであり、X 6 はA、C、又はGであり、及びX 7 はA又はGである);
前記3’末端の近位にある5’-CCX 3 X 4 X 5 CX 7 UUGGCAC-3’(配列番号206)(式中、X 3 はC、T、又はUであり、X 4 はA、T、又はUであり、X 5 はC、T、又はUであり、及びX 7 はA又はGである)
のうちのいずれか1つを含む、項目1~8のいずれか一項に記載のシステム。
(項目10)
前記ダイレクトリピート配列が、表5に提供されるヌクレオチド配列と少なくとも80%(例えば、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%)同一のヌクレオチド配列を含む、項目1~9のいずれか一項に記載のシステム。
(項目11)
前記RNAガイドが、順番に配置されたダイレクトリピート配列と前記スペーサー配列と第2のダイレクトリピートとを含み、前記RNAガイド配列が、表5Bに提供されるヌクレオチド配列又はその断片と少なくとも80%(例えば、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%)同一のヌクレオチド配列を含み、前記可変N領域が前記スペーサーを意味し、且つ表5Bに指定されるとおりの長さを有し得る、項目1~10のいずれか一項に記載のシステム。
(項目12)
前記V-I型CRISPR-Casエフェクタータンパク質がプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の認識能を有し、及び前記標的核酸が、核酸配列5’-TTN-3’(式中、Nは任意のヌクレオチドである)、5’-TTH-3’、5’-TTY-3’、又は5’-TTC-3’を含むPAMを含む、項目1~11のいずれか一項に記載のシステム。
(項目13)
前記標的核酸がDNAである、項目1~12のいずれか一項に記載のシステム。
(項目14)
前記V-I型CRISPR-Casエフェクタータンパク質及びRNAガイドによる前記標的核酸のターゲティングにより、前記標的核酸の修飾が生じる、項目1~13のいずれか一項に記載のシステム。
(項目15)
前記標的核酸の前記修飾が切断イベントである、項目14に記載のシステム。
(項目16)
前記標的核酸の前記修飾がニッキングイベントである、項目14に記載のシステム。
(項目17)
前記修飾が細胞毒性を生じさせる、項目13~16のいずれか一項に記載のシステム。
(項目18)
前記V-I型CRISPR-Casエフェクタータンパク質が、1つ以上のアミノ酸置換を有しない前記V-I型CRISPR-Casエフェクタータンパク質のヌクレアーゼ又はニッカーゼ活性と比較したとき前記V-I型CRISPR-Casエフェクタータンパク質のヌクレアーゼ又はニッカーゼ活性の低下を生じさせる1つ以上のアミノ酸置換を前記RuvCドメイン内に含む、項目3~17のいずれか一項に記載のシステム。
(項目19)
前記1つ以上のアミノ酸置換が、配列番号3のD647、E894、又はD948;又は配列番号5のD599、E833、又はD886に対応するアミノ酸残基におけるアラニン置換を含む、項目18に記載のシステム。
(項目20)
前記V-I型CRISPR-Casエフェクタータンパク質が塩基編集ドメインに融合される、項目18又は19に記載のシステム。
(項目21)
前記V-I型CRISPR-Casエフェクタータンパク質が、DNAメチル化ドメイン、ヒストン残基修飾ドメイン、局在化因子、転写修飾因子、光ゲート制御因子、化学誘導性因子、又はクロマチン可視化因子に融合される、項目18又は19に記載のシステム。
(項目22)
前記V-I型CRISPR-Casエフェクタータンパク質が、少なくとも1つの核局在化シグナル(NLS)、少なくとも1つの核外移行シグナル(NES)、又は両方を含む、項目1~21のいずれか一項に記載のシステム。
(項目23)
プロモーターに作動可能に連結された、前記V-I型CRISPR-Casエフェクタータンパク質をコードする前記核酸を含む、項目1~22のいずれか一項に記載のシステム。
(項目24)
前記プロモーターが構成的プロモーターである、項目23に記載のシステム。
(項目25)
前記V-I型CRISPR-Casエフェクタータンパク質をコードする前記核酸が細胞での発現にコドン最適化される、項目23に記載のシステム。
(項目26)
プロモーターに作動可能に連結された、前記V-I型CRISPR-Casエフェクタータンパク質をコードする前記核酸がベクター中にある、項目23に記載のシステム。
(項目27)
前記ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、及び単純ヘルペスベクターからなる群から選択される、項目26に記載のシステム。
(項目28)
ナノ粒子、リポソーム、エキソソーム、微小胞、及び遺伝子銃からなる群から選択される送達システム中に存在する、項目1~26のいずれか一項に記載のシステム。
(項目29)
標的DNA又は前記標的DNAをコードする核酸を更に含み、前記標的DNAが、前記RNAガイドの前記スペーサー配列へのハイブリダイズ能を有する配列を含む、項目1~28のいずれか一項に記載のシステム。
(項目30)
ドナー鋳型核酸を更に含む、項目1~29のいずれか一項に記載のシステム。
(項目31)
前記ドナー鋳型核酸がDNA又はRNAである、項目30に記載のシステム。
(項目32)
項目1~31のいずれか一項に記載のシステムを含む細胞。
(項目33)
前記細胞が真核細胞である、項目32に記載の細胞。
(項目34)
前記細胞が原核細胞である、項目32に記載の細胞。
(項目35)
標的核酸のターゲティング及び編集方法であって、項目1~31のいずれか一項に記載のシステムを前記標的核酸に接触させることを含む方法。
(項目36)
標的DNAの認識に応じた一本鎖DNAの非特異的分解方法であって、項目1~36のいずれか一項に記載のシステムを前記標的核酸に接触させることを含む方法。
(項目37)
二本鎖標的DNAのスペーサー相補鎖の認識に応じた前記二本鎖標的DNAの非スペーサー相補鎖のターゲティング及びニッキング方法であって、項目1~36のいずれか一項に記載のシステムを前記二本鎖標的DNAに接触させることを含む方法。
(項目38)
二本鎖標的DNAのターゲティング及び切断方法であって、項目1~31のいずれか一項に記載のシステムを前記二本鎖標的DNAに接触させることを含む方法。
(項目39)
前記二本鎖標的DNAの非スペーサー相補鎖が、前記二本鎖標的核酸のスペーサー相補鎖のニッキング前にニッキングされる、項目40に記載の方法。
(項目40)
試料中の標的核酸の検出方法であって、
(a)項目1~31のいずれか一項に記載のシステム及び標識されたレポーター核酸を前記試料に接触させることであって、前記crRNAが前記標的核酸にハイブリダイズすると、前記標識されたレポーター核酸の切断が起こること;及び
(b)前記標識されたレポーター核酸の切断によって生成される検出可能シグナルを測定することであって、それにより前記試料中における前記標的核酸の存在を検出することを含む方法。
(項目41)
前記検出可能シグナルのレベルを参照シグナルレベルと比較すること、及び前記検出可能シグナルの前記レベルに基づき前記試料中の標的核酸の量を決定することを更に含む、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記測定が、金ナノ粒子検出、蛍光偏光、コロイド相転移/分散、電気化学的検出、又は半導体ベースのセンシングを用いて実施される、項目41に記載の方法。
(項目43)
前記標識されたレポーター核酸が蛍光発光色素対、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)対、又は消光剤/フルオロフォア対を含み、前記標識されたレポーター核酸が前記エフェクタータンパク質によって切断されると、前記標識されたレポーター核酸によって生成されるシグナルの量の増加又は減少が生じる、項目42に記載の方法。
(項目44)
二本鎖核酸の特異的編集方法であって、
(a)V-I型CRISPR-Casエフェクター及び配列特異的ニッキング活性を有する1つの他の酵素、及び前記他の配列特異的ニッカーゼの前記活性と比べて逆の鎖をニッキングするように前記V-I型CRISPR-Casエフェクターを誘導するcrRNA;及び
(b)前記二本鎖核酸
を十分な条件下で十分な長さの時間にわたって接触させることを含み;
前記方法により二本鎖切断の形成が生じる、方法。
(項目45)
二本鎖核酸の編集方法であって、
(a)前記V-I型CRISPR-CasエフェクターとDNA修飾活性を有するタンパク質ドメインと前記二本鎖核酸を標的化するRNAガイドとを含む融合タンパク質;及び
(b)前記二本鎖核酸
を十分な条件下で十分な長さの時間にわたって接触させることを含み;
前記融合タンパク質の前記V-I型CRISPR-Casエフェクターが、前記二本鎖核酸の非標的鎖をニッキングするように修飾される、方法。
(項目46)
細胞における遺伝子型特異的又は転写状態特異的細胞死又は休眠の誘導方法であって、項目1~31のいずれか一項に記載のシステムを細胞に接触させることを含み、前記RNAガイドが前記標的DNAにハイブリダイズすると、コラテラルDNアーゼ活性媒介性細胞死又は休眠が起こる、方法。
(項目47)
前記細胞が原核細胞である、項目47に記載の方法。
(項目48)
前記細胞が真核細胞である、項目47に記載の方法。
(項目49)
前記細胞が哺乳類細胞である、項目48に記載の方法。
(項目50)
前記細胞が癌細胞である、項目49に記載の方法。
(項目51)
前記細胞が感染性細胞又は感染性病原体に感染した細胞である、項目47に記載の方法。
(項目52)
前記細胞が、ウイルスに感染した細胞、プリオンに感染した細胞、真菌細胞、原虫、又は寄生虫細胞である、項目51に記載の方法。
(項目53)
それを必要としている対象における病態又は疾患の治療方法であって、項目1~31のいずれか一項に記載のシステムを前記対象に投与することを含み、
前記スペーサー配列が、前記病態又は疾患に関連する標的核酸の少なくとも15ヌクレオチドと相補的であり;
前記V-I型CRISPR-Casエフェクタータンパク質が前記RNAガイドと会合して複合体を形成し;
前記複合体が、前記スペーサー配列の前記少なくとも15ヌクレオチドと相補的な標的核酸配列に結合し;及び
前記複合体が前記標的核酸配列に結合すると、前記V-I型CRISPR-Casエフェクタータンパク質が前記標的核酸を切断し、それにより前記対象の前記病態又は疾患を治療する、方法。
(項目54)
前記病態又は疾患が癌又は感染性疾患である、項目53に記載の方法。
(項目55)
前記病態又は疾患が癌であり、及び前記癌が、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、神経内分泌腫瘍、膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、皮膚癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、肝癌、腎癌、膵癌、肺癌、胆道癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、甲状腺髄様癌、卵巣癌、神経膠腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄球性白血病、ホジキンリンパ腫、
非ホジキンリンパ腫、及び膀胱癌からなる群から選択される、項目54に記載の方法。
(項目56)
医薬としての使用のための項目1~34のいずれか一項に記載のシステム又は細胞。
(項目57)
癌又は感染性疾患の治療又は予防における使用のための項目1~35のいずれか一項に記載のシステム又は細胞。
(項目58)
前記癌が、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、神経内分泌腫瘍、膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、皮膚癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、肝癌、腎癌、膵癌、肺癌、胆道癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、甲状腺髄様癌、卵巣癌、神経膠腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、及び膀胱癌からなる群から選択される、項目57に記載の使用のためのシステム又は細胞。
(項目59)
インビトロ又はエキソビボでの
a)標的核酸のターゲティング及び編集方法;
b)DNA標的核酸の認識に応じた一本鎖DNAの非特異的分解方法;
c)二本鎖標的DNAのスペーサー相補鎖の認識に応じた前記二本鎖標的DNAの非スペーサー相補鎖のターゲティング及びニッキング方法;
d)二本鎖標的DNAのターゲティング及び切断方法;
e)試料中の標的核酸の検出方法;
f)二本鎖核酸の特異的編集方法;
g)二本鎖核酸の塩基編集方法;
h)細胞における遺伝子型特異的又は転写状態特異的細胞死又は休眠の誘導方法
i)二本鎖標的DNAにおけるインデルの作成方法;
j)二本鎖標的DNAへの配列の挿入方法、又は
k)二本鎖標的DNAにおける配列の欠失又は逆位形成方法
における項目1~35のいずれか一項に記載のシステム又は細胞の使用。
(項目60)
a)標的核酸のターゲティング及び編集方法;
b)DNA標的核酸の認識に応じた一本鎖DNAの非特異的分解方法;
c)二本鎖標的DNAのスペーサー相補鎖の認識に応じた前記二本鎖標的DNAの非スペーサー相補鎖のターゲティング及びニッキング方法;
d)二本鎖標的DNAのターゲティング及び切断方法;
e)試料中の標的核酸の検出方法;
f)二本鎖核酸の特異的編集方法;
g)二本鎖核酸の塩基編集方法;
h)細胞における遺伝子型特異的又は転写状態特異的細胞死又は休眠の誘導方法;
i)二本鎖標的DNAにおけるインデルの作成方法;
j)二本鎖標的DNAへの配列の挿入方法、又は
k)二本鎖標的DNAにおける配列の欠失又は逆位形成方法
における項目1~35のいずれか一項に記載のシステム又は細胞の使用であって、
前記方法が、ヒトの生殖細胞系列遺伝子のアイデンティティを修飾するプロセスを含まず、且つ前記ヒト又は動物の生体の治療方法を含まない、使用。
(項目61)
前記標的DNA又は標的核酸の切断がインデルの形成を生じさせる、項目38又は53に記載の方法。
(項目62)
前記標的DNA又は標的核酸の切断が核酸配列の挿入を生じさせる、項目38又は53に記載の方法。
(項目63)
前記標的DNA又は標的核酸の切断が2つの部位における前記標的DNA又は標的核酸の切断を含み、前記2つ部位の間にある配列の欠失又は逆位を生じさせる、項目38又は53に記載の方法。
(項目64)
前記システムがtracrRNAを欠いている、項目1~31のいずれか一項に記載のシステム。
(項目65)
前記V-I型CRISPR-Casエフェクタータンパク質とV-I型RNAガイドとが、前記標的核酸に会合することによって前記標的核酸を修飾する複合体を形成する、項目1~31のいずれか一項に記載のシステム。
(項目66)
前記スペーサー配列が15~47ヌクレオチド長、例えば、20~40ヌクレオチド長、又は24~38ヌクレオチド長である、項目1~31のいずれか一項に記載のシステム。
(項目67)
修飾された目的の標的遺伝子座を含む真核細胞であって、前記目的の標的遺伝子座が、項目1~66のいずれか一項に記載の方法により、又はその組成物の使用によって修飾されている、真核細胞。
(項目68)
前記目的の標的遺伝子座の前記修飾が、
(i)少なくとも1つの遺伝子産物の発現の変化を含む前記真核細胞;
(ii)少なくとも1つの遺伝子産物の発現の変化を含む前記真核細胞であって、前記少なくとも1つの遺伝子産物の前記発現が増加するもの;
(iii)少なくとも1つの遺伝子産物の発現の変化を含む前記真核細胞であって、前記少なくとも1つの遺伝子産物の前記発現が減少するもの;又は
(iv)編集されたゲノムを含む前記真核細胞
を生じさせる、項目67に記載の真核細胞。
(項目69)
前記真核細胞が哺乳類細胞を含む、項目67又は68に記載の真核細胞。
(項目70)
前記哺乳類細胞がヒト細胞を含む、項目69に記載の真核細胞。
(項目71)
項目67~69のいずれか一項に記載の真核細胞の又はそれを含む真核細胞株、又はその子孫。
(項目72)
項目67~69のいずれか一項に記載の細胞を1つ以上含む多細胞生物。
(項目73)
項目67~69のいずれか一項に記載の細胞を1つ以上含む植物又は動物モデル。
(項目74)
目的の遺伝子によってコードされる修飾された目的の形質を有する植物の作製方法であって、項目1~31のいずれか一項に記載のシステムを植物細胞に接触させることであって、それにより前記目的の遺伝子の修飾又は導入のいずれかを行うこと、及び前記植物細胞から植物を再生することを含む方法。
(項目75)
植物における目的の形質の同定方法であって、前記目的の形質が目的の遺伝子によってコードされ、項目1~34のいずれか一項に記載のシステムを植物細胞に接触させることを含み、それにより前記目的の遺伝子を同定する、方法。
(項目76)
前記同定された目的の遺伝子を植物細胞又は植物細胞株又は植物生殖質に導入すること
、及びそれから植物を発生させることを更に含み、それによって前記植物が前記目的の遺伝子を含有する、項目75に記載の方法。
(項目77)
前記植物が前記目的の形質を呈する、項目76に記載の方法。
(項目78)
一本鎖標的DNAのターゲティング及び切断方法であって、項目1~31のいずれか一項に記載のシステムを前記標的核酸に接触させることを含む方法。
(項目79)
前記病態又は疾患が感染性であり、前記感染性病原体が、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、単純ヘルペスウイルス1型(HSV1)、及び単純ヘルペスウイルス2型(HSV2)からなる群から選択される、項目69に記載の方法。
(項目80)
標的DNAの両方の鎖が異なる部位で切断される結果、付着末端型の切断が生じる、項目38に記載の方法。
(項目81)
標的DNAの両方の鎖が同じ部位で切断される結果、平滑末端型の二本鎖切断(DSB)が生じる、項目38に記載の方法。
(項目82)
前記病態又は疾患が、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、α1-アンチトリプシン欠乏症、ポンペ病、筋強直性ジストロフィー、ハンチントン病、脆弱X症候群、フリードライヒ失調症、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、遺伝性慢性腎疾患、高脂血症、高コレステロール血症、レーベル先天黒内障、鎌状赤血球症、及びβサラセミアからなる群から選択される、項目53に記載の方法。
エンジニアリングされた新規CRISPR-Casシステムの活性を効率的に検証し、同時に種々の活性機構及び機能パラメータを偏りのない方法で評価するため、大腸菌(E.coli)において新規プール型スクリーニング手法を用いる。第一に、新規CRISPR-Casシステムの保存タンパク質及び非コードエレメントの計算的同定から、DNA合成及び分子クローニングを用いて個別の成分を単一の人工発現ベクター(一実施形態ではpET-28a+骨格をベースとする)にアセンブルする。第2の実施形態では、エフェクター及び非コードエレメントを単一のmRNA転写物に転写し、異なるリボソーム結合部位を用いて個々のエフェクターを翻訳する。
(1)汎用性-プラスミド設計により、複数のエフェクター及び/又は非コードエレメントを発現させることが可能になる;ライブラリクローニング戦略により、計算的に予測されたcrRNAの両方の転写方向の発現が実現する;
(2)活性機構及び機能パラメータの包括的試験を用いることにより、DNA又はRNA切断を含めた多様な干渉機構を評価し;転写、プラスミドDNA複製などの特徴の共出現;及びcrRNAライブラリについてのフランキング配列を調べて、4Nの複雑さ等価のPAMを確実に決定することができる;
(3)感度-pACYC184は低コピープラスミドであり、僅かな干渉率であっても、プラスミドによってコードされる抗生物質耐性を除去することができるため、CRISPR-Cas活性について高感度を実現する;及び
(4)効率-プール型スクリーニングは、RNAシーケンシングについてより高い速度及びスループットを実現する最適化された分子生物学ステップを含み、タンパク質発現試料をスクリーンにおける生存細胞から直接採取することができる。
インビトロプール型スクリーニング手法もまた用いることができ、これはインビボプール型スクリーンを補完する。インビトロプール型スクリーンは、迅速な生化学的特徴付け及びCRISPRシステムからシステムの活性に必要な必須成分への縮約を実現する。一実施形態では、無細胞インビトロ転写及び翻訳(IVTT)システムを用いることにより、CRISPRシステムの非コード及びエフェクタータンパク質をコードするDNAからRNA及びタンパク質が直接合成され、従ってFPLC精製したタンパク質に頼る従来の生化学アッセイと比べてより多数の異なる別個のCRISPR-Casエフェクターシステムを評価するための、より高速でより高いスループットの方法が実現する。より高いスループット及び効率の生化学反応を実現することに加えて、インビトロスクリーニングには、上記に記載されるインビボプール型スクリーニング手法を補完するものとなる幾つかの利点がある。
一態様において、本開示は、本明細書においてCLUST.029130(V-I型)CRISPR-Casシステムと称されるクラス2 CRISPR-Casシステムを提供する。このクラス2 CRISPR-Casシステムは、RuvCドメインを有する単離されたCRISPR関連タンパク質と、RNAガイド、ガイドRNA、又はgRNAとも称される、DNA配列などの標的核酸配列に相補的なスペーサー配列を含む単離されたcrRNAとを含む。
ヌクレアーゼ欠損CRISPR酵素
本明細書に記載されるCRISPR酵素がヌクレアーゼ活性を有する場合、減少したヌクレアーゼ活性、例えば、野生型CRISPR酵素と比較したとき少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は100%のヌクレアーゼ不活性化となるようにCRISPR酵素を修飾することができる。ヌクレアーゼ活性は、幾つかの方法、例えば、CRISPR酵素のヌクレアーゼ又はPAM相互作用ドメインへの突然変異の導入によって減少させることができる。一部の実施形態において、ヌクレアーゼ活性の触媒残基が同定され、それらのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基(例えば、グリシン又はアラニン)に置換することによりヌクレアーゼ活性を減少させてもよい。Cas12i1についてかかる突然変異の例としては、D647A又はE894A又はD948Aが挙げられる。Cas12i2についてかかる突然変異の例としては、D599A又はE833A又はD886Aが挙げられる。
本開示はまた、本明細書に記載されるCRISPR酵素のスプリットバージョンも提供する。スプリットバージョンのCRISPR酵素は送達に有利であり得る。一部の実施形態において、CRISPR酵素は酵素の2つの部分に分割され、それらが一緒になって実質的に機能性のCRISPR酵素を含む。
本明細書に記載されるCRISPR酵素は、自己活性化型又は自己不活性化型であるように設計されてもよい。一部の実施形態において、CRISPR酵素は自己不活性化型である。例えば、CRISPR酵素をコードするコンストラクトに標的配列を導入することができる。従ってCRISPR酵素が標的配列を切断するとともに、それによって酵素をコードするコンストラクトがその発現を自己不活性化し得る。自己不活性化CRISPRシステムの構築方法については、例えば、Epstein,Benjamin E.,and David V.Schaffer.“Engineering a Self-Inactivating CRISPR System for AAV Vectors,”Mol.Ther.,24(2016):S50(全体として参照により本明細書に援用される)に記載されている。
CRISPR酵素は、誘導性、例えば、光誘導性又は化学誘導性であってもよい。この機構により、CRISPR酵素中の機能性ドメインを公知のトリガーによって活性化させることが可能になる。光誘導能は、当該技術分野において公知の様々な方法により、例えば、スプリットCRISPR酵素においてCRY2PHR/CIBN対が用いられる融合複合体を設計することにより実現し得る(例えば、Konermann et al.“Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states,”Nature,500.7463(2013):472を参照のこと)。化学誘導能は、例えば、スプリットCRISPR酵素においてFKBP/FRB(FK506結合タンパク質/FKBPラパマイシン結合ドメイン)対が用いられる融合複合体を設計することにより実現し得る。ラパマイシンは融合複合体の形成に必要であり、従ってCRISPR酵素を活性化する(例えば、Zetsche,Volz,and Zhang,“A split-Cas9 architecture for inducible genome editing and transcription modulation,”Nature Biotech.,33.2(2015):139-142を参照のこと)。
本明細書に記載されるとおりのCRISPR酵素に様々な突然変異又は修飾を導入して特異性及び/又はロバスト性を改善することができる。一部の実施形態において、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を認識するアミノ酸残基が同定される。本明細書に記載されるCRISPR酵素は、例えば、PAMを認識するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、異なるPAMを認識するように更に修飾されてもよい。一部の実施形態において、CRISPR酵素は、例えば本明細書に記載されるとおりの、別のPAMを認識することができる。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるCRISPRシステムは少なくとも1つのV-I型RNAガイドを含む。多くのRNAガイドの構成が当該技術分野において公知である(例えば、国際公開第2014/093622号パンフレット及び同第2015/070083号パンフレット(これらの各々の内容全体は参照により本明細書に援用される)を参照のこと)。一部の実施形態において、本明細書に記載されるCRISPRシステムは複数のRNAガイド(例えば、2、3、4、5、6、7、8個、又はそれ以上のRNAガイド)を含む。
CLUST.029130(V-I型)CRISPR-Casエフェクターは2つ以上のRNAガイドを利用し、従ってこれらのエフェクター、並びにそれらを含むシステム及び複合体が複数の異なる核酸標的を標的化する能力を実現することが実証されている。一部の実施形態において、本明細書に記載されるCRISPRシステムは複数のRNAガイド(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40個、又はそれ以上のRNAガイド)を含む。一部の実施形態において、本明細書に記載されるCRISPRシステムは単一のRNA鎖又は単一のRNA鎖をコードする核酸を含み、ここでRNAガイドはタンデムに配置される。単一のRNA鎖は、同じRNAガイドの複数のコピー、異なるRNAガイドの複数のコピー、又はこれらの組み合わせを含むことができる。
スペーサー長さ
RNAガイドのスペーサー長さは約15~50ヌクレオチドの範囲であってもよい。一部の実施形態において、RNAガイドのスペーサー長さは、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、又は少なくとも22ヌクレオチドである。一部の実施形態において、スペーサー長さは、15~17ヌクレオチド、15~23ヌクレオチド、16~22ヌクレオチド、17~20ヌクレオチド、20~24ヌクレオチド(例えば、20、21、22、23、又は24ヌクレオチド)、23~25ヌクレオチド(例えば、23、24、又は25ヌクレオチド)、24~27ヌクレオチド、27~30ヌクレオチド、30~45ヌクレオチド(例えば、30、31、32、33、34、35、40、又は45ヌクレオチド)、30又は35~40ヌクレオチド、41~45ヌクレオチド、45~50ヌクレオチド、又はそれ以上である。一部の実施形態において、RNAガイドのスペーサー長さは31ヌクレオチドである。一部の実施形態において、RNAガイドのダイレクトリピート長さは少なくとも21ヌクレオチドであり、又は21~37ヌクレオチド(例えば、23、24、25、30、35、又は36ヌクレオチド)である。一部の実施形態において、RNAガイドのダイレクトリピート長さは23ヌクレオチドである。
RNAガイドは、誘導性システムの成分として作成することができる。このシステムの誘導可能な性質により、遺伝子編集又は遺伝子発現の時空間的制御が可能となる。一部の実施形態において、誘導性システムの刺激としては、例えば、電磁放射線、音響エネルギー、化学エネルギー、及び/又は熱エネルギーが挙げられる。
RNAガイドのリン酸骨格、糖、及び/又は塩基に化学修飾を適用することができる。ホスホロチオエートなどの骨格修飾はリン酸骨格上の電荷を修飾し、オリゴヌクレオチドの送達及びヌクレアーゼ耐性に役立つ(例えば、Eckstein,“Phosphorothioates,essential components of therapeutic oligonucleotides,”Nucl.Acid Ther.,24(2014),pp.374-387を参照のこと);2’-O-メチル(2’-OMe)、2’-F、及びロックド核酸(LNA)などの糖修飾は、塩基対合及びヌクレアーゼ耐性の両方を亢進させる(例えば、Allerson et al.“Fully 2‘-modified oligonucleotide duplexes with improved in vitro potency and stability compared to unmodified small interfering RNA,”J.Med.Chem.,48.4(2005):901-904を参照のこと)。化学修飾塩基、とりわけ2-チオウリジン又はN6-メチルアデノシンなどは、より強い塩基対合又はより弱い塩基対合のいずれも可能にすることができる(例えば、Bramsen et al.,“Development of therapeutic-grade small interfering RNAs by chemical engineering”Front.Genet.,2012 Aug 20;3:154を参照のこと)。加えて、RNAは、蛍光色素、ポリエチレングリコール、又はタンパク質を含めた種々の機能性部分との5’末端及び3’末端の両方のコンジュゲーションに適している。
本明細書に記載されるRNAガイド及びcrRNAの配列及び長さは最適化することができる。一部の実施形態において、RNAガイドの最適化された長さは、プロセシングされた形態のcrRNAを同定することによるか、又はcrRNAのRNAガイドについての経験的な長さ研究によって決定されてもよい。
古典的CRISPRシステムでは、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、97.5%、99%、又は100%であってもよい。一部の実施形態において、相補性の程度は100%である。RNAガイドは、約5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75ヌクレオチド長、又はそれ以上であってもよい。
コドン最適化
本発明は、可能なコドン選択に基づき組み合わせを選択することによって作り出され得るcDNAなどの核酸の可能な全ての変形例を企図する。これらの組み合わせは、天然に存在する変異体をコードするポリヌクレオチドに適用されるとおりの標準的なトリプレット遺伝子コードに従い作り出され、かかる変形例の全てが具体的に開示されていると見なされるべきである。本明細書には、細菌(例えば、大腸菌(E.coli))及びヒト細胞での発現にコドン最適化されたV-I型CRISPR-Cas関連エフェクタータンパク質変異体をコードするヌクレオチド配列が開示される。例えば、ヒト細胞にコドン最適化された配列は、ヒト細胞に低頻度で出現するヌクレオチド配列中のコドンに代えて、ヒト細胞に高頻度で出現するコドンを用いることにより作成し得る。コドンの出現頻度は、当該技術分野において公知の方法により計算的に決定することができる。様々な宿主細胞(例えば、大腸菌(E.coli)、酵母、昆虫、C.エレガンス(C.elegans)、キイロショウジョウバエ(D.melanogaster)、ヒト、マウス、ラット、ブタ、P.パストリス(P.pastoris)、シロイヌナズナ(A.thalian)、トウモロコシ、及びタバコ)についてのこうしたコドン頻度の計算例が公開されており、又はGenScript(登録商標)コドン使用頻度表ツールなどの資料によって利用可能になる(以下には、大腸菌(E.coli)及びヒトについての例示的なコドン使用表が含まれる。
本明細書に記載されるCRISPRシステムには、非常に多数の細胞型における標的ポリヌクレオチドの修飾(例えば、欠失、挿入、転位、不活性化、又は活性化)を含め、多種多様な有用性がある。このCRISPRシステムは、例えば、DNA/RNA検出(例えば、特異的高感度酵素レポーターアンロッキング(specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking:SHERLOCK))、核酸の追跡及び標識、エンリッチメントアッセイ(バックグラウンドからの所望の配列の抽出)、循環腫瘍DNAの検出、次世代ライブラリの調製、薬物スクリーニング、疾患診断及び予後判定、及び様々な遺伝的障害の治療において、幅広い範囲にわたる適用を有する。いかなる特定の理論によっても拘束されることを望むものではないが、Cas12iタンパク質を含むCRISPRシステムは活性の増加を呈し得るか、又はDNAプラスミド、スーパーコイルDNA、若しくは転写活性のあるゲノム遺伝子座など、特定の環境におけるターゲティング時に優先的に活性であり得る。
用語「ゲノム編集システム」は、RNA誘導型DNA編集活性を有する本開示のエンジニアリングされたCRISPRシステムを指す。本開示のゲノム編集システムは、上記に記載されるCRISPRシステムの少なくとも2つの成分:RNAガイドとコグネイトCRISPRエフェクタータンパク質とを含む。本開示の特定の実施形態において、エフェクターはCas12iタンパク質であり、RNAガイドはコグネイトV-I型RNAガイドである。上記に記載したとおり、これらの2つの成分が複合体を形成し、この複合体は、特異的核酸配列に会合して、当該の核酸配列内又はその周辺で、例えば、一本鎖切断(SSB又はニック)、二本鎖切断(DSB)、核酸塩基修飾、DNAメチル化又は脱メチル化、クロマチン修飾等のうちの1つ以上を作り出すことによりDNAを編集する能力を有する。
一態様において、本明細書に記載されるCRISPR-Casシステムは、DNAセンシングによるDNA/RNA検出において使用することができる。シングルエフェクターRNA誘導型DNアーゼをRNAガイドで再プログラム化することにより、特異的一本鎖DNA(ssDNA)センシング用のプラットフォームがもたらされ得る。そのDNA標的の認識時、活性化したCRISPR V-I型エフェクタータンパク質は、標的配列との配列類似性のない近隣ssDNAの「コラテラル」切断に関与する。このRNAによってプログラム化されるコラテラル切断活性により、CRISPRシステムが特異的DNAの存在を標識ssDNAの非特異的分解によって検出することが可能となる。
細胞過程は、タンパク質、RNA、及びDNAの間での分子相互作用網に依存する。タンパク質-DNA及びタンパク質-RNA相互作用の正確な検出は、かかる過程を理解する鍵である。インビトロ近接性標識技法は、レポーター基、例えば光活性化可能な基と組み合わせたアフィニティータグを用いることにより、インビトロで目的のタンパク質又はDNAの近くにあるポリペプチド及びDNAを標識する。紫外線照射後、光活性化可能な基がタグ付加分子にごく近接したタンパク質及び他の分子と反応し、それによってそれらを標識する。標識された相互作用分子は、続いて回収し、同定することができる。このDNAターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、例えば、プローブを選択のDNA配列に標的化することができる。こうした適用はまた、動物モデルにおいても疾患又は培養が困難な細胞型のインビボイメージングに適用することができる。核酸の追跡及び標識方法については、例えば、米国特許第8795965号明細書;国際公開第2016205764号パンフレット;及び国際公開第2017070605号パンフレット(これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される)に記載されている。
本明細書に記載されるCRISPRシステムをタンデムで使用して、一対のRNAガイドによって標的遺伝子座の対向する両鎖に標的化される2つのCas12iニッキング酵素、又は1つのCas12i酵素とニッキング活性を有する1つの他のCRISPR Cas酵素とが、オーバーハングを伴う二本鎖切断を生成できるようにすることができる。この方法によれば、両方の酵素がニックを生成する遺伝子座においてのみ二本鎖切断が生じると予想されるため、オフターゲット修飾の可能性が低下し、従ってゲノム編集の特異性が増加し得る。この方法は「ダブルニッキング」又は「ペアニッカーゼ」戦略と称され、例えば、Ran et al.,“Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity,”Cell,2013 Sep 12;154(6):1380-1389、及びMali et al.,“CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering,”Nature Biotechnology,2013 Aug 01;31:833-838(これらは両方ともに全体として参照により本明細書に援用される)に記載されている。
本明細書に記載されるCRISPRシステムを使用して、CRISPR塩基編集の効率を増強することができる。塩基編集では、DNAヌクレオチド修飾活性(例えば、シチジン脱アミノ化)を有するタンパク質ドメインが、突然変異によってもはや二本鎖DNA切断活性を持たないように不活性化されたプログラム可能なCRISPR Cas酵素に融合される。一部の実施形態において、プログラム可能なCasタンパク質としてニッカーゼを使用すると、例えば、Komor et al.,“Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage,”Nature 533:420-424(2016)、及びNishida et al.,“Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems,”Science 353(6305):aaf8729(2016)(これらは両方ともに全体として参照により本明細書に援用される)に記載されるとおり、塩基編集効率が向上することが示されている。標的遺伝子座の非編集鎖をニッキングするニッカーゼは、内在性DNA修復経路-ミスマッチ修復又はロングパッチ塩基除去修復など、所望のアレルに対する塩基編集によって生成されたミスマッチを優先的に解消するもの-を刺激するか、又は触媒編集ドメインが標的DNAにより接近し易くすると仮定される。
本明細書に記載されるCRISPRシステムは、ニッキングされたDNAに作用するタンパク質と併せて使用することができる。一つのかかるタンパク質クラスは、大腸菌(E.coli)DNAポリメラーゼI又はTaq DNAポリメラーゼなどのニックトランスレーションDNAポリメラーゼである。
細胞過程は、タンパク質、RNA、及びDNAの間での分子相互作用網に依存する。タンパク質-DNA及びタンパク質-RNA相互作用の正確な検出は、かかる過程を理解する鍵である。インビトロ近接性標識技法は、レポーター基、例えば光活性化可能な基と組み合わせたアフィニティータグを用いることにより、インビトロで目的のタンパク質又はRNAの近くにあるポリペプチド及びRNAを標識する。紫外線照射後、光活性化可能な基がタグ付加分子にごく近接したタンパク質及び他の分子と反応し、それによってそれらを標識する。標識された相互作用分子は、続いて回収し、同定することができる。このRNAターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、例えば、プローブを選択のRNA配列に標的化することができる。こうした適用はまた、動物モデルにおいても疾患又は培養が困難な細胞型のインビボイメージングに適用することができる。核酸の追跡及び標識方法については、例えば、米国特許第8795965号明細書;国際公開第2016205764号パンフレット;及び国際公開第2017070605号パンフレット(これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される)に記載されている。
本明細書に記載されるCRISPRシステムは、次世代シーケンシング(NGS)ライブラリの調製に使用することができる。例えば、費用対効果の高いNGSライブラリを作成するため、CRISPRシステムを使用して標的遺伝子のコード配列を破壊することができ、同時に次世代シーケンシングによって(例えば、Ion Torrent PGMシステムで)、CRISPR酵素がトランスフェクトされたクローンをスクリーニングすることができる。NGSライブラリの調製方法に関する詳細な説明については、例えば、Bell et al.,“A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR-Cas9 induced mutations using next-generation sequencing,”BMC Genomics,15.1(2014):1002(これは全体として参照により本明細書に援用される)を参照することができる。
微生物(例えば、大腸菌(E.coli)、酵母、及び微細藻類)は、合成生物学に広く用いられている。合成生物学の発展には、様々な臨床応用を含め、幅広い有用性がある。例えば、本明細書に記載されるプログラム可能なCRISPRシステムを使用して、例えば癌関連RNAを標的転写物として用いる標的化した細胞死のため、毒性ドメインのタンパク質を分割することができる。更に、例えばキナーゼ又は酵素などの適切なエフェクターとの融合複合体により、合成生物系においてタンパク質間相互作用が関わる経路に影響を及ぼすことができる。
本明細書に記載されるCRISPRシステムは、植物において幅広い種類の有用性がある。一部の実施形態において、CRISPRシステムを使用して植物のゲノムをエンジニアリングすることができる(例えば、生産を向上させる、所望の翻訳後修飾を有する生産品にする、又は工業製品を生産するための遺伝子を導入する)。一部の実施形態において、CRISPRシステムを使用して、植物に所望の形質を(例えば、ゲノムに対する遺伝性修飾を伴い又は伴わず)導入し、又は植物細胞若しくは全植物における内因性遺伝子の発現を調節することができる。本開示のCRISPRシステム(例えば、Cas12iシステム)を使用して編集することのできる植物は単子葉類又は双子葉類であってよく、限定なしに、ベニバナ、トウモロコシ、***、コメ、サトウキビ、キャノーラ、モロコシ、タバコ、ライムギ、オオムギ、コムギ、アワ、オートムギ、ピーナッツ、ジャガイモ、スイッチグラス、芝草、ダイズ、アルファルファ、ヒマワリ、綿、及びシロイヌナズナ属(Arabidopsis)が挙げられる。本開示はまた、本開示の方法により及び/又は本開示のCRISPRシステムを利用して作り出された形質を有する植物も包含する。
遺伝子ドライブは、特定の遺伝子又は遺伝子群の遺伝形質に有利な偏りが出る現象である。本明細書に記載されるCRISPRシステムを使用して遺伝子ドライブを構築することができる。例えば、遺伝子の特定のアレルを標的化して破壊することにより、細胞に第2のアレルをコピーさせて配列を固定するようにCRISPRシステムを設計することができる。このコピーのため、第1のアレルが第2のアレルに変換されることになり、子孫に第2のアレルが遺伝する可能性が高くなる。どのように本明細書に記載されるCRISPRシステムを使用して遺伝子ドライブを構築するかに関する詳細な方法については、例えば、Hammond et al.,“A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae,”Nat.Biotechnol.,2016 Jan;34(1):78-83(これは全体として参照により本明細書に援用される)に記載されている。
本明細書に記載されるとおり、プール型CRISPRスクリーニングは、細胞増殖、薬剤耐性、及びウイルス感染などの生物学的機構に関与する遺伝子を同定するための強力なツールである。細胞がバルクで本明細書に記載されるRNAガイド(gRNA)コードベクターのライブラリによって形質導入され、選択的チャレンジの適用前及び適用後にgRNAの分布が測定される。プール型CRISPRスクリーンは、細胞生存及び増殖に影響を及ぼす機構に対して良好に機能し、個々の遺伝子の活性の測定にまで(例えば、エンジニアリングされたレポーター細胞株を使用することにより)拡張することができる。一度に1つの遺伝子のみが標的化されるアレイ化されたCRISPRスクリーンでは、RNA-seqをリードアウトとして使用することが可能になる。一部の実施形態において、本明細書に記載されるとおりのCRISPRシステムは単一細胞CRISPRスクリーンに使用することができる。プール型CRISPRスクリーニングに関する詳細な説明については、例えば、Datlinger et al.,“Pooled CRISPR screening with single-cell transcriptome read-out,”Nat.Methods.,2017 Mar;14(3):297-301(これは全体として参照により本明細書に援用される)を参照することができる。
本明細書に記載されるCRISPRシステムはインサイチュー飽和突然変異誘発に使用することができる。一部の実施形態では、プール型RNAガイドライブラリを使用して、特定の遺伝子又は調節エレメントに関するインサイチュー飽和突然変異誘発を実施することができる。かかる方法では、決定的な最小の特徴及びそれらの遺伝子又は調節エレメント(例えば、エンハンサー)の個別的な脆弱性を明らかにすることができる。これらの方法については、例えば、Canver et al.,“BCL11A enhancer dissection by Cas9-mediated in situ saturating mutagenesis,”Nature,2015 Nov 12;527(7577):192-7(これは全体として参照により本明細書に援用される)に記載されている。
哺乳類細胞コンテクストで活性を有する本明細書に記載されるCRISPRシステム(例えば、Cas12i2)は、多様な範囲にわたる治療上の適用を有し得る。更に、各ヌクレアーゼオルソログが、それを特定のターゲティング、治療、又は送達モダリティに有利にするユニークな特性(例えば、サイズ、PAM等)を有し得るため、最大の治療利益を付与するヌクレアーゼを割り当てる上でオルソログ選択は重要である。
本明細書に記載されるCRISPRシステム、又はその成分、その核酸分子、又はその成分をコードする若しくは提供する核酸分子は、ベクター、例えば、プラスミド、ウイルス送達ベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レンチウイルス、アデノウイルス、及び他のウイルスベクターなどの様々な送達システム、又はV-I型エフェクターとその1つ又は複数のコグネイトRNAガイドとからなるリボ核タンパク質複合体のヌクレオフェクション又は電気穿孔などの方法によって送達することができる。タンパク質及び1つ以上のRNAガイドは、1つ以上のベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターにパッケージングすることができる。細菌適用については、本明細書に記載されるCRISPRシステムの成分のいずれかをコードする核酸は、ファージを使用して細菌に送達することができる。例示的ファージとしては、限定はされないが、T4ファージ、Mu、λファージ、T5ファージ、T7ファージ、T3ファージ、φ29、M13、MS2、Qβ、及びφX174が挙げられる。
本開示はまた、本明細書に記載されるCRISPRシステムを利用した本開示の様々な方法を実行するためのキットも包含する。本開示の一つの例示的なキットは、(a)CRISPR関連タンパク質及びコグネイトcrRNAをコードする1つ以上の核酸、及び/又は(b)CRISPR関連タンパク質とコグネイトcrRNAとのリボ核タンパク質複合体を含む。一部の実施形態において、本キットは、Cas12iタンパク質とCas12iガイドRNAとを含む。上記に記載したとおり、タンパク質とガイドRNAとの複合体は、SSB形成、DSB形成、CRISPR干渉、核酸塩基修飾、DNAメチル化又は脱メチル化、クロマチン修飾等の編集活性を有する。特定の実施形態において、CRISPR関連タンパク質は、エンドヌクレアーゼ活性が低下した変異体など、変異体である。
このタンパク質ファミリーは、淡水環境から採取された無培養のメタゲノム配列に見られるCRISPRシステムに関連する大型のシングルエフェクターを表す(表3)。Cas12iと称されるCLUST.029130(V-I型)エフェクターには、表3及び表4に詳説する例示的タンパク質が含まれる。これらのシステムの例示的ダイレクトリピート配列を表5に示す。
V-I型CRISPR-Casシステムの最小成分を同定したことで、本発明者らは機能検証に2つのシステムを選択し、一方はCas12i1と称されるエフェクターを含むもの(配列番号3)、及び他方はCas12i2と称されるエフェクターを含むもの(配列番号5)であった。
遺伝子合成及びオリゴライブラリクローニング
CRISPRエフェクター、アクセサリータンパク質の大腸菌(E.coli)コドン最適化タンパク質配列をpET-28a(+)(EMD-Millipore)にクローニングしてエフェクタープラスミドを作成した。Cas遺伝子(150ntの末端CDSコード配列を含む)又はCRISPRアレイに隣接する非コード配列をpACYC184(New England Biolabs)に合成して(Genscript)、非コードプラスミドを作成した(図4A)。配列表にある指示されるプライマーを使用した部位特異的突然変異誘発により、エフェクター突然変異体(例えば、D513A又はA513D)プラスミドをクローニングした:配列変化は初めにPCR断片に導入し、次にNEBuilder HiFi DNAアセンブリマスターミックス又はNEB Gibsonアセンブリマスターミックス(New England Biolabs)を製造者の指示に従い使用してそれらをプラスミドにアセンブルし直した。
本発明者らは、特に指示されない限りエレクトロコンピテントなE.cloni EXPRESS BL21(DE3)大腸菌(E.coli)細胞(Lucigen)を使用してインビボスクリーンを実施した。コンピテント細胞をエフェクタープラスミド及び/又は非コードで共形質転換した(図4B)。1.0mmキュベットで製造者のプロトコルに従いGene Pulser Xcell(登録商標)(Bio-rad)を用いて細胞を「入力ライブラリ」で電気穿孔した。クロラムフェニコール(Fisher)及びカナマイシン(Alfa Aesar)の両方を含有するバイオアッセイプレートに細胞をプレーティングし、11時間成長させた後、本発明者らは近似コロニー数を推定することにより十分なライブラリ表現を確認し、細胞を回収した。
Illumina bcl2fastqを使用してスクリーン入力及び出力ライブラリの次世代シーケンシングデータをデマルチプレックス化した。各試料について得られたfastqファイル中のリードが、スクリーニングプラスミドライブラリ用のCRISPRアレイエレメントを含んだ。CRISPRアレイのダイレクトリピート配列を用いてアレイの向きを決定し、スペーサー配列をソース(pACYC184又は大腸菌(E.coli)必須遺伝子)又は陰性対照配列(GFP)にマッピングすることにより対応する標的を決定した。各試料について、所与のプラスミドライブラリ中の各ユニークなアレイエレメントのリード総数(ra)をカウントし、以下のとおり規格化した:(ra+1)/全てのライブラリアレイエレメントの総リード数。所与のアレイエレメントに関する規格化出力リード数を規格化入力リード数で除すことにより、枯渇スコアを計算した。
図5A~図5Dは、pACYC184及び大腸菌(E.coli)E.cloni(登録商標)必須遺伝子を標的化するCas12i1及びCas12i2についての強力に枯渇した標的の位置を示す。注目すべきことに、強力に枯渇した標的の位置は、潜在的標的空間全体にわたって分散しているように見える。
Cas12iはインビボでプレcrRNAをプロセシングする
V-I型CRISPR-CasシステムについてのcrRNAバイオジェネシスを調べるため、本発明者らは、細菌スクリーンからのCas12i及び最小CRISPRアレイライブラリを発現する大腸菌(E.coli)からスモールRNAを精製し、シーケンシングした。図11A及び図11Bは、RNA-シーケンシングリードの累積を示し、それぞれCas12i1及びCas12i2成熟crRNAの強力なコンセンサス形態、並びにスペーサー長さの分布が示される。観察された最も一般的なスペーサー長さは21であり、長さのばらつきは16nt~22ntであった。
エフェクターベクターを大腸菌(E.coli)NiCo21(DE3)(New England BioLabs)に形質転換し、T7プロモーター下で発現させた。形質転換細胞を初めに3mLルリアブロス(Sigma)+50ug/mLカナマイシン中で一晩成長させた後、続いて1Lのテリフィックブロス培地(Sigma)+50ug/mLカナマイシンに1mLの一晩培養物を接種した。1~1.5のOD600になるまで細胞を37℃で成長させて、次に0.2mM IPTGでタンパク質発現を誘導した。次に培養物を20℃で更に14~18時間成長させた。培養物を回収し、遠心によってペレット化し、次に80mLの溶解緩衝液(50mM HEPES pH7.6、0.5M NaCl、10mMイミダゾール、14mM 2-メルカプトエタノール、及び5%グリセロール)+プロテアーゼ阻害薬(Sigma)中に再懸濁した。細胞破壊器(Constant System Limited)で細胞を溶解させて、次に4℃において28,000×gで20分間の遠心を2回行うことによりライセートを清澄化した。このライセートを5mL HisTrap FFカラム(GE Life Sciences)にロードし、次にFPLC(AKTA Pure、GE Life Sciences)によって10mMから250mMへのイミダゾール勾配で精製した。低塩濃度緩衝液(50mM HEPES-KOH pH7.8、500mM KCl、10mM MgCl2、14mM 2-メルカプトエタノール、及び5%グリセロール)中でCas12i1を精製した。精製後、画分をSDS-PAGEゲルに流し、適切なサイズのタンパク質を含有する画分をプールし、10kD Amicon Ultra-15遠心ユニットを用いて濃縮した。Qubitタンパク質アッセイ(Thermo Fisher)により、タンパク質濃度を決定した。
Cas12i1が自律的crRNAバイオジェネシス能力を有するかどうかを決定するため、本発明者らは、大腸菌(E.coli)から精製したエフェクタータンパク質を、最小CRISPRアレイ(リピート-スペーサー-リピート-スペーサー-リピート)から発現するプレcrRNAと共にインキュベートした。本発明者らは、精製したCas12i1が、インビボスモールRNAseqから同定される成熟crRNAと一致する断片へとプレcrRNAをプロセシングすることを観察し、Cas12i1が自律的プレcrRNAプロセシング能力を有することが示唆された(図12)。
Cas12i1の干渉活性機構を探るため、本発明者らは、インビボネガティブ選択スクリーンから強力に枯渇したCRISPRアレイ配列を選択し、DR-スペーサー-DR-スペーサー-DR配列を有するプレcrRNAを作成した。プレcrRNAは、プレcrRNAの第2のスペーサーに相補的な標的配列を含有する128nt ssDNA及びdsDNA基質へとCas12i1を標的化するように設計した。本発明者らは、エフェクタータンパク質とプレcrRNAとからなるCas12i1二元複合体が62.5nM複合体濃度での飽和まで100nMの標的ssDNAを切断したことを観察した(図13)。切断されたssDNAから短い断片又は単一ヌクレオチドに至るまでの更なる分解が高い複合体濃度で観察されたが、これは、二元複合体がssDNA標的に結合することにより活性化されたコラテラルssDNA切断を示唆するものである(図13)。
crRNA及び基質RNA用の一本鎖DNAオリゴ鋳型をIDTに注文した。NEBNEXT Hifi 2×マスターミックス(New England Biolabs)を使用して基質RNA及びプレcrRNA鋳型をPCR増幅することにより、二本鎖インビトロ転写(IVT)鋳型DNAを作成した。T7プライマーを鋳型とアニーリングした後、続いてDNAポリメラーゼI、ラージ(クレノウ)断片(New England Biolabs)を使用して伸長することにより、成熟cr-RNA用の二本鎖DNA鋳型を作成した。アニーリングは、95℃で5分間、続いて-5℃/分の低下で4℃までインキュベートすることにより実施した。インビトロ転写は、HiScribe T7 Quick高収率RNAキット(New England Biolabs)を使用してdsDNA鋳型をT7 RNAポリメラーゼと37℃で3時間インキュベートすることにより実施した。インキュベーション後、IVT試料をTurbo DNase(登録商標)(Thermo Scientific)で処理し、次にRNA Clean & Concentratorキット(Zymo Research)を使用して精製した。IVTから作成された成熟cr-RNAを仔ウシ腸アルカリホスファターゼ(Thermo Fisher)又はRNA5’-ポリホスファターゼ(Lucigen)によって37℃で2時間処理して、それぞれ5’-ヒドロキシル又は5’-一リン酸を作成した後、続いてRNA Clean & Concentratorキット(Zymo Research)でクリーンアップした。Nanodrop 2000(Thermo Fisher)によって濃度を測定した。
IVTからのRNA基質を仔ウシ腸アルカリホスファターゼ(Thermo Fisher)によって37℃で30分間処理することにより5’-三リン酸を5’末端ヒドロキシル基に変換し、RNA Clean & Concentratorキット(Zymo Research)を使用して精製した。5’EndTag Labeling Kit(Vector Labs)でDNA及びRNA基質の5’末端ヒドロキシル基にチオール末端基を付加し、次に基質をIRDye 800CWマレイミド(LI-COR Biosciences)で標識した。DNA Clean & Concentratorキット又はRNA Clean & Concentratorキット(Zymo Research)を使用して基質を精製した。非標的(非スペーサー相補的)ssDNA鎖を標識し、プライマーとアニーリングして、次にDNAポリメラーゼI、ラージ(クレノウ)断片(New England Biolabs)によって25℃で15分間伸長させることにより、標識されたdsDNA基質を作成した。これらの基質をDNA Clean & Concentratorキット(Zymo Research)によって精製した。Nanodrop 2000(Thermo Fisher)によって濃度を測定した。
ssDNA:最適化した切断緩衝液(50mMトリス-HCl pH8.0、50mM NaCl、1mM DTT、10mM MgCl2、50ug/ml BSA)中でssDNAによるCas12i標的切断アッセイを実施した。1:2モル濃度比のCas12i:プレcrRNAを37℃で10分間インキュベートし、続いて氷上に移すことにより、二元複合体を形成した。更なる複合体希釈は全て、タンパク質:RNA比を一定に保ちながら氷上で行った。この複合体を100nM IR800標識基質に加え、37℃で30分間インキュベートした。反応物をRNアーゼカクテル及びプロテイナーゼKで処理し、上記のとおり分析した。
本明細書に記載されるとおり、インビトロプール型スクリーニングは、生化学的評価の実施に効率的なハイスループット方法として働く。概要として、本発明者らはCRISPR-Casシステムのインビトロ再構成から始める(図20)。一実施形態では、1つ又は複数のエフェクタータンパク質の発現をドライブするT7-RNAポリメラーゼプロモーターを含有するdsDNA鋳型を使用し、且つ反応用のタンパク質を作製するインビトロ転写及び翻訳試薬を使用してエフェクタータンパク質を作製する。別の実施形態では、最小CRISPRアレイ及びtracrRNAが、可能な全てのRNAの向きを調べるためPCRを用いてトップ鎖又はボトム鎖のいずれかの転写方向に付加されたT7プロモーター配列を含む。図20に示されるとおり、apo型はエフェクターのみを含み、二元型はエフェクタータンパク質とT7 転写物最小CRISPRアレイとを含み、二元+tracrRNA型はインキュベーション用に複合体に任意のT7転写tracrRNAエレメントを加える。
V-I型CRISPR-Casシステムの最小成分を計算的に同定したことで、本発明者らは、エフェクターCas12i1を含むV-I1型システムからの二本鎖DNA(dsDNA)切断活性を調べた。
V-I型CRISPR-Casシステムの最小成分を計算的に同定したことで、本発明者らは、エフェクターCas12i2を含むV-I2型システムからの二本鎖DNA(dsDNA)切断活性を調べた。
新規CRISPR-Casシステムの活性の迅速検証のため、インビボ遺伝子サイレンシング活性を模倣するインビトロ遺伝子サイレンシングアッセイ(図18A及び図18B)を開発した。このアッセイは同時に、天然細胞環境外で種々の活性機構及び機能パラメータを偏りのない方法で評価することができる。
(1)モジュール性-再構成IVTTは、個々に精製された成分からなる合成システムであり、アッセイを種々の制御及び活性のためにカスタム設計することが可能となる。CRISPR-Casシステムの各成分は別個の線状DNA鋳型にコードされるため、異なるエフェクター、エフェクター変異体、及びRNAガイドの組み合わせの迅速なアッセイが可能となる;
(2)複雑性-このアッセイはRNA転写及びタンパク質合成に必須の成分を全て含むため、DNA及びRNA切断、並びに転写依存性干渉など、多様な干渉機構を一回のワンポット反応で試験することが可能となる。このアッセイの動態学的蛍光リードアウトは、エンドポイント活性アッセイと比べて大幅に多いデータ点を提供する;
(3)感度-このアッセイはエフェクター及びRNAガイド合成を基質干渉と組み合わせるため、新規に合成されたRNP(エフェクタータンパク質とRNAガイドとのリボ核タンパク質複合体)が同じ反応内で基質と直ちに相互作用することが可能となる。別個の精製ステップがなく、従って潜在的に少量のRNPでシグナルの生成に十分とすることが可能となる。更に、DNA鋳型1個につき100個を超えるGFPタンパク質を生成することのできる組み合わされたGFP転写及び翻訳に起因して、GFP発現の干渉が増幅される。
(4)効率-このアッセイは、ハイスループットプラットフォームと高度な適合性があるように設計される。そのモジュール性に起因して、一般に入手可能な液体ハンドリング機器によって96、384及び1536ウェルフォーマットでアッセイの全ての成分を加えることができ、一般に入手可能なプレート蛍光光度計によって蛍光を測定することができる。
(5)関連性-このアッセイは、CRISPR-Casエフェクタータンパク質がその天然細胞環境外でインビトロでエンジニアリングされるシステムにおいて転写及び翻訳時に遺伝子発現に干渉する能力を試験する。この遺伝子サイレンシングアッセイによって測定された高活性CRISPR-Casエフェクターがまた、哺乳類細胞における遺伝子編集にも高度に効率的である可能性があり得る。
Cas12iタンパク質のヌクレアーゼ活性(即ち、crRNAスペーサーに相補的な標的ssDNA基質によって活性化される非特異的コラテラルDNアーゼ活性)により、こうしたエフェクターは核酸種の検出への使用に有望な候補となる。これらの方法の一部は既に記載されており(例えば、East-Seletsky et al.“Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection,”Nature.2016 Oct 13;538(7624):270-273を参照のこと)、Gootenberg et al.(2017)、Chen et al.2018、及びGootenberg et al.(2018)“Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13,Cas12a,and Csm6”Science 15 Feb 2018:eaaq0179)は、Cas13aを使用した一般的なRNA検出原理について記載し(East-Seletsky et al.(2016))、これは検出感度を増加させるための増幅及び更なるCas13a酵素の最適化によって補足され(Gootenberg et al.(2017))、及び最近では、マルチプレックス化した核酸検出を検出感度の増加と共に実現するため、更なるRNA標的、オルソロガス及びパラロガス酵素、並びにCsm6アクチベーターを含めることにより補足されている(Gootenberg et al.(2018))。このツールキットにCas12iを加えると、核酸検出のための直交性の活性の更なるチャンネルが提供される。
CLUST.029130エフェクターCas12iは、非標的鎖のニッキングを通じてdsDNAを操作する能力を有する(図15、図16、図17A~図17B)。触媒的に不活性化されたCas12iがまたFokIヌクレアーゼドメインと融合されて、dsDNAの結合及びニッキング能力を有する融合タンパク質が作成されてもよい。これらの方法の一部については、以前記載されている。Ran et al.(2013)“Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity”Science 29 Aug 2013は、Cas9を使用したダブルニッキングの一般的原理及び最適化について記載している;Guilinger et al.(2014)“Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification”Science 25 Apr 2014は、FokI-dCas9融合体を使用したダブルニッキングの原理について記載している。
真核生物適用向けのCLUST.029130(V-I型)CRISPR Casシステムを開発するため、初めにタンパク質エフェクターをコードするコンストラクトを哺乳類細胞での発現にコドン最適化し、任意選択でエフェクタータンパク質のN末端又はC末端のいずれか一方又は両方に特異的局在化タグを付加した。こうした局在化タグには、ゲノムDNAの修飾のためエフェクターを核に局在化させる核局在化シグナル(NLS)配列などの配列が含まれ得る。これらの配列については、上記の「機能性突然変異」の節に記載される。局在化タグを含む哺乳類コドン最適化されたCas12iエフェクターをコードするようにエンジニアリングされた天然に存在しないヌクレオチド配列の一部の例を表10に提供する。蛍光タンパク質などの他のアクセサリータンパク質が更に付加されてもよい。ロバストな「スーパーフォールディング(superfolding)」タンパク質、例えばスーパーフォールディング緑色蛍光タンパク質(GFP)などを加えると、エフェクターに付加したときの哺乳類細胞におけるCRISPR酵素の活性が増加し得ることが実証されている(Abudayyeh et al.(2017)Nature 550(7675):280-4、及びCox et al.(2017)Science 358(6366):1019-27)。
V-I型CRISPR-Casエフェクタータンパク質及びcrRNAが特異的ssDNA又はdsDNA標的にハイブリダイズすると、基質のニッキング又は切断が生じる。かかる活性が細胞中の特異的DNA標的の存在に依存することは、それが特異的な基礎遺伝子型に基づく特異的ゲノム材料又は細胞集団のターゲティングを実現するため、貴重である。真核生物、原核生物、及びウイルス/プラスミドセッティングの両方において、ゲノム複製、細胞死、又は細胞休眠のかかる制御に向けた適用が多数存在する。
本発明はその詳細な説明を伴い説明されているが、前述の説明は例示であり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定する意図はないことが理解されるべきである。他の態様、利点、及び変形例が、以下の特許請求の範囲内にある。
Claims (30)
- (a)RNAガイド又は前記RNAガイドをコードする核酸であって、前記RNAガイドはダイレクトリピート配列とスペーサー配列とを含む、前記RNAガイド又は前記核酸;及び
(b)CRISPR-Casエフェクタータンパク質又は前記CRISPR-Casエフェクタータンパク質をコードする核酸であって、前記CRISPR-Casエフェクタータンパク質は配列番号5と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記CRISPR-Casエフェクタータンパク質又は前記核酸
を含み、前記CRISPR-Casエフェクタータンパク質が前記RNAガイドに結合し、前記スペーサー配列が標的核酸に結合する、エンジニアリングされた天然に存在しないクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)関連(Cas)システム。 - 前記システムがtracrRNAを含まない、請求項1に記載のシステム。
- 前記CRISPR-Casエフェクタータンパク質が、
(a)アミノ酸配列X1SHX4DX6X7(配列番号200)(式中、X1はS又はTであり、X4はQ又はLであり、X6はP又はSであり、及びX7はF又はLである)を含むRuvCドメイン、
(b)アミノ酸配列X1XDXNX6X7XXXX11(配列番号201)(式中、X1はA、G、又はSであり、Xは任意のアミノ酸であり、X6はQ又はIであり、X7はT、S、又はVであり、及びX11 はT又はAである)を含むRuvCドメイン;及び
(c)アミノ酸配列X1X2X3E(配列番号210)(式中、X1はC、F、I、L、M、P、V、W、又はYであり、X2はC、F、I、L、M、P、R、V、W、又はYであり、及びX3はC、F、G、I、L、M、P、V、W、又はYである)を含むRuvCドメイン
のうちの1つ以上を含む、請求項1に記載のシステム。 - 前記ダイレクトリピート配列が、
(a)前記スペーサー配列に隣接する5’-CCGUCNNNNNNUGACGG-3’(配列番号202)(式中、Nは任意の核酸塩基である);
(b)前記スペーサー配列に隣接する5’-GUGCCNNNNNNUGGCAC-3’(配列番号203)(式中、Nは任意の核酸塩基である);
(c)前記スペーサー配列に隣接する5’-GUGUCN5-6UGACAX1-3’(配列番号204)(式中、N5-6は任意の5又は6核酸塩基の連続配列であり、及びX1はC又はT又はUである);
(d)前記スペーサー配列に隣接する5’-UCX3UX5X6X7UUGACGG-3’(配列番号205)(式中、X3はC、T、又はUであり、X5はA、T、又はUであり、X6はA、C、又はGであり、及びX7はA又はGである);あるいは
(e)前記スペーサー配列に隣接する5’-CCX3X4X5CX7UUGGCAC-3’(配列番号206)(式中、X3はC、T、又はUであり、X4はA、T、又はUであり、X5はC、T、又はUであり、及びX7はA又はGである)
のうちのいずれか1つを含む、請求項1に記載のシステム。 - 前記CRISPR-Casエフェクタータンパク質が、配列番号5と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ダイレクトリピート配列が、配列番号9又は配列番号10と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
請求項1に記載のシステム。 - 前記CRISPR-Casエフェクタータンパク質が、配列番号5と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ダイレクトリピート配列が、配列番号9又は配列番号10に記載のヌクレオチド配列を含む、
請求項1に記載のシステム。 - 前記CRISPR-Casエフェクタータンパク質が、配列番号5に記載のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のシステム。
- 前記ダイレクトリピート配列が、前記ダイレクトリピート配列の3’末端の近位にステム-ループ構造を含み、前記ステム-ループ構造が、
(a)第1のステムヌクレオチド鎖5ヌクレオチド長;
(b)第2のステムヌクレオチド鎖5ヌクレオチド長(前記第1及び第2のステムヌクレオチド鎖は互いに結合する);及び
(c)前記第1及び第2のステムヌクレオチド鎖間に配置されたループヌクレオチド鎖であって、6、7、又は8ヌクレオチドを含むループヌクレオチド鎖
を含む、請求項1に記載のシステム。 - 前記スペーサー配列が長さ15~47のヌクレオチドを含む、請求項1に記載のシステム。
- 前記スペーサー配列が長さ24~38のヌクレオチドを含む、請求項9に記載のシステム。
- 前記標的核酸は、前記スペーサー配列中のヌクレオチド配列に相補的な配列を含む、請求項1に記載のシステム。
- 前記CRISPR-Casエフェクタータンパク質がプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列を認識し、前記PAM配列が、5’-TTN-3’(式中、Nは任意のヌクレオチドである)として記載されるヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載のシステム。
- 前記PAM配列が、5’-TTY-3’(式中、YはC又はTである)又は5’-TTH-3’(式中、HはA又はC又はTである)として記載されるヌクレオチド配列を含む、請求項12に記載のシステム。
- 前記CRISPR-Casエフェクタータンパク質が、前記標的核酸を切断する、請求項1に記載のシステム。
- 前記CRISPR-Casエフェクタータンパク質が、少なくとも1つの核局在化シグナル(NLS)、少なくとも1つの核外移行シグナル(NES)、又は少なくとも1つのNLS及び少なくとも1つのNESをさらに含む、請求項1に記載のシステム。
- 前記CRISPR-Casエフェクタータンパク質が、ペプチドタグ、蛍光タンパク質、塩基編集ドメイン、DNAメチル化ドメイン、ヒストン残基修飾ドメイン、局在化因子、転写修飾因子、光ゲート制御因子、化学誘導性因子、又はクロマチン可視化因子をさらに含む、請求項1に記載のシステム。
- 前記CRISPR-Casエフェクタータンパク質をコードする前記核酸が細胞での発現にコドン最適化される、請求項1に記載のシステム。
- 前記CRISPR-Casエフェクタータンパク質をコードする前記核酸がプロモーターに作動可能に連結される、請求項1に記載のシステム。
- 前記CRISPR-Casエフェクタータンパク質をコードする前記核酸がベクター中にある、請求項1に記載のシステム。
- 前記ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、又は単純ヘルペスベクターを含む、請求項19に記載のシステム。
- ナノ粒子、リポソーム、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃を含む送達システム中に存在する、請求項1に記載のシステム。
- 請求項1に記載のシステムを含むエキソビボまたはインビトロ細胞。
- 前記細胞が原核細胞又は真核細胞である、請求項22に記載のエキソビボまたはインビトロ細胞。
- 前記細胞が哺乳類細胞又は植物細胞である、請求項23に記載のエキソビボまたはインビトロ細胞。
- 前記細胞がヒト細胞である、請求項24に記載のエキソビボまたはインビトロ細胞。
- 前記システムを細胞中の前記標的核酸に結合させる方法における使用のための請求項1に記載のシステムであって、前記方法は、
(a)前記システムを提供すること;及び
(b)前記システムを前記細胞に送達すること
を含み、前記細胞は、前記標的核酸を含み、前記CRISPR-Casエフェクタータンパク質は、前記RNAガイドに結合し、前記スペーサー配列は、前記標的核酸に結合する、システム。 - 前記標的核酸が一本鎖DNA又は二本鎖DNAである、請求項26に記載のシステム。
- 前記システムを前記標的核酸へ結合させることが、前記標的核酸の修飾を生じさせる、請求項26に記載のシステム。
- 前記システムを前記標的核酸へ結合させることが、前記標的核酸の切断を生じさせる、請求項26に記載のシステム。
- 前記標的核酸の切断が、前記標的核酸における挿入又は欠失の形成を生じさせる、請求項29に記載のシステム。
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WO2023010084A2 (en) * | 2021-07-30 | 2023-02-02 | Arbor Biotechnologies, Inc. | Gene editing systems comprising a nuclease and uses thereof |
WO2023018856A1 (en) | 2021-08-11 | 2023-02-16 | Arbor Biotechnologies, Inc. | Gene editing systems comprising an rna guide targeting polypyrimidine tract binding protein 1 (ptbp1) and uses thereof |
US20230203539A1 (en) | 2021-08-11 | 2023-06-29 | Arbor Biotechnologies, Inc. | Gene editing systems comprising an rna guide targeting stathmin 2 (stmn2) and uses thereof |
EP4384608A1 (en) * | 2021-08-12 | 2024-06-19 | Arbor Biotechnologies, Inc. | Compositions comprising a variant cas12i3 polypeptide and uses thereof |
WO2023029532A1 (en) * | 2021-08-30 | 2023-03-09 | Huigene Therapeutics Co., Ltd. | Engineered cas6 protein and uses thereof |
WO2023034475A1 (en) | 2021-09-01 | 2023-03-09 | Arbor Biotechnologies, Inc. | Cells modified by a cas12i polypeptide |
US20230287456A1 (en) * | 2021-09-10 | 2023-09-14 | Arbor Biotechnologies, Inc. | Compositions comprising a cas12i polypeptide and uses thereof |
WO2023070019A1 (en) | 2021-10-21 | 2023-04-27 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Hypoimmune cells |
CN114015674A (zh) | 2021-11-02 | 2022-02-08 | 辉二(上海)生物科技有限公司 | 新型CRISPR-Cas12i*** |
WO2023078314A1 (en) * | 2021-11-02 | 2023-05-11 | Huidagene Therapeutics Co., Ltd. | Novel crispr-cas12i systems and uses thereof |
CN118339285A (zh) * | 2021-12-09 | 2024-07-12 | 北京干细胞与再生医学研究院 | 工程化Cas12b效应子蛋白及其使用方法 |
WO2023122805A1 (en) | 2021-12-20 | 2023-06-29 | Vestaron Corporation | Sorbitol driven selection pressure method |
WO2023122433A1 (en) | 2021-12-22 | 2023-06-29 | Arbor Biotechnologies, Inc. | Gene editing systems targeting hydroxyacid oxidase 1 (hao1) and lactate dehydrogenase a (ldha) |
CN118076730A (zh) * | 2022-03-18 | 2024-05-24 | 山东舜丰生物科技有限公司 | 活性改善的Cas蛋白及其应用 |
CN114591983B (zh) * | 2022-04-12 | 2023-07-21 | 中山大学 | 一种基于dna纳米技术的蛋白质邻近标记方法及其应用 |
WO2023204008A1 (ja) * | 2022-04-21 | 2023-10-26 | 株式会社島津製作所 | 微生物判別用のデータベースを構築する方法および装置 |
CN117460822A (zh) * | 2022-04-25 | 2024-01-26 | 辉大基因治疗(新加坡)私人有限公司 | 新型CRISPR-Cas12i***及其用途 |
WO2023215725A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-09 | Fred Hutchinson Cancer Center | Compositions and methods for cellular immunotherapy |
CN114921439B (zh) * | 2022-06-16 | 2024-04-26 | 尧唐(上海)生物科技有限公司 | CRISPR-Cas效应子蛋白、其基因编辑***及应用 |
WO2024011173A1 (en) * | 2022-07-07 | 2024-01-11 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for editing cytoplasmic dna |
CN116716277A (zh) * | 2022-07-07 | 2023-09-08 | 山东舜丰生物科技有限公司 | Cas酶及其应用 |
WO2024017189A1 (en) * | 2022-07-18 | 2024-01-25 | Beijing Institute For Stem Cell And Regenerative Medicine | Tnpb-based genome editor |
US20240035010A1 (en) * | 2022-07-22 | 2024-02-01 | Arbor Biotechnologies, Inc. | Compositions comprising a variant polypeptide and uses thereof |
WO2024026406A2 (en) | 2022-07-29 | 2024-02-01 | Vestaron Corporation | Next Generation ACTX Peptides |
CN115786378B (zh) * | 2022-09-22 | 2023-12-01 | 态创生物科技(广州)有限公司 | 体内靶向诱变的*** |
WO2024118747A1 (en) | 2022-11-30 | 2024-06-06 | Arbor Biotechnologies, Inc. | Reverse transcriptase-mediated genetic editing of transthyretin (ttr) and uses thereof |
CN115716880A (zh) * | 2022-12-07 | 2023-02-28 | 云舟生物科技(广州)股份有限公司 | 一种核定位荧光蛋白及其应用 |
CN116590237B (zh) * | 2023-05-29 | 2023-10-31 | 上海贝斯昂科生物科技有限公司 | 一种遗传修饰的自然杀伤细胞及其制备和用途 |
CN116854787B (zh) * | 2023-09-05 | 2023-11-07 | 四川大学 | 一种Cas7-11蛋白的抑制剂及其应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017127807A1 (en) | 2016-01-22 | 2017-07-27 | The Broad Institute Inc. | Crystal structure of crispr cpf1 |
WO2018035388A1 (en) | 2016-08-17 | 2018-02-22 | The Broad Institute, Inc. | Novel crispr enzymes and systems |
WO2018035250A1 (en) | 2016-08-17 | 2018-02-22 | The Broad Institute, Inc. | Methods for identifying class 2 crispr-cas systems |
Family Cites Families (50)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4797368A (en) | 1985-03-15 | 1989-01-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector |
US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
US5173414A (en) | 1990-10-30 | 1992-12-22 | Applied Immune Sciences, Inc. | Production of recombinant adeno-associated virus vectors |
US5587308A (en) | 1992-06-02 | 1996-12-24 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services | Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter |
US5593972A (en) | 1993-01-26 | 1997-01-14 | The Wistar Institute | Genetic immunization |
AU2005274948B2 (en) | 2004-07-16 | 2011-09-22 | Genvec, Inc. | Vaccines against aids comprising CMV/R-nucleic acid constructs |
US20140113376A1 (en) | 2011-06-01 | 2014-04-24 | Rotem Sorek | Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes |
CN105658796B (zh) | 2012-12-12 | 2021-10-26 | 布罗德研究所有限公司 | 用于序列操纵的crispr-cas组分***、方法以及组合物 |
MX2015007550A (es) | 2012-12-12 | 2017-02-02 | Broad Inst Inc | Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas. |
US20140186843A1 (en) * | 2012-12-12 | 2014-07-03 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof |
CN115141260A (zh) | 2013-10-11 | 2022-10-04 | 马萨诸塞眼科耳科诊所 | 预测祖先病毒序列的方法及其用途 |
US9834791B2 (en) | 2013-11-07 | 2017-12-05 | Editas Medicine, Inc. | CRISPR-related methods and compositions with governing gRNAS |
AU2015236128A1 (en) | 2014-03-25 | 2016-11-10 | Editas Medicine Inc. | CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating HIV infection and AIDS |
US11242525B2 (en) | 2014-03-26 | 2022-02-08 | Editas Medicine, Inc. | CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating sickle cell disease |
WO2015148860A1 (en) | 2014-03-26 | 2015-10-01 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating beta-thalassemia |
WO2015153789A1 (en) | 2014-04-01 | 2015-10-08 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus type 1 (hsv-1) |
WO2015153791A1 (en) | 2014-04-01 | 2015-10-08 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus type 2 (hsv-2) |
WO2015157070A2 (en) | 2014-04-09 | 2015-10-15 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating cystic fibrosis |
US20170175128A1 (en) | 2014-04-18 | 2017-06-22 | Editas Medicine, Inc. | Crispr-cas-related methods, compositions and components for cancer immunotherapy |
EP3155101B1 (en) * | 2014-06-16 | 2020-01-29 | The Johns Hopkins University | Compositions and methods for the expression of crispr guide rnas using the h1 promoter |
WO2016094874A1 (en) | 2014-12-12 | 2016-06-16 | The Broad Institute Inc. | Escorted and functionalized guides for crispr-cas systems |
WO2016094872A1 (en) | 2014-12-12 | 2016-06-16 | The Broad Institute Inc. | Dead guides for crispr transcription factors |
BR112017012765A2 (pt) * | 2014-12-17 | 2018-01-16 | Du Pont | ?métodos para editar uma sequência de nucleotídeos, célula e linhagem de e. coli e método para produzir uma célula de e. coli? |
WO2016106236A1 (en) | 2014-12-23 | 2016-06-30 | The Broad Institute Inc. | Rna-targeting system |
EP3277816B1 (en) | 2015-04-01 | 2020-06-17 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating duchenne muscular dystrophy and becker muscular dystrophy |
WO2016183236A1 (en) | 2015-05-11 | 2016-11-17 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating hiv infection and aids |
EP3666895A1 (en) | 2015-06-18 | 2020-06-17 | The Broad Institute, Inc. | Novel crispr enzymes and systems |
US9790490B2 (en) | 2015-06-18 | 2017-10-17 | The Broad Institute Inc. | CRISPR enzymes and systems |
KR20180133374A (ko) | 2015-10-22 | 2018-12-14 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | 타입 vi-b crispr 효소 및 시스템 |
CN115491373A (zh) | 2015-10-30 | 2022-12-20 | 爱迪塔斯医药公司 | 治疗单纯疱疹病毒的crispr/cas相关方法及组合物 |
AU2016359629B2 (en) | 2015-11-23 | 2023-03-09 | Ranjan BATRA | Tracking and manipulating cellular RNA via nuclear delivery of CRISPR/Cas9 |
US11512311B2 (en) | 2016-03-25 | 2022-11-29 | Editas Medicine, Inc. | Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (A1AT) deficiency |
US10337051B2 (en) | 2016-06-16 | 2019-07-02 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for detecting a target RNA |
JP7267013B2 (ja) | 2016-06-17 | 2023-05-01 | ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド | Vi型crisprオルソログ及び系 |
US11041164B2 (en) * | 2017-06-22 | 2021-06-22 | Ut-Battelle, Llc | Genes for enhancing drought and heat tolerance in plants and methods of use |
WO2019178428A1 (en) | 2018-03-14 | 2019-09-19 | Arbor Biotechnologies, Inc. | Novel crispr dna and rna targeting enzymes and systems |
DE202019005567U1 (de) * | 2018-03-14 | 2021-02-16 | Arbor Biotechnologies, Inc. | Neue CRISPR-DNA-Targeting-Enzyme und -Systeme |
WO2019201331A1 (zh) | 2018-04-20 | 2019-10-24 | 中国农业大学 | 一种CRISPR/Cas效应蛋白及*** |
AU2019266326A1 (en) | 2018-05-11 | 2020-11-26 | Beam Therapeutics Inc. | Methods of editing single nucleotide polymorphism using programmable base editor systems |
CA3108281A1 (en) * | 2018-08-03 | 2020-02-06 | Beam Therapeutics Inc. | Multi-effector nucleobase editors and methods of using same to modify a nucleic acid target sequence |
CN111757889B (zh) | 2018-10-29 | 2021-05-25 | 中国农业大学 | 新型CRISPR/Cas12f酶和*** |
AU2020221366A1 (en) | 2019-02-13 | 2021-08-26 | Beam Therapeutics Inc. | Adenosine deaminase base editors and methods of using same to modify a nucleobase in a target sequence |
US20220098593A1 (en) | 2019-02-13 | 2022-03-31 | Beam Therapeutics Inc. | Splice acceptor site disruption of a disease-associated gene using adenosine deaminase base editors, including for the treatment of genetic disease |
KR20210138603A (ko) | 2019-02-13 | 2021-11-19 | 빔 테라퓨틱스, 인크. | 표적 서열에서 핵염기를 변형하기 위한 아데노신 데아미나제 염기 편집기를 갖는 변형된 면역 세포 |
JP2022520080A (ja) | 2019-02-13 | 2022-03-28 | ビーム セラピューティクス インク. | 遺伝的疾患の治療用を含めアデノシンデアミナーゼ塩基エディターを用いて疾患関連遺伝子を編集する方法 |
WO2020168088A1 (en) | 2019-02-13 | 2020-08-20 | Beam Therapeutics Inc. | Compositions and methods for treating glycogen storage disease type 1a |
EP4219700A1 (en) | 2019-03-07 | 2023-08-02 | The Regents of the University of California | Crispr-cas effector polypeptides and methods of use thereof |
CA3140093A1 (en) | 2019-05-21 | 2020-11-26 | Beam Therapeutics Inc. | Methods of editing a single nucleotide polymorphism using programmable base editor systems |
CN111690720B (zh) | 2020-06-16 | 2021-06-15 | 山东舜丰生物科技有限公司 | 利用修饰的单链核酸进行靶核酸检测的方法 |
CN113308451B (zh) | 2020-12-07 | 2023-07-25 | 中国科学院动物研究所 | 工程化的Cas效应蛋白及其使用方法 |
-
2019
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-
2020
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-
2021
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-
2022
- 2022-12-09 US US18/064,171 patent/US11912992B2/en active Active
-
2024
- 2024-01-05 JP JP2024000695A patent/JP2024019739A/ja active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017127807A1 (en) | 2016-01-22 | 2017-07-27 | The Broad Institute Inc. | Crystal structure of crispr cpf1 |
WO2018035388A1 (en) | 2016-08-17 | 2018-02-22 | The Broad Institute, Inc. | Novel crispr enzymes and systems |
WO2018035250A1 (en) | 2016-08-17 | 2018-02-22 | The Broad Institute, Inc. | Methods for identifying class 2 crispr-cas systems |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20200063126A1 (en) | 2020-02-27 |
US20200407716A1 (en) | 2020-12-31 |
US20200407715A1 (en) | 2020-12-31 |
JP2021516970A (ja) | 2021-07-15 |
CA3093334A1 (en) | 2019-09-19 |
US20210123047A1 (en) | 2021-04-29 |
EP3765615B1 (en) | 2023-06-28 |
SI3765615T1 (sl) | 2023-10-30 |
EP4257696A3 (en) | 2024-01-24 |
DE202019005567U1 (de) | 2021-02-16 |
HUE063005T2 (hu) | 2023-12-28 |
US20230183688A1 (en) | 2023-06-15 |
WO2019178427A1 (en) | 2019-09-19 |
AU2019236210A1 (en) | 2020-09-10 |
LT3765615T (lt) | 2023-10-10 |
PT3765615T (pt) | 2023-08-28 |
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ES2952978T3 (es) | 2023-11-07 |
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CN112041444A (zh) | 2020-12-04 |
FI3765615T3 (fi) | 2023-08-29 |
US11168324B2 (en) | 2021-11-09 |
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EP4257696A2 (en) | 2023-10-11 |
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