JP7455386B2 - 淡水産微細藻類の培養方法 - Google Patents
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Description
本願は、2018年10月2日に、日本に出願された特願2018-187763号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
微細藻類の産業上利用については、コスト面等から、高価な機能性食品等の利用形態に限られている。微細藻類の生産コストを抑制して産業利用を促進するためには、屋外における大量培養が好ましい。屋外大量培養は、管理が簡易などの特徴を有するものの、コンタミネーションのリスクがあり、また直接外部環境の影響を受けるほか、藻類捕食者等の侵入も問題となる。そのようなリスクを回避するため、屋外大量培養を行う微細藻類としては、環境変動(光、温度等)に耐性を有すること、他の生物が生存できないような条件で培養できること、高密度まで増殖可能であること、等の条件が求められる。
そのため、現在までに、産業的に実用化されているのは、クロレラ(Chlorella)、ユーグレナ(Euglena)、ドナリエラ(Dunaliella)、スピルリナ(Spirulina)等の数種に限られている。これらの藻類種は、屋外大量培養に成功しており、機能性食品やサプリメントの原料として利用されている。
特許文献1には、耐塩性藻類を、段階的に塩濃度を増加させた培地で培養することを特徴とする油脂成分を産生する方法が記載されている。特許文献1に記載の方法では、220nmの波長において、培地中の硝酸塩含有量を測定した場合、該含有量が、10mg/L以下となるときに、2段階目の塩濃度を増加させることを特徴としている。
特許文献2には、淡水に生息し、炭化水素類産生能を有する藻類シュードコリシスチス・エリプソイディア(Pseudochoricystis ellipsoidea)の培養において、その炭化水素生産能の生産性を高めるために、培養を開始してから培地の光学濃度が飽和状態を示す光学濃度の2分の1の光学濃度に達するまでの間に、培地に塩を投入することが開示されている。
特許文献3には、ドコサヘキサエン酸を産生するクリプセコディニウム(Crypthecodinium)属の培養において、藻体内にドコサヘキサエン酸を蓄積させるために、培養液の食塩濃度を前記藻類の生育に好適な食塩濃度より0.1~10重量%高い値に設定して培養する方法が開示されている。
特許文献1~3に記載の方法は、微細藻類に塩ストレスを与えて、炭化水素生産能やドコサヘキサエン酸生産能を高めようとするものであり、屋外培養におけるコンタミネーションリスクの抑制を目的とするものではない。
[1]微細藻類の培養方法であって、淡水産微細藻類を、水素イオン濃度pH1.0~6.0、ナトリウムイオン濃度0.1~0.4Mとなるように調製した培地で、培養温度が15~60℃で培養する培養工程を含む、淡水産微細藻類の培養方法。
[2]淡水産微細藻類の培養方法であって、淡水産微細藻類を、水素イオン濃度pH1.0~6.0、ナトリウムイオン濃度0.1~0.4Mとなるように調製した培地で培養する前培養工程と、前記前培養工程後の淡水産微細藻類を、ナトリウムイオン濃度が前記前培養工程における前記ナトリウムイオン濃度の1.2~5倍であり水素イオン濃度pH1.0~6.0となるように調製した培地で培養する本培養工程と、を含む、[1]に記載の淡水産微細藻類の培養方法。
[3]前記本培養工程における前記培地が、水素イオン濃度pH1.0~6.0、ナトリウムイオン濃度0.5M以上となるように調製した培地である、[1]又は[2]に記載の淡水産微細藻類の培養方法。
[4]前記本培養工程における前記培地が、水素イオン濃度pH1.0~6.0、ナトリウムイオン濃度0.4M以上となるように調製した培地である、[1]又は[2]に記載の淡水産微細藻類の培養方法。
[5]前記本培養工程における前記培地が、海水に、窒素含有塩、リン含有塩及び鉄含有塩を少なくとも添加し、且つ水素イオン濃度pH1.0~6.0となるように調製した培地である、[1]~[4]のいずれかに記載の淡水産微細藻類の培養方法。
[6]前記淡水産微細藻類が、イデユコゴメ綱に属する微細藻類である、[1]~[5]のいずれか1つに記載の淡水産微細藻類の培養方法。
[7]ナトリウムイオン濃度が0.5M以上である培地で増殖できない淡水産微細藻類を、水素イオン濃度pH1.0~6.0、ナトリウムイオン濃度0.1~0.4Mとなるように調製した培地で培養する工程を含む、水素イオン濃度pH1.0~6.0、ナトリウムイオン濃度0.5M以上となるように調製した培地で増殖可能な淡水産微細藻類の生産方法。
[8]前記淡水産微細藻類が、シアニジウム属に属する微細藻類の1倍体である、[7]に記載の淡水産微細藻類の生産方法。
[9]前記淡水産微細藻類が、ガルデリア属に属する微細藻類の1倍体である、[7]に記載の淡水産微細藻類の生産方法。
[10]イデユコゴメ綱に属する微細藻類の1倍体であって、水素イオン濃度pH2.0、ナトリウムイオン濃度0.5Mとなるように調製したM-Allen培地で、培養温度42℃、二酸化炭素濃度2%、照度60μmol/m2sの連続光で7日間静置培養したときの下記式(1)で算出される値が2以上であり、水素イオン濃度pH2.0となるように調製したM-Allen培地で、培養温度42℃、二酸化炭素濃度2%、照度60μmol/m2sの連続光で7日間静置培養したときの下記式(1)で算出される値が2未満である、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の1倍体。
(培養開始7日後のOD750値-培養開始時のOD750値)/(7×培養開始時OD750値) (1)
[11]水素イオン濃度pH7の等張液、または蒸留水中で細胞が破裂する、[10]に記載のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の1倍体。
[12]藻類細胞の乾燥処理を行い、前記乾燥処理後の細胞をpH7の等張液に懸濁すると、前記細胞が破裂する、[10]または[11]に記載のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の1倍体。
[13]前記[10]~[12]のいずれか1つに記載のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の1倍体を、海水に、窒素含有塩、リン含有塩及び鉄含有塩を少なくとも添加し、且つ水素イオン濃度pH1.0~6.0となるように調製した培地で培養することを含む、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の1倍体の培養方法。
[14]前記[10]~[12]のいずれか1つに記載のイデユコゴメ綱に属する微細藻類を屋外で培養することを含む、イデユコゴメ綱に属する微細藻類1倍体の培養方法。
[15]淡水産微細藻類として、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の1倍体であって、水素イオン濃度pH2.0、ナトリウムイオン濃度0.5Mとなるように調製したM-Allen培地で、培養温度42℃、二酸化炭素濃度2%、照度60μmol/m2sの連続光で7日間静置培養したときの下記式(1)で算出される値が2以上であり、水素イオン濃度pH2.0となるように調製したM-Allen培地で、培養温度42℃、二酸化炭素濃度2%、照度60μmol/m2sの連続光で7日間静置培養したときの下記式(1)で算出される値が2未満である、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の1倍体を、水素イオン濃度pH1.0~6.0、ナトリウムイオン濃度0.4M以上となるように調製した培地で培養することを含む、淡水産微細藻類の培養方法。
(培養開始7日後のOD750値-培養開始時のOD750値)/(7×培養開始時OD750値) (1)
[16]淡水産微細藻類として、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の1倍体であって、水素イオン濃度pH2.0、ナトリウムイオン濃度0.5Mとなるように調製したM-Allen培地で、培養温度42℃、二酸化炭素濃度2%、照度60μmol/m2sの連続光で7日間静置培養したときの下記式(1)で算出される値が2以上であり、水素イオン濃度pH2.0となるように調製したM-Allen培地で、培養温度42℃、二酸化炭素濃度2%、照度60μmol/m2sの連続光で7日間静置培養したときの下記式(1)で算出される値が2未満である、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の1倍体を、水素イオン濃度pH1.0~6.0、ナトリウムイオン濃度0.4M以上となるように調製した培地で培養することを含む、淡水産微細藻類の生産方法。
(培養開始7日後のOD750値-培養開始時のOD750値)/(7×培養開始時OD750値) (1)
一実施形態において、本発明は、淡水産微細藻類の培養方法を提供する。本実施形態の培養方法は、淡水産細藻類を、水素イオン濃度pH1.0~6.0、ナトリウムイオン濃度0.1~0.4Mとなるように調製した培地で、培養温度が15~60℃で培養する培養工程を含む。前記培養方法は、淡水産微細藻類を、水素イオン濃度pH1.0~6.0、ナトリウムイオン濃度0.1~0.4Mとなるように調製した培地で培養する前培養工程と、前記前培養工程後の淡水産微細藻類を、ナトリウムイオン濃度が前記前培養工程における前記ナトリウムイオン濃度の1.2~5倍であり水素イオン濃度pH1.0~6.0となるように調製した培地で培養する本培養工程と、を含むことが好ましい。
本培養工程における培地のナトリウムイオン濃度及びpHとは、本培養工程の培養開始時のナトリウムイオン濃度及びpHをそれぞれ意味する。本培養工程の培養開始時の培地が「ナトリウムイオン濃度が前培養工程におけるナトリウムイオン濃度の1.2~5倍」であり「pH1.0~6.0」である限り、本培養期間中に、ナトリウムイオン濃度又はpHが変動して前記範囲を外れた場合であっても、本実施形態の培養方法の本培養工程に包含される。
本実施形態の培養方法は、pH1.0~6.0の酸性条件下で増殖可能な淡水産微細藻類に適用可能である。「淡水産微細藻類」とは、淡水域に生息する微細藻類を意味する。淡水のナトリウムイオン濃度は、通常、0.05質量%未満である。淡水域は、特に限定されず、河川、湖沼、温泉、地下水等が挙げられるが、pH1.0~6.0の酸性条件の淡水域であることが好ましい。そのような酸性条件の淡水域としては、酸性温泉(硫酸酸性温泉など)が好ましく例示される。本明細書において、「微細藻類」とは、単細胞の藻類を意味する。
以下、YFU3株について、2倍体の細胞形態と1倍体の細胞形態とを区別して記載する場合には、2倍体の細胞形態を「YFU3株(2倍体)」、1倍体の細胞形態を「YFU3株(1倍体)」と記載する。同様に、HKN1株について、2倍体の細胞形態と1倍体の細胞形態とを区別して記載する場合には、2倍体の細胞形態を「HKN1株(2倍体)」、1倍体の細胞形態を「HKN1株(1倍体)」と記載する。単に、「YFU3株」又は「HKN1株」と記載する場合には、2倍体の細胞形態及び1倍体の細胞形態の両方を包含するものとする。
あるいは、DAPI等の核染色試薬で細胞を染色し、1倍体であることが既知である細胞と比較して、同等の蛍光輝度を示す細胞を1倍体と判定し、約2倍の蛍光輝度を示す細胞を2倍体と判定してもよい。あるいは、DAPI等の核染色試薬で細胞を染色し、2倍体であることが既知である細胞と比較して、同等の蛍光輝度を示す細胞を2倍体と判定し、約1/2倍の蛍光輝度を示す細胞を1倍体と判定してもよい。
HKN1株は、日本国神奈川県足柄下郡箱根町の温泉の高温酸性水より単離された単細胞紅藻である。HKN1株(1倍体)は、2017年5月30日付で、受託番号FERM P-22333として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号FERM BP-22333として、2018年4月20日付で国際寄託に移管されている。
(B)藻類細胞を蒸留水に懸濁し、1分以上放置する。
(C)藻類細胞の乾燥処理を行い、pH7の等張液に懸濁する。
上記(A)~(C)において、藻類細胞が培養細胞である場合、各処理を行う前に、遠心分離等により培地を除去し、等張液等で藻類細胞を洗浄してもよい。
上記(A)及び(C)において、等張液としては、10%スクロース及び20mMのHEPESを含むpH7の緩衝液が挙げられる。
上記(C)において、乾燥処理としては、冷蔵庫内(4℃)での乾燥、凍結乾燥等が挙げられる。乾燥処理には、遠心分離により回収した藻類細胞の沈殿を用いる。冷蔵庫内で乾燥する場合、乾燥処理時間は、藻類細胞の量によるが、3日以上が例示される。
pH7の条件下で、その細胞が破裂する微細藻類であれば、培養槽の外に流出した場合に、外部環境で生育することが困難であり、環境へのコンタミネーションを抑制することができる。
藻類細胞が強固な細胞壁を有さない場合、光学顕微鏡による観察(例えば、倍率600倍)では、通常、細胞壁が観察されない。なお、pH6以下の条件での温和な低張処理により細胞破裂が生じるか否かは、強固な細胞壁を有さない微細藻類であるか否かの判定には影響しない。
前培養工程は、淡水産微細藻類を、水素イオン濃度pH1.0~6.0、ナトリウムイオン濃度0.1~0.4Mとなるように調製した培地で培養する工程である。
淡水産微細藻類用培地は、特に限定されず、培養する淡水産微細藻類の種類に応じて適宜適切なものを選択すればよい。淡水産微細藻類用培地としては、例えば、窒素源、リン源、鉄源、微量元素(亜鉛、ホウ素、コバルト、銅、マンガン、モリブデンなど)等を含む無機塩培地が例示される。例えば、窒素源としては、アンモニウム塩、硝酸塩、亜硝酸塩、尿素、アミン類等が挙げられ、リン源としては、リン酸塩、亜リン酸塩等が挙げられ、鉄源としては、塩化鉄、硫酸鉄、クエン酸鉄等が挙げられる。淡水産微細藻類用培地の具体例としては、例えば、2×Allen培地(Allen MB. Arch. Microbiol. 1959 32:270-277.)、M-Allen培地(Minoda A et al. Plant Cell Physiol. 2004 45: 667-71.)、MA2培地(Ohnuma M et al. Plant Cell Physiol. 2008 Jan;49(1):117-20.)等が挙げられる。なお、本明細書においては、M-Allen培地を「MA培地」と記載することがある。
例えば、本培養工程におけるナトリウムイオン濃度を海水と同程度(約0.5M)とする場合、前培養工程におけるナトリウムイオン濃度は0.25M以上であることが好ましく、0.25~0.35Mであることがより好ましく、0.25~0.3Mであることがさらに好ましい。
培地のナトリウムイオン濃度の調整は、市販のナトリウムイオン試薬を用いてもよく、食塩を用いて行ってもよい。また、天然海水、濃縮海水、人工海水等をナトリウムイオン濃度が0.1~0.4Mとなるように希釈し、適宜、窒素源、リン源、鉄源、及び微量元素等を添加して用いてもよい。天然海水としては、表層水又は海洋深層水をろ過したものを使用できるほか、市販品も使用可能である。天然海水の市販品としては、例えば、ナジーム10(伊豆10mの表層海水)、及びナジーム800(伊豆赤沢800m海洋深層水)(いずれも日本QCE bluelab事業部)等が挙げられる。人工海水の市販品としては、例えば、ダイゴIMK培地、ダイゴ人工海水SP(いずれも日本製薬株式会社)等が挙げられる。
ナトリウムイオン 1.0556質量%
マグネシウムイオン 0.1272質量%
カルシウムイオン 0.0400質量%
カリウムイオン 0.0380質量%
ストロンチウムイオン 0.0008質量%
塩化物イオン 1.8980質量%
硫酸イオン0.2649質量%
臭化物イオン 0.0065質量%
炭酸水素イオン 0.0140質量%
フッ化物イオン 0.0001質量%
ホウ酸 0.0026質量%
培地のpH調整は、例えば、硫酸、塩酸等の無機酸、水酸化カリウム等の無機塩基等を用いて行うことができる。また、培養中のpH変動を抑制するために、任意に、pH緩衝剤を培地に添加してもよい。
前培養工程における光条件は、淡水産微細藻類の種類に応じて適宜選択すればよい。一般的には、5~2000μmol/m2sを例示することができる。淡水産微細藻類が、イデユコゴメ綱に属する微細藻類である場合、5~1500μmol/m2sが好ましい。光条件は、連続光であってもよく、明暗周期(10L:14Dなど)を設けてもよい。前培養工程は、自然光下で行ってもよい。
前培養工程におけるCO2条件は、淡水産微細藻類の種類に応じて適宜選択すればよい。一般的には、0.04~5%CO2条件を例示することができる。淡水産微細藻類が、イデユコゴメ綱に属する微細藻類である場合、0.04~3%CO2条件が好ましい。イデユコゴメ綱に属する微細藻類の中でも、ガルデリア属は高CO2濃度耐性が高く、100%CO2でも生育可能であるため、淡水産微細藻類がガルデリア属に属する微細藻類である場合には、100%CO2条件としてもよい。また、CO2条件は、大気中CO2濃度であってもよい。
前培養のスケールは本培養のスケールに応じて選択することが出来る。本培養で微細藻類の育種や変異株の選択等小スケールで培養する場合は、前培養を小スケールで行うことができ、通常は、0.1~1000mLで行われる。また、本培養で工業的に大量生産が行われる場合には、前培養を1~10L程度で行われる場合もある。
本培養工程は、前記前培養工程後の淡水産微細藻類を、ナトリウムイオン濃度が前培養工程におけるナトリウムイオン濃度の1.2~5倍であり水素イオン濃度pH1.0~6.0となるように調製した培地で培養する工程である。
窒素含有塩としては、アンモニウム塩、硝酸塩、及び亜硝酸塩等の窒素含有無機塩類等が挙げられる。中でも、窒素含有塩としては、アンモニウム塩(硫酸アンモニウムなど)が好ましい。アンモニウム塩の海水への添加量としては、アンモニウムイオン濃度として、20~100mMが例示される。
リン含有塩としては、リン酸塩、及び亜リン酸塩等のリン含有無機塩類等が挙げられる。中でも、リン含有有塩としては、リン酸塩(リン酸二水素カリウムなど)が好ましい。リン酸塩の海水への添加量としては、リン酸イオン濃度として、2~10mMが例示される。
鉄含有塩としては、塩化鉄(III)、硫酸鉄(II)、クエン酸鉄(II)及びこれらの水和物等が挙げられる。中でも、鉄含有塩としては、塩化鉄(III)が好ましい。鉄含有塩の海水への添加量としては、鉄イオン濃度として、0.1~2mMが例示される。
その他、海水には、ホウ酸、マンガン、亜鉛、モリブデン、コバルト、銅等の微量元素を添加することが好ましい。
淡水産微細藻類がイデユコゴメ綱に属する微細藻類である場合、本培養工程で用いる培地の具体例としては、後述の表9に記載の「海水培地」が好ましく例示される。
また、本培養工程を屋外で行う場合には、他の生物のコンタミネーションを抑制するために、0.5M以上のナトリウムイオン濃度を用いることもできる。例えば、ナトリウムイオン濃度を0.5~1Mとしてもよい。
培地のナトリウムイオン濃度の調整は、前記前培養工程における培地と同様に行うことができる。
また、本培養工程を屋外で行う場合には、他の生物のコンタミネーションを抑制するために、より低いpH(pH1.0~2.0など)を用いることもできる。
培地のpH調整は、前記前培養工程における培地と同様に行うことができる。
また、本培養工程は、屋外で培養を行ってもよい。この場合、温度条件、光条件及びCO2条件は、培養槽が設置された外部環境の条件とすることができる。本培養工程を屋外培養とした場合でも、pH1.0~6.0の酸性条件下での培養であるため、他の生物の混入を抑制することができる。また、淡水産微細藻類として、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の1倍体を用いた場合、pH7の環境下での生存が困難であるため、屋外の培養槽から外部環境に放出された場合でも当該環境の汚染が抑制される。
一実施形態において、本発明は、水素イオン濃度pH1.0~6.0、ナトリウムイオン濃度0.5M以上となるように調製した培地で増殖可能な淡水産微細藻類の生産方法を提供する。本実施形態の淡水産微細藻類の生産方法は、ナトリウムイオン濃度が0.5M以上である培地で増殖できない淡水産微細藻類を、水素イオン濃度pH1.0~6.0、ナトリウムイオン濃度0.1~0.4Mとなるように調製した培地で培養する工程を含む。
淡水産微細藻類が、ナトリウムイオン濃度が0.5M以上である培地で増殖できないか否かは、対象の淡水産微細藻類をナトリウムイオン濃度が0.5M以上である培地で培養し、経時的に細胞濁度(OD750)を測定することにより確認することができる。培養開始時から、OD750が上昇しない場合には、当該淡水産微細藻類は、ナトリウムイオン濃度が0.5M以上である培地で増殖できない淡水産微細藻類であると判定することができる。
また、淡水産微細藻類は、pH1.0~6.0で増殖可能であることが好ましい。
そのような淡水産微細藻類としては、例えば、シアニジウム属に属する微細藻類の1倍体が挙げられる。シアニジウム属に属する微細藻類の1倍体の具体例としては、HKN1株(1倍体)及びYFU3株(1倍体)が挙げられる。
本発明の1実施形態に係るイデユコゴメ綱に属する微細藻類の1倍体は、ナトリウムイオン濃度が0.5Mのような高塩濃度の培地で生育するが、天然のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の1倍体は生育ができない。しかし、本発明の1実施形態に係る培養方法により、前培養期間中に耐塩性を獲得すると、0.5Mのナトリウムイオン濃度の培地でも生育できるようになる。このとき、前培養期間中よりも短期間の誘導期の後、対数増殖を開始する特徴があり、この特徴はさらに培地を植え継いでも同様である。しかも、耐塩性獲得をした本発明の1倍体藻類は、NaClを添加していないMA培地に植え継ぐと、生育しないかまたは生育が不良となってしまうという特徴がある。
生育が良好かどうかについては、コントロールの培養条件と比較することによってもできるが、本発明の1実施形態においては、自己の培養初期状態の細胞数と所定期間経過する間に増大した細胞数の比の大小により検討する。具体的には式(1)により計算する。細胞数は培養液の750nmにおける吸光度ODを測定することにより求め、所定期間は7日間とし、式(1)の値が2以上の場合は生育が良好であり、2未満の場合は生育が不良であるとする。生育が不良の原因としては、環境条件に馴化するのに時間を要することや、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の1倍体は強固な細胞壁を持たないために高張液の浸透圧に耐えられず細胞が破壊されて死滅していることが考えられる。細胞が破壊されていることの確認については顕微鏡で観察することが考えられるが、定量性を確保することが困難である。そのため、本発明の1実施形態においては、細胞の内容物であるフィコシアニンの量を測定することで定量的な考察を行う。
(培養開始7日後のOD750値-培養開始時のOD750値)/(7×培養開始時OD750値)で示される培養速度 (1)
(培養開始7日後のOD750値-培養開始時のOD750値)/(7×培養開始時OD750値) (1)
培養は、培養温度42℃、二酸化炭素濃度2%、照度60μmol/m2sの連続光の条件で、7日間の静置培養で行う。培養スケールは、特に限定されないが、例えば、24穴プレートを用いて、1mLの培養液で培養することができる。
MA+0.5M NaCl培地で培養を行った後、2mLの前記培地に懸濁したときにOD750=1となる量の藻類細胞を回収し、下記の処理1~3を行う。
処理1:MA培地2mLに懸濁し、ボルテックスで10分間振盪する。
処理2:MA+0.5M NaCl培地2mLに懸濁し、ボルテックスで10分間振盪する。
処理3:MA+0.5M NaCl培地0.1mLに懸濁後、-196℃で凍結し、前記培地で2mLとなるようにメスアップし、ボルテックスで10分間振盪する。
死滅率(%)={(処理2後のPC濃度-処理1後のPC濃度)/(処理2後のPC濃度-処理3後のPC濃度)}×100
前記式中、「PC濃度」は、フィコシアニン濃度を表す。PC濃度は、処理1~3のいずれかを行った後の懸濁液について、積分球を取り付けた分光光度計を用いて、620nm及び678nmの吸光度を測定することにより求めることができる。PC濃度は、620nm及び678nmの吸光度から、下記式により算出することができる。
PC濃度(μg/ml)=138.5×A620-35.49×A678
(a)天然の前記微細藻類の1倍体と比較して、ナトリウムイオン濃度が0.5MであるpH1.0~6.0の培地での培養開始後7日間の増殖速度が大きい。
(b)天然の前記微細藻類の1倍体と比較して、ナトリウムイオン濃度が0.05M以下であるpH1.0~6.0の培地での培養開始後7日間の増殖速度が小さい。
(c)ナトリウムイオン濃度が0.05M以下であるpH1.0~6.0の培地での培養開始後7日間の増殖速度と比較して、ナトリウムイオン濃度が0.5MであるpH1.0~6.0の培地での培養開始後7日間の増殖速度が大きい。
「天然のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の1倍体」とは、自然界で生息するイデユコゴメ綱に属する微細藻類の1倍体又は自然界で生息するイデユコゴメ綱に属する微細藻類の2倍体から得られた1倍体をいう。ナトリウムイオン濃度が0.05M以下であり、pH1.0~6.0となるように調製された培地で天然のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の2倍体を一定期間(例えば、1~3週間程度)、一定条件で培養し、減数***した微細藻類を顕微鏡下において物理的に選択し、天然のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の1倍体を得ることができる。
表1に示す組成のM-Allen培地(MA培地)を調製した。具体的には、A2 Fe stock以外の培地成分を混合し、硫酸でpH2.0に調整した後、オートクレーブにより滅菌した。オートクレーブ滅菌後、フィルター滅菌した4mLのA2 Fe stockを添加し、MA培地とした。
表2及び表3に、A2 trace element及びA2 Fe stockの組成をそれぞれ示す。
前培養に用いる場合
MA培地:培地(A)
MA+0.3M NaCl培地:培地(B)
MA+0.5M NaCl培地:培地(C)
本培養に用いる場合
MA培地:培地(a)
MA+0.3M NaCl培地:培地(b)
MA+0.5M NaCl培地:培地(c)
微細藻類の生育状況は、細胞濁度(OD750)により確認した。具体的には、吸光度計(BIO-RAD 社のSmartSpec Plus)を用いて、藻類培養液の750nmにおける吸光度を測定し、細胞濁度(OD750)を求めた。
シアニジウム・エスピー HKN1の培養は、前培養も本培養もともに、特に断りのない限り、CO2インキュベーター内での、静置培養により行った。培養温度は42℃とし、照度60μmol/m2sの連続光を用い、CO2濃度は2%とした。特に断りのない限り、培養は、24穴プレートで、1mLの培養液で行った。
シアニディオシゾン・メロラエ 10Dの培養は、前培養も本培養もともに、特に断りのない限り、通気培養(300mL ambient air/min)により行った。培養温度は42℃とし、照度60μmol/m2sの連続光を用いた。特に断りのない限り、培養は、24穴プレートで、1mLの培養液で行った。
シアニジウム・エスピー HKN1及びシアニディオシゾン・メロラエ 10Dのいずれも、前培養開始時及び本培養開始時の細胞濁度は、OD750=0.1となるようにした。特に断りのない限り、培養は、24穴プレートで、1mLの培養液で行った。
ポリリン酸の存在については次のようにDAPI染色により観察した。
培養液に最終濃度1%(w/v)になる様にglutaraldehydeを加えた後に、最終濃度が3μg/mLになる様にDAPIを加え、蛍光顕微鏡で観察した。
液胞の存在については次のようにキナクリン染色により観察した。
培養液に最終濃度が100mMになる様に1M Tris-HCl(pH 8.0)緩衝液を加えた後に、最終濃度が40μg/mLになる様にキナクリンを加え、15分間、室温で静置した。遠心後(1500g、5分)、上澄みを捨て、沈殿にMA培地を加え、37℃で30分静置し、蛍光顕微鏡で観察した。
シアニジウム・エスピー HKN1(1倍体)(以下、「HKN1(1倍体)」と略記する場合がある)を、MA培地(培地(A))を用いて1週間前培養した。前記前培養後、培地(a)、(b)、又は(c)を用いて7日間静置培養した(本培養)。本培養中、経時的に培地のOD750を測定して、HKN1(1倍体)の生育状況を確認した。
また、HKN1(1倍体)をMA+0.3M NaCl(培地(B))を用いて1週間前培養した。前記前培養後、培地(a)、(b)、又は(c)を用いて7日間静置培養した(本培養)。本培養中、経時的に培地のOD750を測定して、HKN1(1倍体)の生育状況を確認した。
結果を表6及び図1に示す。図1は、表1に示すOD750の変化をグラフにしたものである。
一方、前培養が培地(B)であった場合、本培養が培地(c)のときでも、上記培地(a)及び培地(b)の場合と同様の増殖を示した。
天然海水としてナジーム10(表層の海水:日本QCE bluelab事業部)を使用した。MA培地の成分をそれぞれ海水(ナジーム10)に添加して、HKN1(1倍体)を培養し、MA培地中のどの成分がHKN1(1倍体)の生育に寄与するのかを確認した。
本培養に用いた培地を表7~8に示す。ナジーム10に、表7~8に示すMA培地成分を添加して、硫酸でpH2.0に調整し、培地1~17を調製した。なお、マグネシウム及びカルシウムは、海水中に豊富に存在するため、培地1~16では、MgSO4及びCaCl2を添加しなかった。培地17は、ポジティブコントロールとして、MA培地相当のMgSO4及びCaCl2を添加した。
上記培地16の組成を表9に示す。以下の実施例で「海水培地」と表記するものは、表9に示す組成の培地である。表9中のA2 trace element及びA2 Fe stockは、それぞれ表2及び表3に示すものである。
HKN1(1倍体)をMA+0.3M NaCl培地(培地(B))で1週間前培養し、MA+0.5M NaCl培地(ポジティブコントロール)(培地(c))又は海水培地で、7日間、本培養した。本培養中、経時的に培地のOD750を測定して、HKN1(1倍体)の生育状況を確認した。
結果を表10及び図2に示す。図2は、表10に示すOD750の変化をグラフにしたものである。
HKN1(1倍体)の生育に及ぼすpHの影響を確認するために、pHをpH2~7の間で変化させた海水培地をそれぞれ用意した。pHの調製は、硫酸又は水酸化カリウムを用いて行った。
HKN1(1倍体)をMA+0.3M NaCl(培地(B))で1週間前培養し、上述のようにpHを調整した各海水培地で、7日間、本培養した。本培養終了後、最終的な培地のOD750を測定して、HKN1(1倍体)の生育状況を確認した。
結果を表11、及び図3に示す。図3は、表11に示すOD750をグラフにしたものである。
シアニジウム・エスピー HKN1(2倍体)(以下、「HKN1(2倍体)」と略記する場合がある)を、MA培地(培地(A))を用いて1週間前培養した。前記前培養後、培地(a)、(b)、又は(c)を用いて7日間静置培養した(本培養)。本培養中、経時的に培地のOD750を測定して、HKN1(2倍体)の生育状況を確認した。
また、HKN1(2倍体)をMA+0.3M NaCl(培地(B))を用いて1週間前培養した。前記前培養後、培地(a)、(b)、又は(c)を用いて7日間静置培養した(本培養)。本培養中、経時的に培地のOD750を測定して、HKN1(2倍体)の生育状況を確認した。
結果を表12及び図4に示す。図4は、表12に示すOD750の変化をグラフにしたものである。
HKN1(2倍体)をMA+0.3M NaCl培地(培地(B))で1週間前培養し、MA+0.5M NaCl培地(ポジティブコントロール)(培地(c))又は海水培地で、7日間、本培養した。本培養中、経時的に培地のOD750を測定して、HKN1(2倍体)の生育状況を確認した。
結果を表13及び図5に示す。図5は、表13に示すOD750の変化をグラフにしたものである。
シアニディオシゾン・メロラエ 10D(以下、「10D)」と略記する場合がある)を、MA培地(培地(A))を用いて1週間前培養した。前記前培養後、培地(a)、(b)、又は(c)を用いて7日間静置培養した(本培養)。本培養中、経時的に培地のOD750を測定して、10Dの生育状況を確認した。
また、10DをMA+0.3M NaCl(培地(B))を用いて1週間前培養した。前記前培養後、培地(a)、(b)、又は(c)を用いて7日間静置培養した(本培養)。本培養中、経時的に培地のOD750を測定して、10Dの生育状況を確認した。
結果を表14及び図6に示す。図6は、表14に示すOD750の変化をグラフにしたものである。
一方、前培養が培地(B)であった場合、本培養が培地(c)のときでも、培養開始時から、上記培地(a)及び培地(b)の場合と同様の増殖を示した。
10DをMA+0.3M NaCl培地(培地(B))で1週間前培養し、MA+0.5M NaCl培地(ポジティブコントロール)(培地(c))又は海水培地で、7日間、本培養した。本培養中、経時的に培地のOD750を測定して、10Dの生育状況を確認した。
結果を表15及び図7に示す。図7は、表15に示すOD750の変化をグラフにしたものである。
MA培地で1週間培養したHKN1(1倍体)を、OD750=0.1となるようにMA培地に移植して、7日間、CO2インキュベーター内(2%CO2)で静置培養し、HKN1(1倍体)のMA培地培養品とした。 MA培地で1週間培養したHKN1(1倍体)を、MA培地+0.3M NaClで1週間前培養した後、MA培地+0.5M NaCl培地に移植し、7日間、CO2インキュベーター内(2%CO2)で静置培養した。これを、MA培地+0.5M NaCl培地培養品とした。
MA培地で1週間培養したHKN1(1倍体)を、MA培地+0.3M NaClで1週間前培養した後、海水培地に移植し、7日間、CO2インキュベーター内(2%CO2)で静置培養した。これを海水培地培養品とした。
各培地培養品について、DAPIによりポリリン酸の定性分析を、キナクリンにより液胞の定性分析を行った。
結果を図8に示す。
MA培地培養品、MA培地+0.5M NaCl培地培養品、海水培地培養品をDAPIで染色したところ、MA培地培養品にのみポリリン酸が認められた。ポリリン酸が存在すると言われる液胞をキナクリンで染色したところ、液胞の染色のされ方に違いはなかった。
藻類としてHKN1(2倍体)を用いたこと以外は実施例9と同様にして培養して、MA培地培養品、MA培地+0.5M NaCl培地培養品、及び海水培地培養品の3種類の培養品を製造した。それぞれ、実施例9と同様に、DAPIによりポリリン酸の定性分析を、キナクリンにより液胞の定性分析を行った。
結果を図9に示す。MA培地培養品にはポリリン酸が確認できなかったが、MA培地+0.5M NaCl培地培養品および海水培地培養品では、表層付近を中心にポリリン酸が観察された。また、ポリリン酸が存在すると言われる液胞はいずれの培養品も同様に観察された。
10Dを、MA培地(培地(A))又はMA+0.3M NaCl(培地(B))を用いて1週間前培養した。前記前培養後、NaCl濃度を0~1000mMの間で変化させたMA培地で、7日間、本培養した。本培養終了後、最終的な培地のOD750を測定して、10Dの生育状況を確認した。結果を表16に示す。
また、培地(B)での前培養後、MA+0.5M NaCl培地(培地(c))で10Dを7日間本培養して得られた藻類細胞を、MA培地(培地(a))又はMA+0.5M NaCl培地(培地(c))に植え継ぎ、さらに7日間培養した。培養終了後、最終的な培地のOD750を測定して、10Dの生育状況を確認した。結果を表17に示す。
また、培地(c)で本培養して得られた藻類細胞は、培養液を遠心後に藻類細胞を回収し、pH7の蒸留水に投入したところ、細胞が破裂することが確認された。
HKN1(1倍体)を、MA培地(培地(A))又はMA+0.3M NaCl(培地(B))を用いて1週間前培養した。前記前培養後、NaCl濃度を0~1000mMの間で変化させたMA培地で、7日間、本培養した。本培養終了後、最終的な培地のOD750を測定して、HKN1(1倍体)の生育状況を確認した。結果を表18に示す。
HKN1(2倍体)を、MA培地(培地(A))又はMA+0.3M NaCl(培地(B))を用いて1週間前培養した。前記前培養後、NaCl濃度を0~1000mMの間で変化させたMA培地で、7日間、本培養した。本培養終了後、最終的な培地のOD750を測定して、HKN1(2倍体)の生育状況を確認した。結果を表20に示す。
Galdieria partita (NBRC 102759)(1倍体)を、MA培地(培地(A))又はMA+0.3M NaCl(培地(B))を用いて1週間前培養した。前記前培養後、NaCl濃度を0~1000mMの間で変化させたMA培地で、7日間、本培養した。本培養終了後、最終的な培地のOD750を測定して、G. partita(1倍体)の生育状況を確認した。結果を表22に示す。
G. partita(2倍体)を、MA培地(培地(A))又はMA+0.3M NaCl(培地(B))を用いて1週間前培養した。前記前培養後、NaCl濃度を0~1000mMの間で変化させたMA培地で、7日間、本培養した。本培養終了後、最終的な培地のOD750を測定して、G. partita(2倍体)の生育状況を確認した。結果を表24に示す。
Galdieria sulphuraria(SAG108.79)(1倍体)を、MA培地(培地(A))又はMA+0.3M NaCl(培地(B))を用いて1週間前培養した。前記前培養後、NaCl濃度を0~1000mMの間で変化させたMA培地で、7日間、本培養した。本培養終了後、最終的な培地のOD750を測定して、G. sulphuraria(1倍体)の生育状況を確認した。結果を表26に示す。
G. sulphuraria(2倍体)を、MA培地(培地(A))又はMA+0.3M NaCl(培地(B))を用いて1週間前培養した。前記前培養後、NaCl濃度を0~1000mMの間で変化させたMA培地で、7日間、本培養した。本培養終了後、最終的な培地のOD750を測定して、G. sulphuraria(2倍体)の生育状況を確認した。結果を表28に示す。
また、0.3MのNaCl濃度で前培養を行うことにより、1倍体の淡水産微細藻類でも、500~1000mMの高NaCl濃度の範囲で増殖可能であることが確認された。屋外培養を想定した場合、水の蒸発や、雨水の流入により、培養中に塩濃度が変動することが考えられる。上記の結果より、0.3MのNaCl濃度で前培養したイデユコゴメ綱に属する微細藻類の1倍体は、塩濃度の変動に対する寛容性を示し、屋外培養に十分耐えることが示された。
HKN1(1倍体)を、MA+0.3M NaCl培地(培地(B))で7日間前培養した後、さらに海水培地で1週間前培養した。次いで、前記のHKN1(1倍体)を、10Lの海水培地に植え継いで本培養を行った。本培養は、ビニールハウス中で行い、光、温度及びCO2濃度の制御は行わなかった。本培養は、通気培養で行い、培養期間は、2019年5月13日~2019年7月1日とした。定期的に培養液をサンプリングし、750nmの吸光度を測定した。その結果を図10に示す。
図10に示すように、10Lのスケールでも、海水培地で良好に増殖できることが確認された。
HKN1(1倍体)を、MA培地、MA+0.3M NaCl培地、又はMA+0.5 NaCl培地で7日間培養した。2mLの培地に懸濁したときに、OD750=1となる量の藻類細胞を含む培養液を3本のマイクロチューブに回収した。培養液の遠心分離(1500×g、5分)を行い、上清を除去し、ペレットを回収した。ペレットとして回収した各藻類細胞を、下記処理1~3のいずれかで処理した。
処理1:MA培地2mLに懸濁し、ボルテックスで10分間振盪した。
処理2:前記培養に用いた培地と同じ培地2mLに懸濁し、ボルテックスで10分間振盪した。
処理3:前記培養に用いた培地と同じ培地0.1mLに懸濁後、-196℃で凍結し、前記培養に用いた培地と同じ培地で2mLとなるようにメスアップし、ボルテックスで10分間振盪した。
PC濃度(μg/ml)=138.5×A620-35.49×A678
HKN1(1倍体)に替えて10Dを用いたこと以外は、実施例19と同様の方法で、前記処理1による藻類細胞の死滅率を算出した。その結果を表31に示す。
HKN1(1倍体)に替えてG. partita(1倍体)を用いたこと以外は、実施例19と同様の方法で、前記処理1による藻類細胞の死滅率を算出した。その結果を表32に示す。
HKN1(1倍体)に替えてG. sulphuraria(1倍体)を用いたこと以外は、実施例19と同様の方法で、前記処理1による藻類細胞の死滅率を算出した。その結果を表33に示す。
本発明によれば、安価に入手できる海水により淡水酸微細藻類を大量に培養することができるので、藻類を利用した有用物質の生産に有用である。さらに、淡水酸微細藻類が大量に培養されれば、それによって大気中の二酸化炭素を吸収することも期待される。
Claims (9)
- 淡水産微細藻類の培養方法であって、
淡水産微細藻類を、水素イオン濃度pH1.0~6.0、ナトリウムイオン濃度0.1~0.4Mとなるように調製した培地で、培養温度が15~60℃で培養する前培養工程と、
前記前培養工程後の淡水産微細藻類を、ナトリウムイオン濃度が前記前培養工程における前記ナトリウムイオン濃度の1.2~5倍であって0.4M以上であり水素イオン濃度pH1.0~6.0となるように調製した培地で培養する本培養工程と、
を含み、
前記淡水産微細藻類が、イデユコゴメ綱に属する微細藻類である、
淡水産微細藻類の培養方法。 - 前記本培養工程における前記培地が、海水に、窒素含有塩、リン含有塩及び鉄含有塩を少なくとも添加し、且つ水素イオン濃度pH1.0~6.0となるように調製した培地である、請求項1に記載の淡水産微細藻類の培養方法。
- ナトリウムイオン濃度が0.5M以上である培地で増殖できないイデユコゴメ綱に属する微細藻類を、水素イオン濃度pH1.0~6.0、ナトリウムイオン濃度0.1~0.4Mとなるように調製した培地で培養する工程と、
前記培養後のイデユコゴメ綱に属する微細藻類を、ナトリウムイオン濃度が0.5~1Mであり水素イオン濃度pH1.0~6.0となるように調製した培地で培養する工程と、
を含む、水素イオン濃度pH1.0~6.0、ナトリウムイオン濃度0.5~1Mとなるように調製した培地で増殖可能なイデユコゴメ綱に属する微細藻類の生産方法。 - 前記イデユコゴメ綱に属する微細藻類が、シアニジウム属に属する微細藻類の1倍体である、請求項3に記載のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の生産方法。
- イデユコゴメ綱に属する微細藻類の1倍体であって、
水素イオン濃度pH2.0、ナトリウムイオン濃度0.5Mとなるように調製したMA培地で、培養温度42℃、二酸化炭素濃度2%、照度60μmol/m2sの連続光で7日間静置培養したときの下記式(1)で算出される値が2以上であり、
水素イオン濃度pH2.0となるように調製したMA培地で、培養温度42℃、二酸化炭素濃度2%、照度60μmol/m2sの連続光で7日間静置培養したときの下記式(1)で算出される値が2未満である、
イデユコゴメ綱に属する微細藻類の1倍体。
(培養開始7日後のOD750値-培養開始時のOD750値)/(7×培養開始時OD750値) (1) - 水素イオン濃度pH7の等張液、または蒸留水中で細胞が破裂する、請求項5に記載のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の1倍体。
- 藻類細胞の乾燥処理を行い、前記乾燥処理後の細胞をpH7の等張液に懸濁すると、前記細胞が破裂する、
請求項5又は6に記載のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の1倍体。 - 請求項5~7のいずれか一項に記載のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の1倍体を、海水に、窒素含有塩、リン含有塩及び鉄含有塩を少なくとも添加し、且つ水素イオン濃度pH1.0~6.0となるように調製した培地で培養することを含む、
イデユコゴメ綱に属する微細藻類の1倍体の培養方法。 - 請求項5~7のいずれか一項に記載のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の1倍体を屋外で培養することを含む、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の培養方法。
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