JP7449640B2 - Method of monitoring therapeutic response and disease progression in a subject using circulating cells - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、血液及びその他の体液中の循環細胞バイオマーカーを用いて、固形腫瘍のようながんを有する被検者における治療反応及び疾患の進行をモニターする方法に全般的に関わるものである。
関連技術
FIELD OF THE INVENTION The present invention relates generally to methods of monitoring treatment response and disease progression in subjects with cancer, such as solid tumors, using circulating cell biomarkers in blood and other body fluids. It is something.
Related technology
腫瘍細胞が原発固形腫瘍から離脱すると、それらは血液又はリンパ循環に浸透し、最終的に血流を離れて臓器又は組織に入り、転移を形成する。がんに関連する死亡の90％は、転移過程により引き起こされる。最も一般的な転移部位は、肺、肝臓、骨、及び脳である。循環に見い出される腫瘍細胞は循環腫瘍細胞（CTCs）と称される。多くの研究発表と臨床試験は、CTCsが（i）血流中のCTCsの数え上げを通じて予後の生存とがんの再発の情報を提供すること、及び（ii）CTCsにおけるタンパク質発現レベルと遺伝子変異及び転位の発生の検査を通じて治療情報を提供すること、における臨床的有用性を有することを示している。しかし、CTCsは、ステージIVのがん患者でさえ、被検者のがんの進展及び/又は存在と一貫しては関連付けられない。CTCsは、乳がん、前立腺がん、及び大腸直腸がんのステージIVで最も頻繁に見られ、それらは、同じがんの初期ステージではまれである。CTCsは他のがんでもまれである。 When tumor cells break away from the primary solid tumor, they penetrate the blood or lymph circulation and eventually leave the bloodstream and enter organs or tissues to form metastases. 90% of cancer-related deaths are caused by metastatic processes. The most common sites of metastasis are the lungs, liver, bones, and brain. Tumor cells found in the circulation are called circulating tumor cells (CTCs). Many research publications and clinical trials have demonstrated that CTCs (i) provide prognostic survival and cancer recurrence information through enumeration of CTCs in the bloodstream, and (ii) protein expression levels and genetic mutations in CTCs. It has been shown to have clinical utility in providing therapeutic information through examination of the occurrence of dislocations. However, CTCs are not consistently associated with the progression and/or presence of cancer in a subject, even in stage IV cancer patients. CTCs are most frequently seen in stage IV breast, prostate, and colorectal cancers, and they are rare in early stages of the same cancers. CTCs are also rare in other cancers.
循環がん関連マクロファージ様細胞（CAMLs）は、がんを有する被検者の血液中に見られる別のがん関連細胞型である。それらは循環巨大間質細胞である。CAMLsは、試験された全ての固形腫瘍及びがんの全てのステージに関連している。CAMLsは倍数体であり、サイズが非常に大きく、サイズが～25から～300μmである。これらの倍数体細胞は、CD45（-）又はCD45（+）の何れかであり得、ほとんどの場合、CD11c、CD14、及びCD31を発現し、このことは、それらの骨髄系列としての起源を確認するものである。それらは、しばしばCTCsと細胞破片を貪食する過程で見出される[1,6]。 Circulating cancer-associated macrophage-like cells (CAMLs) are another cancer-associated cell type found in the blood of subjects with cancer. They are circulating giant stromal cells. CAMLs are associated with all solid tumors and all stages of cancer studied. CAMLs are polyploid and very large in size, ~25 to ~300 μm in size. These polyploid cells can be either CD45(-) or CD45(+) and most often express CD11c, CD14, and CD31, confirming their myeloid origin. It is something to do. They are often found in the process of phagocytosing CTCs and cell debris [1,6].
血液及びその他の体液中のCAMLsなどのバイオマーカーの同定及び特性付けに関連するアッセイは、がんを有する被検者で疾患が進行するか否か、がんを有する被検者が治療に反応しているか否か、及びがんを有する被検者が将来の治療に反応し易いか否か、及びそのような被検者における全生存期間（OS）及び無増悪生存期間（PFS）に関する情報を含む、多様な情報を提供するのに用いられることができる。本発明は、疾患の進行、及び治療反応、及びその他の重要な目標を予測するこのようなツールを臨床家に提供することに向けられている。 Assays related to the identification and characterization of biomarkers such as CAMLs in blood and other body fluids can help determine whether disease progresses in subjects with cancer and whether subjects with cancer respond to treatment. and whether subjects with cancer are likely to respond to future treatments, and information regarding overall survival (OS) and progression-free survival (PFS) in such subjects. can be used to provide a variety of information, including: The present invention is directed to providing clinicians with such tools to predict disease progression and treatment response, and other important goals.
血液検査によって疾患の進行と治療反応を迅速に予測できることの重要性は、最初の治療が効果的でなければ治療を変更する機会を提供することに関連している。変更を迅速に行うことができることは、別の治療の前にがんの進行を最小化するのに役立つ。免疫療法では、年間15万ドルから35万ドルを超える費用がかかり得るため、迅速な切り替えはコストも低減する。 The importance of blood tests being able to rapidly predict disease progression and treatment response is relevant because it provides an opportunity to change treatment if initial therapy is ineffective. Being able to make changes quickly can help minimize cancer progression before another treatment. Immunotherapy can cost between $150,000 and more than $350,000 per year, so rapid switching also reduces costs.
要約
本発明は、細胞腫、肉腫、神経芽細胞腫、及び黒色腫を含む固形腫瘍を有する被検者の血液中に見出される独特の特性を有する細胞タイプを用いる方法に向けられている。「循環がん関連マクロファージ様細胞」（CAMLs）と称されるこれらの循環細胞は、がんを有する被検者における固形腫瘍の存在と関連していることが示されてきた。CAMLsに関連する5つの形態が特徴付けられ、説明されてきた[1,2]。CAMLは、がん患者の末梢血において様々な方法で見出されてきた。精密マイクロフィルターを使用した精密濾過のようなサイズ排除法は、ステージIからステージIVの固形腫瘍を有する被検者の末梢血からのCAMLsの着実な分離を提供する。
SUMMARY The present invention is directed to methods using cell types with unique properties found in the blood of subjects with solid tumors, including cytomas, sarcomas, neuroblastomas, and melanomas. These circulating cells, termed "circulating cancer-associated macrophage-like cells" (CAMLs), have been shown to be associated with the presence of solid tumors in subjects with cancer. Five forms associated with CAMLs have been characterized and described [1,2]. CAML has been found in the peripheral blood of cancer patients in a variety of ways. Size exclusion methods, such as microfiltration using precision microfilters, provide a robust separation of CAMLs from the peripheral blood of subjects with stage I to stage IV solid tumors.
CAMLsに関連する医療応用は、それに限定されないが、がんの早期発見とがん診断、特にがんの逆戻り又は再発の早期発見と診断、及びがんの変異の決定を提供するバイオマーカーとしてのこの細胞の使用を含む。CAMLsは、患者の生存に関する予後を知ることにおけるバイオマーカーとして臨床的有用性を有することが示されている。CAMLsは、また、ここに示されたデータを通じて、治療反応及び疾患進行の予測を行う際のバイオマーカーとしての臨床的有用性を有することが示されている。 Medical applications related to CAMLs include, but are not limited to, early detection and diagnosis of cancer, particularly as biomarkers to provide early detection and diagnosis of cancer reversal or recurrence, and determination of cancer mutations. Including the use of this cell. CAMLs have been shown to have clinical utility as biomarkers in prognosing patient survival. CAMLs have also been shown to have clinical utility as biomarkers in predicting treatment response and disease progression through the data presented here.
従って、本発明は、固形腫瘍がんなどのがんを有する被検者における疾患の進行及び／又は治療反応を予測する方法に向けられている。 Accordingly, the present invention is directed to a method of predicting disease progression and/or treatment response in a subject with cancer, such as solid tumor cancer.
第１の実施態様では、本発明の方法は、経時的にがんを有する被検者から得られた２つ以上の生体試料におけるCAMLsなどの循環細胞のサイズを決定することを含み、時間の経過とともに試料間の循環細胞のサイズの減少が見られるときは、がんが進行していないと予測され、及び/又は被検者が治療に反応していることが見出される。関連する実施態様において、本発明の方法は、経時的にがんを有する被検者から得られた２つ以上の生体試料における、CAMLsなどの循環細胞の数を決定することを含み、時間の経過とともに試料間の循環細胞の数の減少が見られるときは、がんが進行していないと予測される、及び/又は被検者が治療に反応していることが見出される。 In a first embodiment, the method of the invention comprises determining the size of circulating cells, such as CAMLs, in two or more biological samples obtained from a subject with cancer over time. If there is a decrease in the size of circulating cells between samples over time, it is predicted that the cancer is not progressing and/or the subject is found to be responding to treatment. In a related embodiment, the method of the invention comprises determining the number of circulating cells, such as CAMLs, in two or more biological samples obtained from a subject with cancer over time, If there is a decrease in the number of circulating cells between samples over time, it is predicted that the cancer is not progressing and/or the subject is found to be responding to treatment.
関連する局面において、この方法は、がんを有する被検者から得られた、第１及び第２の生体試料、ならびに任意の追加の生体試料におけるCAMLsなどの循環細胞のサイズを決定することを含み、第１の試料は被検者から得られるがん治療前又はがん治療中に被検者から得られ、第２及び任意の追加の試料は、少なくとも１つのがん治療後に被検者から得られ、第１の試料中の少なくとも１つの細胞のサイズが約50μm以上であり、第２及び任意の追加の試料中の各細胞のサイズが約50μm未満である場合、がんが進行しないと予測される、及び/又は被検者が治療に反応していることが見出される。 In a related aspect, the method includes determining the size of circulating cells, such as CAMLs, in the first and second biological samples, and any additional biological samples obtained from a subject with cancer. the first sample is obtained from the subject before or during cancer treatment, and the second and optional additional sample is obtained from the subject after at least one cancer treatment. and the cancer does not progress if at least one cell in the first sample has a size of about 50 μm or more and each cell in the second and any additional sample has a size of less than about 50 μm. and/or the subject is found to be responding to treatment.
別の関連する局面では、この方法は、がんを有する被検者から得られた、第１及び第２の生体試料、ならびに任意の追加の生体試料におけるCAMLsなどの循環細胞の平均サイズを決定することを含み、第１の試料はがん治療の前又は治療中に被検者から得られ、第２及び任意の追加の試料は、少なくとも１つのがん治療後に被検者から得られ、第２及び任意の追加の試料における循環細胞の平均サイズが、第１の試料の細胞の平均サイズと比較して減少している場合、被検者は治療に反応していると特定される。ある局面では、第１の試料中の循環細胞の平均サイズは、約50μm以上である。 In another related aspect, the method determines the average size of circulating cells, such as CAMLs, in the first and second biological samples and any additional biological samples obtained from a subject with cancer. the first sample is obtained from the subject before or during cancer treatment, the second and any additional sample is obtained from the subject after at least one cancer treatment, A subject is identified as responding to treatment if the average size of circulating cells in the second and any additional samples is decreased compared to the average size of cells in the first sample. In certain aspects, the average size of circulating cells in the first sample is about 50 μm or greater.
第２の実施態様では、本発明は、がんを有する被検者から得られた生体試料中のCAMLsなどの循環細胞のサイズを決定すること、及びそれに基づいて予測を行うことを含む、がんを有する被検者におけるがんの進行を予測する方法に向けられており、ここで、試料中の各循環細胞のサイズが約50μm未満の場合、がんは進行しないと予測され、試料中の少なくとも１つの循環細胞のサイズが約50μm以上の場合、がんは進行すると予測される。 In a second embodiment, the invention comprises determining the size of circulating cells, such as CAMLs, in a biological sample obtained from a subject with cancer and making a prediction based thereon. The present invention is directed to a method for predicting cancer progression in a subject with cancer, in which the cancer is predicted not to progress if the size of each circulating cell in the sample is less than about 50 μm; The cancer is predicted to progress if at least one circulating cell in the tumor is greater than or equal to about 50 μm in size.
この実施態様の一局面では、本発明は、がんを有する被検者から得られた第１及び第２の生体試料、ならびに任意の追加の生体試料におけるCAMLsなどの循環細胞のサイズを決定することを含む、がんを有する被検者におけるがん進行に向けられており、ここで、第１の試料はがん治療の前又は治療中に被検者から得られ、第２の試料及び任意の追加の試料は少なくとも１つのがん治療後に被検者から得られる、
第２及び任意の追加の試料のCAMLsの平均サイズが第１の試料のCAMLsの平均サイズと比較して減少している場合、被検者でがんは進行しないと予測され、被検者は治療に反応していると任意に特定され；又は、
第２及び任意の追加の試料のCAMLsの平均サイズが第１の試料のCAMLsの平均サイズと比較して維持され又は増加している場合、被検者でがんは進行すると予測され、被検者は治療に反応していないと任意に特定され；又は
第１の試料の少なくとも１つのCAMLのサイズが約50μm以上で、第２及び任意の追加の試料の各細胞のサイズが約50μm未満の場合、がんは進行しないと予測され、被検者は治療に反応していると任意に特定され；又は、
第１の試料の各CAMLのサイズが約50μm未満であり、第２及び任意の追加の試料の少なくとも１つのCAMLのサイズが約50μmより大きい場合、がんは進行すると予測され、被検者は治療に反応していないと任意に特定される。ある局面では、第１の試料中の循環細胞の平均サイズは、約50μm以上である。
In one aspect of this embodiment, the invention provides for determining the size of circulating cells, such as CAMLs, in first and second biological samples obtained from a subject with cancer, as well as in any additional biological samples. cancer progression in a subject having cancer, including: a first sample obtained from the subject before or during cancer treatment; any additional sample obtained from the subject after at least one cancer treatment;
If the average size of CAMLs in the second and any additional samples is decreased compared to the average size of CAMLs in the first sample, the cancer is predicted not to progress in the subject and the subject is arbitrarily identified as responding to treatment; or
If the average size of CAMLs in the second and any additional samples is maintained or increased compared to the average size of CAMLs in the first sample, the cancer is predicted to progress in the subject and the patient or at least one CAML in the first sample has a size of about 50 μm or more and each cell in the second and any additional samples has a size of less than about 50 μm; the cancer is predicted not to progress and the subject is arbitrarily identified as responding to treatment; or
If the size of each CAML in the first sample is less than about 50 μm and the size of at least one CAML in the second and any additional samples is greater than about 50 μm, the cancer is predicted to progress and the subject arbitrarily identified as not responding to treatment. In certain aspects, the average size of circulating cells in the first sample is about 50 μm or greater.
この実施態様の別の局面では、本発明は、がんを有する被検者から得られた第１及び第２の生体試料、並びに任意の追加の生体試料における、CAMLsなどの循環細胞の数を測定することを含む、がんを有する被検者のがんの進行を予測する方法に向けられており、ここで、第１の試料はがん治療の前又は治療中に被検者から得られ、第２の試料及び任意の追加の試料は少なくとも１つのがん治療後に被検者から得られ、第２と任意の追加の試料における循環細胞の数が、第１の試料における循環細胞の数と比較して減少している場合、がんは進行しないと予測され、被検者は治療に反応していると任意に特定され、また、第２と任意の追加の試料における循環細胞の数が、第１の試料における循環細胞の数と比較して維持され又は増加している場合、がんは進行すると予測され、被検者は治療に反応していないと特定される。 In another aspect of this embodiment, the invention provides methods for determining the number of circulating cells, such as CAMLs, in the first and second biological samples obtained from a subject with cancer, and in any additional biological samples. A first sample obtained from a subject before or during cancer treatment is directed to a method of predicting cancer progression in a subject having cancer, the first sample being obtained from the subject before or during cancer treatment. and the second sample and any additional sample are obtained from the subject after at least one cancer treatment, and the number of circulating cells in the second and any additional sample is the same as that of the circulating cells in the first sample. The cancer is predicted not to progress and the subject is arbitrarily identified as responding to treatment if the number of circulating cells in the second and any additional samples is If the number is maintained or increased compared to the number of circulating cells in the first sample, the cancer is predicted to progress and the subject is identified as not responding to treatment.
第３の実施態様において、本発明は、被検者から得られた生体試料中のCAMLsなどの循環細胞のサイズを決定すること、及びそれに基づき予測することを含む、がんを有する被検者の治療に対する反応を予測する方法に向けられており、ここで試料中の各循環細胞のサイズが約50μm未満の場合、被検者は治療に反応すると予測され、試料中の少なくとも１つの循環細胞のサイズが約50μm以上の場合、被検者は治療に反応しないと予測される。 In a third embodiment, the present invention provides methods for determining the size of circulating cells, such as CAMLs, in a biological sample obtained from the subject, and predicting based thereon. A subject is predicted to respond to a treatment if each circulating cell in the sample is less than about 50 μm in size; is approximately 50 μm or greater in size, the subject is predicted to not respond to treatment.
この実施態様の一局面では、本発明は、がんを有する被検者から得られた第１及び第２の生体試料、ならびに任意の追加の生体試料における、CAMLsなどの循環細胞のサイズを決定することを含む、がんを有する被検者の治療に対する反応を予測する方法に向けられており、ここで、第１の試料はがん治療の前又は治療中に被検者から得られ、第２及び任意の追加の試料は少なくとも１つのがん治療後に被検者から得られ、そして
第２及び任意の追加の試料におけるCAMLsの平均サイズが、第１の試料におけるCAMLsの平均サイズと比較して減少している場合、被検者は治療に反応すると予測され；
ここで、第２及び任意の追加の試料におけるCAMLsの平均サイズが、第１の試料におけるCAMLsの平均サイズと比較して維持され又は増加している場合、被検者は治療に反応しないと予測され；
サイズが約50μmを超える循環細胞の数が、第１から第２及び任意の追加の試料で維持され又は増加している場合、被検者は治療に反応しないと予測され；又は、
サイズが約50μmを超える循環細胞の数が、第１から第２及び任意の追加の試料で減少する場合、被検者は治療に反応すると予測され；又は
第２又は後続の試料における各循環細胞のサイズが第１の試料と比較して減少し、第２又は任意の追加試料における各循環細胞のサイズが約50μm未満の場合、被検者は治療に反応し、及びがんの治癒の可能性があると予測される。
In one aspect of this embodiment, the invention provides methods for determining the size of circulating cells, such as CAMLs, in first and second biological samples obtained from a subject with cancer, as well as in any additional biological samples. A first sample is obtained from the subject before or during cancer treatment, comprising: the second and any additional sample is obtained from the subject after at least one cancer treatment, and the average size of the CAMLs in the second and any additional sample is compared to the average size of the CAMLs in the first sample. The subject is predicted to respond to treatment if the
where the subject is predicted not to respond to treatment if the average size of CAMLs in the second and any additional samples is maintained or increased compared to the average size of CAMLs in the first sample. is;
The subject is predicted to not respond to the treatment if the number of circulating cells greater than about 50 μm in size is maintained or increased from the first to the second and any additional samples; or
A subject is predicted to respond to treatment if the number of circulating cells greater than about 50 μm in size decreases from the first to the second and any additional samples; or each circulating cell in the second or subsequent sample. is reduced in size compared to the first sample and the size of each circulating cell in the second or any additional sample is less than about 50 μm, the subject has responded to the treatment, and the cancer is likely to be cured. It is predicted that there is a
この実施態様の別の局面では、本発明は、被検者からの生体試料中に約50μmより大きいCAMLsなどのどのような循環細胞もないことを決定すること、及びこの被検者は治療に反応していると予測することを含む、がんを有する被検者の治療に対する反応を予測する方法に向けられている。 In another aspect of this embodiment, the invention provides for determining that there are no circulating cells, such as CAMLs, larger than about 50 μm in a biological sample from a subject, and that the subject is not receiving treatment. The present invention is directed to a method of predicting response to treatment in a subject with cancer, including predicting response.
この実施態様のさらなる局面において、本発明は、がんを有する被検者から得られた生体試料中のCAMLsなどの循環細胞のサイズを決定することを含む、がんを有する被検者の治療に対する反応を予測する方法に向けられており、ここで、試料は、少なくとも１つのがん治療後に被検者から得られ、各循環細胞のサイズが約50μm以下である場合、被検者は治療に反応すると予測される。 In a further aspect of this embodiment, the invention provides a method for treating a subject with cancer comprising determining the size of circulating cells, such as CAMLs, in a biological sample obtained from the subject with cancer. the sample is obtained from a subject after at least one cancer treatment, and where each circulating cell is approximately 50 μm or less in size; expected to respond to
この実施態様の追加の局面では、本発明は、第１及び第２の生体試料、ならびに任意の追加の生体試料における、CAMLsなどの循環細胞の数を決定することを含む、がんを有する被検者の治療に対する反応を予測する方法に向けられており、ここで、第１の試料はがん治療の前又は治療中に被検者から得られ、第２及び任意の追加の試料は少なくとも１つのがん治療後に被検者から得られ、第１から第２及び任意の追加の試料で循環細胞の数が減少する場合、被検者は治療に反応すると予測され、第１から第２及び任意の追加の試料で循環細胞の数が維持され又は増加する場合、被検者は治療に反応しないと予測される。 In an additional aspect of this embodiment, the invention provides a method for treating a subject with cancer, comprising determining the number of circulating cells, such as CAMLs, in the first and second biological samples, and any additional biological samples. A method for predicting a response to treatment in a subject, wherein the first sample is obtained from the subject before or during cancer treatment, and the second and optional additional sample comprises at least A subject is predicted to respond to treatment if the number of circulating cells obtained from the subject after one cancer treatment decreases from the first to the second and any additional samples; If the number of circulating cells is maintained or increased in and any additional samples, the subject is predicted to not respond to treatment.
第４の実施態様において、本発明は、がんを有する被検者からの生体試料におけるCAMLsなどの循環細胞のサイズを決定することを含む、肺がんを有する被検者における治療に対する耐性を予測する方法に向けられており、ここで、前記試料中の少なくとも１つの細胞のサイズが約50μm以上である場合、被検者は、細胞のサイズが約50μmを超る細胞がないがんを有する被検者よりもがん治療に対してより耐性であると予測される。この実施態様のある局面において、がんは肺がんである。 In a fourth embodiment, the invention predicts resistance to treatment in a subject with lung cancer, comprising determining the size of circulating cells, such as CAMLs, in a biological sample from the subject with cancer. a method, wherein if at least one cell in the sample has a size of about 50 μm or greater, the subject has a cancer in which the cell size is greater than about 50 μm; predicted to be more resistant to cancer treatment than the examiner. In certain aspects of this embodiment, the cancer is lung cancer.
本発明は、また、治療決定が、上記説明した方法において循環細胞を使用する治療反応の予測に基づくことができる、がんの治療方法に向けられている。 The present invention is also directed to a method of treating cancer in which treatment decisions can be based on prediction of therapeutic response using circulating cells in the methods described above.
例えば、第５の実施態様では、本発明は、がんを有する被検者に治療有効量のがん治療を投与すること、及びがんを有する被検者から得られた２つ以上の生体試料の中のCAMLsなどの循環細胞のサイズを決定することを含む、がんを有する被検者を治療する方法に向けられており、ここで、第１の生体試料はがん治療の前又は治療中に被検者から得られ、第２の生体試料はがん治療の間又は後に被検者から得られ、試料間で循環細胞のサイズの減少が経時的に見られる場合、被検者は治療に反応していることが分かり、治療が継続され、そして、試料間で循環細胞のサイズの減少が経時的に見られない場合、被検者は治療に反応しないことが分かり、治療は継続されない。 For example, in a fifth embodiment, the present invention provides for administering a therapeutically effective amount of a cancer treatment to a subject having cancer, and administering a therapeutically effective amount of a cancer treatment to a subject having cancer. A method of treating a subject with cancer includes determining the size of circulating cells, such as CAMLs, in a sample, wherein the first biological sample is administered prior to or after cancer treatment. obtained from the subject during treatment, and the second biological sample is obtained from the subject during or after cancer treatment, and a decrease in the size of circulating cells is observed over time between the samples. If the subject is found to be responding to the treatment, the treatment is continued, and no decrease in the size of circulating cells is seen over time among the samples, then the subject is known to be unresponsive to the treatment and the treatment is continued. Not continued.
関連する実施態様において、本発明の方法は、がんを有する被検体に治療有効量のがん治療を投与すること、及びがんを有する被検体から得られた２つ以上の生体試料におけるCAMLsなどの循環細胞の数を決定することを含み、ここで、第１の生体試料は、がん治療の前又は治療中に被検者から得られ、第２の生体試料は、がん治療の間又は後に被検者から得られ、試料間で循環細胞の数の減少が経時的に見出された場合、被検者は治療に反応していると分かり、治療が継続され、そして、試料間で循環細胞の数の減少が経時的に見られない場合、被検者は治療に反応していないことが分かり、治療は継続されない。 In a related embodiment, the method of the invention comprises administering to a subject with cancer a therapeutically effective amount of a cancer treatment, and administering CAMLs in two or more biological samples obtained from the subject with cancer. , wherein the first biological sample is obtained from the subject before or during cancer treatment, and the second biological sample is obtained from the subject before or during cancer treatment. If a decrease in the number of circulating cells is found over time between samples obtained from the subject or later, the subject is known to be responding to treatment, treatment is continued, and samples are If there is no decrease in the number of circulating cells over time, the subject is known to be not responding to treatment and treatment is not continued.
この実施態様の一局面では、この方法は、がんを有する被検者に治療有効量のがん治療を投与すること、及び被検者から得られる第１及び第２の生体試料、並びに任意の追加の生体試料中のCAMLsなどの循環細胞のサイズを決定することを含み、ここで、第１の試料はがん治療の前又は治療中に被検者から得られ、第２及び任意の追加の試料は少なくとも１つのがん治療後に被検者から得られ、第１の試料の少なくとも１つの細胞のサイズが約50μm以上で、第２の試料と任意の追加の試料の各細胞のサイズが約50μm未満の場合、被検者は治療に反応していることが分かり、治療が継続される。 In one aspect of this embodiment, the method comprises administering to a subject having cancer a therapeutically effective amount of a cancer treatment, and first and second biological samples obtained from the subject, and optionally determining the size of circulating cells, such as CAMLs, in an additional biological sample of the patient, wherein the first sample is obtained from the subject before or during cancer treatment, and the second and optional sample is obtained from the subject before or during cancer treatment. The additional sample is obtained from the subject after at least one cancer treatment, wherein at least one cell in the first sample has a size of about 50 μm or more, and each cell in the second sample and any additional sample has a size of about 50 μm or more. is less than about 50 μm, the subject is known to be responding to treatment and treatment is continued.
別の関連する局面では、この方法は、がんを有する被検者に治療有効量のがん治療を投与すること、及び被検者から得られた第１及び第２の生体試料、並びに任意の追加の生体試料中のCAMLsなどの循環細胞の平均サイズを決定することを含み、ここで、第１の試料はがん治療の前又は治療中に被検者から得られ、第２及び任意の追加の試料は少なくとも１つのがん治療後に被検者から得られ、第２と任意の追加の試料における循環細胞の平均サイズが第１の試料における細胞の平均サイズと比較して減少している場合、被検者は治療に反応していると特定され、治療が継続され、そして、第２及び任意の追加試料における循環細胞の平均サイズが、第１の試料の細胞の平均サイズと比較して減少していない場合、被検者は治療に反応していないと特定され、治療は継続されない。ある局面では、第１の試料中の循環細胞の平均サイズは、約50μm以上である。 In another related aspect, the method comprises administering to a subject having cancer a therapeutically effective amount of a cancer treatment, and first and second biological samples obtained from the subject; determining the average size of circulating cells, such as CAMLs, in additional biological samples of the subject, wherein the first sample is obtained from the subject before or during cancer treatment, and the second and optional sample is obtained from the subject before or during cancer treatment. an additional sample is obtained from the subject after at least one cancer treatment, wherein the average size of circulating cells in the second and any additional samples is decreased compared to the average size of cells in the first sample. , the subject is identified as responding to treatment, treatment is continued, and the average size of circulating cells in the second and any additional samples is compared to the average size of cells in the first sample. If there is no decrease, the subject is identified as not responding to treatment and treatment is not continued. In certain aspects, the average size of circulating cells in the first sample is about 50 μm or greater.
第６の実施態様では、本発明は、がんを有する被検者に治療有効量のがん治療を投与すること、及び被検者から得られた第１及び第２の生体試料、並びに任意の追加の生体試料におけるCAMLsなどの循環細胞のサイズを決定することを含む、がんを有する被検者の治療方法に向けられており、ここで、第１の試料はがん治療前又はがん治療中に被検者から得られ、第２及び任意の追加の試料は少なくとも１つのがん治療後に被検者から得られ、そして、
第２及び任意の追加の試料におけるCAMLsの平均サイズが、第１の試料におけるCAMLsの平均サイズと比較して減少している場合、被検者は治療に反応すると予測され、治療が継続され；
第２及び任意の追加の試料におけるCAMLsの平均サイズが、第１の試料におけるCAMLsの平均サイズと比較して維持され又は増加している場合、被検者は治療に反応しないと予測され、治療は継続されず；
サイズが約50μmを超える循環細胞の数が第１の試料から第２、及び任意の追加の試料で増加する場合、被検者は治療に反応しないと予測され、治療は継続されず；
サイズが約50μmを超える循環細胞の数が第１から第２及び任意の追加の試料で減少する場合、被検者は治療に反応すると予測され、治療が継続され；又は
第２又は後続の試料の各循環細胞のサイズが最初の試料と比較して減少し、第２又は任意の追加試料における各循環細胞のサイズが約50μm未満の場合、被検者は治療に反応すると予測され、治療は継続される。
In a sixth embodiment, the invention provides administering a therapeutically effective amount of a cancer treatment to a subject having cancer, and first and second biological samples obtained from the subject, and optionally is directed to a method of treating a subject with cancer comprising determining the size of circulating cells, such as CAMLs, in an additional biological sample of the second and optional additional sample is obtained from the subject after at least one cancer treatment, and
If the average size of CAMLs in the second and any additional samples is decreased compared to the average size of CAMLs in the first sample, the subject is predicted to respond to treatment and treatment is continued;
If the average size of CAMLs in the second and any additional samples is maintained or increased compared to the average size of CAMLs in the first sample, the subject is predicted not to respond to treatment; is not continued;
If the number of circulating cells greater than about 50 μm in size increases from the first sample to the second and any additional samples, the subject is predicted not to respond to the treatment and treatment is not continued;
The subject is predicted to respond to treatment and treatment is continued if the number of circulating cells greater than about 50 μm in size decreases from the first to the second and any additional samples; or The subject is predicted to respond to the treatment if the size of each circulating cell in the second or any additional sample is less than about 50 μm, and the treatment is Continued.
この実施態様の一局面では、本発明は、治療有効量のがん治療をがんを有する被検者に投与すること、及び被検者から得られた生体試料中に、約50μmより大きい、CAMLsなどのどのような循環細胞もないことを決定することを含む、がんを有する被検者の治療方法に向けられており、ここで、試料は少なくとも１つのがん治療後に被検者から得られ、生体試料中に約50μmより大きいどのような循環細胞も存在しない場合、被検者は治療に反応すると予測され、治療が継続される。 In one aspect of this embodiment, the invention provides for administering a therapeutically effective amount of a cancer treatment to a subject having cancer, and in a biological sample obtained from the subject, a cancer treatment that is larger than about 50 μm. A method of treating a subject with cancer comprising determining the absence of any circulating cells such as CAMLs, wherein the sample is collected from the subject after at least one cancer treatment. If obtained and there are no circulating cells larger than about 50 μm in the biological sample, the subject is predicted to respond to the treatment and treatment is continued.
この実施態様のさらなる局面では、本発明は、治療有効量のがん治療をがんを有する被検者に投与すること、及び被検者から得られた生体試料中のCAMLsなどの循環細胞のサイズを決定することを含む、がんを有する被検者を治療する方法に向けられており、ここで、試料は少なくとも１つのがん治療後に被検者から得られ、各循環細胞のサイズが約50μm以下である場合、被検者は治療に反応すると予測され、治療が継続される。 In a further aspect of this embodiment, the invention provides methods for administering a therapeutically effective amount of a cancer treatment to a subject having cancer and for detecting circulating cells, such as CAMLs, in a biological sample obtained from the subject. A method of treating a subject with cancer comprises determining the size of each circulating cell, wherein the sample is obtained from the subject after at least one cancer treatment and the size of each circulating cell is determined. If it is approximately 50 μm or less, the subject is predicted to respond to treatment and treatment is continued.
この実施態様の追加の局面では、本発明は、治療有効量のがん治療をがんを有する被検者に投与すること、及び被検者から得られる第１及び第２の生体試料、並びに任意の追加の生体試料中の、CAMLsなどの循環細胞の数を決定することを含む、がんを有する被検者の治療方法に向けられており、ここで、第１の試料は、がん治療の前又は治療中に被検者から得られ、第２及び任意の追加の試料は、少なくとも１つのがん治療後に被検者から得られ、循環細胞の数が第１から第２及び任意の追加試料で減少する場合、被検者は治療に反応すると予測され、治療が継続され、循環細胞の数が第１から第２及び任意の追加の試料で維持され又は増加する場合、被検者は治療に反応しないと予測され治療と治療は継続されない。 In an additional aspect of this embodiment, the invention provides for administering a therapeutically effective amount of a cancer treatment to a subject having cancer, and first and second biological samples obtained from the subject; A method of treating a subject with cancer comprising determining the number of circulating cells, such as CAMLs, in an optional additional biological sample, wherein the first sample has cancer. the second and optional additional sample is obtained from the subject after at least one cancer treatment and the number of circulating cells is increased from the first to the second and optional additional sample; The subject is predicted to respond to treatment if the number of circulating cells is maintained or increased from the first to the second and any additional samples if the treatment is continued and the number of circulating cells is maintained or increased from the first to the second and any additional samples. It is predicted that the patient will not respond to treatment and treatment and therapy will not be continued.
本発明のこれらの実施態様及び局面のそれぞれにおいて、治療の終わりに生体試料中に循環細胞が見られない場合、がんが除去されたと結論付けることができる。治療の最後に生体試料に循環細胞がまだ見つかっている場合、患者においてがんは除去されておらず、患者には残存疾患があると結論付けることができる。 In each of these embodiments and aspects of the invention, it can be concluded that the cancer has been eliminated if no circulating cells are seen in the biological sample at the end of treatment. If circulating cells are still found in the biological sample at the end of treatment, it can be concluded that the cancer has not been eliminated in the patient and that the patient has residual disease.
残存疾患の病原力は、循環細胞のサイズによって予測することができる。例えば、生体試料における少なくとも１つのCAMLsのサイズが50μm以上の場合、がんはより速く進行する。 The pathogenicity of residual disease can be predicted by the size of circulating cells. For example, cancer progresses faster when the size of at least one CAML in a biological sample is 50 μm or more.
本発明の実施態様及び局面のそれぞれにおいて、循環細胞はCAMLsであり得る。 CAMLsは、以下の各特性を有すると定義される。
（a）サイズが約14～64μmの大きな非定型倍数体核、複数の個々の核、及び/又は約14～64μmのサイズを持つ１つ以上の融合核；
（b）サイズが約20～300μmの細胞サイズ；及び
（c）紡錘形、オタマジャクシ、円形、楕円形、2本の足、3本以上の足、細い足、及び無定形からなる群より選択される形態学的形状。
In each of the embodiments and aspects of the invention, the circulating cells can be CAMLs. CAMLs are defined as having the following characteristics:
(a) a large atypical polyploid nucleus with a size of about 14-64 μm, a plurality of individual nuclei, and/or one or more fused nuclei with a size of about 14-64 μm;
(b) a cell size of about 20-300 μm in size; and (c) selected from the group consisting of spindle-shaped, tadpole, round, oval, two-legged, three or more legs, slender-legged, and amorphous. Morphological shape.
本発明の実施態様のある局面では、循環細胞は、以下の追加の特徴のうちの１つ又は複数を有するとさらに定義することができる。
（d）CD14陽性表現型;
（e）CD45発現;
（f）EpCAM発現;
（g）ビメンチン発現;
（h）PD-L1発現;
（i）CD11Cマーカーの発現;
（j）CD146マーカーの発現;
（k）CD202bマーカーの発現;
（l）CD31マーカーの発現;及び
（m）CK8、18、19上皮表現型。
In certain aspects of embodiments of the invention, circulating cells can be further defined as having one or more of the following additional characteristics.
(d) CD14 positive phenotype;
(e) CD45 expression;
(f) EpCAM expression;
(g) vimentin expression;
(h) PD-L1 expression;
(i) CD11C marker expression;
(j) CD146 marker expression;
(k) CD202b marker expression;
(l) CD31 marker expression; and (m) CK8, 18, 19 epithelial phenotype.
本発明の実施態様及び局面のそれぞれにおいて、生体試料のサイズは、0.5から50mLである。生体試料のサイズは、5から15mLであってもよい。本発明のある局面では、生体試料のサイズは約7.5mLである。 In each of the embodiments and aspects of the invention, the size of the biological sample is 0.5 to 50 mL. The size of the biological sample may be 5 to 15 mL. In certain aspects of the invention, the size of the biological sample is about 7.5 mL.
本発明の実施態様及び局面のそれぞれにおいて、生体試料の供給源は、血液、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、組織、尿、末梢血単核細胞（PBMCs）、及び凍結保存されたPBMCsの1以上であり得る。生体試料が血液である場合、血液は、例えば、末梢血、肘正中静脈血、下大静脈血、大腿静脈血、門脈血、又は頸静脈血であり得る。試料は、新鮮な試料であってもよいし、適切に調製された凍結保存試料を融解したものであってもよい。 In each of the embodiments and aspects of the invention, the source of the biological sample may include blood, lymph nodes, bone marrow, cerebrospinal fluid, tissue, urine, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), and cryopreserved PBMCs. It can be more than that. When the biological sample is blood, the blood can be, for example, peripheral blood, median cubital vein blood, inferior vena cava blood, femoral vein blood, portal vein blood, or jugular vein blood. The sample may be a fresh sample or a thawed frozen sample that has been appropriately prepared.
本発明の実施態様の有る局面では、がんは、固形腫瘍、ステージIのがん、ステージIIのがん、ステージIIIのがん、ステージIVのがん、細胞腫、肉腫、神経芽細胞腫、黒色腫、上皮細胞がん、乳がん、前立腺がん、肺がん、膵臓がん、大腸がん、肝臓がん、頭頸部がん、腎臓がん、卵巣がん、食道がん、又は他の固形腫瘍がんである。 In some aspects of embodiments of the invention, the cancer is a solid tumor, stage I cancer, stage II cancer, stage III cancer, stage IV cancer, cell tumor, sarcoma, neuroblastoma. , melanoma, epithelial cell carcinoma, breast cancer, prostate cancer, lung cancer, pancreatic cancer, colorectal cancer, liver cancer, head and neck cancer, kidney cancer, ovarian cancer, esophageal cancer, or other solid cancers. It is a tumor cancer.
本発明の実施態様のある局面では、循環細胞は、サイズ排除法、免疫捕捉、デンドリマーを介した多価細胞捕捉、親和性ベースの表面捕捉、生体模倣表面被覆補足、セレクチン被覆表面捕捉、その他の機能化表面捕捉、慣性集束チップ、赤血球溶解、白血球枯渇、FICOLL分離、電気泳動、誘電泳動、フローサイトメトリー、磁気浮上、及び種々のマイクロ流体チップ、又はそれらの組み合わせから選択される１以上の手段を使用して生体試料から分離される。 In some aspects of embodiments of the invention, circulating cells are collected using size exclusion techniques, immunocapture, dendrimer-mediated multivalent cell capture, affinity-based surface capture, biomimetic surface coating capture, selectin-coated surface capture, etc. One or more means selected from functionalized surface capture, inertial focusing chips, red blood cell lysis, leukocyte depletion, FICOLL separation, electrophoresis, dielectrophoresis, flow cytometry, magnetic levitation, and various microfluidic chips, or combinations thereof. separated from biological samples using
本発明の一つの局面では、循環細胞は、マイクロフィルターを用いることを含むサイズ排除法を使用して生体試料から分離される。マイクロフィルターは、約5ミクロンから約20ミクロンの範囲の細孔サイズを有し得る。細孔サイズの適した範囲は、それには限定されないが、約5～7ミクロン、約7～8ミクロン、8～10ミクロン、11～13ミクロン、14～16ミクロン、17～20ミクロン 5～10ミクロン、11～15ミクロン、15～20ミクロン、9～15ミクロン、16～20ミクロン、及び9～20ミクロンの範囲の細孔サイズも含む。別の適した範囲は、約5～20ミクロンの範囲の細孔サイズを含むが、7～8ミクロンの細孔を除外する。マイクロフィルターの細孔は、円形、レーストラック形状、楕円形、スリット、正方形、長方形、及び／又は他の形状を有することができる。マイクロフィルターは、精密な細孔形状、均一な細孔分布、複数の細孔形状、及び／又は不均一な細孔分布を有することができる。マイクロフィルターは、単層でも、異なる層に異なる形状を有する多層でもよい。サイズが約7～8ミクロンの円形細孔を持つマイクロフィルターは、高分子マイクロフィルターが使用される場合に特に最適である。好ましい局面では、マイクロフィルターは、精密な細孔形状及び均一な細孔分布を有する。 In one aspect of the invention, circulating cells are separated from a biological sample using a size exclusion method that involves using a microfilter. Microfilters can have pore sizes ranging from about 5 microns to about 20 microns. Suitable ranges of pore sizes include, but are not limited to, about 5-7 microns, about 7-8 microns, 8-10 microns, 11-13 microns, 14-16 microns, 17-20 microns, 5-10 microns. , 11-15 microns, 15-20 microns, 9-15 microns, 16-20 microns, and 9-20 microns. Another suitable range includes pore sizes ranging from about 5 to 20 microns, but excludes 7 to 8 micron pores. The pores of the microfilter can have circular, racetrack-shaped, oval, slit, square, rectangular, and/or other shapes. Microfilters can have precise pore shapes, uniform pore distributions, multiple pore shapes, and/or non-uniform pore distributions. The microfilter may be single layer or multilayer with different shapes in different layers. Microfilters with circular pores of about 7-8 microns in size are particularly suitable when polymeric microfilters are used. In preferred aspects, the microfilter has a precise pore shape and uniform pore distribution.
本発明の別の局面では、循環細胞は、CellSieve（商標）低圧精密濾過アッセイを使用して生体試料から分離される。 In another aspect of the invention, circulating cells are separated from a biological sample using the CellSieve™ low pressure microfiltration assay.
本発明の別の局面では、循環細胞は、物理的サイズに基づく選別、スリット、チャネル、流体力学的サイズに基づく選別、グループ化、トラッピング、免疫捕獲、大細胞の濃縮、又はサイズに基づく小細胞の排除を介したミクロ流動チップを使用して生体試料から分離される。 In another aspect of the invention, circulating cells can be collected by physical size-based sorting, slits, channels, hydrodynamic size-based sorting, grouping, trapping, immunocapture, large cell enrichment, or size-based small cell sorting. separated from the biological sample using a microfluidic chip through the exclusion of
本発明の実施態様のある局面では、被検者は治療を受けている。治療は、化学療法、単一薬物、薬物の組み合わせ、免疫療法、放射線療法、化学放射線療法、単一又は複数の薬物と組み合わせた放射線、単一又は複数の薬物と組み合わせた化学放射線療法、がんワクチン、及び細胞療法の１つ以上であり得る。治療ががんワクチンである場合、被検者は少なくとも１つのHLA対立遺伝子を発現する可能性がある。 In certain aspects of embodiments of the invention, the subject is undergoing treatment. Treatments include chemotherapy, single drugs, combinations of drugs, immunotherapy, radiotherapy, chemoradiotherapy, radiation in combination with single or multiple drugs, chemoradiotherapy in combination with single or multiple drugs, cancer It can be one or more of a vaccine, and a cell therapy. If the treatment is a cancer vaccine, the subject is likely to express at least one HLA allele.
本発明の実施態様及び局面のそれぞれにおいて、CAMLsは、がんマーカーとして独立して、又は循環腫瘍細胞（CTCs）、上皮間葉転換細胞（EMTs）、循環がん関連血管内皮細胞（CAVEs）などの他の循環細胞と組み合わせて、また、遊離DNA（cfDNA）、循環腫瘍DNA（ctDNA）、メチル化DNA、プロテオミクスの、メタボロームの、リピドミックな、及びその他のバイオマーカーと組み合わせて使用されることができ、それにより患者の疾患のより完全な理解を提供する。CAMLsは、ここで言及される循環細胞のグループの中で、典型的にはサイズが30μmより大きい唯一の細胞型である。 In each of the embodiments and aspects of the invention, CAMLs are used independently as cancer markers or as circulating tumor cells (CTCs), epithelial-mesenchymal transition cells (EMTs), circulating cancer-associated vascular endothelial cells (CAVEs), etc. In combination with other circulating cells, it may also be used in combination with free DNA (cfDNA), circulating tumor DNA (ctDNA), methylated DNA, proteomic, metabolomic, lipidomic, and other biomarkers. and thereby provide a more complete understanding of the patient's disease. CAMLs are the only cell type among the group of circulating cells mentioned here that are typically larger than 30 μm in size.
本発明の方法が被検者における治療反応の予測に関連する場合、治療反応情報を得るための時間の尺度は、治療のタイプに応じて、2治療サイクル又は60日という短さであり得る。 When the methods of the invention relate to predicting treatment response in a subject, the time scale for obtaining treatment response information can be as little as two treatment cycles or 60 days, depending on the type of treatment.
本発明の関連する局面において、がん治療反応を予測するための試験は、以下の１つ以上であり得る：
・固形腫瘍の種類に依存せず、
・がんのステージに依存せず、
・治療の種類に依存せず、
・治療の開始時、進行中の治療中、又は治療の終了時、
・血液試料に基づく、
・組織を必要としない、及び
・画像診断よりも前に得られた決定を介して行われる。
In a related aspect of the invention, a test for predicting cancer treatment response can be one or more of the following:
・Independent of the type of solid tumor,
・Independent of cancer stage,
・Independent of the type of treatment,
・At the start of treatment, during ongoing treatment, or at the end of treatment;
・Based on blood samples,
• Does not require tissue, and • is made through decisions obtained prior to diagnostic imaging.
本発明の方法で言う被検者は、ヒト、ヒト以外の霊長類、鳥、馬、牛、山羊、羊、犬、猫又はげっ歯類などの伴侶動物、又は他の哺乳動物である。 The subject referred to in the method of the present invention is a companion animal such as a human, a non-human primate, a bird, a horse, a cow, a goat, a sheep, a dog, a cat, or a rodent, or another mammal.
詳細な説明
ここで使用される場合、「a」又は「an」は、1つ以上を意味し得る。ここで「含む」という用語と併せて使用される場合、「a」又は「an」という用語は、１つ又は1つ以上を意味し得る。ここで使用される場合、「別の」は、少なくとも第2又はそれ以上を意味し得る。さらに、文脈で他に要求されない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数を含む。
DETAILED DESCRIPTION As used herein, "a" or "an" may mean one or more. When used herein in conjunction with the term "comprising," the term "a" or "an" can mean one or more than one. As used herein, "another" may mean at least a second or more. Further, unless the context otherwise requires, singular terms shall include pluralities and plural terms shall include the singular.
ここで使用される場合、「約」は、明示的に示されているかどうかにかかわらず、例えば、整数、分数、及び百分率を含む数値に言及する。「約」という用語は、一般に、列挙された値（たとえば、同じ関数又は結果を持つ）と同等であると当業者が考えるであろう数値の範囲（例えば、列挙された値の+/- 5、6、7、8、9又は10％）に言及する。ある場合は、「約」という用語は、最も近い有効数字に四捨五入された数値を含み得る。たとえば、「約50μm」は50μm +/- 10％を意味すると解釈されるべきでる。したがって、他に述べない限り、「約50μm」は45～55μmのサイズを包含する。 As used herein, "about" refers to numerical values, including, for example, whole numbers, fractions, and percentages, whether or not explicitly indicated. The term "about" generally refers to a range of numbers (e.g., +/- 5 of the recited value) that one of ordinary skill in the art would consider to be equivalent to the recited value (e.g., having the same function or result). , 6, 7, 8, 9 or 10%). In some cases, the term "about" may include numbers rounded to the nearest significant figure. For example, "about 50 μm" should be interpreted to mean 50 μm +/- 10%. Therefore, unless stated otherwise, "about 50 μm" includes sizes from 45 to 55 μm.
詳細な構成や要素などの説明で定義された事項は、本発明の包括的な理解を助けるために提供されたものに過ぎない。したがって、これらの当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、ここで説明された実施態様の様々な変更及び修正を行うことができることを認識するであろう。 Matters defined in the description, such as detailed configurations and elements, are merely provided to assist in a comprehensive understanding of the present invention. Accordingly, those skilled in the art will appreciate that various changes and modifications can be made to the embodiments described herein without departing from the scope and spirit of the invention.
がんは、世界で最も恐れられている疾患の１つであり、全ての国の全ての集団及び民族集団に影響を及ぼしている。男性及び女性の約40％が一生のうちにがんを発症する。米国だけでも、常に1,200万人を超えるがん患者がおり、2018年には170万人の新規がん患者と60万人を超える死亡が推定されている。世界中のがん死は年間約800万人と推定され、そのうち300万人は、患者が治療を受けられる先進国で発生している。 Cancer is one of the most feared diseases in the world, affecting all populations and ethnic groups in all countries. Approximately 40% of men and women will develop cancer during their lifetime. In the United States alone, there are over 12 million cancer patients at any given time, with an estimated 1.7 million new cancer cases and over 600,000 deaths in 2018. It is estimated that around 8 million people die from cancer each year worldwide, 3 million of which occur in developed countries where patients have access to treatment.
理想的には、選択された治療が機能しているかどうかを迅速に決定し、疾患の進行の予後を提供することができる診断法があるであろう。 Ideally, there would be a diagnostic method that could quickly determine whether the selected treatment is working and provide a prognosis of disease progression.
この開示では、ステージＩ～IVの固形腫瘍患者の血液中に、どのようなその他のがん関連細胞よりも、より一貫して見られる細胞型が示されている。これらの循環細胞は、原発腫瘍と同じ腫瘍マーカーを含むマクロファージ様細胞であり、ここではそれらを循環がん関連マクロファージ様細胞（CAMLs）と称する。 This disclosure describes a cell type that is more consistently found in the blood of patients with stage I-IV solid tumors than any other cancer-associated cell. These circulating cells are macrophage-like cells that contain the same tumor markers as the primary tumor, and we refer to them here as circulating cancer-associated macrophage-like cells (CAMLs).
循環腫瘍細胞（CTCs）と共に、がんを有する患者からの生体試料中に存在するCAMLsは、例えば、精密濾過法を含むサイズ排除法の使用により、分離及び特徴付けられることができる。マイクロフィルターは、CTCsやCAMLsなどのより大きな循環細胞を保持しながら、赤血球と大部分の白血球を通過させるのに十分な大きさの細孔を持って形成されることができる。収集された細胞は、次いで、フィルター上で直接、又は他の手段を介して特徴付けられることができる。 CAMLs present in biological samples from patients with cancer, along with circulating tumor cells (CTCs), can be isolated and characterized by the use of size exclusion methods, including, for example, microfiltration methods. Microfilters can be formed with pores large enough to pass red blood cells and most white blood cells while retaining larger circulating cells such as CTCs and CAMLs. The collected cells can then be characterized directly on the filter or via other means.
CAMLsは、単独で使用されて、多くの臨床的有用性を有する。しかし、本発明の方法を使用する生体試料中のCAMLsの特徴付けは、同じ特徴（例えば、サイズ及び数）又は他の特徴についての他のマーカーのアッセイと組み合わせられることができる。これらの他のマーカーは、CTCs、上皮間葉転換細胞（EMTs）、循環がん関連血管内皮細胞（CAVEs）、また遊離DNA（cfDNA）、循環腫瘍DNA（ctDNA）、メチル化DNA、プロテオミクスの、メタボロームの、リピドミックな、及びその他のバイオマーカー、ならびに血中の遊離タンパク質を含み、ここで定義される方法の感度及び特異性をさらに改善する。これはCAMLs及びCTCsに特に真実であるが、それらは、ここに開示される同じ方法を使用して同時に分離及び同定され得るからである。
循環がん関連マクロファージ様細胞（CAMLs）
CAMLs have many clinical utilities when used alone. However, characterization of CAMLs in biological samples using the methods of the invention can be combined with assays of other markers for the same characteristics (eg, size and number) or other characteristics. These other markers include CTCs, epithelial-mesenchymal transition cells (EMTs), circulating cancer-associated vascular endothelial cells (CAVEs), as well as free DNA (cfDNA), circulating tumor DNA (ctDNA), methylated DNA, and proteomics. Metabolomic, lipidomic, and other biomarkers, as well as free proteins in the blood, are included to further improve the sensitivity and specificity of the methods defined herein. This is particularly true for CAMLs and CTCs, as they can be simultaneously separated and identified using the same methods disclosed herein.
Circulating cancer-associated macrophage-like cells (CAMLs)
ここで定義されるように、CAMLsは、以下の特徴のうちの１つ以上を有する：
・拡大し融合した核小体が一般的であるにもかかわらず、CAMLsは大きく非定型の倍数体の核又は複数の個別の核を持ち、しばしば細胞内に散在する。CAMLs核は、一般に、直径が約10μmから約70μm、より一般的には直径が約14μmから約64μmのサイズの範囲である。
・多くのがんでは、CAMLsは疾患のがんマーカーを発現する。例えば、上皮がんに関連するCAMLsは、CK8、18又は19、ビメンチンなどを発現する可能性がある。このマーカーは、典型的には拡散しているか、又は液胞及び/又は摂取した物質に関連する。どのようなマーカーの染色パターンも、細胞全体にほぼ均一に拡散している。肉腫、神経芽細胞腫、及び黒色腫では、CK8、18、19の代わりに、がんに関連する他のマーカーを使用できる。
・CAMLsは、CD45陽性又はCD45陰性であり得、そして本発明は、CAMLsの両方のタイプの使用を包含する。
・CAMLsは大きく、最長径サイズが約20ミクロンから約300ミクロンである。
・CAMLは、紡錘形、オタマジャクシ、円形、楕円形、2本の足、3本以上の足、細い足、又は無定形を含む、多くの異なる形態学的形状で見られる。
・細胞腫のCAMLsは、典型的には、拡散したサイトケラチンを有する。
・CAMLsがEpCAMを発現する場合、EpCAMは、典型的には、細胞全体に拡散しているか、又は液胞及び／若しくは摂取した物質に関連し、細胞全体でほぼ均一であるが、いくつかの腫瘍はEpCAMの発現が極めて弱いか無いため、全てのCAMLがEpCAMを発現するのではない。
・CAMLsがマーカーを発現する場合、マーカーはしばしば細胞全体に拡散するか、又は液胞及び/又は摂取した物質に関連し、細胞全体でほぼ均一であるが、全てのCAMLが同じマーカーを同じ強度で限られた数だけ発現するわけではなく、マーカーは細胞全体に均一に分布していない。
・CAMLsは、しばしば、腫瘍起源のマーカーに関連するマーカーを発現し、例えば、腫瘍が前立腺がん起源であり、PSMAを発現している場合、そのような患者からのCAMLsもPSMAを発現している。別の例として、原発腫瘍が膵臓起源であり、PDX-1を発現している場合、そのような患者からのCAMLsもPDX-1を発現する。さらなる例として、がん起源の原発腫瘍又はCTCがCXCR-4を発現している場合、そのような患者からのCAMLsもCXCR-4を発現する。
・がん起源の原発腫瘍又はCTCが薬物標的のバイオマーカーを発現している場合、そのような患者からのCAMLsも薬物標的のバイオマーカーを発現する。免疫療法のそのようなバイオマーカーの例は、PD-L1である。
・CAMLsは、単球マーカー（例えば、CD11c、CD14）及び内皮マーカー（例えば、CD146、CD202b、CD31）を発現する。
・CAMLは、Fcフラグメントに結合する能力がある。
As defined herein, CAMLs have one or more of the following characteristics:
-Although enlarged and fused nucleoli are common, CAMLs have large, atypical polyploid nuclei or multiple individual nuclei, often scattered within the cell. CAMLs nuclei generally range in size from about 10 μm to about 70 μm in diameter, more commonly from about 14 μm to about 64 μm in diameter.
- In many cancers, CAMLs express cancer markers of the disease. For example, CAMLs associated with epithelial cancers may express CK8, 18 or 19, vimentin, etc. This marker is typically diffuse or associated with the vacuole and/or ingested material. The staining pattern of any marker is almost uniformly spread throughout the cell. In sarcomas, neuroblastomas, and melanomas, other markers associated with cancer can be used instead of CK8, 18, 19.
- CAMLs can be CD45 positive or CD45 negative and the invention encompasses the use of both types of CAMLs.
- CAMLs are large, with the longest diameter ranging from about 20 microns to about 300 microns.
- CAML is found in many different morphological shapes, including spindle-shaped, tadpole, round, oval, two-legged, three or more legs, thin-legged, or amorphous.
- Cytoma CAMLs typically have diffuse cytokeratin.
- When CAMLs express EpCAM, EpCAM is typically diffused throughout the cell or associated with vacuoles and/or ingested materials, and is approximately uniform throughout the cell, but in some Not all CAML expresses EpCAM, as tumors have very weak or absent expression of EpCAM.
-When CAMLs express markers, they are often diffuse throughout the cell or associated with vacuoles and/or ingested material, and are approximately uniform throughout the cell, although all CAMLs express the same marker with the same intensity. The markers are not expressed in a limited number of cells, and the markers are not evenly distributed throughout the cell.
CAMLs often express markers related to markers of tumor origin, for example, if the tumor is of prostate cancer origin and expresses PSMA, CAMLs from such patients also express PSMA. There is. As another example, if the primary tumor is of pancreatic origin and expresses PDX-1, CAMLs from such patients will also express PDX-1. As a further example, if the primary tumor or CTC of cancer origin expresses CXCR-4, CAMLs from such patients will also express CXCR-4.
- If the primary tumor or CTC of cancer origin expresses a drug target biomarker, CAMLs from such patients will also express a drug target biomarker. An example of such a biomarker for immunotherapy is PD-L1.
- CAMLs express monocyte markers (eg CD11c, CD14) and endothelial markers (eg CD146, CD202b, CD31).
- CAML has the ability to bind to Fc fragments.
マーカーの広範なセットが、CAMLs上でのそれらの発現について評価され、結果が図9に示される。本発明の一局面では、本発明のCAMLsは、図9に示されるマーカーの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又は全21を発現する。マーカーは、異なるがんを有する93人の異なる患者からの1118個のCAMLsに対してスクリーニングされた。 An extensive set of markers was evaluated for their expression on CAMLs and the results are shown in Figure 9. In one aspect of the invention, the CAMLs of the invention include markers 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 or all 21. Markers were screened against 1118 CAMLs from 93 different patients with different cancers.
マーカー、したがってCAMLs自体は、当業者に知られている様々な手段を使用して検出され及び/又は特徴付けられることができる。例えば、特定のマーカーに対する結合特異性を有する抗体は、1つ以上のマーカーを発現する細胞を選択、検出及び／又は同定するのに使用できる。CAMLsは当初、DAPI、サイトケラチン、及びCD45と共に分離され、同定され；次に、骨髄/マクロファージ、白血球、巨核球、上皮、内皮、前駆/本幹、及び運動のマーカーを含む合計27のマーカーで順次再染色された。図9から分かるように、マーカー発現範囲は 0％から96％である。ほとんど全てのCAMLsは、CD31、及び一般に共発現したサイトケラチン、CD14、CXCR4、ビメンチン及びその他のマーカーのレベルを発現することがわかった。しかし、CAMLsは明確な骨髄系譜マーカー（CD14）を含んでいたが、CD31マーカーはより頻繁には96％で発現された。 Markers, and therefore CAMLs themselves, can be detected and/or characterized using various means known to those skilled in the art. For example, antibodies with binding specificity for particular markers can be used to select, detect, and/or identify cells that express one or more markers. CAMLs were initially isolated and identified with DAPI, cytokeratin, and CD45; then with a total of 27 markers including myeloid/macrophage, leukocyte, megakaryocyte, epithelial, endothelial, progenitor/mainstream, and motility markers. Sequentially restained. As can be seen in Figure 9, the marker expression range is from 0% to 96%. Almost all CAMLs were found to express CD31 and commonly co-expressed levels of cytokeratin, CD14, CXCR4, vimentin and other markers. However, although CAMLs contained a clear myeloid lineage marker (CD14), the CD31 marker was more frequently expressed in 96%.
CAMLsはまた、古典的な細胞分化（すなわち、CD45［白血球］及びサイトケラチン［上皮］、CD11c / CD14［マクロファージ］及びCD41［マクロファージ／巨核球］、CD146[内皮細胞]及びCD6 [マクロファージ/内皮細胞/巨核球]、CD31 [白血球/マクロファージ/内皮細胞/巨核球/幹細胞]及びCD68/CD163[マクロファージ]の共発現）の理解と一致していないように見える、多数の表現型を提示する。マーカーの多くは、複数の細胞タイプ上に現われる。これらのデータの組み合わせは、CAMLsは分化プロセスの早い段階で骨髄由来細胞であり、幹細胞及び血管新生促進能に関連する多くの表現型の特性を持っていることを示す。 CAMLs also have classical cell differentiation (i.e., CD45 [leukocytes] and cytokeratin [epithelial cells], CD11c/CD14 [macrophages] and CD41 [macrophages/megakaryocytes], CD146 [endothelial cells] and CD6 [macrophages/endothelial cells]). /megakaryocytes], CD31 [leukocytes/macrophages/endothelial cells/megakaryocytes/stem cells] and co-expression of CD68/CD163 [macrophages]) present a number of phenotypes that do not appear to be consistent with our understanding. Many of the markers appear on multiple cell types. The combination of these data indicates that CAMLs are bone marrow-derived cells early in the differentiation process and have many phenotypic properties associated with stem cell and proangiogenic potential.
CAMLsは、図9に示されるように、H＆Eなどの比色染色、又は特定のマーカーの蛍光染色によって視覚化されることができる。細胞質では、CD31が最も陽性の表現型である。CD31単独、又は図9における他の陽性マーカーとの組み合わせ、又は腫瘍に関連するがんマーカーが推奨される。 CAMLs can be visualized by colorimetric staining, such as H&E, or fluorescent staining of specific markers, as shown in Figure 9. In the cytoplasm, CD31 is the most positive phenotype. CD31 alone or in combination with other positive markers in Figure 9 or tumor-associated cancer markers are recommended.
したがって、本発明の様々な実施態様及び局面では、CAMLsは、以下の特性のそれぞれを有するものとして定義することができ、これらの特性のみに基づいて生体試料中で同定することができる。
（a）サイズが約14～64μmの大きな非定型倍数性核、又は同じ細胞内の複数の核；
（b）サイズが約20～300μmの細胞サイズ；及び
（c）紡錘形、オタマジャクシ、円形、楕円形、2本の足、3本以上の足、細い足、及び無定形からなる群より選択された形態学的形状。
Accordingly, in various embodiments and aspects of the invention, CAMLs can be defined as having each of the following properties and can be identified in a biological sample based solely on these properties.
(a) Large atypical polyploid nuclei approximately 14-64 μm in size, or multiple nuclei within the same cell;
(b) a cell size of approximately 20-300 μm in size; and (c) selected from the group consisting of spindle-shaped, tadpole, round, oval, two-legged, three or more legs, slender-legged, and amorphous. Morphological shape.
本発明の実施態様のある局面では、CAMLsは、以下の追加の特徴のうちの１つ以上を有するものとしてさらに定義することができる：
（d）CD14陽性表現型;
（e）CD45発現;
（f）EpCAM発現;
（g）ビメンチン発現;
（h）PD-L1発現;
（i）CD11Cマーカーの発現;
（j）CD146マーカーの発現;
（k）CD202bマーカー発現;
（l）CD31マーカーの発現;及び
（m）CK8、18、19上皮表現型。
In certain aspects of embodiments of the invention, CAMLs can be further defined as having one or more of the following additional characteristics:
(d) CD14 positive phenotype;
(e) CD45 expression;
(f) EpCAM expression;
(g) vimentin expression;
(h) PD-L1 expression;
(i) CD11C marker expression;
(j) CD146 marker expression;
(k) CD202b marker expression;
(l) CD31 marker expression; and (m) CK8, 18, 19 epithelial phenotype.
転移性がんでは、患者から得られる診断情報は、(i)転移部位のがんを排除する、及び(ii)がんの治療及び／又は治癒、すなわち被検者のあらゆる場所でがんを排除する方法において有用である。CAML数の減少は、腫瘍の退行と転移部位でのクリアランスの指標である。この概念は、多数のCAMLsに関連する全ての治療法と全てのがんに適用できる。例えば、乳がんを有する被検者では、通常、多数のCAMLsがあり、ステージIVの患者では7.5mLの血液あたり約30～50のCAMLsが存在する。対照的に、肺がんを有する被検者ではIV期の患者の血液7.5 mLあたり典型的には約5個のCAMLsしかない。CAMLsの存在は、がんの存在の指標である。CAMLのサイズは、疾患の病原力の指標でもある。
循環腫瘍細胞
For metastatic cancer, the diagnostic information obtained from the patient is important for (i) eliminating the cancer at metastatic sites, and (ii) treating and/or curing the cancer, i.e. eliminating the cancer anywhere in the patient. Useful in eliminating methods. A decrease in CAML numbers is an indicator of tumor regression and clearance at metastatic sites. This concept is applicable to all treatments and all cancers associated with numerous CAMLs. For example, subjects with breast cancer usually have a large number of CAMLs, with stage IV patients having approximately 30-50 CAMLs per 7.5 mL of blood. In contrast, there are typically only about 5 CAMLs per 7.5 mL of blood in patients with stage IV lung cancer. The presence of CAMLs is an indicator of the presence of cancer. CAML size is also an indicator of disease virulence.
circulating tumor cells
CTCsは、多数のサイトケラチン(CKs)を発現する。CK8、18、及び19は診断に最も一般的に使用され、本発明の方法で使用できるが、検査はこれら3つに限定されなくてよい。固形腫瘍CTCsの表面は通常、上皮細胞接着分子（EpCAM）を発現する。しかし、この発現は均一でも一貫性のあるものでもない。CTCsは白血球マーカーであるため、どのようなCD45も発現してはならない。CTCs及びCAMLsなどの腫瘍関連細胞を特定するためのアッセイでは、CK8、18、若しくは19に対する抗体、又はCD45若しくはDAPIに対する抗体を使用すれば十分である。染色の存在と形態を組み合わせれば、病理学的に定義可能なCTCs、アポトーシスCTCs、及びCAMLsを同定できる。 CTCs express numerous cytokeratins (CKs). Although CK8, 18, and 19 are most commonly used for diagnosis and can be used in the methods of the invention, tests need not be limited to these three. The surface of solid tumor CTCs usually expresses epithelial cell adhesion molecule (EpCAM). However, this expression is neither uniform nor consistent. Since CTCs are a leukocyte marker, they should not express any CD45. In assays to identify tumor-associated cells such as CTCs and CAMLs, it is sufficient to use antibodies against CK8, 18, or 19, or antibodies against CD45 or DAPI. The presence of staining combined with morphology allows the identification of pathologically definable CTCs, apoptotic CTCs, and CAMLs.
病理学的に定義可能なCTCは、以下の特徴によって同定される：
・それらはDAPIによって染色された「がんのような」核を持っている。例外は、細胞が***しているときで；核は凝縮されている。
・それらは少なくともCK 、18 及び19を発現する。サイトケラチンは繊維状のパターンを持っている。
・それらはCD45発現を欠いている。低発現CD45細胞を見逃さないようにするために、撮影には長時間暴露が使用される。
Pathologically definable CTCs are identified by the following characteristics:
-They have "cancer-like" nuclei stained by DAPI. The exception is when the cell is dividing; the nucleus is condensed.
- They express at least CK, 18 and 19. Cytokeratin has a fibrous pattern.
-They lack CD45 expression. To avoid missing low-expressing CD45 cells, long exposure times are used for imaging.
したがって、本発明の病理学的に定義可能なCTCは、以下の特徴のうちの1つ、2つ、又は3つを有するCTCsを含む：(a)がん様核；(b)サイトケラチン8、18及び19の1つ以上を発現しており、サイトケラチンは繊維状パターンを有する;及び（c）CD45陰性の表現型。 Accordingly, pathologically definable CTCs of the present invention include CTCs having one, two, or three of the following characteristics: (a) cancerous nuclei; (b) cytokeratin 8 , 18, and 19, and the cytokeratin has a filamentous pattern; and (c) a CD45-negative phenotype.
アポトーシス性CTCは、以下の特徴により同定される：
・それらはがんの核を持っている。
・それらは少なくともCK8、18、19を発現し；サイトケラチンはフィラメント化されていないが、スポットの形で断片化されて現れる。
・それらはCD45を発現していない。
Apoptotic CTCs are identified by the following characteristics:
-They contain cancerous nuclei.
• They express at least CK8, 18, 19; cytokeratin is not filamented but appears fragmented in the form of spots.
-They do not express CD45.
したがって、本発明のアポトーシス性CTCは、以下の特徴のうちの1つ、2つ又は3つを有するCTCsを含む：（ａ）がん様核；（b）サイトケラチン8、18及び19の１つ以上を発現しており、サイトケラチンはスポットの形で断片化されている;及び（c）CD45陰性の表現型。
CAMLs及びCTCの捕捉
Accordingly, apoptotic CTCs of the invention include CTCs having one, two or three of the following characteristics: (a) cancerous nuclei; (b) one of cytokeratin 8, 18 and 19. and (c) a CD45-negative phenotype.
CAMLs and CTC capture
上記示唆したように、ここに説明したCAMLs及びCTCsの独特の特徴は、それらを、がんなどの疾患のスクリーニング及び診断、治療のモニタリング、疾患の進行及び再発のモニタリング方法を含む臨床方法論における使用に非常に適したものとする。 As alluded to above, the unique characteristics of CAMLs and CTCs described herein make them useful in clinical methodologies, including methods for screening and diagnosing diseases such as cancer, monitoring treatment, and monitoring disease progression and recurrence. be very suitable for
体液中に存在する他の細胞より大きい、及び/又は柔軟性の低い細胞、例えばCMALs及びCTCsは、体液をろ過することにより収集できる。例えば、状態を示す標的細胞は、標的細胞が通過するには小さすぎるが、他の細胞が通過するには十分に大きい開口部を有するフィルターに体液を濾過させることにより収集することができる。一旦収集したら、標的細胞の分析をいくつでも行える。そのような分析は、例えば、マーカーの発現の同定、カウント、特徴付け、分子分析の取得、及び／又は収集された細胞の培養を含み得る。 Cells that are larger and/or less flexible than other cells present in the body fluid, such as CMALs and CTCs, can be collected by filtering the body fluid. For example, target cells exhibiting a condition can be collected by filtering body fluids through a filter that has openings that are too small for the target cells to pass through, but large enough for other cells to pass through. Once collected, any number of target cells can be analyzed. Such analysis may include, for example, identifying, counting, characterizing the expression of markers, obtaining molecular analysis, and/or culturing the collected cells.
本発明の実施態様及び局面のそれぞれにおいて、循環細胞（例えば、CAMLs及びCTCs）は、当業者に公知のどのような関連する手段を使用して、本発明の方法における生体試料から分離され得る。適した手段は、それには限定されないが、サイズ排除法、免疫捕獲、赤血球溶解、白血球枯渇、FICOLL分離、電気泳動、誘電泳動、フローサイトメトリー、磁気浮上、及び物理的なサイズベースの選別、スリット、チャネル、流体力学的なサイズベースの選別、グループ化、トラッピング、大きな細胞の濃縮、小さな細胞の排除、又はそれらの組み合わせを介したさまざまなマイクロ流体チップから選択される１つ以上の手段を含む。特定の局面では、サイズ排除法は、マイクロフィルターの使用を含む。 In each of the embodiments and aspects of the invention, circulating cells (e.g., CAMLs and CTCs) may be separated from the biological sample in the methods of the invention using any relevant means known to those skilled in the art. Suitable means include, but are not limited to, size exclusion, immunocapture, red blood cell lysis, leukocyte depletion, FICOLL separation, electrophoresis, dielectrophoresis, flow cytometry, magnetic levitation, and physical size-based sorting, slitting. , channels, hydrodynamic size-based sorting, grouping, trapping, enrichment of large cells, exclusion of small cells, or a combination thereof, on a variety of microfluidic chips. . In certain aspects, size exclusion methods include the use of microfilters.
一例として、循環細胞（例えば、CAMLs及びCTCs）は、マイクロフィルターを用いることを含むサイズ排除法を使用して、生体試料から分離され得る。適したマイクロフィルターは、様々な孔径及び形状を有することができる。例えば、マイクロフィルターは、約5ミクロン～約20ミクロンの範囲の細孔サイズを有し得る。細孔サイズの適した範囲は、それには限定されないが、約5～7ミクロン、7～8ミクロン、8～10ミクロン、11～13ミクロン、14～16ミクロン、17～20ミクロン、5～10ミクロン、11～15ミクロン、15～20ミクロン、9～15ミクロン、16～20ミクロン、及び9～20ミクロンの範囲の細孔サイズも含む。別の適した範囲は、約5～20ミクロンの範囲の細孔サイズを含むが、7～8ミクロンの細孔を除外する。本発明のある局面では、孔径サイズは約5～10ミクロンであり；他の局面では、孔径サイズは約7～8ミクロンである。より大きな孔径サイズは、フィルター上のほとんどの白血球（WBC）汚染を排除する。マイクロフィルターの細孔はどのような形状を有していてもよく、円形、レーストラック形状、楕円形、スリット、正方形、長方形、及び／又は他の形状を含む形状が許容可能である。マイクロフィルターは、精密な細孔形状、均一な細孔分布、複数の細孔形状、及び／又は不均一な分布を有し得る。マイクロフィルターは、単層、又は異なる層に異なる形状の多層であってよい。 As an example, circulating cells (eg, CAMLs and CTCs) can be separated from biological samples using size exclusion methods, including using microfilters. Suitable microfilters can have a variety of pore sizes and shapes. For example, a microfilter can have a pore size ranging from about 5 microns to about 20 microns. Suitable ranges of pore sizes include, but are not limited to, approximately 5-7 microns, 7-8 microns, 8-10 microns, 11-13 microns, 14-16 microns, 17-20 microns, 5-10 microns. , 11-15 microns, 15-20 microns, 9-15 microns, 16-20 microns, and 9-20 microns. Another suitable range includes pore sizes ranging from about 5 to 20 microns, but excludes 7 to 8 micron pores. In some aspects of the invention, the pore size is about 5-10 microns; in other aspects, the pore size is about 7-8 microns. The larger pore size eliminates most white blood cell (WBC) contamination on the filter. The pores of the microfilter may have any shape, including circular, racetrack-shaped, oval, slit, square, rectangular, and/or other shapes are acceptable. Microfilters can have precise pore shapes, uniform pore distributions, multiple pore shapes, and/or non-uniform distributions. The microfilter may be single layer or multilayer with different shapes in different layers.
循環細胞（例えば、CAMLs及びCTCs）はまた、物理的サイズに基づく選別、スリット、チャネル、流体力学的サイズに基づく選別、グループ化、トラッピング、免疫捕獲、大きな細胞の濃縮、又はサイズに基づく小さな細胞の除外を介したマイクロ流体チップにより生体試料から分離され得る。循環細胞の捕捉効率は、収集方法に依存して異なる。異なるプラットフォームの上に捕捉され得る循環細胞のサイズも異なり得る。疾患の進行と治療反応を決定するための循環細胞サイズの使用の原理は同じであるが、統計値は変わるだろう。 CellSieve（商標）マイクロフィルターを使用した循環細胞の収集は、100％の捕捉効率と高品質の細胞を提供する。 Circulating cells (e.g. CAMLs and CTCs) can also be sorted by physical size-based sorting, slits, channels, hydrodynamic size-based sorting, grouping, trapping, immunocapture, large cell enrichment, or size-based small cell sorting. can be separated from biological samples by microfluidic chips through the exclusion of microfluidics. The efficiency of capturing circulating cells varies depending on the collection method. The size of circulating cells that can be captured on different platforms can also vary. Although the principles of using circulating cell size to determine disease progression and treatment response are the same, the statistics will vary. Collection of circulating cells using CellSieve™ microfilters provides 100% capture efficiency and high quality cells.
生体試料は、特に試料が血液である場合、採血管に収集されてもよい。CellSave血液採取管（Menarini Silicon Biosystems Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア）は、安定した細胞形態とサイズを提供する。利用可能な他の採血管は細胞の安定性を提供しないかもしれない。細胞は拡大することができ、ほとんどの他の採血管内で破裂することさえあり得る。 The biological sample may be collected in a blood collection tube, particularly if the sample is blood. CellSave blood collection tubes (Menarini Silicon Biosystems Inc., San Diego, CA) provide stable cell morphology and size. Other blood collection tubes available may not provide cell stability. Cells can expand and even burst within most other blood collection tubes.
本発明の方法でアッセイされる生体試料のサイズは、本発明の根底にある理論及び特性を変更することなく変化し得る。適した試料サイズは一般に約0.5mLから約50mLの範囲である。適したサイズは、約5から約15mL、約5から約10ｍL、約10から約15mL、約15から約20mL、約20から約25mL、約25から約30mL、約30から約35mL、約35から約40mL、約40から約45mL、及び約45から約50mLの範囲の試料を含む。本発明のある局面では、生体試料のサイズは約7.5 mLである。 The size of biological samples assayed in the methods of the invention may be varied without changing the underlying theory and characteristics of the invention. Suitable sample sizes generally range from about 0.5 mL to about 50 mL. Suitable sizes are about 5 to about 15 mL, about 5 to about 10 mL, about 10 to about 15 mL, about 15 to about 20 mL, about 20 to about 25 mL, about 25 to about 30 mL, about 30 to about 35 mL, about 35 to about Samples range from about 40 mL, about 40 to about 45 mL, and about 45 to about 50 mL. In certain aspects of the invention, the size of the biological sample is about 7.5 mL.
本発明の方法で使用される生体試料の供給源は、それがここで言及される循環細胞のタイプの１つ、例えばCAMLs及び/又はCTCsを含まなければならないという点でのみ制限される。生体試料の適した供給源は、血液、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、組織、尿、末梢血単核細胞（PBMCs）、及び凍結保存されたPBMCsを含む。生体試料が血液である場合、血液は、例えば、末梢血、肘正中静脈血、下大静脈血、大腿静脈血、門脈血、又は頸静脈血であり得る。試料は、新鮮な試料、又は適切に調製された凍結保存試料を解凍したものであってもよい。 The source of the biological sample used in the method of the invention is limited only in that it must contain one of the circulating cell types mentioned herein, such as CAMLs and/or CTCs. Suitable sources of biological samples include blood, lymph nodes, bone marrow, cerebrospinal fluid, tissue, urine, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), and cryopreserved PBMCs. When the biological sample is blood, the blood can be, for example, peripheral blood, median cubital vein blood, inferior vena cava blood, femoral vein blood, portal vein blood, or jugular vein blood. The sample may be a fresh sample or a thawed cryopreserved sample that has been appropriately prepared.
本発明のさらなる局面では、循環細胞（CAMLs）は、CellSieve（商標）低圧精密濾過アッセイを使用して生体試料から分離される。 In a further aspect of the invention, circulating cells (CAMLs) are separated from the biological sample using the CellSieve™ low pressure microfiltration assay.
がんを有する2人の被検者間で循環細胞のサイズを比較する場合、被検者が同じタイプのがんを有することが好ましい。しかし、他の要因の中で、がんの種類、がんのステージ、がんの進行速度、治療歴、及びがんの寛解及び/又は再発の履歴について、2人の被検者を完全に一致させることは難しい場合がある。したがって、本発明の関連する方法で比較されている２人の被検者のがんの特徴にはいくつかの変動がある可能性があることが理解されるべきである。
CAMLsの同定
When comparing the size of circulating cells between two subjects with cancer, it is preferred that the subjects have the same type of cancer. However, we did not fully evaluate the two subjects regarding cancer type, cancer stage, rate of cancer progression, treatment history, and history of cancer remission and/or recurrence, among other factors. Matching can be difficult. Therefore, it should be understood that there may be some variation in the cancer characteristics of the two subjects being compared in the associated methods of the invention.
Identification of CAMLs
上記示したように、本発明の様々な実施態様及び局面は、がんを有する被検者から得られた試料中のCMALsのサイズ又は数を決定することに基づいている。試料中のCAMLsを同定するための具体的な手段は前述したとおりであり、以下を含む：（i）細胞内の核のサイズ、形状、及び数の決定；（ii）全体の細胞サイズの決定；（iii）細胞の形態学的形状の決定；及び（iv）図9に示されるマーカーの１つ以上の使用。 As indicated above, various embodiments and aspects of the invention are based on determining the size or number of CMALs in a sample obtained from a subject with cancer. Specific means for identifying CAMLs in a sample are as described above and include: (i) determining the size, shape, and number of nuclei within the cell; (ii) determining the overall cell size. (iii) determining the morphological shape of the cells; and (iv) using one or more of the markers shown in Figure 9.
しかし、本発明の実施態様及び局面のそれぞれは、生体試料中の循環細胞をそれ自体CAMLsとして明確に特定することなく実施できることを明確にすべきである。代わりに、例えば、単に細胞のサイズに基づいて細胞を特定することが使用されてもよい。他の手法の例としては、H＆E染色などのカラーメトリック染色の使用や、生体試料内又は生体試料から収集されたCK（+）細胞の単純な同定などがある。
被検者
However, it should be clear that each of the embodiments and aspects of the invention can be practiced without explicitly identifying circulating cells in a biological sample as CAMLs per se. Alternatively, for example, identifying cells solely based on cell size may be used. Examples of other techniques include the use of colorimetric stains such as H&E staining and the simple identification of CK(+) cells within or collected from biological samples.
Subject
発明の方法で言及される被検者は、ヒト、ヒト以外の霊長類、鳥、馬、牛、山羊、羊、犬、猫、げっ歯類などの伴侶動物、又は他の哺乳動物であろう。動物もがんを発症することがある。がんは10歳を超えるペットの死因のほぼ50％を占める。ペットに見られる幾つかの一般的な種類のがんは、皮膚がん、乳がん、頭頸部がん、リンパ腫、白血病、精巣がん、腹部がん、及び骨のがんを含む。ペットに一般に見られるが、人間にも一般に見られるがんの例は、リンパ腫、黒色腫、及び骨肉腫である。CAMLsは人間以外の動物に見られる。したがって、ヒトでのCAMLsの臨床的有用性は他の動物にも適用できる。 The subjects referred to in the method of the invention may be humans, non-human primates, companion animals such as birds, horses, cows, goats, sheep, dogs, cats, rodents, or other mammals. . Animals can also develop cancer. Cancer accounts for nearly 50% of deaths in pets over the age of 10. Some common types of cancer found in pets include skin cancer, breast cancer, head and neck cancer, lymphoma, leukemia, testicular cancer, abdominal cancer, and bone cancer. Examples of cancers commonly seen in pets, but also commonly seen in humans, are lymphoma, melanoma, and osteosarcoma. CAMLs are found in animals other than humans. Therefore, the clinical utility of CAMLs in humans can also be applied to other animals.
本発明の様々な局面及び実施態様では、被検者は、がんを有する被検者である。がんは固形腫瘍、ステージIがん、ステージIIがん、ステージIII癌、ステージIVがん、細胞腫、肉腫、神経芽細胞腫、黒色腫、上皮細胞がん、乳がん、前立腺がん、肺がん、膵臓がん、大腸がん、肝臓がん、頭頸部がん、腎臓がん、卵巣がん、食道がん、又は他の固形腫瘍がんであり得る。当業者は、本発明の方法が特定の形態又はタイプのがんに限定されないこと、及び多種多様ながんに関連して実施され得ることを完全に理解するであろう。
治療
In various aspects and embodiments of the invention, the subject is a subject with cancer. Cancers include solid tumors, stage I cancer, stage II cancer, stage III cancer, stage IV cancer, cell carcinoma, sarcoma, neuroblastoma, melanoma, epithelial cell carcinoma, breast cancer, prostate cancer, and lung cancer. , pancreatic cancer, colon cancer, liver cancer, head and neck cancer, kidney cancer, ovarian cancer, esophageal cancer, or other solid tumor cancers. Those skilled in the art will fully appreciate that the methods of the invention are not limited to any particular form or type of cancer, and can be practiced in connection with a wide variety of cancers.
treatment
本発明のある局面及び実施態様では、被検者は治療を受けている。治療は、化学療法、単一薬物、薬物の組み合わせ、免疫療法、放射線療法、化学放射線療法、単一又は複数の薬物と組み合わせた放射線、単一又は複数の薬物と組み合わせた化学放射線療法、がんワクチン、及び細胞療法の１つ以上であってよい。 In certain aspects and embodiments of the invention, the subject is undergoing treatment. Treatments include chemotherapy, single drugs, combinations of drugs, immunotherapy, radiotherapy, chemoradiotherapy, radiation in combination with single or multiple drugs, chemoradiotherapy in combination with single or multiple drugs, cancer It may be one or more of a vaccine, and a cell therapy.
がんワクチンは、ワクチン標的として意図されたマーカーを発現する細胞の形態で被検者に投与することができる。細胞は、がん細胞、改変ウイルス及び他のタイプの改変細胞の形態であり得る。被検者がワクチンを受けた後、体の免疫システムは、がん細胞と共に、ワクチンによって発現される抗原を認識して攻撃するT細胞を生産する。治療ががんワクチンである場合、被検者は少なくとも１つのHLA対立遺伝子を発現する可能性がある。 Cancer vaccines can be administered to a subject in the form of cells expressing markers intended as vaccine targets. The cells can be in the form of cancer cells, modified viruses and other types of modified cells. After a subject receives a vaccine, the body's immune system produces T cells that recognize and attack antigens expressed by the vaccine, along with cancer cells. If the treatment is a cancer vaccine, the subject is likely to express at least one HLA allele.
CAMLサイズは、依然としてがんの病原性を予測するものである。追加情報はCAMLの数から得ることができる。免疫システムは、最大のがん部位よりも、小さな転移部位から、より速くがんを排除できる可能性がある。免疫系のキラーT細胞は、他の臓器よりもいくつかの臓器の腫瘍に浸入しやすい場合がある。たとえば、免疫療法は、典型的には、肺がんと黒色腫に最適に機能するが、乳がんと前立腺がんにはあまり良く機能しない。しばしば、免疫細胞が腫瘍に侵入して腫瘍細胞を殺すため、腫瘍が大きくなると偽の進行が見られる。良好な免疫療法の治療反応の指標における疑似進行である。 CAML size remains predictive of cancer pathogenicity. Additional information can be obtained from the CAML numbers. The immune system may be able to eliminate cancer more quickly from small metastatic sites than from the largest cancer sites. The immune system's killer T cells may be more likely to invade tumors in some organs than others. For example, immunotherapy typically works best for lung cancer and melanoma, but less well for breast cancer and prostate cancer. False progression is often seen as the tumor grows because immune cells invade the tumor and kill the tumor cells. Pseudoprogression is an indicator of a good immunotherapy treatment response.
がんワクチンの例はSV-BR-1-GMである。それは、HER2、PRAMEならびにクラスI及びクラスII HLA抗原を発現するGM-CSF操作された乳がん細胞株である。黄熱ウイルス（YFV）ペプチドをロードしたSV-BR-1-GM細胞は、YFV特異的CD4+T細胞を直接活性化した。 An example of a cancer vaccine is SV-BR-1-GM. It is a GM-CSF engineered breast cancer cell line that expresses HER2, PRAME and class I and class II HLA antigens. SV-BR-1-GM cells loaded with yellow fever virus (YFV) peptides directly activated YFV-specific CD4+ T cells.
このSV-BR-1-GMワクチンの反応者は、少なくとも１つのHLA対立遺伝子を発現する乳がん患者であると予測されている。
発明の方法
Responders to this SV-BR-1-GM vaccine are predicted to be breast cancer patients who express at least one HLA allele.
method of invention
上記の要約に説明されているように、本発明は、とりわけ、循環細胞の数及び／又はサイズに基づいて、被検者における治療反応及び／又は疾患進行（例えば、がんの進行）を予測する方法に向けられている。これらの方法は、がんを有する被検者などの被検者からの生体試料中の循環細胞の数及び/又はサイズを決定すること、ならびにいくつかの局面及び実施態様では、異なる時点で同じ被検者から採取された試料からの結果を比較することを含む。アッセイされる循環細胞のサイズ又は数の変化は、被検者における治療反応及び／又は疾患進行の指標であり、予測はそれに基づくことができる。 As described in the Summary above, the present invention provides, among other things, the ability to predict treatment response and/or disease progression (e.g., cancer progression) in a subject based on the number and/or size of circulating cells. It is directed towards how to do. These methods involve determining the number and/or size of circulating cells in a biological sample from a subject, such as a subject with cancer, and in some aspects and embodiments, determining the number and/or size of circulating cells at different time points. Involves comparing results from samples taken from a subject. Changes in the size or number of circulating cells that are assayed are indicative of treatment response and/or disease progression in the subject, and predictions can be based thereon.
本発明の具体的な実施態様及び局面は、以下の段落に提示されている。しかし、本発明の方法が被検者における治療反応の予測に関連している場合、治療反応情報を得るための時間スケールは、治療の種類に依存するが、一般に2治療サイクル又は60日と短い場合があることにまず注目できる。治療反応は、治療の種類に依存するが、１つの治療サイクル後、又はわずか10日でも見られることは明らかであろう。 Specific embodiments and aspects of the invention are presented in the following paragraphs. However, when the methods of the invention are concerned with predicting treatment response in a subject, the time scale for obtaining treatment response information depends on the type of treatment, but is generally as short as 2 treatment cycles or 60 days. First, we can note that there are cases. It will be clear that therapeutic responses can be seen after one treatment cycle or even as little as 10 days, depending on the type of treatment.
ここで、CAMLのサイズ及び数、ならびにCAMLのサイズ及び数の変化を他のパラメーターと共に分析することによって、治療反応及び/又は疾患進行の正しい決定の確率を改善できることにも注目することができる。そのようなパラメーターは以下を含む：
1.良い治療反応、例えば：
・CTCsの消失
・最初非常に高いときのCTC数の減少
・循環腫瘍DNA（ctDNA）の減少
2.悪い治療反応、例えば：
・CTC数の増加[3]
・有糸***におけるCTCsの出現[7]
・クラスタ内のCTCsの出現
・ctDNA量の増加
・ctDNAの変異の増加
・CAML DNAの変異の増加
It may also be noted here that by analyzing the size and number of CAMLs and changes in the size and number of CAMLs together with other parameters, the probability of correct determination of treatment response and/or disease progression can be improved. Such parameters include:
1. Good therapeutic response, e.g.:
・Disappearance of CTCs ・Decrease in CTC number when initially very high ・Decrease in circulating tumor DNA (ctDNA)
2. Bad treatment response, e.g.:
・Increase in the number of CTCs [3]
・Appearance of CTCs in mitosis [7]
・Appearance of CTCs in clusters ・Increase in ctDNA amount ・Increase in ctDNA mutations ・Increase in CAML DNA mutations
さらに、CAMLのサイズ及び数、ならびにCAMLのサイズ及び数の変化は、画像診断が予後情報を提供できるようになる前に、治療反応及び/又は疾患進行の予測を提供することができる。画像診断は、疾患の進行において違いが分かるように腫瘍が実質的に成長している必要がある。CT画像診断はまた、がんを引き起こす可能性がある望ましくない放射線照射量を生成し、また30～45日間隔では望ましくない。最後に、画像診断は高価である。 Furthermore, the size and number of CAML, and changes in the size and number of CAML, can provide prediction of treatment response and/or disease progression before diagnostic imaging can provide prognostic information. Imaging requires substantial tumor growth to show differences in disease progression. CT imaging also produces undesirable radiation doses that can cause cancer, and is also undesirable at 30-45 day intervals. Finally, diagnostic imaging is expensive.
CTCsの数の増加は、疾患の進行に関する予測の基礎を形成することが知られている。しかし、それ自体、ステージIVの乳がん、前立腺がん、及び大腸がんに応用できるだけである。CTCsは、がん及び他のタイプの固形腫瘍の初期ステージではまれである。
循環細胞サイズの決定
An increase in the number of CTCs is known to form the basis of prediction regarding disease progression. However, as such, it is only applicable to stage IV breast cancer, prostate cancer, and colorectal cancer. CTCs are rare in the early stages of cancer and other types of solid tumors.
Determination of circulating cell size
1つの実施態様において、本発明の方法は、がんを有する被検者から経時的に得られた2つ以上の生体試料における、CAMLsなどの循環細胞のサイズを決定することを含み、ここで、試料間に循環細胞のサイズの減少が経時的に見られる場合、がんは進行しないと予測され、及び/又は被検者は治療に反応していることが分かる。関連する実施態様において、本発明の方法は、がんを有する被検者から経時的に得られた2つ以上の生体試料における、CAMLsなどの循環細胞の数を決定することを含み、ここで試料間の循環細胞の数の減少が経時的に見られる場合、がんが進行しないと予測され、及び/又は被検者が治療に反応していると分かる。 In one embodiment, the method of the invention comprises determining the size of circulating cells, such as CAMLs, in two or more biological samples obtained over time from a subject with cancer, wherein , if a decrease in the size of circulating cells is seen over time between samples, it is predicted that the cancer will not progress and/or that the subject is responding to treatment. In a related embodiment, the method of the invention comprises determining the number of circulating cells, such as CAMLs, in two or more biological samples obtained over time from a subject with cancer, wherein If a decrease in the number of circulating cells between samples is seen over time, it is predicted that the cancer will not progress and/or that the subject is responding to treatment.
関連する局面では、この方法は、がんを有する被検者から得られた、第1及び第2の生体試料、ならびに任意の追加の生体試料におけるCAMLsなどの循環細胞のサイズを決定することを含み、ここで、第1の試料は、がん治療前又はがん治療中の被検者から得られ、第2及び任意の追加の試料は、少なくとも1つのがん治療後に被検者から得られ、第1の試料中の少なくとも1つの細胞のサイズが約50μm以上であり、そして第2の及び任意の追加の試料の各細胞のサイズが約50μm未満である場合、がんが進行しないと予測され、及び/又は被検者が治療に反応していると分かる。 In a related aspect, the method provides for determining the size of circulating cells, such as CAMLs, in the first and second biological samples, as well as any additional biological samples obtained from a subject with cancer. comprising, wherein the first sample is obtained from the subject before or during cancer treatment, and the second and any additional sample is obtained from the subject after at least one cancer treatment. and the size of at least one cell in the first sample is greater than or equal to about 50 μm, and the size of each cell in the second and any additional samples is less than about 50 μm, then the cancer does not progress. predicted and/or found that the subject is responding to treatment.
別の関連する局面では、この方法は、がんを有する被検者から得られた、第1及び第2の生体試料、ならびに任意の追加の生体試料におけるCAMLsなどの循環細胞の平均サイズを決定することを含み、ここで第1の試料はがん治療の前又は治療中の被検者から得られ、第2及び任意の追加の試料は、少なくとも１つのがん治療後に被検者から得られ、第2及び任意の追加の試料における循環細胞の平均サイズが、第1の試料の細胞の平均サイズより減少している場合、被検者は治療に反応していると特定される。ある局面では、第1の試料中の循環細胞の平均サイズは、約50μm以上である。
がんの進行の予測
In another related aspect, the method determines the average size of circulating cells, such as CAMLs, in the first and second biological samples, as well as any additional biological samples, obtained from a subject with cancer. wherein the first sample is obtained from the subject before or during cancer treatment, and the second and any additional sample is obtained from the subject after at least one cancer treatment. and the average size of circulating cells in the second and any additional samples is decreased from the average size of cells in the first sample, the subject is identified as responding to the treatment. In certain aspects, the average size of circulating cells in the first sample is about 50 μm or greater.
Prediction of cancer progression
別の実施態様において、本発明は、がんを有する被検者から得られた生体試料中のCAMLsなどの循環細胞のサイズを決定すること、及びそれに基づいて予測することを含む、がんを有する被検者におけるがんの進行を予測する方法に向けられており、ここで、試料中の各循環細胞のサイズが約50μm未満の場合、がんは進行しないと予測され、また試料中の少なくとも１つの循環細胞のサイズが約50μm以上の場合、がんは進行すると予測される。 In another embodiment, the present invention provides a method for determining the size of circulating cells, such as CAMLs, in a biological sample obtained from a subject with cancer, and predicting based thereon. The present invention is directed to a method for predicting cancer progression in subjects with The cancer is predicted to progress if at least one circulating cell is greater than or equal to about 50 μm in size.
この実施態様の一局面では、本発明は、がんを有する被検者から得られた第1及び第2の生体試料、ならびに任意の追加の生体試料中のCAMLsなどの循環細胞のサイズを決定することを含む、がんを有する被検者におけるがんの進行を予測する方法に向けられており、
第1の試料はがん治療前又はがん治療中に被検者から得られ、第2の試料及び任意の追加の試料は少なくとも1つのがん治療後に被検者から得られ、
第2及び任意の追加の試料のCAMLsの平均サイズが第1の試料のCAMLsの平均サイズと比較して減少している場合、がんは被検者の中で進行しないと予測され、被検者は治療に反応していると任意に特定され；又は
第2と任意の追加の試料のCAMLsの平均サイズが第1の試料のCAMLsの平均サイズと比較して維持され又は増加している場合、がんは被検者の中で進行すると予測され、被検者は治療に反応していないと任意に特定され;又は
第1の試料の少なくとも1つのCAMLのサイズが約50μm以上で、第2及び任意の追加の試料の各細胞のサイズが約50μm未満の場合、がんは進行しないと予測され、被検者は治療に反応していると任意に特定され；又は
第1の試料の各CAMLのサイズが約50μm未満であり、かつ第2及び任意の追加の試料の少なくとも１つのCAMLのサイズが約50μmより大きい場合、がんは進行すると予測され、被検者は治療に反応していないと任意に特定される。ある局面では、第1の試料中の循環細胞の平均サイズは、約50μm以上である。
In one aspect of this embodiment, the invention determines the size of circulating cells, such as CAMLs, in first and second biological samples obtained from a subject with cancer, as well as in any additional biological samples. The present invention is directed to a method of predicting cancer progression in a subject having cancer, including
the first sample is obtained from the subject before or during cancer treatment, the second sample and any additional samples are obtained from the subject after at least one cancer treatment;
If the average size of CAMLs in the second and any additional samples is decreased compared to the average size of CAMLs in the first sample, the cancer is predicted not to progress in the subject and or the average size of the CAMLs in the second and any additional samples is maintained or increased compared to the average size of the CAMLs in the first sample. , the cancer is predicted to progress in the subject, the subject is arbitrarily identified as not responding to treatment; or the size of at least one CAML in the first sample is approximately 50 μm or greater; 2 and any additional sample, the cancer is predicted not to progress and the subject is arbitrarily identified as responding to treatment if the size of each cell in the first sample is less than about 50 μm; or If the size of each CAML is less than about 50 μm and the size of at least one CAML in the second and any additional samples is greater than about 50 μm, the cancer is predicted to progress and the subject will not respond to treatment. be arbitrarily specified. In certain aspects, the average size of circulating cells in the first sample is about 50 μm or greater.
この実施態様の別の局面では、本発明は、がんを有する被検者から得られた第1及び第2の生体試料、ならびに任意の追加の生体試料中のCAMLsなどの循環細胞の数を決定することを含む、がんを有する被検者のがんの進行を予測する方法に向けられており、ここで、第1の試料はがん治療前又はがん治療中に被検者から得られ、第2の試料及び任意の追加の試料は、少なくとも1つのがん治療後に被検者から得られ、第2及び任意の追加の試料の循環細胞の数が、第1の試料の循環細胞の数と比較して減少している場合、がんは進行しないと予測され、被検者は治療に反応すると任意に特定され、また、第2及び任意の追加の試料の循環細胞の数が、第1の試料の循環細胞の数と比べて維持され又は増加している場合、がんは進行すると予測され、被検者は治療に反応していないと任意に特定される。
治療反応の予測
In another aspect of this embodiment, the invention provides methods for determining the number of circulating cells, such as CAMLs, in the first and second biological samples obtained from a subject with cancer, as well as in any additional biological samples. A first sample is directed to a method for predicting cancer progression in a subject having cancer, comprising determining a first sample from a subject before or during cancer treatment. obtained, the second sample and any additional sample are obtained from the subject after at least one cancer treatment, and the number of circulating cells in the second and any additional sample is the same as that of the first sample. The cancer is predicted not to progress and the subject is arbitrarily identified as responding to treatment if the number of circulating cells in the second and any additional samples is decreased compared to the number of circulating cells in the sample. is maintained or increased compared to the number of circulating cells in the first sample, then the cancer is predicted to progress and the subject is optionally identified as not responding to treatment.
Prediction of treatment response
さらなる実施態様では、本発明は、被検者から得られた生体試料中のCAMLsなどの循環細胞のサイズを決定すること、及びそれに基づいて予測することを含む、がんを有する被検者の治療に対する反応を予測する方法に向けられており、ここで、試料中の各循環細胞のサイズが約50μm未満の場合、被検者は治療に反応すると予測され、試料中の少なくとも1つの循環細胞のサイズが約50μm以上の場合、被検者は治療に反応しないと予測される。 In a further embodiment, the present invention provides methods for determining the size of circulating cells, such as CAMLs, in a biological sample obtained from the subject, and predicting based thereon. A subject is predicted to respond to a treatment if each circulating cell in the sample is less than about 50 μm in size; is approximately 50 μm or greater in size, the subject is predicted to not respond to treatment.
この実施態様の一局面では、本発明は、がんを有する被検者から得られた第1及び第2の生体試料、ならびに任意の追加の生体試料における、CAMLsなどの循環細胞のサイズを決定することを含む、がんを有する被検者の治療に対する反応を予測する方法に向けられており、第1の試料はがん治療前又はがん治療中に被検者から得られ、第2及び任意の追加の試料は少なくとも1つのがん治療後に被検者から得られ、
第2及び任意の追加の試料におけるCAMLsの平均サイズが、第1の試料におけるCAMLsの平均サイズと比較して減少している場合、被検者は治療に反応すると予測され；
第2及び任意の追加の試料におけるCAMLsの平均サイズが、第1の試料におけるCAMLsの平均サイズと比較して維持され又は増加している場合、被検者は治療に反応しないと予測され；
サイズが約50μmを超える循環細胞の数が第1の試料から第2及び任意の追加の試料で維持され又は増加している場合、被検者は治療に反応しないと予測され；又は
サイズが約50μmを超える循環細胞の数が第1の試料から第2及び任意の追加の試料で減少する場合、被検者は治療に反応すると予測され；又は
第2又は後続の試料の各循環細胞のサイズが第1の試料と比較して減少し、また第2又は任意の追加試料の各循環細胞のサイズが約50μm未満の場合、被検者は治療に反応すると予測され、がんの治癒の可能性がある。
In one aspect of this embodiment, the invention provides methods for determining the size of circulating cells, such as CAMLs, in first and second biological samples obtained from a subject with cancer, as well as in any additional biological samples. A first sample is obtained from the subject before or during cancer treatment, a second sample is obtained from the subject before or during cancer treatment, and a second sample is obtained from the subject before or during cancer treatment; and any additional sample obtained from the subject after at least one cancer treatment;
A subject is predicted to respond to treatment if the average size of CAMLs in the second and any additional samples is decreased compared to the average size of CAMLs in the first sample;
The subject is predicted not to respond to treatment if the average size of the CAMLs in the second and any additional samples is maintained or increased compared to the average size of the CAMLs in the first sample;
A subject is predicted to not respond to treatment if the number of circulating cells greater than about 50 μm in size is maintained or increased from the first sample to the second and any additional samples; or A subject is predicted to respond to treatment if the number of circulating cells greater than 50 μm decreases from the first sample to the second and any additional samples; or the size of each circulating cell in the second or subsequent sample. is decreased compared to the first sample, and if the size of each circulating cell in the second or any additional sample is less than approximately 50 μm, the subject is predicted to respond to treatment and the cancer is likely to be cured. There is sex.
この実施態様の別の局面では、本発明は、被検者から得られた生体試料中に約50μmを超えるCAMLsなどの循環細胞が存在しないことを決定すること、及び被検者が治療に反応していると予測することを含む、がんを有する被検者の治療に対する反応を予測する方法に向けられている。 In another aspect of this embodiment, the invention provides a method for determining the absence of circulating cells, such as CAMLs, larger than about 50 μm in a biological sample obtained from a subject, and for determining that the subject responds to treatment. The present invention is directed to a method of predicting response to treatment in a subject with cancer, including predicting that the patient will have cancer.
この実施態様のさらなる局面において、本発明は、がんを有する被検者から得られた生体試料中のCAMLsなどの循環細胞のサイズを決定することを含む、がんを有する被検者の治療に対する反応を予測する方法に向けられており、ここで、試料は少なくとも1つのがん治療後に被検者から得られ、各循環細胞のサイズが約50μm以下である場合、被検者は治療に反応すると予測される。 In a further aspect of this embodiment, the invention provides a method for treating a subject with cancer comprising determining the size of circulating cells, such as CAMLs, in a biological sample obtained from the subject with cancer. is directed to a method for predicting response to treatment, where the sample is obtained from a subject after at least one cancer treatment, and if each circulating cell is approximately 50 μm or less in size, then the subject is eligible for treatment. expected to respond.
この実施態様の追加の局面では、本発明は、がんを有する被検者から得られた第1及び第2の生体試料、並びに任意の追加の生体試料中のCAMLsなどの循環細胞の数を決定することを含む、がんを有する被検者の治療に対する反応を予測する方法に向けられており、ここで、第1の試料はがん治療の前又は治療中に被検者から得られ、第2及び任意の追加の試料は少なくとも1つのがん治療後に被検者から得られ、循環細胞の数が第1から第２及び任意の追加試料で減少する場合、被検者は治療に反応すると予測され、循環細胞の数が第1から第2及び任意の追加試料で維持され又は増加する場合、被検者は治療に反応しないと予測される。
治療に対する耐性の予測
In an additional aspect of this embodiment, the invention provides methods for determining the number of circulating cells, such as CAMLs, in the first and second biological samples obtained from a subject with cancer, as well as in any additional biological samples. A first sample obtained from a subject before or during cancer treatment is directed to a method of predicting response to treatment in a subject having cancer, comprising determining , the second and any additional samples are obtained from the subject after at least one cancer treatment, and if the number of circulating cells decreases from the first to the second and any additional samples, the subject is eligible for treatment. A subject is predicted to respond and not respond to treatment if the number of circulating cells is maintained or increases from the first to the second and any additional samples.
Prediction of resistance to treatment
最後の実施態様において、本発明は、肺がんを有する被検者における治療に対する耐性を予測する方法に向けられており、その方法は、がんを有する被検者からの生体試料中のCAMLsなどの循環細胞のサイズを決定することを含み、ここで前記試料中の少なくとも1つの細胞のサイズが約50μm以上である場合、被検者は、細胞のサイズが約50μmを超える細胞のないがんを有する被検者よりもがん治療に対してより耐性であると予測される。この実施態様のある局面において、がんは肺がんである。 In a final embodiment, the present invention is directed to a method of predicting resistance to treatment in a subject with lung cancer, the method comprising: determining the size of circulating cells, where the size of at least one cell in said sample is greater than or equal to about 50 μm, the subject has a cell-free cancer in which the cells are greater than about 50 μm in size; are predicted to be more resistant to cancer treatment than subjects with cancer. In certain aspects of this embodiment, the cancer is lung cancer.
本発明のこれらの実施態様及び局面のそれぞれにおいて、治療の終わりに生体試料中に循環細胞が見られない場合、がんが除去されたと結論付けることができる。治療の最後に生体試料に循環細胞がまだ見つかっている場合、患者のがんは除去されておらず、患者には残存疾患があると結論付けることができる。 In each of these embodiments and aspects of the invention, it can be concluded that the cancer has been eliminated if no circulating cells are seen in the biological sample at the end of treatment. If circulating cells are still found in the biological sample at the end of treatment, it can be concluded that the patient's cancer has not been removed and that the patient has residual disease.
本発明の実施態様及び局面のそれぞれにおいて、CAMLsは、がんマーカーとして独立して、又は循環腫瘍細胞（CTCs）、上皮間葉転換細胞（EMTs）、及び循環がん関連血管内皮細胞（CAVEs）などの他の循環細胞や、遊離DNA（cfDNA）、循環腫瘍DNA（ctDNA）、メチル化DNA、プロテオミクスの、メタボロームの、リピドミックな、及びその他のバイオマーカーと組み合わせて使用されることができ、患者の疾患のより完全な理解を提供する。CAMLsは、ここで言及されている循環細胞のグループの中で、典型的にはサイズが30μmより大きい唯一の細胞型である。
治療方法
In each of the embodiments and aspects of the invention, CAMLs are used independently as cancer markers or in circulating tumor cells (CTCs), epithelial-mesenchymal transition cells (EMTs), and circulating cancer-associated vascular endothelial cells (CAVEs). It can be used in combination with other circulating cell, free DNA (cfDNA), circulating tumor DNA (ctDNA), methylated DNA, proteomic, metabolomic, lipidomic, and other biomarkers, such as patient provide a more complete understanding of the disease. CAMLs are the only cell type among the group of circulating cells mentioned here that are typically larger than 30 μm in size.
Method of treatment
上記で要約したように、本発明はまた、治療決定が、上記の方法における循環細胞を使用した治療反応の予測に基づくことができる、がんの治療方法に向けられている。 As summarized above, the present invention is also directed to a method of treating cancer, in which therapeutic decisions can be based on prediction of therapeutic response using circulating cells in the above method.
したがって、本発明は、がんを有する被検者に治療有効量のがん治療を投与すること、及びがんを有する被検者から得られた2つ以上の生体試料の中の、CAMLsなどの循環細胞のサイズを決定することを含む、がんを有する被検者を治療する方法を包含し、ここで、第1の生体試料はがん治療の前又は治療中に被検者から得られ、第2の生体試料はがん治療中又は後に被検者から得られ、その試料間に循環細胞のサイズの減少が経時的に見られる場合、被検者が治療に反応していることが分かり、治療が継続され、また試料間の循環細胞のサイズの減少が経時的に見られない場合、被検者は治療に反応していないことが分かり、治療は継続されない。 Accordingly, the present invention provides for administering a therapeutically effective amount of a cancer treatment to a subject with cancer, and for administering a therapeutically effective amount of a cancer treatment, such as CAMLs, etc., in two or more biological samples obtained from the subject with cancer. a method of treating a subject having cancer, the first biological sample being obtained from the subject before or during cancer treatment; If a second biological sample is obtained from the subject during or after cancer treatment and a decrease in the size of circulating cells is observed over time between the samples, the subject is responding to treatment. is found, treatment is continued, and if there is no decrease in the size of circulating cells between samples over time, then the subject is known not to be responding to treatment and treatment is not continued.
関連する実施態様において、本発明の方法は、がんを有する被検者に治療有効量のがん治療を投与すること、及びがんを有する被検者から得られた2つ以上の生体試料中のCAMLsなどの循環細胞の数を決定することを含み、ここで第1の生体試料は、がん治療の前又は治療中に被検者から得られ、第2の生体試料は、がん治療中又は治療後に被検者から得られ、試料間の循環細胞の数の減少が経時的に見られる場合、被検者は治療に反応していることが分かり、治療が継続され、試料間の循環細胞数の減少が経時的に見られない場合、被検者は治療に反応していないことが分かり、治療は継続されない。 In a related embodiment, a method of the invention comprises administering to a subject with cancer a therapeutically effective amount of a cancer treatment, and administering two or more biological samples obtained from the subject with cancer. determining the number of circulating cells such as CAMLs in a patient, where a first biological sample is obtained from a subject before or during cancer treatment, and a second biological sample is obtained from a cancer patient. If a decrease in the number of circulating cells between samples obtained from a subject during or after treatment is observed over time, the subject is known to be responding to the treatment and treatment is continued and the number of circulating cells between samples is reduced over time. If there is no decrease in the number of circulating cells over time, the subject is known to be unresponsive to treatment and treatment is not continued.
この実施態様の一局面では、この方法は、がんを有する被検者に治療有効量のがん治療を投与すること、及び被検者から得られた第1及び第2の生体試料、ならびに任意の追加の生体試料中のCAMLsなどの循環細胞のサイズを決定することを含み、ここで第1の試料はがん治療の前又は治療中に被検者から得られ、第2及び任意の追加の試料は少なくとも1つのがん治療後に被検者から得られ、第1の試料の少なくとも1つの細胞のサイズが約50μm以上であり、かつ第2の試料と任意の追加試料の各細胞のサイズが約50μm未満の場合、被検者は治療に反応していることが分かり、治療が継続される。 In one aspect of this embodiment, the method includes administering to a subject having cancer a therapeutically effective amount of a cancer treatment, and first and second biological samples obtained from the subject; determining the size of circulating cells such as CAMLs in any additional biological sample, where the first sample is obtained from the subject before or during cancer treatment, the second and any The additional sample is obtained from the subject after at least one cancer treatment, and at least one cell in the first sample is about 50 μm or larger in size, and each cell in the second sample and any additional sample is If the size is less than about 50 μm, the subject is known to be responding to treatment and treatment is continued.
別の関連する態様では、この方法は、がんを有する被検者に治療有効量のがん治療を投与すること、及び被検者から得られた第1及び第2の生体試料、ならびに任意の追加の生体試料中のCAMLsなどの循環細胞の平均サイズを決定することを含み、ここで最初の試料はがん治療の前又は治療中に被検者から得られ、第2及び任意の追加の試料は少なくとも1つのがん治療後に被検者から得られ、第2と任意の追加の試料中の循環細胞の平均サイズが、第1の試料の細胞の平均サイズと比較して減少している場合、被検者は治療に反応していると特定され、治療が継続され、第2と任意の追加試料中の循環細胞の平均サイズが、第1の試料の細胞の平均サイズと比較して減少していない場合、被検者は治療に反応しないと特定され、治療は継続されない。幾つかの局面では、第1の試料中の循環細胞の平均サイズは約50μm以上である。 In another related aspect, the method comprises administering to a subject having cancer a therapeutically effective amount of a cancer treatment, and first and second biological samples obtained from the subject, and an optional determining the average size of circulating cells such as CAMLs in additional biological samples, where the first sample is obtained from the subject before or during cancer treatment, the second and any additional the sample is obtained from the subject after at least one cancer treatment, and the average size of the circulating cells in the second and any additional samples is decreased compared to the average size of the cells in the first sample. If the subject is identified as responding to treatment, treatment is continued and the average size of circulating cells in the second and any additional samples is compared to the average size of cells in the first sample. If the amount is not decreasing, the subject is identified as not responding to treatment and treatment is not continued. In some aspects, the average size of circulating cells in the first sample is about 50 μm or greater.
別の実施態様において、本発明は、治療有効量のがん治療をがんを有する被検者に投与すること、及び被検者から得られた第1及び第2の生体試料、ならびに任意の追加の生体試料中のCAMLsなどの循環細胞のサイズを決定することを含む、がんを有する被検者の治療方法に向けられており、ここで第1の試料はがん治療の前又は治療中に被検者から得られ、第2及び任意の追加の試料は少なくとも1つのがん治療後に被検者から得られ、
第2及び任意の追加の試料におけるCAMLsの平均サイズが、第1の試料におけるCAMLsの平均サイズと比較して減少している場合、被検者は治療に反応すると予測され、治療が継続され；
第2及び任意の追加の試料におけるCAMLsの平均サイズが、第1の試料におけるCAMLsの平均サイズと比較して維持され又は増加している場合、被検者は治療に反応しないと予測され、治療は継続されず；
第1から第2の試料及び任意の追加の試料で、サイズが約50μmを超える循環細胞の数が維持され又は増加する場合、被検者は治療に反応しないと予測され、治療は継続されず；
第1から第2の試料及び任意の追加の試料で、サイズが約50μmを超える循環細胞の数が減少する場合、被検者は治療に反応すると予測され、治療が継続され；又は
第2又は後続の試料の各循環細胞のサイズが第1の試料と比較して減少し、かつ第2又は任意の追加試料の各循環細胞のサイズが約50μm未満の場合、被検者は治療に反応すると予測され、治療は継続される。
In another embodiment, the invention provides for administering a therapeutically effective amount of a cancer treatment to a subject having cancer, and first and second biological samples obtained from the subject, and any The present invention is directed to a method of treating a subject with cancer comprising determining the size of circulating cells, such as CAMLs, in an additional biological sample, wherein the first sample is taken before or after cancer treatment. a second and any additional sample obtained from the subject after at least one cancer treatment;
If the average size of CAMLs in the second and any additional samples is decreased compared to the average size of CAMLs in the first sample, the subject is predicted to respond to treatment and treatment is continued;
If the average size of CAMLs in the second and any additional samples is maintained or increased compared to the average size of CAMLs in the first sample, the subject is predicted to be unresponsive to treatment; is not continued;
If the number of circulating cells greater than approximately 50 μm in size is maintained or increased in the first to second samples and any additional samples, the subject is predicted not to respond to treatment and treatment will not be continued. ;
If the number of circulating cells greater than about 50 μm in size decreases from the first to the second sample and any additional samples, the subject is predicted to respond to treatment and treatment is continued; or The subject responds to treatment if the size of each circulating cell in the subsequent sample is decreased compared to the first sample, and the size of each circulating cell in the second or any additional sample is less than about 50 μm. predicted and treatment continued.
この実施態様の一局面では、本発明は、治療有効量のがん治療をがんを有する被検者に投与すること、及び被検者から得られた生体試料に約50μmより大きいCAMLsなどのどのような循環細胞も存在しないこと決定することを含む、がんを有する被検者の治療方法に向けられており、ここで、試料は少なくとも1つのがん治療後に被検者から得られ、生体試料中に約50μmより大きいどのような循環細胞も存在しない場合、被検者は治療に反応すると予測され、治療が継続される。 In one aspect of this embodiment, the invention provides a method for administering a therapeutically effective amount of a cancer treatment to a subject having cancer, and injecting into a biological sample obtained from the subject CAMLs, such as CAMLs larger than about 50 μm. is directed to a method of treating a subject having cancer comprising determining the absence of any circulating cells, wherein the sample is obtained from the subject after at least one cancer treatment; If there are no circulating cells larger than about 50 μm in the biological sample, the subject is predicted to respond to treatment and treatment is continued.
この実施態様のさらなる局面において、本発明は、がんを有する被検者に治療有効量のがん治療を投与すること、及び被検者から得られた生体試料中のCAMLsなどの循環細胞のサイズを決定することを含む、がんを有する被検者を治療する方法に向けられており、ここで試料は少なくとも1つのがん治療後に被検者から得られ、各循環細胞のサイズが約50μm以下である場合、被検者は治療に反応すると予測され、治療が継続されるる。 In a further aspect of this embodiment, the invention provides methods for administering a therapeutically effective amount of a cancer treatment to a subject having cancer and for detecting circulating cells, such as CAMLs, in a biological sample obtained from the subject. A method of treating a subject with cancer comprises determining the size of each circulating cell, wherein the sample is obtained from the subject after at least one cancer treatment and the size of each circulating cell is approximately If it is 50 μm or less, the subject is predicted to respond to treatment and treatment is continued.
この実施態様の追加の局面では、本発明は、がんを有する被検者に治療有効量のがん治療を投与すること、ならびに被検者から得られる第1及び第2の生体試料、及び任意の追加の生体試料中のCAMLsなどの循環細胞の数を決定することを含む、がんを有する被検者の治療方法に向けられており、ここで、第1の試料はがん治療の前又は治療中に被検者から得られ、第2及び任意の追加の試料は少なくとも1つのがん治療の後に被検者から得られ、循環細胞の数が第1から第2及び任意の追加試料で減少する場合、被検者は治療に反応すると予測され、治療が継続され、また、循環細胞の数が第1から第2及び任意の追加試料で維持され又は増加する場合、被検者は治療に反応しないと予測され、治療は継続されない。
In an additional aspect of this embodiment, the invention provides a method for administering a therapeutically effective amount of a cancer treatment to a subject having cancer, and first and second biological samples obtained from the subject; is directed to a method of treating a subject with cancer, comprising determining the number of circulating cells, such as CAMLs, in an optional additional biological sample, wherein the first sample The second and any additional samples are obtained from the subject after at least one cancer treatment and the number of circulating cells is increased from the first to the second and any additional samples obtained from the subject before or during treatment. The subject is predicted to respond to treatment if the number of circulating cells decreases in the sample, the treatment is continued, and the number of circulating cells is maintained or increases from the first to the second and any additional samples. are predicted to not respond to treatment and treatment will not be continued.
実施例1
試料の収集と処理
サイズ排除法は、CTCs及びCAMLsの両方を収集するための１つの方法である。多くのサイズ排除法がある。ここでは濾過方法を例に説明する。末梢血をCellSaveチューブ（Menarini Silicon Biosystems Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア）に収集し、96時間以内に処理した。 CellSieve（商標）マイクロろ過技術を使用して、血液試料中の全てのがん関連細胞（CTCs、EMTs、CECs、及びCAMLs）を収集した。CellSieve（商標）マイクロフィルターには、9mmの領域内に7μmの細孔径を持つ均一に配列した180,000を超える細孔がある。試薬は、前固定バッファー、後固定バッファー、透過処理バッファー、及び抗体カクテルを含む。ろ過を行う手法は 5mL/分で吸引されるシリンジポンプセット[5]又は真空ポンプ[4]のいずれかを使用した。ろ過プロセスは、フィルターを通して吸引される前に7.5mLの血液を7.5mLの前固定バッファー内で前固定することにより始まった。次に、フィルター及び捕捉された細胞を洗浄、後固定、洗浄、透過処理、及び洗浄に供した。次に、フィルター上に捕捉された細胞を抗体カクテルで染色し、続いて洗浄した。フィルターを顕微鏡スライドの上に置き、Fluoromount-G / DAPI（Southern Biotech）でカバースリップした。上皮がんのCTCsとCAMLsを特定するための１つの可能な抗体カクテルは、サイトケラチンとCD45抗体を含むことができる。目的のマーカーのための追加の抗体を含めることができる。次に、スライドを蛍光顕微鏡で読み取る。CTCsの数がカウントされる。CAMLsのサイズが測定される。CTCsの数、最大のCAMLsサイズ、及び＜50μm又は50μm以上の最大CAMLサイズが記録される。血液からCTCsとCAMLsを収集する方法は他にも多種多様である。
研究1：放射線治療を受けたn=42のNSCLC患者の研究
Example 1
Sample Collection and Processing Size exclusion is one method for collecting both CTCs and CAMLs. There are many size exclusion methods. Here, a filtration method will be explained as an example. Peripheral blood was collected into CellSave tubes (Menarini Silicon Biosystems Inc., San Diego, CA) and processed within 96 hours. CellSieve™ microfiltration technology was used to collect all cancer-associated cells (CTCs, EMTs, CECs, and CAMLs) in the blood samples. CellSieve™ microfilters have over 180,000 uniformly arranged pores with a 7 μm pore size within a 9 mm area. Reagents include pre-fixation buffer, post-fixation buffer, permeabilization buffer, and antibody cocktail. Filtration was performed using either a syringe pump set [5] or a vacuum pump [4] that sucked at 5 mL/min. The filtration process began by prefixing 7.5 mL of blood in 7.5 mL of prefix buffer before being drawn through the filter. The filter and captured cells were then washed, post-fixed, washed, permeabilized, and washed. Cells captured on the filters were then stained with an antibody cocktail followed by washing. Filters were placed on microscope slides and coverslipped with Fluoromount-G/DAPI (Southern Biotech). One possible antibody cocktail for identifying CTCs and CAMLs in epithelial cancers can include cytokeratin and CD45 antibodies. Additional antibodies for markers of interest can be included. The slides are then read under a fluorescence microscope. The number of CTCs is counted. The size of CAMLs is measured. The number of CTCs, the largest CAMLs size, and the largest CAML size <50 μm or greater than 50 μm are recorded. There are many other ways to collect CTCs and CAMLs from blood.
Study 1: Study of n=42 NSCLC patients treated with radiotherapy
図1A～1Dは、治療反応に関連するCAMLサイズ、及びCAMLサイズの変化を示す。実線の曲線と線は非反応者を示し、破線は反応者を示す。この図のデータ分析では、治療反応は24か月の時点での反応として定義された。n=42試料のこのパイロット研究では、被検者は非小細胞肺がん（NSCLC）を有しており、それらのほとんどは放射線療法を受けており、少数者は化学療法も受けていた。進行は、化学放射線療法の導入前と導入後の肺患者における治療画像診断の標準に基づいている。最初の100日でさえ結果は強い傾向を示す。図1Aは、ベースラインでサイズが50μm未満のCAMLsを有する患者のほとんどが50μm未満のままであったことを示す。図1Bは、サイズが50μm未満から50μmを超えるまで増大したCAMLsを有する患者の全てが進行したことを示す。図1Cは、最初に50μmより大きいCAMLsを持ち、第2の時点で50μmより小さいCAMLsを持つ一人の患者が治療に反応したことを示す。図1Dは、CAMLsがベースラインで50μmを超え、サイズの経時的な減少がなかった患者、及びCAMLsのサイズの減少を示した1人の被検者で、治療に対する反応が見られないことを示す。 Figures 1A-1D show CAML size and changes in CAML size associated with treatment response. Solid curves and lines indicate non-responders and dashed lines indicate responders. For data analysis in this figure, treatment response was defined as response at 24 months. In this pilot study of n=42 samples, subjects had non-small cell lung cancer (NSCLC), most of whom had received radiation therapy, and a minority had also received chemotherapy. Progression is based on standards of therapeutic imaging in pulmonary patients before and after the introduction of chemoradiotherapy. Even in the first 100 days the results show a strong trend. Figure 1A shows that most patients with CAMLs less than 50 μm in size at baseline remained less than 50 μm. Figure 1B shows that all patients with CAMLs that increased in size from less than 50 μm to more than 50 μm progressed. Figure 1C shows that one patient with CAMLs initially larger than 50 μm and smaller than 50 μm at the second time point responded to treatment. Figure 1D shows a patient whose CAMLs were >50 μm at baseline and no decrease in size over time, and one subject who showed a decrease in the size of CAMLs with no response to treatment. show.
定性的測定を行うために、所与の時点での予測の正確さは、（真陽性＋真陰性）／（偽陽性＋偽陰性）として定義された。真の陽性は、CAMLsサイズ＞50μmであり、進行した患者の数である。偽陽性は、CAMLsサイズ＞50μmであるが、進行しなかった患者の数である。真の陰性は、CAMLsサイズ＜50μmで、進行しなかった患者の数である。偽陰性は、CAMLsサイズ＜50μmで、進行した患者の数である。この50μmサイズの使用は、2018年8月23日付の国際公開 WO2018/151865 に示されているデータに基づいている。ベースラインでの精度は69％、最後の経過観察での精度は85％であった。 To provide a qualitative measure, the accuracy of prediction at a given time point was defined as (true positives + true negatives)/(false positives + false negatives). A true positive is the number of patients with CAMLs size >50 μm who progressed. False positives are the number of patients with CAMLs size >50 μm but who did not progress. A true negative is the number of patients with CAMLs size <50 μm who did not progress. False negatives are the number of patients with CAMLs size <50 μm who progressed. The use of this 50 μm size is based on data presented in International Publication WO2018/151865 dated August 23, 2018. Accuracy was 69% at baseline and 85% at last follow-up.
治療反応の指標は、ほとんどの患者について100日以内に得ることができる。要約すると、治療後の最終的なCAMLsサイズは、治療反応に関する予測と結論を下すための基礎を提供する。
研究2：放射線療法で治療されたn=52のNSCLC患者の研究
Indications of treatment response can be obtained within 100 days for most patients. In summary, the final CAMLs size after treatment provides the basis for making predictions and conclusions regarding treatment response.
Study 2: Study of n=52 NSCLC patients treated with radiotherapy
0.05のαで両側90％出力を達成するために、52人のNSCLC患者のテストセットが行われた。全ての患者は病理学的に確認された肺がんステージI（n=7）、ステージII（n=7）、ステージIII（n=29）及びステージIV（n=9）を有し、標準的なPET/CTスキャンを受けた。治療開始前にベースライン（BL）の血液試料を採取した。第1の経過観察（FU1）は、放射線療法中に（～30日）行われた。2回目の経過観察（FU2）は、放射線療法の最後に（～60日）行われた。数人の患者は60日以内に化学療法も受けた。 A test set of 52 NSCLC patients was performed to achieve bilateral 90% power with an α of 0.05. All patients had pathologically confirmed lung cancer stage I (n=7), stage II (n=7), stage III (n=29), and stage IV (n=9) and received standard I had a PET/CT scan. A baseline (BL) blood sample was collected before treatment initiation. The first follow-up (FU1) was performed during radiotherapy (~30 days). A second follow-up (FU2) was performed at the end of radiotherapy (~60 days). Several patients also received chemotherapy within 60 days.
血液はCellSieve（商標）精密濾過により濾過され、CAMLサイズが定量された。＜50μm又は50μm以上のCAMLサイズによる分析を利用して、各時点での打ち切り単変量及び多変量解析によるPFSハザード比（HR）を評価した。 Blood was filtered using CellSieve™ microfiltration and CAML size was quantified. Analysis by CAML size <50 μm or ≥50 μm was used to assess PFS hazard ratios (HR) by censoring univariate and multivariate analyzes at each time point.
以下の分析は、治療反応とは逆に、疾患の進行を予測する。CAMLsは全ての試料の97％で同定され、BLでは平均2.9 CAMLs/7.5mL試料で、50μm以上のCAMLsでは無増悪生存期間（PFS）が低下した（HR=2.9、95％CI 1.3-6.2、p=0.015）。FU1（経過観察1）では、7人の患者のCAMLサイズが増加し、PFSが減少した（HR=5.0 95％CI 2.3-10.9、p＜0.001）。FU2（経過観察2）では、さらに7人の患者がCAMLサイズを増加させ、さらにPFSを減少させた（HR=7.1、95％CI 3.4-14.8、p＜0.001）。合計で、BLでサイズが50μm以上のCAMLsは、24か月以内の最終的な進行の予測で65％正確であったが、FU2でサイズが50μm以上のCAMLsは、進行の予測で89％正確であった。 The following analyzes predict disease progression as opposed to treatment response. CAMLs were identified in 97% of all samples, with an average of 2.9 CAMLs/7.5 mL sample in BL, and progression-free survival (PFS) was decreased for CAMLs ≥50 μm (HR=2.9, 95% CI 1.3-6.2; p=0.015). At FU1 (Follow-up 1), CAML size increased and PFS decreased in 7 patients (HR=5.0 95% CI 2.3-10.9, p<0.001). At FU2 (Follow-up 2), 7 additional patients increased CAML size and further decreased PFS (HR=7.1, 95% CI 3.4-14.8, p<0.001). In total, CAMLs ≥50 μm in size at BL were 65% accurate in predicting eventual progression within 24 months, whereas CAMLs ≥50 μm in size at FU2 were 89% accurate in predicting progression. Met.
NSCLCの全てのステージにおける治療反応又は進行の予測に適用可能であることに注意されたい。
研究3：化学放射線療法で治療されたn=52のNSCLC及びn=29の食道がん患者
Note that it is applicable to predicting treatment response or progression in all stages of NSCLC.
Study 3: n=52 NSCLC and n=29 esophageal cancer patients treated with chemoradiotherapy
図1A-1D（ステージI、n=7、ステージII、n=7、ステージIII、n=29、及びステージIV、n=9）に記載されているのと同じ52人のNSCLC及び21人の食道がん（ステージIII n=20及びステージIV（n=1））患者に基づいて、食道がんを含む放射線療法の結果を予測する、より大きな研究が行われた。 The same 52 NSCLC and 21 patients as described in Figures 1A-1D (Stage I, n=7, Stage II, n=7, Stage III, n=29, and Stage IV, n=9) A larger study was conducted to predict the outcome of radiotherapy involving esophageal cancer based on patients with esophageal cancer (stage III n=20 and stage IV (n=1)).
図2A～2Cは、3つの時点：ベースライン（BL）（図2A）、第1の経過観察（FU1）（図2B）、及び第2の経過観察（FU2）（図2C）における無憎悪生存期間（PFS）のカプランマイヤープロットを示す。データは、CAMLsのサイズに基づいて分析され、＜50μm（青（上）曲線）又は50μm以上（赤（下）曲線）である。ベースライン 図2A及び表1では、CAMLsのサイズが予後情報を提供する。第1の経過観察 図2B及び表2では、CAMLサイズに基づく治療反応の予測が示されている。放射線療法終了後の2回目の経過観察 図2Cと表３では、CAMLサイズは、非反応者とくらべての反応者のPFSのはるかに良い予測を提供した。多変量解析が行われた。CAMLサイズは、ステージ、がんの種類、年齢、及び性別と比較して最良の結果を提供した。
図3A～3Cは、3つの時点での全生存期間（OS）のカプランマイヤープロットを示す：ベースライン（BL）（図3A）、第1の経過観察（FU1）（図3B）、及び第2の経過観察（FU2）（図3C）。データは、CAMLsのサイズに基づいて分析され、＜50μm（青（上）曲線）又は≧50μm（赤（下）曲線）である。CAMLサイズは、NSCLCと食道がんの化学放射線療法の非反応者と比べての反応者のOSの良い予測を提供する。 Figures 3A-3C show Kaplan-Meier plots of overall survival (OS) at three time points: baseline (BL) (Figure 3A), first follow-up (FU1) (Figure 3B), and second follow-up (FU1) (Figure 3B). Follow-up (FU2) (Figure 3C). Data were analyzed based on the size of CAMLs, <50 μm (blue (top) curve) or ≧50 μm (red (bottom) curve). CAML size provides a good prediction of OS in responders compared with non-responders to chemoradiotherapy for NSCLC and esophageal cancer.
CAMLsは、全てのBL試料の97％で見られた。平均して、2.9 CAMLs/7.5mL血液が見られた。BLで巨大CAMLsを有する患者は、NSCLCのPFS（HR=2.9、95％CI 1.3～6.2、p=0.015）を有意に低下させ、食道がん（HR=3.0、95％CI 0.9～9.9、p=0.14）ではわずかであった。 CAMLs were seen in 97% of all BL samples. On average, 2.9 CAMLs/7.5mL blood were seen. Patients with BL and giant CAMLs had significantly lower PFS in NSCLC (HR=2.9, 95% CI 1.3-6.2, p=0.015) and esophageal cancer (HR=3.0, 95% CI 0.9-9.9, p =0.14), it was small.
FU1では、検出可能な巨大CAMLsを有する患者は、治療後のPFSをさらに減少させた（NSCLC、HR=5.0、95%CI 2.3～10.9、p＜0.001;EC、HR=4.0、95%CI 1.2～13.2、p=0.05 ）、そしてFU2ではさらに顕著であった（NSCLC、HR=7.1、95％CI 3.4-14.8、p＜0.001;EC、HR=5.6、95％CI 1.6～18.8、p=0.01）。2つの疾患データセットを組み合わせると、BLでの巨大CAMLsは24か月以内の最終的な進行の予測で70％正確であったが、FU2での巨大CAMLsは進行の予測で84％正確であった。多変数解析では、巨大CAMLsが治療反応の予測において最も有意であった。 In FU1, patients with detectable bulky CAMLs had further reduced PFS after treatment (NSCLC, HR=5.0, 95%CI 2.3 to 10.9, p<0.001; EC, HR=4.0, 95%CI 1.2 ~13.2, p=0.05) and even more pronounced in FU2 (NSCLC, HR=7.1, 95% CI 3.4-14.8, p<0.001; EC, HR=5.6, 95% CI 1.6-18.8, p=0.01 ). Combining the two disease datasets, giant CAMLs in BL were 70% accurate in predicting eventual progression within 24 months, whereas giant CAMLs in FU2 were 84% accurate in predicting progression. Ta. In multivariable analysis, large CAMLs were the most significant in predicting treatment response.
図4A～4Fは、乳がん、前立腺がん又は肺がんを有する患者について、3つの時点にわたる各患者における最大のCAMLの詳細を示す。赤と緑の曲線は、進行した患者（赤）対進行も治癒もしていなかった患者（緑）である。 Figures 4A-4F show details of the maximum CAML in each patient across three time points for patients with breast, prostate or lung cancer. The red and green curves are patients who progressed (red) versus those who neither progressed nor cured (green).
図4Aは、ベースラインで50μm未満のCAMLサイズを有し、FU2で50μm未満のままの患者を示す。患者の81％は24か月以内に進行しなかった。 Figure 4A shows patients with CAML size less than 50 μm at baseline and remaining less than 50 μm at FU2. 81% of patients did not progress within 24 months.
図4Bは、ベースラインで50μm未満であるが、FU2で50μmを超えて増加したCAMLサイズを有する患者を示す。患者の79％は24か月以内に進行した。 Figure 4B shows a patient with CAML size less than 50 μm at baseline but increased by more than 50 μm at FU2. 79% of patients progressed within 24 months.
図4Cは、ベースラインで50μmを超え、FU2で50μm未満に減少するCAMLサイズを有する患者を示す。患者の60％は24か月以内に進行しなかった。 Figure 4C shows a patient with CAML size greater than 50 μm at baseline and decreasing to less than 50 μm at FU2. 60% of patients did not progress within 24 months.
図4Dは、ベースラインで50μmを超えるCAMLサイズを有し、FU2で50μmを超えたままの患者を示す。患者の96％は24か月以内に進行した。 Figure 4D shows a patient who had a CAML size >50 μm at baseline and remained >50 μm at FU2. 96% of patients progressed within 24 months.
図4Eは、FU2でCAMLサイズが50μm未満の患者を示す。患者の79％は24か月以内に進行しなかった。 Figure 4E shows a patient with CAML size less than 50 μm at FU2. 79% of patients did not progress within 24 months.
図4Fは、FU2で50μmを超えるCAMLサイズの患者を示す。患者の89％が24か月以内に進行した。
研究4：多くの固形腫瘍及び治療に適用可能
Figure 4F shows a patient with CAML size >50 μm at FU2. 89% of patients progressed within 24 months.
Study 4: Applicable to many solid tumors and treatments
血液ベースのバイオマーカー（PSA、CEA、CA125）は、画像診断と並行して疾患のリアルタイムの進行を追跡するために使用される。しかし、多数の血液バイオマーカーが存在するが、それらはがんのタイプ（すなわち、PSAが前立腺に、CEAが大腸に）に特異的であり、全ての罹患した個体に現れるとは限らない。CAMLsは、進行性の疾患の間にサイズ及び高倍数性が増大することが観察されたさまざまな固形がんのタイプで同定された。CAMLの拡大が進行/反応のバイオマーカーであるかどうかを評価するために、乳がん（n=10）、肺がん（n=16）、及び前立腺がん（n=8）を伴う34人のがん患者の治療[ステージI（n=2）、II（n=3）、III（n = 8）、及びIV（n=21）]からの匿名化末梢血試料を用い、多施設共同前向き試験でCAMLの成長/収縮を追跡した。試料は、治療前（BL）、治療導入後～1か月（FU1）の経過観察時、及び～3か月（FU2）の経過観察時に採取された。 Blood-based biomarkers (PSA, CEA, CA125) are used to track the real-time progression of the disease in parallel with diagnostic imaging. However, although numerous blood biomarkers exist, they are specific to cancer type (i.e., PSA for prostate, CEA for colon) and may not be present in all affected individuals. CAMLs have been identified in various solid tumor types that have been observed to increase in size and hyperploidy during progressive disease. To assess whether CAML expansion is a biomarker of progression/response, 34 cancer patients with breast cancer (n=10), lung cancer (n=16), and prostate cancer (n=8) In a prospective, multicenter study using anonymized peripheral blood samples from patient treatments [stages I (n=2), II (n=3), III (n=8), and IV (n=21)], CAML growth/shrinkage was tracked. Samples were collected before treatment (BL), at follow-up ~1 month after treatment introduction (FU1), and at follow-up ~3 months (FU2).
この群における患者の治療は非常に多様であった。含まれる治療法：放射線療法、化学放射線療法、化学療法、ドセタキセル、トラスツズマブ、トラスツズマブ/ラパチニブ、フルベストラント/トラスツズマブ/ラパチニブ/脳放射線、レトロゾール/デノスマブ、トラスツズマブ/ペルツズマブ/エリブリン、パクリタキセル/ハーセプチン/ペルツズマブ、アブラキサン、エリガルド、ルプロン、エリガルド/ビカルタミド、カソデックス、ルプロン/ビカルタミド、ルプロン、手術、アビラテロン/ルプロン、ニボルマブ、カルボプラチン/タキソール、カルボプラチン/ゲムシタビン、ゲムシタビン/トラスツズマブ＋ラパチニブ、エリブリン/トラスツズマブ/ラパチニブ、ハーセプチン/フルベストラント/パルボチリブ、エリブリン、パクリタキセル/ハーセプチン/ペルツズマブ、アブラキサン、エリガード＋エンザルタミド、ルプロン＋エンザルタミド、カソデックス＋ルプロン、ビノレルビン/トラスツズマブ/ラパチニブ、レトロゾール/フルベストラント、エリブリン/ハーセプチン、ハーセプチン/フェマラ。 Treatment of patients in this group was highly variable. Treatments included: radiotherapy, chemoradiotherapy, chemotherapy, docetaxel, trastuzumab, trastuzumab/lapatinib, fulvestrant/trastuzumab/lapatinib/brain radiation, letrozole/denosumab, trastuzumab/pertuzumab/eribulin, paclitaxel/herceptin/pertuzumab , Abraxane, Eligalde, Lupron, Eligalde/Bicalutamide, Casodex, Lupron/Bicalutamide, Lupron, Surgery, Abiraterone/Lupron, Nivolumab, Carboplatin/Taxol, Carboplatin/Gemcitabine, Gemcitabine/Trastuzumab + Lapatinib, Eribulin/Trastuzumab/Lapatinib, Herceptin/Flu Bestrant/Palvotilib, Eribulin, Paclitaxel/Herceptin/Pertuzumab, Abraxane, Eligard + Enzalutamide, Lupron + Enzalutamide, Casodex + Lupron, Vinorelbine/Trastuzumab/Lapatinib, Letrozole/Fulvestrant, Eribulin/Herceptin, Herceptin/Femara.
全体的な臨床データは：
・CAMLは、BLでがん患者の97％、FU1で97％、FU2で94％で見られた
・2年間で、7人の患者は臨床疾患の進行を示さず（図5及び6の青又は上線）、29人の患者は観察可能な臨床疾患の進行を示した（図5及び6の赤又は下線）。
・進行のない患者（図5及び6の青又は上線、n=7）の1人は、全ての時点でCAMLsが50μm以上であったのに対し、6人は全ての時点で小さいCAMLだけ有していた。
・進行した29人の患者のうち、
〇22人の患者が全ての時点で50μm以上のCAMLsを有した
〇5人の患者がBLで＜50μmのCAMLsを有し、FU2によりサイズが増加した
〇1人の患者がBLで50μm以上のCAMLを有し、FU2により減少した
〇1人の患者は、全ての時点で小さなCAMLsを有していた。
Overall clinical data:
・CAML was seen in 97% of cancer patients with BL, 97% with FU1, and 94% with FU2. ・Over 2 years, 7 patients showed no clinical disease progression (blue in Figures 5 and 6). 29 patients had observable clinical disease progression (red or underlined in Figures 5 and 6).
・One patient without progression (blue or overlined in Figures 5 and 6, n=7) had CAMLs ≥50 μm at all time points, whereas 6 patients had only small CAMLs at all time points. Was.
・Of the 29 patients who progressed,
o 22 patients had CAMLs ≥50 μm at all time points o 5 patients had CAMLs <50 μm at BL that increased in size with FU2 o 1 patient had CAMLs >50 μm at BL One patient with CAML reduced by FU2 had small CAMLs at all time points.
固形腫瘍のタイプ及び治療のタイプとは独立して、CAMLサイズが治療反応を予測できるかどうかが評価された。 It was assessed whether CAML size could predict treatment response, independent of solid tumor type and treatment type.
図５A～5Bは、２つの時点での無増悪生存期間（PFS）のカプランマイヤープロットを示す：ベースライン（BL）（図5A）及び第2の経過観察（FU2）（図5B）。データは、CAMLsのサイズに基づいて分析され、＜50μm（青（上）曲線）又は50μm以上（赤（下）曲線）である。 Figures 5A-5B show Kaplan-Meier plots of progression-free survival (PFS) at two time points: baseline (BL) (Figure 5A) and second follow-up (FU2) (Figure 5B). Data were analyzed based on the size of CAMLs, <50 μm (blue (top) curve) or >50 μm (red (bottom) curve).
図6A～6Bは、2つの時点での全生存期間（OS）のカプランマイヤープロットを示す：ベースライン（BL）（図6A）及び第2の経過観察（FU2）（図6B）。データは、CAMLsのサイズに基づいて分析され、＜50μm（青（上）曲線）又は50μm以上（赤（下）曲線）である。 Figures 6A-6B show Kaplan-Meier plots of overall survival (OS) at two time points: baseline (BL) (Figure 6A) and second follow-up (FU2) (Figure 6B). Data were analyzed based on the size of CAMLs, <50 μm (blue (top) curve) or >50 μm (red (bottom) curve).
我々は、ベースラインと比較して増加したCAML拡大は、治療に反応しないことを示すものであり、その結果、様々な種類のがんにおいて、PFSがより短かくなることを示す。
研究5：CTCとCAMLデータの結合
We show that increased CAML expansion compared to baseline is indicative of non-response to treatment, resulting in shorter PFS in various cancer types.
Study 5: Combining CTC and CAML data
別の結果セットは、異なるがん及び異なる治療に関連している。新しい治療法の導入前と導入後のCAMLsのサイズに加えて、CTCsの包含を評価するために、2年間の前向き二重盲検多施設共同試験が行われた。合計n=91の患者が募集された：III期（n=53）又はIV期（n=38）疾患の乳がん（n=14）、食道がん（n=23）、NSCLC（n=23）、前立腺がん（n=21）、及び小細胞肺がん（SCLC）（n=10）。新しい治療の導入前にベースライン（BL）の血液試料を採取し、全身治療の開始後（～30日）に1回の経過観察（FU）が行われた。 CellSieveろ過で血液をろ過した。CTCsとCAMLsの数量とサブタイプは、打ち切り単変量及び多変量解析によってOSハザード比（HR）に基づいて分析された。 Another set of results relates to different cancers and different treatments. A 2-year, prospective, double-blind, multicenter study was conducted to evaluate the inclusion of CTCs as well as the size of CAMLs before and after the introduction of new treatments. A total of n=91 patients were recruited: breast cancer (n=14), esophageal cancer (n=23), and NSCLC (n=23) with stage III (n=53) or stage IV (n=38) disease. , prostate cancer (n=21), and small cell lung cancer (SCLC) (n=10). A baseline (BL) blood sample was taken before the introduction of new treatment, and one follow-up visit (FU) was performed after the initiation of systemic treatment (~30 days). Blood was filtered with CellSieve filtration. The quantity and subtypes of CTCs and CAMLs were analyzed based on OS hazard ratio (HR) by censored univariate and multivariate analyses.
図7は、CTCsが肺（6％）、食道（4％）及び前立腺（24％）ではまれであったが、***（79％）では一般的であったことを示している。CAMLsは全てのがんに共通しており、BL試料の92％とFU試料の98％で見られ、どちらもOSのための予後である。 Figure 7 shows that CTCs were rare in the lung (6%), esophagus (4%) and prostate (24%), but common in the breast (79%). CAMLs are common to all cancers, seen in 92% of BL samples and 98% of FU samples, both of which are prognostic for OS.
CTCsは、BLの患者の21％で同定され、単一のCTCがOSのための予後である（HR=2.495% CI=1.1～5.1、P=0.048）。さらに、CTCsはFUの試料の23％で見られ、OSのための予後でもある（HR=3.1 95％CI=1.4～6.9、p=0.013）。しかし、CTCsは肺がん（6％）、食道がん（4％）及び前立腺がん（24％）でまれであったが、乳がん（79％）で一般的であった。対照的に、CAMLsはBLの92％で見られ、50μm以上のCAMLsがOSのための予後である（HR=3.0、95％CI=1.6～5.7、p=0.001）。FUでは、CAMLsがFU試料の98％で見られ、50μm以上のCAMLsのOSの予後値が増加した（HR=3.5 95％CI=1.9～6.6、p=0.001）。さらに、全身治療の導入後、CTCsが＞１つ又は50μm以上のCAMLの両方の存在は、OS HR=3.7 95％CI=2.0～7.0、p=0.001で、24時間以内の患者の生存率の予測で75％正確であった。 CTCs were identified in 21% of patients with BL, and a single CTC is prognostic for OS (HR=2.495% CI=1.1-5.1, P=0.048). Additionally, CTCs were found in 23% of FU samples and were also prognostic for OS (HR=3.1 95% CI=1.4-6.9, p=0.013). However, CTCs were rare in lung cancer (6%), esophageal cancer (4%) and prostate cancer (24%), but common in breast cancer (79%). In contrast, CAMLs are seen in 92% of BL, and CAMLs ≥50 μm are prognostic for OS (HR=3.0, 95% CI=1.6-5.7, p=0.001). In FU, CAMLs were found in 98% of FU samples, and CAMLs ≥50 μm had increased prognostic value for OS (HR=3.5 95% CI=1.9-6.6, p=0.001). Furthermore, after the introduction of systemic therapy, the presence of both >1 CTCs or CAML >50 μm was associated with a significantly lower 24-hour patient survival rate, with OS HR=3.7 95% CI=2.0 to 7.0, p=0.001. It was 75% accurate in its predictions.
FUでは、単一のCTC（図8A）は、より低いOSと関連していた（下（赤）曲線）。単一のCAML 50μm以上 CAML（図8B）も、OSの低下（低（赤）曲線）に関連していた。血液検査によるCTCs及びCAMLsの両方の同時測定のOSを図8Cに、下の（赤い）曲線として示される単一のCAML及びCTCと共に示す。 In FU, single CTCs (Figure 8A) were associated with lower OS (bottom (red) curve). Single CAML >50 μm (Figure 8B) was also associated with decreased OS (lower (red) curve). The OS for simultaneous measurement of both CTCs and CAMLs by blood tests is shown in Figure 8C with single CAMLs and CTCs shown as the bottom (red) curve.
このデータは、CTCｓ及びCAMLサイズの両方の同時測定が、血液ベースの診断の予後の価値を高め、そしてその後の治療の利益を予期し得ることを示している。 This data indicates that simultaneous measurement of both CTCs and CAML size may enhance the prognostic value of blood-based diagnosis and anticipate subsequent therapeutic benefit.
このデータは、CAMLサイズ及びCAMLサイズの変化が、主要な固形腫瘍の治療反応又は疾患進行の予測に適用可能であることを示唆している。
実施例2
がんワクチン
This data suggests that CAML size and changes in CAML size have applicability in predicting treatment response or disease progression in major solid tumors.
Example 2
cancer vaccine
がんワクチンは、ワクチン標的として意図されるマーカーを発現する細胞の形態で被検者に投与することができる。細胞は、がん細胞、改変ウイルス及び他のタイプの改変細胞の形態であり得る。被検者がワクチンを受けた後、体の免疫システムは、がん細胞と共にワクチンによって発現された抗原を認識して攻撃するT細胞を生産する。 Cancer vaccines can be administered to a subject in the form of cells expressing markers intended as vaccine targets. The cells can be in the form of cancer cells, modified viruses and other types of modified cells. After a subject receives a vaccine, the body's immune system produces T cells that recognize and attack antigens expressed by the vaccine along with cancer cells.
がんワクチンの患者の治療反応をモニター及び／又は予測するためにCAMLsを利用するという概念をサポートするデータは、CV-BR-1-GMワクチンで治療された10人の乳がん患者に基づいている。7.5mLの血液を採取し、異なる時点で分析した。図10と図11に示されるデータは、少なくとも１つのHLA対立遺伝子を発現している患者（実線）とどのようなHLA対立遺伝子も発現していない患者（破線）のCAMLデータを示す。 Data supporting the concept of using CAMLs to monitor and/or predict patient therapeutic response to cancer vaccines are based on 10 breast cancer patients treated with the CV-BR-1-GM vaccine. . 7.5 mL of blood was collected and analyzed at different time points. The data shown in Figures 10 and 11 show CAML data for patients expressing at least one HLA allele (solid line) and patients not expressing any HLA allele (dashed line).
図10は、治療中のCAMLの数を示す。少なくとも１つのHLA対立遺伝子を発現している患者では、治療中に減少した数又はより少ないCAMLsを有し、このことは肯定的な反応を示す。データポイントが200日である1人の患者では、肺及び軟部組織の転移は完全に除去された。HLA対立遺伝子を発現していない患者はワクチンの恩恵を受けていないようであり、CAML数は増加していることが分かった。 Figure 10 shows the number of CAML during treatment. Patients expressing at least one HLA allele will have a reduced number or fewer CAMLs during treatment, indicating a positive response. In one patient with a data point of 200 days, lung and soft tissue metastases were completely eliminated. Patients who did not express the HLA allele did not appear to benefit from the vaccine and were found to have increased CAML numbers.
図11は、治療中のCAMLのサイズを示す。少なくとも1つのHLA対立遺伝子を発現している一人を除く全ての患者は、治療中にCAMLサイズの減少を示した。しかし、ほとんどの患者のCAMLサイズは依然として50μmよりはるかに大きく、このことは、病原性の高いがんの存在を示している。患者の画像診断は、彼ら全員がまだがんを有することを示した（データは示されていない）。 Figure 11 shows the size of CAML during treatment. All but one patient expressing at least one HLA allele showed a decrease in CAML size during treatment. However, the CAML size in most patients is still much larger than 50 μm, indicating the presence of a highly pathogenic cancer. Imaging of the patients showed that they all still had cancer (data not shown).
CAML数の変化は、ワクチン以外の他の治療及び他のがんに、特にステージIVのがんを有する被検者において典型的に５つを超えるCAMLsを有するがんに適用可能である。
実施例3
Changes in CAML numbers are applicable to other treatments other than vaccines and to other cancers, particularly those cancers that typically have more than 5 CAMLs in subjects with stage IV cancer.
Example 3
CAMLsは、がんの病態形成におけるメカニズムであると仮定されたがん患者の末梢血において一般的な循環間質細胞である。ここで示されるのは、CAMLsが治療反応とがんの進行を予測できるかどうかを判断するための、誘導前及び根治的放射線療法の完了直後の未治療の肺がん患者についての前向き試験の結果である。 CAMLs are common circulating stromal cells in the peripheral blood of cancer patients that have been hypothesized to be a mechanism in cancer pathogenesis. Presented here are the results of a prospective study in previously untreated lung cancer patients before induction and immediately after completion of definitive radiotherapy to determine whether CAMLs can predict treatment response and cancer progression. be.
方法：2年間の単一の前向き単一盲検試験が行われ、根治的放射線療法の導入前後の肺がん患者の無増悪生存期間（PFS）に対する拡大CAMLs（50μm以上）の関係をテストした。両側95％パワー（α=0.05）を達成するために、全て病理学的に確認された肺がんを伴う55人の患者のトレーニングセットが採用された：ステージI（n=13）、ステージII（n=7）、ステージIIIa（n=10）、ステージIIIb（n=18）及びステージIV（n=7）。治療開始前にベースライン（BL）の血液試料を採取した。可能であれば、放射線療法の終了後（～60日）に第2の血液試料（T1）を採取した、n=46患者。CellSieve（商標）ろ過によって血液をろ過し、CAMLsを定量した。＜50μm又は50μm以上のCAMLサイズによる分析を用いて、打ち切り単変量及び多変量解析によるPFS-ハザード比（HR）を評価した。 Methods: A single 2-year prospective, single-blind study was conducted to test the relationship of enlarged CAMLs (>50 μm) to progression-free survival (PFS) in lung cancer patients before and after the introduction of definitive radiotherapy. A training set of 55 patients, all with pathologically confirmed lung cancer, was employed to achieve bilateral 95% power (α=0.05): stage I (n=13), stage II (n =7), stage IIIa (n=10), stage IIIb (n=18) and stage IV (n=7). A baseline (BL) blood sample was collected before treatment initiation. n=46 patients with a second blood sample (T1) taken after completion of radiotherapy (~60 days) if possible. Blood was filtered by CellSieve™ filtration and CAMLs were quantified. Analysis by CAML size <50 μm or ≥50 μm was used to evaluate PFS-hazard ratio (HR) by censored univariate and multivariate analyses.
結果（データは示されていない）：CAMLsは、平均3.2 CAML/7.5mLのBL試料の93％で見られた。50μm以上のCAMLが少なくとも１つある患者では、PFSが低下していた（HR=2.9、95％CI 1.4～6.0、p=0.010）。46人の患者が経過観察採血に同意した。46人の患者のうち13人はCAMLサイズが50μm以上に増加したが、3人の患者は＜50μmに減少し、その結果PFSが増加した（HR=7.7、95％CI 2.6～12.5、p＜0.001）。併せて、BLで50μm以上のCAMLを有する患者の90％が2年以内に進行したのに対し、＜50μmのCAMLsを有する患者では46％であった。T1でのCAMLの拡大は進行をよりよく予測し、50μm以上のCAMLを有する患者の92％が進行していたのに対し、＜50μmのCAMLを有する患者では21％であった。特に、BLとT1の両方でCAMLsが50μm以上の患者の100％が進行した。比較すると、BLとT1の両方でCAMLsが＜50μmの患者の11％のみが進行した。多変量解析では、ステージを含む他の全ての臨床変数とは独立して、CAMLサイズがPFSとOSの最も重要な指標であった。 Results (data not shown): CAMLs were found in 93% of BL samples with an average of 3.2 CAML/7.5mL. Patients with at least one CAML ≥50 μm had decreased PFS (HR=2.9, 95% CI 1.4 to 6.0, p=0.010). Forty-six patients consented to follow-up blood sampling. 13 of 46 patients had an increase in CAML size >50 μm, whereas 3 patients had a decrease to <50 μm, resulting in increased PFS (HR=7.7, 95% CI 2.6 to 12.5, p< 0.001). Together, 90% of patients with BL and CAMLs ≥50 μm progressed within 2 years, compared with 46% of patients with CAMLs <50 μm. Widening of CAML at T1 was a better predictor of progression, with 92% of patients with CAML ≥50 μm having progression compared to 21% of patients with CAML <50 μm. Notably, 100% of patients with CAMLs ≥50 μm at both BL and T1 progressed. By comparison, only 11% of patients with CAMLs <50 μm at both BL and T1 progressed. In multivariate analysis, CAML size was the most important indicator of PFS and OS, independent of all other clinical variables including stage.
このデータは、根治的放射線療法を受けている肺がん患者の場合、拡大したCAMLsの存在が、治療に耐性がある患者を予測するように見えることを示唆している。さらに、これらの循環間質細胞は、治療後に進行し易い患者の予後であり得る患者の逐次モニタリングに有用であるように見える。
引用
This data suggests that for lung cancer patients receiving definitive radiotherapy, the presence of enlarged CAMLs appears to predict which patients will be resistant to treatment. Additionally, these circulating stromal cells appear to be useful for sequential monitoring of patients, which may have a prognosis for patients prone to progression after treatment.
Quote
Claims (20)
第2及び任意の追加の試料におけるCAMLsの平均サイズが、第1の試料におけるCAMLsの平均サイズと比較して減少している場合、がんは、被検者において進行しないであろうことを示し；又は
第2及び任意の追加の試料におけるCAMLsの平均サイズが、第1の試料におけるCAMLsの平均サイズと比較して維持され又は増加している場合、がんは、被検者において進行するであろうことを示し；又は
第1の試料中の少なくとも1つのCAMLsのサイズが約50μm以上で、第２及び任意の追加試料の各細胞のサイズが約50μm未満の場合、がんは進行しないであろうことを示し；又は
第1の試料の各CAMLのサイズが約50μm未満で、かつ第2及び任意の追加試料の少なくとも1つのCAMLのサイズが約50μmより大きい場合、がんは進行するであろうことを示す方法。 A method of indicating the likelihood of cancer progression in a subject with cancer, comprising: in first and second blood samples obtained from the subject with cancer, and in any additional blood sample. determining the size of the CAMLs, the first sample being obtained from the subject before or during cancer treatment, the second sample and any additional samples being obtained after at least one cancer treatment; obtained from the subject;
If the average size of CAMLs in the second and any additional samples is decreased compared to the average size of CAMLs in the first sample, it indicates that the cancer will not progress in the subject. or the cancer has progressed in the subject if the average size of the CAMLs in the second and any additional samples is maintained or increased compared to the average size of the CAMLs in the first sample. or the cancer will not progress if the size of at least one CAML in the first sample is greater than or equal to about 50 μm and each cell in the second and any additional samples is less than about 50 μm; or if the size of each CAML in the first sample is less than about 50 μm and the size of at least one CAML in the second and any additional samples is greater than about 50 μm; A way to show what could be.
（a）約14～64μmのサイズを有する複数の個々の核及び/又は１つ以上の融合核;
（b）サイズが約20～300μmの細胞サイズ;及び
（c）紡錘形、オタマジャクシ、円形、楕円形、2本足、3本以上の足、細い足、及び無定形からなるグループから選択された形態学的形状。 A method according to any of claims 1 to 4, wherein the CAMLs have the following characteristics:
(a) a plurality of individual nuclei and/or one or more fused nuclei having a size of approximately 14-64 μm;
(b) a cell size of approximately 20-300 μm in size; and (c) a morphology selected from the group consisting of spindle-shaped, tadpole, round, oval, two-legged, three or more legs, slender legs, and amorphous. scientific shape.
（d）CD14陽性表現型;
（e）CD45発現;
（f）EpCAM発現;
（g）ビメンチン発現;
（h）PD-L1発現;
（i）単球CD11Cマーカーの発現;
（j）内皮CD146マーカーの発現;
（k）内皮CD202bマーカーの発現;
（l）内皮CD31マーカーの発現;及び
（m）上皮がん細胞CK8、18、及び/又は19マーカーの発現。 The method of claim 5, wherein the CAMLs have one or more of the following additional properties:
(d) CD14 positive phenotype;
(e) CD45 expression;
(f) EpCAM expression;
(g) vimentin expression;
(h) PD-L1 expression;
(i) Monocyte CD11C marker expression;
(j) Expression of endothelial CD146 marker;
(k) Expression of endothelial CD202b marker;
(l) Endothelial CD31 marker expression; and (m) epithelial cancer cells CK8, 18, and/or 19 marker expression.
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