JP7442624B2

JP7442624B2 - 肢虚血を治療するための活性化間葉系幹細胞

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Publication number: JP7442624B2
Application number: JP2022512807A
Authority: JP
Inventors: ローグ、アンドラス; カザントセヴァ、イェカテリーナ; ヴァサール、オラヴィ; メレン、ティート; ヴァサール、トリーン; ライク、マルト
Original assignee: チェリンテクノロジーズオーユー; タースタバキルルギアクリーニクエイエス
Priority date: 2019-08-27
Filing date: 2019-08-27
Publication date: 2024-03-04
Anticipated expiration: 2039-08-27
Also published as: US20220347223A1; WO2021038275A1; KR20220047874A; EP4022039B1; EP4022039C0; CA3152963A1; CN114269901A; JP2022548500A; HRP20240538T1; AU2019463156A1; EP4022039A1

Description

細胞療法の進歩及び成功は、再生組織及び器官への増殖、分化及び統合の刺激によって幹細胞を操作することを可能にする技術に依存する。単離された幹細胞は、細胞単離、細胞増殖、移植のための前処置及び移植後処置を含む細胞療法手順の異なる段階で操作することができる。本発明は、脂肪組織から単離された間葉系幹細胞の活性を調節するための臨床的に承認された抗炎症薬の使用に関する。血管新生因子及びサイトカインを含む様々な増殖因子の分泌の調節、並びに代謝活性の調節を使用して、様々な健康状態の治療のための効率的なＭＳＣベースの医薬品を開発することができる。

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、インビトロで様々な細胞系譜に分化し、再生過程において免疫調節機能を有する能力を特徴とする（Ａｕｇｅｌｌｏ及びＤｅＢａｒｉ、２０１０年）（Ｓｈｉら、２０１０年）。特定の活性成分を特定の用量で送達する薬学的処置とは異なり、ＭＳＣは、外部刺激に応答して様々な生物活性化合物を分泌することによって治療効果を発揮する（Ｍａら、２０１４年）。ＭＳＣによって産生される可溶性因子は、組織傷害及び再生に大きな影響を及ぼす抗炎症及び血管新生プロセスに関与する。ＭＳＣを使用して処置することができる疾患の中には、例えば、心筋梗塞、糖尿病、移植片対宿主病及び肝硬変などの免疫障害及び非免疫障害がある（Ｗｅｉら、２０１３年）（Ｓｈｉら、２０１０年）。ＭＳＣの免疫調節特性及び炎症性微小環境がそれらの機能にどのように影響するかを理解することは、治癒及び組織再生を刺激するための局所的及び／又は全身的状態を作り出すことを目的として、ＭＳＣの治療効率を高めるためのより良好な戦略を開発するために非常に重要である。

末梢動脈疾患は、血管の機能不全による酸素及びグルコースの供給制限を特徴とする状態である。末梢血管疾患は、一般に動脈を冒し、最も進行した段階では重症肢虚血（ＣＬＩ）を引き起こす。今日まで、最も一般的な治療選択肢としては、薬理学的治療及び外科手術が挙げられる（Ｎｏｒｇｒｅｎら、２００７年）、（Ｈａｍｄｙら、２０１３年）、（Ｃｕｌｌら、２０１４年）。非ステロイド性抗炎症薬及び合成グルココルチコイド注射は、ＣＬＩ患者の疼痛及び炎症を軽減するために広く使用されている。しかし、多くの場合、疾患進行の結果は壊疽及び肢切断である。新しい高度な治療法の開発は、臨床転帰を改善し、患者の生活水準を高めることができる。虚血状態の処置のためのＭＳＣの臨床的可能性が、いくつかの動物モデル及び初期段階のヒト臨床試験において記載されている（Ｌｉｅｗ及びＯ’Ｂｒｉｅｎ、２０１２年）。急性虚血性障害の処置のためのＭＳＣの投与の効率及び安全性は、大きな可能性を示す。ＭＳＣの治療効率は、炎症を抑制し、血管形成を刺激する免疫調節因子及び血管新生因子を提供するＭＳＣの能力に依存する。非活性化ＭＳＣは低レベルの免疫抑制因子を発現するが、注射部位における局所状態はそれらの機能性に影響を及ぼす。ＭＳＣの治療効果を改善するために、様々な戦略が開発されている。ＩＦＮγ又はＴＮＦαによるＭＳＣの刺激を使用して、免疫調節因子の分泌を誘導している（Ｃｒｏｐら、２０１０年）。また、ＭＳＣにおけるＣＸＣＲ４の過剰発現は、非修飾細胞と比較して、虚血組織へのＭＳＣのより効果的なホーミングをもたらす（Ｃｈｅｎｇら、２００８年）。したがって、ＭＳＣの免疫抑制作用及び血管新生作用を、患部組織／罹患組織における条件を変化させることによって、又は移植の前にＭＳＣを前処置することによって刺激することができた。肢虚血を有する患者は異なる抗炎症薬で処置されるので、ＭＳＣの抗炎症及び血管新生機能に対するこれらの薬物の結果の理解は極めて重要である。ＮＳＡＩＤの大部分は、シクロオキシゲナーゼ酵素の阻害によるプロスタグランジン合成の遮断を介して機能する。プロスタグランジンＰＧＥ２は、炎症の調節に関与するＭＳＣによって分泌される重要な化合物の１つであることが知られている。しかし、ＭＳＣ抗炎症療法における複合的な代謝応答並びに抗炎症因子及び血管新生因子の分泌に対するＮＳＡＩＤの効果は知られていない。

細胞周期、代謝活性、並びにＡｄＭＳＣによる血管新生及び炎症性サイトカインの発現に対する治療用量で、虚血性障害を処置するために臨床診療において使用されるＮＳＡＩＤ（パラセタモール、メタミゾール（ａｎａｌｇｉｎ）、ケトプロフェン及びジクロフェナク）及びグルココルチコイドプレドニゾロンの効果を分析し、以下に記載する。

本発明の目的は、肢切断を回避するために、閉塞血管を置換するための血管形成増殖用の医薬品を提供することである。

本発明者らは、間葉系幹細胞を刺激して、虚血肢における再生に影響を及ぼし、血管新生及び動脈形成を改善する調節因子を分泌させるためのプロトコルを開発した。活性成分がメタミゾールであるメタミゾール（ａｎａｌｇｉｎ）によるＭＳＣの処置は、細胞周期を変化させ、血管新生栄養因子ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＴＥＫ及びｂＦＧＦの合成を刺激し、炎症性サイトカイン及びケモカイン、例えば、ＩＬ６、ＩＬ１ＲＮ、ＣＣＬ２、ＩＬ８／ＣＸＣＬ８などの発現を低下させる。

肢虚血のラットモデルの使用は、移植前のメタミゾール（ａｎａｌｇｉｎ）によるＭＳＣの処置が、手術肢の血管新生及び動脈形成を刺激することを示す。

以下の研究例によれば、ＡｄＭＳＣは、重症肢虚血（ＣＬＩ）を処置するための細胞療法のための包括的かつ有望な細胞供給源である。ＣＬＩ患者の治療のためのＭＳＣの適用の有望な予備研究にもかかわらず、ＭＳＣの可能性はあまり効果的ではなく、診療所におけるそれらの実行可能な使用について多くの疑問が生じる。最近、ＭＳＣの前処置及び前活性化が、それらの免疫学的及び治療的可能性をかなり改善することが示された。本発明は、ＮＳＡＩＤメタミゾール（ａｎａｌｇｉｎ）によるＡｄＭＳＣの前活性化によるＣＬＩの治療のための新しい戦略を提案する。メタミゾールによるＡｄＭＳＣのプライミングは、ＡｄＭＳＣの増殖及び代謝活性に影響を及ぼし、細胞周期を変化させ、炎症性サイトカイン及びケモカインの発現プロファイルを動的に調節し、疾患の処置との関連で重要な血管新生マーカーの発現を誘導する。ラットでの前臨床実験は、メタミゾール（ａｎａｌｇｉｎ）によって活性化されたＡｄＭＳＣが、それらの加速された信頼性の高い動脈新生及び血管新生によって肢虚血を処置するためのそれらの治療的適用についてより効果的であることを実証した。

本発明では、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の活性化によって、血管新生増殖因子ＶＥＧＦＡ、ＨＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＥＫの分泌が刺激され、炎症促進性サイトカインＩＬ６、ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２、ＩＬ１－ＲＮのレベルが低下する。

本発明は、ヒト患者の肢虚血を治療するための、メタミゾール処置された間葉系幹細胞を提供する。本発明の医薬品は、メタミゾール処置された間葉系幹細胞を含む。生成物は注射可能な形態であり、好ましくは患者１ｋｇ当たり１００万個の細胞を含む。細胞は、患者の体重１ｋｇ当たり０．７５～１５０万個の量で投与される。メタミゾール処置細胞はマイクロ濃度である。

本発明はまた、メタミゾール処置された間葉系幹細胞を含む生成物の生成方法を開示する。本方法は、
脂肪組織を採取することと、
脂肪組織から間葉系幹細胞を分離することと、
ＭＳＣを再生することと、
ＭＳＣに活性成分を作用させることとを含む。

研究によれば、ＭＳＣをメタミゾールで処置することは、生成物が有効であるための利点及び推定を提供する。

処置の結果として、ＭＳＣは、新しい動脈の増殖を加速する新しい血管増殖のためのタンパク質及びシグナル伝達分子を産生する。ＭＳＣに対する異なる薬物の効果及び本発明で使用される薬物メタミゾールが研究されており、以下に記載される。本発明の生成物は、動物での試験に成功している。

幹細胞は、血管新生及び動脈新生に関与することが既に知られており、以前の実験室研究及び動物実験の目的は、最も有効な細胞薬物の組み合わせを見出すことであった。重症下肢虚血を有する患者にとって時間は重要であるため、可能な限り迅速に作用する細胞性薬物を見出すことが重要である。本発明の生成物はこれまで動物でのみ試験されてきたが、先行技術によれば、ヒト患者に対して同じ効果を有すると考えられる。

添付の図面は以下を示す。

抗炎症薬（ＡＩＤ）で処置したＭＳＣのＷＳＴ代謝活性アッセイを示す図である。対照及びＡＩＤ処置（パラセタモール、メタミゾール（ａｎａｌｇｉｎ）、ジクロフェナク、ケトプロフェン、プレドニゾロン）ＡｄＭＳＣのためのＷＳＴ－１試薬との２時間のインキュベーション後、４４０ｎｍで吸光度を測定した。ＡｄＭＳＣ代謝活性を、処置の１、２、３及び５日後に測定した。対照及びＡＩＤ処置ＡｄＭＳＣの細胞周期分析を示す図である。ＡＩＤ処置及び対照ＡｄＭＳＣを、処置の２４時間後にヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色し、ＢＤＡｃｃｕｒｉＣ６によるフローサイトメトリーを使用して分析した。ＡｄＭＳＣにおける血管新生マーカー発現に対するＡＩＤの効果を示す図である。ＡＩＤで２４時間処置したＡｄＭＳＣにおけるＶＥＧＦＡ、ＨＧＦ、ｂＦＧＦ及びＴＥＫｍＲＮＡ発現レベルをＲＴ－ｑＰＣＲによって三連で測定し、ＧＡＰＤＨｍＲＮＡ発現レベルで正規化した。ＡＩＤ処置細胞からのデータを、対照未処置ＡｄＭＳＣに対して相対的に計算し、結果を対数スケールで表す。正の値は、対照未処置細胞と比較してｍＲＮＡレベルの増加を示し、負の値は減少を示した。ヒートマップとして表した、ＬＰＳ刺激及びＡＩＤ処置した２４時間ＡｄＭＳＣにおける炎症遺伝子の相対的ｍＲＮＡ発現を示す図である。発現レベルをＲＴ－ｑＰＣＲによって三連で測定し、ＧＡＰＤＨｍＲＮＡ発現レベルで正規化した。ＬＰＳ刺激したＡＩＤ処置ＡｄＭＳＣからのデータを、ＬＰＳ処置細胞と比較した相対倍率差として計算し、対数スケールに変換した。遺伝子発現の定量的変化を色で表し、赤色は上方制御を示し、青色は下方制御を示す。ＧＥＮＥ－Ｅソフトウェアを使用して発現データを可視化した。培地中の炎症因子の変化を示す図である。分泌されたＩＬ６、ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２及びＩＬ１ＲＮレベルを、対照、ＬＰＳ刺激、並びにＬＰＳ刺激及びパラセタモール又はプレドニゾン処置ＡｄＭＳＣの条件培地から２４、４８及び７２時間でＥＬＩＳＡによって測定し、対照の２４時間プローブに対して正規化されたものとして表した。ＬＰＳ刺激及びＡＩＤ処置ＡｄＭＳＣにおける炎症遺伝子の発現プロファイルのヒートマップを示す図である。４８時間（Ａ）及び７２時間（Ｂ）の間のＬＰＳ刺激及びＡＩＤ処置のＡｄＭＳＣの炎症遺伝子ｍＲＮＡ発現レベルを、ＬＰＳ処置ＡｄＭＳＣと比較した倍率差として計算し、ヒートマップとして表した。炎症遺伝子ｍＲＮＡの発現レベルをＲＴ－ｑＰＣＲによって三連で測定し、ＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベルで正規化し、対数スケールに変換した。対照ＬＰＳ処置ＡｄＭＳＣと比較して、正の値（赤色）はより高い発現を示し、負の値（青色）はより低い発現を示す。血管造影法と灌流の差との間の相関分析を示す図である。（Ａ）は血管形成及び灌流の差を示し、（Ｂ）は動脈形成及び灌流の差を示す。実線の回帰直線が当てはめられ、一方、点線は９５％信頼区間を表す。処置群のカプラン・マイヤー生存分析を示す図である。点線は９５％信頼区間を表す。ＢＥＡＵＬＩｎ＝８、ＣＹＴＯＲＩｎ＝１３、ＭＳＣｎ＝８、ＭＳＣＤｎ＝８及びＳＡＬＩＮＥｎ＝１６。処置群間の灌流の差の一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を示す図である。（Ａ）は術前のデータを示し、（Ｂ）は術後のデータを示し、（Ｃ）は術後３日のデータを示し、（Ｄ）は術後７日のデータを示し、（Ｅ）は術後１４日のデータを示す。ＢＥＡＵＬＩ－吸引脂肪組織を用いて手術及び処置した動物群、ＣＹＴＯＲＩ－ＣｙｔｏｒｉＣｅｌｌｕｔｉｏｎ８００／ＣＲＳＳｙｓｔｅｍ由来細胞で処置した動物群、ＭＳＣ－実験室において単離され、増殖された間葉系幹細胞、ＭＳＣＤ－１０μＭメタミゾール（ａｎａｌｇｉｎ）で処置した間葉系幹細胞、ＳＡＬＩＮＥ－０．９％ＮａＣｌで処置した対照動物。処置群間の血管形成及び動脈形成の一元配置分散分析を示す図である。（Ａ）血管形成及び（Ｂ）動脈形成の分散分析。ＢＥＡＵＬＩ－吸引脂肪組織を用いて手術及び処置した動物群、ＣＹＴＯＲＩ－ＣｙｔｏｒｉＣｅｌｌｕｔｉｏｎ８００／ＣＲＳＳｙｓｔｅｍ由来細胞で処置した動物群、ＭＳＣ－実験室において単離され、増殖された間葉系幹細胞、ＭＳＣＤ－１０μＭメタミゾール（ａｎａｌｇｉｎ）でプライミングした間葉系幹細胞、ＳＡＬＩＮＥ－０．９％ＮａＣｌで処置した対照動物。一連のＭＳＣＤ処置動物からの血管造影を示す図である。一連のＭＳＣ処置動物からの血管造影を示す図である。

ＡＩＤはＭＳＣの代謝活性及び細胞周期進行に影響を及ぼす
代謝活性に対するパラセタモール（４．４ｍＭ）、ジクロフェナク（１０μＭ）、メタミゾール（ａｎａｌｇｉｎ）（１０μＭ）、ケトプロフェン（５０μＭ）及びプレドニゾロン（０．１μＭ）の効果の分析を、ドナー変異の効果を低下させるために少なくとも３人のドナーから単離されたＡｄＭＳＣのプールを使用して行った。代謝活性アッセイ（ＷＳＴ－１）データは、ＡＩＤがＡｄＭＳＣの代謝活性をわずかに変化させることを示した（図１）。最初の４８時間の間、分析した全てのＡＩＤがＡｄＭＳＣの代謝活性を刺激した。メタミゾール（ａｎａｌｇｉｎ）処置は最初の２４時間で細胞代謝を有意に刺激したが、試験した全ての薬物はＡｄＭＳＣの代謝活性に対する長期抑制効果を示した（図１）。

フローサイトメトリーによって測定された細胞周期変化に対する薬物の効果を図２に示す。非処置対照細胞（Ｇ０／Ｇ１期－８２％）と比較して、Ｇ０／Ｇ１期の細胞の割合は、ジクロフェナク（８１％）、ケトプロフェン（８０％）及びプレドニゾロン（７７％）による処置で有意に影響されなかった（図２）。Ｇ０／１期の細胞の割合は、メタミゾール（ａｎａｌｇｉｎ）（６５％）及びパラセタモール（７１％）で処置した培養物ではより低かったが、Ｇ２／Ｍ細胞周期相の細胞の割合はこれらの培養物で増加した（図２）。得られた結果は、メタミゾール（ａｎａｌｇｉｎ）及びパラセタモールが、Ｇ２／Ｍ期にＡｄＭＳＣを蓄積したので、細胞周期に影響を及ぼす唯一の研究された薬物であることを示す。

結論として、試験した全てのＡＩＤはＡｄＭＳＣの代謝活性に影響を及ぼしたが、メタミゾール（ａｎａｌｇｉｎ）及びパラセタモールは細胞周期進行もわずかに変化させた。

ＡＩＤは血管新生因子の発現に影響を及ぼす
ＭＳＣによって産生される多数の可溶性因子が、インビボでの血管形成及び血管新生の調節に関与する（Ｅｓｔｒａｄａら、２００９年）。一方、ＭＳＣは、特定の条件において血管形成を阻害することが明らかにされている（Ｏｔｓｕら、２００９年）。また、栄養因子ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦは、虚血の処置において血管形成を刺激することが示されている（Ｌｅｕｎｇら、１９８９年）。ＡｄＭＳＣにおける血管新生因子の発現に対するＡＩＤの効果を分析した。異なるＡＩＤは、それらの発現を刺激するか又は抑制するかのいずれかで血管新生因子の発現に異なって影響した。メタミゾール（ａｎａｌｇｉｎ）及びケトプロフェンによるＡｄＭＳＣの処置は、ＶＥＧＦＡ、ＨＧＦ、ｂＦＧＦ及びＴＥＫｍＲＮＡ発現の上方制御をもたらし（図３）、ジクロフェナクは効果がなく、パラセタモール及びプレドニゾロンはＶＥＧＦＡ及びＨＧＦ発現を阻害した。更に、パラセタモールはｂＦＧＦを誘導したが、ＴＥＫ発現を強く抑制したのに対して、プレドニゾロンは反対の効果を有した（図３）。

免疫調節因子の発現に対するＡＩＤの効果
ＭＳＣによって分泌されるいくつかの炎症性サイトカイン及びケモカインは、免疫調節のプロセスに関与し、それにより、免疫担当細胞に影響を及ぼす。ＭＳＣによって分泌されるサイトカインのレベルにおける定量的差異は、微小環境の局所的条件を決定し、抗炎症反応を誘導する。ＡＩＤ処置と組み合わせたＭＳＣ治療に応答した炎症性バイオマーカープロファイルの同定は、全体として免疫学的状態に対するそのような介入の結果を予測することができた。タンパク質及び遺伝子発現レベルでのＡｄＭＳＣの炎症プロファイルに対するＡＩＤ処置の効果を分析した。

標準的な培養条件におけるパラセタモール、ジクロフェナク、メタミゾール（ａｎａｌｇｉｎ）、ケトプロフェン及びプレドニゾロンへのＡｄＭＳＣの曝露は、免疫調節因子の合成及び分泌にわずかな影響しか及ぼさない（表１）。パラセタモールのみが、未処置細胞と比較して、培養培地中のＩＬ６、ＣＸＣＬ８／ＩＬ８及びＣＣＬ２レベルの有意な低下をもたらした。

炎症状態を模倣するために、ＡＩＤ処置の前にＡｄＭＳＣをリポ多糖（ＬＰＳ）に曝露した。炎症性サイトカインＩＬ６、ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２及びＩＬ１ＲＮのレベルは、ＬＰＳ処置後に増加した（表１）。次いで、ＬＰＳ処置ＡｄＭＳＣをＡＩＤに曝露して、炎症状態におけるサイトカインに対するそれらの効果を試験した。

パラセタモール及びプレドニゾロンは、ＬＰＳ刺激ＡｄＭＳＣ培養物におけるＩＬ６及びＣＸＣＬ８のレベルを有意に低下させた（表１）。メタミゾール（ａｎａｌｇｉｎ）の阻害効果は、ＣＣＬ２及びＩＬ１ＲＮ発現で検出可能であった。対照的に、ケトプロフェン及びジクロフェナクは、ＬＰＳ刺激ＡｄＭＳＣ培養物においてＩＬ６及びＣＸＣＬ８の発現を刺激した。興味深いことに、ケトプロフェン及びジクロフェナクへのＡｄＭＳＣの曝露は、ＣＣＬ２レベルに影響を及ぼさなかった。

表１．ＡＩＤ処置に応答したＡｄＭＳＣによる炎症因子の分泌。分泌されたＩＬ６、ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２及びＩＬ１ＲＮタンパク質の濃度（ｐｇ／ｍｌ）を、対照、ＬＰＳ刺激したＡｄＭＳＣ及びＡＩＤで２４時間処置したＡｄＭＳＣの培地からＥＬＩＳＡによって測定した。

ＡｄＭＳＣにおける炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現に対するＡＩＤの効果を、ＲＴ－ｑＰＣＲ技術を使用して分析した。分析結果を、ＧＥＮＥ－Ｅプラットフォームを使用してヒートマップグラフとして可視化した（図４）。ＡＩＤによるＡｄＭＳＣの短期処置は、炎症性サイトカインの発現に影響を及ぼした。試験した全てのＡＩＤにＡｄＭＳＣを２４時間曝露すると、ＩＬ－１ＲＮ、ＩＤＯ１、並びにケモカインＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０のレベルが有意に低下したが、ＩＬ４ｍＲＮＡ発現が誘導された（図４）。炎症促進性サイトカインＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＴＮＦ、ＩＬ６、ＩＬ１Ａ及びＩＬ１Ｂの発現は、ケトプロフェン及びメタミゾール（ａｎａｌｇｉｎ）処置によって抑制された。ＮＳＡＩＤ処置は、異なるＴＧＦβファミリーメンバーの発現に対して反対の効果を有するが、ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ３は抑制され、ＴＧＦβ２発現はパラセタモール及びジクロフェナク処置後に刺激された（図４）。全体として、これらのデータは、様々なＡＩＤが、特定の炎症性サイトカインの発現を刺激又は抑制する短期処置においてさえ、ＡｄＭＳＣトランスクリプトームプロファイルを異なって変化させたことを示している。

ＬＰＳ誘導ＡｄＭＳＣのＡＩＤ処置がサイトカインレベルに長期の変化を示すかどうかを調べるために、培養培地中のサイトカインレベルに対するパラセタモール及びプレドニゾロンの効果を分析した。血清欠乏状態におけるＬＰＳ誘導性ＡｄＭＳＣの単回処置でさえ、それらのサイトカインプロファイルに有意に影響を及ぼした（図５）。ＣＣＬ２、ＩＬ６及びＩＬ－１ＲＮのレベルが、対照の未処置ＡｄＭＳＣの培地において３日間にわたって増大した。ＬＰＳによるＡｄＭＳＣの活性化は、分析した各時点においてＣＣＬ２、ＣＸＣＬ８、ＩＬ６及びＩＬ－１ＲＮの発現を誘導した。本発明者らの結果は、パラセタモール処置が対照培養物と比較してＬＰＳ処置培養物中のＣＣＬ２のレベルを低下させ、その期間中にＣＸＣＬ８、ＩＬ６及びＩＬ－１ＲＮ発現に有意な影響を及ぼさなかったことを示している（図５）。ＣＣＬ２及びＩＬ６発現の場合、おそらくこれらの薬物の背後にある様々な機構の影響のために、プレドニゾロン治療の効果はパラセタモールとは反対であった。したがって、プレドニゾロンは、全ての時点でＣＣＬ２の発現を有意に刺激したが、ＩＬ－１ＲＮを阻害し、処置の７２時間後にＩＬ６のレベルを中程度に誘導した（図５）。

ＡｄＭＳＣにおけるサイトカインのｍＲＮＡ発現に対する反復ＡＩＤ処置（４８及び７２時間）の効果を、ＲＴ－ｑＰＣＲ技術を使用して分析した。サイトカイン遺伝子の差次的発現を図６にヒートマップとして表す。分析結果は、２つの時点の間でサイトカイン遺伝子の異なる発現プロファイルを示した。様々な薬物に曝露すると、炎症促進因子及び抗炎症因子の複雑な発現パターンが観察された。ＩＬ１Ｂ、ＣＸＣＬ９、又はＣＣＬ２などのほとんどの炎症促進性サイトカインの発現は、ＡＩＤ処置時に下方制御されたが、いくつかの因子（ＴＮＦ又はＭＩＦ）のレベルはその間に回復し、薬物処置時のそれらの動的調節を示した。しかし、抗炎症因子（ＩＬ４、ＴＮＦＡＩＰ６、ＩＤＯ１）の安定した誘導発現は観察されなかった。

全体として、これらのデータは、炎症因子の発現が時間依存的に様々なＡＩＤによって有意に変化し得ることを示している。

Ｃｙｔｏｒｉ由来ＡＤＲＣを参照系として使用する筋虚血の動物モデルの設定
前臨床研究の目的は、別々に単離され、条件的に操作されたヒトＡｄＭＳＣを比較することによって、血管新生及び動脈新生を最も促進する条件及び細胞を評価することであった。これらのタイプの前臨床研究は、後肢虚血モデル（ＨＬＩＭ）の使用を意味し、虚血性筋肉の血行再建の回復は、投与された薬物（細胞）の再生能に起因して生じるが、動物自身の再生能力によるものではない。この虚血ウィンドウは、少なくとも２～３週間続くべきである。このモデルでは、更に、インビボ再生のためのＡｄＭＳＣの試験によく適しているＨＬＩＭのヘリングマンモデルの開発に成功した。

処置懸濁液の調製
ＢＥＡＵＬＩ：ボディジェット（軟組織欠損を処置するためのヒト医療の日常的な臨床診療）を使用して得た吸引脂肪組織。吸引脂肪組織は、水ジェット支援脂肪吸引を使用して得られる。採取した脂肪を、ＬｉｐｏＣｏｌｌｅｃｔｏｒ（登録商標）又はＦｉｌｌｅｒＣｏｌｌｅｃｔｏｒ（登録商標）を用いて残りの流体から穏やかに分離し、脂肪移植のために直ちに使用した。この技術は、脂肪細胞移植の臨床標準として使用されてきた。

ＣＹＴＯＲＩ：水－ジェット脂肪吸引で得た吸引脂肪組織をＣｙｔｏｒｉＣｅｌｌｕｔｉｏｎ８００／ＣＲＳＳｙｓｔｅｍ（ＣｙｔｏｒｉＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社）で処理した。ＣｙｔｏｒｉＣｅｌｌｕｔｉｏｎ由来の再生細胞は、脂肪移植片を濃縮するため、並びに移植された領域における血管形成を改善するための再生医療において、ゴールドスタンダードである。ＣｙｔｏｒｉＣｅｌｌｕｔｉｏｎ８００／ＣＲＳＳｙｓｔｅｍは、吸引脂肪組織を使用し、コラゲナーゼで消化し、遠心分離で再生細胞を洗浄及び分離する。注入前に、有核細胞上の量を細胞カウンターで分析した。ＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒＮＣ１００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社）を使用して、生有核細胞の平均用量をカウントした。生有核細胞の平均数は０．９×１０^６細胞／ｍｌであった。

ＭＳＣ：ヒトＡｄＭＳＣを新たに単離した皮下脂肪組織から得て、以前に報告されたように特徴付けた（Ｌｉｎら、２００７年）。各投与について、少なくとも３個体及び３回までの継代数由来のＡｄＭＳＣのプールを、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＰＡＡ、オーストリア、パッチング）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＰＥＳＴ）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を補充した低グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ－ＬＧ）（Ｇｉｂｃｏ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国カリフォルニア州カールスバッド）中で増殖させた。約８０～９０％のコンフルエンスを達成して、細胞を収集し、動物あたり２×１０^５個の細胞を使用した。

ＭＳＣＤ：ＡｄＭＳＣを、前述のような標準的な培養条件において８０％～９０％のコンフルエンスになるまで増殖させ、培地を、処置の１２時間前に１％ＦＢＳ及び１％ＰＥＳＴを含有するＤＭＥＭ－ＬＧに交換し、ＬＰＳ（０．１ｕｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、ドイツ、シュタインハイム）で２時間刺激し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で激しく洗浄し、メタミゾール（ａｎａｌｇｉｎ）（１０μＭ）で２４時間処置した。細胞を収集し、動物あたり２×１０^５個の細胞を使用した。

ＳＡＬＩＮＥ：対照シリーズでは、ラットを生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）注射で処置した。

動物試験
前臨床動物試験のために、４つの異なる処置（ＢＥＡＵＬＩ、ＣＹＴＯＲＩ、ＭＳＣ及びＭＳＣＤ）を試験した。各シリーズにおいて、１１匹の動物を手術し、８匹を腓腹筋に注射した異なる細胞で処置し、３匹の対照動物を生理食塩水で処置した。更に、６匹の動物の別個の対照シリーズを手術した。

全ての動物実験は、動物保護のための現地法である欧州指令２０１０／６３／ＥＵ（ＬｏＫＳ）に従って設計され、エストニア農業省（現在は農務省）の倫理委員会によって承認された。

雌のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットを標準的な動物施設条件下（温度（２２±２℃）及び湿度（５５±１０％）が制御された室内で、１２時間：１２時間の明：暗サイクルでケージあたり２～４匹の動物）で飼育した。動物には、標準的な維持げっ歯類用飼料及び水を自由に摂取させた。

本発明者らのシリーズでは、成体ラット（４±１月齢（ｎ＝５０）及び１つのシリーズでは１２～１３月齢（ｎ＝１１））を使用した。群の数及びサイズの詳細については、統計分析の節を参照されたい。

手術方法
動物を全身麻酔（ケタミン（１００ｍｇ／ｍｌ、Ｖｅｔｏｑｕｉｎｏｌ社、フランス）とメデトミジン（１ｍｇ／ｍｌ、Ｓｙｖａ社、スペイン）の混合液をそれぞれ７５ｍｇ／ｋｇと０．５ｍｇ／ｋｇを腹腔内に投与）下で仰臥位で手術した。右肢を切開した。外腸骨動脈、大腿動脈、膝窩動脈及び全ての側枝を露出させた。様々なサイズのタンタルマイクロクリップを使用して、動脈及び側枝を閉塞した。タンタルマイクロクリップは、血管造影検査時の良好なマーカーである。電気焼灼を使用して、腸骨動脈及び静脈並びに大腿動脈及び静脈を切除した。処置群の細胞懸濁液０．４ｍｌ又は対照群の０．９％生理食塩水を動物の腓腹筋に注射した。皮膚を断続縫合で閉じ、皮膚ステープラで固定した。アチパメゾール（５ｍｇ／ｍｌ、Ｓｙｖａ社、スペイン）１ｍｇ／ｋｇの皮下注射によって麻酔を回復させた。動物の体重を毎日測定し、疼痛の徴候についてモニターし、回復期間中に鎮痛薬（ブプレノルフィン（０．３ｍｇ／ｍｌ、Ｒｉｃｈｔｅｒｐｈａｒｍａ社、オーストリア）０．０１～０．０３ｍｇ／ｋｇを必要に応じて６～１２時間毎に最低でも最初の３日間与え、ケトプロフェン（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｍｅｒｉａｌ社、フランス）５ｍｇ／ｋｇを必要に応じて２４時間毎に最低５日間与えた。体重減少が２０％を超えるか、又は重篤な疼痛及び苦痛若しくは瀕死の状態の累積的徴候が観察された場合、安楽死を適用した。

レーザードップラー血液灌流測定
動物は全身麻酔下にあった（外科的介入の日には深部外科手術を行い、灌流測定のみには半量）。測定領域では、電気シェーバー及び除毛クリームを使用して毛を除去した。動物を、３７℃の温度に維持するために、加熱され温度制御された表面に５分間置いた。測定にはＰｅｒｉＣａｍＰＳＩ（ＰｅｒｉｍｅｄＡＢ）を使用した。測定距離は１５ｃｍであった。加熱及び温度制御された表面で測定を行った。両肢において、関心領域（ＲＯＩ）を選択した。測定は、手術前、手術直後、並びに手術の３、７及び１４日後に行った。標準的な条件にもかかわらず、異なる動物は灌流が異なるので、同じ動物の手術肢と対照肢との差及び比較差を分析に使用した。

血管造影
手術後１４日目に血管造影を行った。動物は、加熱及び温度制御された表面上で、背臥位で全身麻酔をかけた。腹部大動脈を露出させた腹壁に正中切開を行った。大動脈カニューレ挿入のために、造影剤Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ３００と共にＭｉｃｒｏＳｌｉｄｅキット（ＧａｌｔＭｅｄｉｃａｌ社）を使用した。デジタルサブトラクション血管造影を、ＺｉｅｈｍＶｉｓｉｏｎＲＦＤ、２０ｋＷ（ＺｉｅｈｍＩｍａｇｉｎｇ社）を使用して行った。

試験群を知らない２人の血管外科医が血管造影結果を分析した。分析では、検出可能な血管の総量、並びに血管形成とは別に動脈新生を見るためにカールした血管の数をカウントした。

統計解析
ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ及びＪＭＰ１０．０ＳＡＳ統計解析ソフトウェアによって統計解析を行った。線形回帰を使用して、血管形成又は動脈形成と灌流との間の関係を分析した。カプラン・マイヤー法を使用して生存を分析し、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、異なる処置群間の灌流の平均差及び新しい血管の平均値を比較した。平均比較のために、ダネットの事後検定を使用して、処置群を生理食塩水対照群と比較した。手術前後で灌流差に変化がなかった場合（３灌流単位未満）、虚血のモデル化は動物において失敗したと考えられ、これらの全ての症例（３匹の生理食塩水処置対照動物）を統計分析から除外した。２つのシリーズのＣＹＴＯＲＩ処置動物が存在し、それらのうちの一方において、より高齢のラットが使用されたが、より高齢のＣＹＴＯＲＩ処置ラットとより若齢のＣＹＴＯＲＩ処置ラットとの間でいかなる測定値においても統計学的に有意な差がなかったので、これらの２つのシリーズの８匹の動物を１つの処置群（ｎ＝１６）と見なした。

結果
レーザードップラー血液灌流測定と血管造影所見との間の相関分析を図７に示す。

手術の７日後に測定された灌流差（対照脚部の灌流－手術脚部の灌流）と、血管形成及び動脈形成の両方（手術の１４日後に行われた血管造影）との間に統計学的に有意な負の相関がある。Ｒ＝０．５１、それぞれ血管形成についてｐ値０．００３１及びＲ＝０．４６、動脈形成についてｐ値０．００９５、両方についてｎ＝３１。予想通り、相関分析は、手術脚部に良好な灌流がある場合、より多くの新しい血管も存在することを示している。

生存分析を図８に示す。

異なる処置群間で生存に統計学的に有意な差はない。

灌流の差の分析を図９に示す。

図９に見られるように、手術前、手術直後及び手術３日後の群間に統計学的に有意な差はない。生理食塩水処置対照と比較して、７日後にはＭＳＣＤに、１４日後にはＣＹＴＯＲＩ群に、それぞれＰ値０．０００８、０．０３２２と統計的に有意な改善がある。分析は、メタミゾール（ａｎａｌｇｉｎ）でプライミングされたＭＳＣで処置された動物（試験群ＭＳＣＤ）が、手術後７日目に既に他の群よりも速い血液灌流の回復を有することを示した（Ｐ値０．０００８）。ＭＳＣ群とＳＡＬＩＮＥ群との間の差は統計学的に有意ではなく、これはおそらくＭＳＣ群のサイズが小さいためである（７日目まで生存した動物は８匹のうち３匹のみ）。

異なる細胞処置群間の血管形成の分析を図１０に示す。

ＣＹＴＯＲＩ、ＭＳＣ及びＭＳＣＤ処置動物については、生理食塩水対照群動物と比較して有意に良好な血管新生が観察された（Ｐ値は、血管形成と動脈形成の両方について、全ての群で０．０００１未満であり、ＭＳＣ群の動脈原性分析については、Ｐ値は０．０３４である）。

処置については盲検化された２人の血管外科医が血管造影の結果を分析した。分析では、検出可能な全ての血管の総量及びカールした血管の量（全ての血管のうちの割合）をカウントして、全体的な血管形成及び動脈新生をそれぞれ評価した。血管造影画像から、ＭＳＣ及びＭＳＣＤ処置動物では、手術肢での有効な動脈新生及び血管新生が観察されたことが明確に分かる。

Claims

ヒトの肢虚血の治療における使用のための、メタミゾール処置された間葉系幹細胞を含む生成物。
患者の体重１ｋｇ当たり１００万個のメタミゾール処置された間葉系幹細胞の用量で注射される、請求項１に記載の生成物。
メタミゾール処置された間葉系幹細胞が、患者の体重１ｋｇ当たり７５万～１５０万個の量で投与される、請求項１又は２に記載の生成物。
採取された脂肪組織から間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を分離することと、
ＭＳＣを再生することと、
ＭＳＣにメタミゾールを作用させることと、
を含む、請求項１に記載の生成物を生成する方法。
インビトロで間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を活性化する方法であって、インビトロでＭＳＣにメタミゾールを作用させることによって、前記ＭＳＣによる血管新生増殖因子ＶＥＧＦＡ、ＨＧＦ、ｂＦＧＦ、及びＴＥＫの分泌を刺激し、前記ＭＳＣの炎症促進性サイトカインＣＣＬ２、及びＩＬ１－ＲＮのレベルを低下させることを含む、上記方法。