JP7438937B2 - 抗ｔｒｋｂモノクローナル抗体および使用の方法 - Google Patents

抗ｔｒｋｂモノクローナル抗体および使用の方法 Download PDF

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Description

本発明は、抗トロポミオシン受容体キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）モノクローナル抗体に関する。より具体的には、本発明は、抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体を含む組成物およびこれらの抗体を使用する方法に関する。
トロポミオシン受容体キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）は、ＴｒｋＡおよびＴｒｋＣを含む単一膜貫通型受容体チロシンキナーゼのファミリーに属する。これらの受容体キナーゼは、神経細胞の生存および発生に必要とされるニューロトロフィンの活性を仲介する。ニューロトロフィンには、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、およびニューロトロフィン－４／５（ＮＴ－４／５）が含まれるが、これらに限定されない。（非特許文献１）。
ＴｒｋＢは、ＢＤＮＦの高親和性受容体であるが（非特許文献２）、ＮＴ４／５に結合することも知られている。ｔｒｋＢへのＢＤＮＦの結合は、受容体の二量体化を引き起こし、受容体上の特定のチロシン残基の自己リン酸化、ならびにマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、およびホスホリパーゼＣ－γ（ＰＬＣ－γ）を含むシグナル伝達経路の活性化をもたらす。（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。ＢＤＮＦに結合した後、ＴｒｋＢは、神経細胞の分化および生存を含む、ニューロトロフィンの複数の作用を仲介する。
ＴｒｋＢは、神経細胞の生存、分化、および機能において主要な役割を果たすため、ＴｒｋＢアゴニストは、多数の神経変性障害および代謝障害の処置に関して治療的見込みを有し得る。
Ｌｏ， Ｋ Ｙら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２８０：４１７４４～５２頁（２００５年） Ｍｉｎｉｃｈｉｅｌｌｏら、Ｎｅｕｒｏｎ ２１：３３５～４５頁（１９９８年） Ｊｉｎｇら、Ｎｅｕｒｏｎ ９：１０６７～１０７９頁（１９９２年） Ｂａｒｂａｃｉｄ、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ２５：１３８６～１４０３頁（１９９４年） Ｂｏｔｈｗｅｌｌ、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １８：２２３～２５３頁（１９９５年） ＳｅｇａｌおよびＧｒｅｅｎｂｅｒｇ、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １９：４６３～４８９頁（１９９６年） ＫａｐｌａｎおよびＭｉｌｌｅｒ、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． １０：３８１～３９１頁（２０００年）
ある種のＴｒｋＢアゴニストが、米国特許出願公開第２０１０／０１５０９１４号、米国特許出願公開第２００３／０１５７０９９号、米国特許出願公開第２０１０／０１９６３９０号、および米国特許出願公開第２０１７／０１５７０９９号に記載されている。しかしながら、本明細書に記載されるものなど、神経細胞の生存および神経保護特性を示すことに加えて、特異性の好転を提供する、さらなるＴｒｋＢアゴニストの同定および開発に対する必要性が依然として存在している。
本発明は、トロポミオシン受容体キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。本発明の単離された抗体およびその抗原結合フラグメントは、ＴｒｋＢ活性または発現に関連する疾患および障害を処置するのに有用である。
広範な態様において、本発明は、ＴｒｋＢを活性化し、神経細胞の生存を促進する抗ＴｒｋＢアゴニスト抗体を提供する。これらの抗体は、神経機能を好転させるため、ならびに神経系損傷および／または慢性神経変性疾患に関連する神経細胞の損傷を含む細胞変性により部分的に特徴付けられる任意の疾患または障害を処置するために、用いることができる。
ある種の実施形態において、抗ＴｒｋＢ抗体は、眼の種々の疾患または障害を処置するために有用であり得、緑内障などであるがこれに限定されない眼の疾患を処置するために、眼内または硝子体内へのデリバリー用に製剤化することができる。
本発明の抗体は、全長（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体）であるか、または抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、もしくはｓｃＦｖフラグメント）のみを含み、機能性に影響するように、例えば、残りのエフェクター機能を除去するように修飾される（Ｒｅｄｄｙら、２０００年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５～１９３３頁）。
本発明の典型的な抗ＴｒｋＢ抗体を、本明細書における表１および２に挙げる。表１に、典型的な抗ＴｒｋＢ抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）、ならびに軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列識別名を記載する。表２に、典型的な抗ＴｒｋＢ抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３の核酸配列識別名を記載する。
本発明は、表１に挙げられるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲを含む、ＴｒｋＢに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
本発明はまた、表１に挙げられるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む、ＴｒｋＢに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
本発明はまた、表１に挙げられるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかと対形成される表１に挙げられるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかを含む、ＨＣＶＲとＬＣＶＲアミノ酸配列対（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む、ＴｒｋＢに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。ある種の実施形態によると、本発明は、表１に挙げられる典型的な抗ＴｒｋＢ抗体のいずれかに含有されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
従って、第１の態様において、本発明は、トロポミオシン受容体キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、表１に記載のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有する３つの重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）に含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）；ならびに表１に記載のアミノ酸配列またはそれ対して少なくとも９０％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含む、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
１つの実施形態において、抗ＴｒｋＢ抗体またはその抗原結合フラグメントは、
（ａ）アゴニスト抗体である特性；
（ｂ）２５℃または３７℃において表面プラズモン共鳴により測定される約２００ｎＭ未満のＫＤでヒトＴｒｋＢに結合する特性；
（ｃ）２５℃または３７℃において表面プラズモン共鳴により測定される約１０分よりも長い解離半減期（ｔ１／２）でヒトＴｒｋＢに結合する特性；
（ｄ）約３５～８２ｐＭの範囲にあるＥＣ５０で、ヒトＴｒｋＢを発現するように操作された細胞において、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の非存在下で、ヒトＴｒｋＢシグナル伝達を活性化する特性；
（ｅ）ヒトＴｒｋＢ受容体についてホモ接合性である（ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕ）マウスの海馬に注射した場合に、ＴｒｋＢリン酸化を増強する特性；
（ｆ）ヒトＴｒｋＢ受容体についてホモ接合性である（ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕ）マウスに注射した場合に、体重減少を促進する特性；
（ｇ）ヒト化ＴｒｋＢラットにおける視神経横断切断モデルにおいて評価される網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の生存を増大させる特性；
（ｈ）ＭＡＰＫ／ＥＲＫおよびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路を活性化する特性；
（ｉ）インビトロにおいて神経細胞の生存を増大する特性；ならびに
（ｊ）５ｎＭ未満のＩＣ５０で、ＴｒｋＢのＢＤＮＦおよび／またはＮＴ－４への結合を遮断する特性
からなる群より選択される１つまたはそれ以上の特性を示す。
１つの実施形態において、本発明は、トロポミオシン受容体キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって：（ａ）表１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）；および（ｂ）表１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲを含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
１つの実施形態において、ＴｒｋＢに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２、１８、３４、４９、５９、および６８からなる群より選択されるＨＣＶＲ配列のいずれか１つ、またはそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列に含有される３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）、ならびに配列番号１０、２６、４２、５３、６３、および７２からなる群より選択されるＬＣＶＲ配列のいずれか１つ、またはそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含む。
１つの実施形態において、ＴｒｋＢに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２、１８、３４、４９、５９、および６８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。
１つの実施形態において、ＴｒｋＢに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０、２６、４２、５３、６３、および７２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。
１つの実施形態において、ＴｒｋＢに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２、１８、３４、４９、５９、および６８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ、ならびに配列番号１０、２６、４２、５３、６３、および７２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。
１つの実施形態において、ＴｒｋＢに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、４９／５３、５９／６３、および６８／７２からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対のＣＤＲを含む。
１つの実施形態において、ＴｒｋＢに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２／１０、１８／２６、および３４／４２からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対のＣＤＲを含む。
１つの実施形態において、ＴｒｋＢに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、４９／５３、５９／６３、および６８／７２からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
１つの実施形態において、ＴｒｋＢに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２／１０、１８／２６、および３４／４２からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
本発明はまた、表１に挙げられるＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含む、ＴｒｋＢに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
本発明はまた、表１に挙げられるＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む、ＴｒｋＢに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
本発明はまた、表１に挙げられるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、ＴｒｋＢに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
本発明はまた、表１に挙げられるＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を含む、ＴｒｋＢに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
本発明はまた、表１に挙げられるＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含む、ＴｒｋＢに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
本発明はまた、表１に挙げられるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、ＴｒｋＢに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
本発明はまた、表１に挙げられるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかと対形成される表１に挙げられるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかを含む、ＨＣＤＲ３とＬＣＤＲ３アミノ酸配列対（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む、ＴｒｋＢに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。ある種の実施形態によると、本発明は、表１に挙げられる典型的な抗ＴｒｋＢ抗体のいずれかに含有されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ある種の実施形態において、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対は、８／１６、２４／３２、４０／４８、５２／５６、６２／６６、および７１／７５からなる群より選択される。
本発明はまた、表１に挙げられる典型的な抗ＴｒｋＢ抗体のいずれかに含有される６つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含む、ＴｒｋＢに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。ある種の実施形態において、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは：（ａ）配列番号４、６、８、１２、１４、１６；（ｂ）配列番号２０、２２、２４、２８、３０、３２；（ｃ）配列番号３６、３８、４０、４４、４６、４８；（ｄ）配列番号５０、５１、５２、５４、５５、５６；（ｅ）配列番号６０、６１、６２、６４、６５、６６；および（ｆ）配列番号６９、７０、７１、７３、７４、７５からなる群より選択される。
関連する実施形態において、本発明は、表１に挙げられる典型的な抗ＴｒｋＢ抗体のいずれかにより定義される、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対に含有される６つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含む、ＴｒｋＢに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。例えば、本発明は、２／１０、１８／２６、３４／４２、４９／５３、５９／６３、および６８／７２からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対に含有されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットを含む、ＴｒｋＢに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定する方法および技術は、当該技術分野において周知であり、これを用いて、本明細書において開示される特定されたＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定することができる。ＣＤＲの境界を同定するために用いられる典型的な慣例は、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、およびＡｂＭ定義を含む。一般的な用語において、Ｋａｂａｔ定義は配列可変性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、構造上のループ領域の位置に基づき、ＡｂＭ定義は、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａのアプローチの間で妥協したものである。例えば、Ｋａｂａｔ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７～９４８頁（１９９７年）；およびＭａｒｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：９２６８～９２７２（１９８９年）を参照。公的データベースも、抗体内のＣＤＲ配列を同定するために利用可能である。
１つの実施形態において、本発明は、ＴｒｋＢに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって：
（ａ）配列番号４、２０、３６、５０、６０、および６９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；
（ｂ）配列番号６、２２、３８、５１、６１、および７０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；
（ｃ）配列番号８、２４、４０、５２、６２、および７１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；
（ｄ）配列番号１２、２８、４４、５４、６４、および７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；
（ｅ）配列番号１４、３０、４６、５５、６５、および７４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン；ならびに
（ｆ）配列番号１６、３２、４８、５６、６６、および７５からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメインを含む、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
１つの実施形態において、本発明は、ＴｒｋＢに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって：
（ａ）配列番号４、２０、および３６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；
（ｂ）配列番号６、２２、および３８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；
（ｃ）配列番号８、２４、および４０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；
（ｄ）配列番号１２、２８、および４４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；
（ｅ）配列番号１４、３０、および４６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン；ならびに
（ｆ）配列番号１６、３２、および４８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメインを含む、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
１つの実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは：
（ａ）配列番号４－６－８－１２－１４－１６；（ｂ）配列番号２０－２２－２４－２８－３０－３２；（ｃ）配列番号３６－３８－４０－４４－４６－４８；（ｄ）配列番号５０－５１－５２－５４－５５－５６；（ｅ）配列番号６０－６１－６２－６４－６５－６６；および（ｆ）配列番号６９－７０－７１－７３－７４－７５からなる群より選択される６つのＣＤＲのセット（ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含む。
１つの実施形態において、ＴｒｋＢに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＴｒｋＢへの結合について参照抗体と競合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、ここで、参照抗体は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、４９／５３、５９／６３、および６８／７２からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
１つの実施形態において、ＴｒｋＢに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、参照抗体と同一のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、ここで、参照抗体は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、４９／５３、５９／６３、および６８／７２からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
１つの実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、２５℃または３７℃において表面プラズモン共鳴により測定される約３００ｎＭ未満のＫＤでヒトＴｒｋＢに結合する。
１つの実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、２５℃または３７℃において表面プラズモン共鳴により測定される約２００ｎＭ未満のＫＤでヒトＴｒｋＢに結合する。
１つの実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、２５℃または３７℃において表面プラズモン共鳴により測定される約１５０ｎＭ未満のＫＤでヒトＴｒｋＢに結合する。
１つの実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、２５℃または３７℃において表面プラズモン共鳴により測定される約５０ｎＭ未満のＫＤでヒトＴｒｋＢに結合する。
１つの実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、２５℃または３７℃において表面プラズモン共鳴により測定される約１００ｐＭ未満のＫＤでヒトＴｒｋＢに結合する。
１つの実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、２５℃または３７℃において表面プラズモン共鳴により測定される約１０分よりも長い解離半減期（ｔ１／２）でヒトＴｒｋＢに結合する。
１つの実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、２５℃または３７℃において表面プラズモン共鳴により測定される約４０分よりも長いｔ１／２でヒトＴｒｋＢに結合する。
１つの実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、２５℃または３７℃において表面プラズモン共鳴により測定される約１２０分よりも長いｔ１／２でヒトＴｒｋＢに結合する。
１つの実施形態において、ＴｒｋＢに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、約１００ｐＭ未満のＥＣ５０で、ＴｒｋＢを発現するように操作された細胞において、ＢＤＮＦの非存在下で、ヒトＴｒｋＢシグナル伝達を活性化する。
１つの実施形態において、ＴｒｋＢに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、約３５ｐＭ～約８２ｐＭの範囲にあるＥＣ５０で、ＴｒｋＢを発現するように操作された細胞において、ＢＤＮＦの非存在下で、ヒトＴｒｋＢシグナル伝達を活性化する。
１つの実施形態において、ＴｒｋＢに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、約１００ｐＭ未満のＥＣ５０で、ＴｒｋＢを発現するように操作された細胞において、ＢＤＮＦの存在下で、ヒトＴｒｋＢシグナル伝達の活性化を増強する。
１つの実施形態において、ヒト化ＴｒｋＢマウスの海馬に注射した場合に、ＴｒｋＢリン酸化の増加により示されるＴｒｋＢ活性化を示す、ＴｒｋＢに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
１つの実施形態において、ＴｒｋＢに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、初代マウス皮質ニューロンをアゴニスト抗ＴｒｋＢ抗体と共にインキュベートした後に示される、ＭＡＰＫ／ＥＲＫおよびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路の活性化を示す。
１つの実施形態において、ＴｒｋＢに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＴｒｋＢヒト化ラットにおける視神経横断切断モデルにおいて示される、網膜神経節細胞の生存を増強／増大させる。
１つの実施形態において、ＴｒｋＢに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、インビトロにおいて神経細胞の生存を増強／増大させる。
１つの実施形態において、ＴｒｋＢに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化ＴｒｋＢマウスにおいて体重減少を促進する。
１つの実施形態において、ＴｒｋＢに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化ＴｒｋＢマウスにおいて体脂肪量の減少を促進する。
１つの実施形態において、ＴｒｋＢに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化ＴｒｋＢマウスにおいて食物および水の摂取量の減少を促進する。
１つの実施形態において、ＴｒｋＢに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化ＴｒｋＢマウスにおける自発運動活動の増大を促進する。
１つの実施形態において、本発明は、ＴｒｋＢに特異的に結合し、約５ｎＭ未満のＩＣ５０でＴｒｋＢのＢＤＮＦへの結合を遮断する抗ＴｒｋＢ抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
１つの実施形態において、本発明は、ＴｒｋＢに特異的に結合し、約５００ｐＭ未満のＩＣ５０でＴｒｋＢのＢＤＮＦへの結合を遮断する抗ＴｒｋＢ抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
１つの実施形態において、本発明は、ＴｒｋＢに特異的に結合し、約２００ｐＭ未満のＩＣ５０でＴｒｋＢのＢＤＮＦへの結合を遮断する抗ＴｒｋＢ抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
第２の態様において、本発明は、抗ＴｒｋＢ抗体またはその部分をコードする核酸分子を提供する。例えば、本発明は、表１に挙げられるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し；ある種の実施形態において、核酸分子は、表２に挙げられるＨＣＶＲ核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、表１に挙げられるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し；ある種の実施形態において、核酸分子は、表２に挙げられるＬＣＶＲ核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、表１に挙げられるＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し；ある種の実施形態において、核酸分子は、表２に挙げられるＨＣＤＲ１核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、表１に挙げられるＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し；ある種の実施形態において、核酸分子は、表２に挙げられるＨＣＤＲ２核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、表１に挙げられるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し；ある種の実施形態において、核酸分子は、表２に挙げられるＨＣＤＲ３核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、表１に挙げられるＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し；ある種の実施形態において、核酸分子は、表２に挙げられるＬＣＤＲ１核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、表１に挙げられるＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し；ある種の実施形態において、核酸分子は、表２に挙げられるＬＣＤＲ２核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、表１に挙げられるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し；ある種の実施形態において、核酸分子は、表２に挙げられるＬＣＤＲ３核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、ＨＣＶＲをコードする核酸分子も提供し、ここで、ＨＣＶＲは、３つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）を含み、ここで、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、表１に挙げられる典型的な抗ＴｒｋＢ抗体のいずれかにより定義される通りである。
本発明はまた、ＬＣＶＲをコードする核酸分子も提供し、ここで、ＬＣＶＲは、３つのＣＤＲのセット（すなわち、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含み、ここで、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、表１に挙げられる典型的な抗ＴｒｋＢ抗体のいずれかにより定義される通りである。
本発明はまた、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ両方をコードする核酸分子も提供し、ここで、ＨＣＶＲは、表１に挙げられるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含み、ここで、ＬＣＶＲは、表１に挙げられるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含む。ある種の実施形態において、核酸分子は、表２に挙げられるＨＣＶＲ核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列、および表２に挙げられるＬＣＶＲ核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。本発明のこの態様によるある種の実施形態において、核酸分子は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲをコードし、ここで、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲはいずれも、表１に挙げられる同一の抗ＴｒｋＢ抗体に由来する。
第３の態様において、本発明は、抗ＴｒｋＢ抗体の重鎖または軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現する能力を有する組み換え発現ベクターを提供する。例えば、本発明は、上述の核酸分子、すなわち、表１に記載のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲ配列のいずれかをコードする核酸分子のいずれかを含む組み換え発現ベクターを含む。かかるベクターが導入される宿主細胞、ならびに抗体もしくは抗体フラグメントの産生が可能となる条件下で宿主細胞を培養すること、ならびにそのようにして産生される抗体および抗体フラグメントを回収することにより、抗体またはその部分を産生する方法もまた、本発明の範囲に含まれる。
本発明は、修飾されたグリコシル化パターンを有する抗ＴｒｋＢ抗体を含む。ある実施形態において、不所望なグリコシル化部位を取り除くための修飾が有用であり得るか、または例えば、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）機能を増大させるために、オリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠く抗体が有用であり得る（Ｓｈｉｅｌｄら（２００２年）ＪＢＣ２７７：２６７３３頁を参照）。他の適用において、ガラクトシル化という修飾は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を修飾するために成される。
第４の態様において、本発明は、ＴｒｋＢに特異的に結合する少なくとも１つの本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を提供する。
関連する態様において、本発明は、抗ＴｒｋＢ抗体および第２の治療剤の組み合わせである組成物を特徴付ける。１つの実施形態において、第２の治療剤は、抗ＴｒｋＢ抗体と有利に併用される任意の薬剤である。第２の治療剤は、神経変性疾患または障害の少なくとも１つの症状を改善するのに有用であり得る。
第５の態様において、本発明は、ＴｒｋＢにより仲介される生物学的活性を増強するための方法であって、ＴｒｋＢを生物学的有効量の表１のアゴニスト抗ＴｒｋＢ抗体と接触させること、またはＴｒｋＢを生物学的有効量の表１のアゴニスト抗ＴｒｋＢ抗体を含有する医薬組成物と接触させることを含む方法を提供する。
ある種の実施形態において、生物学的活性は、神経細胞の保護または神経細胞の生存であり、神経細胞の保護または神経細胞の生存は、ＴｒｋＢがアゴニスト抗ＴｒｋＢ抗体と接触すると増強される。
ある種の実施形態において、生物学的活性は、神経保護および網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の生存である。
第６の態様において、本発明は、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体または抗体の抗原結合部分を用いて、ＴｒｋＢ活性もしくは発現に関連する疾患もしくは障害、またはその疾患もしくは障害に関連する少なくとも１つの症状を処置するための治療方法を提供する。本発明のこの態様による治療方法は、治療上有効量の、本発明の抗体または抗体の抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。処置される障害は、ＴｒｋＢを標的化することおよび／またはＴｒｋＢにより仲介される細胞シグナル伝達を活性化することにより、好転されるか、改善されるか、阻害されるか、または予防される、任意の疾患または状態である。
１つの実施形態において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、網膜ニューロンの損傷または死を予防する方法を提供し得る。１つの実施形態において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、網膜の変性が生じる病理疾患を処置する方法を提供し得る。１つの実施形態において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、眼の手術、光への曝露、または他の環境的外傷の前または後に、生体の眼を処置し、それによって網膜細胞の変性を予防する方法を提供し得る。１つの実施形態において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、光受容体損傷および生体の眼の変性を予防する方法を提供し得る。１つの実施形態において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、可能性としてｐ７５受容体などの他の受容体との交差反応性に起因する、副作用を誘導することなく、網膜ニューロンを保護する方法を提供し得る。１つの実施形態において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、損傷した光受容体が回復または再生することを可能にする方法を提供し得る。
ある種の実施形態において、本発明の抗体で処置しようとする疾患または障害は、緑内障、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性、虚血性視神経症、視神経炎、網膜虚血、光受容体変性、網膜色素変性、レーバー先天黒内障、レーバー依存性視神経萎縮症、アッシャー症候群、シュタルガルト病、および網膜動脈もしくは静脈閉塞からなる群より選択される、眼の疾患または障害である。
本発明の１つまたはそれ以上の抗ＴｒｋＢ抗体で処置することができる他の病的状態は、網膜剥離、光性網膜症（photic retinopathy）、手術により誘導される網膜症（機械的もしくは光に誘導されるかのいずれか）、毒素性網膜症、未熟児の網膜症、ＣＭＶもしくはＡＩＤＳに関連するＨＩＶ網膜症などのウイルス性網膜症、ブドウ膜炎、静脈もしくは動脈閉塞または他の血管障害に起因する虚血性網膜症、外傷もしくは眼の浸透病変に起因する網膜症、末梢硝子体網膜症、または遺伝性網膜変性を含む。
１つの実施形態において、本発明のアゴニスト抗ＴｒｋＢ抗体で処置しようとする眼の疾患または障害は、緑内障である。
本発明の第７の態様は、対象において体重の低減を達成するための方法であって、表１のＴｒｋＢアゴニスト抗体、または抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を、対象に投与することを含む方法を提供する。
関連する態様において、本発明は、対象において体脂肪量の低減を達成するための方法であって、表１のＴｒｋＢアゴニスト抗体、または抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を、対象に投与することを含む方法を提供する。
本発明の第８の態様は、対象において神経細胞の生存を促進する方法であって、治療上有効量の表１のＴｒｋＢアゴニスト抗体、または治療上有効量の抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を、対象に投与することを含む方法を提供する。
１つの実施形態において、上で記載された方法は、アゴニスト抗ＴｒｋＢ抗体またはその抗原結合フラグメントを、それを必要とする対象に投与することによって達成することができ、ここで、アゴニスト抗ＴｒｋＢ抗体は、表１に記載のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）に含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）、ならびに表１に記載のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含む。
１つの実施形態において、本発明の方法は、本発明のアゴニストＴｒｋＢ抗体を投与することによって達成することができ、ここで、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２、１８、３４、４９、５９、および６８からなる群より選択されるＨＣＶＲ配列のいずれか１つ、またはそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列に含有される３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）、ならびに配列番号１０、２６、４２、５３、６３、および７２からなる群より選択されるＬＣＶＲ配列のいずれか１つ、またはそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含む。
１つの実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２、１８、３４、４９、５９、および６８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。
１つの実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０、２６、４２、５３、６３、および７２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。
１つの実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２、１８、３４、４９、５９、および６８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ、ならびに配列番号１０、２６、４２、５３、６３、および７２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。
１つの実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、４９／５３、５９／６３、および６８／７２からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対のＣＤＲを含む。
１つの実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、４９／５３、５９／６３、および６８／７２からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
１つの実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは：
（ａ）配列番号４、２０、３６、５０、６０、および６９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；
（ｂ）配列番号６、２２、３８、５１、６１、および７０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；
（ｃ）配列番号８、２４、４０、５２、６２、および７１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；
（ｄ）配列番号１２、２８、４４、５４、６４、および７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；
（ｅ）配列番号１４、３０、４６、５５、６５、および７４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン；ならびに
（ｆ）配列番号１６、３２、４８、５６、６６、および７５からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメインを含む。
１つの実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは：（ａ）配列番号４－６－８－１２－１４－１６；（ｂ）配列番号２０－２２－２４－２８－３０－３２；（ｃ）配列番号３６－３８－４０－４４－４６－４８；（ｄ）配列番号５０－５１－５２－５４－５５－５６；（ｅ）配列番号６０－６１－６２－６４－６５－６６；および（ｆ）配列番号６９－７０－７１－７３－７４－７５からなる群より選択される６つのＣＤＲのセット（ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含む。
１つの実施形態において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体で処置しようとする疾患または障害は、肥満、および肥満から生じる任意の併発症である。
ＴｒｋＢ活性または発現に関連する任意の疾患または障害は、本発明の抗体での処置に適していることが想定される。これらの疾患は、神経変性状態におけるものまたは神経損傷の後など、細胞の変性が明らかである任意の疾患を含み得る。
他の実施形態は、次の詳細な説明の記載から明らかになるだろう。
ＴＲＫＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２またはアイソタイプ対照抗体の海馬への直接的な注射の１時間後、４時間後、および１８時間後における、ホモ接合性ヒト化ＴＲＫＢマウスにおける総ＴＲＫＢレベルおよびホスホ－ＴＲＫＢレベルを評価するウエスタンブロットを示す図である。 ＴｒｋＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２が、ＭＡＰＫ／ＥＲＫおよびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔの下流経路を活性化したことを示す図である。この図は、出生後１日目のホモ接合性ヒト化ＴＲＫＢ仔マウスから単離した初代皮質ニューロンを種々のＴｒｋＢアゴニスト抗体またはＢＤＮＦで処置した１５分後および２時間後における、ホスホ－ＴｒｋＢ、総ＴｒｋＢ、ホスホ－Ａｋｔ、総ＡＫＴ、ホスホ－ＥＲＫ、および総ＥＲＫのウエスタンブロットを示す。 ３つのＴｒｋＢアゴニスト抗体が、インビトロにおいてＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の生存を用量依存的に増加させたことを示す図である。アイソタイプ対照抗体は、細胞生存に影響を有さなかった。 ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスおよび野生型マウスにおける抗ＴｒｋＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２の薬物動態プロファイルを示す図である。マウスには、０日目に、１０ｍｇ／ｋｇの単回皮下用量を投与した。血清中の総Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２の濃度を、Ｇｙｒｏｓイムノアッセイを用いて測定した。投薬の６時間後、１日後、２日後、３日後、６日後、９日後、１６日後、２１日後、および３０日後におけるデータ点は、抗体の平均濃度を示す。Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２の総抗体濃度は、ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスについては黒色の実線円として表し、野生型マウスについては黒色の実線四角形として表す。データは、平均±標準偏差としてプロットした。 抗マウスＴｒｋＢモノクローナル抗体がマウスまたはラットのＴｒｋＢとそのリガンドであるＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）との間の相互作用を遮断する能力を示す、図５Ａおよび５Ｂからなる図である。ＥＬＩＳＡに基づく方法を用いて、ある濃度範囲の抗マウスＴｒｋＢモノクローナル抗体およびアイソタイプ対照モノクローナル抗体の存在下において、マウスＴｒｋＢ．ｈＦｃ（２つのグラフのある図５Ａ）およびラットＴｒｋＢ．ｍｍｈ（２つのグラフのある図５Ｂ）の、ＢＤＮＦでコートしたプレートへの結合を評価した。挿入図（２つのグラフのある図５Ａ）は、マウスＴｒｋＢ．ｈＦｃ（ＲＥＧＮ２２７７）のＢＤＮＦへの結合の用量応答曲線を７８０ｐＭのＥＣ５０値と共に示す。挿入図（２つのグラフのある図５Ｂ）は、ラットＴｒｋＢ．ｍｍｈ（ＲＥＧＮ１８０８）のＢＤＮＦへの結合の用量応答曲線を２．２ｎＭのＥＣ５０値と共に示す。モル濃度（Ｍ）は、モノクローナル抗体の抗体濃度を示す。エラーバーは、標準偏差を表す。
本発明が記載される前に、本発明は、記載される特定の方法および実験条件に制限されず、方法および条件自体が変動することは理解されるべきである。本明細書において用いられる専門用語は、特定の実施形態を記載する目的のためのみであることも理解されるべきであり、本発明の範囲は、添付の請求項によってのみ制限されるので、制限であることは意図されない。
別段定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術および科学用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書において用いられる用語「約」は、特定の引用される数値を参照して用いられる場合、その値が、１％を上回ることなしに、引用された値から変動し得ることを意味する。例えば、本明細書において用いられる表現「約１００」は、９９および１０１、ならびにその間の全ての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。
本明細書において記載されるものと類似または同等な任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において用いられるが、好ましい方法および材料がここで記載される。本明細書において言及される全ての特許、出願、および非特許刊行物は、参照によってその全体として本明細書に組み入れられる。
定義
「トロポミオシン受容体キナーゼＢ」としても知られている「ＴｒｋＢ」などの表現は、受託番号ＮＰ＿００１０１８０７４．１のアミノ酸残基３２から４３０に記載のアミノ酸配列を含むヒト受容体（別の種に由来すると指定されていない限り）を指す。ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグを含有するヒトＴｒｋＢは、配列番号７６として示される（アミノ酸残基１～３９９がヒトＴｒｋＢであり、アミノ酸残基４００～４２７がｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグである）。ヒトＴｒｋＢタンパク質を含有する他のフォーマットは、マウスＦｃ領域（残基４００～６３２）を有するヒトＴｒｋＢ（残基１～３９９）である配列番号７７、およびヒトＦｃ領域（残基４００～６２６）を有するヒトＴｒｋＢ（残基１～３９９）である配列番号７８を含め、本明細書に記載されている。マウスＴｒｋＢは、受託番号ＮＰ＿００１０２０２４５のアミノ酸残基３２から４２９に記載されているアミノ酸配列を含む。ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグを含有するマウスＴｒｋＢは、配列番号７９として示される（アミノ酸残基１～３９８がマウスＴｒｋＢであり、アミノ酸残基３９９～４２６がｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグである）。マウスＴｒｋＢタンパク質を含有する他のフォーマットは、マウスＦｃ領域（残基３９９～６３１）を有するマウスＴｒｋＢ（残基１～３９８）である配列番号８０、およびヒトＦｃ領域（残基３９９～６２５）を有するマウスＴｒｋＢ（残基１～３９８）である配列番号８１を含め、本明細書に記載されている。ウサギＴｒｋＢは、受託番号ＸＰ＿００２７２１３１９．１のアミノ酸残基３２から４３０に記載のアミノ酸配列を含む。ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグを含有するウサギＴｒｋＢは、配列番号８２として示される（アミノ酸残基１～３９９がウサギＴｒｋＢであり、アミノ酸残基４００～４２７がｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグである）。ウサギＴｒｋＢタンパク質を含有する他のフォーマットは、マウスＦｃ領域（残基４００～６３２）を有するウサギＴｒｋＢ（残基１～３９９）である配列番号８３を含め、本明細書に記載されている。ラットＴｒｋＢは、受託番号ＮＰ＿０３６８６３．１のアミノ酸残基３２から４２９に記載のアミノ酸配列を含む。ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグを含有するラットＴｒｋＢは、配列番号８４として示される（アミノ酸残基１～３９８がラットＴｒｋＢであり、アミノ酸残基３９９～４２６がｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグである）。ラットＴｒｋＢタンパク質を含有する他のフォーマットは、マウスＦｃ領域（残基３９９～６３１）を有するラットＴｒｋＢ（残基１～３９８）である配列番号８５を含め、本明細書に記載されている。アカゲザル（マカク・マラッタ（Macaca mulatta））ＴｒｋＢは、配列番号９５として示され（受託番号ＮＰ＿００１２４８２２６．１のアミノ酸３２から８３８）、カニクイザル（マカク・ファシクラリス（Macaca fascicularis））ＴｒｋＢは、配列番号９６として示される（受託番号ＸＰ＿００５５８２１０２．１のアミノ酸３２から８３８）。
ヒト「ＴｒｋＡ」タンパク質は、配列番号８６として示され、アミノ酸１～３７５がＴｒｋＡであり（Ｖ２６３Ｌ、Ｃ３００Ｓを有する受託番号ＮＰ＿００１０１２３３１．１のアミノ酸３４～４１４）、アミノ酸３７６～３７８がＧＰＧリンカーであり、アミノ酸３７９～６０５がヒトＦｃである。
ヒト「ＴｒｋＣ」タンパク質は、配列番号８７として示され、アミノ酸１～３９８がＴｒｋＣであり（受託番号ＮＰ＿００１０１２３３８．１のアミノ酸３２～４２９）、アミノ酸３９９～４２６がｍｙｃ－ｍｙｃ－ｈｉｓタグである。
マウス「ＴｒｋＣ」タンパク質は、配列番号８８として示され、アミノ酸１～３９８がＴｒｋＣであり（受託番号ＮＰ＿０３２７７２．３のアミノ酸３２～４２９）、アミノ酸３９９～４２６がｍｙｃ－ｍｙｃ－ｈｉｓタグである。
カニクイザル「ＴｒｋＣ」タンパク質は、配列番号８９として示され、アミノ酸１～３９８がＴｒｋＣであり（受託番号ＸＰ＿０１５３０８８３７．１のアミノ酸３２～４２９）、アミノ酸３９９～４２６がｍｙｃ－ｍｙｃ－ｈｉｓタグである。
ある種の例において、ＴｒｋＢタンパク質の外部ドメインならびに膜貫通型および細胞質ドメインを含む、ＴｒｋＢタンパク質を発現する細胞株を調製した。例えば、配列番号９１は、受託番号ＮＰ＿００１０１８０７４．１のアミノ酸３２～８２２）またはＵｎｉｐｒｏｔ Ｑ１６６２０－１に含有される３つ全てのドメインを含有するヒトＴｒｋＢタンパク質であり、アミノ酸１～３９８が外部ドメインであり、膜貫通型／細胞質領域は、アミノ酸残基約３９９～７９０により定義される。１つの例において、マウスＴｒｋＢ（受託番号ＮＰ＿０３２７７１．１のアミノ酸３２～４７６、配列番号９２も参照）を発現するＴｒｋＢ細胞株を調製した。別の例において、受託番号ＮＰ＿００１０２０２４５．１のアミノ酸３２～４２９（配列番号９３も参照）またはＵｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ１５２０９－１に由来するマウスＴｒｋＢの外部ドメイン、ならびにヒトＴｒｋＢ膜貫通型および細胞質ドメイン（受託番号ＮＰ＿００１０１８０７４．１のアミノ酸４３１～８２２（配列番号９１も参照））を有するキメラＴｒｋＢタンパク質を発現する細胞株を調製した。アフリカミドリザル（クロロセブス・サベウス（Chlorocebus sabaeus））ＴｒｋＢ（受託番号ＸＰ＿００７９６７８１５．１のアミノ酸３２～８２２（配列番号９４も参照））を発現する細胞株もまた、調製した。
用語「脳由来神経栄養因子」または「ＢＤＮＦ」は、ＴｒｋＢのリガンドを指し、ＢＤＮＦのアミノ酸配列は、配列番号９０に示される（アイソフォームＡ １～１２０、受託番号ＮＰ＿７３３９２８．１のアミノ酸１２９～２４７、ＭｅｔがＮ末端に付加されている）。本明細書に記載されるある種の実験において、ＢＤＮＦの供給源は、Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、２４８－ＢＤ／ＣＦである。
本明細書におけるタンパク質、ポリペプチド、およびタンパク質フラグメントへの参照は全て、非ヒト種に由来することが明示的に示されない限り、それぞれのタンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質フラグメントのヒトバージョンを指すことを意図している。従って、表現「ＴｒｋＢ」は、非ヒト種に由来すること、例えば、「サルＴｒｋＢ」、「マウスＴｒｋＢ」、「ラットＴｒｋＢ」などであることが示されない限り、ヒトＴｒｋＢを意味する。
本明細書において用いられる表現「抗ＴｒｋＢ抗体」は、単一の特異性を有する１価の抗体、ならびにＴｒｋＢに結合する第１のアームおよび第２の（標的）抗原に結合する第２のアームを含み、抗ＴｒｋＢアームが、本明細書において表１に記載のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲ配列のいずれかを含む、二重特異性抗体の両方を含む。表現「抗ＴｒｋＢ抗体」はまた、薬物または毒素（すなわち、細胞毒性剤）に結合した抗ＴｒｋＢ抗体またはその抗原結合部分を含む抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）も含む。表現「抗ＴｒｋＢ抗体」はまた、放射性核種に結合した抗ＴｒｋＢ抗体またはその抗原結合部分を含む抗体－放射性核種複合体（ＡＲＣ）も含む。
本明細書において用いられる用語「抗ＴｒｋＢ抗体」は、ＴｒｋＢまたはＴｒｋＢの一部分に特異的に結合するかまたはそれと相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、任意の抗原結合分子または分子複合体を意味する。用語「抗体」は、ジスルフィド結合により相互結合された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖である４つのポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびにその多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＨＣＶＲまたはＶＨと略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の３つのドメインを含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＬＣＶＲまたはＶＬと略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存される領域が散在した相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、高頻度可変性の領域にさらに細分される。それぞれのＶＨならびにＶＬは、次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端まで配置された、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む。本発明の異なる実施形態において、抗ＴｒｋＢ抗体（もしくはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であるか、または天然または人工的に修飾される。アミノ酸連続配列は、２つまたはそれ以上のＣＤＲの隣り合った解析に基づき定義される。
本明細書において用いられる用語「抗体」は、全長抗体分子の抗原結合フラグメントも含む。本明細書において用いられる用語、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」などは、任意の酵素的に得られる、合成された、または遺伝子操作された、抗原に特異的に結合して複合体を形成するポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、タンパク質分解消化、または抗体可変ドメインおよび場合により定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を伴う組み換え遺伝子操作技術のような任意の適切な標準的技術を用いて、完全抗体分子から得ることができる。かかるＤＮＡは公知であり、および／または例えば、市販の供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ－抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、もしくは合成することができる。ＤＮＡは、配列決定され、化学的に、または分子生物学技術を用いることにより操作されて、例えば、１つもしくはそれ以上の可変および／もしくは定常ドメインが適切な配置に配置されるか、またはコドンが導入されるか、システイン残基が作製されるか、アミノ酸が修飾されるか、付加されるか、もしくは欠損される。
抗原結合フラグメントの非限定的な例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント、（ｉｖ）Ｆｖフラグメント、（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント、および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位（例えば、ＣＤＲ３ペプチドのような単離された相補決定領域（ＣＤＲ））、または限定されたＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドを含む。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメインが欠損した抗体、キメラ抗体、ＣＤＲが移植された抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ミニボディ、ナノボディ（例えば、１価のナノボディ、２価のナノボディなど）、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインのような他の操作された分子もまた、本明細書において用いられる、表現「抗原結合フラグメント」に包含される。
抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの可変ドメインを典型的に含む。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成であり、少なくとも１つのＣＤＲを一般的に含み、１つまたはそれ以上のフレームワーク配列に隣接されるか、もしくはインフレームである。ＶＬドメインと繋がったＶＨドメインを有する抗原結合フラグメントにおいて、ＶＨおよびＶＬドメインは、任意の適切な配置で相対的に位置する。例えば、可変領域は、二量体であり、ＶＨ－ＶＨ、ＶＨ－ＶＬ、またはＶＬ－ＶＬの二量体を含有する。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体ＶＨまたはＶＬドメインを含有する。
ある種の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合した少なくとも１つの可変ドメインを含有する。本発明の抗体の抗原結合フラグメント内に見出される可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的な典型的配置は、（ｉ）ＶＨ－ＣＨ１；（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ２；（ｉｉｉ）ＶＨ－ＣＨ３；ｉｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２；（ｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｖｉ）ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｖｉｉ）ＶＨ－ＣＬ；（ｖｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１；（ｉｘ）ＶＬ－ＣＨ２；（ｘ）ＶＬ－ＣＨ３；（ｘｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２；（ｘｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｘｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３；および（ｘｉｖ）ＶＬ－ＣＬを含む。上で挙げられる典型的な配置のいずれかを含む、可変および定常ドメインの任意の配置において、可変ならびに定常ドメインは、互いに直接的に結合されるか、または完全もしくは部分的ヒンジもしくはリンカー領域により結合されるか、のいずれかである。ヒンジ領域は、少なくとも２個（例えば、５個、１０個、１５個、２０個、４０個、６０個、またはそれ以上）のアミノ酸からなり、単一のポリペプチド分子における隣接する可変および／または定常ドメイン間の可動性または半可動性の結合をもたらす。さらに、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、（例えば、ジスルフィド結合による）互いにおよび／または１つもしくはそれ以上の単量体ＶＨもしくはＶＬドメインと非共有結合的に会合した、上で挙げられた可変ならびに定常ドメインの配置のいずれかのホモ－二量体またはヘテロ－二量体（または他の多量体）を含む。
全長抗体分子と同様に、抗原結合フラグメントは、単特異性または多特異性（例えば、二重特異性）である。抗体の多特異性抗原結合フラグメントは、少なくとも２つの異なる可変ドメインを典型的には含み、ここで、それぞれの可変ドメインは、別々の抗原、または同一抗原上の異なるエピトープに特異的に結合する能力がある。本明細書において開示される典型的な二重特異性抗体フォーマットを含む、任意の多特異性抗体フォーマットは、当該技術分野において利用可能な慣例的技術を用いて、本発明の抗体の抗原結合フラグメントの文脈において使用するために適合される。
ある種の例において、例えば、例として神経腫瘍細胞の成長または増殖を阻害するために、ＴｒｋＢと拮抗することが望ましい場合がある。しかしながら、本発明の抗体は、アゴニスト抗体として作用し、これは、神経細胞の生存のエンハンサーおよび神経保護剤としての機能を果たす。本発明の抗体は、ＴｒｋＢとそのリガンドであるＢＤＮＦとの間の相互作用を増強することによって機能し得る。あるいは、本発明の抗体は、ＴｒｋＢのそのリガンドとの相互作用を増強することを含まないメカニズムを通じて、ＴｒｋＢシグナル伝達を仲介することができる。
本明細書において用いられる用語「ヒト抗体」は、天然に存在しないヒト抗体を含むことが意図される。この用語は、非ヒト哺乳類において、または非ヒト哺乳類の細胞において、組み換え的に産生される抗体を含む。用語は、ヒト対象から単離された、またはヒト対象において生じた抗体を含むことは意図されない。
本発明の抗体は、ある実施形態において、組み換えおよび／または天然に存在しない、ヒト抗体であり得る。本明細書において用いられる用語「組み換えヒト抗体」は、宿主細胞にトランスフェクトした組み換え発現ベクターを用いて発現された抗体（以下にさらに記載される）、組み換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（以下にさらに記載される）、ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒら（１９９２年） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：６２８７～６２９５頁を参照）、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製、もしくは単離された抗体など、組み換え手段によって調製、発現、作製、または単離された全てのヒト抗体を含むことが意図される。ある種の実施形態において、かかる組み換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（またはヒトＩｇ配列に関してトランスジェニックな動物が用いられる場合には、インビボでの体細胞変異誘発）に供され、これによって、組み換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に関連するが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内には天然に存在し得ない配列となる。
ヒト抗体は、ヒンジの不均一性に関連付けられた２つの形態で存在し得る。１つの形態において、免疫グロブリン分子は、二量体が重鎖の鎖間ジスルフィド結合によって一緒に保持されている、およそ１５０～１６０ｋＤａの安定な四本鎖構築物を含む。第２の形態において、二量体は、鎖間ジスルフィド結合によって結合されず、共有結合した軽鎖および重鎖で構成される約７５～８０ｋＤａの分子が形成される（半抗体）。これらの形態は、親和性精製後であっても、分離することが極めて困難であった。
種々のインタクトなＩｇＧアイソタイプにおける第２の形態の出現頻度は、抗体のヒンジ領域のアイソタイプに関連する構造的違いに起因するが、これに限定されない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一のアミノ酸置換は、第２の形態の出現を、ヒトＩｇＧ１ヒンジを用いて典型的に観察されるレベルまで、有意に低減することができる（Ａｎｇａｌら（１９９３年） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３０：１０５頁）。本発明は、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、またはＣＨ３領域に１つまたはそれ以上の変異を有する抗体を包含し、これは、例えば、産生時に、所望される抗体形態の収率を好転させるために望ましい可能性がある。
用語「特異的に結合する」または「に特異的に結合する」などは、抗体もしくはその抗原結合フラグメントが、生理的条件下で比較的安定である抗原との複合体を形成することを意味する。特異的結合は、少なくとも約１×１０－６Ｍまたはそれよりも低い平衡解離定数によって特徴付けることができる（例えば、ＫＤが小さいほど、より強固な結合を示す）。２つの分子が特異的に結合するかどうかを決定する方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。本明細書において記載される通り、ＴｒｋＢに特異的に結合する抗体は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）により同定されている。さらに、ＴｒｋＢタンパク質および１つもしくはそれ以上のさらなる抗原に結合する多特異性抗体、またはＴｒｋＢの２つの異なる領域に結合する二重特異性抗体は、それにもかかわらず、本明細書において用いられる「特異的に結合する」抗体とみなされる。
本発明の抗体は、単離された抗体であり得る。本明細書において用いられる「単離された抗体」は、同定されており、その天然の環境の少なくとも１つの成分から分離および／または回収されている抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも１つの成分から、または抗体が天然に存在するかもしくは天然に産生される組織もしくは細胞から、分離されているかまたは取り出されている抗体は、本発明の目的で、「単離された抗体」である。単離された抗体はまた、組み換え細胞内のインサイチュの抗体を含む。単離された抗体は、少なくとも１つの精製または単離工程に供されている抗体である。ある種の実施形態によると、単離された抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
本明細書において開示される抗ＴｒｋＢ抗体は、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、挿入および／または欠損を含む。かかる変異は、本明細書において開示されるアミノ酸配列を、例えば、公開抗体配列データベースから入手可能な配列と比較することにより、容易に確認することができる。一旦得られると、１つまたはそれ以上の変異を含有する抗体および抗原結合フラグメントは、結合特異性の好転、結合親和性の増大、アンタゴニストもしくはアゴニスト生物学的特性の好転または増強（場合によっては）、免疫原性の低減などのような１つまたはそれ以上の所望の特性について容易に試験することができる。この一般的な方法において得られる抗体および抗原結合フラグメントは、本発明に包含される。
本発明はまた、１つもしくはそれ以上の保存的置換を有する、本明細書において開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む抗ＴｒｋＢ抗体も含む。例えば、本発明は、例えば、本明細書において表１に記載されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／もしくはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに関連する１０もしくはそれ以下、８つもしくはそれ以下、６つもしくはそれ以下、４つもしくはそれ以下などの保存的アミノ酸置換を有する、ＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ならびに／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＴｒｋＢ抗体を含む。
用語「エピトープ」は、パラトープとしても公知の抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する、抗原決定因子を指す。単一の抗原は、１つより多くのエピトープを有する。従って、異なる抗体は、抗原上の異なる範囲に結合し、異なる生物学的作用を有する。エピトープは、立体構造であってもよく、または直線状であってもよい。立体構造エピトープは、直線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントのアミノ酸が空間的に並置されることによって産生される。直線状エピトープは、ポリペプチド鎖における隣接するアミノ酸残基によって産生されるものである。ある種の状況において、エピトープは、抗原上の糖の部分、リン酸基、またはスルホニル基を含み得る。
核酸もしくはそのフラグメントに言及している場合、用語「実質的な同一性」または「実質的に同一の」は、適切なヌクレオチド挿入または欠損を伴うかたちで別の核酸（もしくはその相補鎖）と最適に整列されると、以下で考察される通り、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＧａｐのような、配列同一性の任意の周知のアルゴリズムにより測定される、少なくとも約９５％、より好ましくは、少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチド塩基のヌクレオチド配列同一性が存在することを示す。参照核酸分子に対する実質的な同一性を有する核酸分子は、ある種の例において、参照核酸分子によりコードされるポリペプチドと同一または実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的な類似性」または「実質的に類似の」は、２つのペプチド配列が、例えば、デフォルトギャップウェイトを用いたプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴにより、最適に整列されると、少なくとも９５％の配列同一性、なおより好ましくは、少なくとも９８％、または９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、残基位置は、同一でなく、保存的アミノ酸置換により異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基により置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つまたはそれ以上のアミノ酸配列が、保存的置換により互いに異なる場合において、パーセント配列同一性または類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するよう上方調節される。この調節を成す手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４年）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７～３３１頁を参照（参照によって本明細書に組み入れられる）。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例は、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；（２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリン、およびスレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギン、およびグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸塩、およびグルタミン酸塩、ならびに（７）硫黄含有側鎖はシステイン、およびメチオニンである、を含む。好ましい保存的アミノ酸置換基は：バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸塩－アスパラギン酸塩、およびアスパラギン－グルタミンである。あるいは、保存的置換は、Ｇｏｎｎｅｔら（１９９２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：１４４３～１４４５頁（参照によって本明細書に組み入れられる）において開示されるＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を有する任意の変化である。「中程度の保存的」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において負でない値を有する任意の変化である。
配列同一性とも称される、ポリペプチドの配列類似性は、配列解析ソフトウェアを用いて典型的に測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、様々な置換、欠損、および他の修飾に割り当てられる類似性の測定を用いて、類似の配列を一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、生物の異なる種由来の相同な諸ポリペプチドの間、または野生型タンパク質とその変異タンパク質の間のような、密接に関連するポリペプチド間の配列相同性または配列同一性を決定するためのデフォルトパラメーターで用いられるＧａｐおよびＢｅｓｔｆｉｔのようなプログラムを含む。例えば、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１を参照。ポリペプチド配列はまた、デフォルトまたは推奨パラメーターを用いたＦＡＳＴＡ；ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１におけるプログラムを用いても比較される。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２、およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリーと検索配列の間の最適オーバーラップの領域の整列化およびパーセント配列同一性をもたらす（上記、Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００年））。本発明の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較する上での別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメーターを用いた、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ、特に、ＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～４１０頁、およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９～４０２頁を参照（それぞれが、参照によって本明細書に組み入れられる）。
抗体の生物学的特徴
本発明は、２５℃または３７℃において表面プラズモン共鳴により測定される約２００ｎＭ未満のＫＤでヒトＴｒｋＢに結合する抗ＴｒｋＢ抗体を含む。ある種の実施形態によると、本発明は、約６００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１５０ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約８０ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、約３０ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約５ｐＭ未満、約３ｐＭ未満、または約１ｐＭ未満のＫＤでヒトＴｒｋＢに結合する抗ＴｒｋＢ抗体を含む。
本発明は、２５℃または３７℃において表面プラズモン共鳴により測定される約１０分を上回る解離半減期（ｔ１／２）でヒトＴｒｋＢに結合する抗ＴｒｋＢ抗体を含む。ある種の実施形態によると、本発明は、約２０分よりも長い、約５０分よりも長い、約１００分よりも長い、約１２０分よりも長い、約１５０分よりも長い、約３００分よりも長い、約３５０分よりも長い、約４００分よりも長い、約４５０分よりも長い、約５００分よりも長い、約５５０分よりも長い、約６００分よりも長い、約７００分よりも長い、約８００分よりも長い、約９００分よりも長い、約１０００分よりも長い、約１１００分、または約１２００分よりも長いｔ１／２でヒトＴｒｋＢに結合する抗ＴｒｋＢ抗体を含む。
本発明は、サルＴｒｋＢ、またはマウスもしくはラットＴｒｋＢに結合する場合もしない場合もある抗ＴｒｋＢ抗体を含む。本明細書において用いられる場合、抗体が、表面プラズモン共鳴などの抗原結合アッセイにおいて試験した場合に、約１０００ｎＭより大きいＫＤを示すか、またはかかるアッセイにおいていずれの抗原結合も示さない場合、抗体は、特定の抗原（例えば、サル、マウス、またはラットＴｒｋＢ）に「結合しない」。本明細書のこの態様により、抗体が特定の抗原に結合するかしないかを決定するために用いることができる別のアッセイフォーマットは、ＥＬＩＳＡである。
本発明は、約１００ｐＭ未満のＥＣ５０で、ＴｒｋＢ受容体を発現するように操作された細胞においてヒトＴｒｋＢシグナル伝達を活性化する抗ＴｒｋＢ抗体を含む。実施例５に記載されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似のアッセイフォーマットを用いて、ＥＣ５０値は、ＴｒｋＢにより仲介されるシグナル伝達を観察されるシグナルの半最大値まで活性化するのに必要とされる抗体の濃度として計算することができる。それ故、ある種の実施形態によると、本発明は、本明細書において実施例５に記載されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似のアッセイを用いて測定される、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約９０ｐＭ未満、約８０ｐＭ未満、約７０ｐＭ未満、約６０ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、約３０ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、または約５ｐＭ未満のＥＣ５０で、ＢＤＮＦの存在下または非存在下で、ＴｒｋＢ受容体を発現するように操作された細胞においてヒトＴｒｋＢシグナル伝達を仲介する抗ＴｒｋＢ抗体を含む。
本発明は、実施例６において示されるように、ヒトＴｒｋＢ受容体を発現するようにヒト化されたマウスにおいて海馬への直接的な注射の後に、ＴｒｋＢリン酸化によって示されるように、ＴｒｋＢ受容体を活性化する抗ＴｒｋＢ抗体を含む。
本発明は、ヒトＴｒｋＢ受容体を発現するようにヒト化されたマウスにおいて体重減少を促進する抗ＴｒｋＢ抗体を含む。本発明の抗体はまた、これらのマウスにおいて体脂肪量の減少を促進し、自発運動活動を増大させ、同時に食物および水の摂取量を減少させるように機能する（実施例７を参照）。
本発明の抗体は、ヒトＴｒｋＢ受容体を発現するようにヒト化されたラットにおいて、視神経横断切断モデルにおいて試験した場合、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の生存を促進する。実施例８を参照。
本発明の抗体は、ヒト化ＴｒｋＢマウスから得られた初代マウス皮質ニューロンの本発明の抗体への曝露によって示されるように、下流経路ＭＡＰＫ／ＥＲＫおよびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔを活性化する。（実施例９を参照）。
本発明のアゴニスト抗ＴｒｋＢ抗体はまた、実施例１０において示されるように、用量依存性様式でＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の生存を促進する。
本発明は、約５ｎＭのＩＣ５０でＴｒｋＢのＢＤＮＦへの結合を遮断する抗ＴｒｋＢ抗体を含む。例えば、実施例１２において示されるように、試験した３つ全ての抗体は、マウスまたはラットＴｒｋＢのＢＤＮＦへの結合を、５０％を上回って遮断した。実施例１２に記載されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似のアッセイフォーマットを用いて、ＩＣ５０値は、抗体の非存在下において観察される最大シグナルと比較した場合に、ＴｒｋＢのＢＤＮＦへの結合を遮断するのに必要とされる抗体の濃度として計算することができる。それ故、ある種の実施形態によると、本発明は、本明細書において実施例１２に記載されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似のアッセイを用いて測定される、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約９００ｐＭ未満、約８００ｐＭ未満、約７００ｐＭ未満、約６００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約９０ｐＭ未満、約８０ｐＭ未満、約７０ｐＭ未満、約６０ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、約３０ｐＭ未満、または約２０ｐＭ未満のＩＣ５０で、ＴｒｋＢのＢＤＮＦへの結合を遮断する抗ＴｒｋＢ抗体を含む。１つの実施形態において、本発明のＴｒｋＢ抗体は、約１８０ｐＭ～約４ｎＭの範囲にあるＩＣ５０で、ＴｒｋＢのＢＤＮＦへの結合を遮断する。
本発明の抗体の結合特徴（例えば、本明細書において上で言及されている結合特徴のいずれか）は、「表面プラズモン共鳴により測定される」に関して開示される場合、抗体と抗原との間の相互作用に関する関連する結合特徴が、表面プラズモン共鳴機器（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）機器、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、本明細書において実施例３および４に説明されている標準的なＢｉａｃｏｒｅアッセイ条件または実質的に類似のアッセイフォーマットを用いて測定されることを意味する。ある種の実施形態において、結合パラメーターは、２５℃で測定されるが、他の実施形態においては、結合パラメーターは、３７℃で測定される。
本発明は、ＴｒｋＢに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、表１に挙げられるＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
本発明の抗体は、前述の生物学的特徴のうちの１つもしくはそれ以上、または任意のその組み合わせを有する。本発明の抗体の生物学的特徴の前述の一覧は、排他的であることを意図するものではない。本発明の抗体の他の生物学的特徴は、本明細書における実施例を含む本開示の説明から当業者に明白であろう。
エピトープマッピングおよび関連技術
本発明の抗体が結合するエピトープは、ＴｒｋＢタンパク質の３個またはそれ以上（例えば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、もしくはそれ以上）のアミノ酸の単一の連続配列からなる。あるいは、エピトープは、ＴｒｋＢの複数の非連続アミノ酸（またはアミノ酸配列）からなる。ある実施形態において、エピトープは、ＴｒｋＢの表面上またはその付近に、例えば、そのリガンドであるＢＤＮＦと相互作用するドメインに位置する。他の実施形態において、エピトープは、ＴｒｋＢリガンドと相互作用しないＴｒｋＢの表面上またはその付近に、例えば、抗体が、かかるエピトープに結合したときに、ＴｒｋＢとそのリガンドとの間の相互作用を妨害しない、ＴｒｋＢの表面上の位置に、位置する。
当業者に公知の種々の技術を用いて、抗体が、ポリペプチドもしくはタンパク質内の「１個またはそれ以上のアミノ酸と相互作用する」かどうかを決定することができる。典型的な技術は、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．、ＮＹ）において記載されるもののような、慣例的交差－遮断アッセイ、アラニンスキャンニング変異解析、ペプチドブロット解析（Ｒｅｉｎｅｋｅ、２００４年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３～４６３頁）、およびペプチド切断解析を含む。加えて、抗原のエピトープ切除、エピトープ抽出、および化学修飾のような方法が利用される（Ｔｏｍｅｒ、２０００年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：４８７～４９６頁）。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために用いられる別の方法は、質量分析により検出される水素／ジュウテリウム交換である。一般的な用語において、水素／ジュウテリウム交換方法は、目的のタンパク質をジュウテリウム標識すること、続いて、抗体をジュウテリウムで標識されたタンパク質に結合させることを含む。次に、タンパク質／抗体複合体を、水に移し、抗体により保護される残基（これはジュウテリウム標識されたままとなる）以外の全ての残基で水素－ジュウテリウム交換が起こるようにする。抗体の解離後、標的タンパク質は、タンパク質分解酵素切断および質量分析に供され、それにより、抗体が相互作用する特異的アミノ酸に対応するジュウテリウムで標識された残基が明らかにされる。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ （１９９９年） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２～２５９頁、ＥｎｇｅｎおよびＳｍｉｔｈ（２００１年） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７３：２５６Ａ～２６５Ａ頁を参照。
本発明は、本明細書に記載される特定の典型的な抗体（例えば、本明細書において表１に記載のアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）のいずれかと同一のエピトープに結合する抗ＴｒｋＢ抗体を含む。同様に、本発明は、ＴｒｋＢへの結合について、本明細書に記載される特定の典型的な抗体（例えば、本明細書において表１に記載のアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）のいずれかと競合する抗ＴｒｋＢ抗体も含む。
当該技術分野において公知であり本明細書において例示される慣例的方法を用いることにより、抗体が、参照抗ＴｒｋＢ抗体と同一のエピトープに結合するか、または結合について参照抗ＴｒｋＢ抗体と競合するかどうかを容易に決定することができる。例えば、試験抗体が、本発明の参照抗ＴｒｋＢ抗体と同一のエピトープに結合するかを決定するために、参照抗体をＴｒｋＢタンパク質に結合させることを可能にする。次に、試験抗体がＴｒｋＢ分子に結合する能力が評価される。試験抗体は、参照抗ＴｒｋＢ抗体との飽和結合後にＴｒｋＢに結合することができるなら、試験抗体は、参照抗ＴｒｋＢ抗体より異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。他方、試験抗体は、参照抗ＴｒｋＢ抗体との飽和結合後にＴｒｋ分子に結合することができないなら、次に、試験抗体は、本発明の参照抗ＴｒｋＢ抗体により結合されるエピトープと同一のエピトープに結合する。次に、さらなる慣例的実験（例えば、ペプチド変異および結合解析）を行い、試験抗体の結合の観察された欠如が、事実上、参照抗体と同一のエピトープへの結合に起因するかどうか、または立体的遮断（もしくは別の現象）が、観察された結合の欠如の原因であるかどうかを確認される。この選別の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー、または当該技術分野において利用可能な任意の他の定量的もしくは定性的抗体結合アッセイを用いて行われる。本発明のある種の実施形態によると、例えば、１倍、５倍、１０倍、２０倍、または１００倍過剰の一方の抗体が、競合的結合アッセイにおいて測定した場合に、他方の結合を、少なくとも５０％阻害するが、好ましくは、７５％、９０％、またはさらには９９％阻害する場合、２つの抗体は、同一の（または重複する）エピトープに結合する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０年５０：１４９５～１５０２頁を参照）。あるいは、一方の抗体の結合を低減または除去する抗原における本質的に全てのアミノ酸変異が、他方の結合を低減または除去する場合、２つの抗体は同一のエピトープに結合するとみられる。一方の抗体の結合を低減または除去するアミノ酸変異のサブセットのみが、他方の結合を低減または除去する場合、２つの抗体は「重複するエピトープ」を有する。
抗体が、結合について参照抗ＴｒｋＢ抗体と競合するかを決定するために、上で記載された結合方法論は、２つの方針で行われる。第１の方針において、参照抗体を、飽和条件下でＴｒｋＢタンパク質に結合させることを可能にし、続いて、試験抗体のＴｒｋＢ分子への結合が評価される。第２の方針において、試験抗体を、飽和条件下でＴｒｋＢ分子に結合させることを可能にし、続いて、参照抗体のＴｒｋＢ分子への結合が評価される。両方の方針において、第１の（飽和）抗体のみが、ＴｒｋＢ分子に結合する能力があるなら、次に、試験抗体と参照抗体は、ＴｒｋＢへの結合について競合すると結論付けられる（例えば、本明細書において実施例４に記載されるアッセイフォーマットを参照されたく、ここでは、ＴｒｋＢタンパク質をセンサーチップに捕捉し、ＴｒｋＢでコートしたセンサーチップを、参照抗体［ｍＡｂ－１］および試験抗ＴｒｋＢ抗体［ｍＡｂ－２］で逐次的および両方の結合順序で処置する）。当業者により理解される通り、結合について参照抗体と競合する抗体は、参照抗体と一致するエピトープに必ずしも結合しないが、重複または隣接するエピトープに結合することにより、参照抗体の結合を立体的に遮断する。
ヒト抗体の調製
本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、完全ヒトであるが非天然である抗体であり得る。完全ヒトモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体を作製するための方法は、当該技術分野において公知である。任意のかかる公知の方法を、本発明の文脈において用いて、ヒトＴｒｋＢに特異的に結合するヒト抗体が作られる。
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術（例えば、ＵＳ６，５９６，５４１、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標））、またはモノクローナル抗体を作製する任意の他の公知の方法を用いて、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する、アレルゲンに対する高親和性キメラ抗体が、まず単離される。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術は、マウスが、抗原刺激に応答して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を含む抗体を産生するように、内在性マウス定常領域部位に作動可能に結合したヒト重鎖および軽鎖可変領域を含むゲノムを有する遺伝子導入マウスの作製に関与する。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡが単離され、ヒト重鎖および軽鎖定常領域をコードするＤＮＡに作動可能に結合される。次に、ＤＮＡは、完全ヒト抗体を発現する能力がある細胞において発現される。
一般的に、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを、目的の抗原でチャレンジし、リンパ系細胞（例えば、Ｂ細胞）を、抗体を発現するマウスから回収する。リンパ系細胞を、ミエローマ細胞株と融合させて、不死化ハイブリドーマ細胞株を調製し、かかるハイブリドーマ細胞株をスクリーニングおよび選択して、目的の抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定する。重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、所望されるアイソタイプの重鎖および軽鎖の定常領域に連結させることができる。かかる抗体タンパク質を、ＣＨＯ細胞などの細胞において産生させることができる。あるいは、抗原特異的キメラ抗体または軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡを、抗原特異的リンパ球から直接的に単離してもよい。
以下の実験の節に記載される通り、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する単離された高親和性キメラ抗体を、親和性、選択性、エピトープなどを含む、望ましい特徴について特徴付けおよび選択する。マウス定常領域を、次に、所望されるヒト定常領域と置き換えて、本発明の完全ヒト抗体、例えば、野生型または修飾されたＩｇＧ１またはＩｇＧ４を生成する。選択される定常領域は、具体的な使用に応じて変動し得るが、高親和性の抗原結合および標的特異性の特徴は、可変領域に存在する。
ある種の実施形態において、ヒトＴｒｋＢ受容体を発現するように操作されたマウスまたはラットにおいて抗ヒトＴｒｋＢ抗体を試験することが望ましい場合がある。これらのマウスまたはラットは、抗ＴｒｋＢ抗体が、ヒトＴｒｋＢにのみ結合し、マウスまたはラットＴｒｋＢとは交差反応しない状況において、有益であり得る。本発明におけるある種の実施例は、ヒトｔｒｋＢを発現するように遺伝子修飾されたマウスおよびラットを用いて実行した。当業者に公知の任意の方法を、かかるＴｒｋＢヒト化マウスおよびラットを生成するために用いることができる。
一般的に、本発明の抗体は、非常に高い親和性を有し、典型的には、固相または液相のいずれかに固定された抗原への結合により測定した場合、約１０－１２～約１０－９ＭのＫＤを有する。
生物学的等価物
本発明の抗ＴｒｋＢ抗体および抗体フラグメントは、記載される抗体のものと異なるが、ヒトＴｒｋＢに結合する能力を保持する、アミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。かかる変異体抗体および抗体フラグメントは、親配列と比較された場合、アミノ酸の１つまたはそれ以上の付加、欠失、または置換を含むが、記載される抗体のものと実質的に等価物である生物学的活性を示す。同様に、本発明のＤＮＡ配列をコードする抗ＴｒｋＢ抗体は、開示される配列と比較された場合、ヌクレオチドの１つまたはそれ以上の付加、欠失、または置換を含むが、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体または抗体フラグメントに実質的な生物学的等価物である抗ＴｒｋＢ抗体または抗体フラグメントをコードする配列を含む。かかるバリアントアミノ酸およびＤＮＡ配列の例は、上で考察されている。
２つの抗原結合タンパク質、または抗体は、例えば、吸収の速度および程度が、類似の実験条件下で同一のモル用量、単回用量もしくは複数回用量いずれかで投与される場合、有意な相違を示さない医薬等価物もしくは医薬代替物であるなら、生物学的等価物とみなされる。ある抗体は、その吸収の程度において等価物であるが、その吸収の速度において等価物でないなら、等価物または医薬代替物とみなされ、かかる吸収の速度における相違が意図的であり、標識において反映され、例えば、慢性的使用の際の有効な身体薬物濃度の到達に必須ではなく、研究される特定の薬物製品にとって医薬的に有意でないとみなされるので、生物学的等価物であると依然みなされる。
１つの実施形態において、２つの抗原結合タンパク質の安全性、純度、および有効性において臨床上有意義な相違はないなら、２つの抗原結合タンパク質は生物学的等価物である。
１つの実施形態において、２つの抗原結合タンパク質は、患者が、切り替えることなく継続される療法と比較して、免疫原性における臨床上有意な変化、もしくは損なわれた効能を含む副作用のリスクの増大を予期せずに、参照産物と生物学的産物の間で１回またはそれ以上切り替えられるなら、生物学的等価物である。
１つの実施形態において、２つの抗原結合タンパク質は、それら両方が、使用の条件もしくは複数の条件についての作用の通常のメカニズムまたは複数のメカニズムにより、かかるメカニズムが公知である限り、作用するなら、生物学的等価物である。
生物学的等価物は、インビボおよびインビトロの方法により実証される。生物学的等価物の測定は、例えば、（ａ）抗体もしくはその代謝産物の濃度が、血液、血漿、血清、もしくは他の生物学的体液において時間の関数として測定される、ヒトまたは他の哺乳類におけるインビボ試験；（ｂ）ヒトインビボバイオアベイラビリティデータと相関し、それを十分に予測するインビトロ試験；（ｃ）抗体（もしくはその標的）の適切な急性薬理作用が、時間の関数として測定される、ヒトまたは他の哺乳類におけるインビボ試験；および（ｄ）抗体の安全性、効能（efficacy）、もしくはバイオアベイラビリティもしくは生物学的均等性を確立する、十分に制御された臨床試験、を含む。
本発明の抗ＴｒｋＢ抗体の生物学的等価物は、例えば、残基もしくは配列の種々の置換を成すこと、または生物学的活性のため必要とされない末端もしくは内部残基もしくは配列を欠損させることにより、構築される。例えば、生物学的活性に必須でないシステイン残基は、欠損されるか、または他のアミノ酸で置換されて、再生の際に不必要または不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成が防止される。他の文脈において、生物学的等価物抗体は、アミノ酸変更を含む抗ＴｒｋＢ抗体変異体を含み、抗体のグリコシル化特徴、例えば、グリコシル化を除去するか、または取り除く変異を修飾する。
種選択性および種交差反応性
本発明は、ある種の実施形態によると、ヒトＴｒｋＢに結合するが、他の種に由来するＴｒｋＢには結合しない抗ＴｒｋＢ抗体を提供する。本発明はまた、ヒトＴｒｋＢに、および１つまたはそれ以上の非ヒト種に由来するＴｒｋＢに結合する抗ＴｒｋＢ抗体を含む。例えば、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、ヒトＴｒｋＢに結合し得るが、場合に応じて、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル、またはチンパンジーのＴｒｋＢのうちの１つまたはそれ以上に結合する場合も結合しない場合もある。本発明のある種の典型的な実施形態によると、ヒトＴｒｋＢに特異的に結合するが、マウスまたはラットＴｒｋＢには結合しないか、またはわずかにのみ結合する抗ＴｒｋＢ抗体が、提供される。
多特異性抗体
本発明の抗体は、単特異性または多特異性（例えば、二重特異性）である。多特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であるか、または１つより多くの標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有する。例えば、Ｔｕｔｔら、１９９１年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０～６９頁、Ｋｕｆｅｒら、２００４年、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８～２４４頁を参照。本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、別の機能性分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質に結合するか、またはそれと共発現される。例えば、抗体またはそのフラグメントは、第２の結合特異性を有する二重特異性もしくは多特異性抗体を作り出すための別の抗体もしくはそのフラグメントのような、１つまたはそれ以上の他の分子実体に、（例えば、化学的架橋結合、遺伝子融合、非共有結合的会合、またはその他により）機能的に結合される。
本発明は、二重特異性抗体であって、免疫グロブリンの一方のアームが、ヒトＴｒｋＢに結合し、免疫グロブリンの他方のアームが、第２の抗原に特異的である、二重特異性抗体を含む。ＴｒｋＢに結合するアームは、本明細書において表１に記載のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかを含み得る。
本発明の文脈において用いられる典型的な二重特異性抗体フォーマットは、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメイン、および第２のＩｇ ＣＨ３ドメインの使用を含み、ここで、第１および第２のＩｇ ＣＨ３ドメインは、少なくとも１個のアミノ酸により互いに異なり、ここで、少なくとも１個のアミノ酸相違が、アミノ酸相違を欠く二重特異性抗体と比較して、タンパク質Ａへの二重特異性抗体の結合を低減する。１つの実施形態において、第１のＩｇ ＣＨ３ドメインは、タンパク質Ａに結合し、第２のＩｇ ＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエキソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングによりＨ４３５Ｒ）のようなタンパク質Ａ結合を低減するか、または消失させる、変異を含有する。第２のＣＨ３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによる；ＥＵによりＹ４３６Ｆ）をさらに含む。第２のＣＨ３内で見出されるさらなる修飾は：ＩｇＧ１抗体の場合において、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、ならびにＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵにより、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合において、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、ならびにＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵにより、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）；ならびにＩｇＧ４抗体の場合において、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、ならびにＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵにより、Ｑ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）を含む。上で記載された二重特異性抗体フォーマットにおけるバリエーションは、本発明の範囲内であると考えられる。
本発明の文脈において用いられる他の典型的な二重特異性フォーマットは、限定されることなく、例えば、ｓｃＦｖ－ベースもしくは二重特異性抗体二重特異性フォーマット、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ、クアドローマ、ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ、共通軽鎖（例えば、ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓを有する共通軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ｂｏｄｙ、ロイシンジッパー、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）－ＩｇＧ、ならびにＭａｂ２二重特異性フォーマットを含む（例えば、前述のフォーマットの説明のため、Ｋｌｅｉｎら、２０１２年、ｍＡｂｓ４：６、１～１１頁、およびそこで引用される参考文献を参照）。二重特異性抗体はまた、ペプチド／核酸結合を用いても構築され、例えば、ここで、直交性化学反応性（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）を有する非天然のアミノ酸を用いて、部位特異的抗体－オリゴヌクレオチド結合を生じ、次に、規定された組成、原子価、および幾何学を有する多量体複合体に自己アセンブルする（例えば、Ｋａｚａｎｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．［Ｅｐｕｂ：２０１２年１２月４日］を参照）。
治療製剤および投与
本発明は、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、適切な担体、賦形剤、または輸送、デリバリー、寛容の好転などをもたらす他の薬剤と共に製剤化される。多数の適切な製剤は、全ての医薬化学者に公知の処方書：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡにおいて見出される。これらの製剤は、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ジェル、ワックス、油、脂質、脂質（陽イオンまたは陰イオン）含有ベシクル（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ＤＮＡ結合体、無水吸収ペースト、水中油型および油中水型エマルジョン、エマルジョンカルボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ジェル、ならびにカルボワックスを含有する半固体混合物を含む。Ｐｏｗｅｌｌら、「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」ＰＤＡ（１９９８年）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ５２：２３８～３１１頁も参照。
患者に投与される抗体の用量は、患者の年齢およびサイズ、標的疾患、状態、投与経路などに依存して変動する。好ましい用量は、典型的に、体重または体表面積に応じて計算される。成人患者の場合には、本発明の抗体を、通常、体重１ｋｇ当たり約０．０１～約２０ｍｇ、より好ましくは体重１ｋｇ当たり約０．０２～約７、約０．０３～約５、または約０．０５～約３ｍｇの単回用量で静脈内投与することが有利であり得る。状態の重症度に依存して、処置の頻度および持続時間は調節される。抗ＴｒｋＢ抗体を投与するのに有効な投薬量およびスケジュールは、経験的に決定され、例えば、患者の進行を、周期的な評価によりモニターし、必要に応じて用量を調節することができる。さらに、当該技術分野において周知の方法を用いて投薬量の種間増減を行ってもよい（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉら、１９９１年、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ． Ｒｅｓ． ８：１３５１頁）。
種々のデリバリーシステムが公知であり、これを用いて、本発明の医薬組成物、例えば、リポソームにおけるカプセル封入、微粒子、マイクロカプセル、変異ウイルスを発現する能力がある組み換え細胞、受容体により仲介されるエンドサイトーシスが投与される（例えば、Ｗｕら、１９８７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９～４４３２頁を参照）。導入の方法は、硝子体内、眼内、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路を含むが、これらに限定されない。組成物は、任意の好都合な経路により、例えば、注入もしくはボーラス注射により、上皮もしくは皮膚粘膜裏層（例えば、経口粘膜、直腸、および腸粘膜など）を通じた吸収により、投与され、他の生物学的に活性な剤と一緒に投与される。投与は全身または局所である。
本発明の医薬組成物は、標準的な針およびシリンジで皮下または静脈内にデリバリーされる。加えて、皮下デリバリーに関して、ペンデリバリー装置は、本発明の医薬組成物のデリバリーにおいて容易に適用される。かかるペンデリバリー装置は、再利用可能であるか、または使い捨てである。再利用可能なペンデリバリー装置は、医薬組成物を含有する置換可能なカートリッジを一般に利用する。カートリッジ内の医薬組成物の全てが投与されると、カートリッジは空になり、空のカートリッジは容易に廃棄され、医薬組成物を含有する新しいカートリッジで置き換えられる。次に、ペンデリバリー装置は再利用される。使い捨てのペンデリバリー装置には、置換可能なカートリッジは存在しない。むしろ、使い捨てのペンデリバリー装置は、装置内のリザーバーにおいて保持される医薬組成物が予め充填される。リザーバーは、医薬組成物が空になると、全体の装置は廃棄される。
多数の再利用可能なペン、および自動注射デリバリー装置は、本発明の医薬組成物の皮下デリバリーにおいて適用される。例は、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ、Ｉｎｃ．、Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ、ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｅｒｇｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、ならびにＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（ｓａｎｏｆｉ－ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）（２、３例のみを挙げる）を含むが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物の皮下デリバリーにおいて適用される、使い捨てのペンデリバリー装置の例は、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（ｓａｎｏｆｉ－ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）Ａｕｔｏｉｎｊｅｃｔｏｒ（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ、Ｌ．Ｐ．）、ならびにＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）（２、３例のみを挙げる）を含むが、これらに限定されない。
ある種の状況において、医薬組成物は、制御放出システムにおいてデリバリーされる。１つの実施形態において、ポンプが用いられる（Ｌａｎｇｅｒ（上記）、Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７年、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｆ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｅｎｇ． １４：２０１頁を参照）。別の実施形態において、ポリマー材料が用いられ、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ （ｅｄｓ．）、１９７４年、ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌｏｒｉｄａを参照。なお別の実施形態において、制御放出システムは、組成物の標的の近くに置かれ、従って、少量の全身性用量ののみが必要とされる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、１９８４年、ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、上記、２巻、１１５～１３８頁を参照）。他の制御放出システムは、Ｌａｎｇｅｒ、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３頁による説明において考察されている。
注射可能な調製物は、静脈内、硝子体内、眼内、皮下、皮内、および筋内注射用形態、点滴注入用形態などを含む。これらの注射可能な調製物は、公的に公知の方法により調製される。例えば、注射可能な調製物は、例えば、注射のため通常用いられる無菌の水性媒体もしくは油性媒体において、上で記載された抗体またはその塩を溶解、懸濁、または乳化することにより、調製される。注射用水性媒体として、例えば、生理的食塩水、グルコースを含有する等調溶液、および他の補助剤などが存在し、アルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］などのような適切な溶解剤と併用で用いられる。油性媒体として、例えば、ゴマ油、大豆油などが利用され、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどのような溶解剤と併用して用いられる。従って、調製される注射は、適切なアンプルに好ましく充填される。
有利には、上で記載された経口または非経口使用用医薬組成物は、有効成分の用量に適合するよう適した単位用量における投薬形態に調製される。単位用量におけるかかる投薬形態は、例えば、錠剤、ピル、カプセル剤、注射（アンプル剤）、坐剤などを含む。含有される前述の抗体の量は、一般に、単位用量において；特に、注射の形態において１つの投薬形態当たり約５～約５００ｍｇ、他の投薬形態のため約５～約１００ｍｇ、および約１０～約２５０ｍｇの前述の抗体が含有されることが好ましい。
抗体の治療上の使用
本発明は、それを必要とする対象に、抗ＴｒｋＢ抗体（例えば、本明細書において表１に記載のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲ配列のいずれかを含む抗ＴｒｋＢ抗体）を含む治療組成物を投与することを含む方法を含む。治療組成物は、本明細書において開示される抗ＴｒｋＢ抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれか１つまたはそれ以上、ならびに薬学的に許容し得る担体または希釈剤を含み得る。
本発明の抗体は、とりわけ、ＴｒｋＢ発現または活性に関連するかまたはそれにより仲介される任意の疾患または障害の処置、予防、および／または改善に有用である。本発明のＴｒｋＢアゴニスト抗体は、神経機能を好転させるために用いることができ、細胞変性により、特に、神経細胞の損傷または神経細胞の変性により部分的に特徴付けられる、任意の疾患または状態、例えば、急性神経系損傷または慢性神経変性疾患を処置または予防するために用いることができる。
本発明は、眼の疾患または障害の処置または予防を、かかる処置を必要とする患者に、本明細書の他の箇所に開示される抗ＴｒｋＢ抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することにより行う、方法を含む。
１つの実施形態において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、網膜ニューロンの損傷または死を予防する方法を提供し得る。１つの実施形態において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、網膜の変性が生じる病理疾患を処置する方法を提供し得る。１つの実施形態において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、眼の手術、光への曝露、または他の環境的外傷の前または後に、眼を処置し、それによって網膜細胞の変性を予防する方法を提供し得る。１つの実施形態において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、光受容体損傷および眼の変性を予防する方法を提供し得る。１つの実施形態において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、副作用を誘導することなく、網膜ニューロンを保護する方法を提供し得る。１つの実施形態において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、損傷した光受容体が回復または再生することを可能にする方法を提供し得る。
ある種の実施形態において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体のうちの１つまたはそれ以上を用いることで処置することができる眼疾患は、緑内障、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性もしくは他の黄斑症、虚血性視神経症、視神経炎、網膜虚血、光受容体変性、網膜色素変性、レーバー先天黒内障、レーバー依存性視神経萎縮症、アッシャー症候群、シュタルガルト病、および網膜動脈もしくは静脈閉塞からなる群より選択される。
本発明の１つまたはそれ以上の抗ＴｒｋＢ抗体で処置することができる他の病的状態は、網膜剥離、光性網膜症、手術により誘導される網膜症（機械的もしくは光に誘導されるかのいずれか）、毒素性網膜症、未熟児の網膜症、ＣＭＶもしくはＡＩＤＳに関連するＨＩＶ網膜症などのウイルス性網膜症、ブドウ膜炎、静脈もしくは動脈閉塞または他の血管障害に起因する虚血性網膜症、外傷もしくは眼の浸透病変に起因する網膜症、末梢硝子体網膜症、または遺伝性網膜変性を含む。
１つの実施形態において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、眼内または硝子体内へのデリバリーのために製剤化することができる。
本発明はまた、卒中または外傷性脳損傷など、他の中枢または末梢神経系疾患または障害を処置するための方法も提供する。さらに、本発明の抗体は、神経細胞の生存を促進するように作用し、神経保護物質として作用するため、これらのアゴニスト抗体のいずれか１つまたはそれ以上は、神経系への損傷により引き起こされるか、または神経変性疾患を含め、神経系に対して大きな影響を有する疾患により引き起こされる細胞損傷の回復または修復における最重要事項が神経細胞の生存である、中枢神経系疾患または障害を患う患者を処置するのに有益であることを実証し得る。
本明細書において記載される処置の方法の文脈において、抗ＴｒｋＢ抗体は、単独療法として（すなわち、唯一の治療剤として）、または１つもしくはそれ以上のさらなる治療剤との併用で投与される。
併用療法および製剤
本発明は、本明細書に記載される抗ＴｒｋＢ抗体のいずれかを、１つまたはそれ以上のさらなる治療上活性な成分との組み合わせで含む組成物および治療製剤、ならびにかかる組み合わせを、それを必要とする対象に投与することを含む、処置の方法を含む。
本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、眼内圧を低下させるのを助ける薬物（ＩＯＰ低下薬）、ニューロトロフィン、およびＶＥＧＦトラップ、例えば、アフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ（登録商標））などの血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）のアンタゴニストからなる群より選択される１つまたはそれ以上のさらなる治療上活性な成分と共に共製剤化される、および／またはそれとの併用で投与される。本発明のＴｒｋＢ抗体と併用することができる他の医薬は、プロスタグランジン類似体（例えば、ＺＩＯＰＴＡＮ（商標）、ＸＡＬＡＴＡＮ（登録商標））、ベータ遮断薬（例えば、ＴＩＭＯＰＴＩＣ ＸＥ（登録商標）、ＩＳＴＡＬＯＬ（登録商標）、ＢＥＴＯＰＴＩＣ（登録商標）Ｓ）、アルファ－２アドレナリンアゴニスト（例えば、アプラクロニジン）、炭酸脱水酵素阻害剤（例えば、ＴＲＵＳＯＰＴ（登録商標）、ＡＺＯＰＴ（登録商標））、コリン作動剤（例えば、ＩＳＯＰＴＯ（登録商標）ＣＡＲＰＩＮＥ、ＰＩＬＯＰＩＮＥ ＨＳ（登録商標）ゲル）、または併用治療薬（ベータ遮断剤に炭酸脱水酵素阻害剤を加えたもの、例えば、ＣＯＭＢＩＧＡＮ（商標）、ＣＯＳＯＰＴ（登録商標））を含むが、これらに限定されない。
本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、抗ウイルス剤、抗生物質、鎮痛剤、抗酸化剤、ＣＯＸ阻害剤、および／またはＮＳＡＩＤとの併用で投与してもよく、および／または共製剤化してもよい。抗ＴｒｋＢ抗体は、幹細胞療法、緑内障濾過手術、レーザー手術、または遺伝子療法を含む、他の種類の治療法との併用で用いることができる。
さらなる治療上活性な成分、例えば、上で挙げられた薬剤のいずれかまたはその誘導体は、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体の投与の直前に、それと同時に、またはその直後に、投与される（本開示の目的のため、かかる投与治療計画は、さらなる治療上活性な成分と「併用した」抗ＴｒｋＢ抗体の投与とみなされる）。本発明は、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体が、本明細書において他の箇所で記載される通り、さらなる治療上活性な成分のうちの１つまたはそれ以上と共製剤化された、医薬組成物を含む。
投与治療計画
本発明のある種の実施形態によると、複数回用量の抗ＴｒｋＢ抗体（または抗ＴｒｋＢ抗体、および本明細書において言及される、さらなる治療上活性な剤のいずれかの併用を含む医薬組成物）は、定義される時間経過にわたり、対象に投与される。本発明のこの態様による方法は、対象に、複数回用量の本発明の抗ＴｒｋＢ抗体を連続して投与することを含む。本明細書において用いられる「連続して投与すること」は、それぞれの用量の抗ＴｒｋＢ抗体が、対象に、時間における異なる点において、例えば、予め決定された間隔（例えば、時間、日、週、または月）により隔てられた異なる日において投与されることを意味する。本発明は、患者に、単回開始用量の抗ＴｒｋＢ抗体、続いて、１つまたはそれ以上の２次用量の抗ＴｒｋＢ抗体、場合により、続いて、１つまたはそれ以上の３次用量の抗ＴｒｋＢ抗体を連続して投与することを含む方法を含む。
用語「開始用量」、「２次用量」、および「３次用量」は、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体の投与の時間的な並びを指す。従って、「開始用量」は、処置計画の開始時に投与される用量であり（「ベースライン用量」としても言及される）；「２次用量」は、開始用量の後に投与される用量であり；「３次用量」は、２次用量後に投与される用量である。開始、２次、および３次用量は、全て、同一量の抗ＴｒｋＢ抗体を含有するが、一般に、投与の頻度の点で互いに異なる。しかしながら、ある種の実施形態において、開始、２次、および／または３次用量において含有される抗ＴｒｋＢ抗体の量は、処置の経過中、互いに異なる（例えば、必要に応じて、上方もしくは下方調節される）。ある種の実施形態において、２回またはそれ以上（例えば、２、３、４、もしくは５回）の用量は、処置治療計画の開始時に、「添加用量」として投与され、続いて、あまり頻繁でない基盤で投与される続く用量（例えば、「維持用量」）が投与される。
本発明のある種の典型的な実施形態において、それぞれの２次および／または３次用量は、直前の先行する用量の後、１～２６（例えば、１、１１／２、２、２１／２、３、３１／２、４、４１／２、５、５１／２、６、６１／２、７、７１／２、８、８１／２、９、９１／２、１０、１０１／２、１１、１１１／２、１２、１２１／２、１３、１３１／２、１４、１４１／２、１５、１５１／２、１６、１６１／２、１７、１７１／２、１８、１８１／２、１９、１９１／２、２０、２０１／２、２１、２１１／２、２２、２２１／２、２３、２３１／２、２４、２４１／２、２５、２５１／２、２６、２６１／２、またはそれ以上）週で投与される。本明細書において用いられる語句「直前の先行する用量」は、複数回投与の並びにおいて、中断のない用量の並びで、まさに次の用量の投与に先立ち患者に投与される、抗ＴｒｋＢ抗体の用量を意味する。
本発明のこの態様による方法は、患者に、任意の数の２次および／または３次用量の抗ＴｒｋＢ抗体を投与することを含む。例えば、ある種の実施形態において、単回２次用量のみが患者に投与される。他の実施形態において、２回またはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８回、もしくはそれ以上）の２次用量が患者に投与される。同様に、ある種の実施形態において、単回の３次用量のみが患者に投与される。他の実施形態において、２回またはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８回、もしくはそれ以上）の３次用量が患者に投与される。投与治療計画は、特定の対象の生涯にわたって無期限に、またはかかる処置が治療上必要となくなるかもしくは有利でなくなるまで、行われる。
複数回の２次用量を含む実施形態において、それぞれの２次用量は、他の２次用量と同一の頻度で投与される。例えば、それぞれの２次用量は、直前の先行する用量の１～２週間または１～２カ月後に投与される。同様に、複数回の３次用量を含む実施形態において、それぞれの３次用量は、他の３次用量と同一の頻度で投与される。例えば、それぞれの３次用量は、直前の先行する用量の２～１２週間後に投与される。本発明のある種の実施形態において、２次および／または３次用量が患者に投与される頻度は、処置治療計画の経過にわたり変動する。投与の頻度もまた、医師による処置の経過中、臨床検査に従い個々の患者のニーズに依存して調節される。
本発明は、投与治療計画を含み、ここで、２～６回の添加用量は、患者に、第１の頻度（例えば、１週間に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、１カ月に１回、２カ月に１回など）で投与され、続いて、２回またはそれ以上の維持用量が、あまり頻繁でない基盤で患者に投与される。例えば、本発明のこの態様によると、添加用量が、１カ月に１回の頻度で投与されるなら、次に、維持用量が、６週間毎に１回、２カ月毎に１回、３カ月毎に１回などで患者に投与される。
抗体の診断上の使用
本発明の抗ＴｒｋＢ抗体はまた、例えば、診断の目的のため、試料中のＴｒｋＢまたはＴｒｋＢを発現する細胞を検出および／または測定するためにも用いることができる。例えば、抗ＴｒｋＢ抗体またはそのフラグメントは、ＴｒｋＢの異常な発現（例えば、過剰発現、過少発現、発現の欠如など）により特徴付けられる状態または疾患を診断するために用いることができる。ＴｒｋＢについての典型的な診断アッセイは、例えば、患者から得た試料を、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体と接触させることを含み、ここで、抗ＴｒｋＢ抗体は、検出可能な標識もしくはレポーター分子で標識される。あるいは、未標識の抗ＴｒｋＢ抗体は、検出可能に標識されたそれ自体である２次抗体と組み合わせた診断適用において用いられる。検出可能な標識またはレポーター分子は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、もしくは１２５Ｉのようなラジオアイソトープ；フルオレセインイソチオシアネート、もしくはローダミンのような蛍光もしくは化学発光部分；またはアルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼのような酵素である。試料中のＴｒｋＢを検出または測定するために用いられる特異的な典型的アッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を含む。
本発明によるＴｒｋＢ診断アッセイにおいて用いられる試料は、患者から得ることができる任意の組織または体液試料を含み、正常もしくは病理条件下で、ＴｒｋＢタンパク質、またはそのフラグメントいずれかの検出可能な量を含有する。一般に、健常患者（例えば、異常なＴｒｋＢレベルまたは活性に関連する疾患または状態を罹患していない患者）から得られた特定の試料中のＴｒｋＢのレベルを測定して、ベースラインまたは標準的なＴｒｋＢのレベルをまず確立する。このベースラインＴｒｋＢレベルを、次に、ＴｒｋＢ関連疾患または状態を有することが疑われる個体から得られた試料において測定されたＴｒｋＢのレベルに対して比較する。
以下の実施例は、当業者に本発明の方法および組成物の作り方、ならびに用い方の完全な開示または記載を提供するために記述するものであり、本発明者らが彼らの発明とみなすものの範囲を制限することは意図されない。用いた数字（例えば、量、温度など）に関する正確さを保証するよう試みられたが、実験上の誤差および自差がある程度あることは考慮されるべきである。別段示されなければ、部分は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏におけるものであり、室温は約２５℃であり、圧力は雰囲気においてであるか、または雰囲気に近い。
ＴｒｋＢに対するヒト抗体の生成
ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含むマウスにおいて、ＴｒｋＢに対するヒト抗体を作製した。１つの実施形態において、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおいて、ヒト抗体を作製した。１つの実施形態において、ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ（登録商標）（ＶＩ）マウスを、ヒトＴｒｋＢ（ｅｃｔｏ）ｍＦｃ（配列番号７７）で免疫した。１つの実施形態において、ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ（登録商標）（ＶＩ）マウスを、マウスＴｒｋＢ（ｅｃｔｏ）ｍＦｃ（配列番号８０）で免疫した。ＴｒｋＢ特異的イムノアッセイにより、抗体免疫応答をモニターした。例えば、精製された全長ＴｒｋＢに対する特定の抗体力価に関して、血清をアッセイした。抗体を産生するクローンを、Ｂ細胞ソーティング技術（ＢＳＴ）およびハイブリドーマ方法の両方を用いて単離した。例えば、所望の免疫応答を達成したら、脾細胞を回収し、マウスミエローマ細胞と融合させて生存能を保持し、ハイブリドーマ細胞株を形成させた。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、選択して、ＴｒｋＢ特異的抗体を産生する細胞株を同定した。ある種の抗マウスＴｒｋＢ抗体を、この方式で生成し、Ｍ２ａＭ１４１７３Ｎ、Ｍ２ａＭ１４１７８Ｎ、およびＭ２ａＭ１４１７９Ｎと命名した。
米国特許７５８２２９８号（参照によって、全体として本明細書に具体的に組み入れる）において記載される通り、ミエローマ細胞に融合させることなく、抗原陽性マウスＢ細胞から抗ＴｒｋＢ抗体も直接的に単離した。この方法を用いて、いくつかの完全ヒト抗ＴｒｋＢ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびヒト定常ドメインを有する抗体）を得て；この方法で作製した典型的な抗体を、次の：Ｈ４Ｈ９７８０Ｐ、Ｈ４Ｈ９８１４Ｐ、およびＨ４Ｈ９８１６Ｐ２と命名した。
この実施例の方法に従い作製した典型的な抗体の生物学的特性を、以下で説明する実施例において詳細に記載する。
重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸およびヌクレオチド配列
表１ａには、選択した本発明の抗ＴｒｋＢ抗体の重鎖および軽鎖可変領域、ならびにＣＤＲのアミノ酸配列識別名を記載する。表１ｂには、選択した本発明の抗ＴｒｋＢ抗体の全長重鎖および軽鎖のアミノ酸配列識別名を記載する。選択した本発明の抗ＴｒｋＢ抗体の対応する核酸配列識別名は、表２に記載する。
Figure 0007438937000001
Figure 0007438937000002
Figure 0007438937000003
抗体は、本明細書において典型的には次の命名法によって言及する：Ｆｃ接頭辞（例えば、「Ｈ４Ｈ」、「Ｈ２Ｍ」など）、続いて、数字で表した識別名（例えば、表１または２において示す「９７８０」、「９８１６」など）、続いて「Ｐ」、「Ｐ２」、または「Ｎ」接尾辞。抗体名称上のＨ４Ｈ接頭辞は、抗体の特定のＦｃ領域アイソタイプを示す。従って、この命名法により、抗体は、本明細書において、例えば、「Ｈ４Ｈ９７８０Ｐ」として言及され、これは、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域を示し、Ｍ２ａＭ１４１７９Ｎは、例えば、マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃ領域を示す。可変領域は、抗体名称において最初の「Ｈ」により示される場合、完全ヒトである。接頭辞「Ｍ」は、マウス可変領域を表す。当業者が理解する通り、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体を、異なるＦｃアイソタイプを有する抗体に変換することができる（例えば、マウスＩｇＧ１ Ｆｃを有する抗体を、ヒトＩｇＧ４を有する抗体などに変換することができる）が、いずれの場合も、表１または２において示した数字で表した識別名により示した可変ドメイン（ＣＤＲを含む）は同一のままであり、抗原の結合特性はＦｃドメインの性質に関わらず、一致または実質的に類似であると予測した。
２５℃および３７℃で測定した、抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体の異なるＴｒｋＢ試薬へのＢｉａｃｏｒｅ結合動態
精製された抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体へのＴｒｋＢ結合について、平衡解離定数（ＫＤ値）を、Ｂｉａｃｏｒｅ ４０００機器を用いてリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いて、決定した。全ての結合研究は、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．０５％ ｖ／ｖ 界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０（ＨＢＳ－ＥＴランニングバッファー）において、２５℃および３７℃で行った。Ｂｉａｃｏｒｅセンサー表面を、まず、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗ヒトＦｃγ特異的ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、番号１０９－００６－０９８）またはウサギ抗マウスＦｃポリクローナル抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、番号ＢＲ－１００８－３８）とのアミンカップリングにより誘導体化して、抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体を捕捉した。結合研究は、以下のＴｒｋＢ試薬；Ｃ末端のｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグと共に発現させたヒトＴｒｋＢ細胞外ドメイン（ｈＴＲＫＢ．ｍｍＨ、配列番号７６、受託番号ＮＰ＿００１０１８０７４．１）、Ｃ末端のｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグと共に発現させたマウスＴｒｋＢ細胞外ドメイン（ｍＴＲＫＢ．ｍｍＨ、配列番号７９、受託番号ＮＰ＿００１０２０２４５）、Ｃ末端のｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグと共に発現させたラットＴｒｋＢ細胞外ドメイン（ｒＴＲＫＢ．ｍｍＨ、配列番号８４、受託番号ＮＰ＿０３６８６３．１）、およびＣ末端のマウスＩｇＧ２ａ Ｆｃタグと共に発現させたヒトＴｒｋＢ細胞外ドメイン（ｈＴｒｋＢ－ｍＦｃ、配列番号７７、受託番号ＮＰ＿００１０１８０７４．１）において行った。異なる濃度のＴｒｋＢ試薬を、まず、ＨＢＳ－ＥＴランニングバッファー（１００ｎＭ～１．２３ｎＭ、３倍連続希釈）中に調製し、抗ヒトＦｃを捕捉した抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体表面上に、流速３０μＬ／分において４分間注入し、ＴｒｋＢ試薬に結合したモノクローナル抗体の解離を、ＨＢＳ－ＥＴランニングバッファーにおいて１０分間モニターした。Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２．０ｃ曲線近似ソフトウェアを用いて質量移動限界を有するリアルタイム結合センサグラムを１：１結合モデルに近似させることにより、動力学的結合（ｋａ）および解離（ｋｄ）速度定数を決定した。結合解離平衡定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）を、動力学的速度定数から
Figure 0007438937000004
 として計算した。
２５℃および３７℃におけるｈＴｒｋＢ．ｍｍＨ、ｍＴｒｋＢ．ｍｍＨ、ｒＴｒｋＢ．ｍｍＨ、またはｈＴｒｋＢ－ｍＦｃの、本発明の異なる抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体への結合の結合動力学的パラメーターを、表３から１０に示す。
結果の概要：
２５℃において、抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体は、表３に示されるように、５４５ｐＭ～４１．３ｎＭの範囲にあるＫＤ値で、ｈＴｒｋＢ．ｍｍＨに結合した。３７℃において、モノクローナル抗体は、表４に示されるように、２．２８ｎＭ～１３５ｎＭの範囲にあるＫＤ値で、ｈＴｒｋＢ．ｍｍＨに結合した。
２５℃において、抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体は、表５に示されるように、３１．１ｐＭ～４．４８ｎＭの範囲にあるＫＤ値で、ｈＴｒｋＢ－ｍＦｃに結合した。３７℃において、抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体は、表６に示されるように、７３．３ｐＭ～３．４６ｎＭの範囲にあるＫＤ値で、ｈＴｒｋＢ－ｍＦｃに結合した。
２５℃において、本明細書においてＨ１Ｍ８０３７Ｃと称される比較物抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体（米国出願公開第２０１０／０１９６３９０号、Ｃ２と命名された抗体を参照；比較物の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列については、それぞれ配列番号９７および９８も参照）は、表７に示されるように、４０．８ｎＭのＫＤ値でｍＴｒｋＢ．ｍｍＨに結合した。本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、表７に示されるように、２５℃においてｍＴｒｋＢ．ｍｍＨに結合しなかった。３７℃において、比較物抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体は、表８に示されるように、９４．１ｎＭのＫＤ値で、ｍＴｒｋＢ．ｍｍＨに結合した。本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、表８に示されるように、３７℃においてｍＴｒｋＢ．ｍｍＨに結合しなかった。
２５℃において、比較物抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体は、表９に示されるように、３１．８ｎＭのＫＤ値でｒＴｒｋＢ．ｍｍＨに結合した。本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、表９に示されるように、２５℃においてｒＴｒｋＢ．ｍｍＨに結合しなかった。３７℃において、比較物抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体は、表１０に示されるように、８７．５ｎＭのＫＤ値でｒＴｒｋＢ．ｍｍＨに結合した。本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、表１０に示されるように、３７℃においてｒＴｒｋＢ．ｍｍＨに結合しなかった。
Figure 0007438937000005
Figure 0007438937000006
Figure 0007438937000007
Figure 0007438937000008
Figure 0007438937000009
Figure 0007438937000010
Figure 0007438937000011
Figure 0007438937000012
２５℃で測定した、サロゲート抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体の異なるＴｒｋＢ試薬へのＢｉａｃｏｒｅ結合動態
精製された抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体へのＴｒｋＢ結合について、平衡解離定数（ＫＤ値）を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を用いてリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いて、決定した。全ての結合研究は、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．０５％ ｖ／ｖ 界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０（ＨＢＳ－ＥＴランニングバッファー）において、２５℃で行った。Ｂｉａｃｏｒｅセンサー表面を、まず、ウサギ抗マウスＦｃポリクローナル抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、番号ＢＲ－１００８－３８）とのアミンカップリングによって誘導体化し、抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体を捕捉した。結合研究は、以下のＴｒｋＢ試薬；Ｃ末端のｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグと共に発現させたヒトＴｒｋＢ細胞外ドメイン（ｈＴｒｋＢ．ｍｍＨ、配列番号７６、ＮＰ＿００１０１８０７４．１）、Ｃ末端のｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグと共に発現させたマウスＴｒｋＢ細胞外ドメイン（ｍＴＲＫＢ．ｍｍＨ、配列番号７９、ＮＰ＿００１０２０２４５）、およびＣ末端のｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグと共に発現させたラットＴｒｋＢ細胞外ドメイン（ｒＴＲＫＢ．ｍｍＨ、配列番号８４、ＸＰ＿００２７２１３１９．１）において行った。異なる濃度のＴｒｋＢ試薬を、まず、ＨＢＳ－ＥＴランニングバッファー（９０ｎＭ－３．３３ｎＭ、３倍連続希釈）中に調製し、抗マウスＦｃを捕捉した抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体表面上に、流速５０μＬ／分において４分間注射し、ＴｒｋＢ試薬に結合したモノクローナル抗体の解離を、ＨＢＳ－ＥＴランニングバッファーにおいて１０分間モニターした。Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２．０ｃ曲線近似ソフトウェアを用いて質量移動限界を有するリアルタイム結合センサグラムを１：１結合モデルに近似させることにより、動力学的結合（ｋａ）および解離（ｋｄ）速度定数を決定した。結合解離平衡定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）を、動力学的速度定数から
Figure 0007438937000013
 として計算した。
２５℃におけるｈＴｒｋＢ．ｍｍＨ、ｍＴｒｋＢ．ｍｍＨ、またはｒＴｒｋＢ．ｍｍＨの、本発明の異なる抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体への結合の結合動力学的パラメーターを、表１１から１３に示す。
結果：
２５℃において、本発明のサロゲート抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体は、表１１に示されるように、ｈＴｒｋＢ．ｍｍＨへの結合を示さなかった。
２５℃において、本発明のサロゲート抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体は、表１２に示されるように、２．３９ｎＭ～３２．４ｎＭの範囲にあるＫＤ値でｍＴｒｋＢ．ｍｍＨに結合した。
２５℃において、本発明のサロゲート抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体は、表１３に示されるように、２．５６ｎＭ～２６．９ｎＭの範囲にあるＫＤ値でｒＴｒｋＢ．ｍｍＨに結合した。
Figure 0007438937000014
Figure 0007438937000015
Figure 0007438937000016
ＨＥＫ２９３／ＳＲＥ－ｌｕｃ／ｈＴｒｋＢおよびＨＥＫ２９３／ＳＲＥ－ｌｕｃ／ｍＴｒｋＢ（Ｅｃｔｏ）－ｈＴｒｋＢ（ＴＭ－Ｃｙｔｏ）細胞を用いたバイオアッセイ
バイオアッセイを発展させて、血清応答エレメント（ＳＲＥ）およびリガンドである脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ、Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の制御下で、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いてＴｒｋＢの活性化を検出した。ヒトＴｒｋＢ（ｈＴｒｋＢ、ＮＰ＿００１０１８０７４．１のアミノ酸３２～４２９もしくはＵｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ１６６２０－１）またはヒトＴｒｋＢの膜貫通型および細胞質ドメインに融合したマウスＴｒｋＢ細胞外ドメイン（ｍＴｒｋＢ、ＮＰ＿００１０２０２４５．１のアミノ酸３２～４２９もしくはＵｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ１５２０９－１がヒトＴｒｋＢアミノ酸４３１～８２２に融合したもの）のいずれかと共にルシフェラーゼレポーター（ＳＲＥ応答エレメント－ルシフェラーゼ、ＳＲＥ－ｌｕｃ、ＳＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、番号ＣＬＳ－０１０Ｌ）を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞株を、生成した。安定な細胞株ＨＥＫ２９３／ＳＲＥ－Ｌｕｃ／ｈＴｒｋＢおよびＨＥＫ２９３／ＳＲＥ－Ｌｕｃ／ｍＴｒｋＢを、１０％ ＦＢＳ、非必須アミノ酸、ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン、１μｇ／ｍＬ ピューロマイシン、および５００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８を補充したＤＭＥＭ中に維持した。
バイオアッセイのために、細胞を、０．１％ ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、およびＬ－グルタミンを補充したＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）において、９６ウェルのアッセイプレートに１ウェル当たり２０，０００個の細胞で播種し、次いで、５％ ＣＯ２において３７℃で一晩インキュベートした。翌朝、ヒトＢＤＮＦまたは抗体を、１００ｎＭから０．００２ｎＭで連続希釈し（加えて、リガンドなしでバッファーのみを含有する試料）、細胞に添加して、ＴｒｋＢシグナル伝達の活性化を決定した。連続希釈した抗体はまた、１００ｐＭのＢＤＮＦで試験した（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、２４８－ＢＤ／ＣＦ）。細胞を、次いで、５％ ＣＯ２の存在下において、３７℃で５．５時間インキュベートした。ＯｎｅＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加後に、Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ機器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を、Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）により非線形回帰（４つのパラメーターのロジスティックス）を用いて解析して、ＥＣ５０およびＩＣ５０値を得た。抗体の最大の活性化を、以下を用いて計算した。
Figure 0007438937000017
結果の概要および結論：
表１４に示されるように、本発明の３つの抗ＴｒｋＢ抗体、Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２、Ｈ４Ｈ９８１４Ｐ、Ｈ４Ｈ９７８０Ｐは、３５～８２ｐＭのＥＣ５０ｓで、ＢＤＮＦの非存在下において、ＨＥＫ２９３／ＳＲＥ－ｌｕｃ／ｈＴｒｋＢ細胞においてヒトＴｒｋＢシグナル伝達の活性化を示し、最大活性化は８８～９２％の範囲にあった。本発明の３つの抗体はまた、１００ｐＭ ＢＤＮＦの存在下においても試験した。１００ｐＭ ＢＤＮＦは、無関係の対照ｍＡｂである対照ｍＡｂ２の存在下において、５６％の活性化を示した一方で、本発明の抗体は、４５～７６ｐＭのＥＣ５０ｓでさらなる活性化を示し、最大活性化は７７～８０％の範囲にあった。本発明の３つの抗ＴｒｋＢ抗体は、ＢＤＮＦの非存在下または１００ｐＭ ＢＤＮＦの存在下において、ＨＥＫ２９３／ＳＲＥ－ｌｕｃ／ｍＴｒｋＢ細胞においてマウスＴｒｋＢシグナル伝達の活性化は示さなかった。対照ｍＡｂ １である抗ＴｒｋＢ比較物抗体Ｈ１Ｍ８０３７Ｃは、７６ｐＭのＥＣ５０でヒトＴｒｋＢシグナル伝達の活性化を示し、最大活性化は７８％であり、ＢＤＮＦなしでは、４３ｐＭのＥＣ５０で、マウスＴｒｋＢの活性化を示し、最大活性化は８５％であった。１００ｐＭ ＢＤＮＦの存在下において、対照ｍＡｂ １は、１１０ｐＭのＥＣ５０でヒトＴｒｋＢシグナル伝達を活性化し、最大活性化７９％であり、４２ｐＭのＥＣ５０でマウスＴｒｋＢを活性化し、最大活性化は６９％であり、これは、１００ｐＭ ＢＤＮＦでの対照ｍＡｂ ２による活性化よりも高かった。対照ｍＡｂ ２である無関係のヒトＩｇＧ４抗体は、１００ｐＭ ＢＤＮＦの非存在下または存在下において、いずれの活性化も示さなかった。
表１５に示されるように、本発明の３つの抗ＴｒｋＢ抗体、Ｍ２ａＭ１４１７３Ｎ、Ｍ２ａＭ１４１７８Ｎ、Ｍ２ａＭ１４１７９Ｎは３４～１９０ｐＭのＥＣ５０ｓで、ＢＤＮＦの非存在下において、ＨＥＫ２９３／ＳＲＥ－ｌｕｃ／ｍＴｒｋＢ細胞においてマウスＴｒｋＢシグナル伝達の活性化を示し、最大活性化は７６～９４％の範囲にあった。本発明の３つの抗体はまた、１００ｐＭ ＢＤＮＦの存在下においても試験した。１００ｐＭ ＢＤＮＦは、無関係のアイソタイプ対照ｍＡｂである対照ｍＡｂ４の存在下において、６０％の活性化を示した一方で、本発明の抗体は、１７～１００ｐＭのＥＣ５０ｓ でさらなる活性化を示し、最大活性化は６７～７５％の範囲にあった。本発明の３つの抗ＴｒｋＢ抗体は、ＢＤＮＦの非存在下または１００ｐＭ ＢＤＮＦの存在下において、ＨＥＫ２９３／ＳＲＥ－ｌｕｃ／ｈＴｒｋＢ細胞においてヒト、ＴｒｋＢシグナル伝達の活性化は示さなかった。対照ｍＡｂ １は、５７ｐＭのＥＣ５０で、ヒトＴｒｋＢシグナル伝達の活性化を示し、最大活性化は８０％であり、ＢＤＮＦなしでは、４３ｐＭのＥＣ５０で、マウスＴｒｋＢの活性化を示し、最大活性化は８５％であった。１００ｐＭ ＢＤＮＦの存在下において、対照ｍＡｂ １は、１１０ｐＭのＥＣ５０でヒトＴｒｋＢシグナル伝達を活性化し、最大活性化は７９％であり、４２ｐＭのＥＣ５０でマウスＴｒｋＢを活性化し、最大活性化は６９％であり、これは、１００ｐＭ ＢＤＮＦでの対照ｍＡｂ ４による活性化よりも高かった。対照ｍＡｂ ３および対照ｍＡｂ ４の無関係のマウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照抗体は、１００ｐＭ ＢＤＮＦの非存在下または存在下において、いずれの活性化も示さなかった。
表でのデータの概要：
Figure 0007438937000018
Figure 0007438937000019
ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスにおける定位的注射後の脳におけるＴｒｋＢリン酸化に対するインビボでのＴｒｋＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２およびＩｇＧ４アイソタイプ対照ＲＥＧＮ１９４５の効果の比較
本発明のＴｒｋＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２の、ＴｒｋＢ活性化動態に対する効果を決定するために、海馬への直接注射後のＴｒｋＢリン酸化の時間経過研究を、マウスＴｒｋＢ受容体の代わりにヒトＴｒｋＢ受容体についてホモ接合性のマウス（ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスと称される）において行った。ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウス（Ｎ＝４８匹）に、ビヒクル（ＰＢＳ）、本明細書においてＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体と表記されるＲＥＧＮ１９４５（２７．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度）、またはＴｒｋＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２（２７．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度）のいずれか２μＬの、ブレグマから－２ｍｍ後方および＋１．５ｍｍ側方の海馬への両側定位的注射を受けさせた。組織損傷を最小限に抑えるために、注射および針の除去は、５分間の間隔にわたって徐々に行った。ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスを、次いで、注射のおよそ３０分後、１時間後、４時間後、または１８時間後に、ＣＯ２安楽死により殺処分した。末端出血を、心臓穿刺により行って採血し、マウスに、次いで、低温のヘパリン化生理食塩水の経心腔的灌流を行った。脳を、頭蓋から慎重に取り出し、注射部位の周囲の組織の２ｍｍ３の切片を切り出し、エッペンドルフチューブに採取し、氷上で保管した。次に、脳切片を、２倍プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号７８４４４）を含有するＲＩＰＡ溶解バッファー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号８９９０１）３００ｕＬ中に溶解させ、氷上で保管した。溶解した組織を、次いで、さらなる処理のためにホモジナイズし、アリコートにし、－８０℃で保管した。
脳組織におけるＴｒｋＢリン酸化を評価するために、免疫沈降およびウエスタンブロッティングを行った。結合についてＨ４Ｈ９８１６Ｐ２と競合しない抗ヒトＴｒｋＢ抗体Ｈ４Ｈ１０１０８Ｎを、ＮＨＳ活性化セファロースビーズ（製造元のプロトコールを用いて調製、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７－０９０６）に結合させ、ＤＰＢＳで３回洗浄して、あらゆる残留保存溶液を除去した。ホモジナイズした脳ライセートを、氷上で解凍し、ＴＢＳＴ中の１％ ＮＰ－４０、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤から構成されるバッファーにおいて、１ｍｇ／ｍＬ（バッファーの体積に対する脳の重量）の濃度まで希釈した。ホモジナイズした脳ライセートのタンパク質濃度を、製造元の指示に従って（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２３２２５）、標準的なＢＣＡアッセイを行うことにより定量化した。タンパク質１００ｕｇ毎に、抗ヒトＴｒｋＢ抗体（Ｈ４Ｈ１０１０８Ｎ）ＮＨＳ－活性化セファロースビーズ１５ｕＬを、脳ライセート溶液に添加し、混合物を、２０ｒｐｍ（Ｔｈｅｒｍｏローテータ）で緩徐に振盪させながら、４℃で一晩インキュベートした。翌日に、試料を、１０００×ｇで１分間遠心分離し、次いで、上清を慎重に除去した。ビーズを、続いて、１％ Ｔｗｅｅｎ－２０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ９４１６）を有するＴｒｉｓバッファー生理食塩水（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１７０６４３５）（ＴＢＳＴ）４００ｕＬで２回洗浄した。洗浄バッファーを慎重に吸引した後、水中の０．１％ トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔ６２２００）ｐＨ３．０、６０ｕＬを、それぞれの試料に添加した。溶液を混合し、２分間静置させた後、採取し、別個のチューブに移した。この手順を、別の０．１％ ＴＦＡ、ｐＨ３．０ ６０ｕＬを用いて繰り返した。それぞれの試料の２つの０．１％ ＴＦＡ溶液を混合し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１５５６７－０２７）ｐＨ８．５、２ｕＬを添加した。
溶液を、高速真空装置を用いて乾燥させ、次いで、再懸濁させ、１×Ｌａｅｍｍｌｉバッファー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１６１０７３７）２０ｕＬと３５５ｎＭ ２－メルカプトエタノール（ＢＭＥ、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１９８５－０２３）との混合物で還元した。試料を、９５℃で１０分間沸騰させ、１０ウェルのＭｉｎｉ－Ｐｒｏｔｅａｎ ４－１５％ Ｔｒｉｓ－グリシンゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号４５６１０８６）にロードした。電気泳動の後に、タンパク質試料を、３０分間の過程にわたって、１．３Ａおよび２５Ｖの一定速度で、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１７０４１５６）を介して、Ｔｒｉｓ－グリシンゲルからＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１７０－４１５６）へと移した。移した後、膜を、室温において１時間、ＴＢＳＴ中の２．５％ ミルク（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１７０－６４０６）で遮断し、続いて、２．５％ ＢＳＡの溶液中に１：１０００希釈した抗ホスホ－ＴｒｋＢ抗体（Ｎｏｖｕｓ、カタログ番号ＮＢ１００－９２６５６）または２．５％ ミルクＴＢＳＴ中に１：１０００希釈した抗ＴｒｋＢ一次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号４６０３）のいずれかで、４℃において一晩、３０ｒｐｍのシェーカーにおいてプローブした。翌日に、ブロットをＴＢＳＴで洗浄し、ＴＢＳＴ中１％ ミルク中に１：１０００で、室温において１時間、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１１１－０３５－１４４）に結合させた抗ウサギＩｇＧ抗体と共にインキュベートした。次に、ブロットを再び洗浄し、ＥＣＬ溶液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ， Ｉｎｃ．、カタログ番号ＲＰＮ２１０６）で発展し、その後の画像露光は、３０秒毎に取得した。
結果の概要および結論：
ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスの脳ライセートに由来するタンパク質の免疫沈降およびその後のウエスタンブロッティングにより、海馬ＴｒｋＢリン酸化は、図１に示されるように、ＴｒｋＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２を注射したマウスにおいては検出可能であったが、ビヒクルまたはアイソタイプ対照抗体で処置したマウスにおいては検出可能でなかったことが示された。評価した時点の中で、ＴｒｋＢリン酸化は、Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２を投薬したマウスにおいて定位的注射の４時間後にピークに達した。ＴｒｋＢリン酸化はまた、全てではないが一部のマウスにおいて、投薬の１８時間後に、ウエスタンブロットにより検出された。対照的に、ビヒクルおよびＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体の注射は、いずれの時点においてもＴｒｋＢリン酸化を誘導しなかった。ウエスタンブロッティングは、総ＴｒｋＢ受容体レベルが、Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２を投薬したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスの全てではないが一部において、ビヒクルおよびアイソタイプ対照処置マウスと比べて、下方制御されたことも示した。総ＴｒｋＢレベルは、投薬１８時間後に、Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２で処置した対象において、わずかに下方制御されるとみられた。従って、これらの結果は、ＴｒｋＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２の直接的な注射が、ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスにおいて海馬のＴｒｋＢ受容体のリン酸化を誘導することを示す。
ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスにおける体重および代謝に対するインビボでのＨ４Ｈ９８１６およびアイソタイプ対照ＲＥＧＮ１９４５抗体の効果の比較
本発明のＴｒｋＢアゴニスト抗体の体重および組成に対する効果を決定するために、マウスＴｒｋＢ受容体の代わりにヒトＴｒｋＢ受容体の発現についてホモ接合性のマウス（ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウス）の代謝研究を、以下の抗体単回皮下注射の後に行った。ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウス（雄性、２０週齢）を、まず、２週間の順化のために、群のケージから単独のケージでの収容に移した。この期間の後に、マウスを、代謝ケージ（ＣＬＡＭＳ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に移して、抗体投与後の食物および水の摂取量、自発運動、エネルギー消費、ならびに呼吸における変化を評価した。通常の粉末飼料を、スプリングロードスケール（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ， ＰＬ６０２Ｅ）上のフロアチャンバに入れ、飼料総重量の変化により食物摂取量を測定した。水は、ケージ上部の飲み口からアクセス可能であり、摂取量を、ポンプライン体積の変化を追跡することにより測定した（Ｏｘｙｍａｘ（登録商標）ＣＬＡＭＳ Ｌｉｑｕｉｄ Ｕｎｉｔ）。ＣＬＡＭＳ代謝ケージは、研究の期間中連続的に１６～１８分間隔でこれらのパラメーターのそれぞれを測定した。代謝データを、単一の尺度で解析し、ＯＸＹＭＡ（登録商標）／ＣＬＡＭＳソフトウェア（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ｖ５．３５）を用いて完全な明暗サイクルを含む２４時間間隔でまとめた。２週間ケージに順化させた後、ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスに、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中のＴｒｋＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２、またはＩｇＧ４アイソタイプ対照のいずれかの単回５０ｍｇ／ｋｇ皮下用量を受容させた。ナイーブ対照ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスの群には、注射を受容させなかった。マウスは、投薬の直前、ならびに投薬の２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、および１２０時間後に、体重を計測した。それぞれのマウスの体組成を測定するために、定量的磁気共鳴とも称される核磁気共鳴緩和時間測定を、ＥｃｈｏＭＲＩ（商標）－５００解析装置（ＥｃｈｏＭＲＩ ＬＬＣ）を用いて行った。投薬の前に、マウスを、透明のプラスチックホルダに入れ、ＮＭＲ－ＭＲＩ装置に挿入して、それぞれの対象の除脂肪量、体脂肪量、および水分状態を測定した。測定は、マウス１匹当たり０．５～３．２分間の過程にわたって行い、投薬のおよそ１２０時間後に再度行った。
結果の概要および結論：
毎日の体重モニターを行って、Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２の単回皮下注射が、ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスにおいて体重減少を誘導するかどうかを判定した。投薬前には、３つの処置群は、それぞれが２８．３９～２９．８５ｇの投薬前平均体重を有したため、平均体重に有意差はなかった（表１６）。投薬４８時間後の時点では、しかしながら、Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２で処置したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスは、平均で１．７０ｇ、または投薬前体重の５．９６％の減少があった。同じ時点で、ナイーブおよびアイソタイプ対照抗体で処置したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスは、投薬前体重の１．７９～２．３７％の増量があった。Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２で処置したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスは、研究の全時間過程を通じて体重の減少が継続され、投薬の７２時間後および９６時間後までに、これらのマウスは、平均で、それぞれ、投薬前体重の８．４２％および１１．８０％の減少があった。投薬１２０時間後の時点では、Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２で処置したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスは、平均で、投薬前体重の１２．６７％の減少があった。対照的に、ナイーブおよびアイソタイプ対照抗体で処置したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスは、研究の間、投薬前体重にいずれの減少も示さなかった。Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２で処置したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスの体重は、投薬の４８時間後、７２時間後、９６時間後、および１２０時間後に、ナイーブおよびアイソタイプ対照の両方と比べて有意に低減されたため、ＴｒｋＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２は、ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスにおいて有意な体重減少を誘導したと決定された。
Figure 0007438937000020
ＴｒｋＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２注射の体組成に対する効果もまた、投薬前および後に、それぞれの対象にＮＭＲ－ＭＲＩを行うことにより測定した。投薬前には、３つの処置群のＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスは、それぞれの群が、平均で４．１９～４．７５ｇの体脂肪量および２１．３２～２１．７０ｇの除脂肪量を有したため、体脂肪量または除脂肪量にいずれの有意差も示さなかった（表１７）。抗体の投与後に、しかしながら、Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２を投薬したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスは、研究の過程にわたって、平均で、合計体脂肪量が４８．９０％減少した（表１７）。ナイーブおよびアイソタイプ対照抗体で処置したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスは、それぞれ、平均で、投薬前の体脂肪量が８．４９％および９．４８％減少し、これは、Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２で処置した対象よりも有意に低かった（表１７）。さらに、Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２で処置したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスは、研究の間、平均で、除脂肪量が７．８４％減少し、これは、ナイーブおよびアイソタイプ対照で処置した群による平均の投薬前除脂肪量の、それぞれ、２．４１％および１．７５％の減少よりも多かった（表１７）。このように、記載される体重減少は、ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスにおけるＴｒｋＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２の注射後の体脂肪量の有意な減少および除脂肪量の中等度の減少により説明することができる。
Figure 0007438937000021
ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスにおけるＴｒｋＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２注射の体重および組成に対する効果を評価することに加えて、給餌、飲水、および自発運動活動を、代謝ケージにより継続的に測定した。投薬の前、ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスは、平均で、１日当たり３．４９～３．７３ｇの飼料を摂取した。投薬の２４時間以内に、しかしながら、Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２で処置したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスは、食物摂取量が、１日当たり２．２０ｇの飼料へと有意に低減された。Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２で処置したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスにおける食物摂取量の平均レベルは、研究の残りの期間の間、１日当たり２．４９ｇの飼料を上回ることがなかったが、ナイーブおよびアイソタイプ抗体で処置したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスは、１日当たり平均で３．６２～４．０７ｇの飼料を一貫して摂取した（表１８）。
同様に、投薬前には、処置群の間で、毎日の水の摂取量に有意差はなかった。ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスは、それぞれの処置群において、平均で１日当たり４．６７～５．５５ｍＬの水を摂取した（表１９）。投与後には、Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２で処置したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスは、水の摂取量が１日当たり２．０５～３．２４ｍＬに低減された。これは、研究の間、１日当たり４．５０～５．７７ｍＬの水を一貫して摂取したナイーブおよびアイソタイプ対照抗体で処置したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスよりも有意に低かった（表１９）。従って、ＴｒｋＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２の注射は、ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスにおいて、ナイーブおよびアイソタイプ対照の両方と比べて、食物および水の両方の摂取量の有意な低減をもたらすとみられた。
Figure 0007438937000022
Figure 0007438937000023
抗体処置の活動に対する効果を決定するために、自発運動を、それぞれのマウスのｘ－面歩行運動の総数を継続的に測定するＯＸＹＭＡＸ（登録商標）／ＣＬＡＭＳソフトウェア（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ｖ５．３５）により解析した。１匹のマウスは、投薬の前に反応亢進を示したため、これは、投薬後の統計学的解析から除外した。ナイーブおよびアイソタイプ抗体で処置した対象は、研究の間、一貫して、平均で１日当たり１１，０００～１５，０００の歩行運動が記録されたが、Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２で処置したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスは、投薬の２４～４８時間後の間に、２８，２６０の歩行運動が記録され、投薬の４８～７２時間後の間および７２～９６時間後の間には、それぞれ、２１，１９３および２７，０２８の歩行運動が記録された（表２０）。Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２で処置したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスは、抗体投与後のそれぞれの時点において、より多くの歩行運動数が記録され、反応亢進が、Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２注射のさらなる効果であろうことが示唆された。合わせると、これらの効果は、ＴｒｋＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２の単回皮下注射が、ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスにおいて、体重、体組成、代謝、および自発運動に有意な変化を誘導したことを示唆する。
Figure 0007438937000024
抗ＴｒｋＢ抗体の網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の生存に対する効果を決定するための視神経横断切断モデル
全ての手順は、ＡＲＶＯ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈおよびｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｃ． ＩＡＣＵＣに従って行った。８～１０週齢でそれぞれ２００～２５０ｇの体重の成体の雌性ＴｒｋＢヒト化ラット（Ｖｅｌｏｃｉｇｅｎｅ、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｃ．）を用いた。ラットに対する全ての手術手順は、ケタミン（６３ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（６．０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を用いた全身麻酔下において行った。エリスロマイシン（０．５％、Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂ）を含有する眼軟膏を、角膜を保護するために塗布した。
眼窩内視神経の軸索切断および硝子体内注射
左の視神経（ＯＮ）を、眼窩内で露出させ、硬膜を開いた。ＯＮを、眼球の後部約１．５ｍｍで横断切断した。網膜への血液供給の損傷を回避するように注意した。５０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジに繋げた、ガラスを引き伸ばしたピペットを用いて、硝子体内注射を毛様体扁平部のすぐ後部に行った。水晶体を損傷しないように注意した。何らかの重大な術後合併症（例えば、網膜虚血、白内障）を有するラットは、さらなる解析から除外した。動物を、異なる実験群に割り当てた。ＯＮ軸索切断の３日後および１０日後に、一方の対照群には、アイソタイプ対照ＲＥＧＮ１９４５（４６．６μｇ／μｌ）３μｌの硝子体内注射を受容させ、他方の群には、抗ヒトＴｒｋＢ抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２（４５．７μｇ／μｌ）３μｌの注射を受容させた。
別の実験において、抗ヒトＴｒｋＢ抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２の用量応答を試験した。１～９カ月齢のホモ接合性ＴｒｋＢヒト化ラットに、３ｕｌの抗ヒトＴｒｋＢ抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２（０．０１、０．１、１、もしくは１０ｕｇ／ｕｌ）またはアイソタイプ対照ＲＥＧＮ１９４５（１０μｇ／μｌ）の硝子体内注射を、ＯＮ軸索切断の３日後および１０日後に受容させた。
生存ＲＧＣの免疫組織化学的染色および計数
ＯＮ損傷後の網膜全組織標本における生存ＲＧＣの選択的標識のための効率的で信頼できる方法であることが示されているため、Ｂｒｎ３ａ（脳特異的ホメオボックス／ＰＯＵドメインタンパク質３Ａ）を、生存している網膜神経節細胞（ＲＧＣ）のマーカーとして使用した（Ｎａｄａｌ－－Ｎｉｃｏｌａｓ ＦＭ、Ｊｉｍｅｎｅｚ－Ｌｏｐｅｚ Ｍ、Ｓｏｂｒａｄｏ－Ｃａｌｖｏ Ｐ、Ｎｉｅｔｏ－Ｌｏｐｅｚ Ｌ、Ｃａｎｏｖａｓ－Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｉ、Ｓａｌｉｎａｓ－Ｎａｖａｒｒｏ Ｍ、Ｖｉｄａｌ－Ｓａｎｚ Ｍ、Ａｇｕｄｏ Ｍ．、Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ． ２００９年８月；５０（８）：３８６０～８頁）。Ｂｒｎ３ａの免疫染色のために、網膜を、１０％正常ロバ血清および０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で１時間遮断し、次に、同じ培地において、Ｂｒｎ３ａ抗体（１：４００、カタログ番号ｓｃ－３１９８４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）と共に、室温で２時間インキュベートした。さらなる洗浄の後、網膜を、Ａｌｅｘａ５９４に結合させたロバ抗ヤギ二次抗体（１：４００、カタログ番号Ａ－１１０５８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に、４℃で一晩インキュベートした。
結果の概要および結論：
ＴｒｋＢアゴニスト抗体の、インビボでのＲＧＣの生存に対する効果を評価するために、完全視神経横断切断モデルを用いた。ＴｒｋＢアゴニスト抗体（Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２）またはアイソタイプ（陰性対照）抗体を、手術の３日後および１０日後に適用した。動物を、軸索切断の１４日後に安楽死させた。損傷していない反対側の眼におけるＲＧＣの密度は、３つのＴｒｋＢ遺伝子型で同様であり、表２１に示されるように、平均で１ｍｍ２当たりおよそ１６００であった。生存しているＲＧＣの密度を、Ｂｒｎ３ａ染色を用いて、網膜全組織標本において評価した。ホモ接合性ＴｒｋＢヒト化ラットにおいて、ＴｒｋＢアゴニスト抗体（Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２）は、対照と比較してＲＧＣの生存を有意に（ｐ＜０．０１、マンホイットニー検定）増大させた（１ｍｍ２当たり、６８５±１０６対２５５±６６のＲＧＣ）。ヘテロ接合性ＴｒｋＢヒト化ラットにおいても、ＴｒｋＢアゴニスト抗体の有意な（ｐ＜０．０５、マンホイットニー検定）生存効果があった（１ｍｍ２当たり、４４４±９０対２０８±５０のＲＧＣ）。野生型ＴｒｋＢラットにおいては、アイソタイプ対照と比較して、ＴｒｋＢアゴニスト抗体では、わずかではあるが有意なＲＧＣ数の増大があった（表２２）。用量応答実験において、ＲＧＣ密度を、軸索切断の１４日後に、Ｂｒｎ３ａ染色を用いて、網膜全組織標本において定量した。ＴｒｋＢアゴニスト抗体の明らかな用量応答があった。抗体対照群（１ｍｍ２当たり１６８±４３のＲＧＣ）と比較して、ＴｒｋＢアゴニスト抗体（Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２）は、注射群毎に、３ｕｇ（１ｍｍ２当たり、５６４±１２４のＲＧＣ）または３０ｕｇ（１ｍｍ２当たり、５４３±２４２のＲＧＣ）において、ＲＧＣの生存を有意に（ｐ＜０．０１、１元ＡＮＯＶＡ、テューキーの事後検定）増大させた。３および３０ｕｇの群間に差はなかった。注射群毎に、０．０３ｕｇを受容させた群（１ｍｍ２当たり、２０２±９６のＲＧＣ）または０．３ｕｇを受容させた群（１ｍｍ２当たり３３７±２１０のＲＧＣ）において、ＲＧＣ生存の増大の傾向があるだけで、有意な増大はなかった（表２３）。結論として、ＴｒｋＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２は、ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕおよびＴｒｋＢｈｕ／＋ラットにおいて、ＲＧＣの生存の有意な増加を示した。
結論：
ＴｒｋＢアゴニスト抗体（Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２）は、ヒト化ＴｒｋＢラットにおいてＲＧＣの生存を用量依存的に有意に増大させた。
Figure 0007438937000025
Figure 0007438937000026
Figure 0007438937000027
ＡｋｔおよびＥｒｋシグナル伝達経路に対する抗ＴｒｋＢ抗体の効果
全ての手順は、ＡＲＶＯ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈおよびｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｃ． ＩＡＣＵＣに従って行った。初代マウス皮質ニューロンを、ヒト化ＴｒｋＢマウス（ＭＡＩＤ ７１３９）から単離し、培養した（Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ． ２０１２年９月；７（９）：１７４１～５４頁． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．０９９）。ウエスタンブロット（ＷＢ）を行って、ＡｋｔおよびＥｒｋの下流経路（ｐ－Ａｋｔ、ｐ－Ｅｒｋ１／２）に対するＴｒｋＢアゴニスト抗体の効果を決定した。出生後１日目（Ｐ１）のヒト化ＴｒｋＢ仔マウスに由来する初代皮質ニューロンを、ＧＳ２１ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｌｏｂａｌ Ｓｔｅｍ、カタログ番号ＧＳＭ－３１００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３５０５０－０６１）、およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＮｅｕｒａｌＱ基礎培地（Ｇｌｏｂａｌ Ｓｔｅｍ、カタログ番号ＧＳＭ－９４２０）において、４日間培養した（ＤＩＶ－４）。細胞を、ＴｒｋＢアゴニスト抗体：Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ－Ｌ１（１０ｕｇ／ｍｌ）、Ｈ４Ｈ９７８０Ｐ－Ｌ１（１０ｕｇ／ｍｌ）、Ｈ４Ｈ９８１４Ｐ－Ｌ１（１０ｕｇ／ｍｌ）、ＩｇＧ４アイソタイプ対照ＲＥＧＮ１９４５（１０ｕｇ／ｍｌ）、対照抗体Ｈ１Ｍ８０３７Ｃ－Ｌ１（１０ｕｇ／ｍｌ）、ＢＤＮＦ（１ｕｇ／ｍｌ）で、１５分間または２時間処置した。ウエスタンブロットを行って、アゴニストが、下流シグナル伝達の維持および強度に差を有するかどうかを決定した。処置した細胞をすすぎ、１％プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ）を含有する低温ＰＢＳ中にこそぎ入れた。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）により決定した。試料（５０μｇ）を、３～８％ Ｔｒｉｓ－酢酸還元ゲル（Ｎｏｖｅｘ）におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に移した。
膜を、５％ ミルクおよび０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．６を含有する遮断溶液において１時間インキュベートした。これに続いて、５％ ＢＳＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、およびウサギ抗ホスホＴｒｋ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号９１４１、１：５００）、ウサギ抗ホスホ－Ａｋｔ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号９２７１、１：１０００）、またはウサギ抗ホスホ－ＥＲＫ１／２抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｅ７０２８、１：５０００）を含有する遮断バッファーにおいて、４℃で一晩インキュベートした。続いて、標識されたタンパク質を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合した抗ヤギ、抗マウス、または抗ウサギＩｇＧと共にインキュベートし、ＨＲＰの化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ）での発展により、可視化した。それぞれのレーンに存在する総ＴｒｋＢ、ＭＡＰＫ、またはＡｋｔの量を決定するために、ニトロセルロース膜を、ストリッピングバッファー（Ｐｉｅｒｃｅ）中で２０分間抗体をストリッピングし、ウサギ抗ＴｒｋＢ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号４６０３、１：１０００）、ウサギ抗Ｅｒｋ１／２抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号０６－１８２、１：１０００）、またはウサギ抗Ａｋｔ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号９２７２、１：１０００）と共にインキュベートし、次いで、上で記載されるように可視化した。ベータ－アクチン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ５３１６、１：２００００およびＧＡＰＤＨ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ９２９５）を、試料ローディング対照としてプローブした。
結果の概要および結論：
図２に示されるように、インキュベーションの１５分後に、全てのＴｒｋＢアゴニスト抗体が、ＭＡＰＫ／ＥＲＫおよびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化を示したが、ＢＤＮＦおよびＨ４Ｈ９８１４Ｐのみが、ＴｒｋＢリン酸化を示した。インキュベーションの２時間後、ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、ＴｒｋＢの活性化を示した。
ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の生存に対するアゴニスト抗ＴｒｋＢ抗体の効果
ヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞株のインビトロ培養：
神経芽細胞腫細胞株ＳＨ－ＳＹ５Ｙ（Ｓｉｇｍａ ＡＴＣＣ 番号９４０３０３０４、カタログ番号１１Ｃ０１６）細胞を、ＤＭＥＭ：Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１３３０）、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５１４０）、ＦＢＳ １０％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１００８２－１４７）を含有する成長培地に、３７℃で５％ ＣＯ２において、播種した。２３～２７継代で、細胞を、全トランス１０ｕＭ レチノイン酸（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、カタログ番号４４５４０）、ＤＭＥＭ：Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１３３０）、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５１４０）、ＦＢＳ １０％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１００８２－１４７）を含有する分化培地において、９６ウェルプレートに播種した。細胞（３万個／ウェル）を、４日間分化させた。培養物を、異なる用量の抗体（１００～０．０１ｕｇ／ｍｌ）を含有する無血清分化培地（１００ｕｌ／ウェル）に交換する生存バイオアッセイにおいて、抗体をスクリーニングした。２日後に、ＣＣＫ８（Ｄｏｊｉｎｄｏ、カタログ番号ＣＫ０４）試薬を添加し（１０ｕｌ／ウェル）、プレートを、３～４時間インキュベートし、ＯＤを、４５０ｎｍで測定して（ＶｉｃｔｏｒまたはＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ ＩＩＩ）、生存細胞のパーセンテージを決定した。データを、処置なしの無血清培地に対して正規化した。抗体なしの無血清処置＝１００％の生存
結果の概要および結論：
図３および表２３に示されるように、本発明のアゴニストＴｒｋＢ抗体は、陰性アイソタイプ対照抗体と比較して、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の生存における有意な用量依存性増大を示した（ｐ＜０．０００１、２元ＡＮＯＶＡによる）。
Figure 0007438937000028
ヒト化ＴｒｋＢおよび野生型マウスにおける抗ＴｒｋＢ抗体の薬物動態評価
抗ＴｒｋＢ抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２の薬物動態の評価を、ヒト化ＴｒｋＢマウス（ヒトＴｒｋＢ発現についてホモ接合性のマウス、ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕ）および野生型（ＷＴ）マウスにおいて行った。コホートは、マウス株１つ当たり５匹のマウスを含んでいた。全てのマウスに、１０ｍｇ／ｋｇの単回皮下（ＳＣ）用量を受容させた。血液試料を、投薬の６時間後、ならびに１日後、２日後、３日後、６日後、９日後、１６日後、２１日後、および３０日後に採取した。血液を、血清に処理し、解析されるまで－８０℃で凍結させた。
循環抗体濃度を、ＧｙｒｏＬａｂ ｘＰｌｏｒｅ（商標）（Ｇｙｒｏｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて総ヒトＩｇＧ４／ｈＩｇＧ１抗体解析により決定した。簡単に述べると、抗体希釈バッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０＋ＰＢＳ）中で１００μｇ／ｍＬに希釈したビオチン化マウス抗ヒトＩｇＧ４／ＩｇＧ１特異的モノクローナル抗体（ＲＥＧＮ２５６７）を、ストレプトアビジンコートビーズ（Ｄｙｎｏｓｐｈｅｒｅｓ（商標））を事前ローディングした親和性カラムを含むＧｙｒｏｌａｂ Ｂｉｏａｆｆｙ ２００ ＣＤで捕捉した。このアッセイにおいてキャリブレーションに用いた標準物は、０．１％ 正常マウス血清（ＮＭＳ）を含有する希釈バッファー（０．５％ ＢＳＡ＋ＰＢＳ）中０．４８８～２０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度のＨ４Ｈ９８１６Ｐであった。血清試料を、抗体希釈バッファー中に１：１００で希釈した。室温で実行したＣＤにおいて抗ＲＥＧＮ２５６７でコートした親和性カラムに捕捉したヒトＩｇＧを、検出バッファー（Ｒｅｘｘｉｐ Ｆバッファー）中に希釈した０．５μｇ／ｍＬ Ａｌｅｘａ－６４７に結合させたマウス抗ヒトカッパモノクローナル抗体（ＲＥＧＮ６５４）の添加により検出し、結果として生じた蛍光シグナルを、ＧｙｒｏＬａｂ ｘＰｌｏｒｅ機器により応答単位（ＲＵ）で記録した。試料濃度を、Ｇｙｒｏｌａｂ Ｅｖａｌｕａｔｏｒソフトウェアを用いた５つのパラメーターのロジスティック曲線近似を用いて近似させた標準曲線からの補間により決定した。２回の複製実験により得られた平均濃度を、後続のＰＫ解析に用いた。
ＰＫパラメーターを、Ｐｈｏｅｎｉｘ（登録商標）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）ソフトウェアバージョン６．３（Ｃｅｒｔａｒａ、Ｌ．Ｐ．、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）および血管外投薬モデルを用いて、非コンパートメント解析（ＮＣＡ）により決定した。各抗体に対するそれぞれの平均の濃度値を用いて、観察された血清中の最大濃度（Ｃｍａｘ）、観察された推定半減期（ｔ１／２）、および最後の測定可能濃度までの時間に対する濃度曲線下面積（ＡＵＣｌａｓｔ）を含む、全てのＰＫパラメーターを、線形補間および均一の加重による線形台形法則を用いて決定した。
結果の概要および結論：
抗ＴｒｋＢ抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２の１０ｍｇ／ｋｇ皮下投与の後に、類似の抗体最大濃度（Ｃｍａｘ）が、ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスおよび野生型マウスの両方において、１日目または２日目までに観察された（それぞれ、１３５および１３１μｇ／ｍＬ、表２６を参照）。９日目までに、Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２は、ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスにおいては、野生型マウスよりも急な薬物排出を示し、標的により仲介される効果を示した。３０日目の抗体濃度は、ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスにおいては、約３５倍低かった。野生型マウスにおけるＨ４Ｈ９８１６Ｐ２の抗体曝露（ＡＵＣｌａｓｔ）は、ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスにおいてみられたものよりも約１．７倍高かった（それぞれ、１７３０および１０２０ ｄ＊μｇ／ｍＬ）。野生型マウスはまた、ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスと比べて半減期（Ｔ１／２）に約３倍の増大を示した（それぞれ、８．４日間および２．９日間）。
総抗ＴｒｋＢ抗体濃度のデータの概要は、表２５に要約されており、平均ＰＫパラメーターは、表２６に記載されており、時間に対する平均総抗体濃度は、図４に示されている。
Figure 0007438937000029
Figure 0007438937000030
抗マウスＴｒｋＢモノクローナル抗体がマウスまたはラットのＴｒｋＢとそのリガンドであるＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）との間の相互作用を遮断する能力
ＴｒｋＢヒト化マウスをマウスＴｒｋＢタンパク質で免疫することにより、抗マウスＴｒｋＢモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生成した。この免疫により同定された３つのリードｍＡｂは、Ｍ２ａＭ１４１７３Ｎ、Ｍ２ａＭ１４１７８Ｎ、およびＭ２ａＭ１４１７９Ｎであった。本発明のリードｍＡｂを、遮断ＥＬＩＳＡにおいて、プレートに結合したＢＤＮＦに対するマウスまたはラットＴｒｋＢの相互作用を遮断する能力について、特徴付けた。
実験は、以下の手順を用いて行った。ヒトＢＤＮＦを、ＰＢＳ中、０．５μｇ／ｍＬ（マウスＴｒｋＢ．ｈＦｃ相互作用を遮断するため）または０．３μｇ／ｍＬ（ラットＴｒｋＢ．ｍｍｈ相互作用を遮断するため）の濃度で、９６ウェルのマイクロタイタープレートにコートし、４℃で一晩インキュベートした。非特異的結合部位を、続いて、ＰＢＳ中５％（ｗ／ｖ） ＢＳＡ溶液（アッセイバッファー）を用いて遮断した。９６ウェルの希釈プレートにおいて、８５０ｐＭ マウスＴｒｋＢ．ｈＦｃまたはラットＴｒｋＢ．ｍｍｈを、３倍連続希釈した抗マウスＴｒｋＢ抗体および対照抗体と混合した。最終抗体濃度は、１．６９ｐＭ～１００ｎＭの範囲にあった。タンパク質－抗体ミックスを、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。結合前ミックスを、次いで、二連に、ＢＤＮＦでコートしたマイクロタイタープレートに移した。アッセイのベースラインを計算するために、アッセイバッファーのみを含有する対照を含めた。ＥＬＩＳＡプレートを、室温で１時間インキュベートし、次いで、プレート洗浄溶液で洗浄した。プレートに結合したマウスＴｒｋＢ．ｈＦｃを、ＨＲＰに結合させたヤギ抗ヒトＦｃγフラグメント特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で検出し、ラットＴｒｋＢ．ｍｍｈを、ＨＲＰに結合させた抗ヒスチジン抗体（Ｑｉａｇｅｎ）で検出した。プレートを、検出抗体と共に室温で１時間インキュベートした後、プレート洗浄溶液で洗浄した。アッセイプレートを、製造元が推奨する手順に従って、ＴＭＢ比色基質発展した。
それぞれのウェルの４５０ｎｍでの吸光を、記録し、抗体の濃度の関数としてプロットした。データを、１１カ所の用量応答曲線にわたる４つのパラメーターのロジスティック方程式を用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアで解析し、ＩＣ５０値を計算した。ＢＤＮＦへのＴｒｋＢの結合の５０％を低減するのに必要とされる抗体の濃度として定義される、計算したＩＣ５０値を、遮断有効性の指標として用いた。試験した抗体の最大濃度での遮断パーセントを、アッセイのベースラインと比べた、プレート上のＢＤＮＦへのＴｒｋＢの結合を遮断する抗体の能力の指標として、計算した。抗体の非存在下における８５０ｐＭ マウスまたはラットＴｒｋＢの結合シグナルを、１００％の結合または０％の遮断として定義した。アッセイバッファー単独でのベースラインシグナルは、０％の結合または１００％の遮断として定義した。
結果の概要および結論
抗マウスＴｒｋＢ抗体がマウスまたはラットＴｒｋＢのＢＤＮＦへの結合を遮断する能力を、遮断ＥＬＩＳＡを用いて評価した。
遮断の結果を、表２７ならびに図５ＡおよびＢに要約する。遮断％を全ての抗体について報告し、試験した最も高い抗体濃度（１００ｎＭ）で計算した。ＩＣ５０値は、ＢＤＮＦへのマウスまたはラットＴｒｋＢの結合を、５０％を上回って遮断する抗体についてのみ示した。本発明の３つの抗体のうち、抗マウスＴｒｋＢ ｍＡｂであるＭ２ａＭ１４１７８Ｎは、ＢＤＮＦへのマウスおよびラットの両方のＴｒｋＢタンパク質の結合を、５０％を上回って遮断した。Ｍ２ａＭ１４１７８Ｎは、８５０ｐＭ マウスＴｒｋＢ．ｈＦｃの結合を、４２６ｐＭのＩＣ５０および８４．４％の遮断％で遮断した。Ｍ２ａＭ１４１７８Ｎは、ＢＤＮＦへの８５０ｐＭ ラットＴｒｋＢ．ｍｍｈの結合を、１８４ｐＭのＩＣ５０値および８９．５％の遮断％で遮断した。Ｍ２ａＭ１４１７３Ｎは、ＢＤＮＦへの８５０ｐＭ マウスＴｒｋＢ．ｈＦｃの結合の２９．７％の遮断を示した。Ｍ２ａＭ１４１７３Ｎは、３．８１ｎＭのＩＣ５０値で、ＢＤＮＦへの８５０ｐＭ ラットＴｒｋＢ．ｍｍｈの結合の８０．７％の遮断を示した。Ｍ２ａＭ１４１７９Ｎは、ＢＤＮＦへのマウスＴｒｋＢ．ｈＦｃの結合を１１．６％遮断した。Ｍ２ａＭ１４１７９Ｎは、１ｎＭを上回る濃度で、ＢＤＮＦへのラットＴｒｋＢ．ｍｍｈの結合の増大を示した。
比較物抗マウスＴｒｋＢ ｍＡｂであるＨ１Ｍ８０３７Ｃは、ＢＤＮＦへの８５０ｐＭ マウスＴｒｋＢ．ｈＦｃの結合を、１８０ｐＭのＩＣ５０値および９１．５％の遮断％で遮断した。Ｈ１Ｍ８０３７Ｃは、８５０ｐＭ ラットＴｒｋＢ．ｍｍｈの結合を、１．４２ｎＭのＩＣ５０値および８３．３％の遮断％で遮断した。ｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照ｍＡｂであるＲＥＧＮ１０９７は、同一のアッセイ条件下において、マウスおよびラットＴｒｋＢのいずれの遮断も示さなかった。１０ｎＭを上回る濃度において、ＲＥＧＮ１０２７は、ラットＴｒｋＢ結合の増大を示した。
Figure 0007438937000031
抗ヒトＴｒｋＢモノクローナル抗体がヒトＴｒｋＢとその天然のリガンドであるヒトＢＤＮＦおよびＮＴ４との相互作用を遮断する能力
Ｈ４Ｈ９８１４Ｐ、Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２、およびＨ４Ｈ９７８０Ｐと命名した抗ヒトＴｒｋＢ抗体が、プレートに捕捉されたＢＤＮＦまたはＮＴ－４へのＴｒｋＢタンパク質の結合を遮断する能力を、２つの競合サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて測定した。アッセイにおいて、種々の濃度の抗ＴｒｋＢ抗体を、一定濃度の二量体ＴｒｋＢタンパク質と事前に混合し、抗体の存在に起因する、プレートに固定化したＢＤＮＦまたはＮＴ－４へのＴｒｋＢの結合の低減を計算した。
実験に用いた組み換え二量体ＴｒｋＢタンパク質は、Ｃ末端におけるヒトＩｇＧ１のＦｃ部分と共に発現されるヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインの部分（アミノ酸Ｃｙｓ３２～Ｈｉｓ４３０）から構成されていた（ｈＴｒｋＢ－ｈＦｃ、受託番号ＮＰ＿００６１７１．２、分子量６９，７００ダルトン）。ＢＤＮＦおよびＮＴ－４タンパク質は、それぞれ、ヒトＢＤＮＦの細胞外ドメイン（アミノ酸Ｈｉｓ１２９～Ａｒｇ２４７、受託番号Ｐ２３５６０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＮＴ－４（アミノ酸Ｇｌｙ８１～Ａｌａ２１０、受託番号Ｐ３４１３０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）から構成されていた。２つのアイソタイプ抗体対照、抗Ｆｅｌ ｄ １ヒトＩｇＧ４抗体、およびマウスＩｇＧ１を有するａ－Ｆｅｌ ｄ １抗体に特異的な抗体を、ＩｇＧバックグラウンド検出のための対照として含めた。
実験は、以下の手順を用いて行った。ヒトＢＤＮＦまたはＮＴ－４を、それぞれ、ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍＬまたは２μｇ／ｍＬの濃度で、別個に、９６ウェルのマイクロタイタープレートに、４℃で一晩コートした。非特異的結合部位を、続いて、ＰＢＳ中のＢＳＡ溶液を用いて遮断した。遮断溶液および希釈バッファーは、ＢＤＮＦコートでのアッセイについては、ＰＢＳ中５％（ｗ／ｖ） ＢＳＡ溶液、またはＮＴ－４コートでのアッセイについては、ＰＢＳ中０．５％（ｗ／ｖ） ＢＳＡ溶液を含有していた。別個のマイクロタイタープレートにおいて、５００ｐＭ ｈＴｒｋＢ－ｈＦｃタンパク質を一定量で、最終濃度が１．７ｐＭ～１００ｎＭの範囲にある抗体の連続希釈物、および抗体が存在しない溶液に添加した。（抗体阻害アッセイのためのｈＴｒｋＢ－ｈＦｃの一定濃度は、プレートにコートしたｈＢＤＮＦまたはｈＮＴ－４へのｈＴｒｋＢ－ｈＦｃの個別の結合曲線の線形部分内のおよそ中間点から選択した）。室温で１時間インキュベートした後、５００ｐＭの一定濃度のｈＴｒｋＢ－ｈＦｃタンパク質を有する抗体－タンパク質複合体を、ｈＢＤＮＦまたはｈＮＴ－４でコートしたマイクロタイタープレートに移した。室温で１時間インキュベートした後、ウェルを洗浄し、プレートに結合したｈＴｒｋＢ－ｈＦｃを、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）に結合させた抗ヒトＦｃγフラグメント特異的ヤギポリクローナル抗体で検出した。プレートを、次いで、製造元の推奨に従ってＴＭＢ基質溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で発展させ、４５０ｎｍでの吸光を、Ｖｉｃｔｏｒプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（商標））で測定した。
Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）のＳ状用量応答モデルを用いて、データ解析を行った。ｈＢＤＮＦまたはｈＮＴ－４へのｈＴｒｋＢ－ｈＦｃの結合の５０％を低減するのに必要とされる抗体の濃度として定義される、計算したＩＣ５０値を、遮断有効性の指標として用いた。試験した抗体の最大濃度での遮断パーセントを、アッセイのベースラインと比べた、プレート上のｈＢＤＮＦまたはｈＮＴ－４への５００ｐＭ ｈＴｒｋＢ－ｈＦｃの結合を遮断する抗体の能力の指標として、計算した。計算において、抗体の存在なしでの５００ｐＭ ｈＴｒｋＢ－ｈＦｃの試料の結合シグナルは、１００％の結合または０％の遮断として参照し、ｈＴｒｋＢ－ｈＦｃまたは抗体なしでのバッファーの試料のベースラインシグナルは、０％の結合または１００％の遮断として参照した。
結果の概要および結論：
抗ＴｒｋＢ抗体がＢＤＮＦまたはＮＴ－４へのＴｒｋＢの結合を遮断する能力を、２つの競合サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて評価した。連続希釈した抗体または抗体なし対照の存在下における、９６ウェルのマイクロタイタープレートにコートしたｈＢＤＮＦまたはｈＮＴ－４へのヒトＴｒｋＢ－ｈＦｃの結合を、ＨＲＰに結合させた抗ヒトＦｃγフラグメント特異的ヤギポリクローナル抗体で検出した。ＩＣ５０値を計算し、ｈＢＤＮＦまたはｈＮＴ－４へのｈＴｒｋＢ－ｈＦｃの結合を遮断する抗体の有効性の指標として用いた。加えて、試験した最も高い濃度におけるそれぞれの抗体による５００ｐＭ ｈＴｒｋＢ－ｈＦｃの最大遮断を、計算し、比較した。
遮断結果を、表２８に要約する。遮断％を全ての抗体について報告し、試験した最も高い抗体濃度１００ｎＭで計算した。負の遮断％は、抗体の存在下において検出されたＴｒｋＢ結合の増大を示す。ＩＣ５０値は、ＢＤＮＦまたはＮＴ－４へのＴｒｋＢの結合を、５０％を上回って遮断する抗体について示す。ＩＣ５０値は、５０％を下回って遮断する抗体については定量的でなく、（－）として報告した。
試験した最も高い抗体濃度において、３つの抗ＴｒｋＢ抗体のうちの１つ（Ｈ４Ｈ９７８０Ｐ）が、ＢＤＮＦまたはＮＴ－４リガンドへのｈＴｒｋＢの結合を、それぞれ、１５０ｐＭおよび１８０ｐＭのＩＣ５０値で、５０％を上回って遮断し、１００ｎＭ 抗体での遮断パーセントはＢＤＮＦについては９３％であり、ＮＴ－４については８０％であった。３．７ｎＭにおいて、この抗体は、ＮＴ－４への５００ｐＭ ｈＴｒｋＢ－ｈＦｃの結合を、９９％遮断した。試験した最も高い濃度での遮断％の減少は、マイクロタイタープレートへのＨ４Ｈ９７８０Ｐの非特異的結合、およびＨＲＰに結合させた抗ヒトＦｃγフラグメント特異的ポリクローナル抗体でのこの結合の検出に帰属し得る。
３つの抗ＴｒｋＢ抗体のうちの２つ（Ｈ４Ｈ９８１４ＰおよびＨ４Ｈ９８１６Ｐ２）ならびに無関係の遮断対照抗体は、ＢＤＮＦまたはＮＴ－４へのｈＴｒｋＢの結合を、５０％を下回って遮断した。比較物は、ＢＤＮＦおよびＮＴ－４の両方への５００ｐＭ ｈＴｒｋＢ－ｈＦｃの結合を、５０％を上回って遮断した。
Figure 0007438937000032
異なる抗ｈＴｒｋＢモノクローナル抗体間でのＯｃｔｅｔ交差競合
２つの抗体が、ｈＴｒｋＢ－ｍｍｈ上のそれらのエピトープへの結合について、互いに競合するかどうかを評価するために、抗ｈＴｒｋＢモノクローナル抗体間での結合競合を、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４バイオセンサー（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．）におけるリアルタイムの、標識を含まない生体層インターフェロメトリーアッセイを用いて決定した。交差競合実験を、２５℃において、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ｖ／ｖ 界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ（ＨＢＳ－ＥＰバッファー）中、１０００ｒｐｍの速度でプレートを振盪しながら行った。試験した全ての抗ｈＴｒｋＢ抗体およびｈＴｒｋＢ－ｍｍｈ溶液は、Ｏｃｔｅｔ ＨＢＳ－ＥＰバッファーにおいて調製した。２つの抗体が、ｈＴｒｋＢ－ｍｍｈ上のそれぞれのエピトープへの結合について、互いに競合し得るかどうかを評価するために、およそ約０．１４～０．２４ｎｍのｈＴｒｋＢ－ｍｍｈを、まず、５０μｇ／ｍＬのｈＴｒｋＢ－ｍｍｈを含有するウェルから、５分間、抗ＨｉｓでコートしたＯｃｔｅｔバイオセンサーチップに捕捉した。ｈＴｒｋＢ－ｍｍｈを捕捉したＯｃｔｅｔバイオセンサーチップを、５分間、５０ｕｇ／ｍｌの第１の抗ｈＴｒｋＢモノクローナル抗体（これよりｍＡｂ－１と称する）を含有するウェルに沈め、続いて、さらに５分間、第２の抗ＨＴｒｋＢモノクローナル抗体（これより、ｍＡｂ－２と称する）を含有するウェルに沈めることにより、飽和させた。工程の間に、Ｏｃｔｅｔバイオセンサーチップは、ＨＢＳ－ＥＰバッファーで３０秒間洗浄した。
実験の経過中、リアルタイムの結合応答をモニターし、工程毎の終わりの結合応答を記録した。ｍＡｂ－１と事前に複合体を形成させたｈＴｒｋＢ．ｍｍｈに対するｍＡｂ－２の結合の応答を比較し、異なる抗ｈＴｒｋＢモノクローナル抗体の競合的／非競合的行為を、６０％阻害閾値を用いて決定した。
表２９は、結合の順序とは独立して、両方の方向で競合する抗体の関係性を明示的に定める。
結果：
Figure 0007438937000033
２５℃で測定した、サロゲート抗マウスＴｒｋＢモノクローナル抗体の異なるＴｒｋＢ試薬へのＢｉａｃｏｒｅ結合動態
２つの抗体が、ｍＴｒｋＢ－ｍｍｈ上のそれらのエピトープへの結合について、互いに競合するかどうかを評価するために、抗ｍＴｒｋＢモノクローナル抗体間での結合競合を、Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸバイオセンサー（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．）におけるリアルタイムの、標識を含まない生体層インターフェロメトリーアッセイを用いて決定した。交差競合実験を、２５℃において、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ｖ／ｖ 界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ（ＨＢＳ－ＥＰバッファー）中、１０００ｒｐｍの速度でプレートを振盪しながら行った。試験した全ての抗ｍＴｒｋＢ抗体およびｍＴｒｋＢ－ｍｍｈ溶液は、Ｏｃｔｅｔ ＨＢＳ－ＥＰバッファーにおいて調製した。２つの抗体が、ｍＴｒｋＢ－ｍｍｈ上のそれぞれのエピトープへの結合について、互いに競合し得るかどうかを評価するために、およそ約０．２０～０．２７ｎｍのｍＴｒｋＢ－ｍｍｈを、まず、２０μｇ／ｍＬのｍＴｒｋＢ－ｍｍｈを含有するウェルから、５分間、抗ＨｉｓでコートしたＯｃｔｅｔバイオセンサーチップに捕捉した。ｍＴｒｋＢ－ｍｍｈを捕捉したＯｃｔｅｔバイオセンサーチップを、５分間、５０ｕｇ／ｍｌの第１の抗ｍＴｒｋＢモノクローナル抗体（これよりｍＡｂ－１と称する）を含有するウェルに沈め、続いて、さらに３分間、第２の抗ｍＴｒｋＢモノクローナル抗体（これより、ｍＡｂ－２と称する）を含有するウェルに沈めることにより、飽和させた。工程の間に、Ｏｃｔｅｔバイオセンサーチップは、ＨＢＳ－ＥＰバッファーで３０秒間洗浄した。
実験の経過中、リアルタイムの結合応答をモニターし、工程毎の終わりの結合応答を記録した。ｍＡｂ－１と事前に複合体を形成させたｍＴｒｋＢ．ｍｍｈに対するｍＡｂ－２の結合の応答を比較し、異なる抗ｍＴｒｋＢモノクローナル抗体の競合的／非競合的行為を、５０％阻害閾値を用いて決定した。
表３０は、結合の順序とは独立して、両方の方向で競合する抗体の関係性を明示的に定める。
結果：
Figure 0007438937000034
Ｏｃｔｅｔ遮断：ＢＤＮＦまたはＮＴ－４による抗ヒトＴｒｋＢまたは抗マウスＴｒｋＢ抗体のＴｒｋＢへの結合の遮断
実験１．
ＢＤＮＦまたはＮＴ－４による抗ヒトＴｒｋＢ抗体または抗マウスＴｒｋＢ抗体のＴｒｋＢへの結合の遮断を、リアルタイム生体層インターフェロメトリー（ＢＬＩ）に基づくＯｃｔｅｔ ＨＴＸ機器を用いて評価した。全ての研究は、２５℃において、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．０２％ ＮａＮ３、および０．０５％ ｖ／ｖ 界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０（ＨＢＳ－ＥＢＴランニングバッファー）中で行った。全ての試料を、タイトル付き３８４ウェルプレートに分注し、プレートを、１０００ｒｐｍの振盪速度のオービタルシェーカーに置いた。２分間、１０μｇ／ｍＬのＴｒｋＢ試薬を含有するウェルに浸すことにより、ｈＴｒｋＢ．ｍＦｃを、抗ｍＦｃ（ＡＭＣ）Ｏｃｔｅｔセンサーに捕捉し、一方でｈＴｒｋＢ．ｈＦｃまたはｍＴｒｋＢ．ｈＦｃは、抗ｈＦｃ（ＡＨＣ）Ｏｃｔｅｔセンサーに捕捉した。ｈＴｒｋＢ．ｍＦｃまたはｈＴｒｋＢ．ｈＦｃを捕捉したＯｃｔｅｔバイオセンサーを、２分間、２０ｎＭのＢＤＮＦ、ｈＮＴ－４、またはｍＮＴ－４を含有するウェルに浸し、続いて、Ｏｃｔｅｔバイオセンサーを、４分間、３００ｎＭの異なるＴｒｋＢ ｍＡｂを含有するウェルに浸すことにより、飽和させた。ＴｒｋＢおよびＢＤＮＦ、ｈＮＴ－４、またはｍＮＴ－４の複合体へのＴｒｋＢ ｍＡｂの結合を、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２．０ｃ解析ソフトウェアを用いて決定した。
本発明の抗ヒトＴｒｋＢ抗体または抗マウスＴｒｋＢ抗体の結合は、表３１および表３２に報告されるように、ＢＤＮＦおよびＮＴ－４の両方により遮断されなかった。
Figure 0007438937000035
Figure 0007438937000036
実験２．
抗ヒトＴｒｋＢ抗体または抗マウスＴｒｋＢ抗体によるＴｒｋＢへのＢＤＮＦまたはＮＴ－４の結合の遮断を、リアルタイム生体層インターフェロメトリー（ＢＬＩ）に基づくＯｃｔｅｔ ＨＴＸ機器を用いて評価した。全ての研究は、２５℃において、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．０２％ ＮａＮ３、および０．０５％ ｖ／ｖ 界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０（ＨＢＳ－ＥＢＴランニングバッファー）中で行った。全ての試料を、タイトル付き３８４ウェルプレートに分注し、プレートを、１０００ｒｐｍの振盪速度のオービタルシェーカーに置いた。２分間、１０μｇ／ｍＬのＴｒｋＢ試薬を含有するウェルに浸すことにより、ｈＴｒｋＢ．ｍＦｃを、抗ｍＦｃ（ＡＭＣ）Ｏｃｔｅｔセンサーに捕捉し、一方でｈＴｒｋＢ．ｈＦｃまたはｍＴｒｋＢ．ｈＦｃは、抗ｈＦｃ（ＡＨＣ）Ｏｃｔｅｔセンサーに捕捉した。ｈＴｒｋＢ．ｍＦｃまたはｈＴｒｋＢ．ｈＦｃを捕捉したＯｃｔｅｔバイオセンサーを、４分間、３００ｎＭの異なるＴｒｋＢ ｍＡｂを含有するウェルに浸し、続いて、Ｏｃｔｅｔバイオセンサーを、２分間、２０ｎＭのＢＤＮＦ、ｈＮＴ－４、またはｍＮＴ－４を含有するウェルに浸すことにより、飽和させた。ＴｒｋＢと異なるＴｒｋＢ ｍＡｂとの複合体へのＢＤＮＦ、ｈＮＴ－４、またはｍＮＴ－４の結合を、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２．０ｃ解析ソフトウェアを用いて決定した。
本発明の３つの抗ヒトＴｒｋＢ抗体のうちの１つの結合は、表３３に報告されるように、ＢＤＮＦおよびｈＮＴ－４の結合を遮断した。本発明の３つの抗マウスＴｒｋＢ抗体のうちの１つの結合は、表３４に報告されるように、ＢＤＮＦおよびｍＮＴ－４の結合を遮断した。
Figure 0007438937000037
Figure 0007438937000038
本発明は、本明細書に記載される具体的な実施形態により、範囲において制限されるべきではない。実際、本明細書に記載されるものに加え本発明の種々の修飾は、前述の記載および添付の図面から当業者に明らかとなるだろう。かかる修飾は、添付の請求の範囲内にあることが意図される。

Claims (24)

  1. トロポミオシン受容体キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号４－６－８－１２－１４－１６；（ｂ）配列番号２０－２２－２４－２８－３０－３２；および（ｃ）配列番号３６－３８－４０－４４－４６－４８からなる群より選択される６つのＣＤＲのセット（ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含む、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  2. 配列番号２／１０、１８／２６、および３４／４２からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  3. （ａ）２５℃または３７℃において表面プラズモン共鳴により測定される３００ｎＭ未満のＫDでヒトＴｒｋＢに結合する；および／または
    （ｂ）２５℃または３７℃において表面プラズモン共鳴により測定される１０分より長い解離半減期（ｔ1/2）で、ヒトＴｒｋＢに結合する、請求項１または２に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  4. 配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  5. 配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、および配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む、請求項４に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  6. 配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨ
    ＣＤＲ２、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号３２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  7. 配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、および配列番号２６のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む、請求項６に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  8. 配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号４８のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  9. 配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、および配列番号４２のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む、請求項８に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  10. 完全ヒトである、請求項１～９のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  11. 請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、および薬学的に許容し得る担体もしくは希釈剤を含む医薬組成物。
  12. 請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
  13. 請求項１２に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
  14. 請求項１３に記載のベクターを発現する細胞。
  15. ＴｒｋＢにより仲介される生物学的活性を増強するために使用される、請求項１１に記載の医薬組成物。
  16. 生物学的活性は、神経細胞の保護または神経細胞の生存である、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 生物学的活性は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の神経保護および生存である、請求項１５に記載の医薬組成物。
  18. ＴｒｋＢ活性もしくは発現に関連する疾患もしくは障害を処置もしくは予防するために、またはＴｒｋＢ活性もしくは発現に関連する該疾患もしくは障害に関連する少なくとも１つの症状を改善するために使用される、請求項１１に記載の医薬組成物。
  19. 疾患または障害は、緑内障、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性、虚血性視神経症、視神経炎、網膜虚血、光受容体変性、網膜色素変性、および網膜動脈もしくは静脈閉塞からなる群より選択される眼の疾患または障害である、請求項１８に記載の医薬組成物。
  20. 疾患または障害は、緑内障である、請求項１９に記載の医薬組成物。
  21. 対象において体重の低減を達成するために使用される、請求項１１に記載の医薬組成物。
  22. 対象において体脂肪量の低減を達成するために使用される、請求項１１に記載の医薬組成物。
  23. 対象において神経細胞の生存を促進するために使用される、請求項１１に記載の医薬組成物。
  24. 注射用製剤として製剤化されている、請求項１５～２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
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