JP7432813B2 - immunoglobulin binding protein - Google Patents
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Description
本発明は、免疫グロブリンに特異的に結合するタンパク質に関する。より詳しくは、本発明は、アルカリに対する安定性に優れた免疫グロブリン結合性タンパク質に関する。 The present invention relates to proteins that specifically bind to immunoglobulins. More specifically, the present invention relates to an immunoglobulin-binding protein with excellent stability against alkali.
抗体医薬は生体内の免疫機能を担う分子である抗体（免疫グロブリン）を利用した医薬である。抗体医薬は抗体が有する可変領域の多様性により標的分子に対し高い特異性と親和性をもって結合する。そのため抗体医薬は副作用が少なく、また、近年では適応疾患が広がってきていることもあり市場が急速に拡大している。 Antibody medicines are medicines that utilize antibodies (immunoglobulins), which are molecules responsible for immune functions in living bodies. Antibody drugs bind to target molecules with high specificity and affinity due to the diversity of the antibody's variable regions. As a result, antibody drugs have few side effects, and the market for them is rapidly expanding as the range of diseases for which they are applicable has expanded in recent years.
抗体医薬の製造は培養工程と精製工程を含み、培養工程では生産性を向上させるために抗体産生細胞の改質や培養条件の最適化が図られている。また、精製工程では粗精製としてアフィニティークロマトグラフィーが採用され、その後の中間精製、最終精製、およびウイルス除去を経て製剤化される。 The production of antibody drugs includes a culture process and a purification process, and in the culture process, antibody-producing cells are modified and culture conditions are optimized to improve productivity. Furthermore, in the purification process, affinity chromatography is employed for crude purification, followed by intermediate purification, final purification, and virus removal to form a formulation.
精製工程では抗体分子を特異的に認識するアフィニティー担体が用いられる。前記担体で用いられるリガンドタンパク質として、抗体（免疫グロブリン）に結合する性質を有した、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（以下、ＳｐＡと略）や連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇなどが多く用いられている。抗体医薬を製造する際は、その生産コストを低く保つため、これらアフィニティー担体は複数回使用され、使用後は当該担体に残存した不純物を除去する工程を行なう。前記不純物を除去する工程では、通常、水酸化ナトリウムを用いた定置洗浄を行ない、アフィニティー担体を再生させる。従って前記リガンドタンパク質は、前記再生工程を行なっても、抗体への結合性が維持されるだけの化学的安定性を有する必要がある。 An affinity carrier that specifically recognizes antibody molecules is used in the purification process. The ligand proteins used in the carrier include Protein A (hereinafter abbreviated as SpA) derived from bacteria of the genus Staphylococcus and Protein G derived from bacteria of the genus Streptococcus, which have the property of binding to antibodies (immunoglobulins). etc. are often used. When manufacturing antibody drugs, these affinity carriers are used multiple times in order to keep production costs low, and after each use, a step is performed to remove impurities remaining in the carrier. In the step of removing impurities, cleaning in place using sodium hydroxide is usually performed to regenerate the affinity carrier. Therefore, the ligand protein needs to have enough chemical stability to maintain its binding property to the antibody even after the regeneration step.
化学的安定性を有する、アフィニティー担体で用いられるリガンドタンパク質の一例として、ＳｐＡのドメインＣのアミノ酸配列を利用したアルカリ安定クロマトグラフィーリガンド（特許文献１）や、前記プロテインＡのドメインＢ、ドメインＣ、ドメインＺのうち、いずれかのドメインの一部のアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列から構成されるアフィニティークロマトリガンド（特許文献２）が挙げられる。また、ドメインＺにおいて２９番目のグリシンをアラニンに置換することで、構造が安定化することが知られている（非特許文献１）。 Examples of chemically stable ligand proteins used in affinity carriers include an alkali-stable chromatography ligand using the amino acid sequence of domain C of SpA (Patent Document 1), domain B, domain C of protein A, An example is an affinity chromatography ligand (Patent Document 2) that is composed of an amino acid sequence in which a part of the amino acid sequence of one of the domains in domain Z is deleted. Furthermore, it is known that the structure is stabilized by substituting glycine at position 29 with alanine in domain Z (Non-Patent Document 1).
本発明の課題はアルカリに対する安定性が向上した免疫グロブリン結合性タンパク質を提供することである。 An object of the present invention is to provide an immunoglobulin-binding protein with improved stability against alkali.
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＳｐＡ）のドメインＣにおける安定性向上に関与したアミノ酸残基を特定し、当該アミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換することでアルカリに対して優れた安定性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors identified amino acid residues involved in improving the stability in domain C of Protein A (SpA) derived from bacteria of the genus Staphylococcus. It was discovered that by substituting the group with another specific amino acid residue, excellent stability against alkali was achieved, and the present invention was completed.
すなわち、本発明は以下の態様を包含する。 That is, the present invention includes the following aspects.
［１］ブドウ球菌属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、少なくとも以下の（１）から（５）および（１４）から（１７）より選択される１以上のアミノ酸置換を有する、免疫グロブリン結合性タンパク質：
（１）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（２）配列番号１の３９番目のセリンに相当するアミノ酸残基がシステインに置換
（３）配列番号１の４７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（４）配列番号１の５０番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアスパラギンに置換
（５）配列番号１の５８番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアスパラギンに置換
（１４）配列番号１の３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がヒスチジンに置換
（１５）配列番号１の４番目のリジンに相当するアミノ酸残基がトレオニンに置換
（１６）配列番号１の３９番目のセリンに相当するアミノ酸残基がグリシンに置換
（１７）配列番号１の４２番目のリジンに相当するアミノ酸残基がロイシンに置換。
[1] Contains the amino acid sequence of the immunoglobulin binding domain of Protein A derived from Staphylococcus bacteria, provided that in the amino acid sequence, at least 1 selected from the following (1) to (5) and (14) to (17) Immunoglobulin-binding protein having the above amino acid substitutions:
(1) The amino acid residue corresponding to the 7th lysine in SEQ ID NO: 1 is replaced with valine (2) The amino acid residue corresponding to the 39th serine in SEQ ID NO: 1 is replaced with cysteine (3) 47 in SEQ ID NO: 1 (4) The amino acid residue corresponding to the 50th lysine of SEQ ID NO: 1 is replaced with asparagine. (5) The amino acid residue corresponding to the 58th lysine of SEQ ID NO: 1 is replaced with valine. group is replaced with asparagine (14) The amino acid residue corresponding to the third asparagine in SEQ ID NO: 1 is replaced with histidine (15) The amino acid residue corresponding to the fourth lysine in SEQ ID NO: 1 is replaced with threonine (16) The amino acid residue corresponding to the 39th serine in SEQ ID NO: 1 was replaced with glycine (17) The amino acid residue corresponding to the 42nd lysine in SEQ ID NO: 1 was replaced with leucine.
［２］以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のタンパク質である、［１］に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質：
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（１）から（５）および（１４）から（１７）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有するタンパク質：
（１）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（２）配列番号１の３９番目のセリンに相当するアミノ酸残基がシステインに置換
（３）配列番号１の４７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（４）配列番号１の５０番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアスパラギンに置換
（５）配列番号１の５８番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアスパラギンに置換
（１４）配列番号１の３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がヒスチジンに置換
（１５）配列番号１の４番目のリジンに相当するアミノ酸残基がトレオニンに置換
（１６）配列番号１の３９番目のセリンに相当するアミノ酸残基がグリシンに置換
（１７）配列番号１の４２番目のリジンに相当するアミノ酸残基がロイシンに置換。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、前記（１）から（５）および（１４）から（１７）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、さらに前記（１）から（５）および（１４）から（１７）以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、ならびに／または付加を含み、かつ免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列またはその部分配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、ただし前記（１）から（５）および（１４）から（１７）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、かつ免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質
（ｄ）前記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のタンパク質のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、さらに以下の（６）から（１３）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有するタンパク質：
（６）配列番号１の３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がイソロイシンに置換
（７）配列番号１の４番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
（８）配列番号１の６番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸に置換
（９）配列番号１の１１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がリジンに置換
（１０）配列番号１の１５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（１１）配列番号１の２１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がチロシンに置換
（１２）配列番号１の２９番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（１３）配列番号１の４０番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換。
[2] The immunoglobulin-binding protein according to [1], which is a protein according to any one of the following (a) to (d):
(a) A protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but having at least one amino acid substitution selected from the following (1) to (5) and (14) to (17) in the amino acid sequence:
(1) The amino acid residue corresponding to the 7th lysine in SEQ ID NO: 1 is replaced with valine (2) The amino acid residue corresponding to the 39th serine in SEQ ID NO: 1 is replaced with cysteine (3) 47 in SEQ ID NO: 1 (4) The amino acid residue corresponding to the 50th lysine of SEQ ID NO: 1 is replaced with asparagine. (5) The amino acid residue corresponding to the 58th lysine of SEQ ID NO: 1 is replaced with valine. group is replaced with asparagine (14) The amino acid residue corresponding to the third asparagine in SEQ ID NO: 1 is replaced with histidine (15) The amino acid residue corresponding to the fourth lysine in SEQ ID NO: 1 is replaced with threonine (16) The amino acid residue corresponding to the 39th serine in SEQ ID NO: 1 was replaced with glycine (17) The amino acid residue corresponding to the 42nd lysine in SEQ ID NO: 1 was replaced with leucine.
(b) comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, provided that the amino acid sequence has at least one amino acid substitution selected from (1) to (5) and (14) to (17), and further Contains substitution, deletion, insertion, and/or addition of one or several amino acid residues at one or several positions other than the above (1) to (5) and (14) to (17), and Protein with immunoglobulin binding activity (c) Contains an amino acid sequence having 70% or more homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof, provided that from (1) to (5) and (14) above (17) A protein having at least one amino acid substitution selected from: A protein further having at least one amino acid substitution selected from the following (6) to (13) in the amino acid sequence:
(6) The amino acid residue corresponding to the third asparagine in SEQ ID NO: 1 is replaced with isoleucine (7) The amino acid residue corresponding to the fourth lysine in SEQ ID NO: 1 is replaced with arginine (8) 6 of SEQ ID NO: 1 The amino acid residue corresponding to the 11th asparagine in SEQ ID NO: 1 is replaced with aspartic acid (9) The amino acid residue corresponding to the 11th asparagine in SEQ ID NO: 1 is replaced with lysine (10) The amino acid residue corresponding to the 15th glutamic acid in SEQ ID NO: 1 The residue is replaced with alanine (11) The amino acid residue corresponding to the 21st asparagine in SEQ ID NO: 1 is replaced with tyrosine (12) The amino acid residue corresponding to the 29th glycine in SEQ ID NO: 1 is replaced with alanine (13) ) The amino acid residue corresponding to valine at position 40 of SEQ ID NO: 1 is replaced with alanine.
［３］以下の（ｅ）から（ｈ）のいずれかに記載のタンパク質である、［２］に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質：
（ｅ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、少なくとも以下の（１）のアミノ酸置換を有するタンパク質
（１）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のバリンへの置換、
（ｆ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、少なくとも前記（１）のアミノ酸置換を有し、さらに前記アミノ酸置換の位置以外の１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含み、かつ免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質
（ｇ）配列番号１に記載のアミノ酸配列またはその部分配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、ただし少なくとも前記（１）のアミノ酸置換を有し、かつ免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質
（ｈ）前記（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）に記載のタンパク質のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、さらに以下の（２）から（１７）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有するタンパク質：
（２）配列番号１の３９番目のセリンに相当するアミノ酸残基がシステインに置換
（３）配列番号１の４７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（４）配列番号１の５０番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアスパラギンに置換
（５）配列番号１の５８番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアスパラギンに置換
（６）配列番号１の３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がイソロイシンに置換
（７）配列番号１の４番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
（８）配列番号１の６番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸に置換
（９）配列番号１の１１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がリジンに置換
（１０）配列番号１の１５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（１１）配列番号１の２１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がチロシンに置換
（１２）配列番号１の２９番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（１３）配列番号１の４０番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（１４）配列番号１の３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がヒスチジンに置換
（１５）配列番号１の４番目のリジンに相当するアミノ酸残基がトレオニンに置換
（１６）配列番号１の３９番目のセリンに相当するアミノ酸残基がグリシンに置換
（１７）配列番号１の４２番目のリジンに相当するアミノ酸残基がロイシンに置換。
[3] The immunoglobulin-binding protein according to [2], which is a protein according to any one of (e) to (h) below:
(e) A protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but having at least the following amino acid substitutions in (1): Substitution with valine,
(f) Contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, provided that the amino acid sequence has at least the amino acid substitution described in (1) above, and further includes one or more amino acid substitutions at one or several positions other than the amino acid substitution positions. A protein containing substitutions, deletions, insertions, and/or additions of several amino acid residues and having immunoglobulin binding activity (g) 70% or more homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof (h) a protein comprising an amino acid sequence having the same amino acid sequence as described in (1) above, and having immunoglobulin binding activity; (h) an amino acid of the protein according to (e), (f) or (g) above; A protein comprising the sequence, but further having at least one amino acid substitution selected from the following (2) to (17) in the amino acid sequence:
(2) The amino acid residue corresponding to serine at position 39 of SEQ ID NO: 1 is replaced with cysteine (3) The amino acid residue corresponding to glutamic acid at position 47 of SEQ ID NO: 1 is replaced with valine (4) 50 of SEQ ID NO: 1 The amino acid residue corresponding to the 58th lysine in SEQ ID NO: 1 is replaced with asparagine (5) The amino acid residue corresponding to the 58th lysine in SEQ ID NO: 1 is replaced with asparagine (6) The amino acid residue corresponding to the 3rd asparagine in SEQ ID NO: 1 is replaced with asparagine. group is replaced with isoleucine (7) The amino acid residue corresponding to the 4th lysine of SEQ ID NO: 1 is replaced with arginine (8) The amino acid residue corresponding to the 6th asparagine of SEQ ID NO: 1 is replaced with aspartic acid (9 ) The amino acid residue corresponding to the 11th asparagine in SEQ ID NO: 1 is replaced with lysine (10) The amino acid residue corresponding to the 15th glutamic acid in SEQ ID NO: 1 is replaced with alanine (11) The 21st amino acid residue in SEQ ID NO: 1 is replaced with alanine. The amino acid residue corresponding to asparagine is replaced with tyrosine (12) The amino acid residue corresponding to glycine at position 29 of SEQ ID NO: 1 is replaced with alanine (13) The amino acid residue corresponding to valine at position 40 of SEQ ID NO: 1 is replaced with tyrosine. Replaced with alanine (14) The amino acid residue corresponding to the third asparagine in SEQ ID NO: 1 is replaced with histidine (15) The amino acid residue corresponding to the fourth lysine in SEQ ID NO: 1 is replaced with threonine (16) SEQ ID NO: The amino acid residue corresponding to the 39th serine in SEQ ID NO: 1 was replaced with glycine (17) The amino acid residue corresponding to the 42nd lysine in SEQ ID NO: 1 was replaced with leucine.
［４］配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（ｉ）から（ｖ）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、［２］に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質：
（ｉ）配列番号１０の７番目のリジンがバリンに置換
（ｉｉ）配列番号１０の３９番目のセリンがシステインに置換
（ｉｉｉ）配列番号１０の４７番目のグルタミン酸がバリンに置換
（ｉｖ）配列番号１０の５０番目のリジンがアスパラギンに置換
（ｖ）配列番号１０の５８番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換。
[4] The immunoglobulin binding according to [2], which comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10, but has at least one amino acid substitution selected from the following (i) to (v) in the amino acid sequence: Sex protein:
(i) Lysine at position 7 of SEQ ID NO: 10 is replaced with valine (ii) Serine at position 39 of SEQ ID NO: 10 is replaced with cysteine (iii) Glutamic acid at position 47 of SEQ ID NO: 10 is replaced with valine (iv) SEQ ID NO: Lysine at position 50 of SEQ ID NO: 10 is replaced with asparagine (v) Aspartic acid at position 58 of SEQ ID NO: 10 is replaced with asparagine.
［５］配列番号１８から２０、２２および２３のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、［４］に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質。 [5] The immunoglobulin-binding protein according to [4], which comprises the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 18 to 20, 22, and 23.
［６］配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（Ｉ）から（ＩＶ）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、［２］に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質：
（Ｉ）配列番号１８の３番目のイソロイシンがヒスチジンに置換
（ＩＩ）配列番号１８の４番目のアルギニンがトレオニンに置換
（ＩＩＩ）配列番号１８の３９番目のセリンがグリシンに置換
（ＩＶ）配列番号１８の４２番目のリジンがロイシンに置換
［７］配列番号４８から５１、５４および５６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、［６］に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質。
[6] The immunoglobulin binding according to [2], which comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18, but has at least one amino acid substitution selected from the following (I) to (IV) in the amino acid sequence: Sex protein:
(I) The 3rd isoleucine of SEQ ID NO: 18 is replaced with histidine (II) The 4th arginine of SEQ ID NO: 18 is replaced with threonine (III) The 39th serine of SEQ ID NO: 18 is replaced with glycine (IV) SEQ ID NO: [7] The immunoglobulin-binding protein according to [6], wherein lysine at position 42 of No. 18 is replaced with leucine.
［８］［１］から［７］のいずれかに記載の免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。 [8] A polynucleotide encoding the immunoglobulin-binding protein according to any one of [1] to [7].
［９］［８］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。 [9] An expression vector comprising the polynucleotide according to [8].
［１０］［８］に記載のポリヌクレオチドまたは［９］に記載の発現ベクターを含む、遺伝子組換え宿主。 [10] A genetically recombinant host comprising the polynucleotide according to [8] or the expression vector according to [9].
［１１］宿主が大腸菌である、［１０］に記載の遺伝子組換え宿主。 [11] The genetically modified host according to [10], wherein the host is E. coli.
［１２］［１０］または［１１］に記載の遺伝子組換え宿主を培養し［１］から［７］のいずれかに記載の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させる工程と、発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む、免疫グロブリン結合性タンパク質の製造方法。 [12] A step of culturing the genetically modified host according to [10] or [11] to express the immunoglobulin-binding protein according to any one of [1] to [7], and collecting the expressed protein. A method for producing an immunoglobulin-binding protein, comprising the step of:
［１３］不溶性担体と、当該不溶性担体に固定化した［１］から［７］のいずれかに記載の免疫グロブリン結合性タンパク質とを含む、免疫グロブリン吸着剤。 [13] An immunoglobulin adsorbent comprising an insoluble carrier and the immunoglobulin-binding protein according to any one of [1] to [7] immobilized on the insoluble carrier.
［１４］［１３］に記載の吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加し当該免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させる工程とを含む、前記溶液中に含まれる免疫グロブリンの分離方法。 [14] A step of adding a solution containing immunoglobulin to the column packed with the adsorbent described in [13] to adsorb the immunoglobulin to the adsorbent, and a step of eluting the immunoglobulin adsorbed to the adsorbent. A method for separating immunoglobulins contained in the solution, comprising:
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質はブドウ球菌属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡのドメインＣの特定位置におけるアミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換したポリペプチドである。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質はアルカリに対する安定性が向上しており、抗体（免疫グロブリン）を分離するための吸着剤におけるリガンドタンパク質として有用である。 The immunoglobulin-binding protein of the present invention is a polypeptide in which an amino acid residue at a specific position in domain C of Protein A derived from a Staphylococcus bacterium is replaced with another specific amino acid residue. The immunoglobulin-binding protein of the present invention has improved stability against alkali and is useful as a ligand protein in an adsorbent for separating antibodies (immunoglobulins).
以下、本発明を詳細に説明する。 The present invention will be explained in detail below.
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、特定の免疫グロブリン結合性タンパク質である。本明細書において「免疫グロブリン結合性タンパク質」とは、免疫グロブリンに対する結合性を有するタンパク質を意味する。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、免疫グロブリンに対する結合性を有する。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、具体的には、免疫グロブリンのＦｃ領域に対する結合性を有するものであってもよい。本明細書では、免疫グロブリンに対する結合性を、「免疫グロブリン結合活性」または「抗体結合活性」ともいう。免疫グロブリン結合活性は、例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法で測定できる。ＥＬＩＳＡ法は、例えば、実施例に記載の条件で実施できる。 The immunoglobulin binding protein of the present invention is a specific immunoglobulin binding protein. As used herein, the term "immunoglobulin-binding protein" refers to a protein that has the ability to bind to immunoglobulins. That is, the immunoglobulin-binding protein of the present invention has the ability to bind to immunoglobulins. Specifically, the immunoglobulin-binding protein of the present invention may have the ability to bind to the Fc region of an immunoglobulin. In this specification, binding to immunoglobulin is also referred to as "immunoglobulin binding activity" or "antibody binding activity." Immunoglobulin binding activity can be measured, for example, by an ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) method. The ELISA method can be carried out, for example, under the conditions described in the Examples.
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（以下、ＳｐＡと略）の免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、特定位置におけるアミノ酸置換を有するタンパク質が挙げられる。本明細書において、ＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列であって、特定位置におけるアミノ酸置換を有さないものを、「非改変型アミノ酸配列」ともいい、ＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列であって、特定位置におけるアミノ酸置換を有するものを、「改変型アミノ酸配列」ともいう。すなわち、改変型アミノ酸配列は、特定位置におけるアミノ酸置換を有すること以外は非改変型アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列であってよい。また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、特定位置におけるアミノ酸置換を有すること以外は非改変型アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含むタンパク質であってよい。また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、改変型アミノ酸配列を含むタンパク質であってよい。非改変型アミノ酸配列は、天然に見出されるアミノ酸配列であってもよく、そうでなくてもよい。非改変型アミノ酸配列は、例えば、所望の性質を有するように改変されていてもよい。非改変型アミノ酸配列は、例えば、特定位置におけるアミノ酸置換以外のアミノ酸置換を有していてもよい。 The immunoglobulin-binding protein of the present invention includes an amino acid sequence of an immunoglobulin-binding domain of Protein A (hereinafter abbreviated as SpA) derived from a bacterium of the genus Staphylococcus, provided that amino acid substitutions at specific positions are present in the amino acid sequence. Examples include proteins having the following. In this specification, an amino acid sequence of the immunoglobulin-binding domain of SpA that does not have amino acid substitutions at a specific position is also referred to as an "unmodified amino acid sequence", and an amino acid sequence of the immunoglobulin-binding domain of SpA that does not have amino acid substitutions at specific positions. A sequence having an amino acid substitution at a specific position is also referred to as a "modified amino acid sequence." That is, the modified amino acid sequence may be the same amino acid sequence as the non-modified amino acid sequence except for having an amino acid substitution at a specific position. Furthermore, the immunoglobulin-binding protein of the present invention may be, for example, a protein that includes an amino acid sequence that is the same as the unmodified amino acid sequence except for having an amino acid substitution at a specific position. Furthermore, the immunoglobulin-binding protein of the present invention may be, for example, a protein containing a modified amino acid sequence. The unmodified amino acid sequence may or may not be an amino acid sequence found in nature. An unmodified amino acid sequence may be modified to have desired properties, for example. The unmodified amino acid sequence may have, for example, amino acid substitutions other than amino acid substitutions at specific positions.
ＳｐＡの由来であるブドウ球菌属細菌としては、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）が挙げられる。免疫グロブリン結合ドメインとしては、ドメインＣ、ドメインＥ、ドメインＤ、ドメインＡ、ドメインＢが挙げられる。免疫グロブリン結合ドメインとしては、特に、ドメインＣが挙げられる。黄色ブドウ球菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡのドメインＣとしては、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の２７０番目から３２７番目までのアミノ酸残基が挙げられる。当該ドメインＣのアミノ酸配列を配列番号１に示す。また黄色ブドウ球菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡのドメインＥとしては、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の３７番目から９２番目までのアミノ酸残基が挙げられる。当該ドメインＥのアミノ酸配列を配列番号２４に示す。また黄色ブドウ球菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡのドメインＤとしては、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の９３番目から１５３番目までのアミノ酸残基が挙げられる。当該ドメインＤのアミノ酸配列を配列番号２５に示す。また黄色ブドウ球菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡのドメインＡとしては、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の１５４番目から２１１番目までのアミノ酸残基が挙げられる。当該ドメインＡのアミノ酸配列を配列番号２６に示す。また黄色ブドウ球菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡのドメインＢとしては、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の２１２番目から２６９番目までのアミノ酸残基が挙げられる。当該ドメインＢのアミノ酸配列を配列番号２７に示す。すなわち非改変型アミノ酸配列として、具体的には、配列番号１、２４、２５、２６、および２７に記載のアミノ酸配列等の上記例示した免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列が挙げられる。 Staphylococcus bacteria from which SpA is derived include Staphylococcus aureus. Immunoglobulin binding domains include domain C, domain E, domain D, domain A, and domain B. Immunoglobulin binding domains include in particular domain C. As domain C of Protein A derived from Staphylococcus aureus, GenBank No. Examples include amino acid residues from 270th to 327th of AAA26676. The amino acid sequence of the domain C is shown in SEQ ID NO: 1. In addition, as domain E of Protein A derived from Staphylococcus aureus, GenBank No. Examples include amino acid residues from the 37th to the 92nd of AAA26676. The amino acid sequence of domain E is shown in SEQ ID NO: 24. Furthermore, as domain D of Protein A derived from Staphylococcus aureus, GenBank No. Examples include amino acid residues from 93rd to 153rd of AAA26676. The amino acid sequence of domain D is shown in SEQ ID NO: 25. In addition, as domain A of Protein A derived from Staphylococcus aureus, GenBank No. Examples include amino acid residues from 154th to 211th of AAA26676. The amino acid sequence of domain A is shown in SEQ ID NO:26. In addition, as domain B of Protein A derived from Staphylococcus aureus, GenBank No. Examples include amino acid residues from 212th to 269th of AAA26676. The amino acid sequence of domain B is shown in SEQ ID NO: 27. Specifically, unmodified amino acid sequences include the amino acid sequences of the immunoglobulin binding domains exemplified above, such as the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1, 24, 25, 26, and 27.
また改変型アミノ酸配列として、具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列等の上記例示した免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列において特定位置におけるアミノ酸置換を有するアミノ酸配列が挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質として、具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列等の上記例示した免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、特定位置におけるアミノ酸置換を有するタンパク質が挙げられる。言い換えると、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、特定位置におけるアミノ酸置換を有すること以外は配列番号１に記載のアミノ酸配列等の上記例示した免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含むタンパク質であってよい。 Specific examples of modified amino acid sequences include amino acid sequences having amino acid substitutions at specific positions in the amino acid sequences of the immunoglobulin binding domains exemplified above, such as the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. That is, the immunoglobulin-binding protein of the present invention specifically includes the amino acid sequence of the immunoglobulin-binding domain exemplified above, such as the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, provided that the amino acid sequence at a specific position in the amino acid sequence is Included are proteins with substitutions. In other words, the immunoglobulin-binding protein of the present invention has an amino acid sequence that is the same as the amino acid sequence of the above-exemplified immunoglobulin-binding domain, such as the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, except for having an amino acid substitution at a specific position. It may be a protein containing.
本明細書において、タンパク質がアミノ酸配列を含むことを、「タンパク質がアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を含む」ともいい、タンパク質またはアミノ酸配列がアミノ酸置換を有することを、「タンパク質またはアミノ酸配列においてアミノ酸置換が生じる」ともいう。またタンパク質またはアミノ酸配列を構成するアミノ酸を、「アミノ酸残基」ともいう。 In this specification, the fact that a protein includes an amino acid sequence is also referred to as "the protein contains amino acid residues consisting of the amino acid sequence", and the fact that the protein or amino acid sequence has an amino acid substitution is also referred to as "an amino acid substitution in the protein or amino acid sequence". It is also said that ``occurs.'' Amino acids that constitute a protein or amino acid sequence are also referred to as "amino acid residues."
前記特定位置におけるアミノ酸置換は、具体的には、Ｌｙｓ７Ｖａｌ（この表記は配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がバリンに置換されていることを表す、以下同じ）、Ｓｅｒ３９Ｃｙｓ、Ｇｌｕ４７Ｖａｌ、Ｌｙｓ５０Ａｓｎ、Ｌｙｓ５８Ａｓｎ、Ａｓｎ３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４Ｔｈｒ、Ｓｅｒ３９ＧｌｙおよびＬｙｓ４２Ｌｅｕから選択される少なくとも一つのアミノ酸置換である。言い換えると、前記特定位置におけるアミノ酸置換は、具体的には、（１）Ｌｙｓ７Ｖａｌ、（２）Ｓｅｒ３９Ｃｙｓ、（３）Ｇｌｕ４７Ｖａｌ、（４）Ｌｙｓ５０Ａｓｎ、（５）Ｌｙｓ５８Ａｓｎ、（１４）Ａｓｎ３Ｈｉｓ、（１５）Ｌｙｓ４Ｔｈｒ、（１６）Ｓｅｒ３９Ｇｌｙおよび（１７）Ｌｙｓ４２Ｌｅｕから選択される少なくとも一つのアミノ酸置換である。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、これらのアミノ酸置換から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つのアミノ酸置換を有してよい。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、少なくとも、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ｓｅｒ３９Ｃｙｓ、Ｇｌｕ４７Ｖａｌ、Ｌｙｓ５０Ａｓｎ、Ｌｙｓ５８Ａｓｎ、Ａｓｎ３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４Ｔｈｒ、Ｓｅｒ３９ＧｌｙおよびＬｙｓ４２Ｌｅｕから選択される少なくとも一つのアミノ酸置換を有してもよい。中でもＬｙｓ７Ｖａｌは、アルカリに対する安定性が特に向上したアミノ酸置換である。そのため、Ｌｙｓ７Ｖａｌのアミノ酸置換を少なくとも有する免疫グロブリン結合性タンパク質は、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の好ましい例である。 Specifically, the amino acid substitution at the specific position includes Lys7Val (this notation indicates that the amino acid residue corresponding to the 7th lysine in SEQ ID NO: 1 is substituted with valine; the same applies hereinafter), Ser39Cys, Glu47Val. , Lys50Asn, Lys58Asn, Asn3His, Lys4Thr, Ser39Gly and Lys42Leu. In other words, the amino acid substitution at the specific position is specifically (1) Lys7Val, (2) Ser39Cys, (3) Glu47Val, (4) Lys50Asn, (5) Lys58Asn, (14) Asn3His, (15) Lys4Thr. , (16) Ser39Gly and (17) Lys42Leu. The immunoglobulin binding protein of the invention may have, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8 amino acid substitutions selected from these amino acid substitutions. . The immunoglobulin binding protein of the present invention may have at least one amino acid substitution selected from, for example, Lys7Val, Ser39Cys, Glu47Val, Lys50Asn, Lys58Asn, Asn3His, Lys4Thr, Ser39Gly and Lys42Leu. Among them, Lys7Val is an amino acid substitution that particularly improves stability against alkali. Therefore, an immunoglobulin-binding protein having at least the Lys7Val amino acid substitution is a preferred example of the immunoglobulin-binding protein of the present invention.
なお、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、少なくとも１つのその他のアミノ酸置換をさらに有してもよい。他のアミノ酸置換としては、構造安定性が増すことが知られているＧｌｙ２９Ａｌａのアミノ酸置換（Ｂｊｏｒｎ Ｎｉｌｓｓｏｎ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１（２），１０７－１１３，１９８７）が挙げられる。また、Ｇｌｙ２９Ａｌａ以外の他のアミノ酸置換としては、Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ａｓｎ６Ａｓｐ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｖａｌ４０Ａｌａのアミノ酸置換が挙げられる。すなわち、改変型アミノ酸配列としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）において前記特定位置におけるアミノ酸置換およびＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列も挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）を含み、ただし当該アミノ酸配列において、前記特定位置におけるアミノ酸置換およびＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換を有するタンパク質も挙げられる。言い換えると、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、前記特定位置におけるアミノ酸置換およびＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換を有すること以外は上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）と同一のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。 Note that the immunoglobulin-binding protein of the present invention may further have at least one other amino acid substitution. Other amino acid substitutions include the amino acid substitution of Gly29Ala, which is known to increase structural stability (Bjorn Nilsson et al., Protein Engineering, 1(2), 107-113, 1987). Further, amino acid substitutions other than Gly29Ala include amino acid substitutions of Asn3Ile, Lys4Arg, Asn6Asp, Asn11Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, and Val40Ala. That is, the modified amino acid sequence also includes an amino acid sequence having an amino acid substitution at the specific position and other amino acid substitutions such as Gly29Ala in the non-modified amino acid sequence exemplified above (for example, the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1). . That is, the immunoglobulin-binding protein of the present invention includes the unmodified amino acid sequence exemplified above (for example, the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1), but in the amino acid sequence, amino acid substitutions at the specific positions, Gly29Ala, etc. Also included are proteins with other amino acid substitutions. In other words, the immunoglobulin-binding protein of the present invention has the above-exemplified unmodified amino acid sequence (for example, the sequence set forth in SEQ ID NO: 1) except that it has an amino acid substitution at the specific position and another amino acid substitution such as Gly29Ala. It may be a protein containing the same amino acid sequence as (amino acid sequence).
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が２つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有する場合、それらアミノ酸置換の組み合わせは特に制限されない。 When the immunoglobulin-binding protein of the present invention has two or more amino acid substitutions, the combination of these amino acid substitutions is not particularly limited.
アミノ酸置換の組み合わせとして、具体的には、例えば、
Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｇｌｕ４７ＶａｌおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ５０ＡｓｎおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｓｅｒ３９Ｃｙｓ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｎのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ４２ＬｅｕおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｓｅｒ３９Ｇｌｙ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ｔｈｒ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ４２ＬｅｕおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｓｅｒ３９Ｇｌｙ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ４２ＬｅｕおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
が挙げられる。
Specifically, as a combination of amino acid substitutions, for example,
Amino acid substitutions of Asn3Ile, Lys4Arg, Lys7Val, Asn11Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala, Val40Ala and Lys58Asp;
Amino acid substitutions of Asn3Ile, Lys4Arg, Lys7Glu, Asn11Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala, Val40Ala, Glu47Val and Lys58Asp;
Amino acid substitutions of Asn3Ile, Lys4Arg, Lys7Glu, Asn11Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala, Val40Ala, Lys50Asn and Lys58Asp;
Amino acid substitutions of Asn3Ile, Lys4Arg, Lys7Glu, Asn11Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala, Ser39Cys, Val40Ala and Lys58Asp;
Amino acid substitutions of Asn3Ile, Lys4Arg, Lys7Glu, Asn11Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala, Val40Ala and Lys58Asn;
Amino acid substitutions of Asn3Ile, Lys4Arg, Lys7Val, Asn11Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala, Val40Ala, Lys42Leu and Lys58Asp;
Amino acid substitutions of Asn3His, Lys4Arg, Lys7Val, Asn11Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala, Val40Ala and Lys58Asp;
Amino acid substitutions of Asn3Ile, Lys4Arg, Lys7Val, Asn11Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala, Ser39Gly, Val40Ala and Lys58Asp;
Amino acid substitutions of Asn3Ile, Lys4Thr, Lys7Val, Asn11Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala, Val40Ala and Lys58Asp;
Amino acid substitutions of Asn3His, Lys4Arg, Lys7Val, Asn11Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala, Val40Ala, Lys42Leu and Lys58Asp;
Amino acid substitutions of Asn3His, Lys4Arg, Lys7Val, Asn11Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala, Ser39Gly, Val40Ala, Lys42Leu and Lys58Asp;
can be mentioned.
すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質として、より具体的には、下記の免疫グロブリン結合性タンパク質が挙げられる。これらの免疫グロブリン結合性タンパク質はアルカリに対する安定性が向上する点で好ましい。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｇｌｕ４７ＶａｌおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ５０ＡｓｎおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｓｅｒ３９Ｃｙｓ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号２２に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｎのアミノ酸置換のアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ４２ＬｅｕおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号４８に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号４９に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｓｅｒ３９Ｇｌｙ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号５０に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ｔｈｒ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号５１に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ４２ＬｅｕおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｓｅｒ３９Ｇｌｙ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ４２ＬｅｕおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号５６に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
More specifically, the immunoglobulin-binding proteins of the present invention include the following immunoglobulin-binding proteins. These immunoglobulin-binding proteins are preferable because they have improved stability against alkali.
An immunoglobulin-binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but having the amino acid substitutions Asn3Ile, Lys4Arg, Lys7Val, Asn11Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala, Val40Ala, and Lys58Asp in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 18). immunoglobulin-binding protein containing the amino acid sequence).
An immunoglobulin-binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but having amino acid substitutions of Asn3Ile, Lys4Arg, Lys7Glu, Asn11Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala, Val40Ala, Glu47Val, and Lys58Asp in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 19). immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence described).
An immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but having amino acid substitutions of Asn3Ile, Lys4Arg, Lys7Glu, Asn11Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala, Val40Ala, Lys50Asn and Lys58Asp in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 20). immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence described).
An immunoglobulin-binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but having the amino acid substitutions Asn3Ile, Lys4Arg, Lys7Glu, Asn11Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala, Ser39Cys, Val40Ala, and Lys58Asp in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 22). immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence described).
An immunoglobulin-binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but having amino acid substitutions of Asn3Ile, Lys4Arg, Lys7Glu, Asn11Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala, Val40Ala, and Lys58Asn in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 23). (an immunoglobulin-binding protein comprising the amino acid sequence described in ).
An immunoglobulin-binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but having amino acid substitutions of Asn3Ile, Lys4Arg, Lys7Val, Asn11Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala, Val40Ala, Lys42Leu, and Lys58Asp in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 48). immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence described).
An immunoglobulin-binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but having the amino acid substitutions Asn3His, Lys4Arg, Lys7Val, Asn11Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala, Val40Ala, and Lys58Asp in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 49) immunoglobulin-binding protein containing the amino acid sequence).
An immunoglobulin-binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but having amino acid substitutions of Asn3Ile, Lys4Arg, Lys7Val, Asn11Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala, Ser39Gly, Val40Ala, and Lys58Asp in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 50). immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence described).
An immunoglobulin-binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but having the amino acid substitutions Asn3Ile, Lys4Thr, Lys7Val, Asn11Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala, Val40Ala, and Lys58Asp in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 51) immunoglobulin-binding protein containing the amino acid sequence).
An immunoglobulin-binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but having amino acid substitutions of Asn3His, Lys4Arg, Lys7Val, Asn11Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala, Val40Ala, Lys42Leu, and Lys58Asp in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 54). immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence described).
An immunoglobulin-binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but having amino acid substitutions of Asn3His, Lys4Arg, Lys7Val, Asn11Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala, Ser39Gly, Val40Ala, Lys42Leu, and Lys58Asp in the amino acid sequence ( Sequence number 56).
またアミノ酸置換の組み合わせとして、具体的には、例えば、Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐと、以下の（ｉ）から（ｖ）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換との組み合わせが挙げられる：
（ｉ）Ｌｙｓ７Ｖａｌ
（ｉｉ）Ｓｅｒ３９Ｃｙｓ
（ｉｉｉ）Ｇｌｕ４７Ｖａｌ
（ｉｖ）Ｌｙｓ５０Ａｓｎ
（ｖ）Ｌｙｓ５８Ａｓｎ
すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質として、より具体的には、配列番号１０に記載のアミノ酸配列（配列番号１に記載のアミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列）を含み、ただし当該アミノ酸配列において、前記（ｉ）から（ｖ）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有するタンパク質も挙げられる。そのようなタンパク質としては、特に、上述した配列番号１８から２０、２２および２３のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質が挙げられる。
Further, as a combination of amino acid substitutions, specifically, for example, Asn3Ile, Lys4Arg, Lys7Glu, Asn11Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala, Val40Ala, and Lys58Asp, and at least one amino acid selected from the following (i) to (v). Combinations with substitutions include:
(i) Lys7Val
(ii) Ser39Cys
(iii) Glu47Val
(iv) Lys50Asn
(v)Lys58Asn
That is, the immunoglobulin binding protein of the present invention more specifically includes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10 (in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, Asn3Ile, Lys4Arg, Lys7Glu, Asn11Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala, Also included are proteins containing an amino acid sequence (having amino acid substitutions of Val40Ala and Lys58Asp), but having at least one amino acid substitution selected from (i) to (v) above in the amino acid sequence. Such proteins include, in particular, immunoglobulin binding proteins comprising the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 18 to 20, 22 and 23 above.
またアミノ酸置換の組み合わせの別の具体例として、Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐと、以下の（Ｉ）から（ＩＶ）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換との組み合わせが挙げられる：
（Ｉ）Ａｓｎ３Ｈｉｓ
（ＩＩ）Ｌｙｓ４Ｔｈｒ
（ＩＩＩ）Ｓｅｒ３９Ｇｌｙ
（ＩＶ）Ｌｙｓ４２Ｌｅｕ
すなわち、発明の免疫グロブリン結合性タンパク質として、より具体的には、配列番号１８に記載のアミノ酸配列（配列番号１に記載のアミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列）を含み、ただし当該アミノ酸配列において、前記（Ｉ）から（ＩＶ）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有するタンパク質も挙げられる。そのようなタンパク質としては、特に、上述した配列番号４８から５１、５４および５６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質が挙げられる。
Further, as another specific example of the combination of amino acid substitutions, Asn3Ile, Lys4Arg, Lys7Val, Asn11Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala, Val40Ala and Lys58Asp, and at least one amino acid substitution selected from the following (I) to (IV). Combinations include:
(I) Asn3His
(II) Lys4Thr
(III) Ser39Gly
(IV)Lys42Leu
That is, the immunoglobulin binding protein of the invention more specifically includes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18 (Asn3Ile, Lys4Arg, Lys7Val, Asn11Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala, Val40Ala in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1). and Lys58Asp), provided that the amino acid sequence has at least one amino acid substitution selected from (I) to (IV) above. Such proteins include, in particular, immunoglobulin binding proteins comprising the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 48 to 51, 54 and 56 above.
なお、ここで（ｉ）または（ｖ）を選択した場合、配列番号１０に含まれるＬｙｓ７ＧｌｕまたはＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換はＬｙｓ７ＶａｌまたはＬｙｓ５８Ａｓｎのアミノ酸置換で上書きされるため、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質はＬｙｓ７ＧｌｕまたはＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有さない。そして（Ｉ）または（ＩＩ）を選択した場合も同様、配列番号１８に含まれるＡｓｎ３ＩｌｅまたはＬｙｓ４Ａｒｇのアミノ酸置換はＡｓｎ３ＨｉｓまたはＬｙｓ４Ｔｈｒのアミノ酸置換で上書きされるため、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質はＡｓｎ３ＩｌｅまたはＬｙｓ４Ａｒｇのアミノ酸置換を有さない。 In addition, if (i) or (v) is selected here, the amino acid substitution of Lys7Glu or Lys58Asp contained in SEQ ID NO: 10 is overwritten by the amino acid substitution of Lys7Val or Lys58Asn, so the immunoglobulin-binding protein of the present invention Does not have Lys7Glu or Lys58Asp amino acid substitutions. Similarly, when (I) or (II) is selected, the amino acid substitution of Asn3Ile or Lys4Arg contained in SEQ ID NO: 18 is overwritten by the amino acid substitution of Asn3His or Lys4Thr. or does not have the Lys4Arg amino acid substitution.
前記（ｉ）から（ｖ）のアミノ酸置換は、いずれも、配列番号１０を参照配列として適宜読み替えできる。また前記（Ｉ）から（ＩＶ）のアミノ酸置換は、いずれも、配列番号１８を参照配列として適宜読み替えできる。すなわち、例えば、ここでいう「Ｌｙｓ５８Ａｓｎ」は、配列番号１０の５８番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換されるアミノ酸置換として、「Ａｓｎ３Ｈｉｓ」は、配列番号１８の３番目のアスパラギン酸がヒスチジンに置換されるアミノ酸置換として、それぞれ読み替えできる。他のアミノ酸配列を参照配列とする場合も同様である。 All of the above amino acid substitutions (i) to (v) can be read as appropriate using SEQ ID NO: 10 as a reference sequence. In addition, all of the amino acid substitutions (I) to (IV) above can be read as appropriate using SEQ ID NO: 18 as a reference sequence. That is, for example, "Lys58Asn" here is an amino acid substitution in which the 58th aspartic acid of SEQ ID NO: 10 is replaced with asparagine, and "Asn3His" is an amino acid substitution in which the 3rd aspartic acid of SEQ ID NO: 18 is replaced with histidine. Each can be read as an amino acid substitution. The same applies when other amino acid sequences are used as reference sequences.
本明細書では、配列番号１に記載のアミノ酸配列において上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を、「配列番号１由来置換アミノ酸配列」ともいう。配列番号１由来置換アミノ酸配列は、言い換えると、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）が生じた配列番号１に記載のアミノ酸配列である。また、配列番号１由来置換アミノ酸配列は、言い換えると、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有すること以外は配列番号１に記載のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列である。 In this specification, an amino acid sequence having the above-exemplified amino acid substitution in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 (i.e., an amino acid substitution at the specific position and optionally another amino acid substitution such as Gly29Ala) is referred to as "substitution derived from SEQ ID NO: 1". Also called amino acid sequence. In other words, the substituted amino acid sequence derived from SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in which the amino acid substitutions exemplified above (that is, the amino acid substitutions at the specific positions and optionally other amino acid substitutions such as Gly29Ala) have occurred. In other words, the substituted amino acid sequence derived from SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 except for having the amino acid substitutions exemplified above (i.e., amino acid substitution at the specific position and optionally other amino acid substitutions such as Gly29Ala). The amino acid sequence is the same as the sequence.
また、改変型アミノ酸配列としては、上記例示した改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１由来置換アミノ酸配列）のバリアント（ｖａｒｉａｎｔ）配列も挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、上記例示した改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１由来置換アミノ酸配列）のバリアント配列を含み、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。以下、配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列の場合を例示して説明するが、当該説明は任意の改変型アミノ酸配列のバリアント配列にも準用できる。 Further, examples of modified amino acid sequences include variant sequences of the modified amino acid sequences exemplified above (for example, substituted amino acid sequences derived from SEQ ID NO: 1). That is, the immunoglobulin-binding protein of the present invention includes a protein that includes a variant sequence of the modified amino acid sequence exemplified above (for example, a substituted amino acid sequence derived from SEQ ID NO: 1) and has immunoglobulin-binding activity. Hereinafter, the case of a variant sequence of a substituted amino acid sequence derived from SEQ ID NO: 1 will be explained as an example, but the explanation can be applied mutatis mutandis to a variant sequence of any modified amino acid sequence.
配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列は、前記特定位置におけるアミノ酸置換が残存するように（すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が前記特定位置におけるアミノ酸置換を有するように）設定されるものとする。また、配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列は、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換が残存するように（すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質がＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換を有するように）設定されてもよい。また、配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列は、例えば、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）から選択される、配列番号１由来置換アミノ酸配列が有さない１つ以上のアミノ酸置換を追加的に有していてもよい。例えば、配列番号１由来置換アミノ酸配列がＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換を有さない場合に、配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列がＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換を有していてもよい。 A variant sequence of the substituted amino acid sequence derived from SEQ ID NO: 1 is one that is set so that the amino acid substitution at the specific position remains (that is, the immunoglobulin binding protein of the present invention has the amino acid substitution at the specific position). shall be. In addition, the variant sequence of the substituted amino acid sequence derived from SEQ ID NO: 1 is such that other amino acid substitutions such as Gly29Ala remain (i.e., such that the immunoglobulin binding protein of the present invention has other amino acid substitutions such as Gly29Ala). May be set. In addition, variant sequences of the substituted amino acid sequence derived from SEQ ID NO: 1 include, for example, substitutions derived from SEQ ID NO: 1 selected from the amino acid substitutions exemplified above (i.e., amino acid substitution at the specific position and optionally other amino acid substitutions such as Gly29Ala). It may additionally have one or more amino acid substitutions that the amino acid sequence does not have. For example, when the substituted amino acid sequence derived from SEQ ID NO: 1 does not have other amino acid substitutions such as Gly29Ala, a variant sequence of the substituted amino acid sequence derived from SEQ ID NO: 1 may have other amino acid substitutions such as Gly29Ala.
配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列としては、配列番号１由来置換アミノ酸配列において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列が挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、免疫グロブリン結合活性を有する限り、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）に加えて、さらに、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含んでいてもよい。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有し、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含み、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。言い換えると、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有し、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むこと以外は配列番号１と同一のアミノ酸配列を含み、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質であってもよい。なお、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、前記特定位置におけるアミノ酸置換が残存するように選択されるものとする。すなわち、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、例えば、前記特定位置以外の位置に生じてよい。また、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換が残存するように選択されてもよい。すなわち、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、例えば、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換以外の位置に生じてもよい。また、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、例えば、上記例示したアミノ酸置換から選択される、配列番号１由来置換アミノ酸配列が有さない１つ以上のアミノ酸置換を含んでいてもよい。前記「１もしくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１から３０個、１から２０個、１から１０個、１から９個、１から８個、１から７個、１から６個、１から５個、１から４個、１から３個、１から２個、１個のいずれかを意味する。上記のアミノ酸残基の置換の一例としては、物理的性質および／または化学的性質が類似したアミノ酸間で置換が生じる保守的置換が挙げられる。保守的置換の場合、一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間での置換があげられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社，９，２００５）。また、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加には、例えば、タンパク質またはそれをコードする遺伝子が由来する微生物の個体差や種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ミュータント（ｍｕｔａｎｔ）またはバリアント（ｖａｒｉａｎｔ））によって生じるものも含まれる。 Variant sequences of the substituted amino acid sequence derived from SEQ ID NO: 1 include substitutions, deletions, insertions, and/or additions of one or several amino acid residues at one or several positions in the substituted amino acid sequence derived from SEQ ID NO: 1. Examples include amino acid sequences containing. That is, as long as the immunoglobulin-binding protein of the present invention has immunoglobulin-binding activity, in addition to the amino acid substitutions exemplified above (i.e., the amino acid substitution at the specific position and optionally other amino acid substitutions such as Gly29Ala), The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 may contain substitutions, deletions, insertions, and/or additions of one or several amino acid residues at one or several positions. That is, the immunoglobulin-binding protein of the present invention includes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, provided that, in the amino acid sequence, the amino acid substitutions exemplified above (i.e., the amino acid substitutions at the specific positions and optionally other amino acid substitutions such as Gly29Ala) are made. (amino acid substitution)) and further contains substitutions, deletions, insertions, and/or additions of one or several amino acid residues at one or several positions, and also has immunoglobulin binding activity. Can be mentioned. In other words, the immunoglobulin-binding protein of the present invention has, for example, the amino acid substitutions exemplified above (i.e., the amino acid substitutions at the specific positions and optionally other amino acid substitutions such as Gly29Ala), and further has one or several positions. A protein that contains the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1, except that it contains one or several amino acid residue substitutions, deletions, insertions, and/or additions, and has immunoglobulin binding activity. Good too. The above amino acid residue substitutions, deletions, insertions, and/or additions are selected such that the amino acid substitution at the specific position remains. That is, the above-mentioned substitution, deletion, insertion, and/or addition of amino acid residues may occur, for example, at positions other than the above-mentioned specific positions. Furthermore, the above amino acid residue substitutions, deletions, insertions, and/or additions may be selected such that other amino acid substitutions such as Gly29Ala remain. That is, the above amino acid residue substitutions, deletions, insertions, and/or additions may occur at positions other than other amino acid substitutions such as, for example, Gly29Ala. In addition, the substitution, deletion, insertion, and/or addition of the above amino acid residues may be, for example, one or more amino acid substitutions selected from the amino acid substitutions exemplified above that are not present in the substituted amino acid sequence derived from SEQ ID NO: 1. May contain. The above-mentioned "one or several" varies depending on the position of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein and the type of amino acid residue, but specifically, for example, 1 to 30, 1 to 20, 1 to 20, or 1 to 20. 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, or 1 do. An example of the above amino acid residue substitutions includes conservative substitutions in which amino acids with similar physical and/or chemical properties are substituted. It is known by those skilled in the art that in the case of conservative substitutions, the protein function is generally maintained between the protein in which the substitution has occurred and the protein in which the substitution has not occurred. Examples of conservative substitutions include substitutions between glycine and alanine, between serine and proline, or between glutamic acid and alanine (Protein Structure and Function, Medical Science International, Inc., 9, 2005). In addition, the above-mentioned substitutions, deletions, insertions, and/or additions of amino acid residues may occur naturally, for example, due to individual differences or species differences in the microorganism from which the protein or the gene encoding it is derived. Also included are those caused by mutations (mutants or variants).
また、配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列としては、配列番号１由来置換アミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列も挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列において上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。なお、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化は、前記特定位置におけるアミノ酸置換が残存するように選択されるものとする。すなわち、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化は、例えば、前記特定位置以外の位置に生じてよい。また、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化は、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換が残存するように選択されてもよい。すなわち、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化は、例えば、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換以外の位置に生じてもよい。また、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化は、例えば、上記例示したアミノ酸置換から選択される、配列番号１由来置換アミノ酸配列が有さない１つ以上のアミノ酸置換を含んでいてもよい。前記「相同性」とは、類似性（Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味してよく、特に同一性を意味してもよい。「アミノ酸配列に対する相同性」とは、アミノ酸配列全体に対する相同性を意味する。前記「高い相同性」とは、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の相同性を意味してよい。アミノ酸配列間の「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率を意味する（実験医学 ２０１３年２月号 Ｖｏｌ．３１ Ｎｏ．３、羊土社）。アミノ酸配列間の「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率と側鎖の性質が類似したアミノ酸残基の比率の合計を意味する（実験医学 ２０１３年２月号 Ｖｏｌ．３１ Ｎｏ．３、羊土社）。側鎖の性質が類似したアミノ酸残基については上述の通りである。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）やＦＡＳＴＡ等のアラインメントプログラムを利用して決定できる。 Variant sequences of the substituted amino acid sequence derived from SEQ ID NO: 1 also include amino acid sequences that have high homology to the substituted amino acid sequence derived from SEQ ID NO: 1. That is, the immunoglobulin-binding protein of the present invention includes an amino acid sequence having the amino acid substitutions exemplified above (i.e., amino acid substitutions at the specific positions and optionally other amino acid substitutions such as Gly29Ala) in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. Also included are proteins that contain an amino acid sequence with high homology to and have immunoglobulin binding activity. Note that changes in the amino acid sequence within the range of homology as described above are selected such that the amino acid substitution at the specific position remains. That is, a change in the amino acid sequence within the range of homology as described above may occur, for example, at a position other than the specific position. Furthermore, changes in the amino acid sequence within the range of homology as described above may be selected such that other amino acid substitutions such as Gly29Ala remain. That is, changes in the amino acid sequence within the range of homology as described above may occur, for example, at positions other than other amino acid substitutions such as Gly29Ala. In addition, changes in the amino acid sequence within the range of homology as described above include, for example, one or more amino acid substitutions selected from the amino acid substitutions exemplified above that are not present in the substituted amino acid sequence derived from SEQ ID NO: 1. You can stay there. The term "homology" may mean similarity or identity, and may particularly mean identity. "Homology to an amino acid sequence" means homology to the entire amino acid sequence. The above-mentioned "high homology" may mean a homology of 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more. "Identity" between amino acid sequences refers to the ratio of amino acid residues of the same type in those amino acid sequences (Jikken Igaku February 2013 issue Vol. 31 No. 3, Yodosha) . "Similarity" between amino acid sequences means the sum of the ratio of amino acid residues of the same type and the ratio of amino acid residues with similar side chain properties in those amino acid sequences (Experimental Medicine 2013 February issue Vol. 31 No. 3, Yodosha). Amino acid residues with similar side chain properties are as described above. Amino acid sequence homology can be determined using alignment programs such as BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) and FASTA.
また改変型アミノ酸配列としては、上記例示したバリアント配列において、さらに、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列も挙げられる。例えば、改変型アミノ酸配列は、少なくとも前記特定位置におけるアミノ酸置換を有するバリアント配列において、さらにＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列であってよい。 In addition, the modified amino acid sequence includes, in the above-exemplified variant sequence, one or more amino acids selected from the above-exemplified amino acid substitutions (i.e., amino acid substitution at the specific position and optionally other amino acid substitutions such as Gly29Ala). Also included are amino acid sequences with substitutions. For example, the modified amino acid sequence may be a variant sequence having an amino acid substitution at least at the specific position, and may also be an amino acid sequence having another amino acid substitution such as Gly29Ala.
また非改変型アミノ酸配列としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）のバリアント配列も挙げられる。すなわち、改変型アミノ酸配列としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）のバリアント配列において、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列も挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）のバリアント配列を含み、ただし当該バリアント配列において、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有し、かつ免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。言い換えると本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、上記例示したアミノ酸置換を有すること以外は上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）のバリアント配列と同一のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。以下、配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列の場合を例示して説明するが、当該説明は任意の非改変型アミノ酸配列のバリアント配列にも準用できる。 The unmodified amino acid sequence also includes a variant sequence of the unmodified amino acid sequence exemplified above (for example, the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1). That is, the modified amino acid sequence includes the above-exemplified amino acid substitution (i.e., amino acid substitution at the specific position and optionally Gly29Ala Also included are amino acid sequences having other amino acid substitutions such as. That is, the immunoglobulin-binding protein of the present invention includes a variant sequence of the above-exemplified non-modified amino acid sequence (for example, the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1), provided that the above-exemplified amino acid substitution ( That is, proteins having an amino acid substitution at the specific position and optionally another amino acid substitution such as Gly29Ala) and having immunoglobulin binding activity are also included. In other words, the immunoglobulin-binding protein of the present invention has, for example, the same amino acid as the variant sequence of the unmodified amino acid sequence exemplified above (for example, the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1) except for having the amino acid substitutions exemplified above. It may also be a protein containing a sequence. Hereinafter, the case of a variant sequence of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 will be explained as an example, but the explanation can be applied mutatis mutandis to a variant sequence of any non-modified amino acid sequence.
配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列が挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含み、さらに上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有し、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、例えば、前記特定位置以外の位置に生じてよい。また、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、例えば、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換以外の位置に生じてもよい。 Variant sequences of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 include substitutions, deletions, and insertions of one or several amino acid residues at one or several positions in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. or an amino acid sequence containing an addition. That is, the immunoglobulin-binding protein of the present invention includes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, provided that the amino acid sequence contains one or several amino acid residue substitutions or deletions at one or several positions. Proteins that include deletions, insertions, and/or additions, and further have the amino acid substitutions exemplified above (i.e., amino acid substitutions at the specific positions and optionally other amino acid substitutions such as Gly29Ala), and have immunoglobulin binding activity. Can be mentioned. The above amino acid residue substitutions, deletions, insertions, and/or additions may occur, for example, at positions other than the above-mentioned specific positions. Furthermore, the above-mentioned substitutions, deletions, insertions, and/or additions of amino acid residues may occur at positions other than other amino acid substitutions such as, for example, Gly29Ala.
配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列も挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列（配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列）において、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有し、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。上記のような相同性の範囲でのアミノ酸残基の変化は、例えば、前記特定位置以外の位置に生じてよい。また、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸残基の変化は、例えば、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換以外の位置に生じてもよい。 Variant sequences of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 also include amino acid sequences that have high homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. That is, the immunoglobulin-binding protein of the present invention includes an amino acid sequence having high homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, provided that the amino acid sequence (with respect to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1) Also included are proteins that have the amino acid substitutions exemplified above (i.e., amino acid substitutions at the specific positions and optionally other amino acid substitutions such as Gly29Ala) in the amino acid sequences with high homology) and have immunoglobulin binding activity. . Changes in amino acid residues within the range of homology as described above may occur, for example, at positions other than the above-mentioned specific positions. Furthermore, changes in amino acid residues within the range of homology as described above may occur, for example, at positions other than other amino acid substitutions such as Gly29Ala.
その他、配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列については、配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列についての記載を準用できる。 In addition, regarding the variant sequence of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, the description regarding the variant sequence of the substituted amino acid sequence derived from SEQ ID NO: 1 can be applied mutatis mutandis.
「配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸」とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端から数えてＸ位の位置に存在するアミノ酸を意味する。あるアミノ酸配列における「配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸に相当するアミノ酸残基」とは、当該あるアミノ酸配列におけるアミノ酸残基であって、当該あるアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列とのアライメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）において配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸と同一の位置に配列されるアミノ酸残基を意味する。例えば、Ｌｙｓ７Ｖａｌのアミノ酸置換の場合、あるアミノ酸配列における「配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基」とは、当該あるアミノ酸配列におけるアミノ酸残基であって、当該あるアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列とのアライメントにおいて配列番号１に示すアミノ酸配列における７番目のリジンと同一の位置に配列されるアミノ酸残基を意味する。なお、配列番号１に記載のアミノ酸配列における「配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸に相当するアミノ酸残基」とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸そのものを意味する。すなわち、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）の位置は、必ずしも本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質における絶対的な位置を示すものではなく、配列番号１に記載のアミノ酸配列に基づく相対的な位置を示すものである。すなわち、例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が、上記例示したアミノ酸置換の位置よりもＮ末端側にアミノ酸残基の挿入、欠失、または付加を含む場合、それに応じて当該アミノ酸置換の絶対的な位置は変動し得る。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質における上記例示したアミノ酸置換の位置は、例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質のアミノ酸配列と配列番号１に記載のアミノ酸配列とのアライメント特定できる。前記アライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のアライメントプログラムを利用して実施できる。配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列等の任意のアミノ酸配列における上記例示したアミノ酸置換の位置についても同様である。また、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）の置換前のアミノ酸残基は、配列番号１に記載のアミノ酸配列における置換前のアミノ酸残基の種類を示すものであって、配列番号１に記載のアミノ酸配列以外の非改変型アミノ酸配列においては保存されていてもよく、いなくてもよい。 The "X-th amino acid in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1" means the amino acid present at position X counting from the N-terminus of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. In a certain amino acid sequence, "the amino acid residue corresponding to the X-th amino acid in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1" is an amino acid residue in the certain amino acid sequence, and is a combination of the certain amino acid sequence and the amino acid of SEQ ID NO: 1. Refers to an amino acid residue that is arranged at the same position as the X-th amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in alignment with the sequence. For example, in the case of Lys7Val amino acid substitution, the "amino acid residue corresponding to the 7th lysine of SEQ ID NO: 1" in a certain amino acid sequence is the amino acid residue in the certain amino acid sequence, and the amino acid residue in the certain amino acid sequence and the sequence Refers to the amino acid residue arranged at the same position as the 7th lysine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in alignment with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. In addition, in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, "the amino acid residue corresponding to the X-th amino acid in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1" refers to the X-th amino acid itself in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. means. That is, the positions of the amino acid substitutions exemplified above (i.e., the amino acid substitutions at the specific positions and optionally other amino acid substitutions such as Gly29Ala) do not necessarily indicate the absolute positions in the immunoglobulin-binding protein of the present invention, It shows the relative position based on the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. That is, for example, when the immunoglobulin-binding protein of the present invention contains an insertion, deletion, or addition of an amino acid residue on the N-terminal side of the position of the amino acid substitution exemplified above, the absolute value of the amino acid substitution is determined accordingly. location may vary. The position of the above-exemplified amino acid substitution in the immunoglobulin-binding protein of the present invention can be determined, for example, by alignment of the amino acid sequence of the immunoglobulin-binding protein of the present invention and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. The alignment can be performed using an alignment program such as BLAST or FASTA, for example. The same applies to the positions of amino acid substitutions exemplified above in any amino acid sequence such as a variant sequence of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. Furthermore, the amino acid residue before the substitution in the above-exemplified amino acid substitution (that is, the amino acid substitution at the specific position and optionally other amino acid substitution such as Gly29Ala) is the amino acid residue before the substitution in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. It may or may not be conserved in non-modified amino acid sequences other than the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、改変型アミノ酸配列を１個のみ含んでいてもよく、改変型アミノ酸配列を複数個含んでいてもよい。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、改変型アミノ酸配列を２個以上、３個以上、４個以上、または５個以上含んでいてもよく、１０個以下、７個以下、５個以下、４個以下、３個以下、または２個以下含んでいてもよく、それらの矛盾しない組み合わせの個数含んでいてもよい。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が複数個の改変型アミノ酸配列を含む場合、それら複数個の改変型アミノ酸配列のアミノ酸配列は同一であってもよく、そうでなくてもよい。それら複数個の改変型アミノ酸配列は、例えば、適切なリンカーを介して互いに連結されていてよい。 The immunoglobulin binding protein of the present invention may contain only one modified amino acid sequence, or may contain multiple modified amino acid sequences. The immunoglobulin-binding protein of the present invention may contain, for example, 2 or more, 3 or more, 4 or more, or 5 or more modified amino acid sequences, and 10 or less, 7 or less, or 5 or less. , 4 or less, 3 or less, or 2 or less, or any consistent combination thereof. When the immunoglobulin binding protein of the present invention includes a plurality of modified amino acid sequences, the amino acid sequences of the plurality of modified amino acid sequences may or may not be the same. The plurality of modified amino acid sequences may be linked to each other, for example, via a suitable linker.
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、改変型アミノ酸配列からなるものであってもよく、他のアミノ酸配列（例えばオリゴペプチド）をさらに含んでいてもよい。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、そのＮ末端側またはＣ末端側に他のアミノ酸配列をさらに含んでいてもよい。言い換えると、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質においては、例えば、改変型アミノ酸配列のＮ末端側またはＣ末端側に他のアミノ酸配列が付加されていてもよい。他のアミノ酸配列は、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の免疫グロブリン結合性や安定性を損なわない限り、特に制限されない。例えば、他のアミノ酸配列の種類や長さは、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の免疫グロブリン結合性や安定性を損なわない限り、特に制限されない。 The immunoglobulin-binding protein of the present invention may consist of a modified amino acid sequence, and may further contain other amino acid sequences (for example, oligopeptides). That is, the immunoglobulin-binding protein of the present invention may further include other amino acid sequences, for example, on its N-terminal side or C-terminal side. In other words, in the immunoglobulin-binding protein of the present invention, another amino acid sequence may be added, for example, to the N-terminus or C-terminus of the modified amino acid sequence. Other amino acid sequences are not particularly limited as long as they do not impair the immunoglobulin binding properties or stability of the immunoglobulin binding protein of the present invention. For example, the type and length of other amino acid sequences are not particularly limited as long as they do not impair the immunoglobulin binding properties or stability of the immunoglobulin binding protein of the present invention.
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、選択した免疫グロブリン結合ドメインに加えて、他の免疫グロブリン結合ドメインの一部を含んでいてもよい。例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質がドメインＣの改変型アミノ酸配列を含む場合、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、さらに、ＳｐＡのドメインＣのＮ末端側領域（ドメインＥ、ドメインＤ、ドメインＡ、ドメインＢ／Ｚ）の一部を含んでいてもよく、ＳｐＡのドメインＣのＣ末端側領域の一部を含んでいてもよい。 The immunoglobulin-binding protein of the present invention may, for example, contain a portion of another immunoglobulin-binding domain in addition to the selected immunoglobulin-binding domain. For example, when the immunoglobulin-binding protein of the present invention contains a modified amino acid sequence of domain C, the immunoglobulin-binding protein of the present invention further comprises the N-terminal region of domain C of SpA (domain E, domain D, domain A, domain B/Z), or a part of the C-terminal region of domain C of SpA.
また本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、そのＮ末端側またはＣ末端側に、目的物を特異的に検出または分離する目的で有用なオリゴペプチドを含んでいてもよい。そのようなオリゴペプチドとしては、ポリヒスチジンやポリアルギニンが挙げられる。 Further, the immunoglobulin-binding protein of the present invention may contain, for example, an oligopeptide useful for specifically detecting or separating a target substance at its N-terminal side or C-terminal side. Such oligopeptides include polyhistidine and polyarginine.
また本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、そのＮ末端側またはＣ末端側に、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質をクロマトグラフィー用の支持体等の固相に固定化する際に有用なオリゴペプチドを含んでいてもよい。そのようなオリゴペプチドとしては、リジンやシステインを含むオリゴペプチドが挙げられる。 Further, the immunoglobulin-binding protein of the present invention has, for example, its N-terminal side or C-terminal side, which is useful when immobilizing the immunoglobulin-binding protein of the present invention on a solid phase such as a support for chromatography. It may also contain oligopeptides. Such oligopeptides include oligopeptides containing lysine and cysteine.
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が上記のような他のアミノ酸配列を含む場合、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、予め他のアミノ酸配列を含む形態で製造されてもよいし、別途製造された上記のような他のアミノ酸配列が付加されてもよい。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が上記のような他のアミノ酸配列を含む場合、典型的には、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、上記のような他のアミノ酸配列を含む本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の全長アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドから発現させることで製造できる。すなわち、例えば、他のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質（例えば他のアミノ酸配列を含まないもの）をコードするポリヌクレオチドとを、他のアミノ酸配列が本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加されるように連結し、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させてもよい。また例えば、化学的に合成した他のアミノ酸配列を本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質（例えば他のアミノ酸配列を含まないもの）のＮ末端側またはＣ末端側に化学的に結合させてもよい。 When the immunoglobulin-binding protein of the present invention contains other amino acid sequences as described above, the immunoglobulin-binding protein of the present invention may be produced in advance in a form containing the other amino acid sequences, or may be separately produced. Other manufactured amino acid sequences such as those described above may be added. When the immunoglobulin binding protein of the invention comprises other amino acid sequences as described above, typically the immunoglobulin binding protein of the invention comprises the immunoglobulin binding protein of the invention comprising other amino acid sequences as described above. It can be produced by expressing a polynucleotide encoding the full-length amino acid sequence of a globulin-binding protein. That is, for example, a polynucleotide encoding another amino acid sequence and a polynucleotide encoding an immunoglobulin-binding protein of the present invention (e.g., one that does not contain the other amino acid sequence) may be used to The immunoglobulin-binding protein of the present invention may be expressed by linking to the N-terminus or C-terminus of the globulin-binding protein. For example, another chemically synthesized amino acid sequence may be chemically bonded to the N-terminus or C-terminus of the immunoglobulin-binding protein of the present invention (for example, one that does not contain other amino acid sequences).
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドから発現させることで製造できる。本明細書では、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、「本発明のポリヌクレオチド」ともいう。本発明のポリヌクレオチドは、具体的には、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであってよい。 The immunoglobulin-binding protein of the present invention can be produced, for example, by expressing it from a polynucleotide encoding the immunoglobulin-binding protein of the present invention. In this specification, the polynucleotide encoding the immunoglobulin-binding protein of the present invention is also referred to as the "polynucleotide of the present invention." The polynucleotide of the present invention may specifically be a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding an immunoglobulin binding protein of the present invention.
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、化学合成法、またはＰＣＲ法等のＤＮＡ増幅法により取得できる。ＤＮＡ増幅法は、例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするヌクレオチド配列等の増幅すべきヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを鋳型として実施できる。鋳型とするポリヌクレオチドとしては、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する生物のゲノムＤＮＡ、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質のｃＤＮＡ、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質のアミノ酸配列からの変換により設計できる。アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際には、標準のコドンテーブルを使用できるが、本発明のポリヌクレオチドで形質転換する宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドン（ｒａｒｅ ｃｏｄｏｎ）であるため）、それらのコドンを避けるように変換してよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のウェブサイトにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。 The polynucleotide of the present invention can be obtained, for example, by a chemical synthesis method or a DNA amplification method such as a PCR method. The DNA amplification method can be carried out using, for example, as a template a polynucleotide containing a nucleotide sequence to be amplified, such as a nucleotide sequence encoding the immunoglobulin-binding protein of the present invention. Examples of the polynucleotide used as a template include genomic DNA of an organism expressing the immunoglobulin-binding protein of the present invention, cDNA of the immunoglobulin-binding protein of the present invention, and vectors containing the polynucleotide of the present invention. The nucleotide sequence of the polynucleotide of the present invention can be designed, for example, by conversion from the amino acid sequence of the immunoglobulin-binding protein of the present invention. When converting an amino acid sequence into a nucleotide sequence, a standard codon table can be used, but it is preferable to perform the conversion in consideration of the codon usage frequency in the host to be transformed with the polynucleotide of the present invention. For example, if the host is Escherichia coli, arginine (Arg) is AGA/AGG/CGG/CGA, isoleucine (Ile) is ATA, leucine (Leu) is CTA, and glycine (Gly) is GGA. However, in proline (Pro), CCC is used less frequently (because it is a so-called rare codon), so it may be converted to avoid these codons. Analysis of codon usage frequency can also be performed by using public databases (eg, Codon Usage Database on the Kazusa DNA Research Institute website).
また本発明のポリヌクレオチドは、例えば、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有さない免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに、コードされるタンパク質が上記例示したアミノ酸置換を有するように変異を導入することによっても、取得できる。上記例示したアミノ酸置換を有さない免疫グロブリン結合性タンパク質としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列またはそのバリアント配列）を含むタンパク質が挙げられる。上記例示したアミノ酸置換を有さない免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、化学合成法、またはＰＣＲ法等のＤＮＡ増幅法で取得できる。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が２つ以上のアミノ酸置換を有する場合、それらのアミノ酸置換は、例えば、同時に、または順次、導入されてよい。例えば、上記例示したアミノ酸置換から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに、コードされるタンパク質が上記例示したアミノ酸置換から選択される別の少なくとも１つのアミノ酸置換を有するように変異を導入してもよい。また、ある位置のアミノ酸残基を２回以上改変してもよい。例えば、既にＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質をさらにＬｙｓ５８Ａｓｎのアミノ酸置換を導入してもよい。 Furthermore, the polynucleotide of the present invention can be, for example, a polynucleotide encoding an immunoglobulin-binding protein that does not have the amino acid substitutions exemplified above (i.e., the amino acid substitution at the specific position and optionally other amino acid substitutions such as Gly29Ala). It can also be obtained by introducing mutations so that the encoded protein has the amino acid substitutions exemplified above. Examples of immunoglobulin-binding proteins without the amino acid substitutions exemplified above include proteins containing the unmodified amino acid sequence exemplified above (for example, the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a variant sequence thereof). A polynucleotide encoding an immunoglobulin-binding protein that does not have the amino acid substitutions exemplified above can be obtained, for example, by a chemical synthesis method or a DNA amplification method such as a PCR method. If the immunoglobulin binding protein of the invention has two or more amino acid substitutions, the amino acid substitutions may be introduced simultaneously or sequentially, for example. For example, in a polynucleotide encoding an immunoglobulin binding protein having at least one amino acid substitution selected from the amino acid substitutions exemplified above, the encoded protein has at least one other amino acid substitution selected from the amino acid substitutions exemplified above. Mutations may be introduced to have substitutions. Furthermore, an amino acid residue at a certain position may be modified two or more times. For example, an immunoglobulin binding protein that already has an amino acid substitution of Lys58Asp may be further introduced with an amino acid substitution of Lys58Asn.
またポリヌクレオチドは、上記例示したアミノ酸置換を生じる変異に限られず、バリアント配列の構築のための変異等の任意の変異を導入して、本発明のポリヌクレオチドまたはそれを取得するための材料として利用してよい。 Furthermore, the polynucleotide can be used as the polynucleotide of the present invention or as a material for obtaining it by introducing any mutations such as mutations for constructing variant sequences, not limited to the mutations that result in amino acid substitutions as exemplified above. You may do so.
ポリヌクレオチドへ変異を導入する方法としては、エラープローンＰＣＲ法が挙げられる。エラープローンＰＣＲ法における反応条件は、ポリヌクレオチドに所望の変異を導入できる条件であれば特に制限されない。例えば、基質である４種類のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）の濃度を不均一にし、ＭｎＣｌ２を０．０１から１０ｍＭ（好ましくは０．１から１ｍＭ）の濃度でＰＣＲ反応液に添加してＰＣＲを行なうことで、ポリヌクレオチドに変異を導入できる。 An example of a method for introducing mutations into polynucleotides is error prone PCR. The reaction conditions in the error-prone PCR method are not particularly limited as long as they can introduce the desired mutation into the polynucleotide. For example, the concentrations of the four types of deoxynucleotides (dATP/dTTP/dCTP/dGTP) that are substrates are made uneven, and MnCl 2 is added to the PCR reaction solution at a concentration of 0.01 to 10 mM (preferably 0.1 to 1 mM). Mutations can be introduced into polynucleotides by adding them and performing PCR.
また、ポリヌクレオチドへ変異を導入する方法としては、インバースＰＣＲ法も挙げられる。インバースＰＣＲ法は、まず目的とする遺伝子を挿入したポリヌクレオチドを変性させた後、変異プライマーをアニーリングさせ、ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行なう。伸長したポリヌクレオチドを制限酵素ＤｐｎＩを用いて選択的に切断し、新たに合成された遺伝子をリン酸化、ライゲーションを実施し、環化させることでポリヌクレオチドに変異を導入できる。 Further, as a method for introducing mutations into polynucleotides, inverse PCR method can also be mentioned. In the inverse PCR method, first, a polynucleotide into which a gene of interest has been inserted is denatured, then a mutant primer is annealed, and an extension reaction is performed using DNA polymerase. Mutations can be introduced into the polynucleotide by selectively cleaving the elongated polynucleotide using the restriction enzyme DpnI, phosphorylating the newly synthesized gene, ligating it, and cyclizing it.
さらにポリヌクレオチドへ変異を導入する方法としては、前述したエラープローンＰＣＲ法やインバースＰＣＲ法以外にも、ポリヌクレオチドに変異原となる薬剤を作用させること、または、ポリヌクレオチドに紫外線を照射すること、ポリヌクレオチドに変異を導入する方法が挙げられる。変異原となる薬剤としては、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン等の、当業者が通常用いる変異原性薬剤が挙げられる。このようなポリヌクレオチドへ変異を導入する方法は、上記例示したアミノ酸置換の導入に限られず、バリアント配列の構築（例えば、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加の導入や、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化）にも利用できる。 Furthermore, methods for introducing mutations into polynucleotides include, in addition to the error-prone PCR method and inverse PCR method described above, applying a mutagenic drug to the polynucleotide, or irradiating the polynucleotide with ultraviolet light. Examples include methods of introducing mutations into polynucleotides. Examples of mutagenic agents include mutagenic agents commonly used by those skilled in the art, such as hydroxylamine, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, nitrous acid, sulfite, and hydrazine. Methods for introducing mutations into such polynucleotides are not limited to introducing amino acid substitutions as exemplified above, but also include constructing variant sequences (for example, introducing amino acid residue substitutions, deletions, insertions, and/or additions, It can also be used for changes in the amino acid sequence within the range of homology as described above.
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、その全長配列を一括して取得してもよく、その部分配列をそれぞれ取得して連結すること取得してもよい。上記のような本発明のポリヌクレオチドを取得する手法についての説明は、その全長配列を一括して取得する場合に限られず、その部分配列を取得する場合にも準用できる。 The polynucleotide of the present invention may be obtained, for example, by obtaining its full-length sequence all at once, or by obtaining its partial sequences and linking them. The above description of the method for obtaining the polynucleotide of the present invention is not limited to the case where the full-length sequence thereof is obtained all at once, but can also be applied mutatis mutandis to the case where the partial sequence thereof is obtained.
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、具体的には、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え宿主に本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させることで製造できる。本明細書では、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え宿主を、「本発明の遺伝子組換え宿主」ともいう。本発明の遺伝子組換え宿主は、本発明のポリヌクレオチドを含むことに依拠して、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現できる。すなわち、本発明の遺伝子組換え宿主は、言い換えると、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現可能な宿主である。 Specifically, the immunoglobulin-binding protein of the present invention can be produced by, for example, expressing the immunoglobulin-binding protein of the present invention in a genetically modified host containing the polynucleotide of the present invention. In this specification, a genetically modified host containing the polynucleotide of the present invention is also referred to as a "genetically modified host of the present invention." The genetically recombinant host of the present invention can express the immunoglobulin binding protein of the present invention by virtue of containing the polynucleotide of the present invention. In other words, the genetically modified host of the present invention is a host capable of expressing the immunoglobulin binding protein of the present invention.
本発明の遺伝子組換え宿主は、例えば、本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換することで得られる。すなわち、本発明の遺伝子組換え宿主は、例えば、本発明のポリヌクレオチドで遺伝子組換え（形質転換）された宿主であってよく、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主であってよく、また本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現可能な宿主であってよい。遺伝子組換えに用いる宿主は、本発明のポリヌクレオチドで形質転換されることで本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現可能な宿主であれば特に制限されない。宿主としては、動物細胞、昆虫細胞、微生物が挙げられる。動物細胞としては、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞が挙げられる。昆虫細胞としては、Ｓｆ９細胞、ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４細胞が挙げられる。微生物としては、酵母や細菌が挙げられる。酵母としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ等のＰｉｃｈｉａ属酵母、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ等のＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母が挙げられる。細菌としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌が挙げられる。大腸菌としては、ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株が挙げられる。なお、酵母や大腸菌を宿主として用いると生産性の面で好ましく、大腸菌を宿主として用いるとさらに好ましい。 The genetically modified host of the present invention can be obtained, for example, by transforming a host using the polynucleotide of the present invention. That is, the genetically modified host of the present invention may be, for example, a host genetically modified (transformed) with the polynucleotide of the present invention, a host containing the polynucleotide of the present invention, or a host containing the polynucleotide of the present invention. The host may be a host capable of expressing an immunoglobulin-binding protein. The host used for genetic recombination is not particularly limited as long as it is a host that can express the immunoglobulin-binding protein of the present invention by being transformed with the polynucleotide of the present invention. Hosts include animal cells, insect cells, and microorganisms. Examples of animal cells include COS cells, CHO (Chinese Hamster Ovary) cells, HeLa cells, NIH3T3 cells, and HEK293 cells. Insect cells include Sf9 cells and BTI-TN-5B1-4 cells. Examples of microorganisms include yeast and bacteria. Examples of yeast include yeasts of the genus Saccharomyces such as Saccharomyces cerevisiae, yeasts of the genus Pichia such as Pichia pastoris, and yeasts of the genus Schizosaccharomyces such as Schizosaccharomyces pombe. Examples include yeast. Examples of bacteria include Escherichia bacteria such as Escherichia coli. Examples of E. coli include JM109 strain and BL21 (DE3) strain. Note that it is preferable to use yeast or E. coli as a host in terms of productivity, and it is more preferable to use E. coli as a host.
本発明のポリヌクレオチドは、発現可能に本発明の遺伝子組換え宿主に保持されていればよい。本発明のポリヌクレオチドは、具体的には、宿主で機能するプロモーターの制御下で発現するように保持されていればよい。宿主で機能するプロモーターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｌｐｐプロモーターが挙げられる。 The polynucleotide of the present invention only needs to be maintained in the genetically modified host of the present invention so that it can be expressed. Specifically, the polynucleotide of the present invention may be maintained so as to be expressed under the control of a promoter that functions in the host. Promoters that function in the host include, for example, when E. coli is used as the host, the trp promoter, tac promoter, trc promoter, lac promoter, T7 promoter, recA promoter, and lpp promoter.
本発明の遺伝子組換え宿主において、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ゲノムＤＮＡ外で自律複製するベクター上に存在していてよい。すなわち、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターとして宿主に導入できる。すなわち、本発明の遺伝子組換え宿主は、一態様において、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主であってよい。本明細書では、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、「本発明の発現ベクター」ともいう。本発明の発現ベクターは、例えば、発現ベクターの適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入することで得られる。なお発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限されない。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合は、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクターを例示できる。発現ベクターは、抗生物質耐性遺伝子等の選択マーカーを備えていてよい。また前記適切な位置とは、発現ベクター複製機能、選択マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモーター等の機能性ポリヌクレオチドに連結された状態で挿入すると好ましい。 In the genetically modified host of the present invention, the polynucleotide of the present invention may be present, for example, on a vector that autonomously replicates outside of the genomic DNA. That is, the polynucleotide of the present invention can be introduced into a host, for example, as an expression vector containing the polynucleotide of the present invention. That is, in one embodiment, the genetically recombinant host of the present invention may be a host containing an expression vector containing the polynucleotide of the present invention. In this specification, an expression vector containing the polynucleotide of the present invention is also referred to as an "expression vector of the present invention." The expression vector of the present invention can be obtained, for example, by inserting the polynucleotide of the present invention into an appropriate position of the expression vector. Note that the expression vector is not particularly limited as long as it can stably exist and replicate within the host to be transformed. Examples of expression vectors include pET plasmid vectors, pUC plasmid vectors, and pTrc plasmid vectors when E. coli is used as a host. The expression vector may be equipped with a selection marker such as an antibiotic resistance gene. Further, the appropriate location means a location that does not destroy regions related to expression vector replication function, selection markers, and transmissibility. When inserting the polynucleotide of the present invention into the expression vector, it is preferably inserted while linked to a functional polynucleotide such as a promoter necessary for expression.
また本発明の遺伝子組換え宿主において、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ゲノムＤＮＡ上に導入されていてもよい。ゲノムＤＮＡへの本発明のポリヌクレオチドの導入は、例えば、相同組み換えによる遺伝子導入法を利用して実施できる。相同組み換えによる遺伝子導入法としては、Ｒｅｄ－ｄｒｉｖｅｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ法（Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ，ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９７：６６４０－６６４５（２０００））等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製起点を含むベクターを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないベクターを用いる方法、ファージを用いたｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ法が挙げられる。 Furthermore, in the genetically modified host of the present invention, the polynucleotide of the present invention may be introduced onto genomic DNA, for example. The polynucleotide of the present invention can be introduced into genomic DNA using, for example, a gene introduction method using homologous recombination. Gene introduction methods using homologous recombination include direct methods such as the Red-driven integration method (Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. NatI. Acad. Sci. USA. 97:6640-6645 (2000)). Examples include a method using stranded DNA, a method using a vector containing a temperature-sensitive replication origin, a method using a vector without a replication origin that functions within the host, and a transduction method using phage.
本発明の発現ベクター等のポリヌクレオチドを用いた宿主の形質転換は、例えば、当業者が通常用いる方法で行なえる。例えば、宿主として大腸菌を選択する場合には、コンピテントセル法、ヒートショック法、エレクトロポレーション法等形質転換できる。形質転換後に適切な方法でスクリーニングすることで、本発明の遺伝子組換え宿主を取得できる。 Transformation of a host using a polynucleotide such as an expression vector of the present invention can be performed, for example, by a method commonly used by those skilled in the art. For example, when selecting Escherichia coli as a host, transformation can be performed using the competent cell method, heat shock method, electroporation method, etc. The genetically modified host of the present invention can be obtained by screening with an appropriate method after transformation.
各種微生物において利用可能な発現ベクターやプロモーター等の遺伝子工学的手法に関する情報については、例えば、「微生物学基礎講座８ 遺伝子工学、共立出版、１９８７年」に詳細に記載されており、それらを利用できる。 Information on genetic engineering methods such as expression vectors and promoters that can be used in various microorganisms is described in detail in, for example, "Basic Microbiology Course 8 Genetic Engineering," Kyoritsu Shuppan, 1987, and can be used. .
本発明の遺伝子組換え宿主が本発明の発現ベクターを含む場合、本発明の遺伝子組換え宿主から本発明の発現ベクターを調製できる。例えば、本発明の遺伝子組換え宿主を培養して得られる培養物からアルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）等の市販の抽出キットを用いて本発明の発現ベクターを調製できる。 When the genetically modified host of the present invention contains the expression vector of the present invention, the expression vector of the present invention can be prepared from the genetically modified host of the present invention. For example, the expression vector of the present invention can be prepared from a culture obtained by culturing the genetically modified host of the present invention using an alkaline extraction method or a commercially available extraction kit such as QIAprep Spin Miniprep kit (manufactured by QIAGEN).
本発明の遺伝子組換え宿主を培養することで、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現できる。また本発明の遺伝子組換え宿主を培養することで、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させ、当該発現したタンパク質を回収することで、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を製造できる。すなわち本発明は、例えば、本発明の遺伝子組換え宿主を培養することで、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させる工程と、発現させた前記タンパク質を回収する工程とを含む、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の製造方法を提供する。培地組成や培養条件は、宿主の種類や本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の特性等の諸条件に応じて適宜設定できる。培地組成や培養条件は、例えば、宿主が増殖でき、かつ本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現できるように設定できる。培地としては、例えば、炭素源、窒素源、無機塩、その他の各種有機成分や無機成分を適宜含有する培地を用いることができる。例えば、宿主が大腸菌の場合、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地（トリプトン １％（ｗ／ｖ）、酵母エキス ０．５％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム １％（ｗ／ｖ））が好ましい培地の一例として挙げられる。なお、本発明の発現ベクターの導入の有無に基づき、本発明の遺伝子組換え宿主を選択的に増殖させるために、培地に当該発現ベクターに含まれる抗生物質耐性遺伝子に対応した抗生物質を添加して培養すると好ましい。例えば、当該発現ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は培地にカナマイシンを添加すればよい。本発明のポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡ上に導入されている場合も同様である。また培地は、グルタチオン、システイン、シスタチン、チオグリコレートおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含有していてもよい。また、培地は、グリシン等の前記遺伝子組換え宿主から培養液へのタンパク質分泌を促す試薬を含有していてもよい。例えば、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で添加すると好ましい。培養温度は、例えば、宿主が大腸菌の場合、一般に１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３７℃、より好ましくは２５℃前後であってよい。培地のｐＨは、例えば、宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４、好ましくはｐＨ７．０前後であってよい。また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を誘導性のプロモーターの制御下で発現する場合は、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が良好に発現できるように誘導をかけると好ましい。発現誘導には、例えば、プロモーターの種類に応じた誘導剤を用いることができる。誘導剤としては、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示できる。例えば、宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）が約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加し、引き続き培養することで、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の発現を誘導できる。ＩＰＴＧの添加濃度は、例えば、０．００５から１．０ｍＭ、好ましくは０．０１から０．５ｍＭであってよい。ＩＰＴＧ誘導等の発現誘導は、例えば、当該技術分野において周知の条件で行なえる。 By culturing the genetically modified host of the present invention, the immunoglobulin-binding protein of the present invention can be expressed. Furthermore, the immunoglobulin-binding protein of the present invention can be produced by culturing the genetically modified host of the present invention to express the immunoglobulin-binding protein of the present invention and collecting the expressed protein. That is, the present invention comprises, for example, the step of culturing the genetically modified host of the present invention to express the immunoglobulin-binding protein of the present invention, and the step of recovering the expressed protein. A method for producing an immunoglobulin binding protein is provided. The medium composition and culture conditions can be appropriately set depending on conditions such as the type of host and the characteristics of the immunoglobulin-binding protein of the present invention. The medium composition and culture conditions can be set, for example, so that the host can proliferate and express the immunoglobulin-binding protein of the present invention. As the medium, for example, a medium containing a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, and other various organic components and inorganic components as appropriate can be used. For example, when the host is E. coli, LB (Luria-Bertani) medium supplemented with necessary nutrients (tryptone 1% (w/v), yeast extract 0.5% (w/v), sodium chloride 1% (w/v) /v)) is mentioned as an example of a preferable medium. Furthermore, in order to selectively propagate the genetically modified host of the present invention based on the presence or absence of the introduction of the expression vector of the present invention, an antibiotic corresponding to the antibiotic resistance gene contained in the expression vector is added to the medium. It is preferable to culture it. For example, if the expression vector contains a kanamycin resistance gene, kanamycin may be added to the medium. The same applies when the polynucleotide of the present invention is introduced onto genomic DNA. The medium may also contain one or more reducing agents selected from the group consisting of glutathione, cysteine, cystatin, thioglycolate, and dithiothreitol. Furthermore, the medium may contain a reagent such as glycine that promotes protein secretion from the genetically modified host into the culture medium. For example, when the host is E. coli, it is preferable to add glycine to the medium at 2% (w/v) or less. For example, when the host is E. coli, the culture temperature may be generally 10°C to 40°C, preferably 20°C to 37°C, more preferably around 25°C. For example, when the host is E. coli, the pH of the medium may be from pH 6.8 to pH 7.4, preferably around pH 7.0. Furthermore, when the immunoglobulin-binding protein of the present invention is expressed under the control of an inducible promoter, it is preferable to induce the immunoglobulin-binding protein of the present invention so that it can be expressed favorably. For expression induction, for example, an inducer depending on the type of promoter can be used. An example of the inducer is IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside). For example, when the host is Escherichia coli, an appropriate amount of IPTG is added when the turbidity (absorbance at 600 nm) of the culture solution becomes about 0.5 to 1.0, and continued culturing is performed to improve the immune system of the present invention. Expression of globulin-binding proteins can be induced. The concentration of IPTG added may be, for example, 0.005 to 1.0 mM, preferably 0.01 to 0.5 mM. Expression induction such as IPTG induction can be performed, for example, under conditions well known in the art.
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、その発現形態に適した方法で培養物から分離して回収できる。なお、本明細書において「培養物」とは、培養で得られた培養液の全体またはその一部を意味する。当該一部は、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を含有する部分であれば特に制限されない。当該一部としては、培養された本発明の遺伝子組換え宿主の細胞や培養後の培地（すなわち培養上清）が挙げられる。例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が培養上清に蓄積する場合、細胞を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を回収できる。また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が細胞内（ペリプラズムを含む）に蓄積する場合、細胞を遠心分離操作回収した後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加することで細胞を破砕して、破砕物から本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を回収できる。培養上清や細胞破砕物からの本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の回収は、例えば、タンパク質の分離精製に用いられる公知の方法で行なえる。そのような方法としては、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点沈殿が挙げられる。 The immunoglobulin-binding protein of the present invention can be separated and recovered from the culture by a method appropriate for its expression form. In addition, in this specification, "culture" means the whole culture solution obtained by culture|cultivation or a part thereof. The part is not particularly limited as long as it contains the immunoglobulin-binding protein of the present invention. The part includes the cultured cells of the genetically modified host of the present invention and the culture medium after culture (ie, culture supernatant). For example, when the immunoglobulin-binding protein of the present invention accumulates in the culture supernatant, the cells can be separated by centrifugation and the immunoglobulin-binding protein of the present invention can be recovered from the resulting culture supernatant. In addition, when the immunoglobulin-binding protein of the present invention accumulates inside cells (including the periplasm), after the cells are collected by centrifugation, the cells can be disrupted by adding an enzyme treatment agent, a surfactant, etc. The immunoglobulin-binding protein of the present invention can be recovered from the crushed product. The immunoglobulin-binding protein of the present invention can be recovered from culture supernatants and cell lysates by, for example, known methods used for protein separation and purification. Such methods include ammonium sulfate fractionation, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, gel filtration chromatography, and isoelectric precipitation.
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、免疫グロブリン（抗体）の分離または分析に使用できる。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、不溶性担体に固定化して使用できる。すなわち、免疫グロブリン（抗体）の分離または分析は、具体的には、例えば、不溶性担体と、当該不溶性担体に固定化された本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質とを含む、免疫グロブリン吸着剤を用いて実施できる。本明細書では、不溶性担体と、当該不溶性担体に固定化された本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質とを含む、免疫グロブリン吸着剤を、「本発明の免疫グロブリン吸着剤」ともいう。なお「免疫グロブリンの分離」とは、夾雑物質共存化の溶液からの免疫グロブリンの分離に限らず、構造、性質または活性等に基づく免疫グロブリン間の分離も含まれる。不溶性担体は特に制限されない。不溶性担体としては、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプン等の多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタン等の合成高分子を原料とした担体や、シリカ等のセラミックスを原料とした担体が例示できる。中でも、多糖質を原料とした担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー社製）等のヒドロキシ基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア社製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ社製）等のセルロースゲルが挙げられる。不溶性担体の形状は特に制限されない。不溶性担体は、例えば、カラムに充填できる形状であってよい。不溶性担体は、例えば、粒状物または非粒状物であってよい。また、不溶性担体は、例えば、多孔性または非多孔性であってもよい。 The immunoglobulin-binding protein of the present invention can be used, for example, in the separation or analysis of immunoglobulins (antibodies). The immunoglobulin-binding protein of the present invention can be used, for example, by being immobilized on an insoluble carrier. That is, the separation or analysis of immunoglobulins (antibodies) is specifically performed using, for example, an immunoglobulin adsorbent containing an insoluble carrier and the immunoglobulin-binding protein of the present invention immobilized on the insoluble carrier. It can be implemented by In this specification, an immunoglobulin adsorbent comprising an insoluble carrier and an immunoglobulin-binding protein of the present invention immobilized on the insoluble carrier is also referred to as an "immunoglobulin adsorbent of the present invention." Note that "separation of immunoglobulins" is not limited to separation of immunoglobulins from a solution in the presence of contaminants, but also includes separation of immunoglobulins based on structure, property, activity, etc. The insoluble carrier is not particularly limited. Examples of insoluble carriers include carriers made from polysaccharides such as agarose, alginate, carrageenan, chitin, cellulose, dextrin, dextran, and starch, as well as polyvinyl alcohol, polymethacrylate, and poly(2-hydroxyethyl methacrylate). Examples include carriers made from synthetic polymers such as polyurethane, and carriers made from ceramics such as silica. Among these, carriers made from polysaccharides and carriers made from synthetic polymers are preferred as insoluble carriers. Examples of the preferred carriers include polymethacrylate gels with introduced hydroxyl groups such as Toyopearl (manufactured by Tosoh Corporation), agarose gels such as Sepharose (manufactured by GE Healthcare Corporation), and cellulose gels such as Cellufine (manufactured by JNC Corporation). It will be done. The shape of the insoluble carrier is not particularly limited. The insoluble carrier may be in a form that can be packed into a column, for example. Insoluble carriers may be, for example, particulate or non-particulate. Insoluble carriers may also be porous or non-porous, for example.
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、共有結合を介して不溶性担体に固定化できる。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、具体的には、例えば、不溶性担体が有する活性基を介して本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質と不溶性担体とを共有結合させることで、不溶性担体に固定化できる。すなわち、不溶性担体は、活性基を有していてよい。不溶性担体は、例えば、その表面に活性基を有していてよい。活性基としては、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、カルボキシ基、マレイミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基、ハロアセトアミドが挙げられる。活性基を有する不溶性担体としては、例えば、活性基を有する市販の不溶性担体をそのまま用いてもよいし、不溶性担体に活性基を導入して用いてもよい。活性基を有する市販の担体としては、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ－Ｅｐｏｘｙ－６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ－Ｔｒｅｓｙｌ－６５０Ｍ（いずれも東ソー社製）、ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ（いずれもＧＥヘルスケア社製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｒｅｓｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）が例示できる。 The immunoglobulin-binding protein of the present invention can be immobilized on an insoluble carrier via, for example, a covalent bond. Specifically, the immunoglobulin-binding protein of the present invention is immobilized on an insoluble carrier, for example, by covalently bonding the immunoglobulin-binding protein of the present invention and the insoluble carrier via an active group possessed by the insoluble carrier. can. That is, the insoluble carrier may have an active group. The insoluble carrier may, for example, have active groups on its surface. Examples of the active group include an N-hydroxysuccinimide (NHS) activated ester group, an epoxy group, a carboxy group, a maleimide group, a haloacetyl group, a tresyl group, a formyl group, and a haloacetamide group. As the insoluble carrier having an active group, for example, a commercially available insoluble carrier having an active group may be used as is, or an active group may be introduced into the insoluble carrier. Commercially available carriers having active groups include TOYOPEARL AF-Epoxy-650M, TOYOPEARL AF-Tresyl-650M (both manufactured by Tosoh Corporation), HiTrap NHS-activated HP Columns, NHS-activated Sepharose. 4 Fast Flow, Epoxy-activated Sepharose 6B (both manufactured by GE Healthcare) and SulfoLink Coupling Resin (manufactured by Thermo Fisher Scientific).
担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在するヒドロキシ基、エポキシ基、カルボキシ基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反応させる方法が例示できる。 Examples of methods for introducing active groups onto the surface of the carrier include a method in which one of the compounds having two or more active sites is reacted with a hydroxy group, epoxy group, carboxy group, amino group, etc. present on the surface of the carrier. .
担体表面に存在するヒドロキシ基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルが例示できる。 Examples of compounds that introduce epoxy groups into hydroxy groups and amino groups present on the surface of the carrier include epichlorohydrin, ethanediol diglycidyl ether, butanediol diglycidyl ether, and hexanediol diglycidyl ether.
また担体表面に存在するエポキシ基にカルボキシ基を導入する化合物としては、２－メルカプト酢酸、３－メルカプトプロピオン酸、４－メルカプト酪酸、６－メルカプト酪酸、グリシン、３－アミノプロピオン酸、４－アミノ酪酸、６－アミノヘキサン酸を例示できる。 Compounds that introduce carboxyl groups into epoxy groups present on the carrier surface include 2-mercaptoacetic acid, 3-mercaptopropionic acid, 4-mercaptobutyric acid, 6-mercaptobutyric acid, glycine, 3-aminopropionic acid, 4-aminopropionic acid, and 4-mercaptobutyric acid. Examples include butyric acid and 6-aminohexanoic acid.
また担体表面に存在するヒドロキシ基、エポキシ基、カルボキシ基、アミノ基にマレイミド基を導入する化合物としては、Ｎ－（ε－マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ－（ε－マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酢酸ヒドラジド、２－アミノマレイミド、３－アミノマレイミド、４－アミノマレイミド、６－アミノマレイミド、１－（４－アミノフェニル）マレイミド、１－（３－アミノフェニル）マレイミド、４－（マレイミド）フェニルイソシアナート、２－マレイミド酢酸、３－マレイミドプロピオン酸、４－マレイミド酪酸、６－マレイミドヘキサン酸、Ｎ－（α－マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボニル－（６－アミノヘキサン酸）、スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸、（ｐ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。 Compounds that introduce maleimide groups into hydroxyl groups, epoxy groups, carboxy groups, and amino groups present on the surface of the carrier include N-(ε-maleimidocaproic acid) hydrazide, N-(ε-maleimidopropionic acid) hydrazide, -(4-N-maleimidophenyl)acetic acid hydrazide, 2-aminomaleimide, 3-aminomaleimide, 4-aminomaleimide, 6-aminomaleimide, 1-(4-aminophenyl)maleimide, 1-(3-aminophenyl) Maleimide, 4-(maleimido) phenyl isocyanate, 2-maleimidoacetic acid, 3-maleimidopropionic acid, 4-maleimidobutyric acid, 6-maleimidohexanoic acid, N-(α-maleimidoacetoxy)succinimide ester, (m-maleimidobenzoyl) N-hydroxysuccinimide ester, succinimidyl-4-(maleimidomethyl)cyclohexane-1-carbonyl-(6-aminohexanoic acid), succinimidyl-4-(maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylic acid, (p-maleimidobenzoyl)N Examples include -hydroxysuccinimide ester and (m-maleimidobenzoyl)N-hydroxysuccinimide ester.
また担体表面に存在するヒドロキシ基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２－（ヨードアセトアミド）酢酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、３－（ブロモアセトアミド）プロピオン酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、４－（ヨードアセチル）アミノ安息香酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。 Compounds that introduce haloacetyl groups into hydroxyl groups or amino groups present on the carrier surface include chloroacetic acid, bromoacetic acid, iodoacetic acid, chloroacetic acid chloride, bromoacetic acid chloride, bromoacetic acid bromide, chloroacetic anhydride, and bromoacetic anhydride. Iodoacetic anhydride, 2-(iodoacetamido)acetic acid-N-hydroxysuccinimide ester, 3-(bromoacetamido)propionic acid-N-hydroxysuccinimide ester, 4-(iodoacetyl)aminobenzoic acid-N-hydroxysuccinimide An example is ester.
また担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在するヒドロキシ基やアミノ基にω－アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω－アルケニル部位をハロゲン化することで活性化する方法も例示できる。ω－アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３－ブテニルグリシジルエーテル、４－ペンテニルグリシジルエーテルを例示できる。ハロゲン化剤としては、Ｎ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミドを例示できる。 In addition, as a method for introducing active groups onto the carrier surface, after reacting ω-alkenyl alkane glycidyl ether with the hydroxyl group or amino group present on the carrier surface, the ω-alkenyl moiety is halogenated with a halogenating agent. A method of activation can also be exemplified. Examples of the ω-alkenyl alkane glycidyl ether include allyl glycidyl ether, 3-butenyl glycidyl ether, and 4-pentenyl glycidyl ether. Examples of the halogenating agent include N-chlorosuccinimide, N-bromosuccinimide, and N-iodosuccinimide.
また担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在するカルボキシ基に対して縮合剤と添加剤を用いて活性基を導入する方法も例示できる。縮合剤としては１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールを例示できる。添加剤としては、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４－ニトロフェノール、１－ヒドロキシベンズトリアゾールを例示できる。 Further, as a method for introducing an active group onto the surface of the carrier, a method of introducing an active group into a carboxy group existing on the surface of the carrier using a condensing agent and an additive can also be exemplified. Examples of the condensing agent include 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC), dicyclohexylcarbodiamide, and carbonyldiimidazole. Examples of additives include N-hydroxysuccinimide (NHS), 4-nitrophenol, and 1-hydroxybenztriazole.
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の不溶性担体への固定化は、例えば、緩衝液中で実施できる。緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（２－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、Ｔｒｉｓ（Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示できる。固定化させるときの反応温度は、例えば、活性基の反応性や免疫グロブリン結合性タンパク質の安定性等の諸条件に応じて適宜設定できる。固定化させるときの反応温度は、例えば、５℃から５０℃であってよく、好ましくは１０℃から３５℃であってよい。 Immobilization of the immunoglobulin-binding protein of the present invention onto an insoluble carrier can be carried out, for example, in a buffer. Buffers include acetate buffer, phosphate buffer, MES (2-Morpholinoethanesulfonic acid) buffer, HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonic acid) buffer, Tris (Tris). s(hydroxymethyl)aminomethane) Examples include buffer solutions and boric acid buffer solutions. The reaction temperature during immobilization can be appropriately set depending on various conditions such as, for example, the reactivity of the active group and the stability of the immunoglobulin-binding protein. The reaction temperature during immobilization may be, for example, from 5°C to 50°C, preferably from 10°C to 35°C.
本発明の免疫グロブリン吸着剤は、例えば、カラムに充填して免疫グロブリン（抗体）の分離に使用できる。具体的には、例えば、本発明の免疫グロブリン吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加して当該免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させ、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させることで、免疫グロブリンを分離できる。すなわち、本発明は、例えば、本発明の免疫グロブリン吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加して当該免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させる工程とを含む、免疫グロブリンの分離方法を提供する。免疫グロブリンを含む溶液は、例えば、ポンプ等の送液手段を用いてカラムに添加できる。なお本明細書では、液体をカラムに添加することを、「液体をカラムに送液する」ともいう。なお免疫グロブリンを含む溶液は、カラムに添加する前に予め適切な緩衝液を用いて溶媒置換してよい。また、免疫グロブリンを含む溶液をカラムに添加する前に、適切な緩衝液を用いてカラムを平衡化してよい。前記平衡化により、例えば、免疫グロブリンをより高純度に分離できると期待される。溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液が例示できる。そのような緩衝液には、例えば、さらに、１０ｍＭから１００ｍＭの塩化ナトリウム等の無機塩を添加してもよい。溶媒置換に用いる緩衝液と平衡化に用いる緩衝液は、同一であってもよく、同一でなくてもよい。また、免疫グロブリンを含む溶液のカラムへの通液後に夾雑物質等の免疫グロブリン以外の成分がカラムに残存している場合、免疫グロブリン吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出する前に、そのような成分をカラムから除去してよい。免疫グロブリン以外の成分は、例えば、適切な緩衝液を用いてカラムから除去できる。免疫グロブリン以外の成分の除去に用いる緩衝液については、例えば、溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液についての記載を準用できる。免疫グロブリン吸着剤に吸着した免疫グロブリンは、例えば、免疫グロブリンとリガンド（本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質）との相互作用を弱めることで、溶出できる。免疫グロブリンとリガンド（本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質）との相互作用を弱める手段としては、緩衝液によるｐＨの低下、カウンターペプチドの添加、温度上昇、塩濃度変化が例示できる。免疫グロブリン吸着剤に吸着した免疫グロブリンは、具体的には、例えば、適切な溶出液を用いて溶出できる。溶出液としては、溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液よりも酸性側の緩衝液が挙げられる。そのような緩衝液としては、クエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示できる。溶出液のｐＨは、例えば、免疫グロブリンの機能（抗原への結合性等）を損なわない範囲で設定できる。 The immunoglobulin adsorbent of the present invention can be used, for example, to separate immunoglobulins (antibodies) by filling a column. Specifically, for example, a solution containing immunoglobulin is added to a column filled with the immunoglobulin adsorbent of the present invention, the immunoglobulin is adsorbed to the adsorbent, and the immunoglobulin adsorbed to the adsorbent is eluted. This allows immunoglobulins to be separated. That is, the present invention includes, for example, a step of adding a solution containing an immunoglobulin to a column filled with the immunoglobulin adsorbent of the present invention to adsorb the immunoglobulin to the adsorbent, and a step of adsorbing the immunoglobulin to the adsorbent. Provided is a method for separating immunoglobulins, the method comprising the step of eluting the immunoglobulins. A solution containing immunoglobulin can be added to the column using a liquid delivery means such as a pump, for example. Note that in this specification, adding a liquid to a column is also referred to as "feeding a liquid to a column." Note that the solution containing immunoglobulin may be solvent-substituted with an appropriate buffer before being added to the column. The column may also be equilibrated with a suitable buffer before adding the immunoglobulin-containing solution to the column. The above equilibration is expected to enable, for example, separation of immunoglobulins with higher purity. Examples of buffers used for solvent replacement and equilibration include phosphate buffer, acetate buffer, and MES buffer. Such a buffer may further include, for example, an inorganic salt such as 10mM to 100mM sodium chloride. The buffer used for solvent replacement and the buffer used for equilibration may or may not be the same. In addition, if components other than immunoglobulin such as contaminants remain in the column after a solution containing immunoglobulin is passed through the column, such components should be removed before eluting the immunoglobulin adsorbed to the immunoglobulin adsorbent. Components may be removed from the column. Components other than immunoglobulins can be removed from the column using, for example, a suitable buffer. Regarding the buffer used for removing components other than immunoglobulin, for example, the description regarding the buffer used for solvent replacement and equilibration can be applied mutatis mutandis. The immunoglobulin adsorbed to the immunoglobulin adsorbent can be eluted, for example, by weakening the interaction between the immunoglobulin and the ligand (immunoglobulin-binding protein of the present invention). Examples of means for weakening the interaction between the immunoglobulin and the ligand (immunoglobulin-binding protein of the present invention) include lowering the pH with a buffer, adding a counter peptide, increasing the temperature, and changing the salt concentration. Specifically, the immunoglobulin adsorbed to the immunoglobulin adsorbent can be eluted using, for example, an appropriate elution solution. Examples of the eluate include buffers that are more acidic than the buffers used for solvent replacement and equilibration. Examples of such buffers include citrate buffer, glycine-hydrochloride buffer, and acetate buffer. The pH of the eluate can be set, for example, within a range that does not impair immunoglobulin functions (antigen binding, etc.).
このようにして免疫グロブリン（抗体）の分離を実施することで、例えば、分離された免疫グロブリンが得られる。すなわち、免疫グロブリンの分離方法は、一態様において、免疫グロブリンの製造方法であってよく、具体的には、分離された免疫グロブリンの製造方法であってよい。免疫グロブリンは、例えば、免疫グロブリンを含有する溶出画分として得られる。すなわち、溶出された免疫グロブリンを含有する画分を分取できる。画分の分取は、例えば、常法で行なえる。画分を分取する方法としては、一定の時間ごとや、一定の容量ごとに回収容器を交換する方法や、溶出液のクロマトグラムの形状に合わせて回収容器を換える方法や、オートサンプラー等の自動フラクションコレクター等画分の分取をする方法が挙げられる。さらに、免疫グロブリンを含有する画分から免疫グロブリンを回収することもできる。免疫グロブリンを含有する画分からの免疫グロブリンの回収は、例えば、タンパク質の分離精製に用いられる公知の方法で行なえる。 By separating immunoglobulins (antibodies) in this way, for example, separated immunoglobulins can be obtained. That is, in one embodiment, the method for isolating immunoglobulin may be a method for producing immunoglobulin, and specifically, it may be a method for producing isolated immunoglobulin. Immunoglobulin is obtained, for example, as an elution fraction containing immunoglobulin. That is, a fraction containing eluted immunoglobulin can be collected. Fractions can be collected, for example, by conventional methods. Methods for separating fractions include changing the collection container at fixed time intervals or fixed volume intervals, changing the collection container according to the shape of the chromatogram of the eluate, and using an autosampler etc. Examples include methods of separating fractions, such as using an automatic fraction collector. Furthermore, immunoglobulins can also be recovered from fractions containing immunoglobulins. Immunoglobulin can be recovered from the immunoglobulin-containing fraction by, for example, known methods used for protein separation and purification.
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は当該実施例に限定されるものではない。また参考例および実施例４に記載のＳｐＡ９ｃ（配列番号２１）は、本発明を構成するものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be explained in more detail using Examples, but the present invention is not limited to the Examples. Furthermore, SpA9c (SEQ ID NO: 21) described in Reference Example and Example 4 does not constitute the present invention.
実施例１ アミノ酸置換免疫グロブリン結合性タンパク質の作製
（１）ＷＯ２０１９／０９３４３９号記載の方法に基づき、天然型免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１）に対し、構造安定化に寄与するＧｌｙ２９Ａｌａのアミノ酸置換（Ｂｊｏｒｎ Ｎｉｌｓｓｏｎ他，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１（２），１０７－１１３，１９８７）およびアルカリ安定性向上に関与するＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、およびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を導入したタンパク質ＳｐＡ６ａを発現可能なベクターｐＥＴ－ＳｐＡ６ａを作製した。ＳｐＡ６ａのアミノ酸配列を配列番号２に、ＳｐＡ６ａをコードするヌクレオチド配列を配列番号３に、それぞれ示す。
Example 1 Production of amino acid substitution immunoglobulin binding protein (1) Based on the method described in WO2019/093439, amino acid substitution of Gly29Ala that contributes to structural stabilization was performed in the natural immunoglobulin binding protein (SEQ ID NO: 1) (Bjorn Nilsson et al., Protein Engineering, 1(2), 107-113, 1987) and protein S into which amino acid substitutions of Lys4Arg, Lys7Glu, Asn11Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, and Lys58Glu, which are involved in improving alkali stability, have been introduced. Can express pA6a A vector pET-SpA6a was created. The amino acid sequence of SpA6a is shown in SEQ ID NO: 2, and the nucleotide sequence encoding SpA6a is shown in SEQ ID NO: 3, respectively.
（２）ＷＯ２０１９／０９３４３９号で明らかになった、免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ（Ｇｌｕ）５８Ａｓｐ（この表記はＳｐＡ６ａ作製時に配列番号１の５８番目のリジンが一度グルタミン酸に置換されたが、さらにアスパラギン酸に置換されたことを表す、以下同じ）を選択し、これら置換をＳｐＡ６ａ（配列番号２）に対し集積したタンパク質（ＳｐＡ８ｃと命名）を設計した。 (2) Among the amino acid substitutions involved in improving the alkaline stability of immunoglobulin-binding proteins revealed in WO2019/093439, Asn3Ile, Val40Ala, and Lys(Glu)58Asp (this notation was changed to SEQ ID NO. at the time of SpA6a production). The 58th lysine of 1 was once substituted with glutamic acid and then further substituted with aspartic acid (the same applies hereinafter). (named) was designed.
（３）（２）で設計したＳｐＡ８ｃをコードするポリヌクレオチドを合成した後、ＰＣＲを用いて前記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。ＰＣＲは、前記合成したポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号１２（５’－ＴＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＧＣＣＧＡＴＡＴＴＣＧＣＴＴＴＡ－３’）および配列番号１７（５’－ＣＴＡＣＴＣＧＡＧＡＴＣＣＧＧＴＧＣＴＴＧＡＧＣＡＴＣ－３’）に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、表１に示す組成からなる反応液を調製後、当該反応液を９８℃で３０秒間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で６０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で２分間熱処理することで行なった。 (3) After synthesizing the polynucleotide encoding SpA8c designed in (2), a polynucleotide containing the nucleotide sequence was produced using PCR. PCR is performed by using the synthesized polynucleotide as a template DNA and using an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 12 (5'-TAGCCATGGGCGCCGATATTCGCTTTA-3') and SEQ ID NO: 17 (5'-CTACTCGAGATCCGGTGCTTGAGCATC-3') as a PCR primer. After preparing a reaction solution having the composition shown in Table 1, the reaction solution was heat-treated at 98°C for 30 seconds, followed by a first step of 10 seconds at 98°C, a second step of 5 seconds at 55°C, and a second step of 72°C. The reaction was carried out for 30 cycles in which the third step of 60 seconds was one cycle, and finally heat-treated at 72° C. for 2 minutes.
（４）得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩとで消化後、予め制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化した発現ベクターｐＥＴ－２８ａにライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ニッポンジーン社製）を形質転換した。 (4) The obtained polynucleotide was purified, digested with restriction enzymes NcoI and ) strain (manufactured by Nippon Gene) was transformed.
（５）得られた形質転換体（遺伝子組換え大腸菌）を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔを用いて発現ベクター（ｐＥＴ－ＳｐＡ８ｃと命名）を抽出した。 (5) After culturing the obtained transformant (genetically modified E. coli) in LB medium containing 50 μg/mL kanamycin, an expression vector (named pET-SpA8c) was extracted using QIAprep Spin Miniprep kit.
（６）得られた抽出物のうち、免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびその周辺領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号１４（５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ－３’）または配列番号１５（５’－ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ－３’）に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。 (6) Among the obtained extracts, polynucleotides encoding immunoglobulin-binding proteins and their surrounding regions were analyzed using a Big Dye Terminator Cycle Sequencing ready Reaction kit (manufactured by Thermo Fisher Scientific) based on the chain terminator method. It was subjected to cycle sequencing reaction, and the nucleotide sequence was analyzed using a fully automatic DNA sequencer ABI Prism 3700 DNA analyzer (manufactured by Thermo Fisher Scientific). In addition, during the analysis, an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 14 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3') or SEQ ID NO: 15 (5'-TATGCTAGTTATTGCTCAG-3') was used as a sequencing primer.
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ８ｃにＳｐＡ８ｃをコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。ＳｐＡ８ｃのアミノ酸配列を配列番号１０に、前記ＳｐＡ８ｃをコードするヌクレオチド配列を配列番号１１に、それぞれ示す。 As a result of sequence analysis, it was confirmed that a polynucleotide encoding SpA8c was inserted into the expression vector pET-SpA8c. The amino acid sequence of SpA8c is shown in SEQ ID NO: 10, and the nucleotide sequence encoding SpA8c is shown in SEQ ID NO: 11, respectively.
参考例１
ＷＯ２０１９／０９３４３９号で明らかになった、免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ（Ｇｌｕ）５８ＡｓｐおよびＬｙｓ（Ｇｌｕ）５８ＶａｌをＳｐＡ６ａ（配列番号２）に対し集積することで、更なる安定性の向上を図った。具体的には、以下の（ａ）から（ｃ）に示す３種類の免疫グロブリン結合性タンパク質を設計し、作製した。
（ａ）ＳｐＡ６ａに対し、さらにＡｓｎ３ＩｌｅおよびＶａｌ４０Ａｌａのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＳｐＡ８ａと命名）
（ｂ）ＳｐＡ６ａに対し、さらにＡｓｎ３ＩｌｅおよびＬｙｓ（Ｇｌｕ）５８Ｖａｌのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＳｐＡ７ｃと命名）
（ｃ）ＳｐＡ６ａに対し、さらにＡｓｎ３ＩｌｅおよびＬｙｓ（Ｇｌｕ）５８Ａｓｐのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＳｐＡ７ｄと命名）
以下、（ａ）から（ｃ）に示す３種類の免疫グロブリン結合性タンパク質の作製方法について説明する。
Reference example 1
Amino acid substitutions Asn3Ile, Val40Ala, Lys(Glu)58Asp and Lys(Glu)58Val involved in improving the alkaline stability of immunoglobulin binding proteins revealed in WO2019/093439 are accumulated in SpA6a (SEQ ID NO: 2) By doing so, we aimed to further improve stability. Specifically, three types of immunoglobulin-binding proteins shown in (a) to (c) below were designed and produced.
(a) Protein with Asn3Ile and Val40Ala amino acid substitutions introduced into SpA6a (named SpA8a)
(b) Protein with Asn3Ile and Lys(Glu)58Val amino acid substitutions introduced into SpA6a (named SpA7c)
(c) A protein with Asn3Ile and Lys(Glu)58Asp amino acid substitutions introduced into SpA6a (named SpA7d)
Hereinafter, methods for producing three types of immunoglobulin-binding proteins shown in (a) to (c) will be explained.
（ａ）ＳｐＡ８ａ
（ａ－１）ＷＯ２０１９／０９３４３９号で明らかになった、アルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３ＩｌｅおよびＶａｌ４０Ａｌａを選択し、それらのアミノ酸置換をＳｐＡ６ａ（配列番号２）に対し集積したタンパク質ＳｐＡ８ａを設計した。
(a) SpA8a
(a-1) Asn3Ile and Val40Ala were selected from among the amino acid substitutions involved in improving alkali stability revealed in WO2019/093439, and these amino acid substitutions were integrated into SpA6a (SEQ ID NO: 2). Protein SpA8a was designed.
（ａ－２）（ａ－１）で設計したＳｐＡ８ａをコードするヌクレオチド配列を合成した後、ＰＣＲを用いて前記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。ＰＣＲは、前記合成したポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号１２および配列番号１３（５’－ＣＴＡＣＴＣＧＡＧＴＴＣＣＧＧＴＧＣＴＴＧＡＧＣＡＴＣＧ－３’）に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例１（３）と同様な方法で行なった。 (a-2) After synthesizing the nucleotide sequence encoding SpA8a designed in (a-1), a polynucleotide containing the nucleotide sequence was produced using PCR. PCR was carried out in accordance with Example 1, except that the synthesized polynucleotide was used as a template DNA and the oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13 (5'-CTACTCGAGTTCCGGTGCTTGAGCATCG-3') was used as a PCR primer. It was carried out in the same manner as in 3).
（ａ－３）得られたポリヌクレオチドを精製し、実施例１（４）と同様な方法で形質転換後、得られた形質転換体（遺伝子組換え大腸菌）から実施例１（５）と同様な方法で発現ベクター（ｐＥＴ－ＳｐＡ８ａと命名）を抽出した。 (a-3) Purify the obtained polynucleotide and transform it in the same manner as in Example 1 (4), then use the obtained transformant (genetically recombinant E. coli) in the same manner as in Example 1 (5). An expression vector (named pET-SpA8a) was extracted using a conventional method.
（ａ－４）ｐＥＴ－ＳｐＡ８ａのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（６）と同様な方法で行なった。 (a-4) The nucleotide sequence of pET-SpA8a was analyzed in the same manner as in Example 1 (6).
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ８ａにＳｐＡ８ａをコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。ＳｐＡ８ａのアミノ酸配列を配列番号４に、ＳｐＡ８ａをコードするヌクレオチド配列を配列番号５に、それぞれ示す。 As a result of sequence analysis, it was confirmed that a polynucleotide encoding SpA8a was inserted into the expression vector pET-SpA8a. The amino acid sequence of SpA8a is shown in SEQ ID NO: 4, and the nucleotide sequence encoding SpA8a is shown in SEQ ID NO: 5.
（ｂ）ＳｐＡ７ｃ
（ｂ－１）ＷＯ２０１９／０９３４３９号で明らかになった、アルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３ＩｌｅおよびＬｙｓ（Ｇｌｕ）５８Ｖａｌを選択し、それらのアミノ酸置換をＳｐＡ６ａ（配列番号２）に対し集積したタンパク質ＳｐＡ７ｃを設計した。
(b) SpA7c
(b-1) Asn3Ile and Lys(Glu)58Val were selected from among the amino acid substitutions involved in improving alkaline stability revealed in WO2019/093439, and these amino acid substitutions were made into SpA6a (SEQ ID NO: 2). We designed a protein, SpA7c, that was integrated against.
（ｂ－２）（ｂ－１）で設計したＳｐＡ７ｃをコードするポリヌクレオチドを合成した後、ＰＣＲを用いて前記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。ＰＣＲは、前記合成したポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号１２および配列番号１６（５’－ＣＴＡＣＴＣＧＡＧＡＡＣＣＧＧＴＧＣＴＴＧＡＧＣＡＴＣＧ－３’）に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例１（３）と同様の方法で行なった。 (b-2) After synthesizing the polynucleotide encoding SpA7c designed in (b-1), a polynucleotide containing the nucleotide sequence was produced using PCR. PCR was carried out in accordance with Example 1, except that the synthesized polynucleotide was used as a template DNA and the oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 16 (5'-CTACTCGAGAACCGGTGCTTGAGCATCG-3') was used as a PCR primer. It was carried out in the same manner as in 3).
（ｂ－３）得られたポリヌクレオチドを精製し、実施例１（４）と同様な方法で形質転換後、得られた形質転換体（遺伝子組換え大腸菌）から実施例１（５）と同様な方法で発現ベクター（ｐＥＴ－ＳｐＡ７ｃと命名）を抽出した。 (b-3) Purify the obtained polynucleotide and transform it in the same manner as in Example 1 (4), and then use the obtained transformant (genetically recombinant E. coli) in the same manner as in Example 1 (5). An expression vector (named pET-SpA7c) was extracted using a conventional method.
（ｂ－４）ｐＥＴ－ＳｐＡ７ｃのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（６）と同様の方法で行なった。 (b-4) The nucleotide sequence of pET-SpA7c was analyzed in the same manner as in Example 1 (6).
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ７ｃにＳｐＡ７ｃをコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。ＳｐＡ７ｃのアミノ酸配列を配列番号６に、ＳｐＡ７ｃをコードするヌクレオチド配列を配列番号７に、それぞれ示す。 As a result of sequence analysis, it was confirmed that a polynucleotide encoding SpA7c was inserted into the expression vector pET-SpA7c. The amino acid sequence of SpA7c is shown in SEQ ID NO: 6, and the nucleotide sequence encoding SpA7c is shown in SEQ ID NO: 7.
（ｃ）ＳｐＡ７ｄ
（ｃ－１）ＷＯ２０１９／０９３４３９号で明らかになった、アルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３ＩｌｅおよびＬｙｓ（Ｇｌｕ）５８Ａｓｐを選択し、それらのアミノ酸置換をＳｐＡ６ａ（配列番号２）に対し集積したタンパク質ＳｐＡ７ｄを設計した。
(c) SpA7d
(c-1) Asn3Ile and Lys(Glu)58Asp were selected from among the amino acid substitutions involved in improving alkali stability revealed in WO2019/093439, and these amino acid substitutions were made into SpA6a (SEQ ID NO: 2). We designed a protein, SpA7d, that was integrated against.
（ｃ－２）（ｃ－１）で設計したＳｐＡ７ｄをコードするポリヌクレオチドを合成した後、ＰＣＲを用いて前記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。ＰＣＲは、前記合成したポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号１２および配列番号１７に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例１（３）と同様の方法で行なった。 (c-2) After synthesizing the polynucleotide encoding SpA7d designed in (c-1), a polynucleotide containing the nucleotide sequence was produced using PCR. PCR was carried out in the same manner as in Example 1 (3), except that the synthesized polynucleotide was used as a template DNA and oligonucleotides consisting of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 17 were used as PCR primers. .
（ｃ－３）得られたポリヌクレオチドを精製し、実施例１（４）と同様な方法で形質転換後、得られた形質転換体（遺伝子組換え大腸菌）から実施例１（５）と同様な方法で発現ベクター（ｐＥＴ－ＳｐＡ７ｄと命名）を抽出した。 (c-3) Purify the obtained polynucleotide and transform it in the same manner as in Example 1 (4), then use the obtained transformant (genetically recombinant E. coli) in the same manner as in Example 1 (5). An expression vector (named pET-SpA7d) was extracted using a conventional method.
（ｃ－４）ｐＥＴ－ＳｐＡ７ｄのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（６）と同様の方法で行なった。 (c-4) The nucleotide sequence of pET-SpA7d was analyzed in the same manner as in Example 1 (6).
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ７ｄにＳｐＡ７ｄをコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。ＳｐＡ７ｄのアミノ酸配列を配列番号８に、ＳｐＡ７ｄをコードするヌクレオチド配列を配列番号９に、それぞれ示す。 As a result of sequence analysis, it was confirmed that a polynucleotide encoding SpA7d was inserted into the expression vector pET-SpA7d. The amino acid sequence of SpA7d is shown in SEQ ID NO: 8, and the nucleotide sequence encoding SpA7d is shown in SEQ ID NO: 9.
実施例２ アミノ酸置換免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性評価（その１）
（１）ＳｐＡ６ａ（配列番号２）、実施例１で作製したＳｐＡ８ｃ（配列番号１０）ならびに参考例１で作製したＳｐＡ８ａ（配列番号４）、ＳｐＡ７ｃ（配列番号６）およびＳｐＡ７ｄ（配列番号８）を発現する形質転換体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ｍＬの２×ＹＴ液体培地（トリプトン１．６％（ｗ／ｖ）、酵母エキス１％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム０．５％（ｗ／ｖ））に接種し、３７℃で終夜、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
Example 2 Alkaline stability evaluation of amino acid substituted immunoglobulin binding protein (Part 1)
(1) SpA6a (SEQ ID NO: 2), SpA8c (SEQ ID NO: 10) produced in Example 1, and SpA8a (SEQ ID NO: 4), SpA7c (SEQ ID NO: 6), and SpA7d (SEQ ID NO: 8) produced in Reference Example 1. The expressing transformants were cultured in 2 mL of 2×YT liquid medium containing 50 μg/mL of kanamycin (tryptone 1.6% (w/v), yeast extract 1% (w/v), sodium chloride 0.5%). (w/v)) and cultured aerobically with shaking overnight at 37°C to perform preculture.
（２）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２０ｍＬの２×ＹＴ液体培地に前培養液を２００μＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。 (2) 200 μL of the preculture solution was inoculated into 20 mL of 2×YT liquid medium supplemented with 50 μg/mL of kanamycin, and cultured with shaking aerobically at 37° C.
（３）培養開始から２から３時間後、培養温度を２０℃に変更し、終濃度０．１ｍＭとなるようＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、２０℃で終夜、好気的に振とう培養した。 (3) After 2 to 3 hours from the start of culture, the culture temperature was changed to 20°C, IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) was added to a final concentration of 0.1 mM, and the mixture was kept at 20°C overnight under aerobic conditions. Cultured with shaking.
（４）培養終了後、遠心分離で集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（メルク社製）を用いてタンパク質抽出液を調製した。 (4) After completion of the culture, bacteria were collected by centrifugation, and a protein extract was prepared using BugBuster Protein Extraction Reagent (manufactured by Merck & Co., Ltd.).
（５）（４）で調製したタンパク質抽出液中の変異型免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号２、４、６、８および１０）の濃度が等しくなるようＴｒｉｓ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）を用いて希釈した。希釈したタンパク質溶液の一部を採取し、一方には２Ｍ ＮａＯＨを、もう一方にはＴＢＳを、それぞれ前記採取したタンパク質溶液に対し等量添加し混合後、３５℃で１５時間静置した。 (5) Tris-Buffered Saline (TBS) was used to equalize the concentrations of the mutant immunoglobulin-binding proteins (SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, and 10) in the protein extract prepared in (4). Diluted. A portion of the diluted protein solution was collected, 2M NaOH was added to one portion, and TBS was added to the other portion in equal amounts to the sampled protein solution, mixed, and then allowed to stand at 35° C. for 15 hours.
（６）１５時間静置後、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を４倍量加えることで中和し、アルカリ処理（２Ｍ ＮａＯＨを混合）およびアルカリ未処理（ＴＢＳを混合）のタンパク質溶液の抗体結合活性を、下記ＥＬＩＳＡ法にて測定した。アルカリ安定性はアルカリ処理したときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理をしなかった（未処理）ときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出し、評価した。
（６－１）ＴＢＳを用いて１０μｇ／ｍＬに調製したヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を９６ウェルマイクロプレートのウェルに分注し固定化した（４℃、１６時間）。固定化後、ＴＢＳを用いて１％（ｗ／ｖ）に調製したＢｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（メルク社製）を用いてブロッキングした。
（６－２）洗浄緩衝液（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０（商品名））で９６ウェルマイクロプレートのウェルを洗浄後、抗体結合活性を評価する免疫グロブリン結合性タンパク質を含む溶液を添加し、免疫グロブリン結合性タンパク質と固定化ガンマグロブリンとを反応させた（３０℃、１時間）。
（６－３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ－６－Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢＥＴＨＹＬ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し反応させた（３０℃、１時間）。
（６－４）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。次に１Ｍ リン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加することで反応を停止し、マイクロプレートリーダー（テカン社製）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
(6) After standing for 15 hours, neutralize by adding 4 times the volume of 1M Tris buffer (pH 7.0), and prepare the alkali-treated (mixed with 2M NaOH) and non-alkali-treated (mixed with TBS) protein solutions. Antibody binding activity was measured by the following ELISA method. Alkaline stability is calculated by dividing the antibody-binding activity of the immunoglobulin-binding protein when treated with alkali by the antibody-binding activity of the immunoglobulin-binding protein when it is not treated with alkali (untreated). and evaluated.
(6-1) A human antibody gamma globulin preparation (manufactured by Chemo and Serum Therapy Research Institute) prepared at 10 μg/mL using TBS was dispensed into wells of a 96-well microplate and immobilized (4°C, 16 time). After fixation, blocking was performed using Bovine Serum Albumin (manufactured by Merck & Co.) prepared at 1% (w/v) using TBS.
(6-2) After washing the wells of a 96-well microplate with washing buffer (0.05M Tris, 0.15M NaCl, 0.05% (w/v) Tween 20 (trade name)), the antibody binding activity was determined. A solution containing the immunoglobulin-binding protein to be evaluated was added, and the immunoglobulin-binding protein and immobilized gamma globulin were allowed to react (30° C., 1 hour).
(6-3) After the reaction was completed, the well was washed with the washing buffer and 100 μL/well of Anti-6-His Antibody (manufactured by BETHYL LABORATORIES) diluted to 100 ng/mL was added and reacted (at 30°C for 1 hour). ).
(6-4) After the reaction was completed, the well was washed with the washing buffer, and TMB Peroxidase Substrate (manufactured by KPL) was added at 50 μL/well. Next, the reaction was stopped by adding 50 μL/well of 1M phosphoric acid, and the absorbance at 450 nm was measured using a microplate reader (manufactured by Tecan).
結果を表２に示す。ＳｐＡ８ａ（配列番号４）、ＳｐＡ７ｃ（配列番号６）、ＳｐＡ７ｄ（配列番号８）およびＳｐＡ８ｃ（配列番号１０）は、いずれもＳｐＡ６ａ（配列番号２）と比較し、残存活性が高くなっており、免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性が向上していることが確認された。 The results are shown in Table 2. SpA8a (SEQ ID NO: 4), SpA7c (SEQ ID NO: 6), SpA7d (SEQ ID NO: 8), and SpA8c (SEQ ID NO: 10) all have higher residual activity than SpA6a (SEQ ID NO: 2), and are highly effective in immunity. It was confirmed that the alkaline stability of the globulin-binding protein was improved.
実施例３ アルカリ安定性向上免疫グロブリン結合性タンパク質へのランダム変異導入およびライブラリーの作製（その１）
以下に示す方法で、実施例１で作製した免疫グロブリン結合性タンパク質ＳｐＡ８ｃ（配列番号１０）をコードするポリヌクレオチド部分（配列番号１１）に対し、エラープローンＰＣＲによりランダムに変異を導入した。
Example 3 Random mutation introduction into alkaline stability-improving immunoglobulin-binding protein and preparation of library (Part 1)
In the method described below, mutations were randomly introduced into the polynucleotide portion (SEQ ID NO: 11) encoding the immunoglobulin binding protein SpA8c (SEQ ID NO: 10) produced in Example 1 by error-prone PCR.
（１）実施例１で作製した発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ８ｃを鋳型ＤＮＡとして用い、エラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。前記エラープローンＰＣＲで変異型の免疫グロブリン結合性タンパク質（ＳｐＡ８ｃ）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１６）に良好に変異が導入され、その平均変異導入率は２．１６％であった。 (1) Error prone PCR was performed using the expression vector pET-SpA8c prepared in Example 1 as template DNA. In error prone PCR, after preparing a reaction solution with the composition shown in Table 3, the reaction solution is heat-treated at 95°C for 2 minutes, a first step at 95°C for 30 seconds, a second step at 50°C for 30 seconds, 72 Thirty cycles of the reaction, each cycle consisting of a third step of 90 seconds at .degree. C., were carried out, followed by a final heat treatment at 72.degree. C. for 7 minutes. Mutations were successfully introduced into the polynucleotide (SEQ ID NO: 16) encoding the mutant immunoglobulin binding protein (SpA8c) by the error-prone PCR, and the average mutation introduction rate was 2.16%.
（２）得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化し、予め制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化した発現ベクターｐＥＴ－２８ａにライゲーションした。 (2) The obtained PCR product was purified, digested with restriction enzymes NcoI and XhoI, and ligated to expression vector pET-28a that had been previously digested with restriction enzymes NcoI and XhoI.
（３）ライゲーション反応終了後、反応液を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃、１６時間）した後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異体ライブラリーとした。 (3) After the ligation reaction is completed, E. coli BL21 (DE3) strain is transformed using the reaction solution, cultured in LB plate medium containing 50 μg/mL kanamycin (37°C, 16 hours), and then formed on the plate. The resulting colonies were used as a random mutant library.
実施例４ アルカリ安定化免疫グロブリン結合性タンパク質のスクリーニング（その１）
（１）実施例３で作製したランダム変異体ライブラリー（形質転換体［遺伝子組換え大腸菌］）約３４００株を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地２５０μＬに接種し、９６ウェルディープウェルプレートを用いて３７℃で終夜振とう培養した。
Example 4 Screening for alkali-stabilized immunoglobulin binding protein (Part 1)
(1) Approximately 3,400 strains of the random mutant library (transformants [genetically modified E. coli]) prepared in Example 3 were inoculated into 250 μL of a 2×YT liquid medium containing 50 μg/mL of kanamycin, and a 96-well deep well The plates were cultured overnight at 37°C with shaking.
（２）培養後、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、０．３％（ｗ／ｖ）のグリシン、０．０５ｍＭのＩＰＴＧを含む２×ＹＴ液体培地５００μＬに５μＬの培養液を植え継ぎ、９６ウェルディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で終夜振とう培養した。 (2) After culturing, 5 μL of the culture solution was subcultured into 500 μL of 2×YT liquid medium containing 50 μg/mL kanamycin, 0.3% (w/v) glycine, and 0.05 mM IPTG in a 96-well deep well. The plate was further cultured with shaking at 20°C overnight.
（３）培養後、遠心操作によって得られた免疫グロブリン結合性タンパク質を含む培養上清を純水で２５倍または４０倍に希釈した。希釈した溶液を２Ｍ ＮａＯＨと等量混合し、６３℃または７１℃で３０分間アルカリ処理を行なった。アルカリ処理後は４倍量の１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）で中和した。 (3) After culturing, the culture supernatant containing immunoglobulin-binding proteins obtained by centrifugation was diluted 25 times or 40 times with pure water. The diluted solution was mixed with an equal amount of 2M NaOH and subjected to alkali treatment at 63°C or 71°C for 30 minutes. After the alkali treatment, it was neutralized with 4 times the volume of 1M Tris buffer (pH 7.0).
（４）アルカリ処理したときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性とアルカリ処理をしなかったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、実施例２（６）に記載のＥＬＩＳＡ法にてそれぞれ測定した。 (4) The antibody-binding activity of the immunoglobulin-binding protein when treated with alkali and the antibody-binding activity of the immunoglobulin-binding protein when not treated with alkali were determined by the ELISA method described in Example 2 (6). Each was measured.
（５）アルカリ処理したときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理をしなかったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出し、ＳｐＡ８ｃと比較してアルカリ安定性が向上した（残存活性が向上した）免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。 (5) Calculate the residual activity by dividing the antibody-binding activity of the immunoglobulin-binding protein when treated with alkali by the antibody-binding activity of the immunoglobulin-binding protein when not treated with alkali, and compare with SpA8c. A transformant expressing an immunoglobulin-binding protein with improved alkaline stability (improved residual activity) was selected.
（６）選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。 (6) The selected transformants were cultured, and an expression vector was prepared using QIAprep Spin Miniprep kit (manufactured by QIAGEN).
（７）得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域のヌクレオチド配列を実施例１（６）に記載の方法で解析し、アミノ酸置換箇所を特定した。 (7) The nucleotide sequence of the polynucleotide region encoding the immunoglobulin binding protein inserted into the obtained expression vector was analyzed by the method described in Example 1 (6), and amino acid substitution sites were identified.
（５）で選択した形質転換体が発現する免疫グロブリン結合性タンパク質のＳｐＡ８ｃ（配列番号１０）に対するアミノ酸置換位置および１．０Ｍ ＮａＯＨを用いて３５℃、１５時間アルカリ処理したときの残存活性［％］をまとめた結果を表４、表５および表６に示す。配列番号１０に記載のアミノ酸配列において、Ａｓｎ６Ａｓｐ、Ｌｙｓ（Ｇｌｕ）７Ｖａｌ、Ｓｅｒ３９Ｃｙｓ、Ｇｌｕ４７Ｖａｌ、Ｌｙｓ５０ＡｓｎおよびＬｙｓ（Ａｓｐ）５８Ａｓｎのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じた免疫グロブリン結合性タンパク質は、ＳｐＡ８ｃ（配列番号１０）と比較しアルカリ安定性が向上しているといえる。 The position of amino acid substitution in SpA8c (SEQ ID NO: 10) of the immunoglobulin binding protein expressed by the transformant selected in (5) and the residual activity [%] when treated with alkali using 1.0 M NaOH at 35°C for 15 hours. ] The results are shown in Tables 4, 5, and 6. An immunoglobulin binding protein in which at least one amino acid substitution of Asn6Asp, Lys(Glu)7Val, Ser39Cys, Glu47Val, Lys50Asn and Lys(Asp)58Asn has occurred in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10 is SpA8c ( It can be said that the alkali stability is improved compared to SEQ ID NO: 10).
配列番号１０に記載のアミノ酸配列において、
Ｇｌｕ７１０Ｖａｌ（この表記は配列番号１０の７番目のグルタミン酸がバリンに置換されていることを表す、以下同じ）のアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ８ｄと命名）のアミノ酸配列を配列番号１８に、
Ｇｌｕ４７１０Ｖａｌのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ９ａと命名）のアミノ酸配列を配列番号１９に、
Ｌｙｓ５０１０Ａｓｎのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ９ｂと命名）のアミノ酸配列を配列番号２０に、
Ａｓｎ６１０Ａｓｐのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ９ｃと命名、本タンパク質は本発明を構成しない）のアミノ酸配列を配列番号２１に、
Ｓｅｒ３９１０Ｃｙｓのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ９ｄと命名）のアミノ酸配列を配列番号２２に、
Ａｓｐ５８１０Ａｓｎのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ８ｅと命名）のアミノ酸配列を配列番号２３に、それぞれ示す。
In the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10,
The amino acid sequence of the protein (named SpA8d) in which the amino acid substitution of Glu7 10 Val (this notation indicates that the 7th glutamic acid in SEQ ID NO: 10 is replaced with valine, the same applies hereinafter) is shown in SEQ ID NO: 18,
The amino acid sequence of the protein (named SpA9a) in which the Glu47 10 Val amino acid substitution occurred is shown in SEQ ID NO: 19.
The amino acid sequence of the protein (named SpA9b) with amino acid substitution of Lys50 10 Asn is shown in SEQ ID NO: 20.
The amino acid sequence of a protein with Asn6 10 Asp amino acid substitution (named SpA9c, this protein does not constitute the present invention) is shown in SEQ ID NO: 21.
The amino acid sequence of the protein (named SpA9d) in which the amino acid substitution of Ser39 10 Cys has occurred is shown in SEQ ID NO: 22,
The amino acid sequence of the protein (named SpA8e) in which the Asp58 10 Asn amino acid substitution has occurred is shown in SEQ ID NO: 23.
参考例２ アミノ酸置換免疫グロブリン結合性タンパク質の親和性評価
（１）センサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケア社製）に、非改変型免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１）、ＳｐＡ６ａ（配列番号２）またはＳｐＡ８ｃ（配列番号１０）を固定化した。当該固定化はカルボキシ基をＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）で活性化し、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて１μｇ／ｍＬに調製したアミノ酸置換免疫グロブリン結合性タンパク質を添加して行なった。なお固定化反応後の残存したＮＨＳ基はエタノールアミンでブロッキングした。
Reference Example 2 Affinity evaluation of amino acid-substituted immunoglobulin-binding protein (1) Sensor chip CM5 (manufactured by GE Healthcare) was coated with unmodified immunoglobulin-binding protein (SEQ ID NO: 1), SpA6a (SEQ ID NO: 2) or SpA8c (SEQ ID NO: 10) was immobilized. The immobilization was performed by activating the carboxyl group with NHS (N-hydroxysuccinimide) and adding amino acid-substituted immunoglobulin-binding protein adjusted to 1 μg/mL using 10 mM sodium acetate buffer (pH 5.0). . Note that the NHS groups remaining after the immobilization reaction were blocked with ethanolamine.
（２）ランニング緩衝液ＨＢＳ－ＥＰ＋（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｖ） Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、ｐＨ７．４）（ＧＥヘルスケア社製）を用いてヒト血漿由来ＩｇＧ１（メルク社製）を３．１ｎＭから２００ｎＭの濃度に希釈し、３０μＬ／ｍｉｎの流速で（１）で固定化したセンサーチップに添加した。測定ごとにセンサーチップ表面を１０ｍＭグリシン塩酸緩衝液で再生し、ランニング緩衝液ＨＢＳ－ＥＰ＋で平衡化した。 (2) Using running buffer HBS-EP+ (0.01M HEPES, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.05% (v/v) Surfactant P20, pH 7.4) (manufactured by GE Healthcare) Plasma-derived IgG1 (manufactured by Merck & Co.) was diluted to a concentration of 3.1 nM to 200 nM and added to the sensor chip immobilized in (1) at a flow rate of 30 μL/min. After each measurement, the sensor chip surface was regenerated with 10 mM glycine-HCl buffer and equilibrated with running buffer HBS-EP+.
（３）Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて解析し、１：１ Ｂｉｎｄｉｎｇモデルでフィッティングした。 (3) Analyzed using Biacore T200 Evaluation software and fitted with a 1:1 Binding model.
表７に、ヒトＩｇＧ１に対する非改変型免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１）ならびにＳｐＡ６ａ（配列番号２）およびＳｐＡ８ｃ（配列番号１０）の解離定数ＫＤを示す。ＳｐＡ６ａ（配列番号２）およびＳｐＡ８ｃ（配列番号１０）のヒトＩｇＧ１に対する親和性は、非改変型免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１）とほぼ同等であることがわかる。 Table 7 shows the dissociation constants KD of the unmodified immunoglobulin binding protein (SEQ ID NO: 1) and SpA6a (SEQ ID NO: 2) and SpA8c (SEQ ID NO: 10) for human IgG1. It can be seen that the affinity of SpA6a (SEQ ID NO: 2) and SpA8c (SEQ ID NO: 10) for human IgG1 is approximately equivalent to that of the unmodified immunoglobulin binding protein (SEQ ID NO: 1).
実施例５ アルカリ安定性向上免疫グロブリン結合性タンパク質へのランダム変異導入およびライブラリーの作製（その２）
実施例４で評価した変異型免疫グロブリン結合性タンパク質のうち、ＳｐＡ８ｄ（配列番号１８）を選択し、ＳｐＡ８ｄをコードするポリヌクレオチド部分（配列番号２９）にエラープローンＰＣＲによりランダムに変異を導入した。
Example 5 Random mutation introduction into alkaline stability-improving immunoglobulin binding protein and library preparation (Part 2)
Among the mutant immunoglobulin-binding proteins evaluated in Example 4, SpA8d (SEQ ID NO: 18) was selected, and mutations were randomly introduced into the polynucleotide portion (SEQ ID NO: 29) encoding SpA8d by error-prone PCR.
（１）ＳｐＡ８ｄをコードするポリヌクレオチド（配列番号２９）をｐＥＴ－２８ａに挿入し得られた発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ８ｄを鋳型ＤＮＡとして用い、エラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。前記エラープローンＰＣＲで変異型の免疫グロブリン結合性タンパク質（ＳｐＡ８ｄ）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２９）に良好に変異が導入され、その平均変異導入率は２．１８％であった。 (1) Error prone PCR was performed using the expression vector pET-SpA8d obtained by inserting a polynucleotide encoding SpA8d (SEQ ID NO: 29) into pET-28a as a template DNA. In error prone PCR, after preparing a reaction solution with the composition shown in Table 3, the reaction solution is heat-treated at 95°C for 2 minutes, a first step at 95°C for 30 seconds, a second step at 50°C for 30 seconds, 72 Thirty cycles of the reaction, each cycle consisting of a third step of 90 seconds at .degree. C., were carried out, followed by a final heat treatment at 72.degree. C. for 7 minutes. Mutations were successfully introduced into the polynucleotide (SEQ ID NO: 29) encoding the mutant immunoglobulin binding protein (SpA8d) by the error-prone PCR, and the average mutation introduction rate was 2.18%.
（２）得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化し、予め制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化した発現ベクターｐＥＴ－２８ａにライゲーションした。 (2) The obtained PCR product was purified, digested with restriction enzymes NcoI and XhoI, and ligated to expression vector pET-28a that had been previously digested with restriction enzymes NcoI and XhoI.
（３）ライゲーション反応終了後、反応液を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃、１６時間）した後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異体ライブラリーとした。 (3) After the ligation reaction is completed, E. coli BL21 (DE3) strain is transformed using the reaction solution, cultured in LB plate medium containing 50 μg/mL kanamycin (37°C, 16 hours), and then formed on the plate. The resulting colonies were used as a random mutant library.
実施例６ アルカリ安定性向上免疫グロブリン結合性タンパク質への部位特異的変異導入およびライブラリーの作製
以下に示す方法で、実施例３で作製した免疫グロブリン結合性タンパク質ＳｐＡ８ｄ（配列番号１８）をコードするポリヌクレオチド部分（配列番号２９）に対し、インバースＰＣＲにより部位特異的にランダムな変異を導入した。変異導入箇所は、これまでの検討で安定性に有効な変異が多く取れた箇所を選択した。具体的には、配列番号１の３番目のアスパラギン、４番目のリジンまたは４２番目のリジンに対して実施した。
Example 6 Site-directed mutagenesis of alkaline stability-enhancing immunoglobulin-binding protein and construction of library The immunoglobulin-binding protein SpA8d (SEQ ID NO: 18) produced in Example 3 is encoded by the method shown below. Random mutations were site-specifically introduced into the polynucleotide portion (SEQ ID NO: 29) by inverse PCR. The mutation introduction site was selected from a site where a large number of mutations effective for stability had been obtained in previous studies. Specifically, the test was performed on the 3rd asparagine, the 4th lysine, or the 42nd lysine of SEQ ID NO: 1.
（１）発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ８ｄを鋳型ＤＮＡとして用い、インバースＰＣＲを行なった。インバースＰＣＲは、表８に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で２分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、６０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で６０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。なお各ｐｒｉｍｅｒ ｍｉｘｔｕｒｅの組成を表９に、各変異導入箇所への変異導入に用いたプライマーの組合せを表１０に、それぞれ示す。 (1) Inverse PCR was performed using the expression vector pET-SpA8d as template DNA. Inverse PCR is performed by preparing a reaction solution with the composition shown in Table 8, and then heat-treating the reaction solution at 98°C for 2 minutes, followed by a first step of 10 seconds at 98°C, a second step of 5 seconds at 60°C, and a second step of 72°C. The reaction was carried out for 30 cycles, each cycle consisting of the third step of 60 seconds, and finally heat-treated at 72° C. for 7 minutes. The composition of each primer mixture is shown in Table 9, and the combination of primers used to introduce mutations into each mutation introduction site is shown in Table 10.
（２）得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＤｐｎＩで処理し、鋳型としたプラスミドのみを選択的に切断した。 (2) The obtained PCR product was treated with restriction enzyme DpnI to selectively cleave only the template plasmid.
（３）制限酵素での処理後、反応液を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃、１６時間）した後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異体ライブラリーとした。前記インバースＰＣＲにより、変異型の免疫グロブリン結合性タンパク質（ＳｐＡ８ｄ）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２９）に良好に変異が導入された。形成したコロニーの中から１００株選択し、任意の箇所に約１７種の変異が導入されたライブラリーを取得した。 (3) After treatment with restriction enzymes, E. coli BL21 (DE3) strain was transformed using the reaction solution, cultured in LB plate medium containing 50 μg/mL kanamycin (37°C, 16 hours), and then plated. The colonies formed were used as a random mutant library. Through the inverse PCR, mutations were successfully introduced into the polynucleotide (SEQ ID NO: 29) encoding a mutant immunoglobulin binding protein (SpA8d). 100 strains were selected from the formed colonies to obtain a library in which approximately 17 types of mutations were introduced at arbitrary locations.
実施例７ アルカリ安定化免疫グロブリン結合性タンパク質のスクリーニング（その２）
（１）実施例５および６で作製したランダム変異体ライブラリー（形質転換体［遺伝子組換え大腸菌］）約１８００株を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地２５０μＬに接種し、９６ウェルディープウェルプレートを用いて３７℃で終夜振とう培養した。
Example 7 Screening for alkaline-stabilized immunoglobulin-binding proteins (Part 2)
(1) Approximately 1800 strains of the random mutant library (transformants [genetically modified E. coli]) prepared in Examples 5 and 6 were inoculated into 250 μL of 2×YT liquid medium containing 50 μg/mL kanamycin, and 96-well The cells were cultured with shaking overnight at 37°C using a deep well plate.
（２）培養後、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、０．３％（ｗ／ｖ）のグリシン、０．０５ｍＭのＩＰＴＧを含む２×ＹＴ液体培地５００μＬに５μＬの培養液を植え継ぎ、９６ウェルディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で終夜振とう培養した。 (2) After culturing, 5 μL of the culture solution was subcultured into 500 μL of 2×YT liquid medium containing 50 μg/mL kanamycin, 0.3% (w/v) glycine, and 0.05 mM IPTG in a 96-well deep well. The plate was further cultured with shaking at 20°C overnight.
（３）培養後、遠心操作によって得られた免疫グロブリン結合性タンパク質を含む培養上清を純水で５０倍に希釈した。希釈した溶液を２Ｍ ＮａＯＨと等量混合し、６４℃で３０分間アルカリ処理を行なった。アルカリ処理後は４倍量の１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）で中和した。 (3) After culturing, the culture supernatant containing immunoglobulin-binding proteins obtained by centrifugation was diluted 50 times with pure water. The diluted solution was mixed with an equal amount of 2M NaOH and subjected to alkali treatment at 64° C. for 30 minutes. After the alkali treatment, it was neutralized with 4 times the volume of 1M Tris buffer (pH 7.0).
（４）アルカリ処理したときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性とアルカリ処理をしなかったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、実施例２（６）に記載のＥＬＩＳＡ法にてそれぞれ測定した。 (4) The antibody-binding activity of the immunoglobulin-binding protein when treated with alkali and the antibody-binding activity of the immunoglobulin-binding protein when not treated with alkali were determined by the ELISA method described in Example 2 (6). Each was measured.
（５）アルカリ処理したときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理をしなかったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出し、ＳｐＡ８ｄと比較してアルカリ安定性が向上した（残存活性が向上した）免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。 (5) Calculate the residual activity by dividing the antibody-binding activity of the immunoglobulin-binding protein when treated with alkali by the antibody-binding activity of the immunoglobulin-binding protein when not treated with alkali, and compare with SpA8d. A transformant expressing an immunoglobulin binding protein with improved alkaline stability (improved residual activity) was selected.
（６）選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。 (6) The selected transformants were cultured, and an expression vector was prepared using QIAprep Spin Miniprep kit (manufactured by QIAGEN).
（７）得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域のヌクレオチド配列を実施例１（６）に記載の方法で解析し、アミノ酸置換箇所を特定した。 (7) The nucleotide sequence of the polynucleotide region encoding the immunoglobulin binding protein inserted into the obtained expression vector was analyzed by the method described in Example 1 (6), and amino acid substitution sites were identified.
（５）で選択した形質転換体が発現する免疫グロブリン結合性タンパク質のＳｐＡ８ｄ（配列番号１８）に対するアミノ酸置換位置、および１Ｍ ＮａＯＨを用いて３５℃で１５時間アルカリ処理したときの残存活性［％］をまとめた結果を表１１に示す。配列番号１８に記載のアミノ酸配列において、Ａｓｎ（Ｉｌｅ）３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ（Ａｒｇ）４Ｔｈｒ、Ｓｅｒ３９ＧｌｙおよびＬｙｓ４２Ｌｅｕのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じた免疫グロブリン結合性タンパク質は、ＳｐＡ８ｄ（配列番号１８）と比較しアルカリ安定性が向上しているといえる。 Amino acid substitution position for SpA8d (SEQ ID NO: 18) in the immunoglobulin binding protein expressed by the transformant selected in (5) and residual activity [%] when treated with alkali using 1M NaOH at 35°C for 15 hours Table 11 summarizes the results. The immunoglobulin-binding protein in which at least one amino acid substitution of Asn(Ile)3His, Lys(Arg)4Thr, Ser39Gly, and Lys42Leu has occurred in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18 is SpA8d (SEQ ID NO: 18). It can be said that the alkali stability is improved compared to the above.
配列番号１８に記載のアミノ酸配列において、Ｉｌｅ３１８Ｈｉｓ（この表記は配列番号１８の３番目のイソロイシンがヒスチジンに置換されていることを表す、以下同じ）のアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ８ｆと命名）のアミノ酸配列を配列番号４９に、
Ａｒｇ４１８Ｔｈｒのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ８ｇと命名）のアミノ酸配列を配列番号５１に、
Ｓｅｒ３９１８Ｇｌｙのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ９ｆと命名）のアミノ酸配列を配列番号５０に、
Ｌｙｓ４２１８Ｌｅｕのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ９ｅと命名）のアミノ酸配列を配列番号４８に、それぞれ示す。なお、ＳｐＡ９ｆは実施例５（ランダム変異導入）で選択した株であり、ＳｐＡ９ｅ、ＳｐＡ８ｆおよびＳｐＡ８ｇは実施例６（部位特異的変異導入）で選択した株である。
In the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18, a protein (named SpA8f) in which the amino acid substitution of Ile3 18 His (this notation indicates that the third isoleucine in SEQ ID NO: 18 is replaced with histidine; the same applies hereinafter) has occurred. ) is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49,
The amino acid sequence of the protein (named SpA8g) in which the Arg4 18 Thr amino acid substitution occurred is shown in SEQ ID NO: 51.
The amino acid sequence of the protein (named SpA9f) in which the Ser39 18 Gly amino acid substitution has occurred is shown in SEQ ID NO: 50.
The amino acid sequence of the protein (named SpA9e) in which the Lys42 18 Leu amino acid substitution has occurred is shown in SEQ ID NO: 48. Note that SpA9f is the strain selected in Example 5 (random mutagenesis), and SpA9e, SpA8f, and SpA8g are the strains selected in Example 6 (site-specific mutagenesis).
実施例８ アミノ酸置換の集積
実施例７で明らかになった、免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換をＳｐＡ８ｄ（配列番号１８）に対し集積することで、更なる安定性の向上を図った。具体的には、以下の（ａ）および（ｂ）に示す２種類の免疫グロブリン結合性タンパク質を設計し、作製した。
（ａ）ＳｐＡ８ｄに対し、さらにＡｓｎ（Ｉｌｅ）３ＨｉｓおよびＬｙｓ４２Ｌｅｕのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＳｐＡ９ｇと命名）
（ｂ）ＳｐＡ８ｄに対し、さらにＡｓｎ（Ｉｌｅ）３Ｈｉｓ 、Ｓｅｒ３９ＧｌｙおよびＬｙｓ４２Ｌｅｕのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＳｐＡ１０ａと命名）
以下、（ａ）および（ｂ）に示す２種類の免疫グロプリン結合性タンパク質の作製方法について説明する。
Example 8 Accumulation of amino acid substitutions By accumulating the amino acid substitutions that are involved in improving the alkaline stability of immunoglobulin-binding proteins revealed in Example 7 to SpA8d (SEQ ID NO: 18), further stability can be achieved. I tried to improve it. Specifically, two types of immunoglobulin-binding proteins shown in (a) and (b) below were designed and produced.
(a) Protein with Asn(Ile)3His and Lys42Leu amino acid substitutions introduced into SpA8d (named SpA9g)
(b) A protein in which amino acid substitutions of Asn(Ile)3His, Ser39Gly, and Lys42Leu were introduced into SpA8d (named SpA10a)
Hereinafter, methods for producing two types of immunoglobulin-binding proteins shown in (a) and (b) will be explained.
（ａ）ＳｐＡ９ｇ
（ａ－１）実施例７で明らかになった、アルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ（Ｉｌｅ）３ＨｉｓおよびＬｙｓ４２Ｌｅｕを選択し、それらのアミノ酸置換をＳｐＡ８ｄ（配列番号１８）に対し集積したタンパク質ＳｐＡ９ｇを設計した。
(a) SpA9g
(a-1) Asn(Ile)3His and Lys42Leu were selected from among the amino acid substitutions involved in improving alkali stability revealed in Example 7, and these amino acid substitutions were made into SpA8d (SEQ ID NO: 18). In contrast, we designed a protein that accumulated, SpA9g.
（ａ－２）（ａ－１）で設計したＳｐＡ９ｇをコードするヌクレオチド配列を合成した後、ＰＣＲを用いて前記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。ＰＣＲは、前記合成したポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号５２（５’－ＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＧＣＧＣＧＧＡＣＣＡＴＣＧＣ－３’）および配列番号５３（５’－ＡＡＡＣＴＣＧＡＧＡＴＣＣＧＧＡＧＣＴＴＧＡＧＣ－３’）に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例１（３）と同様な方法で行なった。 (a-2) After synthesizing the nucleotide sequence encoding SpA9g designed in (a-1), a polynucleotide containing the nucleotide sequence was produced using PCR. PCR is performed by using the synthesized polynucleotide as a template DNA and using oligonucleotides consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 52 (5'-AAAACCATGGGCGCGGACCATCGC-3') and SEQ ID NO: 53 (5'-AAAACTCGAGATCCGGAGCTTGAGC-3') as PCR primers. The same method as in Example 1 (3) was carried out except that.
（ａ－３）得られたポリヌクレオチドを精製し、実施例１（４）と同様な方法で形質転換後、得られた形質転換体（遺伝子組換え大腸菌）から実施例１（５）と同様な方法で発現ベクター（ｐＥＴ－ＳｐＡ９ｇと命名）を抽出した。 (a-3) Purify the obtained polynucleotide and transform it in the same manner as in Example 1 (4), then use the obtained transformant (genetically recombinant E. coli) in the same manner as in Example 1 (5). An expression vector (named pET-SpA9g) was extracted using a conventional method.
（ａ－４）ｐＥＴ－ＳｐＡ９ｇのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（６）と同様の方法で行なった。 (a-4) The nucleotide sequence of pET-SpA9g was analyzed in the same manner as in Example 1 (6).
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ９ｇにＳｐＡ９ｇをコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。ＳｐＡ９ｇのアミノ酸配列を配列番号５４に、ＳｐＡ９ｇをコードするヌクレオチド配列を配列番号５５に、それぞれ示す。 As a result of sequence analysis, it was confirmed that a polynucleotide encoding SpA9g was inserted into the expression vector pET-SpA9g. The amino acid sequence of SpA9g is shown in SEQ ID NO: 54, and the nucleotide sequence encoding SpA9g is shown in SEQ ID NO: 55, respectively.
（ｂ）ＳｐＡ１０ａ
（ｂ－１）実施例７で明らかになった、アルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ（Ｉｌｅ）３Ｈｉｓ、Ｓｅｒ３９ＧｌｙおよびＬｙｓ４２Ｌｅｕを選択し、それらのアミノ酸置換をＳｐＡ８ｄ（配列番号１８）に対し集積したタンパク質ＳｐＡ１０ａを設計した。
(b) SpA10a
(b-1) Asn(Ile)3His, Ser39Gly and Lys42Leu were selected from among the amino acid substitutions involved in improving alkali stability revealed in Example 7, and these amino acid substitutions were made with SpA8d (SEQ ID NO: 18 ) was designed to accumulate protein SpA10a.
（ｂ－２）（ｂ－１）で設計したＳｐＡ１０ａをコードするヌクレオチド配列を合成した後、ＰＣＲを用いて前記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。ＰＣＲは、前記合成したポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号５２および配列番号５３に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例１（３）と同様な方法で行なった。 (b-2) After synthesizing the nucleotide sequence encoding SpA10a designed in (b-1), a polynucleotide containing the nucleotide sequence was produced using PCR. PCR was performed in the same manner as in Example 1 (3), except that the synthesized polynucleotide was used as a template DNA and oligonucleotides consisting of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 52 and SEQ ID NO: 53 were used as PCR primers. .
（ｂ－３）得られたポリヌクレオチドを精製し、実施例１（４）と同様な方法で形質転換後、得られた形質転換体（遺伝子組換え大腸菌）から実施例１（５）と同様な方法で発現ベクター（ｐＥＴ－ＳｐＡ１０ａと命名）を抽出した。 (b-3) Purify the obtained polynucleotide and transform it in the same manner as in Example 1 (4), and then use the obtained transformant (genetically recombinant E. coli) in the same manner as in Example 1 (5). An expression vector (named pET-SpA10a) was extracted using a conventional method.
（ｂ－４）ｐＥＴ－ＳｐＡ１０ａのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（６）と同様の方法で行なった。 (b-4) The nucleotide sequence of pET-SpA10a was analyzed in the same manner as in Example 1 (6).
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ１０ａにＳｐＡ１０ａをコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。ＳｐＡ１０ａのアミノ酸配列を配列番号５６に、ＳｐＡ１０ａをコードするヌクレオチド配列を配列番号５７に、それぞれ示す。 As a result of sequence analysis, it was confirmed that a polynucleotide encoding SpA10a was inserted into the expression vector pET-SpA10a. The amino acid sequence of SpA10a is shown in SEQ ID NO: 56, and the nucleotide sequence encoding SpA10a is shown in SEQ ID NO: 57, respectively.
実施例９ アミノ酸置換免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性評価（その２）
（１）ＳｐＡ８ｄ（配列番号１８）ならびに実施例８で作製したＳｐＡ９ｇ（配列番号５４）およびＳｐＡ１０ａ（配列番号５６）を発現する形質転換体を、実施例２（１）から（３）と同様な方法で培養した。
Example 9 Alkaline stability evaluation of amino acid substituted immunoglobulin binding protein (Part 2)
(1) Transformants expressing SpA8d (SEQ ID NO: 18), SpA9g (SEQ ID NO: 54) and SpA10a (SEQ ID NO: 56) produced in Example 8 were transformed in the same manner as in Example 2 (1) to (3). cultured using the method.
（２）培養終了後、遠心分離で集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（メルク社製）を用いてタンパク質抽出液を調製した。 (2) After completion of the culture, bacteria were collected by centrifugation, and a protein extract was prepared using BugBuster Protein Extraction Reagent (manufactured by Merck & Co., Ltd.).
（３）（２）で調製したタンパク質抽出液中の変異型免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１８、５４および５６）の濃度が等しくなるようＴｒｉｓ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）を用いて希釈した。希釈したタンパク質溶液の一部を採取し、一方には２Ｍ ＮａＯＨを、もう一方にはＴＢＳを、それぞれ前記採取したタンパク質溶液に対し等量添加し混合後、３５℃で１５時間静置した。 (3) The protein extract prepared in (2) was diluted with Tris-Buffered Saline (TBS) so that the concentrations of the mutant immunoglobulin-binding proteins (SEQ ID NOs: 18, 54, and 56) were equal. A portion of the diluted protein solution was collected, 2M NaOH was added to one portion, and TBS was added to the other portion in equal amounts to the sampled protein solution, mixed, and then allowed to stand at 35° C. for 15 hours.
（６）１５時間静置後、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を４倍量加えることで中和し、アルカリ処理（２Ｍ ＮａＯＨを混合）およびアルカリ未処理（ＴＢＳを混合）のタンパク質溶液の抗体結合活性を、実施例２（６）に記載のＥＬＩＳＡ法にてそれぞれ測定した。 (6) After standing for 15 hours, neutralize by adding 4 times the volume of 1M Tris buffer (pH 7.0), and prepare the alkali-treated (mixed with 2M NaOH) and non-alkali-treated (mixed with TBS) protein solutions. Antibody binding activity was measured by the ELISA method described in Example 2 (6).
結果を表１２に示す。ＳｐＡ９ｇ（配列番号５４）およびＳｐＡ１０ａ（配列番号５６）は、いずれもＳｐＡ８ｄ（配列番号１８）と比較し、残存活性が高くなっており、免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性が向上していることが確認された。 The results are shown in Table 12. Both SpA9g (SEQ ID NO: 54) and SpA10a (SEQ ID NO: 56) have higher residual activity than SpA8d (SEQ ID NO: 18), and the alkaline stability of the immunoglobulin-binding protein has improved. was confirmed.
Claims (8)
（a）配列番号１８から２０、２２、２３、４８から５１、５４および５６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、免疫グロブリン結合性タンパク質。(a) An immunoglobulin-binding protein comprising the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 18-20, 22, 23, 48-51, 54, and 56.
（ｂ）配列番号１８から２０、２２、２３、４８から５１、５４および５６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下（１）から（１９）のアミノ酸置換以外に１から５個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、ならびに／または付加を含み、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質よりもアルカリ耐性が向上していて、かつ免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質。(b) Contains the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 18 to 20, 22, 23, 48 to 51, 54, and 56, provided that, in the amino acid sequence, the amino acid substitutions other than the following (1) to (19) are It contains substitutions, deletions, insertions, and/or additions of 1 to 5 amino acid residues, has improved alkaline resistance than the immunoglobulin-binding protein containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, and has improved immunoglobulin resistance. A protein with globulin binding activity.
（１）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がバリンに置換(1) The amino acid residue corresponding to the 7th lysine in SEQ ID NO: 1 is replaced with valine
（２）配列番号１の３９番目のセリンに相当するアミノ酸残基がシステインに置換(2) The amino acid residue corresponding to serine at position 39 of SEQ ID NO: 1 is replaced with cysteine
（３）配列番号１の４７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリンに置換(3) The amino acid residue corresponding to glutamic acid at position 47 of SEQ ID NO: 1 is replaced with valine.
（４）配列番号１の５０番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアスパラギンに置換(4) The amino acid residue corresponding to lysine at position 50 of SEQ ID NO: 1 is replaced with asparagine.
（５）配列番号１の５８番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアスパラギンに置換(5) Amino acid residue corresponding to 58th lysine of SEQ ID NO: 1 is replaced with asparagine
（１５）配列番号１の４番目のリジンに相当するアミノ酸残基がトレオニンに置換(15) The amino acid residue corresponding to the 4th lysine in SEQ ID NO: 1 is replaced with threonine
（１６）配列番号１の３９番目のセリンに相当するアミノ酸残基がグリシンに置換(16) Amino acid residue corresponding to serine at position 39 of SEQ ID NO: 1 is replaced with glycine
（６）配列番号１の３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がイソロイシンに置換(6) The amino acid residue corresponding to the third asparagine in SEQ ID NO: 1 is replaced with isoleucine.
（７）配列番号１の４番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換(7) The amino acid residue corresponding to the 4th lysine in SEQ ID NO: 1 is replaced with arginine
（８）配列番号１の６番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸に置換(8) The amino acid residue corresponding to the 6th asparagine in SEQ ID NO: 1 is replaced with aspartic acid.
（９）配列番号１の１１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がリジンに置換(9) The amino acid residue corresponding to the 11th asparagine in SEQ ID NO: 1 is replaced with lysine.
（１０）配列番号１の１５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアラニンに置換(10) The amino acid residue corresponding to the 15th glutamic acid in SEQ ID NO: 1 is replaced with alanine
（１１）配列番号１の２１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がチロシンに置換(11) The amino acid residue corresponding to the 21st asparagine in SEQ ID NO: 1 is replaced with tyrosine.
（１２）配列番号１の２９番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換(12) The amino acid residue corresponding to glycine at position 29 of SEQ ID NO: 1 is replaced with alanine.
（１３）配列番号１の４０番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換。(13) The amino acid residue corresponding to valine at position 40 of SEQ ID NO: 1 is replaced with alanine.
（１４）配列番号１の３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がヒスチジンに置換(14) The amino acid residue corresponding to the third asparagine in SEQ ID NO: 1 is replaced with histidine.
（１７）配列番号１の４２番目のリジンに相当するアミノ酸残基がロイシンに置換。(17) The amino acid residue corresponding to 42nd lysine in SEQ ID NO: 1 was replaced with leucine.
（１８）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がグルタミン酸に置換。(18) The amino acid residue corresponding to the 7th lysine in SEQ ID NO: 1 was replaced with glutamic acid.
（１９）配列番号１の５８番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸に置換。(19) The amino acid residue corresponding to lysine at position 58 of SEQ ID NO: 1 was replaced with aspartic acid.
（ｃ）配列番号１８から２０、２２、２３、４８から５１、５４および５６に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし前記（１）から（１９）のアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含み、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質よりもアルカリ耐性が向上していて、かつ免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質。(c) An amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 18 to 20, 22, 23, 48 to 51, 54, and 56, provided that the above (1) to (19 ), which has an improved alkali resistance than the immunoglobulin-binding protein containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, and has immunoglobulin-binding activity.
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