JP7430885B2 - 細胞播種基材の低温保存及び関連する方法 - Google Patents

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Description

関連出願への相互参照
本出願は、全ての目的のために参照によりその全体を本明細書に組み込む、2018年9月7日出願の米国仮出願第62/728,646号の利益を主張する。
連邦政府が後援する研究開発の下で達成された発明の権利に関する記載
該当なし
1. 発明の分野
本出願は一般に、超薄基材を標的組織に移植するための器具及び方法に関し、超薄基材は、他の治療的処置の中でも、幹細胞療法のための幹細胞、マイクロバブル、及び薬物送達のための注入されたゲルの播種に適している。超薄基材は更に、細胞の再生可能な培養及び細胞を播種した後の低温保存に使用することができる。
2. 関連技術の説明
細胞の損失又は損傷に関与するヒト疾患の範囲は、非常に広く、それだけには限らないが、眼疾患、神経変性疾患、内分泌疾患、心臓血管疾患、及び癌を含む。細胞療法は、患部組織又は損傷組織を治療するために細胞の使用を伴う。それは、多くの疾患、特に従来の薬理学的治療に反応しない個人に影響を与える疾患を治療する用意ができている技術の最先端に急速に台頭してきている。これらの疾患の多くは、長期の集中した標的領域治療の恩恵を受け、それは全身性副作用を減らすであろう。しかしながら、タンパク質治療薬等の特定の薬物は、高価であり、1バイアル当たり数千ドルかかり、終わりのない反復治療を必要とする。
実際に、細胞療法の適用候補である多くの疾患は、致命的ではないが、通常の生理機能の損失を伴う。例えば、眼疾患は、視力に影響を及ぼす種々の眼組織の機能変性を伴うことが多く、それによって多くの個人の生活の質に影響する。
哺乳動物の目は、前方光学系(角膜及び水晶体)によって集束された入射光子を神経化学的な信号に変換することができる特殊な感覚器官である。この光伝達のプロセスにより、視神経を介して活動電位をより高次の皮質中枢へ送ることによって視覚が可能になる。眼の網膜は、種々のレベルの光を感知する光受容体及び光受容体からの信号を網膜神経節細胞にリレーする介在ニューロンを含む。これらの光受容体は、(体ではないにしても)眼において最も代謝的に活性な細胞であり、代謝的かつ機能的に網膜色素上皮(RPE)細胞によって支持される。これらのRPE細胞は、眼の単層に位置し、視力にとって極めて重要である。
眼の外傷、感染、変性、血管異常、及び炎症性問題を含む多くの病状は、視覚映像を知覚する個人の能力を損なうか又は完全に排除する可能性がある。網膜の中央部は、黄斑として知られており、中心視、微細な視覚化及び色の識別を担っている。黄斑の機能は、他の病状の中で、加齢黄斑変性症(湿潤又は乾燥)、糖尿病性黄斑浮腫、特発性脈絡膜血管新生、高度近視黄斑変性症、又は進行した色素性網膜炎によって悪影響を受ける可能性がある。
加齢黄斑変性症は通常、網膜損傷のために視野の中心(黄斑)における視力の喪失を引き起こす。これは、高齢者(>50歳)の視力障害の主な原因である。黄斑変性症は、「湿潤」及び「乾燥」形態で発生する。
乾燥形態では、細胞片(ドルーゼン)がRPE細胞層と脈絡膜の間に蓄積し、それがRPE細胞に悪影響を及ぼし、それらの機能障害、変性、及び最終的には死に至る。重要な支持機能を果たすために生存可能なRPE細胞に依存する網膜の光受容細胞は、機能不全に陥り、RPE細胞の病状の次に死滅する。
より深刻な湿潤形態では、脈絡膜から新たに形成された血管が黄斑の後ろの空間に浸潤し、新たに形成された血管は脆く、しばしば血液を漏らし-それによって光受容体及びそれらの支持細胞が死滅する。
特定の細胞又は組織に対する損傷を引き起こす疾患は、細胞療法のための明確な候補であるものの、細胞療法の改善された方法が依然として当技術分野で必要とされており、それには、細胞療法の有効性を改善する方法、基材、及び器具、並びにこのような治療において用いられる機能細胞及び生細胞の長期保存を可能にする方法及び組成物が含まれる。
米国特許第8,808,687号
Kashani AH、Lebkowski JS、Rahhal FMら A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry AMD. Sci. Transl. Med. 2018;10:435頁、eaao4097.
種々の実施形態では、本発明は一般に、基材上に成長した細胞の低温保存（又は「凍結保存」ともいう）のための方法及び組成物に関する。特に、ポリマー基材上に播種及び/又は成長した細胞の低温保存のための方法及び組成物に関する。特定の用途では、細胞は、細胞の分化、由来又は培養履歴に関係なく、網膜色素上皮(RPE)細胞、光受容細胞、幹細胞、前分化細胞、そのような細胞の分化したもの、又はその組合せである。
細胞療法で用いられる細胞含有組成物の改善された長期保存の必要性に対処するため、いくつかの実施形態において、所望の温度低下速度を有する温度ランプダウン(ramp-down)フェーズに、細胞の組成物が播種された基材を曝露する工程と、細胞が播種された基材を第1の期間、所望の中間温度範囲に移す工程と、細胞が播種された基材を第2の期間、所望の保存温度範囲で維持することにより、長期保存及び解凍後の細胞療法での使用に適した低温保存された細胞を基材上に得る工程とを含む、基材上の細胞を低温保存する方法が提供される。
本発明は、種々の実施形態において、種々の細胞特性に受け入れるために、特定の低温保存方法及び手順の工程の変形形態を提供する。その上、特定の細胞特性及び基材特性は、有効な治療のための細胞が播種された基材の細胞の生存度及び移植成功を改善するために低温保存プロセスの種々の段階において選択される。
本発明は、より高い細胞生存、基材への最小限の損傷、及び細胞増殖と直接移植に適した細胞が播種された基材を生成するための全体的な簡素化されたプロセスを含む、基材の低温保存のための有益な結果を含む多くの利点を提供する新しい方法及び装置を導入する。
別の態様では、本発明は、意図的なメラニン形成の抑制の方法を導入する。このような方法は、キットに含まれる特定の品目によって可能になる場合がある。
本発明はまた、細胞増殖、細胞増殖速度、生存度、及び分化を改善するために細胞特異的培地を形成する新しい方法を導入する。特定の実施形態では、このような細胞特異的培地は、抽出し、特定の細胞又は既に移植された細胞が播種された基材の領域への硝子体内(IVT)送達等の直接注射に更に適合させることができる。
1台又は複数のコンピューターのシステムは、動作中にシステムにアクションを行なわせるソフトウェア、ファームウェア、ハードウェア、又はそれらの組合せをシステムにインストールすることにより、特定の動作又はアクションを行なうように構成することができる。1つ又は複数のコンピュータープログラムは、データ処理装置によって実行されるとき、装置にアクションを行なわせる命令を含むことにより、特定の動作又はアクションを行なうように構成することができる。一般的な一態様は、基材上の細胞を低温保存する方法を含み、この方法は、未成熟網膜色素上皮(rpe)細胞の単層が播種された生体適合性ポリマー基材を準備する工程であって、ポリマー基材が細胞播種表面を提供する、工程を含む。細胞を低温保存する方法は、i)未成熟rpe細胞の単層が基材上で90%～99%集密（「コンフルエント」ともいう）に達する場合、及びii)未成熟rpe細胞のほとんどが完全に色素沈着していない場合を識別する工程も含む。細胞を低温保存する方法は、識別されたら、細胞が播種された基材を、-20℃未満の第1の温度に達するまで、約-1℃/分～約-30℃/分の制御された温度低下速度に曝露する工程も含む。本態様の他の実施形態は、対応するコンピューターシステム、装置、及び1つ又は複数のコンピューター記憶デバイスに記録されているコンピュータープログラムを含み、それぞれが本方法のアクションを行なうように構成される。
実装形態は、以下の特徴の1つ又は複数を含み得る。方法において、細胞が播種された基材が、播種された細胞の潜熱放出を表す温度よりも低い温度に達する。方法において、表面は、播種された細胞の潜熱放出に反応して核形成及び効率的な温度補償を誘導するのに十分な程度に、基材上に播種された未成熟rpe細胞の単層と実質的に平行である。方法において、細胞が播種された基材を第1の温度で維持する工程であって、温度の均一性を得るために第1の期間の制御された温度低下速度後に第1の温度が-20℃～約-100℃である、工程を更に含む。方法において、細胞を第1の温度より50℃以内の第1の温度よりも低い保存温度で第2の期間維持し、それによって低温保存された細胞を得る工程も含み得る。方法において、細胞が播種された基材を第1の温度で維持する工程であって、第1の期間の制御された温度低下速度後に第1の温度が-20℃～約-100℃である、工程を更に含む。方法において、第2の制御された温度低下速度を実施して最終的に細胞を-196℃未満の保存温度で第2の期間維持し、それによって低温保存された細胞を得る工程も含み得る。方法において、第2の期間が24時間～60か月である。方法において、第2の制御された温度低下速度が約-1℃/分～約-30℃/分である。方法において、細胞の単層が、細胞懸濁液1ミリリットル当たり細胞200,000～700,000個、又は基材表面1平方センチメートル当たり細胞100,000～350,000個の細胞播種密度を有する。方法において、rpe細胞の50%超が丸石状の形態を有する。方法において、rpe細胞が色素沈着していない、又は部分的に色素沈着している。方法において、細胞が、(i)色素沈着していない又は部分的に色素沈着したrpe細胞、(ii)付着しているが非分極、部分分極、又は完全分極のrpe細胞、(iii)成熟した丸石状の形態を有する又は有しないrpe細胞、(iv)遺伝子発現レベルが成熟細胞のレベルよりも低い又は特定の遺伝子発現が欠如しているrpe細胞、及び(v)集密又は90%を超える準集密単層構成のrpe細胞から選択される低温保存生存度特性を示すrpe細胞である。方法において、基材が、(i)基材の熱膨張係数、(ii)基材の弾性パラメーター、(iii)基材の厚さ、(iv)表面改質、(v)剪断力耐性から選択される1つ又は複数の特性を有し、前記特性は、低温保存及び解凍中に、播種された細胞の生存度及び基材の機能性を向上させるのに役立つ。方法において、生体適合性ポリマーがパリレンを含む。方法において、識別する工程は、未成熟rpe細胞の少なくとも1つ又は複数の頂端分泌物、基底（「基礎」ともいう）分泌物、又は非極性特異的分泌物が成熟rpe細胞のレベルよりも低いレベルである場合を決定することを含む。方法において、頂端分泌物は、αbクリスタリン、ヒアルロナン、マトリックスメタロペプチダーゼ(mmp)-9、色素上皮由来因子(pedf)、形質転換成長因子(tgf)-β、メタロプロテイナーゼ(timp)-iの組織阻害剤、又はメカノ成長因子(mgf)-e8を含む。方法において、基底分泌物は、シスタチンc、エンドセリンi、繊維芽細胞成長因子(fgf)5、又は血管内皮増殖因子(vegf) を含む。方法において、非極性特異的分泌物は、脳由来神経栄養因子(bdnf)、補体因子h(cfh)、毛様体神経栄養因子(cntf)、フィブリン3/5、繊維芽細胞成長因子(fgf)2、ヘパリン結合性上皮成長因子(hb-egf)、肝細胞成長因子(hgf)、インスリン様成長因子(igf)-i、白血病抑制因子(lif)、マトリックスメタロプロテイナーゼ(mmp)-9、神経成長因子(ngf)、トロポエラスチンを含む。方法において、識別する工程は、少なくとも1つ又は複数のrpe65、rex1、eif2b2、serf2、ube2r2の未成熟rpe細胞の遺伝子発現が、成熟rpe細胞の発現よりも低いことを決定することを含む。方法において、基材は、細胞がそれを通して栄養素を拡散できるように構成された薄い領域を含む。説明された技術の実装形態は、ハードウェア、方法若しくはプロセス、又はコンピューターアクセス可能媒体上のコンピューターソフトウェアを含み得る。
一般的な一態様は、移植可能な細胞が播種された基材を生成する方法を含み、この方法は、未成熟網膜色素上皮(rpe)細胞の単層が播種された生体適合性ポリマー基材を提供するステップであって、ポリマー基材が細胞播種表面を提供する、工程を含む。方法はまた、細胞が播種された基材を、約-1℃/分～約-30℃/分の制御された温度低下速度に曝露することによって基材上の細胞を低温保存する工程を含む。方法はまた、細胞が播種された基材を4℃未満の温度に移し、それによって低温保存された又は休止した細胞を得る工程を含む。方法はまた、温度ランプアップ(ramp-up)加熱速度を用いて細胞が播種された基材を標的温度まで暖めて、基材上に播種された解凍細胞を得ることによって、低温保存した前記基材上の細胞を解凍する工程であって、解凍細胞は、解凍後も生存度及び/又は機能性を保持する、工程を含む。方法はまた、移植前に成熟状態に達するために、播種された細胞を追加の期間培養する工程を含む。本態様の他の実施形態は、対応するコンピューターシステム、装置、及び1つ又は複数のコンピューター記憶デバイスに記録されているコンピュータープログラムを含み、それぞれが本方法のアクションを行なうように構成される。
実装形態は、以下の特徴の1つ又は複数を含み得る。方法は、解凍後の基材に播種された細胞を、少なくとも1つ又は複数のウシ血清アルブミン(bsa)、アクチビンa、肝細胞成長因子(fgf)、インスリン様成長因子(igf)1、dickkopf関連タンパク質1(dkk1)、及びノギンを含む組合せを補充した基本培地を含む第1の培地で培養する工程を更に含む。方法は、解凍後の基材に播種された細胞を、以前に培養したrpe細胞に由来する上清を補充した基本培地を含む第1の培地で培養し、続いて細胞を、インスリン様成長因子(ifg)1、dickkopf関連タンパク質1(dkk1)、及びノギンを補充した基本培地を含む第2の培地で培養する工程を更に含む。方法において、第1の培地の上清が、(i)色素沈着していない又は部分的に色素沈着したrpe細胞、(ii)非分極又は部分分極rpe細胞、(iii)少なくとも50%成熟した丸石状の形態を有する又は有しないrpe細胞、(iv)遺伝子発現レベルが成熟細胞のレベルよりも低い又は特定の遺伝子発現が欠如しているrpe細胞、及び(v)準集密又は集密単層構成のrpe細胞から選択される最適な低温保存生存度特性を示すrpe細胞を含む未成熟rpe細胞の培養物に由来する。方法において、第1の培地の上清が、(i)色素沈着したrpe細胞、(ii)分極rpe細胞、(iii)成熟した丸石状の形態を有するrpe細胞、(iv)遺伝子発現レベルが成熟rpe細胞に相当するrpe細胞、及び(v)集密単層構成のrpe細胞から選択される成熟特性を示すrpe細胞の培養物に由来する。説明された技術の実装形態は、ハードウェア、方法若しくはプロセス、又はコンピューターアクセス可能媒体上のコンピューターソフトウェアを含み得る。
一般的な一態様は、細胞株特異的培地又は無細胞療法を作成する方法を含み、この方法は、未成熟rpe細胞を成長支持構造上で培養する工程であって、rpe細胞は、(i)色素沈着していないrpe細胞、(ii)非分極又は部分分極rpe細胞、(iii)成熟した丸石状の形態を有しないrpe細胞、(iv)遺伝子発現レベルが成熟細胞のレベルよりも低い又は特定の遺伝子発現が欠如しているrpe細胞、及び(v)準集密単層構成のrpe細胞から選択される最適な低温保存生存度特性を示す、工程を含む。方法はまた、分泌因子を含有する培養液を回収する工程を含む。方法はまた、培養液を精製して培地又は無細胞療法を作成する工程を含む。本態様の他の実施形態は、対応するコンピューターシステム、装置、及び1つ又は複数のコンピューター記憶デバイスに記録されているコンピュータープログラムを含み、それぞれが本方法のアクションを行なうように構成される。
実装形態は、以下の特徴の1つ又は複数を含み得る。方法は、培養液を生成する前に、細胞が、(i)色素沈着したrpe細胞、(ii)分極rpe細胞、(iii)成熟した丸石状の形態を有するrpe細胞、(iv)遺伝子発現レベルが成熟細胞と同様のrpe細胞、及び(v)集密単層構成のrpe細胞から選択される成熟特性を示すまでrpe細胞を培養する工程を更に含む。方法において、精製が、遠心濾過、分画、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除濾過、又は沈殿によって達成される。本方法は、培地上清を注射器に詰める工程を更に含む。上清に薬物媒体又は希釈剤が補充される。方法は、光受容細胞又は光受容前駆細胞を培養する工程を更に含む。方法において、成長支持構造は、基材、格子構造、寒天、又はヒドロゲルを含む。方法において、細胞は、生体適合性基材又は容器の上で、中で、又は生体適合性基材又は容器中に封入（又は「カプセル化」ともいう）されて成長する。説明された技術の実装形態は、ハードウェア、方法若しくはプロセス、又はコンピューターアクセス可能媒体上のコンピューターソフトウェアを含み得る。
一般的な一態様は、疾患又は障害を治療するための方法を含み、対象に、以下を含む方法によって得られた有効量のrpe細胞特異的培地又は無細胞療法を投与する工程を含む。方法はまた、成長支持構造上でrpe細胞を培養する工程を含み、rpe細胞は、rpe65レベルの検出よって特徴付けられる成熟した特性を示す。方法はまた、分泌因子を含有する培養液を回収する工程を含む。方法はまた、培養液を精製して培地又は無細胞療法を作成する工程を含む。本態様の他の実施形態は、対応するコンピューターシステム、装置、及び1つ又は複数のコンピューター記憶デバイスに記録されているコンピュータープログラムを含み、それぞれが本方法のアクションを行なうように構成される。
実装形態は、以下の特徴の1つ又は複数を含み得る。方法は、rpe細胞を移植する工程を更に含む。方法は、基材上に播種されたrpe細胞を移植する工程を更に含む。方法は、光受容細胞を移植する工程を更に含む。方法は、rpe細胞及び光受容細胞を基材上に移植する工程を更に含む。方法において、精製が、遠心濾過、分画、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除濾過、又は沈殿によって達成される。方法において、成長支持構造が、基材、格子構造、寒天、又はヒドロゲルであってもよい。方法において、細胞が、生体適合性基材又は容器の上で、中で、又は生体適合性基材又は容器中に封入されて成長する。説明された技術の実装形態は、ハードウェア、方法若しくはプロセス、又はコンピューターアクセス可能媒体上のコンピューターソフトウェアを含み得る。
一般的な一態様は、患者の機能的外境界膜の患部部位と実質的に同様の正常状態又は柔軟な状態の曲率及びサイズを有する基材を含む、網膜の生体（又は「解剖学的」ともいう）構造の外境界膜を生成するための細胞療法のための基材を含む。基材はまた、移植後に成熟して外境界膜を生成する独立した個々の層としての、基材に播種されたrpe細胞及び光受容細胞を含む。本態様の他の実施形態は、対応するコンピューターシステム、装置、及び1つ又は複数のコンピューター記憶デバイスに記録されているコンピュータープログラムを含み、それぞれが本方法のアクションを行なうように構成される。
実装形態は、以下の特徴の1つ又は複数を含み得る。移植後に患者の前駆細胞を誘引して外境界膜を生成するために、培養液でコーティングされる基材。基材は、成長支持構造上でrpe細胞を培養する工程によって製造される培地上清を更に含む。基材はまた、rpe65レベルの検出によって特徴付けられる成熟した特性を示すrpe細胞を含み得る。基材はまた、分泌因子を含有する培養液を回収する工程を含み得る。基材はまた、培養液を精製して培地又は無細胞療法を作成する工程を含み得る。
説明された技術の実装形態は、ハードウェア、方法若しくはプロセス、又はコンピューターアクセス可能媒体上のコンピューターソフトウェアを含み得る。
一般的な一態様は、第1の培地中で第1の細胞株を選択的透過性基材上で培養する工程を含む、細胞特異的培地を生成する方法を含み、ここで、前記第1の細胞株が第1の培地を処理し、細胞分泌物を生成する。方法はまた、細胞分泌物を回収する工程を含む。方法はまた、細胞分泌物を第2の培地に加えて細胞特異的培地を形成する工程を含む。本態様の他の実施形態は、対応するコンピューターシステム、装置、及び1つ又は複数のコンピューター記憶デバイスに記録されているコンピュータープログラムを含み、それぞれが本方法のアクションを行なうように構成される。
実装形態は、以下の特徴の1つ又は複数を含み得る。方法において、細胞分泌物が、タンパク質、ホルモン、酵素、副産物及び老廃物（「廃棄物」ともいう）の組合せを含む。方法において、細胞分泌物が、αbクリスタリン、ヒアルロナン、マトリックスメタロプロテイナーゼ(mmp)-9、色素上皮由来因子(pedf)、形質転換成長因子(tgf)-β、メタロプロテイナーゼ(timp)-iの組織阻害剤の少なくとも1つを含むrpe細胞からの頂端分泌物を含む。方法において、細胞分泌物が、シスタチンc、エンドセリンi、繊維芽細胞成長因子(fgf)5、血管内皮増殖因子(vegf)の少なくとも1つを含むrpe細胞からの基底分泌物を含む。方法において、細胞分泌物が、bdnf、cfh、cntf、フィブリン3/5、fgf 2、hb-egf、hgf、igf-i、lif、mmp-9、ngf、トロポエラスチンの少なくとも1つを含むrpe細胞からの非極性特異的分泌物を含む。基材は、播種された細胞の極性を誘導して、頂端、基底、及び非極性特異的分泌物を分泌できるようにする。形成された細胞特異的培地は、非成熟rpe細胞の制御された成長のためである。形成された細胞特異的培地は、成熟rpe細胞への非成熟rpe細胞の制御された成熟のためである。形成された細胞特異的培地は、硝子体内(ivt)注射剤のために調製される。説明された技術の実装形態は、ハードウェア、方法若しくはプロセス、又はコンピューターアクセス可能媒体上のコンピューターソフトウェアを含み得る。
一般的な一態様は、第1の培地中で第1の細胞株を選択的透過性基材上で培養する工程を含む、治療組成物を形成する方法を含み、ここで、前記第1の細胞株が第1の培地を処理し、細胞分泌物を生成する。方法はまた、細胞分泌物を回収する工程を含む。方法はまた、特異的細胞分泌物を選択することによって細胞分泌物を精製する工程を含む。本態様の他の実施形態は、対応するコンピューターシステム、装置、及び1つ又は複数のコンピューター記憶デバイスに記録されているコンピュータープログラムを含み、それぞれが本方法のアクションを行なうように構成される。
実装形態は、以下の特徴の1つ又は複数を含み得る。方法は、異なる速度で1回又は複数回遠心分離し、再構成して様々な組成の1個又は複数のペレットを作成する工程を更に含む。方法は、分画、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除濾過、又は沈殿を更に含む。本方法は、異なる濃度に再構成する工程を更に含む。形成された治療組成物が細胞を含有しない。説明された技術の実装形態は、ハードウェア、方法若しくはプロセス、又はコンピューターアクセス可能媒体上のコンピューターソフトウェアを含み得る。
一般的な一態様は、所定量の培養液に実質的に囲まれた膜を別のポリマー表面に配置する工程を含む、ポリマー膜を別のポリマー表面に可逆的に付着させる方法を含む。方法はまた、膜の平らな表面が別のポリマー表面の平らな表面に接触するまで、所定量の培養液を徐々に取り出す工程を含む。方法はまた、乾燥させて、膜の平らな表面を、接触している別のポリマー表面の平らな表面に可逆的に付着させる工程を含む。本態様の他の実施形態は、対応するコンピューターシステム、装置、及び1つ又は複数のコンピューター記憶デバイスに記録されているコンピュータープログラムを含み、それぞれが本方法のアクションを行なうように構成される。
実装形態は、以下の特徴の1つ又は複数を含み得る。方法において、ポリマー表面が、細胞培養プレート又はウェルの底面である。方法において、培養液がDulbecco社のリン酸緩衝食塩水(dpbs)である。方法において、乾燥工程が、デシケーター、温度/湿度制御チャンバー、乾燥器でのベーク、又はクリーンルーム等の制御された部屋での放置によって実施される。方法において、ポリマー膜がパリレンである。方法は、所定量の培養液を導入して、膜の平らな表面を、別のポリマー表面の接触している平らな方面から引き離す工程を更に含む。説明された技術の実装形態は、ハードウェア、方法若しくはプロセス、又はコンピューターアクセス可能媒体上のコンピューターソフトウェアを含み得る。
上記は、特に図面と共に考慮される場合、以下の本発明の詳細な説明からより容易に理解されるであろう。
一実施形態に基づいて、基材調製から移植までの低温保存プロセスを例示するフローチャートである。 一実施形態に基づいて、低温保存の制御された温度ランプダウン工程中に基材上に播種された細胞による潜熱の放出を示すグラフである。 一実施形態に基づいて、栄養素の拡散のためのパターン化された薄い表面を強調する細胞播種のための基材と、細胞増殖を可能にする支持構造の例である。 一実施形態に基づいて、RPE細胞の色素沈着の工程を例示するフローチャートであり、特に、(A)色素沈着していない未成熟RPE細胞、(B)プレメラノソーム(線紋が現れる)、(C)メラノソーム(色素が線紋に沈着し、線紋と色素の両方が観察される)、(D)成熟RPE細胞(色素で覆い隠された線紋で満たされている)である。 例示的な立方体様の丸石状の形態の写真である。 丸石状の形態と繊維芽細胞形態の混合物を含有する無秩序な形態の写真である。 一実施形態に基づいて、均一な細胞増殖を示し、集密に近い(90～99%密度)又は100%集密な基材の写真である。目視では区別ができず、実際の集密度の比率には画像技術が必要である。 一実施形態に基づいて、不均一な細胞増殖を示し、たった約70%集密な基材の写真である。 一実施形態に基づいて、未成熟RPE細胞対成熟RPE細胞によるPEDF分泌の違いを例示するグラフである。 一実施形態に基づいて、RT-qPCRによって測定した遺伝子発現の種々の値(Value)を例示するグラフである。特に、成熟RPE細胞の範囲のRPE65 ΔCt≧-3.0、REX1 ΔCt≦-8.0である。参照遺伝子(EIF2B2、SERF2、UBE2R2)の幾何平均は、Ct≦32.0である。MAP2、S100A4、TYRP1、及びLIN28Aを含むいくつかの他の遺伝子は、情報のためだけにテストされる。 一実施形態に基づいて、IVTとして注射するか又はその後の培養用の補充培養液として使用できる、特異的な細胞分泌因子を含有する標的上清の製造工程を例示するフローチャートである。 光受容体と1つ又は複数の基材上のRPE細胞との間の相互作用を強調した一実施形態の簡略図である。 一実施形態に基づいて、膜を細胞培養ウェルに可逆的に付着させるプロセスを例示するフローチャートである。このような方法は、自動基材コーティングのための基材の固定、又は固定したX及びY軸配向に依存する細胞播種プロセスに有益である。付着は、所定量の培養液を膜に導入することによって可逆的である。 一実施形態に基づいて、低温保存後及び移植後の全体的な細胞生存度を、強調表示された特定の遺伝子発現と共に比較する種々の対比画像である。 一実施形態に基づいて、対照の凍結されていない細胞と比較した、使用した凍結保護剤の違いによる解凍後1日の細胞形態の違いを示す複数の画像である。 一実施形態に基づいて、対照の凍結されていない細胞と比較した、使用した凍結保護剤の違いによる解凍後1週間の細胞形態の違いを示す複数の画像である。 一実施形態に基づいて、非低温保存と低温保存後を比較した単一試料から得られた遺伝子発現の6つのグラフである。 一実施形態に基づいて、比色代謝アッセイによる代謝のグラフを示す。
本発明は、一般に、細胞が播種された基材、細胞評価プロセス、並びに基材上への播種及び低温保存プロセスによって細胞播種膜の生存度を高める方法に関する。細胞播種膜は、従来の単一細胞又は細胞のクラスターとは異なり、低温保存後及び解凍後の生存度を高めるために特別な考慮が必要である。特に下記の適応を行なうことにより、結果は、細胞の生存性増加だけでなく、移植後を含む生存細胞の健康(例えば代謝活性、寿命)の増加を示している。
低温保存最適化:基材/膜
いくつかの実施形態では、基材は、播種表面として機能する生体適合性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、基材は、他の材料と併せてパリレンを含み、他の材料は、生分解性又は非生分解性のいずれかである。いくつかの実施形態では、播種された細胞の生存度を向上させる1つ又は複数の特性を有するように、基材を処理する。例えば、いくつかの実施形態では、基材は、基材への細胞の付着を向上させるためのコーティングを更に含む。ある実施形態では、コーティングは、1つ又は複数のマトリゲル、ビトロネクチン、フィブロネクチン、及びレトロネクチン、又は誘導体化パリレンの層を含む。当業者に既知の他の細胞培養液及びその種々の組合せは、代用可能である。他の実施形態では、他のコーティング又は表面改質を用いて、基材への改善された細胞付着を達成及び/又は低温保存プロセス中及びその後における細胞及び基材の耐久性及び/又は生存度を改善する。例えば、いくつかの実施形態では、コーティングは、低温保存中、低温保存後、又は両方における細胞の生存度を向上させる。別の実施例では、基材の細胞増殖表面を酸素で処理して、親水性細胞増殖表面を作成する。他の表面処理は、酸素プラズマ処理、化学エッチング、及び追加のポリマー堆積を含む。追加のポリマー堆積は、その弾性(例えば200の破断点伸び(%))に関してパリレン-C、その高い酸素ガス透過性(cc.mm/m2日)に関してパリレン-N等、それらの機能的要求に応じて、異なるパリレン型を使用する場合に特に有用である。(Specialty Coating Systems社、KISCO株式会社)。更に、官能化パリレンは、表面に堆積させて、それだけには限らないが、(1)抗凝固特性を有し、それによって移植の血液適合性を高めるタンパク質であるR-ヒルジン、(2)骨芽細胞の付着を改善するためにフィブロネクチンを表面に共有結合させるアミン官能基、及び(3)組織の付着を促進する疎水性表面を形成するpNIPAM鎖(Tanら2010)を含む、活性な化学官能基を付与することができる。
ある実施形態では、基材の特性は、基材の熱膨張係数、基材の弾性パラメーター、又は基材の厚さのうちの1つ又は複数を含む。いくつかの実施形態では、基材は、パリレンを含み、選択的透過性であり、その特性は、基材の厚さを含み、その厚さは、栄養素が基材を通過できるように選択される。基材は、貫通孔がなく、透過性特性に関して基材の厚さだけに依存していることもある。したがって、解凍後に標的部位に移植すると、基材は細胞へ適切な栄養素が通過すること及び/又は細胞廃棄物が基材から離れて適切に通過するこが可能になる。ある実施形態では、播種された細胞への悪影響が減るような基材の熱膨張係数が得られるように、厚さが選択される。厚さは、低温保存すべき細胞が2つ以上の材料の間に播種される実施形態(例えば挟まれた、固定された、又は他の実施形態)において特に重要であり、ここで、使用する細胞又は凍結保護剤の膨張が、凍結中に拡大する可能性があり、それによって基材及び/又は細胞を損傷し得る剪断、ねじれ、又は他の応力がもたらされる。ある実施形態では、材料及び厚さは、播種された細胞の潜熱の放出に干渉しない熱エネルギー放出特性をもつように選択される。ある実施形態では、材料構成は、低温保存及び解凍手順中に遭遇し得る支持構造の六角形のハニカムパターン等、剪断力抵抗が増大するように選択される。
異なる細胞の2つ以上の層が膜上に配置されているある実施形態では、第2の基材層は、別々の層内に分離された増殖を促進するために、そのような細胞層の間に配置してもよい。例えば、細胞が播種された基材が第1の基材層の特定の順序からなる場合、基底側を含むRPE細胞からなる細胞の第1の層は基材と接しており、光受容細胞からなる細胞の第2の層は細胞の第1の層の頂端表面に接しており、第2の基材層は細胞の第1の層と第2の層の間に配置され得る。一実施形態では、2つの細胞層を第1の基材層上で同時に成長させ、RPE細胞の第1の細胞層は最初に基材上に播種され、後続の時点で光受容体の第2の細胞層はRPE細胞の上にある基材上に播種される。そのような時間は1～10日後であってもよく、それによってRPE細胞が主に最初に基材に付着することが可能になる。他の実施形態では、別の細胞型に分化することになる網膜前駆細胞、上皮細胞、他の眼細胞、幹細胞、又は再プログラムされた細胞は、1つ又は複数の層から構成され得る。他の実施形態は、特定の細胞シグナル伝達を促進して隣接する層を再プログラムするために、特定の因子(例えばタンパク質、増殖因子、抗体)を特異的に生成するための遺伝子編集による特定の操作された細胞を含み得る。種々の実施形態では、RPE幹細胞は、光受容細胞の生存を更に支持する神経栄養因子(例えばPEDF、CNTF、BDNF)を分泌するように改変され得る。他の実施形態では、表面インテグリンの過剰発現は、ブルック膜へのRPE付着を向上させ、メラニンの増加によりAMDのリスクが低下し、食作用に必要な受容体の過剰発現は、細胞層の健康を妨げる可能性があるリオプフィシン(liopfiscin)及び他の代謝廃棄物のクリアランスを増加させる。
他の実施形態では、各細胞層は、別々の基材上でそれぞれ独立に成長する。本実施形態では、第2の基材を生分解性にするか、或いはスタッキング及び移植後に1つ又は複数の隣接する細胞層によって溶解又は分解及び/又は吸収されるであろうゼラチン状態の増殖培地で構成することは有益であるかもしれない。増殖培地は、1つ又は複数の層の接着を改善するために、特定の増殖因子(例えばウシ血清アルブミン(BSA)、アクチビンA、繊維芽細胞成長因子(FGF)、インスリン様成長因子(IGF1)、ヒトdickkopf WNTシグナル伝達経路阻害剤(DKK1)、及びノギン)又は抗体(以下に説明するように、パリレンの基材に埋め込まれた官能基に相補的である)で構成されていてもよい。
核形成の制御、液体から結晶への状態変化の開始、及び潜熱の放出のための制御された速度保存中にもたらされる温度補償(別紙X)は、低温保存後及び解凍細胞の生存度を改善することが知られている。多くの実施形態では、基材は、基材の構成及び播種領域により、播種された細胞と平行に配向される。したがって、基材は、播種された全ての細胞と密接に接触及び/又は近接しており、それによって全ての細胞の均一な核形成が同時に、且つ播種された細胞の潜熱放出に応じた効率的な温度補償が可能になる。これは、播種された細胞がほぼ集密(例えば>98%)又は集密単層に成長する実施形態にとって特に有益な要因である。それによって、低温保存プロセス中、基材は、基材上に形成された均一な細胞層に悪影響を与えるであろう、氷晶又は他の成核剤の播種、機械振動、電気凍結等を含む、当技術分野で既知の他の方法を必要としないで、効率的に核形成を誘導する。上記の核形成の特定の方法は、細胞が集密又はほぼ集密な配向にあるため、核形成プロセスを助けるだけの基材と併用することができる。基材構成及び細胞との空間関係は、したがって播種された細胞による潜熱放出のプロセス中の制御された速度凍結によってもたらされる温度補償に加えて、低温保存された細胞の生存度に更に有益に寄与する。潜熱放出は、細胞株に部分的に依存するが、使用される凍結保存培養液の組成に主に依存する。言い換えれば、基材に播種された細胞の単層に実質的に平行な基材表面は、ヒートシンクとして効果的に機能して、播種された細胞からの潜熱放出時を含む、低温保存及び解凍時に効率的に熱伝達する。
理想的な基材は、米国特許第8,808,687号に記載されている基材に見られるような有益な特性も持っている可能性がある。基材特性は、細胞の単層の付着及び生成を促進するための細胞増殖表面、細胞増殖を妨げる周囲(例えば基材の周囲部分は、細胞増殖親和性のための十分な栄養素及び廃棄物輸送のための薄くした膜部分から構成されていない、及び/又は周囲は持ち上がった縁からなる等)を含み、標的組織に隣接する機械的操作及び移植を可能にする。
特定の実施形態では、基材は、所望の移植部位に一致する最適な非平面の正常状態を有するように設計される。培養及び低温保存中に基材を操作して、より容易な取り扱いのための平面形状、自動化機械による細胞播種の容易さ、及び改善された細胞の生存度を維持することができるが、移植後は非平面形状であることが有益な場合がある。細胞が播種された基材がRPE細胞を含有し、網膜内の地図状萎縮領域を適切に網羅するように移植される実施形態では、基材は、眼内の網膜の曲率半径に合致するように最適に曲げられる。曲率は、光受容体の微細構造及び隣接する視覚機能の回復を示す外境界膜(ELM)の平行成長を誘発する。基材と平行に形成されたRPE単層及び光受容体は、前駆細胞のための接着剤として機能し、成熟後にELMを形成する。比較上、独立した細胞、不明瞭な形状の細胞ゲル及び懸濁液のRPE細胞注射は、不十分な臨床結果を示している。
基材/膜を組織培養容器上に可逆的に付着させる方法
小さな基材/膜(100mm2未満)、又は薄い基材/膜(50ミクロン未満)が、後の移植による要件である実施形態において、最小の質量では所定量の培養液内で浮かびやすくなるので、基材を標準的な培養ウェル内で維持することが困難であり、それによって基材が動き回り、播種された細胞が取り外される可能性がある。基材のそのような動きを防ぐ一方法は、蒸発乾燥によって膜を組織培養プレートに可逆的に付着させることである。多くの細胞培養プレートには蒸発を最小限にする追加の特徴があるので、これは直感に反するように見えるかもしれない(例えばThermoFisher Scientific社製 Nunc Edge 2.0 96-ウェル細胞培養プレートにおける滅菌水又は培養液で満たされる蒸発モート)。一実施形態では、膜を最初に、組織培養プレートのウェルに蒸発させる溶液(例えばDulbecco社のリン酸緩衝食塩水(DPBS))と一緒に配置する。膜がウェルの底で平らになり、膜の底とウェルの底の表面の間に液体の残留量が残るまで、DPBSをウェルからゆっくり取り出す。他の全ての該当するウェルで繰り返した後、組織培養プレートを乾燥させる。乾燥の種々の方法は、デシケーター、温度/湿度制御チャンバー、乾燥器でのベーク、又はクリーンルーム等の制御された部屋での放置の使用を含む。この乾燥フェーズ中、残留DPBSが蒸発し、それによって膜がウェルの底に付着し、それによって細胞増殖コーティング(例えばビトロネクチン)並びに細胞播種の適用がより容易になる。ウェル内の動きを制限することによって、既知のX、Y、及びZ軸を必要とし、通常2次元機能に限定される均一な播種に自動細胞播種機を使用することができる。細胞播種後、DPBSをウェルに導入することによって膜を可逆的に付着させ、膜をウェル底面から取り外し、培養のために別のウェルに移動できるようにする。他の実施形態では、pH、塩分、又は他の細胞増殖因子を否定的に変えない種々の他の溶液をDPBSの代わりに使用することができる。
低温保存の最適化:細胞の生物学的評価
基材に播種された細胞を低温保存する実施形態では、最適な低温保存生存度特性は、各製造段階で異なる。
最初に、0日目と定義された細胞播種時に、細胞を、播種プロセスにより容易に適応し、接種後の生存度を維持する非成熟細胞になるように最適に選択される。RPE細胞の実施形態では、これらの特性としては、(i)非分極又は部分分極、(ii)最小限から軽い色素沈着又はメラニンの欠如、(iii)<100%集密の播種密度での播種(例えば50～90%集密、より理想的には70～80%集密)が挙げられる。
基材に播種されたRPE細胞を低温保存する実施形態では、播種後に最適な低温保存生存度特性を示す場合、RPE細胞が選択され、低温保存される。このような特性は、播種後2～10日、ほとんどの実施形態では播種後6～8日で観察される。低温保存の直前に観察された最適な低温保存生存度特性としては、(i)色素沈着していない又は最小限色素沈着したRPE細胞(色素脱失したRPE細胞、色素沈着経路の自然若しくは誘発された遺伝子変異が原因で色素沈着が改変されたRPE細胞又は改変された色素沈着の化学誘導又はその組合せを含む)、(ii)非分極又は部分分極RPE細胞、(iii)いくつかの繊維芽細胞形態が許容され得るが、50%超が成熟丸石状の形態を有するRPE細胞、(iv)遺伝子発現レベルが成熟細胞のレベルよりも低い又は特定の遺伝子発現が欠如しているRPE細胞、及び(v)上皮層の特性である、基材上の正の接着及び成長並びに密着結合の形成を例示する、準集密(100%未満)又は準集密(90%を超える集密、「サブコンフルエント」ともいう)単層構成のRPE細胞が挙げられる。
最適な低温保存生存度RPE細胞の一特性は、非色素沈着又は最小/部分色素沈着である。RPE細胞は、多くのメラノソーム、頂端領域から細胞の中央部分に広がる色素顆粒を含有する。特定のRPE細胞、例えば黄斑領域と接しているものは、より濃く色素沈着されている。色素沈着していない又は限定的な色素沈着RPE細胞は、完全に分化していない、単離されていない、及び/又は精製されていない細胞であってよい。化学的除去(例えばメラニン形成阻害剤)、増殖培地の改変、生理学的に隣接する細胞型との相互作用等によるRPE細胞の色素脱失を含む、種々の方法を、実施することができる。一実施形態では、チロシンからドーパキノン及びユーメラニンへの多段変換を防ぐために、メラニン形成阻害剤、プロピルチオウラシル(PTU)を使用する。低温保存時にメラニン形成及びメラニンの欠如を阻害するこのような方法は、解凍後のRPE細胞生存を促進する。メラニン形成関連経路を阻止又は制限するために、PTUを、当技術分野で既知の種々の物質で置換してもよい。
最適な低温保存生存度RPE細胞の別の特性は、非分極、部分分極、又は完全分極である。分極したRPE細胞は、頂端微絨毛、明確な密着結合、膜輸送能力及びメラノサイト色素沈着を含む生理学的特性を模倣する頂端(RPE細胞の網膜に面する側に対応)と基底(RPE細胞の脈絡膜に面する側に対応)の方向を区別する。分極は、視覚的に区別されるか、又は頂端、基底、及び非極性依存性細胞分泌物の測定した比率によって区別され得る。
最適な低温保存生存度RPE細胞の更に別の特性は、丸石状の形態の観察である。分化、単離、及び/又は精製したRPE細胞は、立方体様の丸石状の形態の外観をとる。
最適な低温保存生存度RPE細胞の追加の特性は、成熟細胞のレベルよりも低い又は特定の遺伝子発現が欠如した遺伝子発現レベルである。この特性は、RNA又は他の核酸発現、タンパク質発現、脂質発現、グリコシル化パターン、免疫組織学的染色、又は電気生理学的特性によってテストすることができる。セクレトームレベルの測定等の二次測定技術も、代替的又は追加的に実施することができる。
最適な低温保存生存度RPE細胞の別の特性は、準集密単層構成である。細胞が完全に全て利用可能な部分に成長し、接触阻害に達すると集密が達成される。集密に達した後、哺乳動物細胞型を含む多くの細胞型が、準集密と比較して異なる特性を示す。基材上の単層RPE細胞の理想的な細胞播種密度は、細胞懸濁液1ミリリットル当たり細胞2.0×10E5～7.0×10E5個、又は基材表面1平方センチメートル当たり細胞1.0×10E3～4.0×10E3個、又は標準的な48ウェル細胞培養プレート1ウェル当たり細胞1.0×10E5～3.5×10E5個である。集密に達すると、対数増殖期に続く培養細胞の標準的な特徴的な増殖パターンから理解されるように、細胞が増殖にするにつれ細胞播種密度は1.0×10E6により近くなる。細胞密度は、画像解析、分光測定法、電気/インピーダンス分析、並びに他のより侵襲的/破壊的なプロセスによって測定することができる。単層は、多細胞層と比較して、基材の平らな細胞播種表面及び単層を支持するための基材の栄養素/廃棄物輸送比の一致によって促進される。
最適な低温保存生存度RPE細胞は、基材へのRPE細胞の播種後3～10日で達成され、その場合細胞は100%集密に達しておらず、基材上で完全に分化していない。最適な低温保存生存度RPE細胞は、この時間窓の間に得られるが、使用される細胞株、増殖培地、基材特性、培養条件、及びその組合せによって異なっていてもよい。したがって、上記の1つ又は複数の最適な低温保存生存度RPE細胞の特性は、細胞が播種された基材を低温保存する前に、定性的及び定量的に再調査すべきである。
上述の基材及び細胞株の特性は、細胞の生存度及び機能性並びに基材の完全性を最大化するための最適な低温保存及び解凍プロトコールを作成するために考慮すべきある。
種々の組合せの凍結保護物質及びその除去を含む種々の方法を使用して、低温保存後解凍した細胞の生存度を高めることができる。
最適な解凍後RPE細胞は、ほぼ100%集密、30%未満の死細胞(最適には10%未満)を維持し、丸石状の形態を維持すべきである。解凍後5～10日目には、PEDFの分泌レベルは、理想的には5～12ng/mm2/24時間、最適には約9.6ng/mm2/24時間である。ある実施形態では、更なる遺伝子発現試験は、遺伝子発現が範囲内にあることを確認するための定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)によって完了する。RPE細胞の実施形態では、重要な遺伝子発現は、RPE65 ΔCt≧-3.0、REX1 ΔCt≦-8.0、及び参照遺伝子(EIF2B2、SERF2、UBE2R2)の幾何平均Ct≦32.0、又は文献で理解されている成熟RPE細胞に匹敵若しくは類似している。
任意の細胞培養改善:上清
種々の実施形態では、細胞の培養は、パラクリン、自己分泌、内分泌、及び細胞間の電気シグナル伝達で使用されるものを含む多くの細胞化学製品を生成することを示している。これらの化学製品は、細胞培養で見つけることができ、抽出及び分類された後、細胞培養添加剤としての潜在的な価値がある。細胞分泌物は、タンパク質、ホルモン、酵素、副産物、廃棄物、又はその組合せを含んでいてもよい。得られた因子の生の組合せ、それらの選択された組合せ、又は精製された形態は、以後、総称的に「標的上清」と呼ばれる。
地図状萎縮(GA)で失われたRPEを補給することを目標とした細胞療法の更なる開発は、大変興味深い。現在第I/IIa相臨床試験中のそのような治療法の1つは、CPCB-RPE1、超薄パリレン膜上で成長した分極ヒト胚性幹細胞(hESC)由来RPE(PRPE)を含有する網膜下移植片(Kashani AH、Lebkowski JS、Rahhal FMら A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry AMD. Sci. Transl. Med. 2018;10:435頁、eaao4097.)が含まれる。CPCB-RPE1は、PRPE単層を復元し、動物実験で移植片の境界を越えても光受容体(PR)保存を支持することが可能であり、これは、PRPE由来可溶性因子が重要なパラクリンの役割を果たすことを示唆している。したがって、移植片自体に加えて、PRPEの分極した色素沈着単層によって分泌される必須の栄養因子とシグナル伝達因子の固有のセットも、PRの生存及び機能を維持し得る。
したがって、PRの救済、生存、及び修復を促進するためのPRPE細胞由来の可溶性の栄養因子の使用は、大きな期待を示す。何人かの研究者は、in vitro及びin vivoモデルにおいて網膜細胞損失を減らす、RPE由来ならし培地又は特定のRPE栄養因子の能力を示している。増殖因子とならし培地の組合せは、網膜外植片のPR増殖及び分化を促進することが報告されている。具体的には、BDNF及びGDNF等の神経栄養成長因子の使用は、網膜シートの移植における補充栄養物として使用されてきた。同様に、LaVailらは複数の増殖因子、サイトカイン及びニュートロフィン(neutrophin)は、軽傷の王立外科学院(RCS)ラットモデルで損傷したPRを遅らせることを示した。それにもかかわらず、増殖因子の単一又は限定された組合せは、単一の病因のみを標的にしているので、それ自体で限定的な成功を示している。
これらの研究の成功とCPCB-RPE1の境界を越えて観察されたパラクリン効果に基づいて、この移植片によって分泌される複数の栄養因子の異なる濃度は、ヒトの乾性進行性非新生血管型AMD(乾性AMD)の治療のための潜在的な併用療法として役立つ可能性があると仮定される。特性決定、CPCB-RPE1修飾移植片に由来するPRPE可溶性因子(SF)で治療された網膜ジストロフィーの動物モデルにおけるin vitro及びin vivo結果は、この概念の実行可能性を裏付けた。
細胞株特異的標的上清を生成する方法は、特定の成長を促進する生体適合性基材又は容器の上で、中で、又は生体適合性基材若しくは容器中に封入されて（「カプセル化されて」ともいう）特定の熟段階及び/又は異なる分化段階の間で、特定の増殖培地のカクテルを用いて標的細胞を培養することからなり、それによって特定の因子の効率的な生成が増幅される。段階は、上記の視覚的形態(例えば立方体様、丸石、色素沈着等)の組合せによる基材に播種された細胞の定期的な評価、特定の因子(例えばBDNF、BMP-7、PEDF、TGF、VEGF等)及びその濃度の特定のテスト、及び細胞静止膜電位値(例えばmV)をテストするための全細胞電流固定記録によってモニターすることができる。
RPE細胞の実施形態では、文献は、未成熟RPE細胞と成熟RPE細胞を区別するための種々の指標を示す。例えば、成熟RPE細胞は、静止膜電位値が通常-40～50mVである。しかしながら、未成熟RPE細胞は、わずかに脱分極した静止膜電位(通常-25～-35mV)を有している。更に、成熟RPE細胞の全細胞電圧固定記録は、未成熟RPE細胞では観察されない電位活性化型内向き電流及び電位開口型ナトリウムチャンネルの活性を示している(Nymarkら 2013)。
一実施形態では、RPE細胞は、ビトロネクチンでコーティングされたパリレン膜上に播種され、XVIVO10(XVIVOTM10、Lonza社)中、37℃、5%CO2インキュベーターで培養された。標的上清(図Xに要約されている)は、28日目から開始して40日目まで4日毎に回収した。28日目から40日目までは、目的とする成熟の特定の段階:ほぼ集密(90%超、理想的には98%超の膜の被覆率)、丸石状の形態、膜全体にわたって均一な単層分布、最小限から中程度の色素沈着(0%～70%色素沈着)、を包含していたので、特に興味深かった。回収方法は、異なっていてよいが、一実施形態では、細胞を抽出しないように注意しながらピペットによって培養ウェルから培養液を抽出する。ある実施形態では、細胞フィルターを使用して、上清のみが抽出されるようにすることができる。
細胞の更なる生存度と、したがって分泌因子の質は、USP 無菌性及びUSPマイコプラズマ試験によって確認することができる。細胞は更に、目的の特定の遺伝子 (例えばRPE細胞のためのRPE65、REX1、EIF2B2、SERF2、UBE2R2等)を特定する逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)によって遺伝子発現についてテストすることができる。回収した標的上清は、図Xに概説されている特定の因子の量及び濃度について更にテストすることができる。異なる細胞株及び培養方法によって分泌因子にはばらつきがでるが、同じ細胞株及び培養方法を使用した場合、上清組成のバッチ間のばらつきが最小限であることが複数の試料から示され、それによって上清を生成する再現性が証明された。
一実施形態では、回収した標的上清は、複数の日及び/又は複数の膜からプールされ得る。次いで標的上清を0.2μmシリンジフィルターシステムで濾過する。種々の実施形態では、濾過した標的上清は、濃縮されていない1倍形態で、kDカットオフ(例えば3kDカットオフ)によるAmicon遠心フィルターデバイス(Milipore Sigma社)を使用して濃縮(例えば3倍)、又は希釈剤若しくは薬物媒体で希釈して使用することができる。いくつかの実施形態では、標的上清は、最初に濃縮され、次いで所望の媒体依存性因子吸収及び特定の因子の改善された貯蔵期限のために選ばれた特定の薬物媒体(例えば、水性、親油性溶液、懸濁液)で希釈される。標的上清は、貯蔵期限を延長するために更に使用するまで、-80℃で保管するのが理想的である。次いで標的上清を注射器に詰め、任意で増殖培地又は他の治療薬を補充してもよい。別の実施形態では、標的上清ペレットは更に、高濃度又は長期の拡散移植片として更に使用するために抽出することもできる。
更に別の実施形態では、細胞は、選択的透過性基材上で培養して、細胞を分極させ、特異的分泌物を生成させることができる。例えば、分極したRPE細胞は、頂端分泌物、基底分泌物、及び非極性特異的分泌物を生成することが知られている。RPE細胞の頂端分泌物は、αBクリスタリン、ヒアルロナン、MMP-9、PEDF、TGF-β、TIMP-I、MGF-E8を含む。RPE細胞の基底分泌物は、シスタチンC、エンドセリンI、FGF 5、VEGFを含む。RPE細胞の非極性特異的分泌物は、BDNF、CFH、CNTF、フィブリン3/5、FGF 2、HB-EGF、HGF、IGF-I、LIF、MMP-9、NGF、トロポエラスチンを含む。識別されている他の栄養因子は、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-6、PEDF-AA、BMP-7である。
詰めた上清は、細胞治療培地(例えば細胞溶液、細胞播種ゲル、細胞が播種された基材等)の移植後、成長の支持、機能性の継続、及び宿主及び/又は移植された細胞と標的部位組織の統合を補うための追加の補充栄養物であってもなくても、治療として標的部位に定期的に注射され得る。詰めた上清は更に、移植前に細胞治療培地にコーティングし、培地に加え、又は細胞播種前に基材上にコーティングすることができる。
他の実施形態では、上清を加えた後、成熟した特性を示すまで細胞を更に培養する。RPE細胞では、これらの成熟した特性は、(i)色素沈着したRPE細胞、(ii)分極RPE細胞、(iii)神経又は繊維芽細胞領域のない成熟した丸石状の形態を有するRPE細胞、(iv)成熟細胞の遺伝子発現レベルを有するRPE細胞、及び(v)集密単層構成のRPE細胞から選択される。
細胞を播種した支持構造が移植されないことになる実施形態では、基材、格子構造、寒天、ヒドロゲル、又は当技術分野で既知の他の細胞増殖表面を含む、種々の他の細胞増殖表面を使用することができる。
上清は、抗炎症性の視覚機能応答(すなわち網膜電図によって評価された増加したb派振幅)、及び光受容体の生存及び機能の増加を含む保存された網膜構造を含む動物モデル(すなわち免疫不全王立外科学院(iRCS)ラットモデル、地図状萎縮及び加齢黄斑変性症の薬物及び細胞治療開発のための承認されたFDA 動物モデル)において治療活性を示した。更に、上清は、既知の神経保護及び抗血管新生剤である単一因子のPEDF対照と比較して、より大きな光受容体生存を示し、これは2つ以上の因子が標的のパラクリン効果に寄与することを示す。更に、多数の注射にもかかわらず、腫瘍形成能又は眼内炎の証拠は観察されなかった。
最適化された低温保存プロトコール及び考察
低温休止(Cryo-hibernation)プロトコール
ある実施形態では、標準的な低温保存プロトコールの代替の低温休止プロトコールは、基材に播種された解凍細胞の生存度の増加を示している。低温保存プロトコールは、以下のとおりである。初期の制御された温度ランプダウンフェーズに続いて、播種された細胞の潜熱放出よりも低い第1の温度に達すると(0℃～20℃)、細胞は第1の期間、第1の温度に保たれる。第1の温度は、潜熱放出温度より低い任意の温度であり、-20、-30、-40、-50、-60、-70、-80、-90、又は-100℃であってもよい。第1の期間は、12時間、1日、7日、28日であり、温度を急激に変化させることなく細胞を低温保存状態に順応させるのに役立つ。この順応は更に、温度低下(-1℃/分以上)によって引き起こされる可能性がある微小引裂が基材に形成されるのを防ぐ。第1の期間後、低温保存した細胞を移し、第2の期間、保存温度で維持する。ほとんどの場合、保存温度は、便宜上-196℃(例えば液体窒素の温度)であるが、休止温度と同じ温度でもよい。ある実施形態では、第2の温度が得られるまで、毎分約-1℃～毎分約-30℃の制御された温度ランプダウンフェーズの温度低下速度、又はこの範囲内の任意の速度で、細胞が播種された基材を第2の温度に移すことも実施される。この特定の温度ランプダウンは、種々の要素(すなわち基材、少なくとも1つの細胞型、凍結保護溶液、及び低温保存容器)の均一な温度低下に役立つ。
特定の実施形態では、細胞は、解凍するまで第1の温度で設定温度の冷凍庫及びキャリングケースに保管される。これには持ち運びできる設定温度冷凍庫が必要だが、長期の休止温度は、解凍プロセスの温度差が、-196℃(例えば液体窒素の温度)からの温度差よりも小さいので、解凍後の細胞の生存度を高め、それによって、バッチ細胞が播種された基材の解凍並びにそれぞれ個々の基材内で小規模で、可変な氷晶形成パターン及び異なる凍結保護物質除去率を引き起こす温度変化ゾーンが著しく少なくなる。
低温保存最適化:RPE細胞株
hESC-RPE細胞の特定の実施形態では、種々の組合せの低温保存プロトコールをテストし、特定の細胞株を最適化した。特定の細胞株をテストしたが、上記の細胞株及び基材特性の主要因子を考慮したので、他のRPE細胞株についても同様の結果が予想される。
CPCB-RPE1移植片のRPE細胞は、(i)色素沈着していないRPE細胞(色素脱失したRPE細胞を含む)、(ii)非分極又は部分分極 RPE細胞、(iii)大半が成熟した丸石状の形態を有するRPE細胞、(iv)遺伝子発現レベルが成熟細胞のレベルよりも低い又は特定の遺伝子発現が欠如しているRPE細胞、(v)準集密単層構成のRPE細胞、又はその組合せを含む、細胞の最適な低温保存生存度特性を示した。この細胞の最適な低温保存生存度特性の組合せは、移植可能な基材上に播種した後、3～12日目(7日目がバッチ間の中央値である)に得られた。
CPCB-RPE1細胞株は、その全てが基材設計について考慮されている、基材の熱膨張係数、基材の弾性パラメーター、基材の厚さ、及び基材移植サイズを含む、基材の最適な低温保生存度特性を示した。
凍結保護剤と凍結速度の種々の組合せで、種種の細胞株をテストした。最も実行可能な組合せは、DMSO濃度が10%で-5℃/分～30℃/分の範囲で凍結するCS-10(製造業者:BioLife Solutions、Bothell、米国ワシントン州)の使用であった。比較すると、2%及び5%のDMSO濃度並びに-1℃～-3℃の凍結速度は、細胞生存度の結果がより低い。
次いで組合せを、解凍後1日目及び1週間後の細胞の位相差画像、細胞の遺伝子発現、細胞の生存度染色及びアラマルブルー代謝を含む種々の方法を用いて評価した。
Figure 0007430885000001
用語「実質的に」又は「約」は、±10%(例えば、質量又は体積による)を意味し、ある実施形態では、±5%を意味する。本明細書全体を通して、「一実施例」、「実施例」、「一実施形態」、又は「実施形態」は、その実施例に関連して説明する特定の特徴、構造又は特性が現在の技術の少なくとも1つの実施例に包含されていることを意味する。したがって、「一実施例において」、「実施例において」、「一実施形態において」、又は「実施形態において」という表現が本明細書全体にわたって様々な箇所において出現するということは必ずしも全てが同一実施例のことを意味しているものではない。更に、特定の特徴、構造、ルーチン、ステップ、又は特性は、技術の1つ又は複数の実施例において任意の適切な方法で組合せることができる。本明細書に記載される見出しは便宜上でしかなく、請求する技術の範囲又は意味を限定又は解釈することを意図したものではない。

Claims (19)

  1. 基材上の細胞を低温保存する方法であって、
    未成熟網膜色素上皮(RPE)細胞の単層が播種された生体適合性ポリマー基材を準備する工程であって、ポリマー基材が細胞播種表面を提供する、工程と;
    i)未成熟RPE細胞の単層が基材上で90%～99%集密に達する場合、及びii)未成熟RPE細胞のほとんどが完全に色素沈着していない場合を識別する工程と;
    識別されたら、細胞が播種された基材を、-20℃未満の第1の温度に達するまで、-1℃/分～-30℃/分の制御された温度低下速度に曝露する工程と
    を含む、方法。
  2. 細胞が播種された基材が、播種された細胞の潜熱放出を表す温度よりも低い温度に達する、請求項1に記載の方法。
  3. 表面が、播種された細胞の潜熱放出に反応して核形成及び効率的な温度補償を誘導するのに十分である程度に、基材上に播種された未成熟RPE細胞の単層と実質的に平行である、請求項2に記載の方法。
  4. 細胞が播種された基材を第1の温度で維持する工程であって、温度の均一性を得るために第1の期間の制御された温度低下速度後に第1の温度が-20℃～-100℃である、工程と;
    細胞を第1の温度より50℃以内の第1の温度よりも低い保存温度で第2の期間維持し、それによって低温保存された細胞を得る工程と
    を更に含む、請求項1に記載の方法。
  5. 細胞が播種された基材を第1の温度で維持する工程であって、第1の期間の制御された温度低下速度後に第1の温度が-20℃～-100℃である、工程と;
    第2の制御された温度低下速度を実施して最終的に細胞を-196℃未満の保存温度で第2の期間維持し、それによって低温保存された細胞を得る工程と
    を更に含む、請求項1に記載の方法。
  6. 第2の期間が24時間～60か月である、請求項5に記載の方法。
  7. 第2の制御された温度低下速度が-1℃/分～-30℃/分である、請求項5に記載の方法。
  8. 細胞の単層が、細胞懸濁液1ミリリットル当たり細胞200,000～700,000個、又は基材表面1平方センチメートル当たり細胞100,000～350,000個の細胞播種密度を有する、請求項1に記載の方法。
  9. RPE細胞の50%超が丸石状の形態を有する、請求項1に記載の方法。
  10. RPE細胞が色素沈着していない、又は部分的に色素沈着している、請求項1に記載の方法。
  11. 細胞が、(i)色素沈着していない又は部分的に色素沈着したRPE細胞、(ii)付着しているが非分極、部分分極、又は完全分極のRPE細胞、(iii)成熟した丸石状の形態を有する又は有しないRPE細胞、(iv)遺伝子発現レベルが成熟細胞のレベルよりも低い又は特定の遺伝子発現が欠如しているRPE細胞、及び(v)集密又は90%を超える準集密単層構成のRPE細胞から選択される低温保存生存度特性を示すRPE細胞である、請求項1に記載の方法。
  12. 基材が、表面改質を有する、請求項1に記載の方法。
  13. 生体適合性ポリマーがパリレンを含む、請求項1に記載の方法。
  14. 識別する工程が、未成熟RPE細胞の少なくとも1つ又は複数の頂端分泌物、基底分泌物、又は非極性特異的分泌物が成熟RPE細胞のレベルよりも低いレベルである場合を決定することを含む、請求項1に記載の方法。
  15. 頂端分泌物が、αBクリスタリン、ヒアルロナン、マトリックスメタロペプチダーゼ(MMP)-9、色素上皮由来因子(PEDF)、形質転換成長因子(TGF)-β、メタロプロテイナーゼ(TIMP)-Iの組織阻害剤、又はメカノ成長因子(MGF)-E8を含む、請求項14に記載の方法。
  16. 基底分泌物が、シスタチンC、エンドセリンI、繊維芽細胞成長因子(FGF)5、又は血管内皮増殖因子(VEGF)を含む、請求項14に記載の方法。
  17. 非極性特異的分泌物が、脳由来神経栄養因子(BDNF)、補体因子H(CFH)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、フィブリン3/5、繊維芽細胞成長因子(FGF)2、ヘパリン結合性上皮成長因子(HB-EGF)、肝細胞成長因子(HGF)、インスリン様成長因子(IGF)-I、白血病抑制因子(LIF)、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)-9、神経成長因子(NGF)、又はトロポエラスチンを含む、請求項14に記載の方法。
  18. 識別する工程が、少なくとも1つ又は複数のRPE65、REX1、EIF2B2、SERF2、UBE2R2の未成熟RPE細胞の遺伝子発現が、成熟RPE細胞の発現よりも低いことを決定することを含む、請求項1に記載の方法。
  19. 基材が、細胞がそれを通して栄養素を拡散できるように構成された薄い領域を含む、請求項1に記載の方法。
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